JP2016008179A - ４ｈ−クロモン誘導体、それらの製造方法およびそれらを用いる癌細胞の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 正常細胞共存下、癌細胞を検出する蛍光プローブを提供すること。
【解決手段】 一般式（１）
【化１】

で表される４Ｈ−クロモン誘導体により前記課題を解決する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、癌細胞の蛍光プローブとして有用な４Ｈ−クロモン誘導体、それらの製造方法およびそれらを用いた癌細胞の検出方法に関する。

正常細胞あるいは正常組織中に混在する癌細胞の精度高い検出方法は、癌の早期発見や治療において重要な技術である。これまでに、様々な癌細胞の検出方法が開発されているが、蛍光プローブを用いた検出方法は、高感度な検出方法の一つである。グルタチオン−Ｓ−転移酵素（以下、ＧＳＴと称する。）は、癌細胞に高発現していることが報告されている。（非特許文献１）
ＧＳＴを発現している癌細胞株として、例えばマウス乳癌由来のＦＭ３Ａ細胞（非特許文献３）、ヒト肺腺癌由来の非小細胞肺癌細胞のＰＣ−９細胞（非特許文献４）、ヒト乳腺癌由来のＳＫ−ＢＲ−３細胞（非特許文献５）などがある。

前記ＧＳＴを高感度に蛍光検出することによって、正常細胞あるいは正常組組織中に混在する癌細胞を精度高く検出することができる。ＧＳＴは、細胞内に侵入した異物を解毒する解毒酵素であり、グルタチオン（以下、ＧＳＨと称する）と異物からグルタチオン−異物抱合体を形成する反応を触媒する。特に、異物が求電子性アリールスルホニル化合物の場合は、ＧＳＨと芳香族求核置換反応により抱合体を形成することが知られている。この反応を利用して、蛍光色素にアリールスルホニル化合物を導入し、ＧＳＨとの芳香族求核置換反応により、アリールスルホニル化合物を除去することで、細胞を蛍光検出する方法が開示されている。（特許文献１、非特許文献２）。

しかしながら、アリールスルホニル化合物は、ＧＳＨもしくはその他の細胞内チオール化合物（例えばシステイン）とも、酵素非依存的に芳香族求核置換反応が進行する可能性があり（非特許文献２）、正常細胞共存下、癌細胞の検出方法には課題があった。

ＷＯ２０１２／０３９４９９ ＷＯ２０１１／１４９０３２

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９６年，５０巻，１４９−１５９頁 Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００８年，１０巻，３７−４０頁 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１２年，２５巻，２２５−２２８頁 Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８８年，７９巻，３０１−３０４頁 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１年，６１巻，５１６８−５１７８頁 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８８年，４８巻，５２７−５３７頁 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７４年，２４９巻，７１３０−７１３９頁

本発明の課題は、癌細胞を検出するための蛍光プローブを提供することにある。特に、正常細胞共存下、癌細胞を検出するための蛍光プローブを提供することが本発明の課題である。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体を用いると、正常細胞共存下、癌細胞を蛍光検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、
［１］一般式（１）

（式中、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立に炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３は各々独立に水素原子、ハロゲン原子またはメトキシ基を表す。Ｒ^６は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７もしくは８のアラルキル基、またはベンゾイル基を表す。Ｒ^７は水素原子または炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０は各々独立に水素原子、ニトロ基またはトリフルオロメチル基を表す。ただし、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０のうち少なくとも一つはニトロ基を表す。ｎは０または１を表し、ｍは０または１を表し、ｋは１から１２の整数を表す。）で表される４Ｈ−クロモン誘導体に関する。
また本発明は［２］ Ｒ^８がニトロ基またはトリフルオロメチル基、Ｒ^９がニトロ基、Ｒ^１０が水素原子、ｋが１から６の整数である［１］ に記載の４Ｈ−クロモン誘導体に関する。
また本発明は［３］ Ｒ^２およびＲ^３がメチル基、Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３が水素原子である、［１］または［２］に記載の４Ｈ−クロモン誘導体に関する。

また本発明は［４］一般式（２）

（式中、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立に炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３は各々独立に水素原子、ハロゲン原子またはメトキシ基を表す。Ｒ^６は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７もしくは８のアラルキル基、またはベンゾイル基を表す。ｎは０または１を表し、ｍは０または１を表し、ｋは１から１２の整数を表す。）で表されるアミン誘導体を、塩基の存在下、一般式（３）

（式中、Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０は各々独立に水素原子、ニトロ基またはトリフルオロメチル基を表す。ただし、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０のうち少なくとも一つはニトロ基を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。）で表されるアリールスルホニル化合物と反応させることを特徴とする、一般式（１ａ）

（式中、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２、Ｒ^５−３、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、ｎ、ｍおよびｋは前記と同じ意味を表す。）で表される４Ｈ−クロモン誘導体の製造方法に関する。

また本発明は［５］一般式（１）

（式中、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立に炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３は各々独立に水素原子、ハロゲン原子またはメトキシ基を表す。Ｒ^６は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７もしくは８のアラルキル基、またはベンゾイル基を表す。Ｒ^７は水素原子または炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０は各々独立に水素原子、ニトロ基またはトリフルオロメチル基を表す。ただし、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０のうち少なくとも一つはニトロ基を表す。ｎは０または１を表し、ｍは０または１を表し、ｋは１から１２の整数を表す。）で表される４Ｈ−クロモン誘導体よりなる蛍光プローブに関する。

また本発明は［６］一般式（１）

（式中、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立に炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３は各々独立に水素原子、ハロゲン原子またはメトキシ基を表す。Ｒ^６は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７もしくは８のアラルキル基、またはベンゾイル基を表す。Ｒ^７は水素原子または炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０は各々独立に水素原子、ニトロ基またはトリフルオロメチル基を表す。ただし、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０のうち少なくとも一つはニトロ基を表す。ｎは０または１を表し、ｍは０または１を表し、ｋは１から１２の整数を表す。）で表される４Ｈ−クロモン誘導体を用いることを特徴とする、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの検出方法に関する。

また本発明は［７］一般式（１）

（式中、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立に炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３は各々独立に水素原子、ハロゲン原子またはメトキシ基を表す。Ｒ^６は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７もしくは８のアラルキル基、またはベンゾイル基を表す。Ｒ^７は水素原子または炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０は各々独立に水素原子、ニトロ基またはトリフルオロメチル基を表す。ただし、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０のうち少なくとも一つはニトロ基を表す。ｎは０または１を表し、ｍは０または１を表し、ｋは１から１２の整数を表す。）で表される４Ｈ−クロモン誘導体を用いることを特徴とする、癌細胞の検出方法に関するものである。

本発明の４Ｈ−クロモン誘導体は、正常細胞共存下、癌細胞を蛍光染色し、癌細胞が強い発光を示すので、癌細胞を検出する蛍光プローブとして有用である。

実施例９の結果を示した図である。 実施例９の結果を示した図である。 実施例９の結果を示した図である。 実施例９の結果を示した図である。 実施例１０及び比較例１から２の結果を示した図である。 実施例１１及び比較例３の結果を示した図である。 実施例１１及び比較例３の結果を示した図である。 実施例１２の結果を示した図である。 実施例１２の結果を示した図である。 細胞診断チップの模式図である。 細胞診断チップの模式図である。 実施例１３の結果を示した図である。 実施例１４の結果を示した図である。

以下に本発明を詳細に説明する。本明細書における、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２、Ｒ^５−３、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｘおよびｋの定義について説明する。
Ｒ^２およびＲ^３で表される炭素数１から３のアルキル基としては、直鎖状、分岐状または環状アルキル基のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、シクロプロピル基およびイソプロピル基を例示することができる。蛍光強度が強い点で、Ｒ^２およびＲ^３としてはメチル基が好ましい。

Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３およびＲ^４−４で表されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子を例示することができる。蛍光強度が強い点で、Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３およびＲ^４−４としてはフッ素原子が好ましい。

Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３およびＲ^４−４としては、蛍光強度が強い点で、水素原子が好ましい。

Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３で表されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子を例示することができる。

Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３としては、蛍光強度が強い点で、水素原子が好ましい。

Ｒ^６で表される炭素数１から４のアルキル基としては、直鎖状、分岐状および環状アルキル基のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基およびｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができる。

Ｒ^６で表される炭素数７もしくは８のアラルキル基としては、ベンジル基およびフェネチル基を例示することができる。蛍光強度が強い点で、Ｒ^６としては水素原子またはベンジル基が好ましい。

Ｒ^７で表される炭素数１から３のアルキル基としては、直鎖状、分岐状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基およびイソプロピル基を例示することができる。蛍光強度が強い点で、Ｒ^７としては水素原子が好ましい。

Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０としては、検出感度が高い点で、Ｒ^８がニトロ基またはトリフルオロメチル基、Ｒ^９がニトロ基、Ｒ^１０が水素原子であることが好ましい。

Ｘで表されるハロゲン原子としては、ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子を例示することができる。中でも収率が良い点で塩素原子が望ましい。またｋとしては、蛍光強度が高い点で、１から６の整数が好ましい。

更に、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体（１）の好ましい例として、（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−７−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］エトキシ］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、（Ｅ）−３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−７−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］エトキシ］−４Ｈ−クロメン−４−オン、（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−８−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］エトキシ］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン、２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−８−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］エトキシ］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン、３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−８−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］エトキシ］−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン、（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−７−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］ブトキシ］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン、（Ｅ）−３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−７−［２−［［［４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）フェニル］スルホニル］アミノ］エトキシ］−４Ｈ−クロメン−４−オン、（Ｅ）−３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−７−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］メチルアミノ］エトキシ］−４Ｈ−クロメン−４−オンを、挙げることができる。

次に、本発明の製造方法について詳細に説明する。本発明の４Ｈ−クロモン誘導体（１）は、下記スキームにより製造することができる。

（式中、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２、Ｒ^５−３、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｘ、ｎ、ｍおよびｋは前記と同じ意味を表す。Ｒ^６ａは炭素数１から４のアルキル基、炭素数７もしくは８のアラルキル基、またはベンゾイル基を表し、Ｒ^７ａは炭素数１から３のアルキル基を表し、Ｙはハロゲン原子を表し、Ｚはハロゲン原子を表す。）
Ｒ^６ａで表される炭素数１から４のアルキル基としては、直鎖状、分岐状および環状アルキル基のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができる。

Ｒ^６ａで表される炭素数７もしくは８のアラルキル基としては、ベンジル基、フェネチル基を例示することができる。

Ｒ^７ａで表される炭素数１から３のアルキル基としては、直鎖状、分岐状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基を例示することができる。

Ｙで表されるハロゲン原子としては、ヨウ素原子、臭素原子を例示することができる。

Ｚで表されるハロゲン原子としては、ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子を例示することができる。

（１）工程−１について
工程−１は、ヒドロキシアセトフェノン誘導体（４）をアルデヒド誘導体（５）と塩基存在下反応させ、エノン誘導体（６）を製造する工程である。

本工程の原料であるヒドロキシアセトフェノン誘導体（４）は、文献記載の方法（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６，７３５８−７３７０（２００８））を参考に調製することができる。

本工程の原料であるアルデヒド誘導体（５）は、文献記載の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３３，６６４２−６６４９（２０１１）、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５，７７７−７８０（２００３）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１８，１６４１−１６５０（１９８８））を参考に、対応する４−アミノベンズアルデヒドまたは４−アミノハロベンゼンから調製することができる。

工程−１の反応は、塩基の存在下に行なうことが必須である。塩基としては、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩を例示することができる。中でも収率が良い点で、ナトリウムメトキシド、水酸化ナトリウムが塩基として好ましい。

また工程−１の反応は、反応を阻害しない溶媒であれば溶媒中で行なってもよい。本工程で用いることのできる溶媒として、具体的には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、メタノール、エタノール等のアルコール、水等を例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてもよい。中でも収率が良い点で、ジメチルホルムアミド、エタノールが好ましい。

ヒドロキシアセトフェノン誘導体（４）とアルデヒド誘導体（５）とのモル比に特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：１から１：３がさらに好ましい。ヒドロキシアセトフェノン誘導体（４）と塩基とのモル比も特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：１から１：３がさらに好ましい。

工程−１の反応温度は、−７８℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。中でも収率が良い点で室温から１２０℃の範囲が好ましい。

工程−１の反応で得られるエノン誘導体（６）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定は無いが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層分取クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。

（２）工程−２について
工程−２は、エノン誘導体（６）を酸化して、３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロモン誘導体（７）を製造する工程である。 工程−２の酸化は、酸化剤の存在下に行なうことが好ましい。用いることのできる酸化剤としては、過酸化水素、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、３−クロロ過安息香酸、過安息香酸を例示することができる。収率が良い点で過酸化水素が好ましい。

また、塩基の存在下に行なうことにより収率を向上することができる。塩基としては、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物類、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩を例示することができる。中でも収率が良い点で、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが塩基として好ましい。

工程−２の反応は、反応を阻害しない溶媒であれば溶媒中で行なってもよい。本工程で用いることのできる溶媒として、具体的には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、メタノール、エタノール等のアルコール、水等を例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてもよい。中でも収率が良い点で、エタノールが好ましい。

エノン誘導体（６）と酸化剤とのモル比に特に制限はないが、１：１から１：３０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：１０から１：１５がさらに好ましい。エノン誘導体（６）と塩基とのモル比も特に制限はないが、１：１から１：３０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：１０から１：１５がさらに好ましい。

工程−２の反応温度は、−７８℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。中でも収率が良い点で室温から１２０℃の範囲が好ましい。

工程−２の反応で得られる３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロモン誘導体（７）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定は無いが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層分取クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。

（３）工程−３について
工程−３は、３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロモン誘導体（７）とハロゲン化物（９）を塩基存在下で反応させ、Ｂｏｃ保護アミン（８）を製造する工程である。

本工程の原料であるハロゲン化物（９）は、一部市販されているが、文献記載の方法（Ｓｙｎｌｅｔｔ，２０１２年，２３巻，２６９２−２６９８頁、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００２年，５８巻，８６８９−８６９３頁、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００１年，３巻，３７２７−３７２８頁）を参考に調製することができる。

工程−３の反応は、塩基の存在下に行なうことが必須である。塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物類、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩を例示することができる。中でも収率が良い点で、炭酸カリウムが塩基として好ましい。

工程−３の反応は、反応を阻害しない溶媒であれば溶媒中で行なってもよい。本工程で用いることのできる溶媒として、具体的には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、メタノール、エタノール等のアルコール、水等を例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてもよい。中でも収率が良い点で、ジメチルホルムアミドが好ましい。

３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロモン誘導体（７）とハロゲン化物（９）とのモル比に特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：１から１：３がさらに好ましい。３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロモン誘導体（７）と塩基とのモル比も特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：３から１：５がさらに好ましい。

工程−３の反応温度は、−７８℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。中でも収率が良い点で室温から１００℃の範囲が好ましい。

工程−３の反応で得られるＢｏｃ保護アミン（８）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定は無いが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層分取クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。

（４）工程−４について
工程−４の反応は、３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロモン誘導体（７）またはＢｏｃ保護アミン（８）を酸処理することにより、アミン誘導体（２）を製造する工程である。

工程−４の反応で用いることのできる酸としては、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、トシル酸およびメシル酸等のブレンステッド酸を例示することができる。

工程−５の反応は、反応を阻害しない溶媒であれば溶媒中で行なってもよい。本工程で用いることのできる溶媒として、具体的には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、メタノール、エタノール等のアルコール、水等を例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてもよい。

３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロモン誘導体（７）またはＢｏｃ保護アミン（８）と酸とのモル比も特に制限はないが、１００：１から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で２０：１から１：１がさらに好ましい。

工程−４の反応温度は、−７８℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。中でも収率が良い点で室温から１００℃の範囲が好ましい。

工程−４の反応で得られるアミン誘導体（２）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定は無いが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層分取クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。

（５）工程−５について
工程−５の反応は、アミン誘導体（２）とアリールスルホニル化合物（３）を塩基存在下反応させ、４Ｈ−クロモン誘導体（１ａ）を製造する工程である。

本発明の製造方法の原料であるアリールスルホニル化合物（３）は、一部市販されているが、文献記載の方法（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９年，４８巻，７５９１−７５９４頁）を参考に調製することができる。

工程−５の反応は、塩基の存在下に行うことが必須である。塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリイソプロピルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等の第３級脂肪族アミン類、ピリジン、ピコリン、４−ジメチルアミノピリジン等の芳香族アミン類、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩を例示することができる。中でも収率が良い点で、ジイソプロピルエチルアミンが塩基として好ましい。

工程−５の反応は、反応を阻害しない溶媒であれば溶媒中で行なってもよい。本工程で用いることのできる溶媒として、具体的には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、メタノール、エタノール等のアルコール、水等を例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてもよい。中でも収率が良い点で、ジメチルホルムアミドが好ましい。

アミン誘導体（２）とアリールスルホニル化合物（３）とのモル比に特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：１から１：３がさらに好ましい。アミン誘導体（２）と塩基とのモル比も特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：１から１：３がさらに好ましい。

工程−５の反応温度は、−７８℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。中でも収率が良い点で室温から５０℃の範囲が好ましい。

工程−５で得られる４Ｈ−クロモン誘導体（１ａ）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定は無いが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層分取クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。

（６）工程−６について
工程−６は、４Ｈ−クロモン誘導体（１ａ）とハロゲン化アルキル（１０）を塩基存在下で反応させ、４Ｈ−クロモン誘導体（１ｂ）を製造する工程である。

本工程の原料であるハロゲン化アルキル（１０）は、一部市販されているが、文献記載の方法（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０年，５５巻，２９２７−２９３８頁）を参考に調製することができる。

工程−６の反応は、塩基の存在下に行なうことが必須である。塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物類、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩を例示することができる。中でも収率が良い点で、炭酸カリウムが塩基として好ましい。

工程−６の反応は、反応を阻害しない溶媒であれば溶媒中で行なってもよい。本工程で用いることのできる溶媒として、具体的には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、メタノール、エタノール等のアルコール、水等を例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてもよい。中でも収率が良い点で、ジメチルホルムアミドが好ましい。

４Ｈ−クロモン誘導体（１ａ）とハロゲン化アルキル（１０）とのモル比に特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：１から１：３がさらに好ましい。４Ｈ−クロモン誘導体（１ａ）と塩基とのモル比も特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：３から１：５がさらに好ましい。

工程−６の反応温度は、−７８℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。中でも収率が良い点で室温から１００℃の範囲が好ましい。

工程−６の反応で得られる４Ｈ−クロモン誘導体（１ｂ）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定は無いが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層分取クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。

次に、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体（１）からなる蛍光プローブ（以下、本発明の蛍光プローブという）について説明する。

蛍光プローブは、特定のタンパク質、細胞、又は組織などに特異的に結合又は分布し、蛍光を発する物質であり、それにより特定のタンパク質、細胞、又は組織の観察を容易にする。通常、蛍光プローブといった場合は、その物質自体が蛍光を発する物質を指すが、本発明では、それ自体蛍光を発しないが、変換反応などにより蛍光を発するようになる前駆物質も蛍光プローブに含まれるものとする。

本発明の蛍光プローブは、それ自体では蛍光を発しないものの、癌細胞などの特定の細胞において発現しているＧＳＴの触媒作用によりＧＳＨと反応して、蛍光を発するアミン誘導体（１１）に変換される。

（式中、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２、Ｒ^５−３、Ｒ^６、Ｒ^７、ｎ、ｍおよびｋは前記と同じ意味を表す。）
アミン誘導体（１１）は、所定の励起光、例えば４００〜５００ｎｍ程度の励起光を照射した場合に、極めて強い蛍光（例えば６００ｎｍでの蛍光）を発する性質を有する一方で、本発明の蛍光プローブは、同程度の励起光を照射した場合であっても、ほとんど蛍光を発しない。アミン誘導体（１１）に対する励起光の範囲の上限は、蛍光波長とのオーバーラップを避ける観点から、５００ｎｍ以下が好ましく、特に好ましくは４９５ｎｍ以下であり、励起光の範囲の下限は、励起能力の観点から４００ｎｍ以上が好ましい。蛍光観測の観点から、励起光は、所望される波長のみを透過する励起フィルターを通して得た単一波長の光であることが好ましいが、４００〜４９５ｎｍにピークを有するスペクトルを有する光源を使用することもできる。

アミン誘導体（１１）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸やタンパク質が存在する場合は、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸やタンパク質と相互作用し、強い蛍光を発する。アミン誘導体（１１）は、結合するＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸やタンパク質に応じて蛍光の波長が変化することがあるが、通常５００〜７００ｎｍ程度の蛍光が発せられ、好ましくは５１０〜６５０ｎｍ程度の蛍光が観察される。

ＧＳＴは、通常細胞質酵素として特に癌細胞で高発現している。癌細胞の細胞膜を透過して細胞内に拡散した蛍光プローブは、細胞質中でＧＳＴの触媒作用によりＧＳＨと反応して、アミン誘導体（１１）へ変換され、次に細胞質中に存在する核酸や、タンパク質と相互作用し、癌細胞が強い蛍光を発するようになる。

本発明の蛍光プローブは、それ自体蛍光を発しないが、ＧＳＴの触媒作用によりＧＳＨと反応して強い蛍光を発するアミン誘導体（１１）に変換されるため、蛍光強度の変化を測定することでＧＳＴを検出することができる。

次に、本発明の蛍光プローブを用いたＧＳＴの検出方法について説明する。本発明の蛍光プローブを用いたＧＳＴ検出方法は、（ａ）蛍光プローブをＧＳＨ存在下にＧＳＴと反応させる工程；および（ｂ）工程（ａ）の発光強度を測定する工程を含む。

ＧＳＴの種類及びその由来は特に限定されないが、サブタイプとしてπ、α、μに属するものが好ましい。

本発明の蛍光プローブをＧＳＨ存在下にＧＳＴと作用させる工程に用いる溶媒は、ＧＳＴの活性が低下または失活しなければ特に制限はないものの、緩衝液を用いることが好ましい。用いることのできる緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液を例示することができる。さらに、緩衝液に混和可能な有機溶媒を添加してもよい。該有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセリンを例示することができ、これらの有機溶媒のうち２種類以上を混合して用いてもよい。有機溶媒の割合は、ＧＳＴが安定的に触媒反応をおこなう点で、０％から１０％の範囲が好ましい。

本発明の蛍光プローブをＧＳＨ存在下にＧＳＴと作用させる工程の温度は、ＧＳＴの活性が低下または失活しない温度であれば特に制限はないものの、ＧＳＴが安定的に触媒反応をおこなう点で、５℃から４０℃の範囲であることが好ましく、より好ましくは２０℃から３７℃の範囲である。また、本発明の蛍光プローブとＧＳＨとＧＳＴを加える順番は特に限定されるものではない。

発光強度を測定する工程は、それぞれの測定方法に応じて、当業者であればその条件を適宜設定でき、特に制限はされず、蛍光の検出装置として従来公知のものを用いればよい。当該装置としては、例えばプレートリーダー、蛍光分光装置、蛍光顕微鏡等が好ましく挙げられる。

発光強度を測定する工程は、工程（ａ）をそのまま測定しても良いが、発光強度が増加する点で、核酸またはタンパク質存在下で行う方が好ましい。用いることのできる核酸の由来に特に制限は無く、血液、組織、細胞等から抽出されたポリヌクレオチドであってもよいし、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドであってもよい。また、用いることのできるタンパク質の由来に特に制限はない。入手が容易な点で、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンが好ましい。用いる核酸またはタンパク質の濃度は、検出に影響を与えなければ特に制限はなく、蛍光強度を考慮の上、適宜設定すればよい。

次に、本発明の蛍光プローブを用いた癌細胞の検出方法について説明する。

本発明の蛍光プローブは、癌細胞検出用のプローブであり、癌の検出、判定、又は診断方法においても使用することができる。癌の検出、判定、又は診断方法は体外で行われる方法であってもよいし、体内で行われる方法であってもよい。

本発明の蛍光プローブは、プレパラート、ガラスボトムディッシュやスライドガラス、マルチウェルプレートなど、生体イメージングの手法において一般的に用いられる観察容器に保持した生体試料に対して作用させることができるが、特許文献２に記載の、生体試料固定装置に保持した生体試料に対して作用させることもできる。

前述のような生体試料固定装置として、例えば、図１０に示すように上部電極基板と下部電極基板の間に、スペーサーを配置し、複数の微細孔をアレイ状に配置した平板状の絶縁体及び絶縁体と下部電極基板の間に設置した遮光部材からなる保持部をスペーサーと下部電極基板とで挟んだ構造を有する、生体試料固定装置（以下、「細胞診断チップ」と記載することがある）を、生体試料を保持するための容器として用いることができる。図１０の例では、保持部に生体試料懸濁液を導入するための導入口と、保持部から溶液を排出するための排出口とを、前記スペーサーに設け、保持部への生体試料懸濁液の供給と排出が迅速に実施可能となるようにしてある。また、前記遮光部材は、前記下部電極基板の、前記微細孔の底部以外の全面を覆うように配置され、微細孔周辺の光ノイズを低減することができる。これにより、微細孔内において生体試料から発する微弱な蛍光などの情報をより高感度に検出することが可能となる。本発明により提供される蛍光プローブを用いると、白血球細胞と、癌細胞とが混合された状態の細胞群の中から、癌細胞のみを、生きたまま蛍光標識し、生体イメージング手法により、癌細胞と白血球細胞とを精度よく識別することが可能になる。

前述のような構成の細胞診断チップの保持部に細胞などの生体試料懸濁液を導入し、信号発生器と前記２つの電極を導線でそれぞれ接続し、２つの電極の間に所定の波形を有する交流電圧を前記信号発生器により印加することで、電気力線が微細孔へ集中し、懸濁液中の生体試料が、電気力線の集中する方向に力を受け、保持部分の微細孔内へ移動して容易に固定される。この時に発生する力を誘電泳動力という。

観察容器に保持された生体試料に対し、本発明の蛍光プローブ、又はその溶液を加えることにより接触させ、所定の時間インキュベートした後に、蛍光顕微鏡やマイクロプレートリーダーにより励起光を生体試料に照射し、生じた蛍光を検出することができる。蛍光を発する細胞を癌細胞と判定することができる。本発明では、例えば癌の転移を判定する観点から、生体試料は組織であっても血液であってもよく、さらに組織あるいは血液から得られた細胞群であってもよい。例えば転移性の癌を患う患者から採取された血液の細胞群には、大量の血球細胞と少数の癌細胞が含まれているが、本発明の蛍光プローブを用いることにより、大量の細胞のなかから、癌細胞を精度よく検出することが可能になる。被験者の血液細胞中に癌細胞が存在した場合に、被験者が転移性の癌を患っていると判定又は診断することができる。

別法では、インキュベート後に、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡による画像取得とそれに続くマイクロピペットによる細胞分取技法を用いて、癌細胞数の計測及び癌細胞の取得を行うこともできる。被験者の血液細胞中の癌細胞数を計測することにより、ＣＴなどの画像診断では発見不可能な微小な固形癌の存在を診断することが可能となる。さらに、被験者の血液細胞中の癌細胞数を一定期間ごとに計測することにより、被験者に対する外科手術、放射線治療などによる局所治療、または化学療法などによる全身治療、または分子標的薬の投与などによる治療の効果を判定することが可能となる。また、被験者の血液細胞中の癌細胞を取得することにより、癌細胞に対して別途解析手法を適用することが可能となり、遺伝子解析、発現解析、局在解析などの性状解析が可能となる。

本発明の別の態様では、本発明の蛍光プローブを用いた癌細胞又は癌組織の検出方法に関する。当該検出方法では、本発明の蛍光プローブを、細胞又は組織に適用し、適用後の細胞又は組織に対し所定の励起光を照射することにより、細胞又は組織における蛍光を検出することを含む。例えばかかる方法は、血液中における癌細胞を検出する方法であり、その場合、血液中の細胞は、プレパラートなどの観察容器に固定されていてもよいし、上で説明した生体試料固定装置により固定された診断チップであってもよい。一方で、係る検出方法を、生体の組織に適用して、手術時における癌組織の確定診断に用いることもできる。その場合の適用方法としては、細胞又は組織に対する噴霧又は塗布することにより適用してもよいし、注射や輸液により適用されてもよい。

本発明のさらに別の態様は、本発明の癌細胞又は癌組織の検出方法を用いて、癌の切除領域を決定し、当該領域を切除する工程を含む、手術・治療方法に関してもよい。

本発明の癌細胞の検出方法は、転移癌の判定に用いることができる。すなわち、本発明の癌細胞の検出方法により、指標となる蛍光よりも高い蛍光が検出された場合に、転移癌が存在すると判定することができる。ここで、判定方法とは、指標との比較をすることにより、医師をはじめとした医療従事者による判断を含まずに特定する方法をいう。例えば指標となる蛍光として、蛍光を有する細胞を選択することができ、この場合、蛍光を有する細胞が検出された場合に、対象が転移癌を有すると決定することができる。別の態様では、蛍光強度や蛍光を有する細胞の数を指標とすることにより、転移癌の重篤度を判定することもできる。

本明細書において、「癌組織」の用語は癌細胞を含む任意の組織を意味している。「組織」の用語は、臓器の一部又は全体を含めて最も広義に解釈することができ、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。本発明の蛍光プローブは、癌組織において特異的に強発現しているＧＳＴを検出する作用を有していることから、癌組織の中でも、ＧＳＴを高発現している組織が好ましく、このような癌組織は、例えばＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４８，ｐｐ．５２７−５３７，１９８８（非特許文献６）に説明されている。癌の例として、頭頚部癌、咽頭癌、胃癌、肺癌、乳癌、大腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、子宮体癌、卵巣癌、中皮腫、皮膚癌、メラノーマ、骨癌などの典型的な原発癌の他に、リンパ節などのリンパ組織や周囲組織への転移癌の組織も挙げられるが、これらの癌種に限定されることを意図するものではない。

次に本発明を実施例および参考例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

参考例１

４’−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−２’−ヒドロキシアセトフェノン（２４８ｍｇ，０．８４ｍｍｏｌ）と（Ｅ）−３−［４−（ジメチアルアミノ）フェニル］−２−プロペナール（１４７ｍｇ，０．８４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（１３６ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で３０分間、８０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、反応混合液に１Ｍ塩酸を加えて液性をｐＨ７とした後、酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（２５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［１４％酢酸エチル／ヘキサン、５０％酢酸エチル／ヘキサンの順］で精製して、（２Ｅ，４Ｅ）−５−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−１−［２−ヒドロキシ−４−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］フェニル］ペンタ−２，４−ジエン−１−オン（１６７ｍｇ，収率４４％）を赤色固体として得て、参考例２に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ１３．６７（ｓ，１Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１４．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），６．４５（ｄｄ，Ｊ＝２．５，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），４．９７（ｂｒｓ，１Ｈ），４．０６（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），３．０３（ｓ，６Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ）．
参考例２

参考例１で得られた（２Ｅ，４Ｅ）−５−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−１−［２−ヒドロキシ−４−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］フェニル］ペンタ−２，４−ジエン−１−オン（１６７ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）に懸濁させ、４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．９２ｍＬ，３．７ｍｍｏｌ）、３０％過酸化水素水（４２０ｍｇ，３．７ｍｍｏｌ）を加えて、２．５時間加熱還流した。反応終了後、反応混合液を室温まで冷却した後、１Ｍ塩酸を加えて液性をｐＨ７とし、水を加えて沈殿物を析出させた。析出した沈殿物をろ取した後、得られた固体を分取薄層クロマトグラフィー（５％メタノール／クロロホルム）で精製して、（Ｅ）−７−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（３５ｍｇ，２０％）を茶色固体として得て、参考例３に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ９．２１（ｂｒｓ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｂｒｓ，１Ｈ），７．０９（ｍ，１Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９８（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），４．１０−４．１７（ｍ，２Ｈ），３．３４−３．３９（ｍ，２Ｈ），２．９８（ｓ，６Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ）．
参考例３

参考例２で得られた（Ｅ）−７−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（３５ｍｇ，７５μｍｏｌ）をジクロロメタン（０．８ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加えて、室温で１時間撹拌した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣にジエチルエーテルを加えて固化させ、（Ｅ）−７−（２−アンモニオエトキシ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン＝トリフルオロアセテート（２５ｍｇ，６９％）を茶色固体として得て、実施例１に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ９．２８（ｂｒｓ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８８−８．１７（ｍ，３Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄｄ，Ｊ＝２．４，８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），４．３３（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），３．２４−３．３５（ｍ，２Ｈ），２．９９（ｓ，６Ｈ）．
参考例４

参考例３で得られた（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−ヒドロキシ−７−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−４Ｈ−クロメン−４−オン（３０ｍｇ，６４μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（２７ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）、ベンジルブロミド（１１μＬ，９６μｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。反応終了後、反応液に水（２０ｍＬ）を加えた後、クロロホルム（２０ｍＬ×３）で抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー（５％メタノール／クロロホルム）で精製して、（Ｅ）−３−ベンジルオキシ−７−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−４Ｈ−クロメン−４−オン（２５ｍｇ，７０％）を橙色固体として得た。得られた（Ｅ）−３−ベンジルオキシ−７−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−４Ｈ−クロメン−４−オン（２５ｍｇ，４５μｍｏｌ）をジクロロメタン（０．８ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加えて室温で３０分間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣にジエチルエーテルを加えて固化させ、（Ｅ）−７−（２−アンモニオエトキシ）−３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−４Ｈ−クロメン−４−オン＝トリフルオロアセテート（１５ｍｇ，５８％）を橙色固体として得て、実施例２及び７に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ８．０３（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｂｒｓ，３Ｈ），７．４８−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．３０−７．４７（ｍ，６Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝１６，１Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．３３（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２９−３．３５（ｍ，２Ｈ），３．００（ｓ，６Ｈ）．
参考例５

６’−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−３’−ヒドロキシ−２’−アセトナフトン（５１１ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）と（Ｅ）−３−［４−（ジメチアルアミノ）フェニル］−２−プロペナール（２８５ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（２４３ｍｇ，４．５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で２．５時間撹拌した。次いで、反応混合液にエタノール（７．５ｍＬ）、４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３．８ｍＬ，１５ｍｍｏｌ）、３０％過酸化水素水（１．７ｇ，１５ｍｍｏｌ）を加えて、更に１．５時間加熱還流した。反応終了後、反応混合液を室温まで冷却した後、１Ｍ塩酸を加えて液性をｐＨ７とし、水を加えて沈殿物を析出させた。析出した沈殿物をろ取した後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２．５％メタノール／クロロホルム、５％メタノール／クロロホルムの順）で精製して、（Ｅ）−８−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン（３０１ｍｇ，３９％）を赤色固体として得て、参考例６に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ９．２６（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．５，９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．４０（ｄｔ，Ｊ＝５．５，５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．００（ｓ，６Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ）．
参考例６

参考例５で得られた（Ｅ）−８−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン（３００ｍｇ，０．５８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を加えて、室温で１時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣にジエチルエーテルを加えて固化させ、（Ｅ）−８−（２−アンモニオエトキシ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン＝トリフルオロアセテート（２８２ｍｇ，９５％）を茶褐色固体として得て、実施例３に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ９．３０（ｂｒｓ，１Ｈ），８．７１（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．９５−８．０７（ｍ，３Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄｄ，Ｊ＝２．３，９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），４．３５（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），３．００（ｓ，６Ｈ）．
参考例７

６’−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−３’−ヒドロキシ−２’−アセトナフトン（４９４ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノベンズアルデヒド（２３５ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した後、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５１３ｍｇ，４．２ｍｍｏｌ）を加えて、０℃で３０分間撹拌した。反応液に水を加えて沈殿を析出させ、ろ過により回収した。得られた固体をフラッシュクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、（Ｅ）−３−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−１−（２−ヒドロキシ−７−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシナフタレン−３−イル］プロパ−２−エン−１−オン（６４８ｍｇ，９７％）を橙色固体として得て、参考例８に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１２．５８（ｓ，１Ｈ），８．９２（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝ １５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｓ，１Ｈ），７．０７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄｄ，Ｊ＝２．４，９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３７（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．０５（ｓ，６Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ）．
参考例８

参考例７で得られた（Ｅ）−３−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−１−（２−ヒドロキシ−７−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシナフタレン−３−イル］プロパ−２−エン−１−オン（８６ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に懸濁させ、３０％過酸化水素水（２０４ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）、４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４５ｍＬ，１．８ｍｍｏｌ）を加えて１時間加熱還流した。反応液を室温に冷却後、１Ｍ塩酸を加えて液性をｐＨ７とし、水を加えて沈殿物を析出させた。析出した沈殿物をろ取した後、得られた固体をフラッシュクロマトグラフィー（２％メタノール／クロロホルム）で精製して、８−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン（２０ｍｇ，２３％）を黄色固体として得て、参考例９に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ９．０６（ｓ，１Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｄｄ，Ｊ＝２．５，９．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｍ，１Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．４０（ｑ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．０４（ｓ，６Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ）．
参考例９

参考例８で得られた８−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン（２０ｍｇ，４１μｍｏｌ）をジクロロメタン（０．８ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加えて室温で３０分間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣にジエチルエーテルを加えて固化させ、８−（２−アンモニオエトキシ）−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン＝トリフルオロアセテート（１４ｍｇ，６８％）を黄色固体として得て、実施例４に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ８．７３（ｓ，１Ｈ），８．１９（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），８．１９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１２（ｓ，１Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄｄ，Ｊ＝２．４，９．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），４．３４（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．３３（ｑ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．０４（ｓ，６Ｈ）．
参考例１０

参考例８で得られた８−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン（５０ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（４２ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）、ベンジルブロミド（１８μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）を加えて室温で２４時間撹拌した。反応終了後、反応液に水（２０ｍＬ）を加えた後、クロロホルム（２０ｍＬ×３）で抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム、次いで５％酢酸エチル／クロロホルム）で精製して、３−ベンジルオキシ−８−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン（４３ｍｇ，７４％）を黄色固体として得て、参考例１１に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．６８（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），７．４２−７．４６（ｍ，３Ｈ），７．２９−７．４０（ｍ，３Ｈ），７．２２（ｄｄ，Ｊ＝２．３，９．３Ｈｚ，１Ｈ），７．０７−７．１３（ｍ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），５．０７（ｓ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．４０（ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．０４（ｓ，６Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ）．
参考例１１

参考例１０で得られた３−ベンジルオキシ−８−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エトキシ］−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン（４３ｍｇ，７４μｍｏｌ）をジクロロメタン（０．８ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加えて室温で３０分間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣にジエチルエーテルを加えて固化させ、８−（２−アンモニオエトキシ）−３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン＝トリフルオロアセテート（１９ｍｇ，５１％）を黄色固体として得、実施例５に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ８．７２（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１２（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），８．０１（ｂｒｓ，３Ｈ），７．４５−７．５１（ｍ，２Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．３０−７．４０（ｍ，４Ｈ），７．２７（ｄｄ，Ｊ＝２．３，９．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），４．３５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．３５−３．４０（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｓ，６Ｈ）．
参考例１２

４’−［５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブチルオキシ］−２’−ヒドロキシアセトフェノン（１．２９ｇ，３．９ｍｍｏｌ）と（Ｅ）−３−［４−（ジメチアルアミノ）フェニル］−２−プロペナール（６９９ｍｇ，３．９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解し、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．３６ｇ，１１ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１時間撹拌した。反応終了後、反応混合液に１Ｍ塩酸を加えて液性をｐＨ１とした後、クロロホルム（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を１Ｍ塩酸（２５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）、飽和食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル／ヘキサン、次に２５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、（２Ｅ，４Ｅ）−１−［４−［５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブチルオキシ］−２−ヒドロキシフェニル］−５−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］ペンタ−２，４−ジエン−１−オン（５００ｍｇ，収率２８％）を赤色固体として得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ１３．６８（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝１４．４，１Ｈ），６．９９（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１５．３Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），６．４１−６．４６（ｍ，２Ｈ），４．５９（ｂｒｓ，１Ｈ），４．０２（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．１５−３．２５（ｍ，２Ｈ），３．０３（ｓ，６Ｈ），１．７８−１．８８（ｍ，２Ｈ），１．６３−１．７２（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）．
参考例１３

（２Ｅ，４Ｅ）−１−［４−［３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブトキシ］−５−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−２−ヒドロキシフェニル］ペンタ−２，４−ジエン−１−オン（１００ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に懸濁させ、４Ｍ水酸化カリウム水溶液（０．５３ｍＬ，２．１ｍｍｏｌ）、３０％過酸化水素水（２３６ｍｇ，２．１ｍｍｏｌ）を加えて、１．５時間加熱還流した。反応終了後、反応混合液を室温まで冷却した後、１Ｍ塩酸を加えて液性をｐＨ１とし、更に水（２５ｍＬ）を加えて反応液を希釈し、クロロホルム（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー（５％メタノール／クロロホルム）で精製して、（Ｅ）−７−［３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブトキシ］−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（４９ｍｇ，４７％）を茶色固体として得て、参考例１４に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ９．２１（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），７．１６−７．２１（ｍ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８５−６．９２（ｍ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．９９−３．０４（ｍ，２Ｈ），２．９９（ｓ，６Ｈ），１．７０−１．８２（ｍ，２Ｈ），１．５０−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．３８（ｓ，９Ｈ）．
参考例１４

実施例１

参考例３によって得られた（Ｅ）−７−（２−アンモニオエトキシ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン＝トリフルオロアセテート（２０ｍｇ，４２μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（２２μＬ，０．１３ｍｍｏｌ）、２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロリド（１７ｍｇ，６２μｍｏｌ）を加えて、室温で３０分間撹拌した。反応液に水（５ｍＬ）を加えて反応を停止させ、クロロホルム（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー（５％メタノール／クロロホルム）で精製して、（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−７−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］エトキシ］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（化合物３）（３．０ｍｇ，１２％）を茶色固体として得て、実施例９乃至１４及び比較例１乃至３に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ９．２１（ｓ，１Ｈ），８．８４（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５５（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．２７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．９５（ｍ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（１Ｈ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｄｄ，Ｊ＝２．１，８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），４．１３（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），３．４３−３．４９（ｍ，２Ｈ），２．９９（ｓ，６Ｈ）．
実施例２

参考例４で得られた（Ｅ）−７−（２−アンモニオエトキシ）−３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−４Ｈ−クロメン−４−オン（１０ｍｇ，１８μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（９．４μＬ，５４μｍｏｌ）、２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロリド（５．６ｍｇ，２１μｍｏｌ）を加えて、室温で３０分間撹拌した。反応液に水（５ｍＬ）を加えて反応を停止させ、クロロホルム（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー（５％メタノール／クロロホルム）で精製して、（Ｅ）−３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−７−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］エトキシ］−４Ｈ−クロメン−４−オン（化合物５）（５．６ｍｇ，４５％）を暗赤色固体として得て、実施例８乃至１４及び比較例１乃至３に用いた。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ８．８３（ｂｒｓ，１Ｈ），８．８１（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５３（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．２６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４８−７．５２（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３１−７．４３（ｍ，４Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），５．１４（ｓ，２Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．４０−３．４８（ｍ，２Ｈ），３．００（ｓ，６Ｈ）．
実施例３

参考例６で得られた（Ｅ）−８−（２−アンモニオエトキシ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン＝トリフルオロアセテート（１３ｍｇ，２５μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（１３μＬ，７５μｍｏｌ）、２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロリド（１０ｍｇ，３８μｍｏｌ）を加えて、室温で３０分間撹拌した。反応液に水（５ｍＬ）を加えて反応を停止させ、クロロホルム（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー（５％メタノール／クロロホルム）で精製して、（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−８−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］エトキシ］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン（化合物７）（４．０ｍｇ，２５％）を暗紫色固体として得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ９．２７（ｓ，１Ｈ），８．８８（ｂｒｓ，１Ｈ），８．８０（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），８．６４（ｓ，１Ｈ），８．５０（ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．７Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｓ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄｄ，Ｊ＝２．２，９．３Ｈｚ，１Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．４７−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．００（ｓ，６Ｈ）．
実施例４

参考例９で得られた８−（２−アンモニオエトキシ）−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン＝トリフルオロアセテート（１０ｍｇ，２０μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（１０μＬ，６０μｍｏｌ）、２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロリド（８ｍｇ，３０μｍｏｌ）を加えて、室温で３０分間撹拌した。反応液に水（５ｍＬ）を加えて反応を停止させ、クロロホルム（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー（５％メタノール／クロロホルム）で精製して、２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−８−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］エトキシ］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン（化合物９）（１．０ｍｇ，８％）を茶色固体として得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ９．１０（ｓ，１Ｈ），８．７７（ｍ，２Ｈ），８．６５（ｓ，１Ｈ），８．４４（ｍ，１Ｈ），８．２２（ｍ，１Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），８．０７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．００（ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），４．０９−４．１４（ｍ，２Ｈ），３．３７−３．４３（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｓ，６Ｈ）．
実施例５

参考例１１で得られた８−（２−アンモニオエトキシ）−３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン＝トリフルオロアセテート（１０ｍｇ，１７μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（７．２μＬ，５１μｍｏｌ）、２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロリド（６．７ｍｇ，２５μｍｏｌ）を加えて、室温で３０分間撹拌した。反応液に水（５ｍＬ）を加えて反応を停止させ、クロロホルム（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー（５％メタノール／クロロホルム）で精製して、３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−８−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］エトキシ］−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］クロメン−４−オン（化合物１１）（３．０ｍｇ，２５％）を茶色固体として得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ８．８８（ｂｒｓ，１Ｈ），８．８１（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．６５（ｓ，１Ｈ），８．５０（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．７Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），８．０６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．４３−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．３１−７．４０（ｍ，３Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ）６．９９（ｄｄ，Ｊ＝２．３，９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），５．０７（ｓ，２Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），３．４８−３．５３（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｓ，６Ｈ）．
実施例６

参考例１４で得られた（Ｅ）−７−（２−アンモニオブトキシ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン＝トリフルオロアセテート（１０ｍｇ，２０μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（１０μＬ，６０μｍｏｌ）、２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロリド（６．５ｍｇ，２４μｍｏｌ）を加えて、室温で３０分間撹拌した。反応液に水（５ｍＬ）を加えて反応を停止させ、クロロホルム（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー（５％メタノール／クロロホルム）で精製して、（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−７−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］ブトキシ］−３−ヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン（化合物１３）（４．０ｍｇ，３２％）を茶色固体として得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ９．２２（ｓ，１Ｈ），８．９０（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．６４（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．６Ｈｚ，１Ｈ），８．５３−８，６０（ｍ，２Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄｄ，Ｊ＝２．２，９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），４．０６−４．１４（ｍ，２Ｈ），３．０２−３．０９（ｍ，２Ｈ），２．９９（ｓ，６Ｈ），１．７０−１．８５（ｍ，２Ｈ），１．５５−１．６８（ｍ，２Ｈ）．
実施例７

参考例４で得られた（Ｅ）−７−（２−アンモニオエトキシ）−３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−４Ｈ−クロメン−４−オン＝トリフルオロアセテート（５０ｍｇ，８８μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（４６μＬ，０．２６ｍｍｏｌ）、４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホニルクロリド（３１ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を加えて、室温で３０分間撹拌した。反応液に水（１０ｍＬ）を加えて沈殿を析出させ、生じた沈殿をろ過により回収した。得られた固体をフラッシュクロマトグラフィー（４０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、（Ｅ）−３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−７−［２−［［［４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）フェニル］スルホニル］アミノ］エトキシ］−４Ｈ−クロメン−４−オン（化合物１５）（１０ｍｇ，１６％）を茶色固体として得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ８．７５（ｂｒｓ，１Ｈ），８．６１（ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．６Ｈｚ，１Ｈ），８．５２（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），８．３９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４７−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．２９−７．４７（ｍ，４Ｈ），６．９９（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），５．１４（ｓ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），３．４８（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），３．００（ｓ，６Ｈ）．^１９Ｆ−ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ−５６．８（ｓ，３Ｆ）．
実施例８

実施例２によって得られた（Ｅ）−３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−７−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］アミノ］エトキシ］−４Ｈ−クロメン−４−オン（化合物５）（２３ｍｇ，３３μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（９２ｍｇ，０．６６ｍｍｏｌ）、ヨウ化メチル（２０μＬ，０．３３ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１時間撹拌した。反応液に水（１０ｍＬ）を加えて沈殿を析出させ、生じた沈殿をろ過により回収した。得られた固体を分取薄層クロマトグラフィー（５％メタノール／クロロホルム）で精製して、（Ｅ）−３−ベンジルオキシ−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−７−［２−［［（２，４−ジニトロフェニル）スルホニル］メチルアミノ］エトキシ］−４Ｈ−クロメン−４−オン（化合物１６）（１５ｍｇ，６５％）を茶色固体として得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ８．９８（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），８．５３（ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．３１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４８−７．５２（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２８−７．４５（ｍ，４Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄｄ，Ｊ＝２．３，８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），５．１５（ｓ，２Ｈ），４．３３（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．７４（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ），３．００（ｓ，６Ｈ）．

実施例９
以下の条件で、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体（１）（化合物３、化合物５、化合物１５、化合物１６）にＧＳＴを添加して、発光強度を測定した。また同様に、ＧＳＴを添加しない場合の発光強度も測定し、その発光強度と比較することでＧＳＴの検出を評価した。

（ａ）方法
反応溶液：リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１．４７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４）
化合物３の濃度：１５μＭ（１％ＤＭＳＯ）
ＧＳＨの濃度：１ｍＭ
ＧＳＴ Ｐ１−１，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ（オックスフォード バイオメディカル リサーチ社製）の濃度：２０μｇ／ｍＬ
反応温度：３７℃
ＧＳＴを添加しない場合は、ＧＳＴ溶液の代わりに、同量のリン酸緩衝溶液を反応溶液に加えた。
各時間に上記の反応溶液を抜き取り、ヒト血清アルブミン（２００ｍｇ／ｍＬ）を含むリン酸緩衝溶液で１０倍希釈した後、プレートリーダーで発光強度を測定した。
励起光：４４０ｎｍ
検出光：６００ｎｍ
（ｂ）結果
化合物３のＧＳＴ存在下および非存在下の蛍光強度の経時変化を図１に示す。なお、図１において、実線黒四角はＧＳＴ存在下での蛍光強度を、点線黒三角はＧＳＴ非存在下での蛍光強度を、それぞれ示している。反応開始３０分後、ＧＳＴ存在下での蛍光強度は、非存在下での蛍光強度より約５．３倍強い値を示した。このことから、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体は、ＧＳＴを検出できることがわかる。

化合物５のＧＳＴ存在下および非存在下の蛍光強度の経時変化を図２に示す。なお、図２において、実線黒四角はＧＳＴ存在下での蛍光強度を、点線黒三角はＧＳＴ非存在下での蛍光強度を、それぞれ示している。反応開始３０分後、ＧＳＴ存在下での蛍光強度は、非存在下での蛍光強度より約４．８倍強い値を示した。このことから、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体は、ＧＳＴを検出できることがわかる。

化合物１５のＧＳＴ存在下および非存在下の蛍光強度の経時変化を図３に示す。なお、図３において、実線黒四角はＧＳＴ存在下での蛍光強度を、点線黒三角はＧＳＴ非存在下での蛍光強度を、それぞれ示している。反応開始１２０分後、ＧＳＴ存在下での蛍光強度は、非存在下での蛍光強度より約３．５倍強い値を示した。このことから、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体は、ＧＳＴを検出できることがわかる。

化合物１６のＧＳＴ存在下および非存在下の蛍光強度の経時変化を図４に示す。なお、図４において、実線黒四角はＧＳＴ存在下での蛍光強度を、点線黒三角はＧＳＴ非存在下での蛍光強度を、それぞれ示している。反応開始１２０分後、ＧＳＴ存在下での蛍光強度は、非存在下での蛍光強度より約３．８倍強い値を示した。このことから、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体は、ＧＳＴを検出できることがわかる。

実施例１０
以下の条件で、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体（１）（化合物３、化合物５）に癌細胞内タンパク質抽出液を添加して、発光強度を測定した。また、癌細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合、白血球細胞内タンパク抽出液を添加した場合（比較例１）、並びに、癌細胞内タンパク質抽出液および２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（ＣＤＮＢ）を添加した場合（比較例２）の発光強度も測定し、それらの発光強度と比較することでＧＳＴおよび癌細胞検出能を評価した。

（ａ）方法
マウス乳癌由来のＦＭ３Ａ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃にて、浮遊培養用シャーレ９０φ（深型）（住友ベークライト社製）内で２４時間以上培養した。

細胞がサブコンフルエントに達した後に細胞を回収した。回収した細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。さらに細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、２５０μＬのＰＢＳで細胞を懸濁し、細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液中の細胞数は、１．４５×１０^６個であった。続いて、細胞懸濁液を超低温フリーザー（−８０℃）内で一旦凍結し、その後解凍した。続いて、解凍した細胞懸濁液をタッチミキサーで約１０分間、氷上で冷却しながら激しく混合し、細胞膜を破壊した。続いて、遠心（１００００×ｇ、４℃、１０分）し、上澄みを回収することで、癌細胞内タンパク質抽出液を得た。得られた癌細胞内タンパク質抽出液は、使用するまでは超低温フリーザー（−８０℃）内で凍結保存した。

以下の条件で、本発明の化合物３または化合物５に癌細胞内タンパク質抽出液を添加して、蛍光強度を測定した。また同様に、癌細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合の蛍光強度も測定し、その蛍光強度と比較することで癌細胞内タンパク質抽出液に含まれるＧＳＴの検出を評価した。

反応溶液
緩衝溶液：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
化合物３、または化合物５の濃度：１５μＭ（１％ＤＭＳＯ）
ＧＳＨの濃度：１ｍＭ
癌細胞内タンパク質抽出液：反応溶液量の１０分の１量
反応温度：３７℃
癌細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合は、癌細胞内タンパク質抽出液の代わりに、同量のＰＢＳを反応溶液に加えた。０分、３０分、６０分、及び１２０分経過時に上記の反応溶液を抜き取り、測定まで超低温フリーザー（−８０℃）内で凍結保持した。解凍した反応溶液を、牛血清アルブミン（２００μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳで１０倍希釈した後、プレートリーダーで蛍光強度を測定した。
化合物３
励起光：４７０ｎｍ
検出光：６５０ｎｍ
化合物５
励起光：４５０ｎｍ
検出光：５７９ｎｍ
（ｂ）結果
その結果を図５に示す。癌細胞内タンパク質抽出液を添加した場合は、反応時間経過に伴い、化合物３を含む溶液の蛍光強度（図５Ａ、実線黒四角）、及び化合物５を含む溶液の蛍光強度（図５Ｂ、実線黒四角）が増大した。一方、癌細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合（化合物３：図５Ａ、破線黒丸、化合物５：図５Ｂ、破線黒丸）は、反応時間経過に伴う溶液の蛍光強度の変化は僅かであった。

比較例１
（ａ）方法
ＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に採血したヒト健常者血液３ｍＬを等量の生理食塩水で希釈して計６ｍＬの希釈血液とした。前期希釈血液６ｍＬを２ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）に重層し、遠心（１１００×ｇ、１０分、２５℃）し、白血球細胞層を回収した。回収した白血球細胞を生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し、上澄みを捨てた後、再度生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）して上澄みを捨てることで、血小板の除去と、白血球細胞の洗浄とを同時に行い、白血球細胞を得た。

白血球細胞を遠心し、上澄みを捨て、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で懸濁し、２５０μＬの白血球細胞懸濁液を得た。白血球細胞懸濁液中の細胞数は、３．２５×１０^６個であった。続いて、細胞懸濁液を超低温フリーザー（−８０℃）内で一旦凍結し、その後解凍し、細胞膜を破壊した。続いて、細胞膜を破壊した細胞懸濁液をタッチミキサーで約１０分間、氷上で冷却しながら激しく混合した。続いて、遠心（１００００×ｇ、４℃、１０分）し、上澄みを回収することで、白血球細胞内タンパク質抽出液を得た。得られた白血球細胞内タンパク質抽出液は、使用するまでは超低温フリーザー（−８０℃）内で凍結保存した。

以下の条件で、本発明の化合物３、または化合物５に白血球細胞内タンパク質抽出液を添加して、蛍光強度を測定した。また同様に、白血球細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合の蛍光強度も測定した。
反応溶液
緩衝溶液：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
化合物３、または化合物５の濃度：１５μＭ（１％ＤＭＳＯ）
ＧＳＨの濃度：１ｍＭ
白血球細胞内タンパク質抽出液：反応溶液量の１０分の１量
反応温度：３７℃
白血球細胞内タンパク質抽出液を添加しない場合は、白血球細胞内タンパク質抽出液の代わりに、同量のＰＢＳを反応溶液に加えた。０分、３０分、６０分、９０分、及び１２０分経過時に上記の反応溶液を抜き取り、測定まで超低温フリーザー（−８０℃）内で凍結保持した。解凍した反応溶液を、牛血清アルブミン（２００μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳで１０倍希釈した後、プレートリーダーで蛍光強度を測定した。
化合物３
励起光：４７０ｎｍ
検出光：６５０ｎｍ
化合物５
励起光：４５０ｎｍ
検出光：５７９ｎｍ
（ｂ）結果
その結果、図５Ａ（化合物３：点線黒三角）及び図５Ｂ（化合物５：点線黒三角）に示すように、白血球細胞内タンパク質抽出液の存在下では、反応時間経過に伴う溶液の蛍光強度の変化は僅かであった。

比較例２
（ａ）方法
以下の条件で、本発明の化合物３または化合物５に、実施例１０と同様に調製した癌細胞内タンパク質抽出液と、ＧＳＴの基質であり、化合物３及び化合物５に対し競合阻害的に作用する２，４−Ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（ＣＤＮＢ）（非特許文献７）を添加して、蛍光強度を測定した。また同様に、ＣＤＮＢを添加しない場合の蛍光強度も測定し、その蛍光強度と比較することで化合物３、または化合物５のＧＳＴ酵素特異性を評価した。
反応溶液
緩衝溶液：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
化合物３、または化合物５の濃度：１５μＭ（１％ＤＭＳＯ）
ＧＳＨの濃度：１ｍＭ
癌細胞内タンパク質抽出液：反応溶液量の１０分の１量
ＣＤＮＢの濃度：４ｍＭ（４％エタノール）
反応温度：３７℃
ＣＤＮＢを添加しない場合は、ＣＤＮＢエタノール溶液の代わりに、同量のエタノールを加えた。０分、３０分、６０分、及び１２０分経過時に上記の反応溶液を抜き取り、測定まで超低温フリーザー（−８０℃）内で凍結保持した。解凍した反応溶液を、牛血清アルブミン（２００μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳで１０倍希釈した後、プレートリーダーで蛍光強度を測定した。
化合物３、及び化合物５
励起光：４４０ｎｍ
検出光：５８０ｎｍ
（ｂ）結果
その結果を図５Ｃおよび図５Ｄに示す。ＣＤＮＢを添加しなかった場合は、反応時間経過に伴い、化合物３を含む溶液の蛍光強度（図５Ｃ、点線黒三角）、及び化合物５を含む溶液の蛍光強度（図５Ｄ、点線黒三角）が増大した。一方、ＣＤＮＢを添加した場合（図５Ｃおよび図５Ｄ、実線黒四角）は、反応時間経過に伴い溶液の蛍光強度が変化しなかった。

実施例１０、比較例１、及び比較例２の結果から、本発明の化合物３、及び化合物５が細胞内タンパク質抽出液に含まれるＧＳＴを検出できることが分かる。また、蛍光強度を比較することで、癌細胞と正常細胞とを識別することができることがわかる。

実施例１１
以下の条件で、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体（１）（化合物３、化合物５）を癌細胞に接触させ、癌細胞の蛍光検出能を評価した。また、同様に白血球細胞に接触させて、白血球細胞の蛍光検出能を評価した（比較例３）。

（ａ）方法
ヒト乳腺癌由来のＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ‘ｓ ５ａ培地中で、また、ヒト肺腺癌由来の非小細胞肺癌細胞のＰＣ−９細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ／Ｈａｍ‘ｓ Ｆ−１２培地中で、どちらも５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃にて、マルチウェルプレート２４Ｆ（接着系細胞用、住友ベークライト社製）内で２４時間以上培養した。

ＳＫ−ＢＲ−３細胞、及びＰＣ−９細胞がどちらも底面の半分程度を覆うような細胞密度になってから、上澄みの培地を捨てた後、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で洗浄し、１．５μＭの化合物３、もしくは化合物５を含む前記フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を１５０μＬ加えた。

細胞の蛍光画像を、励起波長４７０−４９５ｎｍ、蛍光波長５１０−５５０ｎｍの条件で、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製）を通じてＥＭ−ＣＣＤカメラで１０分、３０分、及び６０分経過時に撮像した（化合物３：図６上部、化合物５：図７上部）。

（ｂ）結果
その結果、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、及びＰＣ−９細胞のどちらも、細胞質が蛍光標識された。また、時間経過に伴い、細胞が発する蛍光強度が増大した。蛍光強度は、ＳＫ−ＢＲ−３と比較してＰＣ−９細胞の方が大きかった。

比較例３
（ａ）方法
ＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に採血したヒト健常者血液３ｍＬを等量の生理食塩水で希釈して計６ｍＬの希釈血液とした。前期希釈血液６ｍＬを２ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）に重層し、遠心（１１００×ｇ、１０分、２５℃）し、白血球細胞層を回収した。回収した白血球細胞を生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し、上澄みを捨てた後、再度生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）して上澄みを捨てることで、血小板の除去と、白血球細胞の洗浄とを同時に行い、白血球細胞を得た。

前記白血球細胞を、１．５μＭの化合物３、もしくは化合物５を含むフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で懸濁し（細胞濃度２．０×１０^６個／ｍＬ）、マルチウェルプレート２４Ｆ（接着系細胞用、住友ベークライト社製）に１５０μＬ播種した。

前記白血球細胞の蛍光画像を、励起波長４７０−４９５ｎｍ、蛍光波長５１０−５５０ｎｍの条件で、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製）を通じてＥＭ−ＣＣＤカメラで１０分、３０分、及び６０分経過時に撮像した（化合物３：図６下部、化合物５：図７下部）。
（ｂ）結果
その結果、時間経過に伴い、白血球細胞の発する蛍光強度の変化は僅かであった。

実施例１１、及び比較例３の結果から、本発明の化合物３及び化合物５は、癌細胞を蛍光染色し、正常細胞である白血球細胞の蛍光染色は僅かであることが分かる。

実施例１２
以下の条件で、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体（１）（化合物３、化合物５）を癌細胞及び白血球細胞の混合体に接触させ、癌細胞の蛍光検出能を評価した。

（ａ）方法
ＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に採血したヒト健常者血液３ｍＬを等量の生理食塩水で希釈して計６ｍＬの希釈血液とした。前期希釈血液６ｍＬを２ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）に重層し、遠心（１１００×ｇ、１０分、２５℃）し、白血球細胞層を回収した。回収した白血球細胞を生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し、上澄みを捨てた後、再度生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）して上澄みを捨てることで、血小板の除去と、白血球細胞の洗浄とを同時に行った。次に、得られた白血球細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し、１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所社製）を加えて細胞核染色し、同時に抗ＣＤ−４５抗体（ＡＰＣ標識）（ミルテニーバイオテク社製）を加えて細胞表面染色を行った。次に遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し上澄みを捨て、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で白血球細胞を洗浄して抗原に結合しなかった抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）を除去した。次に遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し上澄みを捨て、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で懸濁し、白血球細胞懸濁液を得た。

ヒト肺腺癌由来の非小細胞肺癌細胞のＰＣ−９細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ／Ｈａｍ‘ｓ Ｆ−１２培地中で、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で培養した。細胞がサブコンフルエントに達した後にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。処理した細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で懸濁し、ＰＣ−９細胞懸濁液を得た。次に、１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所社製）を加えて細胞核染色した。

続いて、ＰＣ−９細胞の細胞密度が１．０×１０^５個／ｍＬ、白血球細胞の細胞密度が１．０×１０^６個／ｍＬにそれぞれなるよう、前記ＰＣ−９細胞懸濁液と前記白血球細胞懸濁液とを混合し、癌細胞及び白血球細胞の混合体を作製した。

前記癌細胞及び白血球細胞の混合体に、１．５μＭの化合物３、もしくは化合物５を加え、マルチウェルプレート２４Ｆ（接着系細胞用、住友ベークライト社製）に４００μＬ播種した。
前記癌細胞及び白血球細胞の混合体の蛍光画像を、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製）を通じてＥＭ−ＣＣＤカメラで１０分、３０分、及び６０分経過時に撮像した（化合物３：図８、化合物５：図９）。なお、抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）由来の蛍光像は励起波長６００−６５０ｎｍ、蛍光波長６７０−７２０ｎｍの条件で撮像し、またＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２由来の蛍光像は励起波長３６０−３７０ｎｍ、蛍光波長４２０−４６０ｎｍの条件で撮像し、また化合物３及び化合物５由来の蛍光像は励起波長４７０−４９５ｎｍ、蛍光波長５１０−５５０ｎｍの条件で撮像した。

（ｂ）結果
以上の条件で撮像すると、全ての有核細胞はＨｏｅｃｈｓｔ３３４２によりその細胞核が蛍光染色され、また白血球細胞は抗ＣＤ４５（ＡＰＣ標識）により蛍光染色されることが分かる。従って、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２により蛍光染色され、抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）により蛍光染色される細胞が白血球細胞であり、またＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２により蛍光染色され、かつ抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）により蛍光染色されない細胞はＰＣ−９細胞であることが分かる。その結果、時間経過に伴い、ＰＣ−９細胞が発する化合物３及び化合物５由来の蛍光強度が増大した。一方、白血球細胞が発する化合物３及び化合物５由来の蛍光強度は僅かであり、ＰＣ−９細胞と白血球細胞とを蛍光強度の違いから、白血球細胞の集団の中から癌細胞を検出することが可能であることが分かった。

実施例１３
以下の条件で、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体（１）（化合物３、化合物５）を細胞診断チップ上に固定化した癌細胞に接触させ、癌細胞の蛍光検出能を評価した。

（ａ）方法
ヒト肺腺癌由来の非小細胞肺癌細胞のＰＣ−９細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ／Ｈａｍ‘ｓ Ｆ−１２培地中で、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で培養した。細胞がサブコンフルエントに達した後にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。処理した細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、０．５×１０^５個／ｍＬの細胞密度になるように３００ｍＭのマンニトール水溶液に懸濁した。

細胞を観察するための容器は、図１０及び図１１に示すような、孔間隔１００μｍでアレイ状に配置された、直径３０μｍ、深さ３０μｍの複数の微細孔を有する絶縁体及び絶縁体と下部電極基板の間に設置した遮光性のクロム膜からなる保持部をスペーサーと下部電極基板とで挟んだ構造を有する、生体試料固定装置（以下、「細胞診断チップ」と記載することがある）を用いた。

細胞診断チップに調整した細胞懸濁液を導入し、信号発生器より交流電圧として電圧２０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したところ、細胞に誘電泳動力が作用し、１分程度の時間でアレイ状に配置した複数の微細孔に細胞を１個ずつ固定することができた。なお、「固定することができた」とは、微細孔に細胞が入った場合を意味し、以下の実施例でも同じ定義とした。

１個の微細孔に概ね１個の細胞が固定された細胞診断チップに、引き続き交流電圧を印加しながら、０．０１％ ポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭ マンニトール水溶液を導入し、２分静置後、交流電圧の印加を停止し、細胞診断チップ内の溶液を吸引除去し、すぐさまＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を細胞診断チップに導入し、細胞診断チップ内のポリ−Ｌ−リジンを洗浄することで、微細孔内へ細胞を静電気的に結合することができた。なお、ポリ−Ｌ−リジンの作用により、細胞は微細孔内に静電気的に結合しているため、洗浄により微細孔から脱離することはない。

続いて、細胞診断チップ内の溶液を吸引除去し、５μＭの化合物３、もしくは化合物５を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を導入した。細胞診断チップの蛍光画像を、励起波長４７０−４９５ｎｍ、蛍光波長５１０−５５０ｎｍの条件で、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス（株）製）を通じてＥＭ−ＣＣＤカメラで０分、１０分、３０分、６０分、１２０分経過時に撮像した（化合物３：図１２Ａ、化合物５：図１２Ｂ）。

（ｂ）結果
その結果、時間経過に伴い、細胞が発する蛍光強度が増大した。ＰＣ−９細胞の標識率は、化合物３、及び化合物５のどちらの場合も１００％であった。なお、「標識率」とは、蛍光像撮像写真の視野に存在する細胞のうち、蛍光を発する細胞の割合を意味し、以下の実施例でも同じ定義とした。

実施例１４
以下の条件で、本発明の４Ｈ−クロモン誘導体（１）（化合物３、化合物５）を細胞診断チップ上に固定化した癌細胞及び白血球細胞の混合体に接触させ、癌細胞の蛍光検出能を評価した。

（ａ）方法
ＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に採血したヒト健常者血液３ｍＬを等量の生理食塩水で希釈して計６ｍＬの希釈血液とした。前期希釈血液６ｍＬを２ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）に重層し、遠心（１１００×ｇ、１０分、２５℃）し、白血球細胞層を回収した。回収した白血球細胞を生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し、上澄みを捨てた後、再度生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）して上澄みを捨てることで、血小板の除去と、白血球細胞の洗浄とを同時に行った。次に、得られた白血球細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し、１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所社製）を加えて細胞核染色し、同時に抗ＣＤ−４５抗体（ＡＰＣ標識）（ミルテニーバイオテク社製）を加えて細胞表面染色を行った。続いて、染色を行った白血球細胞を３００ｍＭのマンニトール水溶液に懸濁し白血球細胞懸濁液を得た。

続いて、実施例１３と同様に培養したヒト肺腺癌由来の非小細胞肺癌細胞のＰＣ−９細胞がサブコンフルエントに達した後にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。処理した細胞に１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を加え、細胞核染色した。細胞核染色した細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、１×１０^５個／ｍＬの細胞密度になるように３００ｍＭのマンニトール水溶液に懸濁し、ＰＣ−９細胞懸濁液を調製した。

続いて、ＰＣ−９細胞の細胞密度が０．５×１０^５個／ｍＬ、白血球細胞の細胞密度が３．５×１０^５個／ｍＬにそれぞれなるよう、前記ＰＣ−９細胞懸濁液と前記白血球細胞懸濁液とを混合し、癌細胞及び白血球細胞の混合体を作製した。

細胞診断チップに前記癌細胞及び白血球細胞の混合体を導入し、交流電圧として電圧２０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したところ、細胞に誘電泳動力が作用し、１分程度の時間でアレイ状に配置した複数の微細孔に白血球細胞、およびＰＣ−９細胞を固定することができた。なお、細胞診断チップに導入した白血球細胞とＰＣ−９細胞のそれぞれの細胞密度の合計が、微細孔の密度（４．０×１０^５個／ｍＬ）と等しいため、１個の微細孔に概ね１個の白血球細胞もしくはＰＣ−９細胞が固定された。

細胞が固定された細胞診断チップに、引き続き交流電圧を印加しながら、０．０１％ ポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭ マンニトール水溶液を導入し、２分静置後、交流電圧の印加を停止し、細胞診断チップ内の溶液を吸引除去し、すぐさまＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を細胞診断チップに導入し、細胞診断チップ内のポリ−Ｌ−リジンを洗浄することで、微細孔内へ細胞を静電気的に結合することができた。なお、ポリ−Ｌ−リジンの作用により、白血球細胞、およびＰＣ−９細胞は微細孔内に静電気的に結合しているため、洗浄により微細孔から脱離することはない。

続いて、細胞診断チップ内の溶液を吸引除去し、５μＭの化合物３、または化合物５を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を導入した。細胞診断チップの蛍光画像を、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製）を通じてＥＭ−ＣＣＤカメラで０分、１５分、３０分、６０分、１２０分経過時に撮像した（化合物３：図１３Ａ、化合物５：図１３Ｂ）。なお、抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）由来の蛍光像は励起波長６００−６５０ｎｍ、蛍光波長６７０−７２０ｎｍの条件で撮像し、またＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２由来の蛍光像は励起波長３６０−３７０ｎｍ、蛍光波長４２０−４６０ｎｍの条件で撮像し、また化合物３及び化合物５由来の蛍光像は励起波長４７０−４９５ｎｍ、蛍光波長５１０−５５０ｎｍの条件で撮像した。以上の条件で撮像すると、全ての有核細胞はＨｏｅｃｈｓｔ３３４２によりその細胞核が蛍光染色され、また白血球細胞は抗ＣＤ４５（ＡＰＣ標識）により蛍光染色されることが分かる。従って、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２により蛍光染色され、抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）により蛍光染色される細胞が白血球細胞であり、またＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２により蛍光染色され、かつ抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ標識）により蛍光染色されない細胞はＰＣ−９細胞であることが分かる。

（ｂ）結果
その結果、時間経過に伴い、ＰＣ−９細胞が発する化合物３及び化合物５由来の蛍光強度が増大した。一方、白血球細胞が発する化合物３及び化合物５由来の蛍光強度は僅かであり、ＰＣ−９細胞と白血球細胞とを蛍光強度の違いから、細胞診断チップに固定した白血球細胞の集団の中から癌細胞を特異的に検出することが可能であることが分かった。

１：下部電極基板
２：上部電極基板
３：微細孔
４：絶縁体
５：遮光部材
６：スペーサー
７：導入口
８：排出口
９：保持部
１０：信号発生器
１１：導線
１２：生体試料固定装置（細胞診断チップ）
１３：電気力線
１４：誘電泳動力
１５：生体試料

Claims (8)

1. 一般式（１）
   

   

   （式中、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立に炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３は各々独立に水素原子、ハロゲン原子またはメトキシ基を表す。Ｒ^６は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７もしくは８のアラルキル基、またはベンゾイル基を表す。Ｒ^７は水素原子または炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０は各々独立に水素原子、ニトロ基またはトリフルオロメチル基を表す。ただし、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０のうち少なくとも一つはニトロ基を表す。ｎは０または１を表し、ｍは０または１を表し、ｋは１から１２の整数を表す。）で表される４Ｈ−クロモン誘導体。
2. Ｒ^８がニトロ基またはトリフルオロメチル基、Ｒ^９がニトロ基、Ｒ^１０が水素原子、ｋが１から６の整数である請求項１に記載の４Ｈ−クロモン誘導体。
3. Ｒ^２およびＲ^３がメチル基、Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３が水素原子である、請求項１または２に記載の４Ｈ−クロモン誘導体。
4. 一般式（２）
   

   

   （式中、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立に炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３は各々独立に水素原子、ハロゲン原子またはメトキシ基を表す。Ｒ^６は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７もしくは８のアラルキル基、またはベンゾイル基を表す。ｎは０または１を表し、ｍは０または１を表し、ｋは１から１２の整数を表す。）で表されるアミン誘導体を、塩基の存在下、一般式（３）
   

   

   （式中、Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０は各々独立に水素原子、ニトロ基またはトリフルオロメチル基を表す。ただし、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０のうち少なくとも一つはニトロ基を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。）で表されるアリールスルホニル化合物と反応させることを特徴とする、一般式（１ａ）
   

   

   （式中、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２、Ｒ^５−３、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、ｎ、ｍおよびｋは前記と同じ意味を表す。）で表される４Ｈ−クロモン誘導体の製造方法。
5. 一般式（１）
   

   

   （式中、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立に炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３は各々独立に水素原子、ハロゲン原子またはメトキシ基を表す。Ｒ^６は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７もしくは８のアラルキル基、またはベンゾイル基を表す。Ｒ^７は水素原子または炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０は各々独立に水素原子、ニトロ基またはトリフルオロメチル基を表す。ただし、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０のうち少なくとも一つはニトロ基を表す。ｎは０または１を表し、ｍは０または１を表し、ｋは１から１２の整数を表す。）で表される４Ｈ−クロモン誘導体よりなる蛍光プローブ。
6. 一般式（１）
   

   

   （式中、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立に炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３は各々独立に水素原子、ハロゲン原子またはメトキシ基を表す。Ｒ^６は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７もしくは８のアラルキル基、またはベンゾイル基を表す。Ｒ^７は水素原子または炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０は各々独立に水素原子、ニトロ基またはトリフルオロメチル基を表す。ただし、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０のうち少なくとも一つはニトロ基を表す。ｎは０または１を表し、ｍは０または１を表し、ｋは１から１２の整数を表す。）で表される４Ｈ−クロモン誘導体を用いることを特徴とする、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの検出方法。
7. 一般式（１）
   

   

   （式中、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立に炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^４−１、Ｒ^４−２、Ｒ^４−３、Ｒ^４−４、Ｒ^５−１、Ｒ^５−２およびＲ^５−３は各々独立に水素原子、ハロゲン原子またはメトキシ基を表す。Ｒ^６は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７もしくは８のアラルキル基、またはベンゾイル基を表す。Ｒ^７は水素原子または炭素数１から３のアルキル基を表す。Ｒ^８、Ｒ^９およびＲ^１０は各々独立に水素原子、ニトロ基またはトリフルオロメチル基を表す。ただし、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０のうち少なくとも一つはニトロ基を表す。ｎは０または１を表し、ｍは０または１を表し、ｋは１から１２の整数を表す。）で表される４Ｈ−クロモン誘導体を用いることを特徴とする、癌細胞の検出方法。
8. 正常細胞中に混在する癌細胞を検出する、請求項７に記載の癌細胞の検出方法。

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