JP2015536667A - 癌のための分子診断検査 - Google Patents

Abstract

癌のための分子診断検査の同定のための方法および組成物を提供する。該検査は、血管新生および血管発生と関係するバイオマーカー発現が上方制御または下方制御されている癌サブタイプを同定する。本発明は、癌を有する患者が、何らかの抗血管新生剤の投与前に治療レジメンに臨床的に応答性であるか非応答性であるかを決定するために使用できる。この検査は、種々の癌タイプにおよび血管新生または血管新生シグナル伝達に直接的または間接的に影響を与える種々の薬物に使用し得る。さらに、本発明は、ある特定の癌タイプの予後指標として使用し得る。特に、本発明は、予測的マーカーのある特定の組み合わせの使用に関し、該予測的マーカーの発現が治療レジメンに対する応答性または非応答性と相関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、“癌のための分子診断検査”なる発明の名称の、２０１２年１２月３日出願の米国仮特許出願番号６１／７３２,７６１に基づく利益を主張する。

発明の分野
本発明は、血管新生と関係する一般的サブタイプの使用を含む、種々の解剖学的部位から癌を診断するために有用な分子診断検査に関する。本発明は、遺伝子発現レベルからの遺伝子分類モデルの誘導を含む。一つの応用は、癌治療剤群に対する応答の層化および癌治療剤群に関する患者の選択と、これによる患者処置選択の指針である。他の応用は、抗血管新生治療剤に応答し、または応答しない癌患者の層化である。本発明は、治療選択の指針となり得るだけでなく、新規治療剤の臨床試験評価中の強化戦略のための患者群を選択できる検査を提供する。本発明は、卵巣癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌および神経膠芽腫を含むある特定の癌の予後指標として使用できる。血管新生サブタイプは、新鮮／凍結(ＦＦ)またはホルマリン固定パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)患者サンプルから同定できる。

背景
製薬業界は、現在投与されている薬物よりも有効な、特異的なまたは有害副作用が少ない新規薬物処置選択肢を探求し続けている。ヒト集団内の遺伝的可変性により多くの確立された薬物の有効性に実質的差異を生じるために、薬物療法代替物が開発され続けている。それゆえに、広汎な薬物療法選択肢が現在利用可能であるが、患者が応答しない場合には、さらなる治療が常に必要とされる。

伝統的に、医師により使用される処置パラダイムは、疾患の処置について可能な最高成功率をもたらす第一選択薬物療法を処方することである。この第一選択薬物の効果がないならば、代替の薬物療法を処方する。このパラダイムは、ある特定の疾患に対しては最良の処置方法ではないことは明らかである。例えば、癌のような疾患において、第一処置はしばしば最も重要であり、治療成功のための最良の機会を提供するため、特定の患者の疾患に対して最も有効であろう初期薬物を選択する要求が高まっている。

卵巣癌は、西洋諸国では全婦人科癌の中で死因の第一位である。この高い死亡率は、ほとんどの患者で診断が進行期であるためである。上皮性卵巣癌(ＥＯＣ)は、卵巣悪性腫瘍の９０％を占め、漿液性、粘液性、類内膜、明細胞、移行性、混合性および未分化サブタイプを含む明確な組織学的カテゴリーに分類される。これらの異なる組織像が異なる病因から発生するとの証拠が増えている。上皮性卵巣癌の分類に使用する方法について最近進歩があった(McCluggage, W.G. “Morphological subtypes of ovarian carcinoma: a review with emphasis on new developments and pathogenesis”, PATHOLOGY 2011 Aug;43(5):420-32)。この結果の一つは、以前は類内膜として分類されていたであろう多くの腫瘍が現在漿液性と分類されることである。

卵巣癌の現在の標準処置は、減量手術および標準的白金錯体・タキサンに基づく細胞毒性化学療法である。しかしながら、全ての患者がこれに応答するわけではなく、応答した内で約７０％が再発を経験する。組織学的分類または分子分類に基づく卵巣癌のための特異的標的治療もなお上市に至っていない。他のタイプの癌と同様、適当な細胞毒性化学療法剤を選択する正確な方法はまだない。

マイクロアレイおよび分子ゲノミクスの出現は、疾患の診断能力および予後分類に相当な影響を与える可能性を有しており、個々の患者の規定の治療レジメンに対する応答の予測の一助となり得る。マイクロアレイは、大量の遺伝情報の解析を提供し、それにより個々の遺伝的フィンガープリントを提供する。このテクノロジーが最終的にオーダーメイドの薬物処置レジメンのための必要なツールを提供するであろうとの大きな期待がある。

現在、医療従事者は、化学療法剤が有効であろう癌患者を同定する助けとなる手段をほとんど持たない。最適第一選択薬物の同定は、どの薬物処置が特定の癌の生理学に最も有効であるかを正確に予測できる方法が利用できないため、困難である。この欠陥が、相対的に低い単剤応答率と、癌罹病率および死亡者数の増加という結果をもたらす。さらに、患者は、しばしば、不必要に無効かつ高毒性の薬物治療を受けることになる。

血管新生は、腫瘍における新血管系形成の鍵となる要素であり、腫瘍形成および転移に必須である。従って、治療介入の鍵となる領域であり、予後不良および生存率低下と相関している。このことが、血管新生と関係する過程および経路を標的とする多くの薬物の開発を促進することとなり、Genentech/Rocheにより開発され、最初にＦＤＡにより承認された市場のリーダーである抗血管新生剤ベバシズマブ(アバスチン)もこれに含まれる。

ベバシズマブを含む処置レジメンは広い臨床的有効性を有していることが証明されている^１〜１０。しかしながら、全生存率(ＯＳ)の利益は、細胞毒性化学療法にベバシズマブを追加した後のほとんどの癌で示されていない^{８、１２〜１３}。これにより、かなりの割合の腫瘍が、ＶＥＧＦ遮断(ベバシズマブの作用機序)に対して始めから耐性であるかまたは急速に耐性を獲得することが示唆される。実際、卵巣癌患者の２１％、腎癌患者の１０％および直腸癌患者の３３％が、ベバシズマブ単剤療法を受けたときに部分退縮を示し、ベバシズマブが患者の小サブグループで活性であり得ることが示唆されるが、このような部分的有効性は、任意抽出患者では有意に至らない。従って、ベバシズマブに対する応答のバイオマーカーの使用は、処置成績の評価を改善し、そうして、ベバシズマブ処置から最良の臨床的利益を受けるであろう患者サブグループの同定を可能にする。臨床的に有益なバイオマーカーが存在しないために、ベバシズマブの使用が害されている転移乳癌の場合にこれは特に関係する。これまで、ベバシズマブ有効性を予測するためのこのようなバイオマーカーは、臨床的に検証されていない。高血圧およびＶＥＧＦ多型が、従来可能性を示す唯一のバイオマーカーであったが、臨床の現場でのその使用に関する重要な問題は残ったままである。

抗血管新生治療への他の取り組みは、ＶＥＧＦ経路の選択的ターゲティングではなく、複数血管新生経路の同時ターゲティングである。理論上、多標的抗血管新生剤は、ベバシズマブのような薬剤よりも血管新生を完全に阻害し、それゆえに、大きな治療利益を生じ得るはずである。ある腫瘍において、血管新生は、疾患の初期段階でＶＥＧＦしか必要としないが、疾患が進むに連れて、さらなる血管新生経路により促進されるとの仮説が立てられている。それゆえに、複数経路をターゲティングすることにより、ＶＥＧＦ阻害に対する耐性に至る代償性回避機構に対抗することが可能であり得る。

他のタイプの癌については、抗血管新生治療的治療または単剤抗血管新生治療を用いる標準治療に応答するまたは応答しない患者を選択する正確な方法はない。

それゆえに、標準治療と組み合わせてまたは単剤治療としての抗血管新生治療剤に対する予測される応答に基づいた患者の層化を促進する分子診断検査が必要とされている。これは、代替療法を受けるべき患者の急速な同定を可能にする。このような分子診断検査は、十分な精度で種々の癌タイプの治療応答性を予測するはずである。

発明の要約
ここに開示されるのは、転写物の一部または全てが過小発現であるとき、血管新生と関係する分子シグナル伝達が上方制御または下方制御されている癌のサブタイプを同定するように、癌において発現されるバイオマーカーのコレクションを使用する方法である。バイオマーカーのコレクションは、発現サインにより規定でき、該発現サインをバイオマーカーのコレクションの測定された発現値に累積スコアを割り当てるために使用する。本発明はまた、ここに開示するバイオマーカーのコレクションおよび発現サインを使用する、抗血管新生剤に対する応答性または非応答性を示す方法ならびに予後良好または予後不良の患者を同定する方法も提供する。異なる面において、バイオマーカーおよび発現サインは、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を定量できるマイクロアレイ、Ｑ−ＰＣＲ、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡまたは他の科学技術のような当技術分野で知られる方法を使用して実施され得る単一パラメータまたは多重パラメータ予測的検査の基礎を形成し得る。

一つの例示的態様において、本発明は、血管新生に関係するバイオマーカーの上方制御(“血管新生”)と結びついた癌サブタイプを規定する発現サインを提供する。他の例示的態様において、本発明は、血管新生に関係するバイオマーカーの下方制御(“非血管新生”)とと結びついた癌サブタイプを規定する発現サインを提供する。さらに、ここに記載する癌サブタイプは多くのタイプの癌に共通し、単一癌疾患タイプに限定されない。従って、本発明の発現サインは、単一癌タイプに限定されない。ある例示的態様において、発現サインは表１Ａ〜１Ｃに挙げられるバイオマーカーから選択される２個以上のバイオマーカーを含む。他の例示的態様において、血管新生発現サインは、表２Ａまたは２Ｂに挙げられるバイオマーカーから選択される２個以上のバイオマーカーを含む。他の例示的態様において、非血管新生発現サインは、表２Ｃに挙げられる２個以上のバイオマーカーを含む。他の例示的態様において、血管新生発現サインは、表２Ａまたは２Ｂに挙げるバイオマーカーおよびＰＬＳ分類器を使用して測定するこれらの対応する重みを含む。他の例示的態様において、非血管新生サインは表２Ｃに挙げるバイオマーカーおよびＰＬＳ分類器を使用して測定するこれらの対応する重みを含む。

本発明の一つの態様において、発現サインは、抗血管新生治療剤に対する癌腫瘍の応答性の評価に有用である。抗血管新生治療剤に対する腫瘍の応答性を測定するための本発明の使用は単一癌タイプに限定されない。一つの例示的態様において、癌は卵巣癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌または神経膠芽腫であり得る。本発明は、全生存、無増悪生存期間、ＲＥＣＩＳＴにより定義される放射線学的応答、完全寛解、部分寛解、不変ならびにＰＳＡ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３およびＣＡ１９−９のようなしかしこれらに限定されない血清学的マーカーのような、少なくともまたは最大１０個の異なる応答の分類を使用する薬物に対する応答の予測と関係する。ここに記載する本発明は、何らかの一つの薬剤に限定されず、現在使用されている、開発中のおよび新規の、直接的にまたは間接的に血管新生過程に影響するまたはこれを標的とする広範な薬のいずれかに対する応答者および非応答者の同定に使用できる。一つの態様において、本発明は、単剤としてまたは標準療法と組み合わせたアジュバントまたはネオアジュバントであるベバシズマブまたはダサチニブの評価に使用できる。他の態様において、本発明は、卵巣癌におけるアバスチン、VEGF Trap処置の評価のために使用し得る。

本発明の他の態様において、ここに開示する発現サインを、患者の臨床予後の決定に使用し得る。例えば、血管新生に関係するバイオマーカーの下方制御と結びついた癌サブタイプを有すると同定された患者は、血管新生に関係するバイオマーカーの上方制御と結びついた癌サブタイプよりも長い生存率を示し得る。個体の臨床予後を決定するための本発明の使用は単一癌タイプに限定されない。一つの例示的態様において、癌は卵巣癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌または神経膠芽腫であり得る。本発明は、少なくとも無増悪生存期間を使用する、臨床予後の予測に関する。考慮し得るさらなる予後因子は、民族性および人種、年齢、疾患ステージ、組織学、腫瘍グレード、腫瘍マーカー(例えば、ＣＡ１２５)、部位特異的外科的処置、残存疾患サイズおよび腫瘍応答である。

ここに開示する発現サインの予測的および予後的使用は、単一発現サインまたは複数発現サインを使用して達成し得る。例えば、一つの発現サインは非血管新生サインであってよく、第二の発現サインは血管新生サインであってよい。一つの例示的態様において、非血管新生発現サインを使用して患者の臨床予後を決定し、血管新生サインを使用して、あるクラスの治療剤または処置レジメンに対する患者の予測応答性を決定する。一つの例示的態様において、血管新生サインは表２Ａまたは表２Ｂからの１個以上のバイオマーカーを含み、非血管新生サインは表２Ｃからの１個以上のバイオマーカーを含む。他の例示的態様において、血管新生サインは表２Ａまたは表２Ｂにおけるバイオマーカーを含み、非血管新生サインは表２Ａにおけるバイオマーカーを含む。

他の面において、本発明は、ｑＰＣＲ、マイクロアレイおよび免疫アッセイ、例えば免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどのような上記の慣用の診断用キットに関する。このようなキットは、遺伝子または遺伝子産物の発現をアッセイするためおよびｍＲＮＡまたはタンパク質発現を定量するために適当な試薬および指示を含む。

また開示されるのは、非血管新生表現型を有するまたは有しないヒト腫瘍を同定する方法である。ある例示的態様において、このような方法を使用して、血管新生と関係する工程を直接的または間接的に阻害する薬物に対して感受性であり、応答する患者を同定し得る。ある他の例示的態様において、このような方法を使用して、血管新生と関係する工程を直接的または間接的に阻害する薬物に耐性であるまたは応答しない患者を同定し得る。

本発明はまた患者の有効な処置への指針にも関する。さらに、患者処置レジメンの選択に関するおよび血管新生に直接的または間接的に影響する現在のまたは開発段階の薬物の臨床試験のために患者を選択する方法を提供する。

さらに、全ての転写物のアッセイのために、保存されたホルマリン固定パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)生検材料ならびに新鮮／凍結(ＦＦ)組織の使用に順応し、それゆえに、最も広く利用可能なタイプの生検材料と適合する方法をここに記載する。バイオマーカー発現レベルを、ＦＦＰＥ組織、新鮮凍結組織またはRNAlater(登録商標)のような溶液に保存されている新鮮組織から得たＲＮＡを使用して決定し得る。

Almac Diagnosticsの上皮性卵巣癌サンプルセットの１９９個の漿液性サンプル全体で最も可変性のプローブセットの階層的凝集型クラスタリング解析を表すヒートマップを示す。プローブセットクラスターの機能分析を図の右手側に要約する。図の上部にわたる説明文は、分類器作成のために各サンプルが割り当てられた分類器群(すなわちクラスラベル)を示す。

機能濃縮分析を使用する上皮性卵巣癌トレーニングセットにおける１９９個の漿液性のみのサンプルにおける血管新生プローブセットクラスターの機能分析結果を示す。図２Ａは、濃縮遺伝子オントロジー生物学的過程の上位１０位の有意性を表すヒストグラムを示す。赤色棒は、偽陽性率補正後の０.０５のｐ値での過程の有意性を示す。図２Ｂは、過程がクラスター３におけるプローブセットによりコードされる１個以上の遺伝子を含むときの、遺伝子オントロジー生物学的過程のツリーのサブセットを表す。赤色で示す過程は、偽陽性率補正０.０５のｐ値でのその過程の有意性を示す。黒色で示す過程は、血管新生プローブセットクラスターにおけるプローブセットによりコードされるが、有意ではない１個以上の遺伝子を含む。

血管新生と関係する分子サブタイプを同定する２５個の遺伝子発現サイン例内の遺伝子の機能濃縮結果を示す。赤色棒は、偽陽性率補正後の０.０５のｐ値での過程の有意性を示す。

高悪性度神経膠芽腫の患者から、事前の処置をせずに最初に外科的摘出した後の無再発生存(週での時間事象)のカプラン・マイヤー曲線を示す(Phillips HS, Kharbanda S, Chen R, Forrest WF et al. “Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis”、 CANCER CELL 2006 Mar;9(3):157-73. PMID: 16530701; Costa BM, Smith JS, Chen Y, Chen J et al. “Reversing HOXA9 oncogene activation by PI3K inhibition: epigenetic mechanism and prognostic significance in human glioblastoma”、 CANCER RES 2010 Jan 15;70(2):453-62. PMID: 20068170)。

ダサチニブでの処置後の１６個の前立腺細胞株内の２５個の遺伝子分類器モデル例の分類性能のＲＯＣ曲線の図である。分類器モデル適用後のＡＵＣは約０.８４である。９５％信頼限界を、１０００回のブートストラップイテレーションを使用して決定した(Wang XD, Reeves K, Luo FR, Xu LA et al. “Identification of candidate predictive and surrogate molecular markers for dasatinib in prostate cancer: rationale for patient selection and efficacy monitoring”、 GENOME BIOL 2007;8(11):R255. PMID: 18047674)。

最新の病理学的分類基準に従い再分類された上皮性卵巣癌サンプルセットの２６５個の漿液性サンプル全体で最も可変性の遺伝子の階層的凝集型クラスタリング解析を表すヒートマップを提供する。プローブセットクラスターの機能分析を図の右手側に要約する。図の上部にわたる説明文は、“血管新生”および“非血管新生”サブタイプの両者の分類器作成のために各サンプルが割り当てられた分類器群(すなわちクラスラベル)を示す。

機能濃縮ツール(ＦＥＴ)アルゴリズムを使用した上皮性卵巣癌トレーニングセットにおける２６５個の漿液性のみのサンプルの血管新生プローブセットクラスターの機能分析結果を示す。図７Ａは、濃縮遺伝子オントロジー生物学的過程の上位１０位の有意性を表すヒストグラムを示す。赤色棒は、偽陽性率補正後の０.０５のｐ値での過程の有意性を示す。図７Ｂは、過程がクラスター２(血管新生プローブセットクラスター)におけるプローブセットによりコードされる１個以上の遺伝子を含むときの遺伝子オントロジー生物学的過程ツリーのサブセットを示す。赤色過程は、偽陽性率補正後の０.０５のｐ値でのこの過程の有意性を示す。黒色過程は、血管新生クラスターにおけるプローブセットによりコードされるが、有意ではない１個以上の遺伝子を含む。

血管新生と関係する分子サブタイプを同定する４５個の遺伝子分類器モデル例内の遺伝子の機能濃縮結果を示す。赤色棒は、偽陽性率補正後の０.０５のｐ値での過程の有意性を示す。

ダサチニブでの処置後の１６個の前立腺細胞株内の４５個の遺伝子分類器モデル例の分類性能のＲＯＣ曲線の図である。分類器モデル適用後のＡＵＣは〜０.９５である。９５％信頼限界を、１０００回のブートストラップイテレーションを使用して決定した。

再分類された卵巣サンプルセットおける、て非血管新生サンプル群対“非血管新生”サンプル群とラベルされない“他の”サンプルの無進行生存(週)のカプラン・マイヤー曲線を提供する。

乳癌サンプルセットの５１個のＥＲ陰性サンプル全体で最も可変性の遺伝子(図１１Ａ)および乳癌サンプルセットの５６個のＥＲ陽性サンプル全体で最も可変性の遺伝子の階層的凝集型クラスタリング解析を表すヒートマップを示す(図１１Ｂ)。脈管構造構築／血管新生または免疫応答／ＩＦＮシグナル伝達を示すクラスターについて、プローブセットクラスターの機能分析を図の右手側に要約する。

２６５個の再分類された卵巣サンプルセットにおける、６３個の遺伝子“非血管新生”サイン例を使用して“非血管新生”と同定されたサンプル対６３個の遺伝子サイン例を使用して“非血管新生”として分類されない“他の”サンプルの無進行生存(週で)に関するカプラン・マイヤー曲線を提供する。

