JP2015530119A - 配列決定方法 - Google Patents

Abstract

＊ａ．単一ヌクレオチドを含有する液滴のストリームを生成するステップであって、液滴のストリーム中の単一ヌクレオチドの順序が検体中のヌクレオチドの配列に対応する、ステップ；＊ｂ．各液滴中に複数の生体プローブタイプを導入するステップであって、各タイプが異なる標識を検出不能な状態で備え、異なる単一ヌクレオチドを捕捉するように構成された、ステップ；＊ｃ．液滴中に含有される単一ヌクレオチドをその相補的なプローブに結合させるステップ；および＊ｄ．標識をヌクレオチドに結合したプローブから検出可能な状態に解放させるステップを備える、ポリヌクレオチド検体の配列を決定する方法が開示される。プローブは、蛍光供与体およびクエンチャ標識ならびに単一ヌクレオチドギャップを備えるダンベル形状プローブである。ポリメラーゼおよびリガーゼによるギャップ修復後、制限酵素認識部位は制限酵素により開裂され、その後、エキソヌクレアーゼ消化が行われ、標識が解放される。

Description

本発明は、例えば自然発生のＤＮＡまたはＲＮＡに由来する、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド塩基の配列を決定する方法に関する。

遺伝物質の次世代配列決定は、ますます高速化する配列決定装置の市場参入に伴って配列決定の単価が下落しているように、すでに一般に生物科学、特に医学に顕著な影響を与えている。例えば、我々の係属中の出願、国際公開第２００９／０３０９５３号は、特に一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチド試料（例えば自然発生のＲＮＡまたはＤＮＡ）中のヌクレオチド塩基または塩基対の配列が、ナノ多孔質基板であって、ナノポア内にまたはナノポアの開口部に隣接して並置されたプラズモンナノ構造体を備えるナノ多孔質基板を通して転位させることによって読まれる、新規の高速配列決定装置について開示している。この装置において、プラズモンナノ構造体は、中で（任意で標識された）各ヌクレオチド塩基が順に光子を入射光との相互作用により特徴的に蛍光またはラマン散乱させるように誘導される、検出窓（本質的には電磁場）を画定する。こうして生成された光子は、その後遠隔検出され、多重化され、その情報内容がポリヌクレオチドに関連するヌクレオチド塩基配列に特徴的であるデータストリームに変換される。この配列は、その後、それと一体化したマイクロプロセッサまたはそれに付属した補助計算装置中にプログラムされた対応するソフトウェアにおいて具現化された計算アルゴリズムを用い、データストリームから回収することができる。

ポリヌクレオチドの高速配列決定の別の装置は、例えば、米国特許第６６２７０６７号、第６２６７８７２号および第６７４６５９４号に記載される。そのもっとも単純な形態において、この装置は、プラズモンナノ構造の代わりに電極を用い、基板上またはナノポアの開口部中もしくはその周辺に、検出窓を画定する。次いで、電極に異なる電位が印加され、その間を流動するイオン性媒体の電気特性の変化が、ナノポアを通るポリヌクレオチドおよび関連電解質の電気泳動的転位の結果として、時間の関数で測定される。この装置では、さまざまな個別のヌクレオチド塩基が検出窓を通過する際、それらはこれを連続的に閉塞および開放する「閉塞事象」を引き起こし、電流または抵抗の特徴的な変動をもたらす。これらの変動は、その後、上述したような分析に適したデータストリームを生成するのに用いられる。

