JP2016064989A - 癌を治療するための医薬組成物、およびｐｄ−１阻害剤による治療に対する感受性を評価する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】癌を治療するための医薬組成物、PD-1阻害剤による治療に対する感受性を評価する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、miR-197もしくはその前駆体、もしくはそれらの変異体、または前記miR-197、前駆体もしくは変異体を発現するベクターを含む、癌を治療するための医薬組成物を提供する。また、本発明は、PD-L1関連疾患の患者において、PD-1阻害剤による治療に対する感受性を評価する方法であって、（i）前記患者から採取された生物試料中のmiR-197レベルを測定すること、および、（ii）前記miR-197レベルが基準値より低いとき、前記患者はPD-1阻害剤による治療に対する感受性が高いと評価すること、を含む方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、癌を治療するための医薬組成物に関する。本発明はまた、PD-1阻害剤による治療に対する感受性を評価する方法に関する。

PD-1（Programmed cell death 1）は、CD28ファミリー分子の一つであり、活性化B細胞、T細胞および骨髄細胞上に発現し，抑制性シグナルの導入に関わっている。PD-1は、そのリガンドであるPD-L1との相互作用の結果、腫瘍浸潤性リンパ球の減少、T細胞受容体を介した細胞増殖の低下、癌細胞の免疫回避を誘導することが知られている。抗PD-1抗体は、PD-1とPD-L1との相互作用を阻害することにより、癌を含むPD-L1関連疾患を治療しうる。抗PD-1抗体であるニボルマブおよびペムブロリズマブは、悪性黒色腫の治療薬として承認されており、また、非小細胞肺癌や腎細胞癌に対する治療効果も報告され、有望な癌治療薬として注目されている。

抗PD-1抗体の治療効果は、腫瘍におけるPD-L1の発現と相関することが知られている（非特許文献２６、２７）。しかしながら、抗PD-1抗体の治療効果を予測するためのバイオマーカーとして他に知られているものは存在しない。

特開２００６−３４０７１４号公報

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本発明は、癌を治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、PD-L1関連疾患の患者において、PD-1阻害剤による治療に対する感受性を評価する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、癌組織中のPD-L1の発現と癌組織中または血液中のmicroRNA-197（miR-197）レベルとの間に負の相関があること、miR-197が癌細胞におけるPD-L1の発現を抑制すること、さらに、miR-197が癌細胞の薬剤耐性を抑制することを見出し、本発明を完成した。

本発明は、miR-197もしくはその前駆体、もしくはそれらの変異体、または前記miR-197、前駆体もしくは変異体を発現するベクターを含む、癌を治療するための医薬組成物を提供する。

本発明は、PD-L1関連疾患の患者において、PD-1阻害剤による治療に対する感受性を評価する方法であって、
（i）前記患者から採取された生物試料中のmiR-197レベルを測定すること、および、
（ii）前記miR-197レベルが基準値より低いとき、前記患者はPD-1阻害剤による治療に対する感受性が高いと評価すること、
を含む方法を提供する。

本発明により、新たな癌治療薬が提供される。また、本発明により、PD-1阻害剤による治療に対する感受性を評価することが可能となる。

図１Ａは、microRNA（miRNA）マイクロアレイのためのコホート試験の患者選抜の説明図である。 図１Ｂは、応答群および非応答群における腫瘍および隣接する正常組織中で示差的に発現するmiRNAを示すmiRNAマイクロアレイ解析のヒートマップを示す。 図１Ｃは、肺腫瘍および隣接する正常組織中のmiR-197の発現レベルの定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）解析の結果を示す。*P<0.05、**P<0.01（以下の図についても同じ）。 図１Ｄは、ヒト肺癌細胞株におけるmiR-197の発現レベルのqRT-PCR解析の結果を示す。 図１Ｅは、肺腺癌組織のヘマトキシリン/エオジン（HE）染色、および肺腺癌組織にmiR-197特異的プローブまたはスクランブルコントロールプローブをイン・サイチュでハイブリダイズした結果を示す。倍率：x100。 図１Ｆは、pre-miR-197またはLNA-miR-197の一過性トランスフェクション、およびシスプラチン(CDDP)またはパクリタキセル（TXL）処理後のIC₅₀を示す。各グラフ中のカラムは、左から、NC、pre-miR-197、LNA-NC、およびLNA-miR-197の結果を示す。NC：陰性対照（以下の図についても同じ）。 図２Ａは、miR-197センサーベクターまたはその変異ベクターに対する、A549-miR-197-TuD、PC14-miR-197-TuD、およびPC14CDDP-miR-197細胞のルシフェラーゼ活性を、それぞれの対照細胞株と比較した結果を示す。 図２Ｂは、PC14-miR-197-TuD細胞およびPC14CDDP-miR-197細胞とそれぞれの対照細胞の成長速度を示す。 図２Ｃは、細胞浸潤に対するmiR-197の効果を示す代表的画像および定量結果を示す。グラフ中、A549およびPC14細胞については、左のカラムが陰性対照細胞（TuD-NC）、右のカラムがmiR-197-TuD発現細胞（miR-197-TuD）の結果を示し、PC14CDDP細胞については、左のカラムが陰性対照細胞（Vector）、右のカラムがmiR-197過剰発現細胞（miR-197）の結果を示す。値は、対照細胞の値に対して正規化した。 図２Ｄは、細胞遊走に対するmiR-197の効果を示す代表的画像および定量結果を示す。グラフ中、A549およびPC14細胞については、左のカラムが陰性対照細胞（TuD-NC）、右のカラムがmiR-197-TuD発現細胞（miR-197-TuD）の結果を示し、PC14CDDP細胞については、左のカラムが陰性対照細胞（Vector）、右のカラムがmiR-197過剰発現細胞（miR-197）の結果を示す。値は、対照細胞の値に対して正規化した。 図３Ａは、PC14-miR-197-TuD細胞またはPC14-TuD-NC細胞を移植したマウス全身からの生物発光の変化を示す。 図３Ｂは、PC14-miR-197-TuD細胞またはPC14-TuD-NC細胞を移植したマウスの全肺の代表的写真を示す。矢印は、原発性肺小塊を示し、三角は転移性小塊の表面を示す。スケールバーは100 μmである。 図３Ｃは、PC14-miR-197-TuD細胞またはPC14-TuD-NC細胞を移植したマウスの右肺のHE染色の代表的写真を示す。スケールバーは100 μmである。 図３Ｄは、PC14-miR-197-TuD細胞またはPC14-TuD-NC細胞を移植したマウスにおける、目視可能な表面転移性病変を示す（各群10匹）。 図３Ｅは、PC14-miR-197-TuD細胞またはPC14-TuD-NC細胞を移植したマウスの全体重あたりの肺重量の割合を示す（各群10匹）。 図３Ｆは、CDDPの反復投与試験のプロトコールを示す（各群10匹）。 図３Ｇは、CDDPの反復投与後の肺腫瘍成長の代表的生物発光画像を示す。 図３Ｈは、PC14-miR-197-TuD細胞またはPC14-TuD-NC細胞を移植したマウスの全生存率をカプラン・マイヤー法により評価した結果を示す。 図４Ａは、miR-197による標的遺伝子の抑制を示すデュアル−ルシフェラーゼアッセイの結果を示す。 図４Ｂは、pre-miR-197またはLNA-miR-197をトランスフェクトした細胞におけるCKS1BのmRNAレベルのqRT-PCR解析の結果を示す。グラフ中の各細胞についてのカラムは、左から、NC、pre-miR-197、LNA-NC、およびLNA-miR-197の結果を示す。 図４Ｃは、CKS1BをノックダウンしたA549細胞における細胞増殖アッセイの結果を示す。 図４Ｄは、CKS1Bをノックダウンした細胞におけるIC₅₀（CDDPまたはTXL）を示す。 図４Ｅは、CKS1Bのノックダウンによる細胞浸潤に対する効果の定量結果を示す。 図４Ｆは、CKS1Bのノックダウンによる細胞遊走に対する効果の定量結果を示す。 図４Ｇ（上）は、PD-L1プロモーター調節モジュールを示す。STAT3結合部位を太字で示した。この領域を、pGL-ルシフェラーゼベクターにクローニングした（pGL4-PD-L1p）。図４Ｇ（下）は、STAT3-siRNA、LNA-miR-197、または各陰性対照により処理されたPC14CDDP細胞におけるpGL4-PD-L1pルシフェラーゼ活性の解析結果を示す。 図４Ｈは、PC14CDDP細胞における、LNA-miR-197処理後のCKS1B/STAT3シグナル伝達と関連する標的遺伝子のウエスタンブロット解析の結果を示す。 図５Ａは、pre-miR-197またはLNA-miR-197をトランスフェクトした細胞におけるPD-L1のmRNAレベルのqRT-PCR解析の結果を示す。グラフ中の各細胞についてのカラムは、左から、NC、pre-miR-197、LNA-NC、およびLNA-miR-197の結果を示す。 図５Ｂは、PC14またはPC14CDDP細胞におけるmiR-197のノックダウンまたは過剰発現により誘導されるPD-L1発現のフロー・サイトメトリー（FCM）解析の結果を示す。 図５Ｃは、コホート試験の肺腫瘍中のPD-L1のmRNAレベルのqRT-PCR解析の結果を示す。 図５Ｄは、PC14CDDP細胞からのPD-L1^high細胞およびPD-L1^low細胞を精製するためのFCM細胞ソーティング、PD-L1^high細胞およびPD-L1^low細胞へのpre-miR-197のトランスフェクション後のIC₅₀（CDDPまたはTXL）を示す。各グラフ中、両端のカラムはPD-L1^high細胞の結果を示し、中央のカラムはPD-L1^low細胞の結果を示す。 図５Ｅは、検証コホート試験におけるmiR-197の発現と生存期間との関係を示す（P=0.0149、n=177）。 図５Ｆは、miR-197の発現とPD-L1の発現との間のスキャッタープロットを示す（P=0.026、n=177）。 図５Ｇは、NSCLCにおける癌の進行および薬剤耐性の新規シグナル伝達経路の説明図である。miR-197/CKS1B/STAT3経路は、様々な腫瘍形成遺伝子のみならず、このシグナル伝達に関する推定バイオマーカーとしてのPD-L1もまた制御する。 図６Ａは、コホート試験におけるmiRNAマイクロアレイの統計学的解析の説明図である。 図６Ｂは、miR-197またはmiR-1260と全生存期間との相関関係を示すカプラン・マイヤー曲線を示す(miR-197; P=0.014, miR-1260; P=0.037)。miRNA発現の中央値を高発現（High）および低発現（Low）患者の区別に用いた。 図７Ａは、3Dスフェロイドアッセイにおいて増殖した細胞の代表的画像および定量結果を示す。グラフ中、A549およびPC14細胞については、左のカラムが陰性対照細胞（TuD-NC）、右のカラムがmiR-197-TuD発現細胞（miR-197-TuD）の結果を示し、PC14CDDP細胞については、左のカラムが陰性対照細胞（Vector）、右のカラムがmiR-197過剰発現細胞（miR-197）の結果を示す。スケールバーは100 mmである。 図７Ｂは、PC14-miR-197-TuD細胞およびPC14CDDP-miR-197細胞における肺癌開始関連遺伝子の発現のqRT-PCR解析の結果を示す。上のグラフ中、各遺伝子についての左のカラムはPC14-miR-197-TuD細胞の結果を示し、右のカラムは陰性対照細胞の結果を示す。下のグラフ中、各遺伝子についての左のカラムはPC14CDDP-miR-197細胞の結果を示し、右のカラムは陰性対照細胞の結果を示す。実験は少なくとも３回行い、同様の結果を得た。エラーバーは平均±SDを示す。 図８は、miR-197の標的候補の予測の説明図である。予測解析には、２種類のアルゴリズムとin silicoデータベースを使用した。 図９Ａは、CTNND1、ERLIN2、CKS1B、およびCEP55の3'UTRにおけるmiR-197の推定標的部位、および3'UTR変異体の配列を示す。 図９Ｂは、pre-miR-197と各遺伝子の野生型（Wt）または変異体（Mut）psiCHECK2（商標）ベクターとをコトランスフェクションしたA549細胞におけるルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す。グラフ中、各遺伝子についてのカラムは、左から、Wt+NC、Wt+pre-miR-197、Mut+NC、およびMut+pre-miR-197の結果を示す。実験は少なくとも３回行い、同様の結果を得た。エラーバーは平均±SDを示す。 図１０は、CKS1Bのノックダウン後の、CKS1B下流の標的のウェスタンブロット解析の結果を示す。実験は少なくとも３回行い、同様の結果を得た。 図１１は、A549、PC14、およびPC14CDDP細胞におけるPD-L1レベルのFCM解析の結果を示す。実験は少なくとも３回行い、同様の結果を得た。 図１２は、NSCLC患者の腫瘍内PD-L1と血漿中miR-197の間のスキャッタープロットを示す。

１．本発明の医薬組成物
miRNAは、約２０−２５塩基の非コードRNAであり、遺伝子の発現調節に関与する。miRNAは、miRNA前駆体に転写されるゲノム上に存在する遺伝子から生成される。まず、遺伝子から一次転写産物であるpri-miRNAが転写され、次いで、pri−miRNAが核内でDroshaと呼ばれるRNase IIIによりプロセシングされ、約70塩基程度のヘアピン構造を有するpre-miRNAが生成される。その後、pre-miRNAは細胞質に輸送され、Dicerと呼ばれるRNase IIIによりプロセシングされて、約２０−２５塩基の成熟型miRNAが生成される。

本明細書において、miRNAの「前駆体」は、前記pri-miRNAとpre-miRNAの両方を意味する。すなわち、「miR-197の前駆体」は、miR-197のpri-miRNAおよびpre-miRNAの両方を意味する。本明細書において、miR-197のpri-miRNAおよびpre-miRNAは、それぞれ「pri-miR-197」および「pre-miR-197」とも記載される。「pri-miR-197」および「pre-miR-197」は、生体に投与されると、上記のとおり生体内でプロセシングされてmiR-197を生じ、miR-197と同じ機能を発揮する。

miR-197、pre-miR-197、およびpri-miR-197の配列の例を以下に示すが、これに限定されるものではない。また、pre-miR-197はmiR-197を含んだ配列であればよく、pri-miR-197はpre-miR-197を含んだ配列であればよい。

miR-197：uucaccaccuucuccacccagc（配列番号１）

pre-miR-197：cggguagagagggcagugggagguaagagcucuucacccuucaccaccuucuccacccagc（配列番号２）；または、
uucaccaccuucuccacccagc（配列番号１）とcggguagagagggcagugggagg（配列番号３）によって、以下の式（I）の二次構造をとる前駆体

式（I）

pri-miR-197：ggcugugccggguagagagggcagugggagguaagagcucuucacccuucaccaccuucuccacccagcauggcc（配列番号４）

本明細書において、miR-197またはその前駆体の「変異体」には、miR-197、pri-miR-197、またはpre-miR-197の配列と60％、70％、80％、85％、90％、または95％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上の配列同一性を有し、miR-197の機能を保持するRNA分子が含まれる。「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の配列は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。配列同一性は、公共のデータベース（例えば、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp））で提供されるFASTA、BLAST、CLUSTAL W等のプログラムを用いて算出することができる。あるいは、市販の配列解析ソフトウェア（例えば、Vector NTI（登録商標）ソフトウェア、GENETYX（登録商標） ver. 12）を用いて求めることもできる。また、miR-197またはその前駆体の「変異体」には、miR-197、pri-miR-197、またはpre-miR-197の配列において、1個から数個、好ましくは1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列を有し、miRNA-197の機能を保持するRNA分子が含まれる。本明細書において、「miR-197もしくはその前駆体、またはそれらの変異体」を「本発明のmiRNA」とも記載する。

本発明のmiRNAは、公知の方法を用いて合成することができる。本発明のmiRNAを構成する核酸は、天然の核酸であっても、安定性の向上した核酸誘導体などの非天然の核酸であってもよい。核酸誘導体としては、例えばメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミデート、ホスホトリエステル、スルホン、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋型ホスホラミデート、架橋型メチレンホスホネート、架橋型ホスホロチオエート、ジメチレン-スルフィド、ジメチレン-スルホキシド、ジメチレン-スルホン、2'-O-アルキル、または2'-デオキシ-2'-フルオロホスホロチオエートのヌクレオシド間結合を含む核酸、LNA（Locked Nucleic Acid）、ENA（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acid）などが挙げられる。また、核酸誘導体には、2'または3'糖修飾を含む核酸、例えば2'-O-メチル（2'-O-Me）化ヌクレオチドまたは2'-デオキシヌクレオチド、または2'-フルオロ、ジフルオロトルイル、5-Me-2'-ピリミジン、5-アリルアミノ-ピリミジン、2'-O-メトキシエチル（2'-O-MOE）、2'-O-アミノプロピル（2'-O-AP）、2'-O-N-メチルアセタミド（2'-O-NMA）、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル（2'-DMAEOE）、2'-O-ジメチルアミノエチル（2'-O-DMAOE）、2'-O-ジメチルアミノプロピル（2'-O-AP）、2'-ヒドロキシヌクレオチド、ホスホロチオエート、4'-チオヌクレオチド、2'-O-トリフルオロメチルヌクレオチド、2'-O-エチル-トリフルオロメトキシヌクレオチド、2'-O-ジフルオロメトキシ-エトキシヌクレオチド、または2'-アラ−フルオロヌクレオチド、などを含む核酸が含まれる。

本発明の医薬組成物は、本発明のmiRNAをコードするDNAを含み、生体内で本発明のmiRNAを発現するベクターを含んでいてもよい。ベクターは、ウイルスベクターであっても、非ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルス、センダイウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ニワトリポックスウイルス、SV40を代表とするパポバウイルス等に由来するベクターが例示される。好ましくは、ベクターはアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来するウイルスである。非ウイルスベクターとしては、Pol Iプロモーター、Pol IIプロモーター、Pol IIIプロモーター、バクテリオファージ（T4ファージやT7ファージのRNAポリメラーゼ認識配列）のプロモーター等を有するベクターが挙げられる。Pol IIプロモーターとしては、CMVプロモーターやβ-グロブリンプロモーターなどを、Pol IIIプロモーターとしては、U6プロモーター、H1プロモーター、tRNAプロモーター、7SKプロモーター、7SLプロモーター、Y3プロモーター、5S rRNAプロモーター、Ad2 VAIおよびVAIIプロモーターなどが例示される。これらのプロモーターを有するベクターは市販されており、容易に入手可能である。

本発明のmiRNAおよびベクターは、患者にそのまま投与してもよく、リポソーム、アテロコラーゲン、自己組織化ペプチド、ナノパーティクル、カチオンポリマーおよびデンドリマーなどを担体として投与してもよい。リポソームとしては、N-［2,3-（ジオレイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）などが例示される。本発明のmiRNAおよびベクターは、コレステロールや抗体などとのコンジュゲートとして投与してもよい。投与方法としては、経口投与および非経口投与が挙げられるが、非経口投与が好ましい。非経口投与としては、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、および直腸内投与などが例示される。本発明の医薬組成物は、本発明のmiRNAまたはベクターに加えて、医薬上許容される担体（例えば、滅菌水、生理食塩水など）、安定剤（例えば、ヌクレアーゼ阻害剤など）、キレート剤（例えば、EDTAなど）、およびその他の助剤を含んでもよい。

本発明の医薬組成物の投与量および投与頻度は、使用目的、患者の年齢、体重、性別、既往歴、疾患の重篤度、有効成分の種類などを考慮して、適宜決定することができる。投与量は、例えば、miRNAの場合、成人1回あたり1.0μg/kg〜1.0 g/kg、好ましくは10μg/kg〜100 mg/kgであり、ウイルスベクターの場合、ウイルスの最終的な力価として10⁷〜10¹³pfu/mL、好ましくは10⁹〜10¹² pfu/mLである。投与頻度は、例えば、1日1回〜数ヶ月に1回である。

PD-1阻害剤は、PD-1とそのリガンドであるPD-L1との相互作用を阻害することにより、癌を含むPD-L1関連疾患に対する治療効果を発揮する。一方、本発明者らは、miR-197が癌細胞においてPD-L1の発現を抑制することを見出した。よって、本願発明のmiRNAまたはベクターを含む医薬組成物は、PD-L1の発現を抑制し、PD-1およびPD-L1からのシグナル伝達を阻害することにより、癌を治療することができる。ある態様において、癌は、PD-L1陽性癌である。別の態様において、癌は、患者の癌組織中または血液中においてmiR-197またはその前駆体の減少が観察される癌である。癌組織中または血液中のmiR-197またはその前駆体は、後述するとおり、qRT-PCR法、マイクロアレイ法などにより測定することができる。

具体的な癌としては、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、メラノーマ（例えば、転移性悪性メラノーマ）、腎癌（例えば、透明細胞カルシノーマ）、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺アデノカルシノーマ）、大腸癌（例えば、結腸癌）、乳癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚若しくは眼窩内悪性メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管のカルシノーマ、子宮内膜カルシノーマ、子宮頚部カルシノーマ、膣カルシノーマ、外陰部カルシノーマ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫）、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、柔組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、肝細胞癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性若しくは急性白血病、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓若しくは尿管の癌、腎盂カルシノーマ、中枢神経系（CNS）腫瘍（例えば、膠芽腫）、原発性CNSリンパ腫、腫瘍新脈管形成、脊椎腫瘍、脳幹グリオーム、下垂体アデノーマ、カポシ肉腫、扁平上皮癌、扁平細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベスト誘発癌を含む環境誘発癌が例示される。癌は、好ましくは、肺癌、メラノーマ、腎癌、前立腺癌、食道癌、頭頚部癌、膠芽腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、肝細胞癌、乳癌、胃癌、膵癌、膀胱癌および結腸癌であり、より好ましくは、非小細胞肺癌である。

本願発明の医薬組成物は、他の抗癌剤と併用することができる。併用される抗癌剤としては、例えば、アルキル化剤（シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、メルファラン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、テモゾロミド等）、白金製剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、フルオロウラシル、テガフール、ドキシフルリジン、カペシタビン、シタラビン、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、ヒドロキシウレア等）、抗腫瘍性抗菌薬（例えば、塩酸ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、塩酸イダルビシン、ピラルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸アムルビシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、アクラルビシン、ジノスタチン等）、微小管阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル等）、トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、イリノテカン、トポテカン、エトポシド等）、ホルモン療法剤（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、タモキシフェン、トレミフェン、酢酸メドロキシプロゲステロン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリン、フルタミド、ビカルタミド、リン酸エストラムスチン、ホスフェストロール、酢酸クロルマジノン、メピチオスタン、メチルテストステロン等）、免疫賦活剤（例えば、インターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ−１ａ、インターフェロンγ−ｎ１、ピシバニール、クレスチン、ＧＶＡＸ等）、分子標的薬（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、イマチニブ、ゲフィニチブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ボルテゾミブ、エルロチニブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、パニツムバブ、ペガプタニブ、バタラニブ、ラニビツマブ、ＳＵ−６６６８、ＳＵ−１１２４８、ネオバスタット、バンデタニブ、テムシロリムス、エベロリムス、シロリムス等）、免疫チェックポイント阻害剤（ニボルマブ、イピリムマブ等）などが例示される。本願発明の医薬組成物と他の抗癌剤とは、単一の製剤に含まれていても、別の製剤に含まれていてもよい。すなわち、本願発明の医薬組成物は、本発明のmiRNAまたはベクターに加えて、さらに他の抗癌剤を含んでいてもよい。

本発明者らは、miR-197が癌細胞の薬剤耐性を抑制することを見出した。よって、本発明のmiRNAまたはベクターを含む医薬組成物は、薬剤耐性癌の治療に用いることができる。薬剤耐性癌としては、例えば、アルキル化剤（シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、メルファラン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、テモゾロミド等）、白金製剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、フルオロウラシル、テガフール、ドキシフルリジン、カペシタビン、シタラビン、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、ヒドロキシウレア等）、抗腫瘍性抗菌薬（例えば、塩酸ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、塩酸イダルビシン、ピラルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸アムルビシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、アクラルビシン、ジノスタチン等）、微小管阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル等）、トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、イリノテカン、トポテカン、エトポシド等）、ホルモン療法剤（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、タモキシフェン、トレミフェン、酢酸メドロキシプロゲステロン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリン、フルタミド、ビカルタミド、リン酸エストラムスチン、ホスフェストロール、酢酸クロルマジノン、メピチオスタン、メチルテストステロン等）、免疫賦活剤（例えば、インターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ−１ａ、インターフェロンγ−ｎ１、ピシバニール、クレスチン、ＧＶＡＸ等）、分子標的薬（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、イマチニブ、ゲフィニチブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ボルテゾミブ、エルロチニブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、パニツムバブ、ペガプタニブ、バタラニブ、ラニビツマブ、ＳＵ−６６６８、ＳＵ−１１２４８、ネオバスタット、バンデタニブ、テムシロリムス、エベロリムス、シロリムス等）、免疫チェックポイント阻害剤（ニボルマブ、イピリムマブ等）などの抗癌剤に耐性の癌が挙げられる。好ましくは、薬剤耐性癌は、シスプラチンまたはパクリタキセルに耐性の癌である。また、本願発明の医薬組成物は、薬剤耐性の原因となる抗癌剤、例えばアルキル化剤（シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、メルファラン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、テモゾロミド等）、白金製剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、フルオロウラシル、テガフール、ドキシフルリジン、カペシタビン、シタラビン、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、ヒドロキシウレア等）、抗腫瘍性抗菌薬（例えば、塩酸ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、塩酸イダルビシン、ピラルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸アムルビシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、アクラルビシン、ジノスタチン等）、微小管阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル等）、トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、イリノテカン、トポテカン、エトポシド等）、ホルモン療法剤（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、タモキシフェン、トレミフェン、酢酸メドロキシプロゲステロン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリン、フルタミド、ビカルタミド、リン酸エストラムスチン、ホスフェストロール、酢酸クロルマジノン、メピチオスタン、メチルテストステロン等）、免疫賦活剤（例えば、インターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ−１ａ、インターフェロンγ−ｎ１、ピシバニール、クレスチン、ＧＶＡＸ等）、分子標的薬（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、イマチニブ、ゲフィニチブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ボルテゾミブ、エルロチニブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、パニツムバブ、ペガプタニブ、バタラニブ、ラニビツマブ、ＳＵ−６６６８、ＳＵ−１１２４８、ネオバスタット、バンデタニブ、テムシロリムス、エベロリムス、シロリムス等）、免疫チェックポイント阻害剤（ニボルマブ、イピリムマブ等）、特にシスプラチンまたはパクリタキセルなどの抗癌剤との併用に好適である。本願発明の医薬組成物は、薬剤耐性を獲得していない癌に対しても、薬剤耐性癌に対しても、他の抗癌剤と併用して用いることができる。

２．PD-1阻害剤による治療に対する感受性を評価する方法
本発明の方法は、PD-L1関連疾患の患者において、PD-1阻害剤による治療に対する感受性を評価する方法であって、
（i）前記患者から採取された生物試料中のmiR-197レベルを測定すること、および、
（ii）前記miR-197レベルが基準値より低いとき、前記患者はPD-1阻害剤による治療に対する感受性が高いと評価すること、
を含む。

PD-1阻害剤は、PD-1とそのリガンドであるPD-L1との相互作用を阻害し、PD-1およびPD-L1からのシグナル伝達を阻害する。PD-1阻害剤としては、例えば抗PD-1抗体（ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ANA-011、MEDI-0680等）、抗PD-L1抗体（MSB-0010718C、MEDI-4736、MPDL-3280A、MDX-1105等）、B7-DC Fc（AMP224など）等が挙げられる。PD-1阻害剤は、好ましくは、抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体であり、より好ましくは抗PD-1抗体である。

抗PD-1抗体は、PD-1とそのリガンドであるPD-L1との相互作用を阻害し、PD-1およびPD-L1からのシグナル伝達を阻害することにより、PD-L1関連疾患に対する治療効果を発揮する（特許文献１）。PD-L1関連疾患としては、癌、感染性疾患、および自己抗原に対する免疫応答の誘導により治療される疾患が例示される。

ある態様において、癌は、PD-L1陽性癌である。別の態様において、癌は、患者の癌組織中または血液中においてmiR-197またはその前駆体の減少が観察される癌である。具体的な癌としては、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、メラノーマ（例えば、転移性悪性メラノーマ）、腎癌（例えば、透明細胞カルシノーマ）、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺アデノカルシノーマ）、大腸癌（例えば、結腸癌）、乳癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚若しくは眼窩内悪性メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管のカルシノーマ、子宮内膜カルシノーマ、子宮頚部カルシノーマ、膣カルシノーマ、外陰部カルシノーマ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫）、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、柔組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、肝細胞癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性若しくは急性白血病、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓若しくは尿管の癌、腎盂カルシノーマ、中枢神経系（CNS）腫瘍（例えば、膠芽腫）、原発性CNSリンパ腫、腫瘍新脈管形成、脊椎腫瘍、脳幹グリオーム、下垂体アデノーマ、カポシ肉腫、扁平上皮癌、扁平細胞癌、T細胞リンパ腫、アスベスト誘発癌を含む環境誘発癌が例示される。癌は、好ましくは、肺癌、メラノーマ、腎癌、前立腺癌、食道癌、頭頚部癌、膠芽腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、肝細胞癌、乳癌、胃癌、膵癌、膀胱癌および結腸癌であり、より好ましくは、非小細胞肺癌である。

感染性疾患としては、HIV、肝炎（A、BまたはC）、ヘルペスウイルス（例えば、VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、およびCMV、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、おたふくかぜウイルス、ロタウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクチシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスなどの病原性ウイルス；クラミジア、リケッチアバクテリア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、ニューモコッカス、髄膜炎菌およびコノコッカス、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、テタヌス、ボツリズム、炭素菌、ペスト、レストスピラ症およびライムス病菌などの病原菌；カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス等）、クリプトコッカスネオフォルマンス、アスパルギルス（フミガツス、ニゲル等）、ムコラレス属（ムコル、アブスディア、リゾファス）、スポロスリックスシェンキ、ブラストマイセスデルマチチディス、パラコッキジオイデスブラシリエンシス、コッキジオイデスイミチスおよびヒストプラズマカプスラツムなどの病原性真菌；および、赤痢アメーバ寄生体、大腸バランチジウム、ナエグレリアファウレリ、アカンテャモエーバ種、ジアルジアランビア、クリプトスポリジウム種、ニューモシスチスカリニ、プラスモディウムビバックス、バベシアミクロチ、トリパノゾーマブルーセイ、クルーズトリパノゾーマ、リューシュマニアドノヴァニ、トキシプラズマゴンジ、およびブラジル鉤虫などの病原性寄生体により起こる感染性疾患が挙げられる。

自己抗原に対する免疫応答の誘導により治療される疾患としては、脳内アミロイド沈着物におけるAβタンパク質の不適切な集積を伴うアルツハイマー病、IgEの過剰産生を伴うアレルギー性疾患や喘息、TNFαの過剰産生を伴うリウマチ性関節炎などが挙げられる。

生物試料としては、癌組織試料および血液試料を用いることができる。癌組織試料は、例えば、腫瘍の外科的切除または生検により得られた癌組織試料である。血液試料には、全血、血漿、および血清試料が含まれる。生物試料は、公知の方法により患者から採取することができる。好ましくは、生物試料は、PD-1阻害剤（好ましくは抗PD-1抗体）による治療を受ける前に患者から採取する。

miR-197レベルの測定のため、患者から採取された生物試料から全RNA（total RNA）を抽出する。miR-197レベルは、miR-197の塩基配列に基づいて設計されたプライマーおよび／またはプローブを使用して例えば、qRT-PCR法、マイクロアレイ法、次世代シーケンサー法、一分子シーケンシング法等により測定することができる。本発明の方法において測定されるmiR-197には、配列番号１に示される配列を有するものに加えて、前記配列に天然に生じる変異による塩基の欠失、置換、または付加が生じた配列を有するmiR-197も含まれる。

qRT-PCR法は、miR-197の配列を増幅し得るプライマーセットを用いる方法であり、SYBR（登録商標） Green Iを用いる方法、サイクリングプローブ法やTaqMan（登録商標）プローブ法などの蛍光プローブを用いる方法が例示される。miR-197レベルは、TaqMan（登録商標）MicroRNA Assay（has-miR-197-3p, cat#4427975）などの市販のキットを用いて測定することもできる。

本発明のキットは、患者から採取された生物試料中のmiR-197レベルを測定するためのプライマーセット（および所望により蛍光プローブ）またはプローブを含む。本発明のキットは、プライマーセットまたはプローブに加えて、例えば、生物試料からのRNA抽出、RNAの標識、ハイブリダイゼーション、洗浄等に用いる試薬をさらに含んでいてもよい。

測定されたmiRNAレベルは、基準値と比較される。基準値は、例えば、ある患者群において、患者の癌組織試料中のPD-L1レベルと、生存期間またはRECIST（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors）などにより評価した患者のPD-1阻害剤(好ましくは抗PD-1抗体)による治療に対する感受性との相関関係から、PD-1阻害剤(好ましくは抗PD-1抗体)による治療に対する感受性が高いと評価されるPD-L1レベルの下限値を得て、次に、患者の癌組織試料中のPD-L1レベルと、患者の生物試料中のmiR-197レベルとの相関関係から、前記PD-L1レベルの下限値に対応するmiR-197レベルを得ることにより決定することができる。評価対象の患者の生物試料中のmiR-197レベルが基準値よりも低い場合に、その患者はPD-1阻害剤(好ましくは抗PD-1抗体)による治療に対する感受性が高いと評価される。

本発明の方法は、PD-1阻害剤による治療効果の予測や、PD-1阻害剤による治療を施す患者の選択などに用いることができる。

本発明をさらに下記の実施例で説明するが、これら実施例は如何なる意味においても本発明を限定するものではない。

１．方法
臨床肺癌試料
試験プロトコールは、国立がん研究センターの施設内倫理委員会により承認された（番号：2012-054）。材料は全て、書面による同意と共に得ており、国立がん研究センターバイオバンクから提供された。ヒト肺組織の試料はいずれも、1997年から2010年の間に国立がん研究センター病院内の呼吸器外科で肺切除後に再発した肺癌患者の摘出肺から得た。国立がん研究センター病院の呼吸器内科から得た臨床データべースにしたがって、miRNAのマイクロアレイ解析のために29の肺癌組織試料および対応する正常肺組織を選抜し、検証コホート試験のために177の肺癌組織試料を選抜した（表１および２）。本試験では、非小細胞肺がん（NSCLC）（腺癌または扁平上皮細胞癌）と診断された患者を登録した。外科検体を摘出後、研究者は組織をバイオバンクに直ちに輸送した。組織は液体窒素内で即時凍結した後に-80℃で貯蔵した。全ての腫瘍は病理学者により精査され、WHOの腫瘍分類に従って病理学的に診断された。

臨床肺癌試料における化学療法応答
白金製剤ベースの化学療法に対する腫瘍の化学療法応答を、下記のようなRECIST（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors）に従って臨床学的に評価した：１）完全奏効（CR）、全ての既存の疾患の消失；２）部分奏効（PR）、全身腫瘍組織量の30％以上の低減；３）疾患安定（SD）、全身腫瘍組織量の30％未満の低減または20％未満の増加；および４）疾患進行（PD）、全身腫瘍組織量の20％以上の増加または新規病変の出現。本試験では、CRおよびPR患者を応答群とし、PD患者を非応答群とした。再発後、白金製剤ベースの化学療法を4サイクル以上行った。根治的切除後に補助化学療法を受けた症例はなかった。

細胞培養
ヒト肺癌細胞株A549、PC9、PC14、H226、H358、およびH69、並びにヒト気管支上皮細胞株BEAS-2BをATCC(Manassas, USA)から購入した。PC9CDDP、PC14CDDP（非特許文献２４）、およびH69TXLは、国立がん研究センター腫瘍内科の支援ラボから提供された。これらの細胞は、37℃、5％CO₂にて、10％の熱不活化ウシ胎児血清（FBS）およびAntibiotic-Antimycotic (Invitrogen)を含むRPMI1640培地中で維持した。

RNA抽出、qRT-PCR、およびマイクロアレイ解析
培養細胞またはヒト肺から、QIAzol（登録商標）およびmiRNeasy Mini Kit (Qiagen)を製造元の説明書にしたがい用いて、全RNAを抽出した。臨床試料は全て、RIN（RNA Integrity Number）＞6.0を示した。qRT-PCRの方法は既報のとおりである（非特許文献２５）。反応はいずれもトリプリケートで実施した。Hsa-miR-197、内部標準RNU6B、RNU44のTaqMan (登録商標) qRT-PCRキット、ヒトCKS1B、ヒトPD-L1、およびヒトβ-アクチンのTaqMan (登録商標） Gene Expression Assayは、Applied Biosystemsから購入した。SYBR (登録商標) Green I qRT-PCRを実施して、β-アクチンハウスキーピング遺伝子を用いて、cDNAレベルの変動を正規化した。全てのプライマー配列を表３に示した。マイクロアレイにより肺組織中のmiRNAを検出するため、500 ngの全RNAを標識し、製造元の説明書にしたがって3D-Gene（登録商標） miRNA Oligo chip (Ver. 17.0) (東レ株式会社)にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションシグナルを、3D-Gene (登録商標) Scanner 3000 (東レ株式会社)を用いて検出し、このスキャン画像を、3D-Gene (登録商標) extraction software (東レ株式会社)を用いて解析した。細胞内のmRNAを検出するため、100 ngの全RNAを標識し、SurePrint G3 Human GE v2 8x60K Microarray (Agilent Technologies) を製造元の説明書にしたがい用いてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションシグナルは、DNAマイクロアレイスキャナー (Agilent Technologies)を用いて検出した。

細胞生存試験
Cell Countign Kit-8 (CCK-8) (株式会社 同仁化学研究所)を、細胞生存試験に使用した。1ウェルあたり3000個の細胞を96ウェルプレートに播種した。翌日、細胞に各miRNAまたはsiRNA (25 nM)を含有する新鮮培地を補充した。この細胞を細胞増殖試験または細胞毒性試験に使用した。細胞増殖試験では、24時間、48時間、72時間、96時間、および120時間後に10 μlのCCK-8溶液を各ウェルに添加し、37℃で4時間さらにインキュベートした。450 nmでの吸光度をEnvision (PerkinElmer)を用いて測定した。細胞毒性試験では、翌日に培地を吸引除去し、様々な濃度のCDDPまたはTXLを含有する新鮮培地と交換した。培養3日後に、各ウェルにCCK-8溶液（10 μl）を添加し、さらに37℃で4時間インキュベートした。450 nmでの吸光度をEnvision (PerkinElmer)を用いて測定した。細胞生存率は、対照（非処理）細胞の値に対する割合（％）として表示した。各濃度のCDDPおよびTXLについて、8つのウェルからの平均吸光度の平均値を算出した。IC₅₀ (細胞増殖を50％阻害するのに必要な薬物濃度)を、各細胞株についての用量−反応曲線からもとめた。実験はいずれも独立に3回行った。

細胞浸潤および遊走試験
トランスウェル遊走試験のため、マトリゲルコーティングをしていない各インサート(孔サイズ 8μm；BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)の最上部のチャンバーに50,000細胞をセットした。浸潤試験のため、24ウェルのBioCoat (商標) Matrigel (登録商標) Invasion Chamber (8 μm 孔サイズ；BD Biosciences) 内の各インサートの上方のチャンバー上に1x10⁵細胞をセットした。いずれの試験においても、細胞をトリプシン処理し、RPMI 1640に再度懸濁した。10% FBSを添加した培地(750 μl)を、下方のチャンバーに注入した。遊走試験および浸潤試験では、A549、PC14、およびPC14CDDPを37℃で24時間インキュベートした。次いで、最上部のチャンバーあるいはインサート上方の膜に残存する細胞を、注意深く回収した。膜を通過し、膜のより低い表面に接着した細胞をメタノールで固定し、ディフ・クイック染色により染色した。定量のため、細胞を4つの無作為視野にて顕微鏡下で計測した。試験はいずれもトリプリケートで行った。

免疫ブロット解析
SDS-PAGEゲルを、Precision Plus Protein (商標) スタンダード (161-0375) (Bio-Rad, Hercules, CA)を用いてキャリブレートし、抗CKS1B (1:200)、抗STAT3 (1:1000) 、抗p-STAT3 (1:2000) 、抗PD-L1 (1:1000) 、抗Bcl-2 (1:200) 、抗c-Myc (1:1000) 、抗サイクリンD1 (1:200) 、および抗アクチン (1:1,000)抗体を一次抗体として使用した。２種類の二次抗体（ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体および抗ウサギ抗体）を、1:10,000で希釈して用いた。

FCM解析および細胞ソーティング
細胞を培養培地に懸濁して、FCM解析および細胞ソーティングのため、FACSAria（商標）IIセルソーター (BD Biosciences)に供した。少なくとも100万個の細胞を、遠心分離（180 x g、5分間、4℃)により沈殿させて、20 μlのモノクローナルマウス抗ヒトPD-L1-APC抗体 (eBioscience)またはモノクローナルマウスIgG1 K アイソタイプコントロールAPC抗体 (eBioscience)の溶液に再懸濁し、30分間4℃でインキュベートした。独立した実験を3回行った。

動物試験
動物実験は、国立がん研究センター研究所の実験動物研究機関のガイドラインにしたがって実施した（番号：T12-004）。6〜7週齢の雄C.B-17/Icr-scid/scidJclマウス (日本クレア株式会社)を実験に用いた。胸腔内注射は、既報の方法を微修正して行った（非特許文献７）。インビボでの画像化のために、マウスに、150 mg/kgのD-ルシフェリン (Promega)を腹腔内注射により投与した。10分後、動物全身からの光子量を、IVIS Imaging System (Xenogen, Alameda, CA)を製造元の説明書にしたがい用いて生物発光を測定することにより計測した。データは、LIVINGIMAGE（登録商標） 4.2ソフトウェア (Xenogen)を用いて解析した。肺癌の発生を、インビボで1週間に2回、生物発光を画像化することにより観察した。反復投与試験では、7、14、および21日目に3 mg/kgのCDDPの処置を行った（3週間の間、1週間に1回、全部で3回処置）。データは、独立した3回の実験のうち代表的実験のものである。

統計学的解析
実験はいずれも、少なくとも3回繰り返し、その結果を平均±SDとして表した。統計学的解析は、主にスチューデントt検定を用いて行った。臨床試料のmiRNAマイクロアレイの解析は、ANOVAを用いて行った。ピアソン相関を、miR-197とPD-L1の間で推定した。カプラン・マイヤー法を用いて、生存期間を時間関数として算出して、生存期間の差異を、ログランク検定により解析した。解析はいずれも、PASW statistics version 18.0 (IBM Inc., Armonk, NY)およびSTATA version 12.0 (Stata Corp, College Station, TX)を用いて行った。確率値＜0.05は統計学的有意差を示す。

２．結果
NSCLCにおけるmiR-197のダウンレギュレーションは、薬剤耐性および生存と関連する。
薬剤耐性を制御するmiRNAを同定するため、原発性NSCLC組織および隣接する正常組織のコホート試験においてハイスループットmiRNAマイクロアレイを行った（図１Ａ）。術後再発後の第一選択である白金製剤ベースの化学療法を4コース以上受けた29人の患者を2群に分けた［応答群（n=17）および非応答群（n=12）］（表１）。この2群の癌組織および隣接する正常組織からのqRT-PCR結果の統計学的解析の結果（図６Ａ）、５つのmiRNA（miR-197、miR-181c、miR-21、miR-210およびmiR-1260）が有意な発現変化を示した（図１Ｂ）。肺癌の予後におけるこれらmiRNAの発現の役割を検討するため、はじめに、患者の生存期間との臨床的関連性を調べた。その結果、miR-197およびmiR-1260の発現が、全生存期間について好適な肺癌の予後マーカーとして同定された(図６Ｂ)。予後バイオマーカーと推定されるこれらのmiRNAのうち、腫瘍抑制性のmiRNAであるmiR-197に注目し、コホート試験の肺腫瘍および隣接する正常組織におけるmiR-197についてのqRT-PCRを用いてこの知見を検証した(図１Ｃ)。ヒト肺癌細胞株のパネルにおけるmiR-197発現レベルの解析から、miR-197が、正常な気管支細胞株であるBEAS-2Bと比較して、肺癌細胞株において有意に抑制されていることが明らかとなった。さらに、3つの薬物耐性細胞株（PC9/CDDP、PC14CDDP、およびH69/TXL）におけるmiR-197の発現が、その親の肺癌細胞株よりも低いことが観察された(図１Ｄ)。

qRT-PCR解析と同様に、miR-197−ロックド核酸(LNA)プローブを用いたイン・シチュ・ハイブリダイゼーションにより、応答群の試料と比較して、非応答群の試料中のmiR-197発現が低いことが明らかとなった(図１Ｅ)。このことから、miR-197が、治療効果との関連に加え、機能的に治療への応答を制御している可能性が考えられた。それゆえ、NSCLCの薬剤耐性の制御におけるmiR-197の役割に焦点をあて、miR-197が肺癌の進行および薬剤耐性に関与するかを調べるため、miR-197のアンチセンスであるLNA-miR-197（miRCURY LNA（登録商標） Power Inhibitor, product number 426907-00, EXIQON）（CTGGGTGGAGAAGGTGGTGA（配列番号５）またはpre-miR-197（式（I））を、4種類の独立した肺癌細胞株（A549、PC9、PC14、およびPC14CDDP）に一過性にトランスフェクトした。興味深いことに、miR-197のノックダウンにより、これら４種類の独立した肺癌細胞株において、CDDPおよびTXLに対する有意な耐性が誘導された。さらに、インビトロにおいて、miR-197の過剰発現によりこれら化合物に対する感受性が増強された(図１Ｆ)。

miR-197の安定的ノックダウンはインビトロにおいて悪性度を亢進する。
NSCLCにおけるmiR-197の発現抑制が示されたため、このmiRNAの別の役割をインビトロで評価することを検討した。miRNAの阻害に使用されているmiR-197−TuDを発現するタフ・デコイ（Tough Decoy (TuD)）ベクター (非特許文献６）を構築し、A549およびPC14細胞においてmiR-197の発現を安定に抑制した。また、CMVプロモーターによるmiR-197の過剰発現を示すPC14CDDP細胞（PC14CDDP-miR-197）を樹立した。安定なmiRNA発現を確認するためのpsiCHECK2（商標）ベクターを用いたmiR-197センサーアッセイにおいて、A549-miR-197-TuDおよびPC14-miR-197-TuD細胞のルシフェラーゼ活性が陰性対照細胞株および変異センサーベクターと比較して有意に増加したことが観察され、これらの細胞株においてmiR-197発現が機能的に抑制されたことが示された。PC14CDDP-miR-197細胞のルシフェラーゼ活性は有意に減少し、これら細胞のmiR-197発現が機能的に活性化されたことが示された（図２Ａ）。次に細胞増殖、細胞浸潤、細胞遊走、およびスフェロイド形成に対するmiR-197の効果を評価した。細胞増殖解析から、減少または増加したmiR-197レベルは癌細胞の増殖に影響しないことが示唆された（図２Ｂ）。反対に、miR-197の機能喪失は、A549細胞およびPC14細胞の浸潤および遊走率を増強した。また、miR-197を安定に過剰発現するPC14CDDP細胞は、対照と比較して、抑制された浸潤および遊走率を示した（図２ＣおよびＤ）。さらに、腫瘍スフィア形成能について、A549-miR-197-TuD、PC14-miR-197-TuD、およびPC14CDDP-miR-197細胞を評価した。A549-miR-197-TuDおよびPC14-miR-197-TuDは、対応する対照細胞よりも２〜３倍多くのスフィアを生成し、PC14CDDP-miR-197細胞のスフェロイド形成は対照細胞と比較して抑制された（図７Ａ）。PC14-miR-197-TuD細胞は、様々な肺癌イニシエーション関連遺伝子、特にABCトランスポーター遺伝子を高レベルに発現していた。一方、PC14CDDP-miR-197細胞は、対照細胞と比較してこれら遺伝子の発現が抑制されていた（図７Ｂ）。これらの結果から、miR-197が、肺癌細胞において薬剤耐性だけでなく悪性の表現型を制御しうることが示唆された。

インビボにおける腫瘍形成、肺転移、および薬剤耐性に対するmiR-197の効果
インビボにおける肺癌進行の調節因子としてのmiR-197の役割を検証するため、scidマウスに直接胸腔内注射（左肺）により樹立した肺癌異種移植モデル（非特許文献７）を用いて、腫瘍形成および薬剤耐性に対するPC14-miR-197-TuDの効果を試験した。インビボでのmiRNAノックダウン細胞のモニタリングを容易にするため、pLuc-NeoプラスミドDNAが安定にトランスフェクトされたPC14-miR-197-TuDまたはPC14-TuD-NC細胞をクローニングした。生物発光画像において、移植28日後、PC14-miR-197-TuD-luc細胞から形成される腫瘍は、陰性対照細胞移植マウスと比較して有意に増加した（図３Ａ）。特に、PC14-miR-197-TuD-luc腫瘍を担持するマウスは顕著な肺転移を示したが、対照のPC14-TuD-NC-luc細胞を移植したマウスでは、目視できる転移はほとんど観察されなかった（図３Ｂ）。組織学的解析によって、miR-197のノックダウンによりこの肺癌細胞株の肺転移が促進されうることも明らかとなった（図３Ｃ）。さらに、腫瘍小塊の数および肺重量が、miR-197低下群において有意に増加した（図３ＤおよびＥ）。次に、miR-197のダウンレギュレーションが、インビボにおいてPC14細胞のCDDPに対する薬剤耐性に影響するかを調べるため、scidマウスにおける腫瘍形成開始後、CDDP（3 mg/kg）を１週間に１回、３週間の間、腹腔内注射した（図３Ｆ）。生物発光画像において、移植28日後、PC14-miR-197-TuD-lucマウス（n=10）から形成される腫瘍は、PC14-TuD-NC-luc腫瘍（n=10）を担持するマウスと比較して有意に増加した（図３Ｇ）。また、PC14-miR-197-TuD-luc腫瘍を担持するマウスは、低い生存率を示した（図３Ｈ；P=0.0358）。これらの結果は、miR-197がインビボにおいて癌の進行および薬剤耐性において中心的役割を担うことを示す。

miR-197はサイクリン依存性キナーゼであるCKS1Bを直接の標的とする。
miRNAは、その標的遺伝子の翻訳を抑制するか、または分解を促進することにより、遺伝子発現を制御する。miR-197の直接の標的遺伝子を同定するため、まず、pre-miR-197またはLNA-miR-197およびそれらの対照を一過的にトランスフェクトしたA549、PC14、およびPC14CDDP細胞のmRNAマイクロアレイ解析を行った。3つの異なる肺癌細胞株の全てにおいて、標的遺伝子と予測される1037遺伝子が発現変化を示すことが観察された。次に、miR-197の標的遺伝子を同定するため、予測解析のためのコンピューターアルゴリズムを使用した（図８）。最終的に、５つの候補である、CTNND1（Catenin delta-1）、ERLIN2（ER lipid raft associated 2）、CKS1B（CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B）、CEP55（Centrosomal protein of 55 kDa）、およびPD-L1（Programmed cell death 1 ligand 1）が見いだされ、それら3'非翻訳領域（UTR）を、レポーターアッセイのためにルシフェラーゼと結合した。標的遺伝子と予測される1037遺伝子のうち、PD-L1は、miR-197により有意に制御された、コンピューターデータベースの3'UTRに予測結合部位を持たない遺伝子の一つである。CTNND1、ERLIN2、CKS1B、およびCEP55のmRNAの3'UTRは、miR-197のシード配列に相補的な配列を有する（図９Ａ）。CTNND1、ERLIN2、CKS1B、CEP55、およびPD-L1がmiR-197の直接的な標的であるかを調べるため、ルシフェラーゼORFベクターの下流に各3'UTRをクローニングした。加えて、標的特異性を確認するため、3'UTRの部位特異的突然変異生成を行った。5つのクローニングしたUTRのいずれかとpre-miR-197とをA549細胞にコトランスフェクションすると、CTNND1、ERLIN2、CKS1B、およびCEP55の3'UTRのルシフェラーゼ活性はいずれも低下が観察されたが、PD-L1では低下が観察されなかった（図４Ａ）。一方、3'UTRの変異体をpre-miR-197とコトランスフェクションしても、ルシフェラーゼ活性は有意に変化しなかった（図９Ｂ）。これらの直接的な標的遺伝子のうちCKS1Bのみが、細胞運動性、薬剤耐性、および癌進行を制御することが報告されている（非特許文献８−１０）。肺癌における薬剤耐性に対するその効果から、CKS1BがmiR-197の重要な標的であると考えられ、この仮説を検証するため実験を行った。その結果、pre-miR-197によりCKS1Bの発現が阻害され、また、3種の肺癌細胞株において、LNA-miR-197の一過性のトランスフェクションによりCKS1B発現が有意に増加することがqRT-PCRにより確認された（図４Ｂ）。miR-197の生物学的機能がCKS1Bのシグナル伝達を直接標的とすることと関連するかを調べるために、低分子干渉RNA（siRNA）に基づくCKS1Bのサイレンシングを行い、細胞増殖、薬剤耐性、浸潤、および遊走について細胞を評価した。注目すべきことに、siRNAによるCKS1Bのノックダウンにより、細胞増殖、浸潤、および遊走が有意に低下し、また、3種の肺癌細胞株のCDDPおよびTXLに対する応答が増強されることが観察された（図４Ｃ−Ｆ）。これらの結果は、NSCLCにおけるmiR-197/CKS1B経路の主な機能が、肺癌の進行と薬剤耐性の制御であることを示唆する。

PD-L1の発現はmiR-197/CKS1Bシグナル伝達経路の重要な下流標的としてSTAT3により制御される。
miRNAマイクロアレイ解析により、肺癌細胞において、miR-197が、様々な組織で発現する補助刺激／補助阻害リガンドのB7ファミリーのメンバーであるPD-L1（CD274またはB7-H1とも称される）の発現を制御することが観察された（図８）。3'UTRアッセイの結果から、miR-197は間接的にPD-L1を標的とする可能性が考えられた。そのため、このmiR-197とPD-L1との間の調節性の関連について検討した。これまでに、リンパ腫細胞において、恒常的な腫瘍形成経路がSTAT3 (Signal Tranducer and Activator of Transcription 3)シグナル伝達経路を介してPD-L1発現を誘導することが報告されている（非特許文献１１）。さらに、STAT3シグナル伝達は、多発性骨髄腫細胞においてCKS1B活性化の下流標的であることが知られている（非特許文献９）。CKS1BがSTAT3を活性化することによりPD-L1発現を調節すると考え、CKS1Bの調節のPD-L1に対する効果を試験した。その結果、CKS1BのsiRNAによるノックダウンにより、リン酸化 (p)-STAT3 (Tyr705)とPD-L1タンパク質の発現が阻害されたが、ウェスタンブロットにおいてSTAT3に対する顕著な効果は観察されなかった（図１０）。これらのデータは、PD-L1が、miR-197シグナル伝達経路においてSTAT3により活性化されたCKS1Bの重要な下流標的であることを示唆している。STAT3とPD-L1発現の誘導との関連を調べるため、プロモーター領域を含むPD-L1レポーターコンストラクトを使用して、STAT3のPD-L1プロモーターへの結合能を調べた。PD-L1の5'配列（-319bp上流〜+56bp下流）は、潜在的STAT3結合部位（TTCN2-4GAA）を含む（非特許文献１２）（図４Ｇ）。STAT3−siRNAとPD-L1プロモーターベクターのコトランスフェクションにより、対照のsiRNAと比較して、PD-L1プロモーター駆動性のルシフェラーゼの発現が0.66（±0.1）倍に低下した。さらに、LNA-miR-197では、陰性対照の値と比較して、ルシフェラーゼ活性が1.58（±0.4）倍高く誘導された（図４Ｇ）。すなわち、STAT3は、miR-197のダウンレギュレーションの下流でPD-L1遺伝子プロモーターと強力な結合を示していた。以上のとおり、ウエスタンブロットでは、miR-197ノックダウンの下流において、陰性対照細胞と比較して、CKS1B、p-STAT3、およびPD-L1レベルの増加が検出されたが、STAT3の発現に顕著な効果は観察されなかった。さらに、LNA-miR-197は、一般的なSTAT3の転写標的遺伝子である、Bcl-2（代表的な抗アポトーシス因子）、c-Myc（腫瘍形成性転写因子）、およびサイクリンD1（細胞周期調節タンパク質）のアップレギュレーションを誘導した（図４Ｈ）。これらの結果は、miR-197が、CKS1Bのアップレギュレーションによる複数の標的を介したSTAT3の腫瘍形成性の活性化に関与することを示唆している。

PD-L1はmiR-197/CKS1B/STAT3シグナル伝達の推定バイオマーカーである。
抗PD-L1抗体は、進行性の固体腫瘍を有する患者に対する顕著なブレイクスルーである（非特許文献４）。特に、PD-L1の阻害により、進行性のNSCLC患者における持続的な腫瘍退縮と長期の疾患安定化が誘導された。NSCLCにおけるmiR-197介在性シグナル伝達経路におけるPD-L1の役割を調べるため、肺癌細胞株および肺癌試料におけるPD-L1の発現を調べた。miR-197によるPD-L1発現の特異的調節をqRT-PCR解析により確認した結果、A549およびPC14CDDP細胞のPD-L1発現に対してpre-miR-197が有意な阻害効果を示し、3種の肺癌細胞株においてLNA-miR-197がPD-L1発現を刺激することが示された（図５Ａ）。FCM解析により、PC14CDDP細胞におけるPD-L1レベルが、親細胞であるPC14細胞よりも有意に高いことが明らかとなった（図１１）。さらに、PC14細胞におけるPD-L1の発現は、miR-197のノックダウン後に有意に増加した。反対に、FCM解析において、miR-197の過剰発現により、PC14CDDP細胞におけるPD-L1の発現低下が誘導された（図５Ｂ）。PD-L1がNSCLCにおける薬剤耐性マーカーの候補であるかをさらに調べるため、コホート試験の応答群（n=17）におけるPD-L1のmRNAレベルを、非応答群（n=12）におけるレベルと比較した。応答群の腫瘍と比較して、非応答群の腫瘍においてPD-L1の発現が高いことが観察された（図５Ｃ；P=0.015）。次に、FCMによる細胞ソートにより、PC14CDDPから、PD-L1の発現が高い（PD-L1^high）細胞、およびPD-L1の発現が低い（PD-L1^low）細胞を単離して、PD-L1^high分画がmiR-197介在性のシグナル伝達により調節される薬剤耐性と関連するかを調べた。PD-L1^high細胞は、PD-L1^low細胞と比較して、CDDPおよびTXLに対して有意な耐性を示した（図５Ｄ）。さらに、pre-miR-197の一過性トランスフェクションにより、PD-L1^high細胞のCDDPおよびTXLに対する応答が増強された（図５Ｄ）。これらのデータは、PD-L1が薬剤耐性を促進する能力を有しており、miR-197/CKS1B/STAT3経路のバイオマーカーであることを示唆する。

臨床におけるmiR-197とPD-L1の重要性
肺癌の進行において低下したmiR-197の発現の生物学意義をさらに理解するために、miR-197発現プロファイルと治療的切除後の再発を経験した177人のNSCLC患者由来の腫瘍試料における全生存率との相関を評価した（表２）。miR-197レベルをqRT-PCRにより測定し、カプラン・マイヤー解析により、miR-197の発現レベルの低下が全生存率の悪化と有意に相関することが示された（図５Ｅ；P=0.0149）。次に、miR-197と、このシグナル伝達経路のバイオマーカーと推定されるPD-L1との関連性を調べた。mRNAとmiRNAの発現プロファイルを組み合わせた腫瘍データに基づき、miR-197とPD-L1の発現の間に負の相関関係が観察された（図５Ｆ；P=0.026）。これらのデータは、miR-197とその下流の標的であるPD-L1とを結ぶシグナル伝達ネットワークの存在を示唆し、NSCLCにおけるmiR-197調節経路の臨床的重要性を示す（図５Ｇ）。

腫瘍内PD-L1と血液中miR-197との相関関係
国立がん研究センターにて2014年6月以降にNSCLCに対して根治的手術を施行された患者のうち、包括同意が取られ、癌組織試料（凍結試料）および手術前血漿試料が国立がん研究センターバイオバンクにある患者計6例を検討した。癌組織試料および血漿試料から、QIAzol（登録商標）およびmiRNeasy Mini Kit (Qiagen) を製造元の説明書にしたがい用いて全RNAを抽出した。RNA試料の純度および濃度は、NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific)を用いて評価した。qRT-PCRの方法は既報のとおりである（非特許文献２５）。PCRは、7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて96ウェルプレートで行った。反応はいずれもトリプリケートで実施した。hsa-miR-197および内部標準としてのhsa-miR-16のTaqMan (登録商標) qRT-PCR キット、ヒトPD-L1およびヒトβ-アクチンのTaqMan (登録商標) Gene Expression AssayはApplied Biosystemsより購入した。統計学的解析は実施例１と同様に行った。

腫瘍内PD-L1、腫瘍内miR-197、および血漿中miR-197（内部標準：miR-16）について発現解析を行った結果、腫瘍内PD-L1と血漿中miR-197の間に負の相関関係が観察された（図１２）。

配列番号１：miR-197
配列番号２：pre-miR-197
配列番号３：式（I）のpre-miR-197を構成する配列
配列番号４：pri-miR-197
配列番号５：LNA-miR-197
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
配列番号１９：プライマー
配列番号２０：プライマー
配列番号２１：プライマー
配列番号２２：プライマー
配列番号２３：プライマー
配列番号２４：プライマー
配列番号２５：プライマー
配列番号２６：プライマー
配列番号２７：プライマー
配列番号２８：プライマー
配列番号２９：プライマー

Claims (22)

1. miR-197もしくはその前駆体、もしくはそれらの変異体、または前記miR-197、前駆体もしくは変異体を発現するベクターを含む、癌を治療するための医薬組成物。
2. miR-197またはその前駆体を含む、請求項１記載の医薬組成物。
3. 癌がPD-L1陽性癌である、請求項１または２記載の医薬組成物。
4. 癌が、患者の癌組織中または血液中でmiR-197またはその前駆体の減少が観察される癌である、請求項１または２記載の医薬組成物。
5. 癌が非小細胞肺癌である、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
6. 癌が薬剤耐性癌である、請求項１または２記載の医薬組成物。
7. 薬剤耐性癌が、シスプラチンまたはパクリタキセルに耐性の癌である、請求項６記載の医薬組成物。
8. 癌が非小細胞肺癌である、請求項６または７記載の医薬組成物。
9. さらに他の抗癌剤を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
10. 他の抗癌剤と併用される、請求項１〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
11. 抗癌剤が、薬剤耐性の原因となる抗癌剤である、請求項９または１０記載の医薬組成物。
12. 抗癌剤が、シスプラチンまたはパクリタキセルである、請求項９または１０記載の医薬組成物。
13. miR-197またはその前駆体を含む、非小細胞肺癌を治療するための医薬組成物。
14. PD-L1関連疾患の患者において、PD-1阻害剤による治療に対する感受性を評価する方法であって、
    （i）前記患者から採取された生物試料中のmiR-197レベルを測定すること、および、
    （ii）前記miR-197レベルが基準値より低いとき、前記患者はPD-1阻害剤による治療に対する感受性が高いと評価すること、
    を含む方法。
15. PD-1阻害剤が抗PD-1抗体である、請求項１４記載の方法。
16. PD-L1関連疾患が癌である、請求項１４または１５記載の方法。
17. 癌がPD-L1陽性癌である、請求項１５記載の方法。
18. 癌が非小細胞肺癌である、請求項１６または１７記載の方法。
19. 生物試料が血液試料または癌組織試料である、請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
20. miR-197レベルを定量的RT-PCR法またはマイクロアレイ法により測定する、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
21. PD-L1関連疾患の患者において、PD-1阻害剤による治療に対する感受性を評価するためのキットであって、患者から採取された生物試料中のmiR-197レベルを測定するためのプライマーセットまたはプローブを含むキット。
22. 請求項１４〜２０のいずれかに記載の方法に使用される、請求項２１記載のキット。

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