独立した２６５個の上皮性および漿液性卵巣サンプルセットにおける、６３個の遺伝子“非血管新生”サイン例を使用して“非血管新生”と同定されたサンプル対６３個の遺伝子サイン例を使用して“非血管新生”として分類されない“他の”サンプルの無進行生存(週で)に関するカプラン・マイヤー曲線を提供する。

結腸直腸癌サンプルに適用した非血管新生サイン例のある特定の分類性能ベンチマークを示すグラフである。

ダサチニブでの処置後の１６個の前立腺細胞株内の４５個の遺伝子分類器モデルの分類性能のＲＯＣ曲線の図である。分類器モデル適用後のＡＵＣは〜０.９５である。９５％信頼限界は１０００回のブートストラップイテレーションを使用して決定した(Wang XD, Reeves K, Luo FR, Xu LA et al. “Identification of candidate predictive and surrogate molecular markers for dasatinib in prostate cancer: rationale for patient selection and efficacy monitoring”、 GENOME BIOL 2007;8(11):R255. PMID: 18047674)。

Almac Diagnosticsの上皮性卵巣癌サンプルセットの１９９個の漿液性サンプル全体で最も可変性のプローブセットの階層的凝集型クラスタリング解析を表すヒートマップを示す。プローブセットクラスターの機能分析を図の右手側に要約する。図の上部にわたる説明文は、分類器作成のために各サンプルが割り当てられた分類器群(すなわちクラスラベル)を表す。

予後に基づき患者を分類するための非血管新生サインおよび次に例示的態様に従いある治療レジメンに対する応答性を決定するための血管新生サインの使用のための過程フロー図例カプラン・マイヤー曲線を提供する。

結腸直腸癌サンプルに適用した２５個の血管新生サイン例のある特定の分類性能ベンチマークを示すグラフである。

結腸直腸癌サンプルに適用した４５個の遺伝子血管新生サインのある特定の分類性能ベンチマークを示すグラフである。

発明の詳細な記載
特に断らない限り、ここで使用する技術用語および化学用語は、本発明が属する分野の通常の技術者に共通して理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的用語の定義はBenjamin Lewin, Genes IX, published by Jones and Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)およびMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)に見ることができる。

文脈から明らかに矛盾しない限り、単数表現は複数を含む。同様に、用語“または”は、文脈から明らかに矛盾しない限り、“および”を含むことを意図する。用語“包含する”は“含む”を意味する。矛盾がある場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。

ここで使用する用語“マーカーパネル”、“発現分類器”、“分類器”、“発現サイン”または“サイン”は相互交換可能に使用し得る。

本出現において引用する全ての刊行物、公開特許明細書および特許出願は、本出願が関係する技術分野における技術レベルの指標である。ここに引用する全ての刊行物、公開特許明細書および特許出願は、個々の刊行物、公開特許明細書および特許出願が具体的におよび個々に引用により包含されたのと同程度に引用によりここに包含される。

概説
癌における現在の研究努力の主な目標は、臨床的治療判断に分子パラメータを組み入れることによる、患者における周術期全身治療の有効性を高めることである。薬理遺伝学／ゲノミクスは、外来化合物または薬物に対する個々の応答に関与する遺伝子／ゲノム因子の研究である。本発明のバイオマーカーの発現に対して刺激性または阻害性効果を有する因子またはモジュレーターを個体に投与して、患者の癌を(予防的または治療的に)処置できる。このような処置と組み合わせて個体の薬理ゲノミクスを考慮することも理想である。治療剤の代謝における差異は、薬理学的活性薬物の投与量と血中濃度の間の相関を変えることにより、重度の毒性または治療失敗に至る可能性がある。それゆえに、個体の薬理ゲノミクスの理解は、予防処置または治療処置に有効な薬剤(例えば、薬物)の選択を可能にする。このような薬理ゲノミクスは、さらに、適当な投与量および治療レジメンの決定のために使用できる。従って、個体での本発明のバイオマーカーの発現レベルを決定し、それにより、該個体の治療的処置または予防的処置のための適当な薬剤を選択することができる。

本発明は、血管新生と関係する１個以上の一般的サブタイプの使用を含む、種々の解剖学的部位由来の癌を診断するのに有用な分子診断検査に関する。本発明は、抗血管新生治療剤に応答性または非応答性であるおよび／または臨床予後良好または臨床予後不良であるとして、対象を同定する発現サインを含む。発現サインは、病理および／または臨床成績が知られるサンプルセットからのサンプルの発現プロファイルを得ることにより導かれる。サンプルは、同一サンプル組織型に由来しても、異なる組織型に由来してもよい。ここで使用する“発現プロファイル”は、あるサンプルから解析した各バイオマーカーの発現レベルを表す値のセットである。

サンプルセット由来の発現プロファイルを、続いて数学モデルを使用して解析する。種々の数学モデルを適用でき、パターン認識(Duda et al. Pattern Classification, 2^nd ed., John Wiley, New York 2001)、機械学習(Schoelkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002, Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995)、統計学(Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001)、バイオインフォマティクス(Dudoit et al., 2002, J. Am. Statist. Assoc. 97:77-87, Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572)または計量化学(Vandeginste, et al., Handbook of Chemometrics and Qualimetrics, Part B, Elsevier, Amsterdam 1998)の分野からのモデルを含むが、これらに限定されない。数学モデルは、サンプルセットにおいて発現される、ある疾患表現型の最も予測的である１個以上のバイオマーカーを同定する。これらの１個以上のバイオマーカーは発現サインを規定する。従って、発現サインは、ある疾患表現型の最も予測的として同定されたバイオマーカーを含む。ある例示的態様において、数学モデルは、同定されたバイオマーカーの各々について重みのような変数を規定する。ある例示的態様において、数学モデルは、決定関数を規定する。決定関数は、さらに、抗血管新生治療剤に応答性および非応答性であるサンプルを含むが、これらに限定されない２個の疾患表現型にサンプルセットを分類する閾値スコアを規定し得る。一つの例示的態様において、決定関数および発現サインを線形分類器を使用して規定する。

規定の発現サインを使用して新規サンプルを分類するために、発現サインにより規定されたバイオマーカーを単離し、バイオマーカーの発現プロファイルを決定する。新規サンプルバイオマーカー発現プロファイルを同じ数学モデルを使用して解析して、発現サインを規定する。ある例示的態様において、数学モデルは、新規サンプルの発現スコアを規定する。発現スコアは、バイオマーカーの発現値と、単一スカラー値を導くための非線形手段、代数的手段、三角法手段または相関手段を使用する対応するスカラー重みを組み合わせることにより決定し得る。発現スコアを閾値スコアと比較し、発現スコアが閾値スコアより大きいか、等しいか小さいかに基づきサンプルを分類する。一つの例示的態様において、対照発現値より大きいサンプル発現値は、患者が抗血管新生治療剤に応答性であろうことを示す。他の例示的態様において、閾値スコアより小さいサンプル発現スコアは、患者が抗血管新生治療剤に応答性でないであろうことを示す。他の例示的態様において、閾値発現スコアより小さいサンプル発現スコアは、患者が抗血管新生治療剤に応答性ではないタイプの癌を有するまたはこのタイプの癌を発症する危険性があることを示す。他の例示的態様において、対照発現スコアより大きいサンプル発現スコアは、患者が抗血管新生治療剤に応答性であるタイプの癌を有するまたはこのタイプの癌を発症する危険性があることを示す。他の例示的態様において、閾値スコアより大きいサンプル発現スコアは、患者が臨床予後良好な癌サブタイプを有することを示す。他の例示的態様において、閾値スコアより小さいサンプル発現スコアは、患者が臨床予後不良な癌サブタイプを有することを示す。発現サインが一タイプの癌組織を含む組織サンプルセットに由来するとき、発現サインは、同じ癌タイプの組織における同じ癌サブタイプの同定のみだけではなく、同じ癌サブタイプを共有する他の癌タイプにも使用し得る。例えば、発現サインが卵巣癌サンプルに由来するとき、該発現サインを使用して、神経膠芽腫、乳癌、肺癌、結腸癌または前立腺癌のような異なる癌における類似の血管新生サブタイプを同定し得る。

ここに開示する発現サインの一つの適用は、予後良好および予後不良の患者の同定である。腫瘍における同定されたバイオマーカーのコレクションの発現を審査することにより、患者の可能性のある臨床成績を決定することが可能であり得る。従って、バイオマーカーのコレクションの発現を審査することにより、より積極的な治療レジメンを最も必要とする患者を同定し、同様に不要な治療処置または患者の臨床成績を有意に改善しない可能性がある治療処置を排除することが可能である。

例えば、癌サブタイプと関係する生存率が、他の関連する癌サブタイプと関係する生存率より高いならば、患者は“予後良好”であると見なし得る。ある態様において、“予後良好”は、少なくとも予測余命の延長を示す。これはここに記載する抗血管新生治療剤に対する応答性としての分類に基づき得る。延長した予測余命は、抗血管新生治療剤に非応答性として分類されたものとの対比であり得る。

例えば、癌サブタイプと関係する生存率が、他の関連する癌サブタイプと関係する生存率より低いとき、患者は“予後不良”または“予後が悪い”と見なし得る。

ここに開示する発現サインの他の適用は、抗血管新生治療剤を含む治療剤群に対する患者の応答の層化および選択である。腫瘍における同定されたバイオマーカーのコレクションの発現を審査することにより、どの治療剤または薬剤の組み合わせが癌の成長速度を最も減少できる可能性があるかを決定することが可能である。また、どの治療剤または薬剤の組み合わせが癌の成長速度を最も減少させない可能性があるかを決定することが可能である。従って、バイオマーカーのコレクションの発現を審査することにより、無効なまたは不適切な治療剤を排除することが可能である。重要なことに、ある態様において、これらの決定は患者毎原則または薬剤毎原則でなし得る。それゆえに、特定の治療レジメンが特定の患者または患者タイプに有益であるか否かおよび／または特定のレジメンを継続すべきか否かを決定できる。本発明は、治療選択の指針となり得るだけでなく、新規治療剤の臨床試験評価中の濃縮戦略のための患者群を選択できる試験を提供する。例えば、推定抗血管新生剤または処置レジメを評価するとき、ここに開示する発現サインおよび方法を使用して、抗血管新生剤に応答性である癌サブタイプを有する個体を臨床試験に選択し得る。

癌は、治療剤との接触の非存在下での成長と比較して、治療剤と接触させることにより成長速度が抑制されるならば、該治療剤に“応答性”である。癌の成長は多様な方法で測定できる。例えば、腫瘍サイズまたはその腫瘍タイプに適する腫瘍マーカーの発現の測定。

癌は、治療剤との接触の非存在下での成長と比較して、治療剤との接触の結果として成長速度が抑制されないまたは極めて低い程度にしか抑制されないならば、該治療剤に対して“非応答性”である。上記のとおり、癌の成長は、多様な方法で、例えば、腫瘍のサイズまたはその腫瘍タイプに適する腫瘍マーカーの発現の測定により測定できる。治療剤に対して非応答性であるとの資質は高度に変動性であり、異なる癌は、異なる条件下で、ある治療剤に対して異なるレベルの“非応答性”を示す。なおさらに、非応答性の尺度は、患者クオリティ・オブ・ライフおよび転移の程度のような、しかしこれらに限定されない腫瘍成長サイズ以外の付加的基準を使用して評価できる。

ここに開示する発現サインの他の適用は、ある治療剤に対する患者の予測応答性の同定と併せた患者の予後の複合同定である。ある例示的態様において、下に定義する非血管新生発現サインを、予後良好と予後不良の患者の同定に使用し、血管新生発現サインをある薬効分類の薬物に対する患者の応答の予測に使用する。

血管新生サブタイプを、新鮮／凍結(ＦＦ)またはホルマリン固定パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)患者サンプルから同定できる。一つの例示的態様において、癌タイプは卵巣癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌または神経膠芽腫である。他の例示的態様において、癌タイプは卵巣癌である。さらなる例示的態様において、癌タイプは乳癌である。他の例示的態様において、癌タイプは肺癌である。他の例示的態様において、癌タイプは結腸癌である。他の例示的態様において、癌タイプは前立腺癌である。他の例示的態様において、癌タイプは神経膠芽腫である。

発現サインの同定
本発明の発現サインを、患者サンプルセットにおけるある特定のバイオマーカーの発現プロファイルの解析により同定する。本発明における使用に適するバイオマーカーはＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含む。バイオマーカーを患者サンプルから単離し、その発現レベルを測定して、患者サンプルセットにおいて分析した各サンプルについての発現プロファイルのセットを導く。ある例示的態様において、発現サインは血管新生発現サインである。血管新生発現サインは癌組織で見られる血管新生表現型、すなわち血管新生および血管発生と関係するバイオマーカーの上方制御により特徴付けられる表現型である。ある他の例示的態様において、発現サインは非血管新生発現サインである。非血管新生発現サインは癌組織で見られる表現型、すなわち血管新生および血管発生と関係するバイオマーカーの下方制御により特徴付けられる表現型と関係する。

ａ. 発現プロファイル
ある態様において、得られる発現プロファイルはゲノムまたは核酸発現プロファイルであり、ここで、サンプル中の１個以上の核酸の量またはレベルを決定する。これらの態様において、診断方法または予後方法において用いる発現プロファイルを作成するためにアッセイするサンプルは、核酸サンプルであるものである。核酸サンプルは、分析する細胞または組織の表現型確定的バイオマーカーの発現情報を含む核酸集団である。ある態様において、核酸は、サンプルがこれを得た宿主細胞または組織の発現情報を保持する限り、ＲＮＡまたはＤＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡなどであってよい。サンプルは当分野で知られるとおり、多くの多様な方法で、例えば、細胞からのｍＲＮＡの単離により製造してよく、ここで、差次的遺伝子発現の分野において知られるとおり、単離ｍＲＮＡを単離して、増幅して使用するか、またはｃＤＮＡ、ｃＲＮＡなどを製造するために使用する。従って、サンプル中のｍＲＮＡレベルの測定は、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの製造と、続くｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの測定を含む。サンプルは、典型的に、処置を必要とする対象から、例えば、組織生検を介して採取した細胞または組織から標準的プロトコルを使用して調製し、ここで、このような核酸を産生し得る細胞型または組織は、疾患細胞または組織、体液などを含むが、これらに限定されない、測定する表現型の発現パターンが存在するあらゆる組織を含む。

発現プロファイルは、慣用のプロトコルのいずれかを使用して、最初の核酸サンプルから製造し得る。差次的遺伝子発現／バイオマーカー分析の分野で用いられているもののような、発現プロファイルを作成するための多種多様な方法が知られているが、発現プロファイルを作成するための一つの代表的かつ簡便なプロトコルのタイプはアレイを利用する遺伝子発現プロファイル作成プロトコルである。このような適用は、作成するプロファイルにおいてアッセイ／プロファイルすべき遺伝子の各々に対する“プローブ”核酸を呈する核酸を用いるハイブリダイゼーションアッセイである。これらのアッセイにおいて、標的核酸のサンプルを最初にアッセイする最初の核酸サンプルから調製し、ここで、調製物は標識、例えば、シグナル生成系のメンバーでの標的核酸の標識を含み得る。標的核酸サンプル調製後、サンプルをアレイとハイブリダイゼーション条件下に接触させ、それにより、アレイ表面に結合したプローブ配列と相補的である標的核酸の間で複合体が形成される。次いで、ハイブリダイズした複合体の存在を、定性的または定量的に検出する。対象方法において用いる発現プロファイルの作成のために実施し得る具体的ハイブリダイゼーションテクノロジーは、米国特許番号５,１４３,８５４；５,２８８,６４４；５,３２４,６３３；５,４３２,０４９；５,４７０,７１０；５,４９２,８０６；５,５０３,９８０；５,５１０,２７０；５,５２５,４６４；５,５４７,８３９；５,５８０,７３２；５,６６１,０２８；５,８００,９９２；ならびにＷＯ９５／２１２６５；ＷＯ９６／３１６２２；ＷＯ９７／１０３６５；ＷＯ９７／２７３１７；ＥＰ３７３２０３；およびＥＰ７８５２８０に記載されたテクノロジーを含む(これらの開示を引用により本明細書に包含させる)。これらの方法において、発現をアッセイするバイオマーカーの各々に対するプローブを含む“プローブ”核酸のアレイを、上記のとおり標的核酸と接触させる。接触を、上記のとおりハイブリダイゼーション条件下、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行い、未結合核酸をその後除去する。得られたハイブリダイズした核酸のパターンは、プローブされたバイオマーカーの各々の発現に関する情報を提供し、ここで、発現情報は、該遺伝子が発現しているかしていないか、そして典型的に、どの程度のレベルかの観点であり、該発現データ、すなわち、発現プロファイルは定質的および定量的の両者であり得る。

ｂ. 疾患およびサンプル組織スコア
ある例示的態様において、患者サンプルセットは、保存されたサンプルのような癌組織サンプルを含む。患者サンプルセットは、好ましくは予後、再発の可能性、長期生存、臨床成績、処置応答、診断、癌分類または個別化ゲノミクスプロファイルにより特徴付けられている癌組織サンプル由来である。ここで使用する癌は、白血病、脳の癌、前立腺癌、肝癌、卵巣癌、胃癌、結腸直腸癌、咽頭癌、乳癌、皮膚癌、黒色腫、肺癌、肉腫、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、内分泌癌、子宮内膜癌、食道癌、神経膠腫、リンパ腫、神経芽腫、骨肉腫、膵癌、下垂体癌、腎癌などを含むが、これらに限定されない。ここで使用する結腸直腸癌は、直腸および結腸の他の部分の組織における癌を含み得る癌ならびに結腸癌または直腸癌のいずれかと独立して分類され得る癌の両者を含む。一つの態様において、ここに記載する方法は、抗血管新生剤、抗血管新生標的治療、血管新生シグナル伝達の阻害剤で処置される癌を引用するが、これらのクラスに限定されない。これらの癌はまた、種々の病理学的段階にあるこれらの癌のサブクラスおよびサブタイプを含む。ある例示的態様において、患者サンプルセットは卵巣癌サンプルを含む。他の例示的態様において、患者サンプルセットは乳癌サンプルを含む。さらに別の例示的態様において、患者サンプルセットは神経膠芽腫サンプルを含む。

“生物学的サンプル”、“サンプル”および“検査サンプル”は、個体から得たまたは他の方法でもたらされたあらゆる物質、体液、組織または細胞を指すためにここで交換可能に使用する。これは血液(全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、血漿および血清を含む)、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻咽頭吸引液、息、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、腹水、細胞、細胞抽出物および脳脊髄液を含む。これはまた、前記の全ての実験的に分離させたフラクションも含む。例えば、血液サンプを血清にまたは赤血球もしくは白血球(ロイコサイト)のような特定のタイプの血球を含むフラクションに分画できる。所望により、サンプルは一個体からの、組織サンプルと体液サンプルの組み合わせのようなサンプルの組み合わせであり得る。用語“生物学的サンプル”はまた、例えば、便サンプル、組織サンプルまたは組織生検由来のような均質化固形物を含む物質も含む。用語“生物学的サンプル”はまた、組織培養物または細胞培養物由来の物質も含む。生物学的サンプルを得るのに適する任意の適切な方法を使用でき、方法の例は、例えば、静脈切開術、スワブ(例えば、口腔スワブ)および穿刺吸引細胞診法を含む。サンプルはまた、例えば、マイクロダイセクション(例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(ＬＣＭ)またはレーザーマイクロダイセクション(ＬＭＤ))、膀胱洗浄、スメア(例えば、ＰＡＰスメア)または乳管洗浄細胞診によっても採取できる。個体から得たまたは個体に由来する“生物学的サンプル”は、個体から得られた後、何らかの適当な方法、例えば、新鮮凍結またはホルマリン固定および／またはパラフィン包埋で処理されている任意のこのようなサンプルを含む。ここに定義する本発明の方法を、得たサンプルで開始してよく、それゆえに、患者からサンプルを得る工程は必ずしも含まれない。方法は、単離サンプル上で実施するインビトロ方法であり得る。

ここで使用する用語“患者”はヒトおよび非ヒト動物を含む。処置のための好ましい患者はヒトである。“患者”、“個体”および“対象”は、ここでは相互交換可能に使用する。

ｃ. バイオマーカー
ここで使用する用語“バイオマーカー”は遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンス転写物、ｍｉＲＮＡ、ポリペチド、タンパク質、タンパク質フラグメントまたは遺伝子発現レベルもしくはタンパク質産物レベルのいずれかを示す任意の他の核酸配列またはポリペチド配列を指すことができる。バイオマーカーが個体における異常な過程、疾患または他の状態のサインを示すか、または該サインであるならば、そのバイオマーカーは、個体における正常な過程、疾患または他の状態の不在のサインを示すか、または該サインであるバイオマーカーの発現レベルまたは値と比較して、一般に過剰発現または過小発現していると述べられる。“上方制御”、“上方制御された”、“過剰発現”、“過剰発現した”およびそのあらゆる異形を、健常なまたは正常な個体由来の同等な生物学的サンプルで典型的に検出されるバイオマーカーの値またはレベル(または値もしくはレベルの範囲)より大きな、生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの値またはレベルを指すために相互交換可能に使用する。本用語はまた特定の疾患の異なる段階で検出され得るバイオマーカーの値またはレベル(または値もしくはレベルの範囲)より大きい、生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの値またはレベルも指すことができる。

“下方制御”、“下方制御された”、“過小発現”、“過小発現した”およびそのあらゆる異形を、健常なまたは正常な個体由来の同等な生物学的サンプルで典型的に検出されるバイオマーカーの値またはレベル(または値もしくはレベルの範囲)より低い生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの値またはレベルを指すために相互交換可能に使用する。本用語はまた特定の疾患の異なる段階で検出され得るバイオマーカーの値またはレベル(または値もしくはレベルの範囲)より小さい、生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの値またはレベルも指すことができる。

さらに、過剰発現または過小発現しているバイオマーカーはまた、個体における正常な過程、疾患または他の状態の不在のサインを示すか、または該サインであるバイオマーカーの“正常”発現レベルまたは値と比較して、“差次的に発現している”または“差次的レベル”または“差次的値”を有するということもできる。それゆえに、バイオマーカーの“差次的発現”はまた、バイオマーカーの“正常”発現レベルからの変動ということもできる。

用語“差次的バイオマーカー発現”および“差次的発現”は、正常対象における発現に対してまたは特定の治療に対して異なって応答するまたは異なる予後の患者における発現に対して、該特定の疾患に罹患している対象において発現が高いまたは低いレベルで活性化されているバイオマーカーを指すために相互交換可能に使用する。本用語はまた、同じ疾患の異なる段階で、発現が高いまたは低いレベルで活性化されているバイオマーカーも含む。差次的に発現しているバイオマーカーは、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化されていても、阻害されていてもよく、選択的スプライシングに付されて、異なるポリペチド産物を生じてもよいことも理解される。このような差異は、ｍＲＮＡレベル、ｍｉＲＮＡレベル、アンチセンス転写物レベルまたはタンパク質表面発現、分泌またはポリペチドの他の分割を含む、広範な変化により証明され得る。差次的バイオマーカー発現は、２個以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物の発現の比較または２個以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物の発現の割合の比較または正常対象と疾患に罹患している対象の間で異なる同じ遺伝子の２個の異なって処理された産物の比較または同じ疾患の種々の段階での比較を含み得る。差次的発現は、例えば、正常細胞と罹患細胞の間のまたは異なる疾患事象または疾患段階にある細胞間の、バイオマーカーにおける一過性または細胞性発現パターンの定量的および定性的差異の両者であり得る。

ある例示的態様において、バイオマーカーはＲＮＡ転写物である。ここで使用する“ＲＮＡ転写物”は、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、選択的スプライシングされたｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ(ｒＲＮＡ)、トランスファーＲＮＡ(ｔＲＮＡ)、核内低分子ＲＮＡ(ｓｎＲＮＡ)およびアンチセンスＲＮＡを含む、コードＲＮＡおよび非コードＲＮＡの両者を指す。生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡの測定を、生物学的サンプルにおける対応するタンパク質および遺伝子のレベルを検出するための代用として使用し得る。それゆえに、ここに記載するあらゆるバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルを、適当なＲＮＡの検出によっても検出できる。バイオマーカー発現プロファイリングの方法は、定量的ＰＣＲ、ＮＧＳ、ノーザンブロット、サザンブロット、マイクロアレイ、ＳＡＧＥ、免疫アッセイ(ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、凝集、比濁分析、比濁法、ウェスタンブロット、免疫沈殿、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ルミネックスアッセイ)および質量分析を含むが、これらに限定されない。あるサンプルの全体的発現データを、異なる量の出発物質、抽出および増幅反応の効率変動を補正するために、当業者に知られる方法を使用して正規化し得る。

ある例示的態様において、抗血管新生治療剤に対して応答性および非応答性である癌タイプを区別するために有用なバイオマーカーを、上記発現検出方法および患者サンプルセットを使用して決定した、患者データセットにおけるサンプル間で最も可変性の程度が高いバイオマーカーの同定により決定できる。発現データの高度に可変性のデータ点を同定するための当分野で知られる標準的統計法を使用して、高度に可変性のバイオマーカーを同定し得る。例えば、バックグラウンドフィルタおよび分散フィルタの組み合わせを患者データセットに使用する。バックグラウンドフィルタは、発現Ｅならびにバックグラウンド標準偏差σＢｇにより規定した閾値(Expression Consoleソフトウェアから)を超える発現分散を有するプローブセットの選択に基づき、
〔式中、ａは有意性閾値を規定する。〕
であるならば、プローブセットは、特定の有意性ａでの標準正規分布の分位点ｚ_αを維持した。ある例示的態様において、有意性閾値は６.３×１０^−５である。他の例示的態様において、有意性閾値は１.０×１０^−７〜１.０×１０^−３であり得る。

ある例示的態様において、高度に可変性のバイオマーカーをさらに分析して、患者データセットのサンプルを類似遺伝子発現プロファイルに基づき、サブタイプまたはクラスターに群別けしてよい。例えば、バイオマーカーを、その発現の上方制御または下方制御が互いにどの程度高度に相関するかに基づき、クラスター化してよい。当分野で知られる多様なクラスタリング解析技術を使用し得る。一つの例示的態様において、階層的凝縮型クラスタリングを使用して、癌サブタイプを同定する。各サブタイプの生物学的関連性を測定するために、各クラスター内のバイオマーカーを、それらの対応する遺伝子にさらにマッピングし、該遺伝子と関係する生物学的活性および生物学的経路についての情報を含む１個以上の遺伝子オントロジーデータベースへの相互参照によりアノテートしてよい。一つの例示的態様において、血管新生、脈管構造構築および免疫応答一般機能の項について濃縮されたクラスターにおけるバイオマーカーを推定血管新生サンプル群にグループ分けし、発現サイン作成に使用する。他の例示的態様において、血管新生、脈管構造構築および免疫応答一般機能の項について上方制御されたおよび濃縮されたクラスターにけるバイオマーカーを推定血管新生サンプル群にグループ分けし、発現サイン作成に使用する。他の例示的態様において、血管新生、脈管構造構築および免疫応答一般機能の項について下方制御されたおよび濃縮されたクラスターにおけるバイオマーカーを推定血管新生サンプル群にグループ分けし、発現サイン作成に使用する。バイオマーカークラスターの機能分析を実施するためのさらなる詳細は、下の実施例の章に示す。

一つの例示的態様において、本発明で使用するための発現サインの抽出において有用なバイオマーカーは表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃに挙げるバイオマーカーまたはこれらの組み合わせである。これらのバイオマーカーは、治療剤に対する患者応答を決定するための予測的価値および／または個体の臨床予後良好または臨床予後不良への同定における予後価値を有するとして同定されている。

ある例示的態様において、その発現は、薬剤、より具体的に、抗血管新生治療剤への応答または応答欠如と相関する。腫瘍における同定されたバイオマーカーのコレクションの発現を審査することにより、腫瘍における同定されたバイオマーカーのコレクションの発現を審査することにより、どの治療剤または薬剤の組み合わせが癌の成長速度を最も減少できる可能性があるかを決定することが可能である。腫瘍における同定されたバイオマーカーのコレクションを審査することにより、どの治療剤または薬剤の組み合わせが癌の成長速度を最も減少させない可能性があるかを決定することも可能である。従って、バイオマーカーのコレクションの発現を審査することにより、無効なまたは不適切な治療剤を排除することが可能である。重要なことに、ある態様において、これらの決定は患者毎原則または薬剤毎原則でなし得る。それゆえに、それゆえに、特定の治療レジメンが特定の患者または患者タイプに有益であるか否かおよび／または特定のレジメンを継続すべきか否かを決定できる。

ある他の例示的態様において、ここに開示するバイオマーカーの発現は、患者の全体的臨床予後と相関する。腫瘍において同定されたバイオマーカーのコレクションの発現を審査することにより、該個体が臨床予後良好または臨床予後不良と結びつく癌サブタイプを有するか否かを決定することが可能である。重要なことに、ある態様において、これらの決定は患者毎原則でなし得る。それゆえに、当業者は、望まないまたは医学的に不当な有害副作用を生じる可能性が最も高い処置レジメンを排除しながら、根底の疾患を処置するのに適当な処置レジメンを選択する助けとして、予測予後を使用できる。

表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃに挙げる配列番号は、トランスクリプトームアレイ例における、遺伝子の発現レベルを測定するために使用するプローブセット識別子を指す。本発明の発現サインは、下の実施例の章にさらに詳述する、異なるプローブセットを有する異なるアレイからの発現データを使用して交差検証されている。従って、ここに開示する発現サインおよび方法は、ここに開示するプローブセットを使用して測定した発現値に限定されない。

ある例示的態様において、表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃに記載するバイオマーカーの全てまたは一部を発現サインに使用し得る。例えば、表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃにおけるバイオマーカーを含む発現サインを、ここに提供する方法を使用して作成でき、表１Ａ、１Ｂ、１Ｃに示すマーカーセットの１個ないし全ておよび間のそれぞれのおよび全ての組み合わせ(例えば、４個の選択マーカー、１６個の選択マーカー、７４個の選択マーカーなど)を含み得る。ある態様において、発現サインは、少なくとも５個、１０個、２０個、４０個、６０個、１００個、１５０個、２００個または３００個またはそれ以上のマーカーを含む。他の態様において、予測的バイオマーカーパネルは、５個、１０個、２０個、４０個、６０個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個または７００個を超えないマーカーを含む。一つの例示的態様において、発現サインは表１Ａに挙げた複数のマーカーを含む。他の例示的態様において、発現サインは表１Ｂに挙げた複数のバイオマーカーを含む。他の例示的態様において、発現サインは表１Ｃに挙げた複数のバイオマーカーを含む。さらに別の例示的態様において、発現サインは表１Ａ、表１Ｂおよび表１Ｃに挙げた複数のバイオマーカーを含む。ある態様において、発現サインは、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃに挙げたマーカーまたはこれらの組み合わせの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％を含む。選択した発現サインを、ここに記載した方法および類似した当技術分野で知られる方法を使用して提供されるバイオマーカーから組み立てることができる。一つの態様において、発現サインは、表１Ａにおける全２５０個の遺伝子または遺伝子産物を含む。他の例示的態様において、発現サインは表１Ｂにおける全４８６個の遺伝子または遺伝子産物を含む。他の例示的態様において、発現サインは表１Ｃにおける全３４３個の遺伝子または遺伝子産物を含む。

４. 数学モデル
次の方法を使用して、抗血管新生治療剤に対して応答性または非応答性である対象を区別するためのまたはある特定の癌タイプの予後指標としての、上に開示したバイオマーカー由来の発現サインを含む、発現サインを導き得る。ある他の例示的態様において、発現サインを、線形、斜め線形、二次およびロジスティック判別分析、マイクロアレイの予測分析(ＰＡＭ、(Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572))またはクラスのアナロジーのソフトの独立したモデリング(ＳＩＭＣＡ、(Wold, 1976, Pattern Recogn. 8:127-139))を含むが、これらに限定されない、決定木(Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001)、ランダムフォレスト(Breiman, 2001 Random Forests, Machine Learning 45:5)、ニューラル・ネットワーク(Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995)、判別分析(Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001)を使用して導く。

バイオマーカー発現値を、種々の強度の実規模での対応するスカラー重みと組み合わせて定義してよく、これを、さらに、線形または非線形、代数的、三角法または相関手段を経る代数的、統計的学習、ベイジアン、回帰または類似のアルゴリズムを介して単一スカラー値に併せ、これは、スカラー値上の数学的に導かれる決定関数と共に予測的モデルを提供し、これにより、サンプルからの発現プロファイルを、特定の薬物、薬物群または処置レジメンに対する応答者または非応答者、耐性または非耐性の別個の群に分解し得る。バイオマーカーメンバーシップを含むこのような予測的モデルは、薬物応答および／または耐性が知られる歴史的患者サンプルからの代表的発現プロファイルのセットから、交差検証、ブートストラッピングまたは類似するサンプリング技術下に、感受性、特異性、陰性および陽性予測的値、ハザード比またはこれらの組み合わせのいずれかに対して最適化された、重みおよび判定閾値の学習により開発される。

一つの態様において、バイオマーカーを使用してこれらのシグナルの加重和を形成し、ここで、個々の重みは陽性でも陰性でもよい。得られた和(“発現スコア”)を定義済み対照点または値と比較する。対照点または値との比較を、臨床状態または臨床成績の診断または予測に使用し得る。

上記のとおり、当業者は、表１Ａ、１Ｂおよび表１Ｃに提供される分類器に含まれるバイオマーカーが、治療剤に対する応答性または耐性について分類器に同等ではない重みを持つことを認識する。それゆえに、わずか１個の配列を、治療剤に対する応答性のような成績の診断または予後に使用できるが、特異性および感受性または診断または予測精度は配列が多いほど上がり得る。

ここで使用する用語“重み”は、統計的計算における項目の相対的重要度を指す。遺伝子発現分類器における各バイオマーカーの重みを、当技術分野で知られる分析方法を使用して、患者サンプルのデータセットで決定し得る。ここで使用する用語“バイアス”または“オフセット”は、トレーニングセットにおけるサイン遺伝子の平均発現を使用して導いた定数項を指し、検査データセットで解析される各遺伝子の中心に併せることを意味するために使用される。

ある例示的態様において、発現サインを決定関数により決定する。決定関数は、線形分類器を使用して導いた重み付けした発現値のセットである。全ての線形分類器は、次の等式を使用して決定関数を規定する。

ある特定のサンプルのマイクロアレイ遺伝子発現強度ｘ_ｉのような全測定値をベクトルｘに集める。次いで、各強度を対応する重みｗ_ｉで乗算し、オフセット項ｂを加算して、決定関数ｆ(ｘ)の値を得る。決定関数を導くとき、線形分類器は、さらに、遺伝子発現データ領域を２個の互いに素な半分に別ける閾値をさらに規定する。線形分類器の例は、部分最小二乗法(ＰＬＳ)(Nguyen et al., Bioinformatics 18 (2002) 39-50)、サポートベクターマシン(ＳＶＭ)(Schoelkopf et al., Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002)および縮小判別分析(ＳＤＡ)(Ahdesmaeki et al., Annals of applied statistics 4, 503-519 (2010))を含むが、これらに限定されない。一つの例示的態様において、線形分類器はＰＬＳ線形分類器である。

決定関数は、例えば治療剤に応答性または耐性を示す患者からの、大きなトレーニングサンプルセット上で経験的に導かれる。閾値は、処置に対する応答性／非応答性を含むが、これに限定されない異なる特徴に基づき、患者群を別ける。この量の解釈、すなわち治療剤に対する応答性または耐性のカットオフ閾値は、成績が知られる患者のセットからの開発段階(“トレーニング”)で得られる。スコアを判定するための対応する重みおよび応答性／耐性カットオフ閾値は、当業者に知られる方法によりトレーニングデータから推測的に固定される。一つの例示的態様において、部分最小二乗法判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)を重みの決定に使用する(L. Stahle, S. Wold, J. Chemom. 1 (1987) 185-196; D. V. Nguyen, D.M. Rocke, Bioinformatics 18 (2002) 39-50)。

実際上、これは、データ領域、すなわちバイオマーカー発現値の全ての可能な組み合わせのセットを、異なる臨床的分類または予測に対応する、例えば、一方は治療剤に対する応答性に、他方は非応答性に対応する２個の互いに排反する群に別けることを意味する。全体的分類器の状況において、ある特定のバイオマーカーの相対的過剰発現は、判定スコアを上げる(正の重み)または下げる(負の重み)ことができ、そうして、例えば、治療剤に対する応答性または耐性のような、全体的決定に寄与する。

本発明のある例示的態様において、データを、上記のとおり加重和を適用する前に非線形的に変換する。この非線形変換は、データの次元性の増加を含むはずである。非線形変換および加重総和法はまた、例えば、核関数の使用を介して、陰関数により実施もされるはずである(Schoelkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002)。

ある例示的態様において、患者トレーニングセットデータは、対応する癌組織サンプルセットからＲＮＡを単離し、単離ＲＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズすることにより発現値を測定することにより導く。ある例示的態様において、発現サインを導くのに使用するマイクロアレイはトランスクリプトームアレイである。ここで使用する“トランスクリプトームアレイ”は、目的の罹患組織において発現されることが検証されている配列にハイブリダイズするために設計されたプローブセットを含むマイクロアレイである。組織および生物学的状況での選択的スプライシングおよび可変性ポリＡテイルプロセシングを考慮すると、他の組織源または生物学的状況に由来する同じ遺伝子配列に対して設計したプローブは、目的の罹患組織において発現された転写物に効果的に結合せず、潜在的に関連する生物学的情報の損失に至る可能性がある。従って、どの配列が目的の疾患組織で発現するかを、マイクロアレイプローブセットを誘導する前に検証することは有益である。特定の疾患状況で発現された配列の検証は、例えば、罹患組織サンプルセットから全ＲＮＡを単離および配列決定し、単離配列と既知核酸配列データベースを相互参照して、トランスクリプトームアレイ上のプローブセットが目的の罹患組織で実際発現されている配列に対して設計されていることを検証することにより行い得る。トランスクリプトームアレイの製造方法は、米国特許出願公開番号２００６／０１３４６６３に記載されており、これを引用により本明細書に包含させる。ある例示的態様において、トランスクリプトームアレイのプローブセットを転写物の３’末端の３００個以内のヌクレオチドと結合するように設計する。標的転写物の３’末端の３００個以内のヌクレオチドと結合するプローブセットを備えたトランスクリプトームアレイを設計する方法は、米国特許出願公開番号２００９／００８２２１８に記載されており、これを引用により本明細書に包含させる。ある例示的態様において、本発明の遺伝子発現プロファイルの誘導において使用するマイクロアレイは、Almac Ovarian Cancer DSA^TMマイクロアレイ(Almac Group, Craigavon, United Kingdom)である。

最適線形分類器を、“曲線下面積”(ＡＵＣ)のような診断を使用して、線形分類器の製造を評価することにより選択できる。ＡＵＣは、受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線の曲線下面積を指し、このいずれも当分野で周知である。ＡＵＣ尺度は、完全データ範囲にわたる分類器の精度の比較に有用である。線形分類器のＡＵＣが高い程、未知のものを目的の２群(例えば、卵巣癌サンプルと正常または対照サンプル)の間に正確に分類する能力が高い。ＲＯＣ曲線は、２つの集団(例えば、治療剤に応答するおよび応答しない個体)の区別において、特定の特性(例えば、ここに記載するバイオマーカーのいずれかおよび／または付加的生物医学的情報のいずれかの項目)の性能をプロットするのに有用である。典型的に、集団全体(例えば、症例と対照)にわたる特性データを、単一特性の値に基づき昇順でソートする。次いで、この特性の各値について、データの真陽性率および偽陽性率を計算する。真陽性率は、この特性について該値を超える症例の数を計数し、症例の総数で除算することにより決定する。偽陽性率は、この特性について該値を超える対照の数を計数し、対照の総数で除算することにより決定する。この定義は、特性が対照と比較して症例で上昇しているシナリオを参照しているが、特性が対照と比較して症例で低下しているシナリオにもこの定義は適用される(このようなシナリオにおいて、この特性について該値を下回るサンプルを計数する)。ＲＯＣ曲線は単一特性と同様に他の単一結果で作成でき、例えば、２個以上の特性の組み合わせを数学的に併せ(例えば、加算、減算、乗算など)、単一合計値を得ることができ、この単一合計値をＲＯＣ曲線にプロットしてよい。さらに、単一結果値を導く複数特性のあらゆる組み合わせをＲＯＣ曲線にプロットできる。これらの特性の組み合わせは検査を構成し得る。ＲＯＣ曲線は、検査の偽陽性率(１−特異性)に対する検査の真陽性率(感受性)のプロットである。

一つの例示的態様において、血管新生発現サインは、表２Ａに詳述した２５個のバイオマーカーと共に、該表に詳述した対応するランク、重みおよび関係するバイアスまたは、例えば、疾患状況によって異なるランク付け、重み付けおよびバイアスに関する。他の例示的態様において、血管新生発現サインは、表２Ｂに詳述した４５個のバイオマーカーと共に、該表に詳述した対応するランク、重みおよび関係するバイアスまたは、例えば、疾患状況によって異なるランク付け、重み付けおよびバイアスに関する。他の例示的態様において、非血管新生発現サインは、表２Ｃに詳述した６３個のバイオマーカーと共に、該表に詳述した対応するランク、重みおよび関係するバイアスまたは、例えば、疾患状況によって異なるランク付け、重み付けおよびバイアスに関する。表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、化合物決定スコア関数において、例示的分類器における、絶対的に減少している重みの順でバイオマーカーをランク付けする。

一つの例示的態様において、発現サインは次のバイオマーカーＣＣＤＣ８０、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２、ＭＭＰ２、ＰＬＡＵ、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ３８Ｂ、ＶＣＡＮ、ＧＪＢ２、ＩＴＧＡ５、ＣＲＩＳＰＬＤ２、Ｃ１７、ｆ９１、ＢＧＮ、ＴＩＭＰ３、ＡＬＰＫ２、ＬＵＭ、ＮＫＤ２、ＬＯＸ、ＭＩＲ１２４５、ＬＯＸＬ１およびＣＸＣＬ１２の全てまたは一部を含む。

他の例示的態様において、発現サインはＣＣＤＣ８０、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２およびＳＦＲＰ２ならびに表２Ａにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１である

他の例示的態様において、発現サインはＣＣＤＣ８０および表２Ａにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４である

他の例示的態様において、発現サインはＩＮＨＢＡおよび表２Ａにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４である

他の例示的態様において、発現サインはＴＨＢＳ２および表２Ａにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４である

他の例示的態様において、発現サインはＳＦＲＰ２および表２Ａにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４である

他の例示的態様において、発現サイン例は、表２Ａに挙げたバイオマーカーおよび対応するバイオマーカー荷重値を含む。他の例示的態様において、発現サイン例は表２Ａに挙げたバイオマーカーおよび対応するバイオマーカー荷重値からなる。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＣＣＤＣ８０、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２およびＳＦＲＰ２ならびに表２Ａにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＣＣＤＣ８０および表２Ａにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３または２４である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＮＨＢＡおよび表２Ａにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３または２４である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＴＨＢＳ２および表２Ａにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３または２４である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＳＦＲＰ２および表２Ａにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３または２４である。

他の例示的態様において、発現サインは次のバイオマーカーＴＭＥＭ２００Ａ、ＧＪＢ２、ＭＭＰ１３、ＧＦＰＴ２、ＰＯＳＴＮ、ＢＩＣＣ１、ＣＤＨ１１、ＭＲＶＩ１、ＰＭＰ２２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＩＧＦＬ２、ＬＵＭ、ＮＴＭ、ＢＧＮ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＲＡＢ３１、ＡＮＧＰＴＬ２、ＰＬＡＵ、ＣＯＬ８Ａ１、ＭＩＲ１２４５、ＰＯＬＤ２、ＮＫＤ２、ＦＺＤ１、ＣＯＰＺ２、ＩＴＧＡ５、ＶＧＬＬ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＭＰ１４、ＶＣＡＮ、ＴＨＢＳ２、ＲＵＮＸ２、ＴＩＭＰ３、ＳＦＲＰ２、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＫＩＦ２６Ｂ、ＴＮＦＡＩＰ６、ＭＭＰ２、ＦＮ１、ＡＬＰＫ２、ＣＴＳＫ、ＬＯＸＬ１およびＦＡＰの全てまたは一部を含む。

他の例示的態様において、発現サインはＴＭＥＭ２００Ａ、ＧＪＢ２、ＭＭＰ１３およびＧＦＰＴ２ならびに表２Ｂにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４１である。

他の例示的態様において、発現サインはＴＭＥＭ２００Ａおよび表２Ｂにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４である。

他の例示的態様において、発現サインはＧＪＢ２および表２Ｂにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４である。

他の例示的態様において、発現サインはＭＭＰ１３および表２Ｂにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４である。

他の例示的態様において、発現サインはＧＦＰＴ２および表２Ｂにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４である。

他の例示的態様において、発現サイン例は、表２Ｂに挙げたバイオマーカーおよび対応するバイオマーカー荷重値を含む。他の例示的態様において、発現サインは表２Ｂに挙げたバイオマーカーおよび対応するバイオマーカー荷重値からなる。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＴＭＥＭ２００Ａ、ＧＪＢ２、ＭＭＰ１３およびＧＦＰＴ２ならびに表２Ｂにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４１である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＴＭＥＭ２００Ａおよび表２Ｂにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＧＪＢ２および表２Ａにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＭＭＰ１３および表２Ｂにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＧＦＰＴ２および表２Ｂにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４である。

他の例示的態様において、発現サインは次のバイオマーカーＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３、ＲＴＰ４、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＤＲ１、ＲＡＲＲＥＳ３、ＴＮＦＳＦ１０、ＮＵＡＫ１、ＳＮＯＲＤ１１４−１４、ＳＲＰＸ、ＳＰＡＲＣ、ＧＪＢ１、ＴＩＭＰ３、ＩＳＬＲ、ＴＵＢＡ１Ａ、ＤＥＸＩ、ＢＡＳＰ１、ＰＸＤＮ、ＧＢＰ４、ＳＬＣ２８Ａ３、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＴＡＰ２、ＡＣＳＬ５、ＣＤＨ１１、ＰＳＭＢ９、ＭＭＰ１４、ＣＤ７４、ＬＯＸＬ１、ＣＩＩＴＡ、ＺＮＦ６９７、ＳＨ３ＲＦ２、ＭＩＲ１９８、ＣＯＬ１Ａ２、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＣＯＬ８Ａ１、Ｃ２１ｏｒｆ６３、ＴＡＰ１、ＰＤＰＮ、ＲＨＯＢＴＢ３、ＢＣＬ１１Ａ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＸＡＦ１、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＰＯＬＤ２、ＤＰＹＳＬ２、ＣＯＬ４Ａ１、ＩＤ３、ＣＦＢ、ＮＩＤ１、ＦＫＢＰ７、ＴＩＭＰ２、ＲＣＢＴＢ１、ＡＮＧＰＴＬ２、ＥＮＴＰＤ７、ＳＨＩＳＡ４およびＨＩＮＴ１の全てまたは一部を含む。

他の例示的態様において、発現サインはＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳおよびＣＸＣＬ１７ならびに表２Ｃにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。

他の例示的態様において、発現サインはＩＧＦ２および表２Ｃにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。

他の例示的態様において、発現サインはＳＯＸ１１および表２Ｃにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。

他の例示的態様において、発現サインはＩＮＳおよび表２Ｃにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。

他の例示的態様において、発現サインはＣＸＣＬ１７および表２Ｃにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。

他の例示的態様において、発現サイン例は、表２Ｃに挙げたバイオマーカーおよび対応するバイオマーカー荷重値を含む。他の例示的態様において、発現サイン例は表２Ｃに挙げたバイオマーカーおよび対応するバイオマーカー荷重値からなる。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルは表２Ｃに挙げるバイオマーカーの全てまたは一部を含む。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳおよびＣＸＣＬ１７ならびに表２Ｃにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＧＦ２および表２Ｃにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＳＯＸ１１および表２Ｃにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＩＮＳおよび表２Ｃにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＣＸＣＬ１７および表２Ｃにおけるバイオマーカーの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２である。

一つの例示的態様において、発現サインは、次のバイオマーカーＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮの全てまたは一部を含む。

他の例示的態様において、発現サインはＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰおよびＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮから選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１およびＦＡＰならびにＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮから選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＡＬＰＫ２ならびにバイオマーカーＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＢＧＮならびにバイオマーカーＡＬＰＫ２、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＣＯＬ８Ａ１ならびにバイオマーカーＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。

さらなる面において、本発明の方法は、バイオマーカーパネルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するために個体からの生物学的サンプルでアッセイを実施することを含み、該バイオマーカーパネルはＦＡＰならびにバイオマーカーＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮの一覧から選択した少なくともＮ個の付加的バイオマーカー￥を含み、ここで、Ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。

他の例示的態様において、発現サインは次のバイオマーカーＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２、ＰＬＡＵの全てまたは一部ならびに表１Ａ〜１Ｃからの少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０である。

他の例示的態様において、発現サインは全ＧＪＢ２および表１Ａ〜１Ｃからの少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３または７４である。

他の例示的態様において、発現サインは全ＩＮＨＢＡおよび表１Ａ〜１Ｃからの少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３または７４である。

他の例示的態様において、発現サインは全ＴＨＢＳ２および表１Ａ〜１Ｃからの少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３または７４である。

他の例示的態様において、発現サインは全ＳＦＲＰ２を含み、ここで、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３または７４である。

他の例示的態様において、発現サインは全ＰＬＡＵおよび表１Ａ〜１Ｃからの少なくともＮ個の付加的バイオマーカーを含み、ここで、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０である。

他の例示的態様において、発現サインは全ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２、ＰＬＡＵならびに表１Ａおよび表１Ｂに挙げられたバイオマーカーまたはこれらの組み合わせの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％を含む。

発現サインを使用する新規検査サンプル分類
上記のような、発現サインを使用して新規検査サンプルを分類するために、癌組織におけるバイオマーカーの相対的発現レベルを測定して、検査サンプル発現プロファイルを作成する。ある例示的態様において、検査サンプル発現プロファイルを化合物決定スコア(“発現スコア”)の形で要約し、患者データのトレーニングセットから数学的に導かれる閾値スコアと比較する。スコア閾値は、処置に対する応答性／非応答性を含むが、これに限定されない、異なる特徴に基づき患者群を別ける。患者トレーニングセットデータは、好ましくは予後、再発の可能性、長期生存、臨床成績、処置応答、診断、癌分類または個別化ゲノミクスプロファイルにより特徴付けされている癌組織サンプルに由来する。患者サンプルからの発現プロファイルおよび対応する決定スコアを、トレーニングセットにおける数学的に導かれるスコア決定閾値の同じ側にある患者サンプルの特徴と相関させ得る。線形分類器スカラー出力の閾値を、トレーニングデータセット内で観察された交差検証下の感受性および特異性の和を最大化するために最適化する。

異なる量の出発物質、抽出および増幅反応の効率変動などに対して補正するために、あるサンプルの全体的発現データを、当業者に知られる方法を使用して正規化する。

一つの態様において、患者組織サンプルのバイオマーカー発現プロファイルを線形分類器で評価する。ここで使用する線形分類器は、個々のバイオマーカー強度の化合物決定スコア(“決定関数”)への加重和を指す。次いで、判定スコアを、サンプルがスコア閾値を超えるか(決定関数正)または超えないか(決定関数負)を示す、感受性および特異性の観点でのある設定値に対応する、定義済みカットオフスコア閾値と比較する。

正規化データで線形分類器を使用して診断または予後コール(例えば治療剤に対する応答性または耐性)を作成するのは、データ領域を分ける、すなわち分類器における全遺伝子の発現値の全ての可能な組み合わせを、分離超平面の手段により２個の互いに素な半分に分ける、効果的手段である。この分割は、例えば治療剤に応答性または耐性を示す患者からの、トレーニングセットの大きなセットで経験的に導かれる。普遍性を損なうことなく、一つを除いて全てのバイオマーカーについてある特定の固定された値のセットを仮定でき、これが、判定が、例えば、治療剤に対する応答性または耐性から変わるところで、この残ったバイオマーカーの閾値を自動的に規定する。この動的閾値を超える発現値は、そうであるならば、治療剤に対する耐性(負の重みを有するバイオマーカーについて)または応答性(正の重みを有するバイオマーカーについて)を示す。この閾値の厳密な値は、分類器内の他の全てのバイオマーカーの実際に測定された発現プロファイルに依存するが、ある特定のバイオマーカーの一般的指標は固定されたままであり、すなわち高値または“相対的過剰発現”は常に応答性(正の重みを有する遺伝子)または耐性(負の重みを有する遺伝子)に貢献する。それゆえに、全体的遺伝子発現分類器の状況において、相対的発現が、ある特定のバイオマーカーの上方制御または下方制御のいずれが治療剤に対する応答性または耐性のいずれの指標であるかを示し得る。

アッセイするバイオマーカーのタイプによって、検査サンプルの発現プロファイルを測定するための多数の適切な方法がある。生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡの測定は、生物学的サンプルにおける対応するタンパク質レベルの検出の代用として使用し得る。それゆえに、ここに記載するバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルのいずれも、適当なＲＮＡの検出により検出できる。遺伝子発現プロファイリングの方法は、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＴ、ｑＰＣＲ、ＮＧＳ、ノーザンブロット、ＳＡＧＥ、質量分析を含むが、これらに限定されない。

ｍＲＮＡ発現レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲと続くｑＰＣＲ)で測定できる。ＲＴ−ＰＣＲを、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを製造するために使用する。ｃＤＮＡをｑＰＣＲアッセイに使用して、ＤＮＡ増幅過程が進行するに連れて蛍光を発するようにし得る。標準曲線との比較により、ｑＰＣＲは、細胞あたりのｍＲＮＡコピー数のような絶対測定を生じ得る。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイおよびＲＴ−ＰＣＲとキャピラリー電気泳動の組み合わせは、全て、サンプルにおけるｍＲＮＡの発現レベルの測定に使用されている。Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004参照。

ｍｉＲＮＡ分子は、非コードであるが、遺伝子発現を制御し得る小ＲＮＡである。ｍＲＮＡ発現レベルの測定に適する方法のいずれも対応するｍｉＲＮＡで使用できる。近年、多くの研究所で、疾患のバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用が研究されている。多くの疾患は、広汎な転写制御が関与し、ｍｉＲＮＡのバイオマーカーとしての役割が発見されたとしても驚きではない。ｍｉＲＮＡ濃度と疾患の関係は、しばしば、タンパク質レベルと疾患の関係よりもはるかに不明であり、ｍｉＲＮＡバイオマーカーの値が実質的に不明であるのは言わずもがなである。当然、疾患の間差次的に発現されるＲＮＡと同様、インビトロ診断製品の開発中に直面する問題は、ｍｉＲＮＡが罹患細胞で生存し、解析のために容易に抽出されるか、またはｍｉＲＮＡが血中または他のマトリックスに遊離され、その場所で測定するのに十分長く生存しなければならないとの要件を含む。タンパク質バイオマーカーも同じような要件を有するが、多くの潜在的タンパク質バイオマーカーが、疾患の間、傍分泌形式で病変部位で意図的に分泌され、機能する。多くの潜在的タンパク質バイオマーカーが、これらのタンパク質が合成される細胞の外側で機能するように設計される。

遺伝子発現を質量分析方法を使用して評価してもよい。質量分析計の種々の配置を使用してバイオマーカー値を検出できる。数タイプの質量分析計が利用可能であるかまたは多様な配置で製造できる。一般に、質量分析計は、次のサンプル注入口、イオン源、質量分析器、検出器、真空系および装置制御系およびデータ系の主な部品を有する。サンプル注入口、イオン源および質量分析器の差により、一般に装置のタイプおよびその性能が規定される。例えば、注入口はキャピラリーカラム液体クロマトグラフィー源であっても、マトリックス支援レーザー脱離に使用されるような直接プローブまたはステージであってもよい。一般的イオン源は、例えば、ナノスプレーおよびマイクロスプレーを含むエレクトロスプレーまたはマトリックス支援レーザー脱離である。一般的質量分析器は、四重極質量フィルタ、イオントラップ質量分析器および飛行時間型質量分析器を含む。さらなる質量分析方法は当分野で周知である(Burlingame et al., Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter and Sherman, New York (2000)参照)。

タンパク質バイオマーカーおよびバイオマーカー値を、次のエレクトロスプレーイオン化質量分析(ＥＳＩ−ＭＳ)、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／(ＭＳ)ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ)、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析(ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ)、シリコン上の脱離／イオン化(ＤＩＯＳ)、二次イオン質量分析(ＳＩＭＳ)、四重極飛行時間型(Ｑ−ＴＯＦ)、ultraflex III TOF/TOFと呼ばれるタンデム飛行時間型(ＴＯＦ／ＴＯＦ)テクノロジー、大気圧化学イオン化質量分析(ＡＰＣＩ−ＭＳ)、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−(ＭＳ).ｓｕｐ.Ｎ、大気圧光イオン化質量分析(ＡＰＰＩ−ＭＳ)、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳおよびＡＰＰＩ−(ＭＳ).ｓｕｐ.Ｎ、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析(ＦＴＭＳ)、定量的質量分析およびイオントラップ質量分析のいずれかを使用して検出および測定できる。

サンプル調製戦略を使用して、タンパク質バイオマーカーのマススペクトル特徴付けおよびバイオマーカー値の決定前に、サンプルを標識および濃縮できる。標識方法は、相対的および絶対的定量のための等圧性タグ(ｉＴＲＡＱ)および細胞培養物におけるアミノ酸での安定同位体標識(ＳＩＬＡＣ)を含むが、これらに限定されない。マススペクトル解析前に候補バイオマーカータンパク質についてサンプルを選択的に濃縮するのに使用する捕捉剤はアプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、小分子、Ｆ(ａｂ’)_２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替抗体骨格(例えば二重特異性抗体等)刷り込みポリマー、アビマー、ペプチド模倣剤、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体および合成受容体ならびにこれらの修飾物およびフラグメントを含むが、これらに限定されない。

前記アッセイは、癌治療剤の応答性を予測する方法において有用であるバイオマーカー値の検出を可能にし、該方法は、個体からの生物学的サンプルにおいて、各々表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂに示すバイオマーカーからなる群から選択されるまたはグループＩおよびIIからなる群から選択されるバイオマーカーに対応する少なくともＮ個のバイオマーカー値を検出し、下に詳述するバイオマーカー値を使用する分類は、該個体が治療剤に応答性であるか否かを示す。記載した予測的バイオマーカーのいくつかは、治療剤に対する応答性の予測に単独で有用であるが、２個以上のバイオマーカーのパネルとして各々有用であるバイオマーカーの複数のサブセットのグループ分けの方法もここに記載する。それゆえに、本発明の多様な態様はＮ個のバイオマーカーを含む組み合わせを提供しここで、Ｎは少なくとも３個のバイオマーカーである。当然であるが、Ｎは上記範囲、ならびに類似の、しかし高次の範囲のいずれかから選択される任意の数である。ここに記載する方法のいずれかによって、バイオマーカー値を個々に検出および分類しても、例えば多重アッセイ形式におけるように、集合的に検出し、分類してもよい。

ｂ)マイクロアレイ方法
一つの態様において、本発明は、“オリゴヌクレオチドアレイ”(ここでは“マイクロアレイ”とも呼ぶ)を利用する。マイクロアレイを、細胞におけるバイオマーカーの発現の解析に、特に癌組織のバイオマーカーの発現の測定に使用できる。

一つの態様において、バイオマーカーアレイを、細胞に存在するｍＲＮＡ転写物を表す検出可能に標識されたポリヌクレオチド(例えば、全細胞ｍＲＮＡから合成した蛍光標識ｃＤＮＡまたは標識ｃＲＮＡ)をマイクロアレイにハイブリダイズすることにより調製する。マイクロアレイは、細胞または生物のゲノムにおける多くの遺伝子、好ましくは遺伝子の大部分またはほとんど全ての産物のための結合(例えば、ハイブリダイゼーション)部位の秩序配列を有する表面である。マイクロアレイは当分野で知られる多くの方法で製造できる。どのように製造しても、マイクロアレイは、一定の特徴を共有する。アレイは再現性があり、あるアレイの複数コピーの製造と互いの容易な比較を可能にする。好ましくは、マイクロアレイは小さく、通常５cm^２より小さく、結合(例えば、核酸ハイブリダイゼーション)条件下で安定な物質から製造される。マイクロアレイにおけるある結合部位または独特の結合部位のセットは、細胞における単一遺伝子の産物と特異的に結合する。具体的態様において、各位置に既知配列の装着核酸を含む位置的にアドレス可能なアレイを使用する。

当然であるが、細胞のＲＮＡと相補的なｃＤＮＡを製造し、適切なハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイにハイブリダイズするとき、特定の何らかの遺伝子に対応するアレイの部位へのハイブリダイゼーションレベルは、その遺伝子／バイオマーカーから転写されたｍＲＮＡの細胞内の普及を反映する。例えば、全細胞ｍＲＮＡに相補的な検出可能に標識された(例えば、フルオロフォアで)ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズするとき、細胞において転写されていない遺伝子に対応するアレイ上の部位(すなわち、遺伝子の産物と特異的に結合できる)のシグナル(例えば、蛍光シグナル)はわずかであるか、シグナルはなく、コード化ｍＲＮＡが普及している遺伝子は、相対的に強いシグナルを有する。核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を、プローブが特異的アレイ部位に“特異的に結合”または“特異的にハイブリダイズ”するように選択し、すなわち、プローブは、相補性核酸配列を有する配列アレイ部位とハイブリダイズ、二本鎖化または結合するが、非相補性核酸配列の部位とはハイブリダイズしない。ここで使用する一つのポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドの短い方が２５塩基以下であるとき、標準塩基対形成法則を使用してミスマッチがないか、ポリヌクレオチドの短い方が２５塩基より長いならば、ミスマッチが５％を超えないとき、他と相補性と見なす。好ましくは、ポリヌクレオチドは完全に相補性(ミスマッチなし)である。特異的ハイブリダイゼーション条件は、日常的な実験を使用して陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを実施することにより、特異的ハイブリダイゼーションを生じることが証明できる。

最適ハイブリダイゼーション条件は、標識プローブおよび固定化ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ(例えば、オリゴマー対２００塩基より大きいポリヌクレオチド)およびタイプ(例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ)による。核酸のための特異的(すなわち、ストリンジェント)ハイブリダイゼーション条件の一般的パラメータは、Sambrook et al., supraおよびAusubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing and Wiley-interscience, NY (1987)に記載れ、これを、その全体を全ての目的のために本明細書に包含させる。ｃＤＮＡマイクロアレイを使用するとき、典型的ハイブリダイゼーション条件は、０.２％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中、６５℃で４時間のハイブリダイゼーションと、２５℃で低ストリンジェンシー洗浄緩衝液(０.２％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ)、続いて１０分、２５℃で高ストリンジェンシー洗浄緩衝液(０.２％ＳＤＳを含む０.１ＳＳＣ)での洗浄である(ｓShena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, p. 10614 (1996)参照)。有用なハイブリダイゼーション条件はまた、例えば、Tijessen, “Hybridization With Nucleic Acid Probes”, Elsevier Science Publishers B.V. (1993)およびKricka, “Nonisotopic DNA Probe Techniques”, Academic Press, San Diego, Calif. (1992)に提供される。

ｃ)免疫アッセイ方法
免疫アッセイ方法は、抗体とその対応する標的または検体の反応に基づき、具体的なアッセイ形式によってサンプル中の検体を検出できる。免疫反応性に基づくアッセイ方法の特異性および感受性を改善するために、特異的エピトープ認識のためにモノクローナル抗体がしばしば使用される。ポリクローナル抗体もまた、モノクローナル抗体免疫アッセイと比較した標的に対する高い親和性が広範な生物学的サンプルマトリックスで使用するために設計されているため、多様な免疫アッセイで使用され、成功している。免疫アッセイ形式は定性的、半定量的および定量的結果を提供するために設計されている。

定量的結果は、濃度が知られる検出する特異的検体で作成した標準曲線の使用を介して生成してよい。未知サンプルからの応答またはシグナルを標準曲線にプロットし、未知サンプル中の標的に対応する量または値を確立する。

多くの免疫アッセイ形式が設計されている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、検体／バイオマーカーの検出について定量的であり得る。この方法は、検体または抗体のいずれかへの標識の結合に依存し、標識成分は、直接的であれ、間接的であれ、酵素である。ＥＬＩＳ検査は、検体の直接、間接、競合またはサンドイッチ検出のための形でよい。他の方法は、例えば、放射性同位体(Ｉ^１２５)または蛍光のような標識に依存する。さらなる技術は例えば、凝集、比濁分析、比濁法、ウェスタンブロット、免疫沈殿、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ルミネックスアッセイおよびその他を含む(ImmunoAssay: A Practical Guide, edited by Brian Law, published by Taylor & Francis, Ltd., 2005 edition参照)。

アッセイ形式の例は、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、放射免疫アッセイ、蛍光、化学発光および蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)または時間分解ＦＲＥＴ(ＴＲ−ＦＲＥＴ)免疫アッセイを含む。バイオマーカーの検出方法の例は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面電気クロマトグラフィーなどのようなサイズおよびペプチドレベルの区別を可能にする、バイオマーカー免疫沈殿と続く定量的方法を含む。

検出可能標識またはシグナル発生物質を検出および／または定量する方法は標識の性質による。適当な酵素(検出可能標識は酵素である；上記参照)により触媒される反応産物は、蛍光、ルミネセンスまたは放射性であるかまたは可視光または紫外線を吸収し得るものであるが、これらに限定されない。このような検出可能標識の検出に適する検出器の例は、Ｘ線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、ルミノメーターおよび濃度計を含むが、これらに限定されない。

検出のためのあらゆる方法を、反応物のあらゆる適切な調製、処理および解析を可能にするあらゆる形式で実施できる。これは、例えば、多ウェルアッセイプレート(例えば、９６ウェルまたは３８４ウェル)中または任意の適切なアレイまたはマイクロアレイの使用であり得る。多様な試薬の原液を手動でまたはロボット制御で製造し、その後のピペット操作、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベート、サンプル読み出し、データ収集および解析の全てを、市販の解析ソフトウェア、ロボット工学および検出可能標識の検出可能な検出器具類を使用してロボット制御で実施できる。

キット
ここに記載する方法を実施するための試薬、ツールおよび／または指示をキットで提供できる。例えば、キットは、癌患者の適当な治療を決定するための試薬、ツールおよび指示を含み得る。このようなキットは、生検によるような患者から組織サンプルを採取するための試薬および該組織を処理するための試薬を含む。キットはまた、患者のサンプルにおける遺伝子または遺伝子産物マーカーの発現レベルを決定するための核酸増幅(例えばＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ)、配列決定(例えば次世代配列決定)、ノーザンブロット、プロテオミクス解析または免疫組織化学のための試薬のような、遺伝子または遺伝子産物発現分析を実施するための１個以上の試薬を含む。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを実施するためのプライマー、ノーザンブロット分析を実施するためのプローブおよび／またはウェスタンブロット、免疫組織化学およびＥＬＩＳＡ分析のようなプロテオミクス分析を実施するための抗体をこのようなキットに入れてよい。アッセイのための適当な緩衝液も入れることができる。これらのアッセイに必要なあらゆる検出試薬も入れてよい。適当な試薬および方法を下にさらに詳述する。キットは、表２Ａおよび／または２Ｂおよび／または２Ｃにおけるバイオマーカーの少なくとも１個(最大全て)の発現レベルを検出するための適切なプライマーおよび／またはプローブを含み得る。発現をタンパク質レベルで測定するならば、キットは目的のタンパク質に特異的な結合試薬を含み得る。結合試薬は、その全てのフラグメントおよび誘導体を含むために、抗体を含み得る。本発明の多様な態様の文脈において、用語“抗体”は、関係のあるタンパク質に対する特異的結合親和性を有する全ての免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子(例として、限定せずに、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、これらの組み合わせおよびあらゆる脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギおよびマウスのような哺乳動物において免疫応答中に生じる類似分子)を含む。本発明の多様な態様において有用な具体的免疫グロブリンはＩｇＧアイソタイプを含む。本発明の多様な態様において有用な抗体は、本来はモノクローナルでもポリクローナルでもよいが、典型的にモノクローナル抗体である。抗体はヒト抗体、非ヒト抗体または非ヒト抗体のヒト化バージョンまたはキメラ抗体であり得る。抗体のヒト化のための種々の技術は十分確立されており、任意の適切な技術を用いてよい。用語“抗体”はまた、少なくとも抗原のエピトープを特異的に認識し、結合する軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペチドリガンドも指し、これは、関係のあるタンパク質と特異的に結合する能力を維持する限り、全ての抗体誘導体およびフラグメントまで拡大される。これらの誘導体およびフラグメントはＦａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ’)_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆｃフラグメントなどを含み得る。用語抗体は、重鎖および軽鎖の両者からなる抗体だけでなく、重鎖(のみ)抗体(これは、多様な軟骨魚類種またはラクダ科の動物に由来し得る)を含む。具体的態様において、抗体を、１個を超えるタンパク質に特異的であるように、例えばここに示す２個の標的タンパク質への結合をを可能にするために二特異的であるように操作し得る(表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ参照)。

ある態様において、キットはまた、検査により応答性と予測されたときには投与する特定の抗血管新生治療剤も含み得る。この薬剤は、特定の処置のためにあつらえた投与形態のような形態で提供され得る。キットは、適当な処置レジメンに従う投与のための適切な指示を備える。

ここで考慮するキットは、遺伝子または遺伝子産物発現を測定するためのアッセイをどのように行うかを記載した指示書も含み得る。指示書はまた、対照コホートにおける遺伝子または遺伝子産物マーカーの発現レベルをどのように測定するかおよび検査する患者との比較のための対照を確立するためにどのように発現データをアセンブルするかを含み、対照コホートをどのように決定するかの指示も含み得る。指示書はまた検査する患者における遺伝子または遺伝子産物発現のアッセイおよび対照コホートにおける発現と該発現レベルし、その後検査した患者のための適当な化学療法を決定するための指示も含み得る。適当な化学療法を決定する方法は上に記載され、指示書に詳細に記載できる。

キットに含まれる情報資料は、ここに記載する方法および／またはここに記載する方法のための試薬の使用と関係する、説明的資料、指示的資料、マーケティング資料または他の物質であり得る。例えば、キットの情報資料は、キット使用者が遺伝子発現解析の実施および、特に、特定の治療剤に対してヒトが陽性応答を有する可能性に応用されるときの結果の解釈に関する実質的な情報が得られる場所である、問い合わせ先情報、例えば、医師の住所、メールアドレス、ウェブサイトまたは電話番号を含んでよい。

ここで考慮するキットはまた、遺伝子産物マーカー発現から、患者が特定の治療剤に対して陽性応答を有する可能性を推測するために必要なソフトウェアも含んでよい。

治療剤
上記のとおり、ここに記載する方法は、腫瘍内の血管新生過程およびシグナル伝達を標的とする治療剤に対して応答性または非応答性であるとして患者を分類することを可能にする。癌の処置に使用される現在のこのような治療剤の一部は、次の多標的経路阻害剤(ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ／ＦＧＦ／ＥＧＦＴ／ＦＬＴ−３／ｃ−ｋｉｔ)を含むＶＥＧＦ経路標的治療剤、アンギオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管新生阻害剤、免疫調節剤である薬剤を含むが、これらに限定されない。ＶＥＧＦ特異的阻害剤は、ベバシズマブ(アバスチン)、アフリバーセプト(VEGF Trap)、IMC-1121B(ラムシルマブ)を含むが、これらに限定されない。多標的経路阻害剤は、イマチニブ(グリベック)、ソラフェニブ(ネクサバール)、ゲフィチニブ(イレッサ)、スニチニブ(スーテント)、エルロチニブ、チボザニブ、セディラニブ(Recentin)、パゾパニブ(ヴォトリエント)、BIBF 1120(バルガテフ)、ドビチニブ、セマクサニブ(Sugen)、アクシチニブ(AG013736)、バンデタニブ(ザクティマ)、ニロチニブ(タシグナ)、ダサチニブ(スプリセル)、バタラニブ、モテサニブ、ABT-869、TKI-258を含むが、これらに限定されない。アンギオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤は、AMG-386、PF-4856884 CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、トラスツマブ(ハーセプチン)を含むが、これらに限定されない。内在性血管新生阻害剤は、トロンボスポンジン、エンドスタチン、タムスタチン、カンスタチン、アレスチン、アンジオスタチン、バソスタチン、インターフェロンアルファを含むが、これらに限定されない。免疫調節剤は、サリドマイドおよびレナリドマイドを含むが、これらに限定されない。

本発明を、次の番号付けした項を参照してさらに定義する。
１. 対象の抗血管新生治療剤に対する応答性を予測する方法であって、
該対象から得た罹患組織の検査サンプルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを測定してサンプル発現スコアを決定し、ここで、該バイオマーカーは発現サインにより規定され；
サンプル発現スコアと閾値発現スコアを比較し；そして
サンプル発現スコアが閾値発現スコアより上であるか下であるかに基づき、対象を応答性または非応答性として分類することを含む、方法。

２. 罹患組織が癌組織である、項１に記載の方法。

３. 癌が卵巣癌、神経膠芽腫、肺癌、結腸癌、前立腺癌または乳癌である、項２に記載の方法。

４. サンプル発現値を各バイオマーカーについて発現レベルを測定することにより決定し、これを対応する重みで乗算し、ここで、各バイオマーカーについての重みを発現サインにより決定する、項１〜３のいずれかに記載の方法。

５. 発現サインを、
罹患組織のサンプルセットから全ＲＮＡを単離し；
単離した全ＲＮＡをマイクロアレイとハイブリダイズさせてサンプル発現データセットを得て；
規定の有意性閾値を超える可変性を有するマイクロアレイ上のプローブを選択して予備的バイオマーカーセットを形成し；
クラスタリングアルゴリズムを使用して類似の発現プロファイルを有する予備的バイオマーカーセット内のバイオマーカーのクラスターを生成し；
各バイオマーカーのクラスターについて生物学的過程または生物学的経路を同定し；
目的の生物学的過程または生物学的経路に対応するクラスターを選択し；そして
監督または無監督トレーニングアルゴリズムを使用して罹患組織のサンプルセットにおける選択したクラスターにおけるバイオマーカーの発現レベルを解析することにより発現サインを規定する
ことを含む方法により導く、項４に記載の方法。

６. マイクロアレイが、検査サンプルセットからＲＮＡ転写物を単離し、配列決定し、単離ＲＮＡ転写物配列を既知ＲＮＡ転写物配列に対して交差検証することにより検査サンプルセットで発現されることが検証されたＲＮＡ転写物に結合するプローブセットを含むトランスクリプトームアレイであり、ここで、該検査サンプルセットが患者検査サンプルと同じ組織を含む、項５に記載の方法。

７. プローブセットが各ＲＮＡ転写物の３’末端の３００個以内のヌクレオチドと結合するプローブを含む、項６に記載の方法。

８. コードおよび非コード転写物を含むＲＮＡ転写物が、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、選択的スプライシングされたｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ(ｒＲＮＡ)、トランスファーＲＮＡ(ｔＲＮＡ)、核内低分子ＲＮＡ(ｓｎＲＮＡ)、ミクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)およびアンチセンスＲＮＡを含む、項５〜７のいずれかに記載の方法。

９. 発現サインをＰＬＳ分類器、ＳＶＭ分類器、ＳＤＡ分類器またはＤＳＤＡ分類器を使用して規定する、項５〜８のいずれかに記載の方法。

１０. 発現サインをＰＬＳ分類器を使用して規定する、項９に記載の方法。

１１. 発現サインが表１Ａ、表１Ｂまたは表２Ｃからの２個以上の遺伝子を含む、項１〜１０のいずれかに記載の方法。

１２. 発現サインが表２Ａ、表２Ｂまたは表２Ｃからの２個以上の遺伝子を含む、項１〜１０のいずれかに記載の方法。

１３. 発現サインがＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３、ＶＣＡＮを含む、項１〜１０のいずれかに記載の方法。

１４. 発現サインがＣＣＤＣ８０、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２およびＭＭＰ２を含む、項１〜１０のいずれかに記載の方法。

１５. 発現サインがＴＭＥＭ２００Ａ、ＧＪＢ２、ＭＭＰ１３、ＧＦＰＴ２およびＰＯＳＴＮを含む、項１〜１０のいずれかに記載の方法。

１６. 発現サインがＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＳＣＬ１７およびＳＬＣ５Ａ１を含む、項１〜１０のいずれかに記載の方法。

１７. 発現サインが表２Ａに挙げられた遺伝子を含む、項１〜１０のいずれかに記載の方法。

１８. 発現サインが表２Ｂに挙げられた遺伝子を含む、項１〜１０のいずれかに記載の方法。

１９. 発現サインが表２Ｃに挙げられた遺伝子を含む、項１〜１０のいずれかに記載の方法。

２０. 発現サインがＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２およびＰＬＡＵを含む、項１〜１０のいずれかに記載の方法。

２１. 抗血管新生治療剤がＶＥＧＦ経路標的治療剤、アンギオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管新生阻害剤および免疫調節剤である、項１〜２０のいずれかに記載の方法。

２２. ＶＥＧＦ経路標的治療剤がベバシズマブ(アバスチン)、アフリバーセプト(VEGF Trap)、IMC-1121B(ラムシルマブ)、イマチニブ(グリベック)、ソラフェニブ(ネクサバール)、ゲフィチニブ(イレッサ)、スニチニブ(スーテント)、エルロチニブ、チボザニブ、セディラニブ(Recentin)、パゾパニブ(ヴォトリエント)、BIBF 1120(バルガテフ)、ドビチニブ、セマクサニブ(Sugen)、アクシチニブ(AG013736)、バンデタニブ(ザクティマ)、ニロチニブ(タシグナ)、ダサチニブ(スプリセル)、バタラニブ、モテサニブ、ABT-869、TKI-258またはこれらの組み合わせを含む、項２１に記載の方法。

２３. アンギオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤がAMG-386、PF-4856884 CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、トラスツマブ(ハーセプチン)またはこれらの組み合わせを含む、項２１に記載の方法。

２４. 内在性血管新生阻害剤がトロンボスポンジン、エンドスタチン、タムスタチン、カンスタチン、アレスチン、アンジオスタチン、バソスタチン、インターフェロンアルファまたはこれらの組み合わせを含む、項２１に記載の方法。

２５. 免疫調節剤がサリドマイドおよびレナリドマイドまたはこれらの組み合わせを含む、項２１に記載の方法。

２６. 癌を有するまたは癌を発症する素因のある対象を抗血管新生治療剤に応答性であるとして診断する方法であって、
該対象から得た罹患組織の検査サンプルにおけるバイオマーカーの発現レベルを測定してサンプル発現スコアを決定し、ここで、該バイオマーカーは発現サインにより規定され；
サンプル発現値と閾値スコアを比較し；そして
該対象を、発現スコアが閾値スコアより上であるか下であるかに基づき、対象を応答性または非応答性として分類することを含む、方法。

２７. 癌が卵巣癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌または神経膠芽腫である、項２６に記載の方法。

２８. 対照発現値を各バイオマーカーについての発現値を計算し、それを対応する重みで乗算することにより決定し、ここで、各バイオマーカーの重みを発現サインにより決定する、項２６または２７に記載の方法。

２９. 発現サインを
罹患組織のサンプルセットから全ＲＮＡを単離し；
単離した全ＲＮＡをマイクロアレイとハイブリダイズさせて発現値のセットを得て；
規定の有意性閾値を超える可変性を有するマイクロアレイ上のプローブを選択して、予備的バイオマーカーセットを形成し；
クラスタリングアルゴリズムを使用して、類似の遺伝子発現プロファイルを有する予備的バイオマーカー内のバイオマーカーのクラスターを産生し；
各バイオマーカーのクラスターについて生物学的過程または生物学的経路を同定し；
目的の生物学的過程または生物学的経路に対応するクラスターを選択し；そして
監督または無監督トレーニングアルゴリズムを使用して、癌組織のサンプルセットにおける選択したクラスターのバイオマーカーの発現レベルを解析することにより発現サインを導くことを含む方法により導き、ここで、該発現値はバイオマーカーのセット、各バイオマーカーの対応する重みおよび対照発現値を規定する、項２６に記載の方法。

３０. マイクロアレイが癌組織からのＲＮＡ転写物の単離および配列決定および既知ＲＮＡ転写物配列に対する単離ＲＮＡ転写物配列の交差検証により、癌組織のサンプルセットで発現されることが検証されているＲＮＡ転写物に結合するプローブセットを含むトランスクリプトームアレイである、項２９に記載の方法。

３１. プローブセットが各ＲＮＡ転写物の３’末端の３００個以内のヌクレオチドと結合するプローブを含む、項３０に記載の方法。

３２. コードおよび非コード転写物を含むＲＮＡ転写物が、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、選択的スプライシングされたｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ(ｒＲＮＡ)、トランスファーＲＮＡ(ｔＲＮＡ)、核内低分子ＲＮＡ(ｓｎＲＮＡ)、ミクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)およびアンチセンスＲＮＡを含む、項２９〜３１のいずれかに記載の方法。

３３. 発現サインをＰＬＳ分類器、ＳＶＭ分類器、ＳＤＡ分類器またはＤＳＤＡ分類器を使用して規定する、項２７〜３２のいずれかに記載の方法。

３４. 発現サインをＰＬＳ分類器を使用して規定する、項３３に記載の方法。

３５. 発現サインが表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃからの２個以上の遺伝子を含む、項２６〜３４のいずれかに記載の方法。

３６. 発現サインが表２Ａ、表２Ｂまたは表２Ｃからの２個以上の遺伝子を含む、項２６〜３４のいずれかに記載の方法。

３７. 発現サインがＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３、ＶＣＡＮを含む、項２６〜３４のいずれかに記載の方法。

３８. 発現サインがＣＣＤＣ８０、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２、ＭＭＰ２を含む、項２６〜３４のいずれかに記載の方法。

３９. 発現サインがＴＭＥＭ２００Ａ、ＧＪＢ２、ＭＭＰ１３、ＧＦＰＴ２およびＰＯＳＴＮを含む、項２６〜３４のいずれかに記載の方法。

４０. 発現サインがＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＳＣＬ１７およびＳＬＣ５Ａ１を含む、項２６〜３４のいずれかに記載の方法。

４１. 発現サインが表２Ａに挙げられた遺伝子を含む、項２６〜３４のいずれかに記載の方法。

４２. 発現サインが表２Ｂに挙げられた遺伝子を含む、項２６〜３４のいずれかに記載の方法。

４３. 発現サインが表２Ｃに挙げられた遺伝子を含む、項２６〜３４のいずれかに記載の方法。

４４. 発現サインがＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２およびＰＬＡＵを含む、項２６〜３４のいずれかに記載の方法。

４５. 抗血管新生剤がＶＥＧＦ経路標的治療剤、アンギオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管新生阻害剤および免疫調節剤である、項２６〜４４のいずれかに記載の方法。

４６. ＶＥＧＦ経路標的治療剤がベバシズマブ(アバスチン)、アフリバーセプト(VEGF Trap)、IMC-1121B(ラムシルマブ)、イマチニブ(グリベック)、ソラフェニブ(ネクサバール)、ゲフィチニブ(イレッサ)、スニチニブ(スーテント)、エルロチニブ、チボザニブ、セディラニブ(Recentin)、パゾパニブ(ヴォトリエント)、BIBF 1120(バルガテフ)、ドビチニブ、セマクサニブ(Sugen)、アクシチニブ(AG013736)、バンデタニブ(ザクティマ)、ニロチニブ(タシグナ)、ダサチニブ(スプリセル)、バタラニブ、モテサニブ、ABT-869およびTKI-258を含む、項４５に記載の方法。

４７. アンギオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤がAMG-386、PF-4856884 CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、トラスツマブ(ハーセプチン)を含む、項４５に記載の方法。

４８. 内在性血管新生阻害剤がトロンボスポンジン、エンドスタチン、タムスタチン、カンスタチン、アレスチン、アンジオスタチン、バソスタチン、インターフェロンアルファを含む、項４５に記載の方法。

４９. 免疫調節剤がサリドマイドおよびレナリドマイドを含む、項４５に記載の方法。

５０. 癌を有する対象の予後を決定する方法であって、
該対象から得た罹患組織の検査サンプルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを測定してサンプル発現スコアを決定し、ここで、該バイオマーカーは発現サインにより規定され；
サンプル発現スコアと閾値発現スコアを比較し；そして
サンプル発現スコアが閾値発現スコアより上であるか下であるかに基づき、対象を応答性または非応答性として分類することを含む、方法。

４７. 罹患組織が癌組織である、項４６に記載の方法。

４８. 癌が卵巣癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、神経膠芽腫または乳癌である、項４７に記載の方法。

４９. サンプル発現値を各バイオマーカーの発現レベルを測定し、それを対応する重みで乗算することにより決定し、ここで、各バイオマーカーについての各重みを発現サインにより決定する、項４６〜４８のいずれかに記載の方法。

５０. 発現サインを
罹患組織のサンプルセットから全ＲＮＡを単離し；
単離した全ＲＮＡをマイクロアレイとハイブリダイズさせてサンプル発現データセットを得て；
規定の有意性閾値を超える可変性を有するマイクロアレイ上のプローブを選択して予備的バイオマーカーセットを形成し；
クラスタリングアルゴリズムを使用して類似の発現プロファイルを有する予備的バイオマーカーセット内のバイオマーカーのクラスターを生成し；
各バイオマーカーのクラスターについて生物学的過程または生物学的経路を同定し；
目的の生物学的過程または生物学的経路に対応するクラスターを選択し；そして
監督または無監督トレーニングアルゴリズムを使用して罹患組織のサンプルセットにおける選択したクラスターにおけるバイオマーカーの発現レベルを解析することにより発現サインを規定することを含む方法により導く、項４９に記載の方法。

５１. マイクロアレイが、検査サンプルセットからＲＮＡ転写物を単離し、配列決定し、単離ＲＮＡ転写物配列を既知ＲＮＡ転写物配列に対して交差検証することにより検査サンプルセットで発現されることが検証されたＲＮＡ転写物に結合するプローブセットを含むトランスクリプトームアレイであり、ここで、該検査サンプルセットが患者検査サンプルと同じ組織を含む、項５０に記載の方法。

５２. プローブセットが各ＲＮＡ転写物の３’末端の３００個以内のヌクレオチドと結合するプローブを含む、項５１に記載の方法。

５３. コードおよび非コード転写物を含むＲＮＡ転写物が、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、選択的スプライシングされたｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ(ｒＲＮＡ)、トランスファーＲＮＡ(ｔＲＮＡ)、核内低分子ＲＮＡ(ｓｎＲＮＡ)、ミクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)およびアンチセンスＲＮＡを含む、項５０〜５７のいずれかに記載の方法。

５４. 発現サインをＰＬＳ分類器、ＳＶＭ分類器、ＳＤＡ分類器またはＤＳＤＡ分類器を使用して規定する、項５０〜５３のいずれかに記載の方法。

５５. 発現サインをＰＬＳ分類器を使用して規定する、項４６〜５４のいずれかに記載の方法。

５６. 項発現サインが表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃからの２個以上の遺伝子を含む、４６〜５５のいずれかに記載の方法。

５７. 発現サインが表２Ａ、表２Ｂまたは表２Ｃからの２個以上の遺伝子を含む、項４６〜５５のいずれかに記載の方法。

５８. 発現サインがＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３、ＶＣＡＮを含む、項４６〜５５のいずれかに記載の方法。

５９. 発現サインがＣＣＤＣ８０、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２およびＭＭＰ２を含む、項４６〜５５のいずれかに記載の方法。

６０. 発現サインがＴＭＥＭ２００Ａ、ＧＪＢ２、ＭＭＰ１３、ＧＦＰＴ２およびＰＯＳＴＮを含む、項４６〜５５のいずれかに記載の方法。

６１. 発現サインがＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＳＣＬ１７およびＳＬＣ５Ａ１を含む、項４６〜５５のいずれかに記載の方法。

６２. 発現サインが表２Ａに挙げられた遺伝子を含む、項４６〜５５のいずれかに記載の方法。

６３. 発現サインが表２Ｂに挙げられた遺伝子を含む、項４６〜５５のいずれかに記載の方法。

６４. 発現サインが表２Ｃに挙げられた遺伝子を含む、項４６〜５５のいずれかに記載の方法。

６５. 発現サインがＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２およびＰＬＡＵを含む、項４６〜５５のいずれかに記載の方法。

６６. 癌を有する対象についての処置方針を決定する方法であって、
該対象から得た罹患組織の検査サンプルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを測定して、非血管新生発現サインを使用してサンプル発現スコアを決定し、ここで、バイオマーカーは発現サインにより規定し、
非血管新生サインからのサンプル発現スコアを閾値スコアと比較することにより対象の予後を決定し、ここで、閾値スコアより大きいサンプル発現スコアは予後良好を示し、閾値スコアより低いサンプル発現スコアは予後不良を示し；
該対象から得た罹患組織の検査サンプルにおける１個以上のバイオマーカーの発現レベルを測定して、血管新生発現サインを使用してサンプル発現スコアを決定し、ここで、バイオマーカーは血管新生発現サインにより規定し；
対象の治療剤に対する応答性をサンプル発現スコアと閾値スコアの比較により決定することを含み、ここで、閾値より大きいサンプル発現スコアは治療剤に対して応答性であることを示し、閾値より低いサンプル発現スコアは治療剤に対して非応答性であることを示す、方法。

６７. 非血管新生サインが表２Ｃに挙げられる２個以上のバイオマーカーを含む、項６６に記載の方法。

６８. 非血管新生サインが表２Ｃに挙げるバイオマーカーからなる、項６６に記載の方法。

６９. 血管新生サインが表２Ａ、表２Ｂまたはこれらの組み合わせに挙げる２個以上のバイオマーカーを含む、項６６に記載の方法。

７０.
７１. 血管新生サインが表１Ａに挙げるバイオマーカーからなる、項６６に記載の方法。

７２. 血管新生サインが表１Ｂに挙げるバイオマーカーからなる、項６６に記載の方法。

７３. 癌が卵巣癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌または神経膠芽腫である、項６６に記載の方法。

７４. 治療剤が抗血管新生治療剤である、項６６に記載の方法。

７５. 抗血管新生治療剤がＶＥＧＦ経路標的治療剤、アンギオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管新生阻害剤および免疫調節剤である、項７４に記載の方法。

７６. ＶＥＧＦ経路標的治療剤がベバシズマブ(アバスチン)、アフリバーセプト(VEGF Trap)、IMC-1121B(ラムシルマブ)、イマチニブ(グリベック)、ソラフェニブ(ネクサバール)、ゲフィチニブ(イレッサ)、スニチニブ(スーテント)、エルロチニブ、チボザニブ、セディラニブ(Recentin)、パゾパニブ(ヴォトリエント)、BIBF 1120(バルガテフ)、ドビチニブ、セマクサニブ(Sugen)、アクシチニブ(AG013736)、バンデタニブ(ザクティマ)、ニロチニブ(タシグナ)、ダサチニブ(スプリセル)、バタラニブ、モテサニブ、ABT-869、TKI-258またはこれらの組み合わせを含む、項７５に記載の方法。

７７. アンギオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤がAMG-386、PF-4856884 CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、トラスツマブ(ハーセプチン)またはこれらの組み合わせを含む、項７５に記載の方法。

７８. 内在性血管新生阻害剤がトロンボスポンジン、エンドスタチン、タムスタチン、カンスタチン、アレスチン、アンジオスタチン、バソスタチン、インターフェロンアルファまたはこれらの組み合わせを含む、項７５に記載の方法。

７９. 免疫調節剤がサリドマイドおよびレナリドマイドまたはこれらの組み合わせを含む、項７５に記載の方法。

誤解を避けるために、本発明の範囲を添付する特許請求の範囲により規定する。

本発明をさらに次の実施例により説明するが、これは、決してそれに範囲を限定するものとして解釈してはならない。むしろ、本記載を熟読後に、本発明の精神および／または添付する特許請求の範囲から逸脱することなく当業者に示唆され得る、多様な他の態様、修飾および同等物を本手段は有し得ることを明確に理解すべきである。

実施例１：組織プロセシング、階層的クラスタリング、サブタイプ同定および分類器構築
腫瘍材料
発現サイン例を、NHS LothianおよびUniversity of Edinburghから調達したマクロダイセクションした上皮性漿液性卵巣腫瘍ＦＦＰＥ組織サンプルのコホートの遺伝子発現解析から同定した。

漿液性、類内膜、明細胞および粘液性組織像を規定するための上皮性卵巣癌の組織学的分類のためのプロトコルは最近改訂されている。この結果の一つは、以前は類内膜として分類されていたであろう多くの腫瘍が現在漿液性と分類されることである(McCluggage, W.G. “Morphological subtypes of ovarian carcinoma: a review with emphasis on new developments and pathogenesis,” PATHOLOGY 2011 Aug;43(5):420-32)。本研究で使用した漿液性サンプルは、１９８４年〜２００６年に採取された全組織像の上皮性卵巣癌サンプルの大きなセット全体であった。組織学的状態を割り当てるための病理学を、病理学者が採取時に各センターで実施した。２０１２年３月から４月にかけて、これらの上皮性卵巣サンプルの３５７個を２名の無関係な顧問医師である卵巣癌病理学者が、改訂されたプロトコルに従い組織学的分類について再調査した。これにより、表３に示すとおりこれらのサンプルのいくつかが再分類された。

下に同定した元の３個の漿液性サブタイプ、および結果的に下の実施例(図１)に記載する２５個の遺伝子サイン(表２Ａ)は、元の病理学者の報告により漿液性として分類された１９９個のサンプルから同定された。バイオインフォマティクス解析を、同様に最新の病理分類方法を使用してステージIIIおよびIV高悪性度漿液性卵巣癌として分類された２７７個のサンプルでも同様に行った。この解析は、図６に詳述する改訂された漿液性サブグループを同定し、結果的に４５個の遺伝子“血管新生”サイン(表２Ｂ)および６３個の遺伝子“非血管新生”サイン(表２Ｃ)の規定に使用した。

ＦＦＰＥからの遺伝子発現プロファイリング
全ＲＮＡを、マクロダイセクションしたＦＦＰＥ組織から、High Pure RNA Paraffin Kit(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を使用して抽出した。ＲＮＡを相補性デオキシリボ核酸(ｃＤＮＡ)に変換し、これを続いてWT-Ovation^TM FFPE RNA Amplification System V2(NuGEN Technologies Inc., San Carlos, CA, USA)のＳＰＩＡ(登録商標)テクノロジーを使用して増幅し、一本鎖に変換した。増幅した一本鎖ｃＤＮＡを次いで断片化し、FL-Ovation^TM cDNA Biotin Module V2(NuGEN Technologies Inc.)を使用してビオチン標識した。断片化し、標識したｃＤＮＡを、次いでAlmac Ovarian Cancer DSA^TMとハイブリダイズさせた。AlmacのOvarian Cancer DSA^TMリサーチツールはＦＦＰＥ組織サンプルの解析のために最適化されており、価値ある保存された組織バンクの使用を可能とする。Almac Ovarian Cancer DSA^TMリサーチツールは、正常および癌性の両者の卵巣組織のトランスクリプトームを表す革新的マイクロアレイプラットフォームである。結果的に、Ovarian Cancer DSA^TMは、一般的マイクロアレイプラットフォームでは利用不可能な、卵巣疾患および組織設定内のトランスクリプトームの包括的提示を提供する。アレイを、Affymentrix Genechip(登録商標) Scanner 7G(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA)を使用して走査した。

データ準備
プロファイルしたサンプルの品質管理(ＱＣ)を、ＭＡＳ５処理アルゴリズムを使用して実施した。平均ノイズおよびバックグラウンド均一性、現コールのパーセンテージ(アレイ品質)、シグナル品質、ＲＮＡ品質およびハイブリダイゼーション品質の種々の技術的側面に対処した。対応するパラメータの分布および中央絶対偏差を解析し、潜在的外れ値の同定のために使用した。

AlmacのOvarian Cancer DSA^TMは、３’末端から３００個以内のヌクレオチドの領域を一次標的とするプローブを含む。それゆえに標準Affymetrix ＲＮＡ品質尺度を適用した − ハウスキーピング遺伝子に関しては、通常の３’／５’比に加えて、３’末端プローブセット強度対平均バックグラウンド強度の比と共に３’末端プローブセットの強度を使用した。ハイブリダイゼーション対照を確認して、それらの強度および現コールがAffymetrixにより特定された要求に一致することを確実にした。

上皮性漿液性卵巣癌トレーニングセットの発現プロファイリングから作成された生データの前処理を、ロバストマルチアレイ解析(ＲＭＡ)を用いてExpression Console v1.1で実施した。

階層的クラスタリングおよび機能分析
ａ. 階層的クラスタリング解析
階層的クラスタリング技術を、Ovarian Cancer DSA^TM(疾患特異的アレイ)プラットフォームを使用して解析した上皮性漿液性卵巣腫瘍からのマイクロアレイデータに適用した。生発現データを、標準的ロバストマルチチップアルゴリズム(ＲＭＡ)手順を使用して処理した。データセット内の非生物学的体系的分散を同定し、除いた。発現レベルが腫瘍毎に有意に変化するプローブセットを同定した。これらのプローブセットは内因性リストを形成した。

二次元クラスター解析(腫瘍、プローブセット)を実施して、内因性リストに基づき腫瘍相関を確立した。階層的凝縮型クラスタリングを適用した(ピアソン相関係数 − 当初の解析 − またはユークリッド距離 − 最新の解析 − およびウォードの連結)。最適分割数を、ＧＡＰ指数を使用して選択した(Tibshirani et al., 2002, J. R. Stat. Soc., 63:411-423)。クラスターサブグループで利用可能な全プローブセットを遺伝子名に対してマッピングした。

ｂ. 遺伝子クラスターの機能分析
プローブセットクラスターの機能的有意性を確立するために、プローブセットを遺伝子(Entrez gene ID)に対してマッピングし、濃縮分析を実施した。濃縮有意性を超幾何関数に基づき計算した(偽陽性率適用(Benjamini and Hochberg, 1995, J. R. Stat. Soc. 57:289:300))。生物学的過程および経路の過剰提示を、Almac Diagnosticsの独自開発機能的濃縮ツール(ＦＥＴ)を使用して、上皮性漿液性卵巣癌サンプルに対する階層的クラスタリングにより作成した各遺伝子群について分析した。アンチセンスプローブセットを本分析から除外した。超幾何ｐ値を、各濃縮機能エンティティクラスについて評価した。最高ｐ値の機能エンティティクラスを群の代表として選択し、これらの機能エンティティを表す一般機能カテゴリーを、表現の有意性(すなわちｐ値)に基づき、遺伝子クラスターに割り当てた。

元の１９９個の上皮性漿液性卵巣腫瘍を使用する血管新生分類器を作成するために、血管新生、脈管構造構築および免疫応答一般機能項について濃縮したクラスターにおける遺伝子を、推定血管新生遺伝子群に群分けし、サイン作成に使用した。血管新生、脈管構造構築および免疫応答一般機能項に関する遺伝子が高発現であるサンプルクラスターを、分類のために選択し、‘血管新生’と標識した。これらの機能的項に関与する遺伝子の高発現を示さないものは、‘非血管新生’として標識した。

再分類された２６５個の上皮性漿液性卵巣腫瘍を使用して血管新生分類器を作成するために、血管新生および脈管構造構築一般機能項について濃縮されたクラスターにおける遺伝子を推定血管新生遺伝子群に群分けし、サイン作成に使用した。血管新生および脈管構造構築一般機能項に関与する遺伝子について高発現であるサンプルクラスターを分類のために選択し、‘血管新生’として標識した。これらの機能的項に関与する遺伝子の高発現を示さないものは、‘その他’として標識した(図６の上部の標識は“血管新生”サンプル(赤色)に加えて“その他”(灰色)を示す)。

再分類された２６５個の上皮性漿液性卵巣腫瘍を使用して“非血管新生分類器”を作成するために、血管新生および脈管構造構築一般機能項に関与する遺伝子について低発現であるサンプルクラスターを分類のために選択し、“非血管新生”として標識した。これらの機能的項に関与する遺伝子の低発現を示さないものは、‘その他’として標識した(図６の下部の標識は、“非血管新生”サンプルに加えて“その他”を示す)。

遺伝子レベルでの分類器構築
複数のアレイプラットフォームにまたがる分類器の検証を促進するために、血管新生分類器を、遺伝子レベルで作成した。下記工程は、遺伝子レベルサイン構築のために使用した手順の概略である(各々の工程は、５倍交差検証の１０反復を使用する内部交差検証を使用して実施した)。
遺伝子レベルサイン構築
■ 前処理：
○ ＲＭＡバックグラウンド補正。
○ 遺伝子の対照セットは、卵巣ＤＳＡプラットフォームに独特の遺伝子(センスプローブセットのみ)である。
○ 遺伝子レベル要約を、最初にプローブ対プローブセット要約を、プローブセット中のプローブの中央発現の計算により実施し、次に、対照分布における各遺伝子に対してマッピングした(センスのみ)プローブセットの中央発現を計算して、“遺伝子レベル”発現マトリックスを得る２工程で実施した。
○ 分位点正規化を完全遺伝子発現データマトリックス上で実施し、トレーニングデータから得た対照分位点を交差検証の各ラウンド内の検査サンプルの正規化に使用した。
■ 特性選択：遺伝子の７５％をｃＤＮＡ濃度に対する分散、強度および相関によりフィルタリングし、ＣＡＴスコアに基づき再帰的特性消去(ＲＦＥ)またはフィルタ特性選択(ＦＦＳ)。
■ 分類アルゴリズム：部分最小二乗法(ＰＬＳ)、ＳＤＡ(縮小判別解析)およびＤＳＤＡ(ダイヤゴナルＳＤＡ)。

モデル選択
モデル選択に使用する基準は、内部交差検証および特性消去に対するＡＵＣおよび／またはハザード比(ＨＲ)である。ＦＥＴを使用した交差検証についてのサインの機能的濃縮は、遺伝子オントロジー、反復サンプルのためのサインスコアの標準偏差が交差検証および特性消去について評価された２セットの技術的な複製を含んだ暫定的検証セットおよび交差検証に対する臨床的因子と技術的因子の独立性の評価に基づく(表４に記載する因子)。

部分群(すなわちクラス標識)誘導を、サイン構築に使用したのと同じサンプルコホートからのマイクロアレイ発現を使用して実施したため、ＡＵＣに基づく何らかの性能推定値の予想される正のバイアスがあったことは注意すべきである。これは、ハザード比、機能的濃縮および臨床的因子と技術的因子の独立性の評価のような付加的基準を含めることにより、モデル選択のために使用した基準の拡張の重要性を強調する。

データセット検証のための分類器スコアのクラスタリング
全データセットを、ＲＭＡを使用してバックグラウンド補正した。各検証セットにつおて、アンチセンスプローブセット(該当するならば)を除いて分類器遺伝子に対してマッピングしたプローブセットを決定した。Affymetrix Plus 2.0およびＵ１３３ＡアレイのアノテーションはAffymetrixウェブサイトから入手可能である。分類器における各遺伝子に対してマッピングした全プローブにわたる中央強度を計算し、トレーニングセットからの分位点正規化モデルを、試験サンプルを一つずつ正規化するために適用し、遺伝子強度マトリックスをもたらした。次いで、分類器をこのデータマトリックスに適用して、各サンプルについての分類器スコア／予測を作成した。

単変量解析および多変量解析
単変量解析および多変量解析を神経膠芽腫データセットにカンして行い、それぞれ、血管新生サブタイプ分類器と生存の関連性、もしあれば、該関連性が既知臨床的予測因子と無関係であるかの決定をし得る。単変量解析のｐ値を、ＭＡＴＬＡＢにおけるロジスティック回帰を使用して計算した。多変量解析について、我々は、ロジスティック回帰からの尤度比検定を使用し、ここでは、ｐ値は、臨床的共変量および予測を有するモデルと、臨床的共変量のみを有する縮小モデルを比較したときの対数尤度の低下を表す。尤度比検定は、生存のモデリングにおける遺伝子予測因子の重要性を測定し、臨床的予測因子に対する予測因子の独立性を強調する。単変量解析および多変量解析の両者で、ｐ値＜０.０５を有意性の基準として使用した。さらに、未知臨床的因子を有するサンプルをこの評価から除外した。

結果
サブグループの同定ならびに元のおよび改訂した組織学的分類からのサインの作成
階層的クラスタリング解析
特性選択により、元の上皮性漿液性卵巣癌データセット(１９９個のサンプル)から１２００個のおよび再分類された上皮性漿液性卵巣癌データセット(２６５個のサンプル)から１４００個のプローブセットが選択された。ＧＡＰ解析は、両サンプルセット内の３個のサンプルクラスターおよび３個のプローブセットクラスター群を確認した(図１、図６)。

‘血管新生’または‘非血管新生’サンプル群への腫瘍の分類
‘血管新生’または‘非血管新生’としてのサンプル分類は、上皮性漿液性卵巣癌データセットの機能分析の結果に基づいた(図１、図６)。この研究の目標は、トランスクリプトームレベルで、病原性細胞の抗血管新生剤に対する応答性または耐性を決定でき、おそらく、抗血管新生治療により利益を受ける患者を同定できるであろう、遺伝子のセットの特徴付けである。この点を考慮して、この生物学を最も良く示した上皮性漿液性卵巣癌データセット内のサンプルを選択し、分類器作成のために残りのサンプルと比較した(次章参照)。元の上皮性漿液性卵巣癌サンプルセット(１９９個のサンプル)(図１)内のサンプル血管新生クラスターからのサンプルが、これらのサンプルが機能分析により定義されるとおり血管新生および免疫応答過程および経路と関係するシグナル伝達に含まれる遺伝子の上方制御を示したため、この選択に最も関係のあるサンプルであったと決定された(図２Ａおよび２Ｂ)。再分類された上皮性漿液性卵巣癌サンプルセット(２６５個のサンプル)(図６)内の３個のサンプルクラスターからのサンプルが、これらのサンプルが機能分析により定義されるとおり血管新生過程および経路と関係するシグナル伝達に含まれる遺伝子の上方制御を示したため、この選択と最も関係のあるサンプルであったと決定された(図２Ａおよび２Ｂ)。

再分類された上皮性漿液性卵巣癌サンプルセット(２６５個のサンプル)(図６)内のサンプルクラスターからのサンプルが、これらのサンプルが機能分析により定義されるとおり血管新生過程および経路と関係するシグナル伝達に含まれる遺伝子の下方制御を示したため、“非血管新生”部分群を代表する選択のために最も関係のあるサンプルであったと決定された(図２Ａおよび２Ｂ)。

同一の階層的クラスタリング手法を１０５個の乳癌サンプルに適用した。乳癌の優性生物学はＥＲ状態であり、それゆえにサンプルにおける生物学の構造を同定するために、このコホートを、クラスター解析のために２個の集団に分けた。我々は血管新生および脈管構造構築サブタイプ(図１１Ａおよび１１Ｂ)を同定し、乳癌サンプルからの血管新生サブタイプの外位置性(expositing)を証明する。

血管新生サブタイプ分類器モデルの構築および検証
参照を容易にするために、次の工程は、表１Ａまたは表１Ｂ由来音発現サインを参照して詳述する。推定‘血管新生’部分群を形成する腫瘍クラスの同定に続き、これらの腫瘍の機能的‘血管新生’(血管新生、脈管構造構築、免疫応答)遺伝子リスト(表１Ａまたは表１Ｂ)に関する腫瘍コホートにおける全てのその他に対するコンピューターによる分類を実施して、‘血管新生’サブタイプを分類する精密な遺伝子分類モデルを同定した。

分類パイプラインを使用して、上皮性漿液性卵巣癌サンプルのセットを使用するモデルを導いた。分類パイプラインは、一般に受け入れられている優良実践に従い開発されている(MAQC Consortium, Nat Biotechnol 2010)。本工程は、平行して、１)経験的データからの遺伝子分類モデルの誘導；および２)モデルの分類性能評価であり、いずれも交差検証下である。性能および分類器作成の成功は、変えることができるパラメータの数、例えば分類方法またはプローブセットフィルタリングの選択による。これを考慮に入れて、(ｉ)７５％分散／強度フィルタリングを用いる完全特性リスト(血管新生遺伝子リスト、表１Ａの強制的包含を伴う)および(ii)血管新生遺伝子リストのみの２個の特性セットを評価し、３個の分類アルゴリズム、すなわちＰＬＳ、ＳＤＡおよびＤＳＤＡを評価した。(ｉ)各反復での最低ランクの特性の分数を消去し、最小数の特性しか残らなくなたっときに停止する反復性手順である再帰的特性消去(ＲＦＥ)、(ii)相関調整ｔスコア(ＣＡＴ−スコア)(対照)に基づき特性を前ランク付けし、各特性消去ラウンドで最低ランキング特性を消去するフィルタ特性選択(ＦＦＳ)の２個の特性消去方法を適用した。受信動作特性曲線の曲線下面積(ＡＵＣ)を、この指標がデータにおける群間のカットオフおよび有病率に依存しないため、分類性能の評価に使用した。これはまた分類性能の選択のための認識された測定値である。そのようなものとして、各モデルについての最良の特性の数を交差検証下に平均ＡＵＣに基づき選択した。

上記解析から、ＰＬＳ ＦＦＳモデルが最も適切な分類器モデルであると見なされた。ＰＬＳ回帰を使用して各遺伝子について重みを計算し、最終遺伝子分類器モデルをもたらし(元の手法について２５個の遺伝子分類器モデルおよび標準組織学プロトコルにカンする最近の変更を反映して再分類したサンプルについて４５個の遺伝子分類器)、これを、異なるアレイプラットフォームからの外部データセット上での検証に使用できた。遺伝子サイン構築過程は、構築したサインのいずれかの生物学的関連性を確実にするための血管新生と関係のあるオントロジーの(ontological)過程および経路の同定に焦点を絞った。そのようなものとして、機能分析を両サインで行い、血管新生および関連過程へのそれらの関連性を定量した。図３および図８における有意性過程は血管新生および脈管構造構築に関する。

実施例２：血管新生サブタイプおよび血管新生分類器モデルのインシリコ検証
２５個の遺伝子(元の手法)および４５個の遺伝子(再分類手法)血管新生分類器モデルの両者の性能を、元のAlmac上皮性漿液性卵巣癌データセットおよび２個の無関係のデータセットでＲＯＣ(受信者動作特性)曲線下面積(ＡＵＣ)により検証した。ＡＵＣは、観察された疾患スケールに対して計算された統計値であり、分類器モデルを使用する表現型予測の有効性の指標である(Wray et al., PLoS Genetics Vol 6, 1-9)。０.５のＡＵＣは典型的ランダム分類器であり、１.０のＡＵＣは、群間の完全な分離を表す。それゆえに、血管新生サブタイプ分類器モデルが、単剤または標準治療剤との組み合わせとしての抗血管新生卵巣癌治療剤群に対する応答を予測し、患者を選択できるかを決定するために、これらのデータセット内の適用後のＡＵＣが０.５を超え、最低信頼区間も０.５を超えるべきであることが仮説立てられる。

独立的前立腺癌細胞株データセットへの本分類器モデルの適用
２５個の遺伝子および４５個の遺伝子の分類器モデルの予測力を評価するために、ダサチニブでの処置後の１６個の前立腺細胞株のデータセットにこれらを適用した。細胞株は、細胞増殖アッセイに基づき‘応答者’または‘非応答者’と規定された。この解析は、２５個の遺伝子分類器モデルはダサチニブに対する応答と相関し、０.８３６４のＡＵＣ(ＣＩ＝０.５２５５〜１.００００)であることを確認し、２５個の遺伝子分類器がダサチニブに対する応答に予測的であることを示した。本解析は、４５個の遺伝子分類器モデルが同化合物に対する応答と相関し、０.９４５５のＡＵＣ(ＣＩ＝０.７９４９〜１.００００)であることを確認し、４５個の遺伝子分類器もダサチニブに対する応答に予測的であることを示した。

実施例３：卵巣癌の“非血管新生”部分群の同定およびインシリコ検証
腫瘍の‘非血管新生’サンプル群への分類
プローブセットクラスター２における血管新生遺伝子の発現は、新たに漿液性と分類された２６５個のサンプルの階層的クラスタリングのサンプルクラスター１における全サンプルで下方制御される(図６下部標識青色棒))。サンプルクラスター２におけるこれらのサンプルは、図１０に示されるとおり、クラスター１および３の併合群からのサンプルにおける漿液性サンプルの残りよりも予後が良好である。これは、この群が、表１Ｂに同定される血管新生遺伝子の発現の下方制御により同定されることを示す。血管新生に関与する遺伝子が下方制御された患者、すなわちこの部分群を“非血管新生”群と呼ぶ。この表現型はまた図１１Ａの中央サンプル群および図１１Ｂにおける第二のサンプル群で見られるとおり、ＥＲ^＋およびＥＲ⁻乳癌でも同定されている。

非血管新生サブタイプ分類器モデルの構築および検証
推定‘非血管新生’部分群を形成する、新たに漿液性と分類された２６５個のサンプル内の腫瘍クラスの同定に続き、機能的‘血管新生’(血管新生、脈管構造構築、免疫応答)遺伝子リスト(表１Ａまたは表１Ｂ)を参照した腫瘍コホートにおけるこれらの腫瘍対その他全てのコンピューターによる分類を行い、‘非血管新生’サブタイプを分類する精密な遺伝子分類モデルを同定した。

分類パイプラインを使用して、上皮性漿液性卵巣癌サンプルのセットで使用したモデルを導いた。方法は上の実施例１に記載したものに準じる。

実施例１に記載した解析を適用して、ＰＬＳ ＦＦＳモデルは最も適切な分類器モデルであると見なされた。ＰＬＳ回帰を使用して重みを各遺伝子に対して計算し、最終遺伝子分類器モデル(６３個の遺伝子分類器モデル)をもたらし、これは、異なるアレイプラットフォームからの外部データセットでの検証に使用できる。

発見データおよび独立したマイクロアレイデータセットへの非血管新生分類器モデルの適用
６３個の遺伝子非血管新生分類器モデルの性能を、元のAlmac上皮性漿液性卵巣癌データセットおよび１個の独立的データセット内のハザード比(ＨＲ)を使用して検証した。ハザード比は、２セットの説明変数により記載される条件に対応するハザード比の比率である。例えば、処置集団は、対照集団に比して、単位時間あたり２倍の速度で死亡し得る。ハザード比が２であるならば、処置による死亡の高いハザードを示す。それゆえに、非血管新生サブタイプ分類器モデルが、単剤としてまたは標準治療剤との組み合わせでの抗血管新生癌治療剤群に非応答であり、処置すべきでない患者を予測できるかを決定するために、ＨＲは１.０より低く、ｐ値が０.０５未満でなければならないことが期待される。

６３個の遺伝子分類器モデルの予後予測力を評価するために、最初に２６５個の上皮性漿液性卵巣サンプルの発見データに適用し、次に２７５個の上皮性漿液性および類内膜卵巣サンプルのデータセットに適用した(１４)。両データセット内で、サンプルを、前に治療を受けていない患者からの最初の外科的摘出の時点で採った。

この解析は、６３個の遺伝子分類器モデルが両卵巣癌データセットにおいて予後と独立的に関係することを確認した。発見セットの中で、非血管新生群は他のサンプルと比較して優位に良好な生存と相関した(図１２)；ハザード比＝０.４８４２、ｐ＝１.３０７ｅ−０５)。同様に独立的マイクロアレイデータセットにおいて、非血管新生群は、他のサンプルと比較して有意に良好な生存を示した(図１３)ハザード比＝０.６２[０.４１−０.９５]、ｐ＝０.０２９およびＯＳ(多変数解析；ＨＲ＝０.３２[０.１９−０.５４]、ｐ＝０.００００１。これは、６３個の遺伝子分類器が卵巣漿液性および類内膜癌サンプルの生存の独立的予後バイオマーカーであるとの事実を検証する。

International Collaboration on Ovarian Neoplasms 7(ＩＣＯＮ７)治験は、原発性腹膜癌、ファロピウス管癌および上皮性卵巣癌を有する患者における、カルボプラチンおよびパクリタキセルでの標準化学療法と、同時におよび継続として、ベバシズマブを追加した効果を評価する婦人科癌群間第３相治験である(Perren TJ, Swart AM, Pfisterer J, Ledermann JA, Pujade-Lauraine E, Kristensen G, et al. A phase 3 trial of bevacizumab in ovarian cancer. N Engl J Med. 365(26): 2484-96, Aghajanian C, Blank SV, Goff BA, Judson PL, Teneriello MG, Husain A, et al. OCEANS: A randomized, double-blind, placebo-controlled phase III trial of chemotherapy with or without bevacizumab in patients with platinum-sensitive recurrent epithelial ovarian, primary peritoneal, or fallopian tube cancer. Journal of Clinical Oncology. 2012; 30(17): 2039-45)。

患者特徴、無進行生存、毒性および予備的全生存データおよびクオリティ・オブ・ライブ(ＱｏＬ)データの要約はＩＣＯＮ７から報告されている。標準化学療法群において、７６４名のうち６９６名(９１％)の女性が、プロトコルにより１８週の化学療法を受けた。ベバシズマブ群において、７６４名のうち７１９名(９４％)の女性が１８週の化学療法およびベバシズマブを受け、４７２名(６２％)が５４週のプロトコル終了までベバシズマブを続けた。標準化学療法およびベバシズマブに関する無進行生存のハザード比は０.８１(９５％ＣＩ＝０.７０〜０.９４、ｐ＝０.００４)であった。減量手術後、残留疾患が１.０cmを超える世界産婦人科連合(ＦＩＧＯ)ステージIV疾患またはステージIII疾患と規定された進行のリスクが最高の患者において、ベバシズマブ群における死亡のハザード比は０.６４(９５％ＣＩ＝０.４８〜０.８５；ｐ＝０.００２)であった。

医学研究審議会(ＭＲＣ)を介してＩＣＯＮ７治験サンプルへのアクセスをした。公正な仲介者がＭＲＣからの関係する臨床的データを保持した。サンプルをプロファイリングするための無作為化ストラテジーは、臨床的因子に基づき成されていた。全試薬、アレイおよび対照サンプルは予め検査し、品質基準を通過していた。

全ＲＮＡを、High Pure RNA Paraffin Kit(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を使用してマクロダイセクションしたＦＦＰＥ組織から抽出した。ＲＮＡを相補性デオキシリボ核酸(ｃＤＮＡ)に変換し、これを続いてWT-Ovation^TM FFPE RNA Amplification System V2(NuGEN Technologies Inc., San Carlos, CA, USA)のＳＰＩＡ(登録商標)テクノロジーを使用して増幅し、一本鎖に変換した。増幅した一本鎖ｃＤＮＡを次いで断片化し、FL-Ovation^TM cDNA Biotin Module V2(NuGEN Technologies Inc.)を使用してビオチン標識した。断片化し、標識したｃＤＮＡを、次にサインを構築すべきAlmac Ovarian Cancer DSAとハイブリダイズした。アレイをAffymentrix Genechip(登録商標) Scanner 7G(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA)を使用して走査する。

対照ＵＨＲおよび保存臨床的対照サンプルを、各ＲＮＡ抽出後バッチにおいて処理する。ＱＣを、ＲＮＡ抽出ＱＣ対アレイＱＣからの処理の数工程で実施する。

プロファイルしたサンプルの品質管理(ＱＣ)をＲＭＡ前処理アルゴリズムを使用して行う。平均ノイズおよびバックグラウンド均一性、現コールのパーセンテージ(アレイ品質)、シグナル品質、ＲＮＡ品質およびハイブリダイゼーション品質の多様な技術的側面を評価する。対応するパラメータの分布および中央絶対偏差を解析し、潜在的外れ値の同定のために使用した。

AlmacのOvarian Cancer DSA^TMは、３’末端から３００個以内のヌクレオチドの領域を一次標的とするプローブを含む。それゆえに標準Affymetrix ＲＮＡ品質尺度を適用した − ハウスキーピング遺伝子に関しては、通常の３’／５’比に加えて、３’末端プローブセット強度対平均バックグラウンド強度の比と共に３’末端プローブセットの強度を使用した。ハイブリダイゼーション対照を確認して、それらの強度および現コールがAffymetrixにより特定された要求に一致することを確実にした。

ＱＣ基準を通過したサンプルはその後の解析に入れるのに適すると見なされ、サインスコアは、次のものを使用して計算される(サンプルあたり)。
−バックグラウンド補正
−データを前処理するためのＲｅｆＲＭＡモデル、一度に１サンプル
−サインスコアをサインにおける遺伝子の発現の加重和として計算する。
〔式中、ｗ_ｉは各遺伝子の重みであり、ｂ_ｉは遺伝子特異的バイアスであり(追加的表Ｓ５)、ｇｅ_ｉは前処理後の観察された遺伝子発現レベルであり、ｋ＝０.２９５３は一定オフセットである。〕

サンプルＩＤおよび対応するサインスコアを公正な仲介者に送り、本治験の処理アームにおけるアバスチンに対する耐性を予測する卵巣免疫サインの予測的性能を評価する。

発見データおよび独立したマイクロアレイデータセットへの血管新生分類器モデルの適用
クラスラベルを、血管新生関連遺伝子の発現に基づきサンプルに割り当て、２５個および４５個の遺伝子発現サインを構築して、高悪性度漿液性(ＨＧＳ)癌の血管新生促進分子部分群を同定した。

血管新生は癌成長および転移過程の中心であり、卵巣癌の進行および予後に役割を有する。ＶＥＧＦは正常細胞および新生物細胞により産生される血管新生の重要なプロモーターである。ベバシズマブ(アバスチン、Riche)は、マウス抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体の組み換えヒト化型であり、多くの腫瘍の管理について研究されている。International Collaboration on Ovarian Neoplasms 7(ＩＣＯＮ７)治験は、原発性腹膜癌、ファロピウス管癌および上皮性卵巣癌を有する患者における、カルボプラチンおよびパクリタキセルでの標準化学療法と、同時におよび継続として、ベバシズマブを追加した効果を評価する婦人科癌群間第３相治験である(Perren TJ, Swart AM, Pfisterer J, Ledermann JA, Pujade-Lauraine E, Kristensen G, et al. A phase 3 trial of bevacizumab in ovarian cancer. N Engl J Med. 365(26): 2484-96, Aghajanian C, Blank SV, Goff BA, Judson PL, Teneriello MG, Husain A, et al. OCEANS: A randomized, double-blind, placebo-controlled phase III trial of chemotherapy with or without bevacizumab in patients with platinum-sensitive recurrent epithelial ovarian, primary peritoneal, or fallopian tube cancer. Journal of Clinical Oncology. 2012; 30(17): 2039-45)。

患者特徴、無進行生存、毒性および予備的全生存データおよびクオリティ・オブ・ライブ(ＱｏＬ)データの要約はＩＣＯＮ７から報告されている。標準化学療法群において、７６４名のうち６９６名(９１％)の女性が、プロトコルにより１８週の化学療法を受けた。ベバシズマブ群において、７６４名のうち７１９名(９４％)の女性が１８週の化学療法およびベバシズマブを受け、４７２名(６２％)が５４週のプロトコル終了までベバシズマブを続けた。標準化学療法およびベバシズマブに関する無進行生存のハザード比は０８１(９５％ＣＩ＝０.７０〜０.９４、ｐ＝０.００４)。減量手術後、残留疾患が１.０cmを超える世界産婦人科連合(ＦＩＧＯ)ステージIV疾患またはステージIII疾患と規定された進行のリスクが最高の患者において、ベバシズマブ群における死亡のハザード比は０６４(９５％ＣＩ＝０.４８〜０.８５；ｐ＝０.００２)。

血管新生部分群のＨＧＳ患者は、抗血管新生標的治療により利益を受け得る。ＭＲＣを介してＩＣＯＮ７治験サンプルにアクセスし、この仮説を検証するために卵巣ＤＳＡにプロファイルされる。

ＩＣＯＮ７治験サンプルからのＦＦＰＥ物質のＨ＆Ｅ切片は病理審査され腫瘍含有量の印が付され、腫瘍材料はマクロダイセクションされていた。

公正な仲介者がＭＲＣからの関係する臨床的データを保持した。サンプルプロファイリングのための、臨床的因子に基づく、無作為化ストラテジーも実施されていた。全試薬、アレイおよび対照サンプルは予め検査し、品質基準を通過していた。

全ＲＮＡを、High Pure RNA Paraffin Kit(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を使用してマクロダイセクションしたＦＦＰＥ組織から抽出した。ＲＮＡを相補性デオキシリボ核酸(ｃＤＮＡ)に変換し、これを続いてWT-Ovation^TM FFPE RNA Amplification System V2(NuGEN Technologies Inc., San Carlos, CA, USA)のＳＰＩＡ(登録商標)テクノロジーを使用して増幅し、一本鎖に変換した。増幅した一本鎖ｃＤＮＡを次いで断片化し、FL-Ovation^TM cDNA Biotin Module V2(NuGEN Technologies Inc.)を使用してビオチン標識した。断片化し、標識したｃＤＮＡを、次にサインを構築すべきAlmac Ovarian Cancer DSAとハイブリダイズした。アレイをAffymentrix Genechip(登録商標) Scanner 7G(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA)を使用して走査する。

対照ＵＨＲおよび保存臨床的対照サンプルを、各ＲＮＡ抽出後バッチにおいて処理する。ＱＣを、ＲＮＡ抽出ＱＣ対アレイＱＣから、過程の数工程で実施する。

プロファイルしたサンプルの品質管理(ＱＣ)をＲＭＡ前処理アルゴリズムを使用して行う。平均ノイズおよびバックグラウンド均一性、現コールのパーセンテージ(アレイ品質)、シグナル品質、ＲＮＡ品質およびハイブリダイゼーション品質の多様な技術的側面を評価する。対応するパラメータの分布および中央絶対偏差を解析し、潜在的外れ値の同定のために使用した。

AlmacのOvarian Cancer DSAＴＭは、３’末端から３００個以内のヌクレオチドの領域を一次標的とするプローブを含む。それゆえに標準Affymetrix ＲＮＡ品質尺度を適用した − ハウスキーピング遺伝子に関しては、通常の３’／５’比に加えて、３’末端プローブセット強度対平均バックグラウンド強度の比と共に３’末端プローブセットの強度を使用した。ハイブリダイゼーション対照を確認して、それらの強度および現コールがAffymetrixにより特定された要求に一致することを確実にした。

ＱＣ基準を通過したサンプルはその後の解析に入れるのに適すると見なされ、サインスコアは、次のものを使用して計算される(サンプルあたり)。
バックグラウンド補正
データを前処理するためのＲｅｆＲＭＡモデル、一度に１サンプル
サインスコアをサインにおける遺伝子の発現の加重和として計算する：
〔式中、ｗ_ｉは各遺伝子の重みであり、ｂ_ｉは遺伝子特異的バイアスであり(追加的表Ｓ５)、ｇｅ_ｉは前処理後の観察された遺伝子発現レベルであり、ｋ＝０.２９５３は一定オフセットである。〕

サンプルＩＤおよび対応するサインスコアを公正な仲介者に送り、本治験の処理アームにおけるアバスチンからの利益を予測するための血管新生促進サインの予測的性能を評価する。

３分子サブグループを同定するための分類器モデル組み合わせの適用
二次的エンドポイントとして、複合サイン手法(図１７参照)の解析を評価する。この手法は、良好な生存の群、すなわち、血管新生過程の活性化が低い群と、生存が悪い群の２群を同定するために６３個の遺伝子サインを使用する。４５個の遺伝子サインを悪い生存成績の群に適用して、さらに血管新生過程の活性化が高い群と、血管新生活性化が無関係の群の２群を同定する。血管新生活性が高いと同定された群は、本治験の処置アームでアバスチンに応答するはずであるとの仮説が立てられる。

実施例４：結腸直腸癌における非血管新生サインの予測有用性
プラス２アレイ上の再発性または転移性結腸直腸癌のベバシズマブに対する応答者および非応答者のコホートから得た公的アレイデータセット(E-GEOD-19862)を得て、表２Ｃの６３個の遺伝子サイン例を使用して解析した。６３個の遺伝子卵巣免疫サインは、ＡＵＣ：０.８６(０.６０〜１.００)でベバシズマブに対する応答を予測する。図１４参照。

実施例５：結腸直腸癌における２５個および４５個の血管新生遺伝子サインの予測有用性
プラス２アレイ上の再発性または転移性結腸直腸癌のベバシズマブに対する応答者および非応答者のコホートから得た公的アレイデータセット(E-GEOD-19862)において、２５個遺伝子および４５個の遺伝子血管新生サインのいずれも、ベバシズマブに対する応答を予測する − それぞれ図１８および１９参照。

参考文献
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Claims (27)

1. 対象の抗血管新生治療剤に対する応答性を予測する方法であって、
   対象から検査サンプルを得て；
   該対象から得た検査サンプルからのバイオマーカーパネルの発現レベルを測定し、ここで、該バイオマーカーパネルは表２Ｃから選択される１個以上のバイオマーカーを含み；
   該バイオマーカーパネルのサンプル発現スコアを決定し；
   サンプル発現スコアと閾値スコアを比較し；そして
   該サンプル発現スコアが閾値発現スコアより高いか低いかに基づき、該対象を抗血管新生治療剤に対して応答性または非応答性として分類することを含む、方法。
2. バイオマーカーパネルがＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含む、請求項１に記載の方法。
3. バイオマーカーパネルが表２Ｃに挙げるバイオマーカーを含む、請求項１に記載の方法。
4. サンプル発現スコアを各バイオマーカーの発現レベルを測定し、対応する重みを乗算することにより決定し、ここで、発現サインが各バイオマーカーの重みを規定する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. バイオマーカーパネルにおける各バイオマーカーの発現レベルをマイクロアレイ、定量的ＰＣＲまたは免疫アッセイを使用して測定する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 発現サインを
   罹患組織のサンプルセットから全ＲＮＡを単離し；
   単離した全ＲＮＡをマイクロアレイとハイブリダイズさせてサンプル発現データセットを得て；
   規定の有意性閾値を超える可変性を有するマイクロアレイ上のプローブを選択して予備的バイオマーカーセットを形成し；
   クラスタリングアルゴリズムを使用して類似の発現プロファイルを有する予備的バイオマーカーセット内のバイオマーカーのクラスターを生成し；
   各バイオマーカーのクラスターについて生物学的過程または生物学的経路を同定し；
   目的の生物学的過程または生物学的経路に対応するクラスターを選択し；そして
   罹患組織のサンプルセットにおける選択したクラスターにおけるバイオマーカーの発現レベルを監督または無監督トレーニングアルゴリズムを使用して解析することにより発現サインを規定する
   ことを含む方法により導く、請求項４に記載の方法。
7. 発現サインをＰＬＳ分類器、ＳＶＭ分類器、ＳＤＡ分類器またはＤＳＤＡ分類器を使用して規定する、請求項６に記載の方法。
8. 罹患組織が癌組織である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 癌が卵巣癌、前立腺、乳癌、結腸癌または結腸直腸癌である、請求項８に記載の方法。
10. 抗血管新生治療剤がＶＥＧＦ経路標的治療剤、アンギオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管新生阻害剤または免疫調節剤である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
11. ＶＥＧＦ経路標的治療剤がベバシズマブ(アバスチン)、アフリバーセプト(VEGF Trap)、IMC−1121B(ラムシルマブ)、イマチニブ(グリベック)、ソラフェニブ(ネクサバール)、ゲフィチニブ(イレッサ)、スニチニブ(スーテント)、エルロチニブ、チボザニブ、セディラニブ(Recentin)、パゾパニブ(ヴォトリエント)、BIBF 1120(バルガテフ)、ドビチニブ、セマクサニブ(Sugen)、アクシチニブ(AG013736)、バンデタニブ(ザクティマ)、ニロチニブ(タシグナ)、ダサチニブ(スプリセル)、バタラニブ、モテサニブ、ABT−869、TKI−258またはこれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の方法。
12. アンギオポエチン−ＴＩＥ２経路阻害剤がAMG−386、PF−4856884 CVX−060、CEP−11981、CE−245677、MEDI−3617、CVX−241、トラスツマブ(ハーセプチン)またはこれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の方法。
13. 内在性血管新生阻害剤がトロンボスポンジン、エンドスタチン、タムスタチン、カンスタチン、アレスチン、アンジオスタチン、バソスタチン、インターフェロンアルファまたはこれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の方法。
14. 免疫調節剤がサリドマイドおよびレナリドマイドを含む、請求項１０に記載の方法。
15. 対象の予後を決定することをさらに含み、ここで、抗血管新生治療剤に対する応答性の分類が予後良好を示し、予後良好は抗血管新生治療剤に非応答性との分類と比較して少なくとも予測余命が長いことを示す、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 抗血管新生治療剤に対する対象の応答性を予測し、処置予後を提供する方法であって、
    疾患または障害を有する対象から検査サンプルを得て；
    該対象から得た罹患組織の検査サンプルから第一バイオマーカーパネルの発現レベルを測定し、ここで、該バイオマーカーパネルは表２Ｃから選択される１個以上のバイオマーカーを含み；
    該第一バイオマーカーパネルについて第一サンプル発現スコアを決定し；
    該第一サンプル発現スコアと第一閾値スコアを比較し、
    該第一サンプル発現スコアが該第一閾値スコアより高いか低いかに基づき、対象を予後良好または予後不良と分類し、ここで、予後良好は予後不良と比較して少なくとも予測余命が長いことを示し、予後不良の場合には、該対象から得た罹患組織の検査サンプルから第二バイオマーカーパネルの発現レベルを測定し、ここで、該第二バイオマーカーパネルは表２Ａまたは表２Ｂから選択される１個以上のバイオマーカーを含み；
    該第二バイオマーカーパネルについて第二サンプル発現スコアを決定し；
    該第二サンプル発現スコアと第二閾値スコアを比較し；そして
    第二サンプル発現スコアが第二閾値発現スコアより高いか低いかに基づき、対象を抗血管新生治療剤に対して応答性または非応答性として分類することを含む、方法。
17. 第一バイオマーカーパネルがＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含み、第二バイオマーカーパネルがＣＣＤＣ８０、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２、ＭＭＰ２、ＰＬＡＵ、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＣＯＬ８Ａ１またはＲＡＢ３１の１個以上を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 第一バイオマーカーパネルがＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含み、第二バイオマーカーパネルがＴＭＥＭ２００Ａ、ＧＪＢ２、ＭＭＰ１３、ＧＦＰＴ２、ＰＯＳＴＮ、ＢＩＣＣ１、ＣＤＨ１１、ＭＲＶＩ１、ＰＭＰ２２またはＣＯＬ１１Ａ１の１個以上を含む、請求項１６に記載の方法。
19. 第一バイオマーカーパネルが表２Ｃにおけるバイオマーカーからなり、第二バイオマーカーパネルが表２Ａまたは２Ｂにおけるバイオマーカーからなる、請求項１６に記載の方法。
20. バイオマーカーパネルにおける各バイオマーカーの発現レベルをマイクロアレイ、定量的ＰＣＲまたは免疫アッセイを使用して測定する、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
21. 対象を、抗血管新生治療剤に応答性である癌を有するとしてまたは癌の発症の素因があるとして診断する方法であって、
    癌を有するまたは癌を有する疑いがある対象から検査サンプルを得て；
    該対象から得た検査サンプルからのバイオマーカーパネルの発現レベルを測定し、ここで、該バイオマーカーパネルは表２Ｃから選択される１個以上のバイオマーカーを含み；
    該バイオマーカーパネルのサンプル発現スコアを決定し；
    サンプル発現スコアと閾値スコアを比較し；そして
    サンプル発現スコアが閾値発現スコアより高いか低いかに基づき、対象を、抗血管新生治療に対して応答性である癌を有するまたは癌の発症の素因があるとして診断することを含む、方法。
22. バイオマーカーパネルがＩＧＦ２、ＳＯＸ１１、ＩＮＳ、ＣＸＣＬ１７、ＳＬＣ５Ａ１、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＣＸＣＲ２Ｐ１、ＭＦＡＰ２、ＭＡＴＮ３またはＲＴＰ４の１個以上を含む、請求項２１に記載の方法。
23. バイオマーカーパネルが表２Ｃに挙げるバイオマーカーを含む、請求項２１に記載の方法。
24. サンプル発現スコアを各バイオマーカーの発現レベルを測定し、対応する重みを乗算することにより決定し、ここで、発現サインが各バイオマーカーの重みを規定する、 請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
25. 発現サインをＰＬＳ分類器、ＳＶＭ分類器、ＳＤＡ分類器またはＤＳＤＡ分類器を使用して規定する、請求項２４に記載の方法。
26. 癌が卵巣癌、神経膠芽腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌または結腸癌である、請求項２１〜２５のいずれかに記載の方法。
27. バイオマーカーパネルにおける各バイオマーカーの発現レベルをマイクロアレイ、定量的ＰＣＲまたは免疫アッセイを使用して測定する、請求項２１〜２６のいずれかに記載の方法。