安定な液滴ストリーム、特に微小液滴ストリームの生成は、分子生物学においてすでに用途を有するもう１つの技術開発分野である。例えば、米国特許第７７０８９４９号は、安定な油中水滴を生成する新規のマイクロ流体方法を開示し、例えば米国特許出願公開第２０１１／０２５０５９７号は、１つの核酸テンプレート（一般的にはポリヌクレオチドＤＮＡまたはＲＮＡ断片）およびポリメラーゼ鎖反応を用いてテンプレートを増幅させることができる複数のプライマー対を含有する微小液滴を生成するためのこの技術の利用について記載している。この方法および分野に関する他の特許出願として一般的には、米国特許出願公開第２０１０／１８４０２０号、第２０１２／０１６４６３３号、第２０１２／０１２２７１４号、第２０１１／００００５６０号、第２０１０／０１３７６１６３号、第２０１０／００２２４１４号および第２００８／０００３１４２号が挙げられる。Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ １４（３） ２３３−２４６（２０１２）は、先天性筋ジストロフィーに関連する遺伝子変異の同定におけるこの微小液滴ＰＣＲ法の使用について記載している。

国際公開第２００７／１２０２４０号およびＪ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３ ８４３９−８４４７（２０１１）は、それぞれ、パイロシーケンシングを含む、液滴に基づく核酸の特性化の方法について記載している。

同様に、生体プローブは、一般的に既知の配列順序を有する１０００未満のヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドを備え、分析分子生物学において広く知られる。こうしたプローブは、一般的には、プローブのヌクレオチド塩基と標的との間に十分な配列相補性が存在する場合に、標的（例えば、自然発生病原体のＤＮＡに由来するもの）に結合することにより機能する。通常、こうしたプローブのヌクレオチドは、放射性または蛍光マーカーのような検出可能要素で標識され、プローブを用い、中にまたは上に標的が捕捉されていると考えられる検体溶液または基質を処理すると、検出要素の特徴的な検出特性を検索および検出することにより標的の存在または非存在が明らかとなる。

こうしたプローブの１つの種類は、例えば国際公開第０２／０６５３１号または米国特許第８２１１６４４号に記載されるように、当技術分野において「分子ビーコン」として知られる物質に代表される。これらのプローブは、一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、これが実際に折り畳まれて、プローブのセンサーとして作用する残った一本鎖ループと、２つの末端に隣接するヌクレオチドが相補的なヌクレオチド塩基対を介して互いに結合し、これにより二本鎖領域を作り出す短いステムとがもたらされる。この配置は、一本鎖ループが概念的な二本鎖オリゴヌクレオチドの同じ末端の相補鎖に結合しているヘアピンに例えることができ、高度に歪んでいる。（ここでは互いに隣接し、ステムの遠端にある）オリゴヌクレオチドの自由３’および５’末端には、それぞれ、フルオロフォアおよびクエンチャが結合する。それらを互いに幾何学的に近接させることにより、顕著な蛍光が発生しないようにする。使用時において、標的は、一本鎖ループに結合してさらなる歪みをもたらし、プローブが加熱されるとステムが展開し、これによりフルオロフォアおよびクエンチャが離れ、前者を蛍光させる。

そこで、我々は、ポリヌクレオチド試料中のヌクレオチド塩基の配列を決定する新規の方法であって、上述したものとは異なり、試料から誘導され、その順序がそのヌクレオチド塩基対配列に対応する個別の単一ヌクレオチド含有液滴ストリームを、特定の標識された生体プローブで処理した後調査する方法を開発した。一般的には、この処理の結果として、各液滴中に、その中のヌクレオチドに関連する特定のヌクレオチド塩基に特徴的な１つ以上の検出可能要素が生成される。この方法の特徴は、１つまたは一連の検出可能要素をプローブから検出可能な状態に解放する一連の生体化学／酵素反応により特に活性化されない限り、検出可能要素が本質的に検出不能である、新規の生体プローブの使用である。

本発明によると、したがって、
ａ．その少なくともいくつかが単一ヌクレオチドを含有する液滴のストリームを生成するステップであって、前記液滴のストリーム中の単一ヌクレオチドの順序が検体中のヌクレオチドの配列に対応する、ステップ；
ｂ．各液滴中に複数の生体プローブタイプを導入するステップであって、各タイプが（ｉ）異なる検出可能要素を検出不能な状態で備え、（ｉｉ）検体を構成する異なる相補的な単一ヌクレオチドを捕捉するように構成された、ステップ；
ｃ．前記液滴中に含有される単一ヌクレオチドをその相補的なプローブに結合させ、使用済プローブをもたらすステップ；および
ｄ．前記検出可能要素を使用済プローブから検出可能な状態に解放させるステップ
により特徴づけられる、ポリヌクレオチド検体中のヌクレオチド塩基の配列を決定する方法が提供される。

[発明の詳細な説明]
本発明の好適な実施形態において、各生体プローブは、末端が２つの異なる二本鎖オリゴヌクレオチド領域に結合した一本鎖ヌクレオチド領域を備えることを特徴とし、オリゴヌクレオチド領域の少なくとも１つは、特徴的な検出特性を有する検出可能要素を備え、検出可能要素は、オリゴヌクレオチド領域上において、同じ数の検出可能要素が対応する数の単一ヌクレオチドに結合した場合よりも検出可能特性が検出できないように配置される。

１つの好適な実施形態において、検出可能要素は、フルオロフォアを備え、プローブそのものは、フルオロフォアが検出されるように設計された波長において本質的に非蛍光性である。よって、フルオロフォアは、電磁スペクトルの広範部分にわたって一般的な低レベルのバックグラウンド蛍光を示し得るが、一般的には、蛍光の強度が最大である１つまたは少数の特定の波長または波長包絡線がある。フルオロフォアが特徴的に検出されるこれら最大の１つ以上では、蛍光は本質的にまったく発生すべきではない。本発明の文脈では、「本質的に非蛍光性」の語または同等の語は、関連する特徴的な波長または波長包絡線においてプローブに結合した全フルオロフォアの蛍光の強度が、同等数の遊離フルオロフォア蛍光の対応する強度の２５％未満；好適には１０％未満；より好適には１％未満；もっとも好適には０．１％未満であることを意味する。

原理的には、プローブの未使用状態においてフルオロフォアが本質的に非蛍光性であるようにするため、いかなる方法を用いることもできる。１つの方法は、クエンチャを、それに近接して追加で結合させることである。別の方法は、複数のフルオロフォアを互いに近接して同一のプローブに結合させる場合に、前段落に記載した基準をクエンチャの必要なしに達成することができるほど十分に互いをクエンチする傾向があるという観察に基づくものである。本発明のこの文脈では、フルオロフォア間またはフルオロフォアとクエンチャとの間の「近接」を構成するものは用いられる特定のフルオロフォアおよびクエンチャならびに場合によってはオリゴヌクレオチド領域の構造的特徴に応じて決まる。したがって、この語は、プローブ上のいずれかの特定の構造的配置を参照してではなく、求められる結果を参照して解釈されることを意図している。しかしながら、例を提供することのみを目的として、隣接するフルオロフォアまたは隣接するフルオロフォアおよびクエンチャが、特徴的なフェルスター距離に対応する距離（一般的には５ｎｍ未満）だけ離れる場合、十分なクエンチングが達成されることが指摘される。

好適には、プローブを備えるオリゴヌクレオチド領域の少なくとも１つは、最大２０個、好適には最大１０個、もっとも好適には最大５個のフルオロフォアで標識される。最大の利益を得るには、オリゴヌクレオチド領域の少なくとも１つは、少なくとも２つ、好適には少なくとも３つのフルオロフォアで標識されることが好ましい。したがって、本明細書では、これらの最大および最小のいずれかの変更から構成される範囲が具体的に想定される。クエンチャが用いられる場合、プローブは、最大２０個、好適には最大１０個、もっとも好適には最大５個のフルオロフォアで標識されることが同様に好ましい。例えば特徴的な指紋をもたらすため、２つ以上のタイプのフルオロフォアをプローブに結合することができると想定されるが、所定のプローブに結合したすべてのフルオロフォアは同じタイプであることが好ましい。１つの実施形態において、、フルオロフォアおよびクエンチャは、オリゴヌクレオチド領域の異なる鎖上にあるか、または、一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体を折り畳むことによりもたらされるところの対向にある。

フルオロフォアそのものに関して、それらは、原則として、これらに限定されないが、例えばフルオレセイン、ローダミンおよびフルオレセインイソチオシアネート、ローダミンＢ等のようなそれらの誘導体などのキサンテン部分、クマリン部分（例えばヒドロキシ−、メチル−およびアミノクマリン）、ならびにＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７のようなシアニン部分を含む、当技術分野において従来用いられるもののいずれかから選択することができる。具体例としては、Ａｌｅｘａ染料、シアニン染料、Ａｔｔｏ Ｔｅｃ染料、およびローダミン染料。例としては：Ａｔｔｏ ６３３（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ）、テキサスレッド、Ａｔｔｏ ７４０（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ）、ローズベンガル、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）７５０ Ｃ_５−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５３２ Ｃ_２−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにローダミンレッドＣ_２−マレイミドおよびローダミングリーン、またＱｕａｓａｒ ５７０のようなホスホラミダイト染料などの、よく用いられる染料から誘導されるフルオロフォアが挙げられる。あるいは、量子ドットまたはＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより供給されるような近赤外染料を用いることができる。フルオロフォアは、一般的には、当技術分野において知られる化学的方法を用いてヌクレオチド塩基を介してオリゴヌクレオチドに結合される。

適切なクエンチャは、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）メカニズムにより機能するものである。上記フルオロフォアと関連して用いることができる市販のクエンチャの例としては、これらに限定されないが、ＤＤＱ−１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱおよびＲＱ、ＩＲ Ｄｙｅ−ＱＣ１、ＢＨＱ−１、−２および−３ならびにＱＳＹ−７および−２１が挙げられる。

一本鎖ヌクレオチド領域は１つのヌクレオチドのみからなり、これにより、プローブは、相補的なヌクレオチド塩基を有する遊離ヌクレオチドの検出について極めて選択的となる。実際、これは、ヌクレオチド領域が、その特徴的なヌクレオチド塩基がＤＮＡの場合、グアニン、シトシン、アデニンおよびチミンから、また、ＲＮＡの場合、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルから選択されるヌクレオチドに結合するように構成されることを意味する。しかしながら、所望に応じて他のヌクレオチド塩基に対応する他のヌクレオチド（例えば他の合成ポリヌクレオチドを構成するもの）を用いることができる。したがって、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を決定する場合、それぞれ異なる相補的なヌクレオチド塩基について選択的であり、それぞれ異なる検出可能要素を用いる、４つの異なるプローブの混合物が一般的に用いられる。好適な実施形態において、各プローブは、例えば異なる特徴的な波長または波長包絡線で蛍光する異なるフルオロフォアで標識された、異なる検出可能要素を有する。よって、特徴的な蛍光が検出される場合には、ヌクレオチドを一意的に同定することができる。

二本鎖オリゴヌクレオチド領域について、それらは、それぞれ好適にクローズドループである２つのオリゴヌクレオチド前駆体から、または、１つの一般的な一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体であって、２つの末端を折り畳むことにより、２つのクローズドループのオリゴヌクレオチド領域と一本鎖ヌクレオチド領域を構成する中間ギャップとをもたらす一般的な一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体、から誘導される、または誘導可能であることが好ましい。すべての場合において、効果は同じであり；一本鎖ヌクレオチド領域の末端に、オリゴヌクレオチド領域の他方の鎖上の３’および５’自由末端が隣接し、ここに、標的の対応する５’および３’末端を結合させることができる。このように、プローブの使用は、前記３’および５’末端に結合することにより、一本鎖ヌクレオチド領域を標的単一ヌクレオチドに結合させて、全長に沿って二本鎖である使用済プローブをもたらすプロセスを含む。

適切には、二本鎖オリゴヌクレオチド領域は、長さが、最大で５０のヌクレオチド対、好適には最大で４５のヌクレオチド対、より好適には５〜４０のヌクレオチド対の範囲内、もっとも好適には１０〜３０のヌクレオチドの範囲内である。より長いオリゴヌクレオチド領域を用いてもよいが、この実施形態は、それらが絡み合うようになることでