JP2016500521A

JP2016500521A - 胃ポリープおよび胃癌特異的メチル化マーカー遺伝子を利用した胃ポリープおよび胃癌の検出方法

Info

Publication number: JP2016500521A
Application number: JP2015540589A
Authority: JP
Inventors: サンホワンアン，; テジョンオー，
Original assignee: ゲノミックツリー，インコーポレイテッド
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2013-09-26
Publication date: 2016-01-14
Also published as: US20160040244A1; EP2918679B1; WO2014073785A1; EP2918679A1; TR201810602T4; KR101569498B1; KR20140059125A; DK2918679T3; EP2918679A4; CN104812899A; ES2681035T3

Abstract

本発明は、ＳＤＣ２（ＮＭ＿００２９９８、シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子の胃ポリープおよび胃癌特異的メチル化バイオマーカーとしての新しい用途に関し、より詳細にはＳＤＣ２遺伝子をバイオマーカーとして利用してメチル化レベルを測定することによって胃ポリープおよび胃癌を早期に診断する用途に関する。本発明は胃ポリープおよび胃癌特異的マーカー遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を検出することによって、胃癌診断のための情報を与え得る方法を提供する効果がある。本発明に係るメチル化検出方法と診断用組成物、キットおよび核酸チップを利用すると、胃癌を初期形質転換期で診断できて早期診断が可能である。よって、本発明は、通常の方法より正確でかつ早く胃癌を診断できて有用である。

Description

本発明は、ＳＤＣ２（ＮＭ＿００２９９８、シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子の胃ポリープおよび胃癌特異的メチル化バイオマーカーとしての新しい用途に関し、より詳細にはそのメチル化レベルを測定することによって胃ポリープおよび胃癌を早期に診断することを可能にするバイオマーカーとしてのシンデカン２遺伝子の用途に関する。

医学が発達した現在においても、癌患者、特に固形腫瘍（ｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒ：血液癌を除いた他の癌）患者の場合、５年生存率は５０％未満である。全癌患者の約３分の２は、進行期で診断され、ほとんどすべてが癌の診断後２年以内に死亡する。このように低調な癌の治療結果は、治療法の問題だけではなくて、癌を早期に診断することと進行中の癌を正確に診断することと、癌の治療後癌患者を追跡調査することが容易でないという事実のためでもある。

現在の診療における癌の診断は、問診（ｈｉｓｔｏｒｙｔａｋｉｎｇ）、身体検査、および臨床的評価の後、癌が疑われると、Ｘ線検査及び内視鏡検査に進み、組織生検で確認される。しかし、現在の診療による癌の診断では癌の細胞数が１０億個、癌の直径が１ｃｍ以上になった場合だけ診断が可能である。こうした場合、既に癌細胞は転移能力を持っており、少なくともその半分は既に転移している。一方、癌が直接または間接的に産生する物質をモニタリングするための腫瘍マーカー（ｔｕｍｏｒｍａｒｋｅｒｓ）が癌スクリーニング（ｃａｎｃｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に利用されるが、これは正確度に限界があって、癌が存在しても約半分まで正常と示され、癌が存在しない時にも度々陽性と示されるため、混乱を引き起こす。また、癌の治療に主に使われる抗癌剤の場合、癌の容積が少ない場合にだけその効果を示す問題点がある。

癌の診断と治療が共に難しいことは、癌細胞は非常に複雑で多様な形態を示すためである。癌細胞は、過剰にかつ持続的に増殖し、死滅することなくずっと生存して、周囲組織を侵潤して遠位臓器に拡散（転移）してヒトを死亡させる。免疫機構の攻撃や坑癌治療にも癌細胞は生存して絶えず発達して生存に最も有利な細胞群が選択的に増殖する。癌細胞は、多数の遺伝子の変異によって発生する高度な生存能力を持った生存体である。一つの細胞が癌細胞に変わって、臨床において検出できる悪性の癌塊に発展していくためには、多数の遺伝子に変異が起きなければならない。従って、癌を根源的に診断して治療するためには、遺伝子レベルで接近する必要がある。

最近、癌の診断に遺伝子解析が積極的に試みられている。最も単純な代表的方法は、血液における白血病の遺伝子指標であるＡＢＬ：ＢＣＲ融合遺伝子の存在をＰＣＲで検出することである。この方法は、正確度が９５％以上であり、慢性骨髄性白血病の診断および治療の後、単純かつ簡易な遺伝子解析を使用して、結果、および追跡調査等の評価に使用されている。しかし、この方法は、少数血液癌の場合にだけ適用可能である。

また、癌細胞が発現する遺伝子の存在をＲＴ−ＰＣＲ及びブロッティングで検出することによって、血球細胞中に存在する癌細胞を診断する方法も試みられている。しかし、この方法は、前立腺癌と黒色種等一部の癌だけに適用が可能で、偽陽性が多いという欠点を有している。さらに、この方法における検出および読み取りの標準化が難しく、その有用性にも限界がある(Ｋｏｐｒｅｓｋｉ，Ｍ．Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５：１９６１，１９９９；Ｍｉｙａｓｈｉｒｏ，Ｉ．ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４７：５０５，２００１)。

血清（ｓｅｒｕｍ）や血漿（ｐｌａｓｍａ）内ＤＮＡを使う遺伝子検査が最近盛んに行われている。これは、癌細胞から分離して血液に出て、血清内に遊離型ＤＮＡ（ｆｒｅｅＤＮＡ）として存在する癌関連遺伝子を検出する方法である。実際の癌患者において血清内ＤＮＡ濃度が健常者の５〜１０倍に増加し、このように増加したＤＮＡは多くが癌細胞から遊離することが明らかになっている。これらの癌細胞から分離したＤＮＡを使用して、癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）と腫瘍抑制遺伝子の突然変異や消失、機能喪失等、癌に特異的な遺伝子異常を分析すると癌を診断することができる。実際、血清における突然変異型のＫ−Ｒａｓ癌遺伝子、p５３腫瘍抑制遺伝子、およびp１６遺伝子のプロモーターのメチル化、さらにマイクロサテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）の標識と不安定性（ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）等を検査して、肺癌、頭頸部癌、乳癌、大腸癌、および肝臓癌等を診断することが盛んに行われている（Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｑ．ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５：２２９７，１９９９；Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５９：６７，１９９９；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｅｓｐｅｄｅｓ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６０：８９２，２０００；Ｓｏｚｚｉ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５：２６８９，１９９９）。

一方、血液以外のサンプルでも癌細胞のＤＮＡを検出することができる。肺癌患者の痰や気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅ）内に存在する癌細胞または癌遺伝子の存在を遺伝子検査や抗体検査で検出する方法が試みられており（Ｐａｌｍｉｓａｎｏ，Ｗ．Ａ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６０：５９５４，２０００；Ｓｕｅｏｋａ，Ｅ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５９：１４０４，１９９９）、大腸および直腸癌患者の糞便内に存在する癌遺伝子を検出する方法（Ａｈｌｑｕｉｓｔ，Ｄ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１１９：１２１９−２７，２０００）と尿及び前立腺液内に存在するプロモーターのメチル化異常を検出する方法（Ｇｏｅｓｓｌ，Ｃ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６０：５９４１，２０００）も試みられている。しかし、多数の遺伝子異常を引き起こして、癌毎の多様な変異的特徴を示す癌を正確に診断するためには、多数の遺伝子を同時に、正確かつ自動で分析できる方法が求められるが、まだこのような方法は確立されていない。

癌を正確に診断しようとしたら、変異遺伝子を検出することだけでなく、その遺伝子の変異が現れる機構を把握することが重要である。以前にはコード配列の突然変異、即ち点突然変異、欠失、および挿入等の微細変化や巨視的な染色体異常に焦点を合わせて研究してきた。しかし、最近ではこれらの突然変異と同程度にエピジェネティック変化が重要なものであると報告されており、代表的なエピジェネティック変化の例がプロモーターのＣｐＧ島のメチル化である。

哺乳類細胞のゲノムＤＮＡには、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの他に５番目の塩基が存在し、これはシトシン環の５番目の炭素にメチル基がついた５−メチルシトシン（５−ｍＣ）である。５−ｍＣは、常にＣＧジヌクレオチドのＣにだけつき（５’−ｍＣＧ−３’）、このようなＣＧをよくＣｐＧと表示する。ＣｐＧのＣは、多くはメチル基がついてメチル化されている。このようなＣｐＧのメチル化は、アル（ａｌｕ）やトランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）などのゲノム内の反復配列（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が発現できないように抑制して、哺乳類細胞でエピジェネティック変化が最もよく現れる部位である。このようなＣｐＧの５−ｍＣは、自然に脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）されてＴに変わり、これに伴い、哺乳類ゲノム内ＣｐＧは正常な頻度（１／４ｘ１／４＝６．２５％）よりずっと低い１％の頻度だけを示す。

ＣｐＧが例外的に密集して現れる領域があって、これをＣｐＧ島という。ＣｐＧ島は長さが０．２〜３ｋｂで、Ｃ及びＧの含有量が５０％を越え、ＣｐＧの割合が３．７５％以上である部位を示す。ＣｐＧ島は、全ヒトゲノムに約４５、０００個存在し、特に遺伝子の発現を調節するプロモーター領域に集中して現れる。実際にヒト遺伝子中約半分を占めるハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｇｅｎｅｓ）のプロモーターにはＣｐＧ島が現れる（Ｃｒｏｓｓ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＧｅｎｅＤｅｖｅｌｏｐ．，５：３０９，１９９５）。血液、痰、唾液、糞便、尿等で腫瘍関連遺伝子のプロモーターメチル化を調べて、調べた結果を種々の癌診療に使おうとする試みが最近盛んに行われている（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５９：６７，１９９９；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｅｓｐｅｄｅｚ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６０：８９２，２０００；Ａｈｌｑｕｉｓｔ，Ｄ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１１９：１２１９，２０００）。そこで本発明者等は、関連研究を通じてシンデカン２（Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子が大腸癌診断のために特異的に使用されうることを明らかにした（ＫＲ１０−１１４２１３１Ｂ）。しかし、これは胃癌を含んだ他癌への診断のためのシンデカン２遺伝子の使用を提示していない。一方、本発明者らは、シンデカン２遺伝子が、肺癌、乳癌など種々の固形癌のバイオマーカーとして適してなく、一般的な癌の診断のためのバイオマーカーというよりは、大腸癌特異的バイオマーカーとしてだけ作用することを確認した。

本発明者等は、早期の癌および発癌リスクの診断、または、癌の予後の予測等を可能にする効果的な胃癌特異的メチル化マーカーを開発しようと鋭意努力した結果、ＳＤＣ２（ＮＭ＿００２９９８、シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子が肺癌組織、乳癌組織、肝臓癌組織、子宮頸部癌組織、および甲状腺癌組織全てにおいて特異的にメチル化されていないが、胃ポリープおよび胃癌細胞で特異的にメチル化されていて、ＳＤＣ２遺伝子をバイオマーカーとして利用してメチル化レベルを測定することによって胃ポリープおよび胃癌を早期に診断できることを見出して、本発明を完成することになった。
本背景技術の部分に記載された前記情報は、ただ本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであって、そこに当業者にとって既に公知の先行技術を形成する情報を含まないことがある。

Ｋｏｐｒｅｓｋｉ，Ｍ．Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５：１９６１，１９９９；Ｍｉｙａｓｈｉｒｏ，Ｉ．ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４７：５０５，２００１Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｑ．ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５：２２９７，１９９９Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５９：６７，１９９９Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｅｓｐｅｄｅｓ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６０：８９２，２０００Ｓｏｚｚｉ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５：２６８９，１９９９Ｐａｌｍｉｓａｎｏ，Ｗ．Ａ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６０：５９５４，２０００Ｓｕｅｏｋａ，Ｅ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５９：１４０４，１９９９Ａｈｌｑｕｉｓｔ，Ｄ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１１９：１２１９−２７，２０００Ｇｏｅｓｓｌ，Ｃ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６０：５９４１，２０００Ｃｒｏｓｓ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＧｅｎｅＤｅｖｅｌｏｐ．，５：３０９，１９９５

本発明の主な目的は、胃ポリープまたは胃癌において特異的にメチル化され、したがって胃ポリープまたは胃癌診断に効果的に使用できる胃ポリープまたは胃癌特異的メチル化バイオマーカーを提供して、これを利用して早期に胃癌を診断するための情報を提供するところにある。
本発明の他の目的は、胃ポリープまたは胃癌特異的メチル化マーカー遺伝子であるＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出方法およびＳＤＣ２遺伝子を利用した胃ポリープまたは胃癌診断用キットおよび核酸チップを提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は、ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島を含む断片を増幅するためのＰＣＲプライマー対と前記プライマー対によって増幅されたＰＣＲ産物をパイロシークエンシングするためのシークエンシングプライマーを含有する胃ポリープまたは胃癌診断用キットを提供する。

本発明はまた、下記工程を含む、胃ポリープまたは胃癌の検出方法を提供する：
（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する工程；及び
（ｂ）前記分離したＤＮＡにおいて胃ポリープまたは胃癌バイオマーカーであるＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を測定して胃ポリープまたは胃癌を検出する工程。

本発明はまた、ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を検出できる物質を含有する胃ポリープまたは胃癌診断用組成物を提供する。

本発明はまた、ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島を含む断片と厳しい条件下でハイブリダイゼーションできるプローブが固定されている胃ポリープまたは胃癌診断用核酸チップを提供する。

本発明の他の特徴及び実施形態は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からより一層明白になる。

図１はパイロシークエンシングを利用して、ビスフェノールＡに特異的に結合するＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の正常胃組織、低度形成異常および高度形成異常でのメチル化レベルを測定した結果を示すグラフである。図２Ａは、胃癌細胞株でパイロシークエンシングを利用してＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化を測定した結果を示すグラフで、２Ｂは、正常胃組織と、胃癌組織およびこれと隣接した正常胃組織でのＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化レベルをパイロシークエンシングを利用して測定した結果を示すグラフで、２Ｃは、ＲＯＣ曲線分析を介してＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の胃癌診断に対する敏感度および特異度を測定した結果を示す。図３Ａは、ｑＭＳＰ方法を利用して健常者および胃癌患者の血清ＤＮＡでのＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化レベルの測定結果を示し、３Ｂは、ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の胃癌診断能力を評価するためにＲＯＣ曲線分析を介して胃癌診断に対するＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の敏感度および特異度を測定した結果を示す。図４は、パイロシークエンシングを利用してＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の肺癌、乳癌、肝臓癌、子宮頸部癌、および甲状腺癌患者の癌組織および正常組織でのメチル化レベルを測定した結果を示す。図５は、胃内視鏡により正常であることが確定した健常者、および胃ポリープ患者の血清でＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化レベルを測定した結果、ならびにＲＯＣカーブを分析した結果を示す。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明は、胃ポリープまたは胃癌で特異的にメチル化されている遺伝子であるＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島をバイオマーカーとして使用することに関する。したがって、本発明は、一態様において、ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を検出できる物質を含有する胃ポリープまたは胃癌診断用組成物に関する。

本発明において、前記ＣｐＧ島はＳＤＣ２遺伝子のプロモーター領域に位置し得る。加えて、イントロン領域、エクソン領域、またはエンハンサー領域などこれらの上流領域または下流領域に存在してもよい。

本発明において、前記ＣｐＧ島は、好ましくはＳＤＣ２遺伝子のプロモーター領域、５‘非転写領域（５’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ）、第１のエクソンおよび第１のイントロン上に位置し、具体的には、前記ＣｐＧ島はＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子の転写開始点から、−０．５ｋｂ〜＋１．５ｋｂまでの範囲、より具体的には、配列番号１で表される領域に位置し得る。

本発明の胃ポリープまたは胃癌特異的メチル化マーカー遺伝子は、胃癌スクリーニング、危険性評価、予後、病変の同定、病期の診断及び治療ターゲットの選定にも使用できる。特に、本発明に係るバイオマーカー遺伝子であるＳＤＣ２遺伝子は、胃癌の前癌病変である胃ポリープでも高いレベルおよび頻度のメチル化陽性を示して胃ポリープの診断および胃癌の早期診断のバイオマーカーとしての有用性があることを示唆した。

本発明で、前記ＣｐＧ島のメチル化を検出できる物質は、前記メチル化されたＣｐＧ島を含む断片を増幅できるプライマー対、前記メチル化されたＣｐＧ島とハイブリダイゼーションできるプローブ、前記メチル化されたＣｐＧ島と結合できるメチル化特異的結合タンパク質またはメチル化特異的結合抗体、シークエンシングプライマー、シークエンシングバイシンセシスプライマーおよびシークエンシングバイライゲーションプライマーで構成された群から選択されたいずれか一つでありうる。

胃癌及び様々な段階の胃癌の異常においてメチル化される遺伝子を同定することは、正確かつ効果的に胃癌を早期診断できるようにさせ、複数遺伝子のメチル化プロファイリング及び治療介入のための新しいターゲットを同定することを可能にする。加えて、本発明に係るメチル化データは、他の非メチル化関連バイオマーカー検出方法と組み合わせて、さらに正確な胃癌診断システムを確立できる。

本発明の前記方法で、サンプルから得られた一つ以上の核酸バイオマーカーのメチル化段階を決めることにより、様々な段階または期の胃癌の進行を診断することができる。胃癌の各段階のサンプルから分離した核酸のメチル化段階を、胃組織の細胞増殖性障害を持たないサンプルから分離された一つ以上の核酸のメチル化段階と比較して、サンプルの胃癌の具体的な段階を検出でき、前本明細書において、記メチル化工程はハイパーメチル化でありうる。

本発明の一実施形態において、核酸は遺伝子の調節領域でメチル化できる。他の実施形態において、メチル化は遺伝子の調節部位の外側から始まって内側に進行されるため、遺伝子の調節領域の外側でメチル化を検出することで、細胞形質転換に係る遺伝子を診断することができる。

本発明のキットの一例では、サンプルを入れる区切られたキャリア手段；非メチル化シトシンを高感度に切断する試薬を含有する第１の容器、ＣｐＧ含有核酸を増幅するためのプライマーを含有する第２の容器および切断されたまたは切断されていない核酸の存在を検出する手段が含まれた第３の容器を含む一つ以上の容器を含む。本発明により使用されるプライマーは、配列番号２、３、５および６に表される配列、任意の機能的組合せおよびその断片を含んでもよい。機能的組合せまたは断片は、検出しようとしているゲノム領域上でメチル化が起きたか否かを検出するプライマーとして使用される。

さらに、本発明ではＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のメチル化をキットまたは核酸チップを利用して検出することによって、サンプルに存在する胃組織の細胞増殖性障害（形成異常）を診断することができる。

そこで、本発明は、他の態様において、配列番号１で表されるＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子断片由来の修飾核酸であって、前記ＳＤＣ２遺伝子断片のうち少なくとも一つのシトシン残基がウラシルに修飾されているか、ハイブリダイゼーション過程でシトシン以外のヌクレオチドに修飾されるように、ＳＤＣ２遺伝子断片を修飾することにより得られる、胃ポリープまたは胃癌の診断用修飾核酸に関する。

本発明で、前記修飾核酸は、配列番号１７で表される配列を含み得る。

他の態様において、本発明は、ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島を含む断片を増幅するためのＰＣＲプライマー対と前記プライマー対によって増幅されたＰＣＲ産物をパイロシークエンシングするためのシークエンシングプライマーを含有する胃ポリープまたは胃癌診断用キットに関する。

本発明はまた、ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島を含む断片と厳しい条件下でハイブリダイゼーションできるプローブが固定されている胃ポリープまたは胃癌診断用核酸チップに関する。

診断用キットまたは核酸チップを利用すると、サンプルの胃組織の細胞増殖性障害（形成異常）を検出することができる。前記検出方法は、サンプルから分離した少なくとも一つの核酸のメチル化状態を決めることを含み、前記少なくとも一つの核酸のメチル化状態は、胃組織の細胞増殖性障害（形成異常）がないサンプルから分離した核酸のメチル化状態と比較され得る。

本発明の他の実施形態では、前記メチル化遺伝子マーカーを利用して胃癌を形成する可能性がある細胞の早期診断が可能である。癌細胞でメチル化されると確認された遺伝子が臨床的にまたは、形態学的に正常と見える細胞でメチル化されると、前記正常と見える細胞は癌へと進行していることを示している。従って、正常と見える細胞での胃癌特異的遺伝子のメチル化を検出することで、胃癌を早期診断することができる。特に本発明の一実施例では、ＳＤＣ２（シンデカン２）遺伝子を、胃癌の前癌病変である胃ポリープの診断に利用できることを発見したことがある。

本発明では、前記メチル化遺伝子マーカーを利用して胃癌を形成する可能性がある細胞の早期診断を可能とする。癌細胞でメチル化されていると確認された遺伝子が臨床的にまたは、形態学的に正常と見える細胞でメチル化されると、前記正常と見える細胞は癌へと進行していることを示している。従って、正常と見える細胞での胃癌特異的遺伝子のメチル化を確認することで、胃癌を早期診断することができる。

本発明のメチル化マーカー遺伝子を利用すると、サンプルにおいて胃組織の細胞増殖性障害（形成異常）を検出することができる。前記検出方法は被検体から分離した少なくとも一つの核酸を含むサンプルを核酸のメチル化状態を決定できる少なくとも一つの薬剤と接触させることを含む。前記方法は少なくとも一つの核酸における少なくとも一つの領域のメチル化を検出することを含み、前記核酸のメチル化は胃細胞の異常増殖（形成異常の進行）を持たないサンプルに存在する核酸の同じ領域のメチル化状態と異なる。

本発明のさらに他の実施形態において、胃癌で特異的にメチル化される遺伝子のメチル化頻度を調べて、胃癌への進行の可能性を持つ組織のメチル化頻度を決めることによって組織の胃癌への進行の可能性を評価することができる。

従って、さらに別の態様において、本発明は、下記工程を含む、胃ポリープまたは胃癌の検出方法に関する：
（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する工程；及び
（ｂ）前記分離したＤＮＡにおける胃ポリープまたは胃癌バイオマーカーであるＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を測定して胃ポリープまたは胃癌を検出する工程。

本発明において、前記（ｂ）工程は、前記遺伝子のプロモーター、５‘ ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ；非翻訳領域）、イントロンおよびエクソンのうちいずれか一つの領域のメチル化を測定することにより実行され得る。好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列を持つＳＤＣ２遺伝子の領域のＣｐＧ島のメチル化を測定し得る。

本発明において、前記（ｂ）工程は、ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ）、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を利用したＰＣＲ解析、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップベースの解析、パイロシークエンシングおよびバイサルファイトシークエンシングで構成された群から選択される方法によって実行され得る。また、前記臨床サンプルは、癌の疑いがある患者、または診断被検体由来の組織、細胞、血液、血漿、糞便及び尿で構成された群から選択され得るが、これに制限されるものではない。

本発明の一実施形態において、前記遺伝子のメチル化を検出する方法は、下記工程を含んでもよい：（ａ）ＤＮＡを含有した臨床サンプルを調製する工程、（ｂ）前記臨床サンプルからＤＮＡを分離する工程、（ｃ）前記分離したＤＮＡをＳＤＣ２遺伝子のプロモーターまたはイントロンのＣｐＧ島を含む断片を増幅できるプライマーを使って増幅する工程、及び（ｄ）前記ＤＮＡが前記（ｃ）工程で増幅されたかどうかに基づいて、イントロンがメチル化されたかどうかを決める工程。

本発明の他の実施形態において、ＳＤＣ２（ＮＭ＿００２９９８、シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のメチル化状態をキットを利用して検出することによって、サンプルにおける胃組織の細胞増殖性障害（形成異常）を診断することができる。

従って、さらに別の実施形態において、本発明は、ＳＤＣ２（ＮＭ＿００２９９８、シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島を含む断片を増幅するためのＰＣＲプライマー対と前記プライマー対によって増幅されたＰＣＲ産物をパイロシーケンスするためのシーケンスプライマーを含有する胃ポリープまたは胃癌診断用キットに関する。

本発明において、前記ＰＣＲプライマー対は、配列番号２及び３で表されるプライマー対、または配列番号５及び６で表されるプライマー対であり得る。

本発明において、前記シーケンスプライマーは、配列番号４または７で表されるプライマーであり得る。

本発明の他の実施形態において、ＳＤＣ２（ＮＭ＿００２９９８、シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のメチル化状態を核酸チップを利用して検出することによって、サンプルにおける胃組織細胞の細胞増殖性障害（形成異常）を診断することができる。

従って、さらに他の態様において、本発明は、ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島を含む断片と厳格な条件下でハイブリダイゼーションできるプローブが固定されている胃ポリープまたは胃癌診断用核酸チップに関する。

本発明において、前記プローブは、配列番号８乃至１３で表される塩基配列で構成される群から選択され得、その具体的な例は以下のとおりである:

本発明の診断用キットまたは核酸チップを利用すると、サンプルにおける胃組織の細胞の異常増殖（形成異常の進行）を決めることができる。前記方法は、サンプルから分離した少なくとも一つの核酸のメチル化状態を決めることを含み、前記少なくとも一つの核酸のメチル化状態は、胃細胞の異常増殖（形成異常の進行）がないサンプルから分離した核酸のメチル化状態と比較することを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、前記キットまたは核酸チップを利用してマーカー遺伝子のメチル化を検査することによって、形質転換された胃癌細胞を検出することができる。

本発明のさらに他の実施形態において、前記キットまたは核酸チップを利用してマーカー遺伝子のメチル化を検査することによって、胃癌を診断することができる。

本発明のさらに他の実施形態において、正常表現型を示すサンプルにおいて、前記キットまたは核酸チップを利用してマーカー遺伝子のメチル化を検査することによって、胃癌への進行の可能性を診断することができる。本発明において使用されるサンプルは、固体または液体組織、細胞、糞便、尿、血清または、血漿を使うことができる。

本明細書で使われる主な用語の定義は以下のとおりである。
本明細書で使用される「細胞形質転換」は、正常から異常に、非腫瘍性から腫瘍性に、未分化から分化に、幹細胞から非幹細胞にといった細胞の特徴がある形態から他の形態に変わることを意味する。加えて、前記形質転換は、細胞の形態、表現型、生化学的性質等によって認識され得る。

本明細書において使用される癌の「早期検出」は、転移する前に癌の可能性を発見することであり、好ましくは、組織または細胞で形態学的変化が観察される前に発見することである。加えて、細胞形質転換の「早期検出」は、細胞が形質転換していると形態学的に規定される前の初期段階で形質転換が起きる可能性が高いことをいう。

本明細書において使用される「ハイパーメチル化」はＣｐＧ島のメチル化を意味する。
本明細書において使用される「サンプル」、または「臨床サンプル」は、行われる分析の種類に応じて、個人、体液、細胞株、組織培養物等から得られる任意の生物学的サンプルを含む広義のものを意味する。哺乳動物から体液及び組織生検を獲得する方法は、通常広く知られている。好ましいソースは、腸の生検（ｂｉｏｐｓｙ）である。

胃癌のバイオマーカーと正常細胞との間の比較のための癌細胞の使用
本発明において、「正常」細胞は、いずれの異常な形態学的なまたは細胞学的な変化を示さない細胞を意味する。「腫瘍」細胞は、癌細胞を意味して、「非腫瘍」細胞は、病症組織の一部であるが、腫瘍部位ではないと判断される細胞を意味する。
本発明は一態様において、胃癌とＳＤＣ２（ＮＭ＿００２９９８、シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のハイパーメチル化との間の関連性の発見に基づいたものである。

本発明の別の実施形態において、本発明のキットまたは核酸チップを使用して、被検体由来の少なくとも一つの核酸のメチル化段階を決めることにより、胃組織細胞の細胞増殖性障害を早期診断することができる。前記少なくとも一つの核酸のメチル化段階は、胃組織の細胞増殖性障害を持たない被検体から分離した少なくとも一つの核酸のメチル化状態と比較され得る。核酸は、ＣｐＧ島などのＣｐＧ含有核酸であることが好ましい。

本発明の別の実施形態において、本発明のキットまたは核酸チップを使用して、被検体由来の少なくとも一つの核酸のメチル化を決めることにより、胃組織の細胞増殖性障害を診断することができる。本明細書において、前記核酸は、ＳＤＣ２（ＮＭ＿００２９９８、シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）であり得る。この実施形態において、前記少なくとも一つの核酸のメチル化は、胃組織の細胞増殖性障害に対する素因を有しない被検体から分離した少なくとも一つの核酸のメチル化状態と比較され得る。

本明細書において使用される「素因」とは、細胞増殖性障害にかかりやすい性質を意味する。細胞増殖性障害に対する素因を持った被検体は、細胞増殖性障害を持っていないが、細胞増殖性障害を持っている可能性が増加した被検体をいう。

本発明は他の態様において、核酸を含むサンプルをサンプルのメチル化状態を決定できる薬剤と接触させて、少なくとも一つの核酸の少なくとも一つの領域のメチル化を決定することを含む胃組織の細胞増殖性障害を診断する方法を提供する。ここで、少なくとも一つの核酸の少なくとも一つの領域のメチル化は、細胞の異常増殖を持たない被検体に存在する核酸の同じ領域のメチル化状態と異なる。

本発明の方法は、被検体から分離した少なくとも一つの核酸の少なくとも一つの領域のメチル化を決める段階を含む。本明細書において使用される「核酸」または「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはこれらの断片、一本鎖または、二本鎖のゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、センスまたはアンチセンス鎖のゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）、あるいは、任意の自然起源または合成起源のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質をいう。核酸がＲＮＡであると、デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＴの代わりに、それぞれリボヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＵを使用できることは、当該分野において通常の知識を有する者には明らかである。
異なってメチル化されたＣｐＧ島の存在を検出できる核酸であれば、いずれのものも本発明において使用可能である。前記ＣｐＧ島は、核酸配列でＣｐＧが豊富な領域である。

メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）
本発明において、精製された、または精製されていない形態のいかなる核酸サンプルが使用可能であり、ターゲット部位（例えば、ＣｐＧ含有核酸）を含有する核酸配列を含有するか含有すると疑われるいかなる核酸が使用可能である。示差的にメチル化できる核酸領域がＣｐＧ島で、これは他のジヌクレオチドＣｐＧ核酸領域と比較して高い密度を持つ核酸配列である。ＣｐＧダブレットは、Ｇ＊Ｃ塩基対の割合で予測した時、脊椎動物ＤＮＡにおいてわずか２０％程度の頻度で現れる。特定領域において、ＣｐＧダブレットの密度は、ゲノムの残りと比較して１０倍も高い予測値に達する。ＣｐＧ島は、平均Ｇ＊Ｃ含有量が約６０％で、対照的に、バルクＤＮＡは平均４０％を示す。ＣｐＧ島は、典型的に約１〜２kbの長さのＤＮＡ区間の形態をとり、ヒトゲノムには約４５，０００個のＣｐＧ島が存在する。

種々の遺伝子で、ＣｐＧ島は、プロモーターの上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）から始まって、下流の転写領域まで伸長する。プロモーターにおけるＣｐＧ島のメチル化は、通常遺伝子の発現を抑制させる。ＣｐＧ島は、遺伝子コード領域の３'領域だけでなく、遺伝子コード領域の５'領域も囲むことができる。従って、ＣｐＧ島は、プロモーター領域を含む調節領域のコード配列の上流、コード領域（例えば、エクソン）、コード領域の下流、例えば、エンヘンサー領域及びイントロンを含む核酸の複数の領域領域で発見される。

通常、ＣｐＧ含有核酸はＤＮＡである。しかし、本発明の方法は、例えば、ＤＮＡ、またはＤＮＡとｍＲＮＡを含むＲＮＡとを含有するサンプルを適用することができ、ここでＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または、二本鎖であってもよく、またはサンプル中にＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含有することを特徴とする。

核酸混合物も使うことができる。検出される特定の核酸配列は、大きい分子の分画であってもよく、特定の配列が全体の核酸を構成するように、分離した分子形態で最初に存在してもよい。試験される核酸配列は、純粋な形態で最初に存在する必要はなく、核酸は全ヒトＤＮＡが含まれているものなどの複雑な混合物の微量な分画であってもよい。メチル化されたＣｐＧ島を検出するのに使われるサンプルに含まれる核酸は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９）に記載されたものなどの種々の技法で抽出できる。

被検体から分離した核酸は、被検体の生物学的サンプルによって得られる。胃癌や胃癌の進行段階を検出することが望ましい場合、擦過や生検で胃組織から核酸を分離し得る。このようなサンプルは、当業者に公知の種々の医学的手順によって得てもよい。
本発明の一様態で、被検体から得られたサンプルの核酸のメチル化状態は、胃組織の細胞増殖性障害がない被検体の核酸の同じ領域と比較されたハイパーメチル化である。本明細書において使用されるハイパーメチル化とは、一つ以上の核酸でメチル化された対立遺伝子が存在することをいう。胃組織の細胞増殖性障害がない被検体由来の核酸は、同じ核酸を検査した時、検出可能なメチル化対立遺伝子を含有しない。

個々の遺伝子及びパネル
本発明は、診断または予後マーカーとして、各遺伝子を別々に使用すること、またはいくつかのマーカー遺伝子を組み合わせてパネルディスプレー形態にして使用することが予測され得、その結果、いくつかのマーカー遺伝子は、全体のパターンまたはメチル化された遺伝子のリストについて検出して、信頼性及び効率性を向上させることができることが理解される。さらに本発明で確認された任意の遺伝子は、個々にまたは、本明細書に記載された任意の他の遺伝子と組み合わされた遺伝子セットとして使用できる。または、遺伝子はメチル化された遺伝子の数及びその重要度に応じて順位を付けることができ、および重み付けを行うことができ、癌を発症する可能性のレベルを割り当てることができる。このようなアルゴリズムは、本発明の範囲に属する。

メチル化検出方法
本発明は、臨床サンプルから分離したゲノムＤＮＡをバイサルファイトで処理して、ＳＤＣ２ＣｐＧ部位に変換すること、およびこれに相補的であるかハイブリダイゼーションできる少なくとも一つの合成オリゴヌクレオチドを利用して、変換されたＳＤＣＣｐＧ部位のメチル化を検出することを含む、胃癌または胃ポリープを診断する方法に関する。

メチル化特異的ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ）
ゲノムＤＮＡをバイサルファイトで処理すると、５’−ＣｐＧ−３’領域のシトシンがメチル化されている場合にはインタクトのままであるが、メチル化されていない場合にはシトシンはウラシルに変わることになる。従って、バイサルファイト処理後変換された塩基配列に基づいて、５'−ＣｐＧ−３'塩基配列が存在する領域に対応するＰＣＲプライマーセットを作製した。本明細書において、メチル化された塩基配列に対応するＰＣＲプライマーセットとメチル化されていない塩基配列に対応するプライマーセットの二種類のプライマーセットを作製した。ゲノムＤＮＡをバイサルファイトで変換させた後、前記二種類のプライマーセットを利用してＰＣＲにより増幅すると、ゲノムＤＮＡがメチル化されている場合にはメチル化された塩基配列に対応するプライマーを使用してＰＣＲ混合物においてＰＣＲ産物が検出され、逆にゲノムＤＮＡがメチル化されていない場合には非メチル化に対応するプライマーを使用して、ＰＣＲ混合物においてゲノムＤＮＡが検出される。このメチル化は、アガロースゲル電気泳動方法で定量的に分析することができる。

リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ）
リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲは、メチル化特異的ＰＣＲ方法をリアルタイム測定方法に修正したもので、ゲノムＤＮＡをバイサルファイトで処理すること、メチル化された塩基配列に対応するＰＣＲプライマーをデザインすること、これらプライマーを利用してリアルタイムＰＣＲを行うことを含む。ゲノムＤＮＡのメチル化を検出する方法は、増幅された塩基配列と相補的なＴａｎＭａｎプローブを利用して検出する方法と、Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎを利用して検出する方法の二方法がある。従って、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲにより、メチル化されたＤＮＡを選択的に定量分析することができる。ここで、ｉｎｖｉｔｒｏメチル化ＤＮＡサンプルを利用して標準曲線をプロットして、標準化のために塩基配列内に５'−ＣｐＧ−３'配列を含まない遺伝子も陰性対照群として増幅してメチル化の程度を定量分析した。

パイロシーケンス
パイロシーケンシング方法は、バイサルファイトシーケンシング方法を定量的なリアルタイムシーケンシングに修正した方法である。バイサルファイトシーケンシングと同じようにゲノムＤＮＡをバイサルファイトで処理して変換させた後、５'−ＣｐＧ−３'塩基配列を含まない領域に該当するＰＣＲプライマーを作製した。ゲノムＤＮＡをバイサルファイトで処理し、前記ＰＣＲプライマーで増幅した後、シーケンシングプライマーを利用してリアルタイム塩基配列分析を行った。５'−ＣｐＧ−３'領域でシトシンとチミンの量を分析してメチル化の程度をメチル化指数として示した。

メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を利用したＰＣＲ、定量ＰＣＲ及びＤＮＡチップアッセイ
メチル化ＤＮＡにだけ特異的に結合するタンパク質をＤＮＡと混ぜると、タンパク質は、メチル化ＤＮＡにだけ特異的に結合するため、メチル化特異的ン結合タンパク質を使用するＰＣＲまたは、ＤＮＡチップアッセイのいずれかにより、メチル化ＤＮＡだけを選択的に分離することができる。ゲノムＤＮＡをメチル化特異的結合タンパク質と混ぜた後、メチル化されたＤＮＡだけを選択的に分離した。これら分離したＤＮＡをプロモーター領域に対応するＰＣＲプライマーを利用して増幅した後、アガロースゲル電気泳動でＤＡＮのメチル化を測定した。
また、定量ＰＣＲ方法でもＤＮＡのメチル化を測定することができ、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質により分離したメチル化ＤＮＡを、蛍光プローブで標識して相補的なプローブを含むＤＮＡチップにハイブリダイゼーションさせることでＤＮＡのメチル化を測定することができる。ここで、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質は、ＭＢＤ２ｂｔ(トランケート型メチルＣｐＧ結合ドメインタンパク質２)であり得るが、これに制限されない。

示差的メチル化の検出−メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ
示差的メチル化の検出は、メチル化されないＣｐＧ部位だけを切断するメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼと核酸サンプルを接触させることで行える。

別の反応で、前記サンプルをメチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位をの両方を切断するメチル化感受性制限酵素のアイソシゾマー（ｉｓｏｃｈｉｚｏｍｅｒ）とさらに接触させて、メチル化された核酸を切断した。
特異的プライマーを核酸サンプルに添加し、任意の慣例的な方法で核酸を増幅させた。メチル化感受性制限酵素で処理したサンプルに増幅産物が存在するが、メチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーで処理したサンプルに増幅産物が存在しなければ、分析された核酸領域にメチル化が起きたことを示す。しかし、メチル化感受性制限酵素を処理したサンプルに増幅産物が存在せず、メチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーで処理したサンプルにも増幅産物が存在しないことは、分析された核酸領域にメチル化が起きなかったことを示す。

本明細書において使用される「メチル化感受性制限酵素」は、認識部位の一部としてＣＧを含み、Ｃがメチル化されていない場合と比較してＣがメチル化されている場合に活性を持つ制限酵素である（例えば、ＳｍａＩ）。メチル化感受性制限酵素の非制限的な例として、ＭｓｐI、ＨｐａＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ及びＮｏｔＩが含まれる。前記酵素は単独でまたは組み合わせて使用可能である。他のメチル化感受性制限酵素の例としては、例えば、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩが挙げられるが、これに限定されない。

メチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーはメチル化感受性制限酵素と同じ認識部位を認識する制限酵素であるが、メチル化されたＣＧとメチル化されていないＣＧを両方切断し、その例としては、ＭＳＰIが挙げられる。

本発明のプライマーは、増幅される遺伝子座の各鎖と「実質的に」相補性を持つようにデザインされ、前述した通り、適切なＧまたはＣヌクレオチドを含む。これは、重合反応を行う条件下でプライマーがそれぞれの核酸鎖とハイブリダイゼーションするのに十分に相補性でなければならないことを意味する。本発明のプライマーは、増幅工程に使われ、前記増幅過程は、例えば、ＰＣＲといった、ターゲット遺伝子座が多くの反応段階を経ながら指数関数的に増加する酵素連鎖反応である。典型的には、一つのプライマー（アンチセンスプライマー）は、遺伝子座のネガティブ（−）鎖に対して相同性を持って、他のプライマー（センスプライマー）はポジティブ（＋）鎖に対し相同性を持つ。変性された核酸にプライマーがアニーリングされると、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）のような酵素及びヌクレオチドのような反応物によって核酸鎖が伸長され、その結果、ターゲット遺伝子座配列を含有する＋鎖と−鎖が新たに合成される。前記新たに合成されたターゲット遺伝子座が鋳型としても使われ、変性、プライマーアニーリング及び伸長のサイクルが繰り返されると、ターゲット遺伝子座配列の指数関数的な合成が起こる。得られる反応産物は、使われた特異的プライマーの末端と対応する末端を持つ別個の二本鎖核酸である。
前記増幅反応は、当分野で一般的に使われているＰＣＲである。しかし、リアルタイムＰＣＲまたは等温酵素（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｅｎｚｙｍｅ）を使った線形増幅といった代替的な方法も使用可能であり、さらにマルチプレックス増幅反応も使用可能である。

バイサルファイトシークエンシング方法
メチル化ＣｐＧを含有した核酸を検出する他の方法は、核酸を含有したサンプルを、非メチル化シトシンを修飾させる試薬と接触させる工程及びメチル化非依存的（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）オリゴヌクレオチドプライマーを使用してサンプルのＣｐＧ含有核酸を増幅させる工程を含む。ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、修飾されたメチル化核酸と非メチル化核酸とを区別せずに核酸を増幅する。前記増幅された産物をシークエンシングプライマーを利用してＳａｎｇｅｒ方法でシークエンシングするか、メチル化核酸の検出のためのバイサルファイト（bisulfite）シークエンシングと関連して記載されている次世代シークエンシング（ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）方法でシーケンシングする。ここで次世代シークエンシング方法は、シーケンシングバイシンセシスまたはシーケンシングバイライゲーション技法で行われ得る。この方法の特徴は、細菌のクローンを調製する代わりに一本鎖ＤＮＡ断片を空間的に分離してｉｎｓｉｔｕで増幅して（クローン増幅）、シークエンシングを行うことである。この時、数十万個の断片を同時に読み取るので、この方法は、大量並列シーケンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙｐａｒａｌｌｅｌｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳ））法と呼ばれることもある。

典型的には、モノあるいはジヌクレオチドを次々と付けながらシグナルを得るシークエンシングバイシンセシス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂｙｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）方法を使用する。この方法の例として、パイロシークエンシング、ｉｏｎｔｏｒｒｅｎｔ、およびＳｏｌｅｘａ方法が挙げられる。
シークエンシングバイシンセシスに基づくＮＧＳシステムとしては、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社の４５４プラットフォーム、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）社のＨｉＳｅｑプラットフォーム、ライフテクノロジー（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社のＩｏｎＰＧＭプラットフォーム、およびパシフィックバイオサイエンス（ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）社のＰａｃＢｉｏプラットフォームがある。４５４プラットフォームとＩｏｎＰＧＭプラットフォームは、クローン増幅（ｃｌｏｎａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のためにエマルジョンＰＣＲを使用して、ＨｉＳｅｑプラットフォームはブリッジ増幅（Ｂｒｉｄｇｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用する。シークエンシングバイシンセシス方法は、一個のヌクレオチドを連続して付加することによりＤＮＡを合成する時発生するリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、水素イオン、あるいは蛍光を検出して配列を読んでいく。配列を検出する方法において、４５４プラットフォームはパイロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｅｕｎｃｉｎｇ）に基づいており、ＩｏｎＰＧＭプラットフォームは水素イオン検出に基づいている。ＨｉＳｅｑプラットフォームとＰａｃＢｉｏプラットフォームは、蛍光を検出して配列を読み取る。

シークエンシングバイライゲーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂｙｌｉｇａｔｉｏｎ）は、ＤＮＡリガーゼを利用するシークエンシング技術であり、ＤＮＡヌクレオチド配列の特定位置に存在するヌクレオチドを確認するために行われる。ポリメラーゼを使用する多くのシークエンシング技術とは異なり、シーケンシングバイライゲーションは、ポリメラーゼを使用せずＤＮＡリガーゼがミスマッチ配列をライゲーションしないことを特徴とする。ＳＯＬｉＤシステムがこの方法に対応する。この技法では、シークエンシングプロセスのステップごとに二個のヌクレオチドを読み取る。読み取りは、プライマーリセット（ｐｒｉｍｅｒｒｅｓｅｔ）により個々に五回繰り返すので、最終的には各ヌクレオチドを二回取ってデータ正確度を高める。

シークエンシングバイライゲーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂｙｌｉｇａｔｉｏｎ）法の場合、１６個の組合せで作られたジヌクレオチドプライマーセットのうち、対象のヌクレオチド配列に対応するジヌクレオチドプライマーが順次ライゲーションされて、このライゲーションの組合せを最終的に分析して対象のＤＮＡのヌクレオチド配列が決定される。

メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質または抗体を利用したシークエンシング、シークエンシングバイシンセシスまたはシークエンシングバイライゲーション
メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質または抗体を利用したシークエンシングまたは次世代シークエンシング方法は、メチル化ＤＮＡに特異的に結合するタンパク質または抗体をＤＮＡと混ぜると、その後メチル化ＤＮＡに特異的に前記タンパク質または抗体が結合するので、メチル化ＤＮＡだけを選択的に分離することができる。本発明において、ゲノムＤＮＡをメチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質と混ぜた後、メチル化されたＤＮＡだけを選択的に分離した。これらの分離したＤＮＡをＰＣＲプライマーを利用して増幅した後、Ｓａｎｇｅｒ方法、シークエンシングバイシンセシスまたはシークエンシングバイライゲーション方法で、ＤＮＡがメチル化されているかどうかを測定した。

ここで次世代シークエンシング方法は、シークエンシングバイシンセシスまたはシークエンシングバイライゲーション方法で行われ得る。

さらにメチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質はＭＢＤ２ｂｔであり得るが、これに制限されず、抗体は５‘−メチル−シトシンに制限されない。

キット（Ｋｉｔ）
本発明は、被検体の細胞増殖性障害を検出するのに有用なキットを提供している。本発明のキットは、サンプルを入れる仕切られたキャリア手段、サンプルをパイロシーケンスするための５'−ＣｐＧ−３'塩基配列の増幅のためのＰＣＲプライマーを含有する第２の容器、及び増幅されたＰＣＲ産物をパイロシーケンスするためのシーケンスプライマーを含有する第３の容器を含む一つ以上の容器を含む。
キャリア手段は、バイアル、チューブのような一つ以上の容器を含有するのに適しており、各容器は本方法に使われる別個の要素の１つを含有する。本発明の方法についてのの明細書で提供される説明を考慮すれば、当業者は、容器中の必要な試薬の分配を容易に決定することができる。

基質
ターゲット核酸領域が増幅された後、核酸配列の存在を検出するために、前記核酸増幅産物は固体支持体（基質）に結合した公知の遺伝子プローブとハイブリダイゼーションできる。
本明細書において使用される「基質」は、物質、構造、表面、または、材料と関連して使用される場合、非生物学的な、合成的な、無生物の、平面の、または球型の表面を含む組成物（特異的結合、ハイブリダイゼーションまたは触媒認識部位あるいは複数の異なる認識部位または表面、構造または材料で構成された異なる分子種の数を越える数多くの異なる認識部位を含まないことがこれまでに知られている）を意味する。前記基質の例としては、例えば、半導体、（有機）合成金属、合成半導体、インシュレーター及びドーパント；金属、合金、元素、化合物及びミネラル；合成され、切断され、エッチングされ、リソグラフされ、プリントされ、機械にかけられ、そしてマイクロファブリケートされたスライド、装置、構造及び表面；産業的ポリマー、プラスチック、膜、シリコン、ケイ酸、ガラス、金属及びセラミック；ならびに木、紙、ボール紙、綿、ウール、布、織り繊維及び不織繊維、材料及び織物ならびに両性表面（ａｍｐｈｉｂｉｏｕｓｓｕｒｆａｃｅ）が挙げられるが、これに限定されない。
いくつかの種類の膜は、当分野で核酸配列に対し付着力を持つと知られている。これらの膜の特定の非制限的な例として、ニトロセルロースまたはポリビニルクロライド、ジアゾ化（ｄｉａｚｏｔｉｚｅｄ）ペーパー及びＧＥＮＥＳＣＲＥＥＮ^ＴＭ、ＺＥＴＡＰＲＯＢＥ^ＴＭ（Ｂｉｏｒａｄ）及びＮＹＴＲＡＮ^ＴＭ等の他の市販されている膜のような遺伝子発現検出用の膜が挙げられる。ビーズ、グラス、ウェハー及び金属基質も含まれる。このような目的物に核酸を付着させる方法は、当分野で良く知られている。あるいは、液相中でもスクリーニングが行える。

ハイブリダイゼーション条件
核酸ハイブリダイゼーション反応で、ストリンジェンシーの特定レベルを達成するために使われる条件は、ハイブリダイゼーションされる核酸の性質によって異なる。例えば、ハイブリダイゼーションされる核酸領域の長さ、相同性レベル、ヌクレオチド配列組成（例えば、ＧＣ／ＡＴ含有量）及び核酸タイプ（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）等がハイブリダイゼーション条件を選択するのに考慮され得る。追加的な考慮事項は、核酸の１つが、例えば、フィルター等に固定化されているのか否かである。
進行性のより高いストリンジェンシー条件の例としては、次のようになる：室温の２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）、室温の０．２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェンシー条件）、４２℃での０．２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中程度のストリンジェンシー条件）、約６８℃で０．１ＸＳＳＣ（高ストリンジェンシー条件。洗浄はこれらの中一つの条件のみを使って行うことができ、例えば高ストリンジェンシー条件、または、前記条件の各々を使え、前記記載された順に各々１０〜１５分間、前記記載された工程を全部または一部繰り返して行える。しかし、前述した通り、最適条件は、含まれた特定のハイブリダイゼーション反応によって異なり、経験的に決めることができる。一般に、対象のプローブのハイブリダイゼーションには高いストリンジェンシー条件が使われる。

標識（Ｌａｂｅｌ）
対象のプローブは検出できるように標識され、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、バイオ発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素で標識できる。こようなプローブを適切に標識することは当分野で広く知られており、任意の慣例的な方法で行える。

以下、本発明を実施例に関してさらに詳述する。これらの実施例は単に説明するためのものであり、本発明の範囲が制限されないことは当業者にとって自明である。

実施例1:胃ポリープ患者組織でのＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化測定
ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の、前癌病変である胃ポリープに対する早期診断の有用性を評価するために正常胃組織（Ｂｉｏｃｈａｉｎ社、５例）と胃ポリープ患者のパラフィン組織（忠南（チュンナム）大学病院のバイオバンクにより提供；低度形成異常１０例、および高度形成異常１０例）からゲノムＤＮＡを分離した。パラフィン組織からゲノムＤＮＡの分離は、ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｃｒｏＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用してメーカーの説明書に従って行った。

メチル化測定は、定量的パイロシークエンシング方法を利用して行った。分離したゲノムＤＮＡ２００ｎｇにＥＺＤＮＡメチル化−Ｇｏｌｄｋｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を利用してバイサルファイトで処理した。前記ＤＮＡをバイサルファイトで処理すると、メチル化されていないシトシンはウラシルに修飾されて、メチル化されたシトシンは変化なしに残ることになる。前記バイサルファイトで処理されたＤＮＡを滅菌蒸溜水２０ｕｌで溶出させてパイロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。前記ＳＤＣ２遺伝子に対するパイロシークエンシングを行うためのＰＣＲおよびシークエンシングプライマーは、ＰＳＱアッセイデザインプログラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して設計した。各遺伝子のメチル化測定のためのＰＣＲおよびシークエンシングプライマーは、表１に示される。

バイサルファイトで処理されたゲノムＤＮＡ２０ｎｇをＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲ増幅において、ＰＣＲ反応溶液（バイサルファイトで処理されたゲノムＤＮＡ２０ｎｇ、１０ＸＰＣＲバッファー（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）５ユニット、２．５ｍＭｄＮＴＰ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）４μｌ、およびＰＣＲプライマー２μｌ（５ｐｍｏｌｅ/ｕｌ）を使用して、ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った：９５℃で５分間あらかじめ変性した後、９５℃で４０秒変性、６０℃で４５秒アニーリング、および７２℃で４０秒伸長で４５サイクル実施した後、７２℃で５分間最後の伸長を行った。前記ＰＣＲ産物の増幅は２．０％アガロースゲルにおいて電気泳動で確認した。

前記増幅されたＰＣＲ産物をＰｙｒｏＧｏｌｄ試薬（Ｂｉｏｔａｇｅ、ＵＳＡ）で処理した後、ＰＳＱ９６ＭＡシステム（Ｂｉｏｔａｇｅ、ＵＳＡ）を利用してメーカーの説明書に従って、パイロシークエンシングを行った。前記パイロシークエンシング後、メチル化指数（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ）を計算することによってＤＮＡのメチル化レベルを測定した。メチル化指数は、各ＣｐＧ島にシトシンが結合する平均率を決定することにより計算した。

その結果、図１に示された通り、正常胃組織では全くメチル化を示さず、低度形成異常では９０．０％（９/１０）、そして高度形成異常では１００％（１０/１０）のメチル化頻度を示した。

このような結果が示すのは、ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子は胃癌の前癌病変である胃ポリープでも高いレベルおよび頻度のメチル化陽性を示すことであり、胃ポリープの診断および胃癌の早期診断のためのバイオマーカーとしての有用性があることを示す。

実施例２：胃癌細胞株及び胃癌組織でのバイオマーカー遺伝子のメチル化測定
胃ポリープでメチル化が確認されたＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子が胃癌診断用バイオマーカーとしても有用性があるか試験するために、実施例１に記載されているものと同じ方法でパイロシークエンシングを行った。胃癌細胞株であるＡＧＳ（韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢＮｏ.２１７３９）、そして４１名の胃癌患者の癌組織およびこれに隣接した正常組織（忠南（チュンナム）大学病院のバイオバンクにより提供）からＱＩＡａｍｐＤＮＡｍｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用してメーカーの説明書に従ってゲノムＤＮＡを分離した。分離したゲノムＤＮＡ２００ｎｇをＥＺＤＮＡメチル化−Ｇｏｌｄｋｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を利用してバイサルファイトで処理した。ゲノムＤＮＡをバイサルファイトで処理すると、メチル化されていないシトシンはウラシルに修飾されて、メチル化されたシトシンは変化ぜず残ることになる。前記バイサルファイトで処理されたＤＮＡを滅菌蒸溜水２０μｌで溶出させてパイロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。

前記ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の胃癌細胞株でのメチル化レベルをパイロシークエンシング方法により定量的に測定した結果を図２Ａに示す。これからわかるように、胃癌細胞株であるＡＧＳで高いレベルでＳＤＣ２バイオマーカーが発現した。これにより、ＳＤＣ２遺伝子は胃癌細胞株で高いメチル化レベルを示すことによって、胃癌診断用バイオマーカーとしての有用性を持つことを示したことを示唆する。

そこで、この示唆を検証するために、胃癌組織サンプルにおいてＳＤＣ２遺伝子のメチル化検証実験を行った。

胃癌組織でのＳＤＣ２遺伝子のメチル化の検証のために様々な病期における胃癌組織（病期１：１３人、病期２：９人、病期３：１１人、および病期４：８人）におけるＳＤＣ２遺伝子のメチル化レベルを実施例１に記載されているものと同じ方法で測定した。

その結果、図２Ｂに示された通り、患者でない健常者の胃組織と胃癌組織に隣接した正常胃組織に比べて胃癌組織でＳＤＣ２遺伝子のメチル化レベルが顕著により高かった。

また、胃癌診断に対するＳＤＣ２遺伝子の敏感度および特異度を評価するためにＲＯＣ曲線分析を行った結果、前記遺伝子は、敏感度は９０．２％と高く、そして特異度は１００％で非常に優秀であった（図２Ｃ）。このような結果は、ＳＤＣ２メチル化バイオマーカー遺伝子は、胃癌診断としての有用性を有していることを示す。

実施例３：胃癌患者血清でのＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化測定
ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の、血清を利用した胃癌診断用バイオマーカーとしての有用性を試験するために、胃癌患者血清でのＳＤＣ２バイオバーカー遺伝子のメチル化の有無を定量的メチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ；ｑＭＳＰ）方法により測定した。

この目的のために、バイサルファイトで処理されたメチル化されたＳＤＣ２遺伝子を特異的に増幅できる二つのＰＣＲプライマー（ＩＤＴ社、米国）と蛍光プローブ（ＩＤＴ社、米国）を設計した。バイサルファイトで処理された血清ＤＮＡの量と質を決定するために、ＡＣＴＢ遺伝子を内部コントロールとして使用した。ｑＭＳＰに使用したＰＣＲプライマーおよび蛍光プローブの配列は下記の表２に示す。

ゲノムＤＮＡを、８００μｌの血清からＤｙｎａｌＢｅａｄｓＳＩＬＡＮＥｖｉｒａｌＮＡｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用してメーカーの説明書に従って分離した。前記分離したゲノムＤＮＡにＥＺＤＮＡメチル化−Ｇｏｌｄｋｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ,ＵＳＡ）を利用して、バイサルファイトで処理した後、滅菌蒸溜水２０μｌで溶出してｑＭＳＰに使用した。前記バイサルファイトで処理されたゲノムＤＮＡ１／３体積をｑＭＳＰに使用した。リアルタイムＰＣＲは、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅＰｒｏｂｅＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用してＲｏｔｏｒＧｅｎｅ−ＱＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲシステム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して行った。最終体積２０ｕｌを、次の条件下でリアルタイムＰＣＲに供した：ＳＤＣ２については９５℃ １０分、ならびに９５℃ １０秒、６２℃ １秒、および７２℃ ２０秒から各々なる５０サイクル、ＡＣＴＢについては９５℃ １０分ならびに、９５℃ １０秒、５８℃ ６０秒から各々なる５０サイクル。メチル化レベルは、相対サイクル閾値（ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＣｔ）方法でメチル化参照パーセンテージ（ＰｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＭｅｔｈｙｌａｔｅｄＲｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＰＭＲ）として測定して、人為的にメチル化させた胃癌細胞株ＡＧＳ（韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢＮｏ.２１７３９））のゲノムＤＮＡを参照として使用した。ＰＭＲを以下の式を使用して計算した:ＰＭＲ＝２^{−△△Ｃｔ}Ｘ１００；△△Ｃｔ＝[（Ｃ_{ｔＳＤＣ２}−Ｃ_{ｔＡＣＴＢ}）_サンプル]−[（Ｃ_{ｔＳＤＣ２}−Ｃ_{ｔＡＣＴＢ}）_ＡＧＳ]。

ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の血清において胃癌を診断する能力を評価するために、１３０人の健常者の血清、そして４０人の胃癌患者の血清におけるＤＮＡをｑＭＳＰに供した。

その結果、図３Ａに示された通り、健常者血清ではほとんどＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化がされていないか、またはまったくされておらず、胃癌患者の血清は高いレベルおよび頻度でＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子がメチル化されていた。特に、早期胃癌である病期１期と２期の血清は高いＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化レベルおよび頻度を示すことを確認した。

ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の胃癌診断に対する敏感度および特異度を測定するためにＭｅｄＣａｌｃプログラム（ＭＥＤＣＡＬＣ、ベルギー）を利用したＲＯＣ曲線（受信者操作特性（ＲｅｃｅｉｖｅｒＯｐｅｒａｔｉｎｇＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ））分析を行った。

その結果、図３Ｂに示された通り、ＳＤＣ２遺伝子は敏感度および特異度が各々８０．０％及び９６．９％を示して胃癌を診断する能力が非常に優秀であることを示唆した。特に、ＳＤＣ２遺伝子は早期胃癌や進行性胃癌に対する敏感度が８０．０％を示し、胃癌早期診断に対する有用性を示唆した。

実施例４：他の固形癌組織でのＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化測定
ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子を胃ポリープおよび胃癌特異的診断用マーカーとして特異的に使用できるか試験するために、他の癌種における実験を行った。

ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子を胃ポリープまたは胃癌診断用マーカーとして使用するには、患者以外の健常者の種々の臓器組織と他の固形癌組織ではメチル化がされていなければならない。

ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子がこの要求を満たしているかどうかを証明するために、患者でなく健常者の種々の臓器組織（Ｂｉｏｃｈａｉｎ社）、種々の固形癌組織、そして癌組織に隣接した正常組織（忠南（チュンナム）大学病院のバイオバンクにより提供される）からＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ＵＳＡ）を使用してゲノムＤＮＡを分離した。前記分離したゲノムＤＮＡ２００ｎｇをＥＺＤＮＡメチル化−Ｇｏｌｄｋｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を利用してバイサルファイトで処理した後、滅菌蒸溜水２０μｌで溶出してパイロシークエンシングに使用した。

前記バイサルファイトで処理されたゲノムＤＮＡ２０ｎｇをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅において、ＰＣＲ反応溶液（バイサルファイトで処理されたゲノムＤＮＡ２０ｎｇ、１０ＸＰＣＲバッファー５μｌ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）、Ｔａｑポリメラーゼ５ユニット（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）、２．５ｍＭｄＮＴＰ４μｌ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）、およびＰＣＲプライマー２μｌ（５ｐｍｏｌｅ/μｌ））を使用して、ＰＣＲ反応を以下の条件下で行った：９５℃で５分間予め変性した後、９５℃で４０秒変性、６０℃で４５秒アニーリング、および７２℃で４０秒伸長で４５サイクル実施した後、７２℃で５分間最後の伸長を行った。前記ＰＣＲ産物の増幅は、２．０％アガロースゲルにおいて電気泳動で確認した。

前記増幅されたＰＣＲ産物をＰｙｒｏＧｏｌｄ試薬（Ｂｉｏｔａｇｅ、ＵＳＡ）を処理した後、ＰＳＱ９６ＭＡシステム（Ｂｉｏｔａｇｅ、ＵＳＡ）を利用してパイロシークエンシングを行った。パイロシークエンシング後、ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化レベルはメチル化指数（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ）を計算することによって測定した。メチル化指数は、各ＣｐＧ島にシトシンが結合する平均率を決定することにより計算した。

その結果、図４に示された通り、ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化レベルは、肺癌組織、乳癌組織、肝臓癌組織、子宮頸部癌組織、そして前立腺癌組織全てにおいて１０％以下であった。これは、ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子は、胃癌組織において特異的にメチル化されていることを示唆している。このような結果は、ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子が胃癌特異的診断だけでなく腸癌診断用バイオマーカーとして使用できる。

実施例５：胃ポリープ患者の血清におけるＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化測定
ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の血清における胃ポリープ診断に対する有用性を確認するために、胃ポリープ患者血清でのＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子のメチル化を定量的メチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ；ｑＭＳＰ）方法により測定した。ｑＭＳＰは、実施例３に記載された方法と同じ方法で行った。

ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の血清での胃ポリープを診断する能力を評価するために１２人の胃内視鏡により正常と決定された健常者、５人の過形成ポリープ患者、そして１６人の腺腫性ポリープ患者の血清ＤＮＡを対象にｑＭＳＰを行った。メチル化レベルは、ＳＤＣ２遺伝子のサイクル閾値（ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ；Ｃｔ）で表され、メチル化がされないためにＣｔ値が形成されなかった場合はＣｔ値を４０として表した。

その結果、図５Ａに示された通り、１２人の健常者血清では全くＳＤＣ２遺伝子のメチル化がされてなく胃ポリープ患者の血清は高いレベルおよび頻度でＳＤＣ２遺伝子がメチル化されていることを示した。

ＳＤＣ２バイオマーカー遺伝子の胃ポリープ診断に対する敏感度および特異度を測定するために、ＭｅｄＣａｌｃプログラム（ＭＥＤＣＡＬＣ、ベルギー）を利用したＲＯＣ曲線（受信者操作特性（ＲｅｃｅｉｖｅｒＯｐｅｒａｔｉｎｇＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ））分析を行った。

その結果、図５Ｂに示された通り、ＳＤＣ２遺伝子は全胃ポリープ患者に対する敏感度および特異度がそれぞれ６１．９％（１３/２１）および１００％を示して胃ポリープを診断する能力が非常に優秀であることを示唆した。さらにＳＤＣ２遺伝子は、過形成ポリープに対する敏感度は４０％（２/５）、そして腺腫性ポリープに対する敏感度は６８．８％（１１/１６）を示した。従って、ＳＤＣ２遺伝子は血液における胃ポリープ診断に対する有用性が高いことを見出した。

以上、本発明を特定の特徴に関してを詳細に記述したが、当業者にとって、この説明は単に望ましい実施形態のためであるに過ぎず、本発明の範囲が制限されるのではない点は明白である。従って、本発明の実質的な範囲は添付された特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義される。

以上説明した通り、本発明は胃ポリープおよび胃癌特異的マーカー遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を検出することによって、胃癌診断のための情報を与える効果がある。

本発明に係るメチル化検出方法あるいは診断用の組成物、キットまたは核酸チップを利用すると、胃癌を初期形質転換段階での診断を可能にさせ早期診断を可能にする。さらに、本発明の方法は、慣例的な方法と比べて正確でかつ早く胃癌を有効に診断することを可能にする。

本発明を特定の特徴に関して詳述したが、当業者にとって、この記述は単なる好適な実施形態に過ぎず、本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は添付の特許請求の範囲とこれらの等価物により定義される。

本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を検出できる物質を含有する胃癌診断用組成物。
（項目２）
ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を検出できる物質を含有する胃ポリープ診断用組成物。
（項目３）
前記ＣｐＧ島は、ＳＤＣ２遺伝子のプロモーター領域、５‘非転写領域（５’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ）、イントロンおよびエクソンの中いずれか一つの部位に存在することを特徴とする項目１または項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記ＳＤＣ２遺伝子のＣｐＧ島は、配列番号１のヌクレオチド配列を有することを特徴とする項目１または項目２に記載の組成物。
（項目５）
前記ＣｐＧ島のメチル化を検出できる物質は、前記メチル化されたＣｐＧ島を含む断片を増幅できるプライマー対、前記メチル化されたＣｐＧ島とハイブリダイゼーションできるプローブ、シークエンシングプライマー、シークエンシングバイシンセシスプライマーおよびシークエンシングバイライゲーションプライマーで構成された群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする項目１または項目２に記載の組成物。
（項目６）
前記ＣｐＧ島のメチル化の有無を検出できる物質は、前記メチル化されたＣｐＧ島と結合できるメチル化特異的結合タンパク質またはメチル化特異的結合抗体をさらに含むことを特徴とする項目５に記載の組成物。
（項目７）
配列番号１で表されるＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子断片由来の修飾核酸であって、前記ＳＤＣ２遺伝子断片のうち少なくとも一つのシトシン残基がウラシルに修飾されているか、ハイブリダイゼーション過程でシトシン以外のヌクレオチドに修飾されるように、ＳＤＣ２遺伝子断片を修飾することにより得られる、胃ポリープまたは胃癌の診断用修飾核酸。
（項目８）
前記修飾核酸は、配列番号２３で表される配列を含むことを特徴とする項目７に記載の修飾核酸。
（項目９）
ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島を含む断片を増幅するためのＰＣＲプライマー対と前記プライマー対によって増幅されたＰＣＲ産物をパイロシークエンシングするためのシークエンシングプライマーを含有する胃ポリープまたは胃癌診断用キット。
（項目１０）
前記ＰＣＲプライマー対およびシークエンシングプライマーは、ＣｐＧ島を含む断片をメチル化されたＤＮＡと非メチル化されたＤＮＡを異なるように修飾させる試薬により処理して修飾させた後、前記ＣｐＧ島のメチル化を検出するためのＰＣＲプライマー対およびシークエンシングプライマーであることを特徴とする項目９に記載のキット。
（項目１１）
前記ＰＣＲプライマー対は、配列番号２及び３で表されるプライマー対、または配列番号５及び６で表されるプライマー対であることを特徴とする項目９に記載のキット。
（項目１２）
前記シーケンスプライマーは、配列番号４または７で表されるプライマーであることを特徴とする項目９に記載のキット。
（項目１３）
下記工程を含む、胃癌の検出方法:
（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する工程；及び
（ｂ）前記分離したＤＮＡにおいて胃癌バイオマーカーであるＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を測定して胃癌を検出する工程。
（項目１４）
下記工程を含む、胃ポリープの検出方法：
（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する工程；及び
（ｂ）前記分離したＤＮＡにおいて胃ポリープバイオマーカーであるＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を測定して胃ポリープを検出する工程。
（項目１５）
前記臨床サンプルから分離したＤＮＡをメチル化されたＤＮＡと非メチル化されたＤＮＡを異なるように修飾させる試薬で処理した後、処理されたＤＮＡのメチル化を測定することを特徴とする項目１３または項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記試薬は、バイサルファイトであることを特徴とする項目１５に記載の方法。
（項目１７）
（ｂ）工程は、前記遺伝子のプロモーター、５‘ ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ；非翻訳領域）、イントロン領域およびエクソン領域の中いずれか一つのメチル化を測定することによって実行されることを特徴とする項目１３または項目１４に記載の方法。
（項目１８）
（ｂ）工程は、配列番号１のヌクレオチド配列を持つＳＤＣ２遺伝子の領域のＣｐＧ島のメチル化を測定することによって実行されることを特徴とする項目１３または項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記ＣｐＧ島のメチル化は、配列番号２３で表される配列を有する修飾核酸を用いて測定することを特徴とする項目１３または項目１４に記載の方法。
（項目２０）
（ｂ）工程は、ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ）、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を利用したＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的結合抗体を利用したＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップ、シークエンシング、シークエンシングバイシンセシス技法及びシークエンシングバイライゲーション技法で構成された群から選択される方法によって実行されることを特徴とする項目１３または項目１４に記載の方法。
（項目２１）
前記臨床サンプルは、癌の疑いがある患者、または診断被検体由来の組織、細胞、血液、血漿、糞便及び尿で構成された群から選択されることを特徴とする項目１３または項目１４に記載の方法。
（項目２２）
ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島を含む断片と厳しい条件下でハイブリダイゼーションできるプローブが固定されている胃癌診断用核酸チップ。
（項目２３）
ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島を含む断片と厳しい条件下でハイブリダイゼーションできるプローブが固定されている胃ポリープ診断用核酸チップ。
（項目２４）
前記プローブは、配列番号８乃至１９で表される塩基配列で構成される群から選択されることを特徴とする項目２２または項目２３に記載の核酸チップ。
（項目２５）
前記プローブは、前記ＣｐＧ島を含む断片をメチル化されたＤＮＡと非メチル化されたＤＮＡを異なるように修飾させる試薬で処理して修飾させることのより得られる核酸断片と共に処理される場合、メチル化されたＣｐＧ島を含む断片に対して対応する修飾核酸断片とハイブリダイゼーションできるプローブであることを特徴とする項目２２または２３に記載の核酸チップ。
本発明の他の特徴及び実施形態は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からより一層明白になる。

Claims

ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を検出できる物質を含有する胃癌診断用組成物。
ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を検出できる物質を含有する胃ポリープ診断用組成物。
前記ＣｐＧ島は、ＳＤＣ２遺伝子のプロモーター領域、５‘非転写領域（５’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ）、イントロンおよびエクソンの中いずれか一つの部位に存在することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の組成物。
前記ＳＤＣ２遺伝子のＣｐＧ島は、配列番号１のヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の組成物。
前記ＣｐＧ島のメチル化を検出できる物質は、前記メチル化されたＣｐＧ島を含む断片を増幅できるプライマー対、前記メチル化されたＣｐＧ島とハイブリダイゼーションできるプローブ、シークエンシングプライマー、シークエンシングバイシンセシスプライマーおよびシークエンシングバイライゲーションプライマーで構成された群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の組成物。
前記ＣｐＧ島のメチル化を検出できる物質は、前記メチル化されたＣｐＧ島と結合できるメチル化特異的結合タンパク質またはメチル化特異的結合抗体をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の組成物。
配列番号１で表されるＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子断片由来の修飾核酸であって、前記ＳＤＣ２遺伝子断片のうち少なくとも一つのシトシン残基がウラシルに修飾されているか、ハイブリダイゼーション過程でシトシン以外のヌクレオチドに修飾されるように、ＳＤＣ２遺伝子断片を修飾することにより得られる、胃ポリープまたは胃癌の診断用修飾核酸。
前記修飾核酸は、配列番号２３で表される配列を含むことを特徴とする請求項７に記載の修飾核酸。
ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島を含む断片を増幅するためのＰＣＲプライマー対と前記プライマー対によって増幅されたＰＣＲ産物をパイロシークエンシングするためのシークエンシングプライマーを含有する胃ポリープまたは胃癌診断用キット。
前記ＰＣＲプライマー対およびシークエンシングプライマーは、ＣｐＧ島を含む断片をメチル化されたＤＮＡと非メチル化されたＤＮＡを異なるように修飾させる試薬により処理して修飾させた後、前記ＣｐＧ島のメチル化を検出するためのＰＣＲプライマー対およびシークエンシングプライマーであることを特徴とする請求項９に記載のキット。
前記ＰＣＲプライマー対は、配列番号２及び３で表されるプライマー対、または配列番号５及び６で表されるプライマー対であることを特徴とする請求項９に記載のキット。
前記シーケンスプライマーは、配列番号４または７で表されるプライマーであることを特徴とする請求項９に記載のキット。
下記工程を含む、胃癌の検出方法:
（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する工程；及び
（ｂ）前記分離したＤＮＡにおいて胃癌バイオマーカーであるＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を測定して胃癌を検出する工程。
下記工程を含む、胃ポリープの検出方法：
（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する工程；及び
（ｂ）前記分離したＤＮＡにおいて胃ポリープバイオマーカーであるＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島のメチル化を測定して胃ポリープを検出する工程。
前記臨床サンプルから分離したＤＮＡをメチル化されたＤＮＡと非メチル化されたＤＮＡを異なるように修飾させる試薬で処理した後、処理されたＤＮＡのメチル化を測定することを特徴とする請求項１３または請求項１４に記載の方法。
前記試薬は、バイサルファイトであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
（ｂ）工程は、前記遺伝子のプロモーター、５‘ ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ；非翻訳領域）、イントロン領域およびエクソン領域の中いずれか一つのメチル化を測定することによって実行されることを特徴とする請求項１３または請求項１４に記載の方法。
（ｂ）工程は、配列番号１のヌクレオチド配列を持つＳＤＣ２遺伝子の領域のＣｐＧ島のメチル化を測定することによって実行されることを特徴とする請求項１３または請求項１４に記載の方法。
前記ＣｐＧ島のメチル化は、配列番号２３で表される配列を有する修飾核酸を用いて測定することを特徴とする請求項１３または請求項１４に記載の方法。
（ｂ）工程は、ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ）、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を利用したＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的結合抗体を利用したＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップ、シークエンシング、シークエンシングバイシンセシス技法及びシークエンシングバイライゲーション技法で構成された群から選択される方法によって実行されることを特徴とする請求項１３または請求項１４に記載の方法。
前記臨床サンプルは、癌の疑いがある患者、または診断被検体由来の組織、細胞、血液、血漿、糞便及び尿で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１３または請求項１４に記載の方法。
ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島を含む断片と厳しい条件下でハイブリダイゼーションできるプローブが固定されている胃癌診断用核酸チップ。
ＳＤＣ２（シンデカン２、Ｓｙｎｄｅｃａｎ２）遺伝子のＣｐＧ島を含む断片と厳しい条件下でハイブリダイゼーションできるプローブが固定されている胃ポリープ診断用核酸チップ。
前記プローブは、配列番号８乃至１９で表される塩基配列で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２２または請求項２３に記載の核酸チップ。
前記プローブは、前記ＣｐＧ島を含む断片をメチル化されたＤＮＡと非メチル化されたＤＮＡを異なるように修飾させる試薬で処理して修飾させることのより得られる核酸断片と共に処理される場合、メチル化されたＣｐＧ島を含む断片に対して対応する修飾核酸断片とハイブリダイゼーションできるプローブであることを特徴とする請求項２２または２３に記載の核酸チップ。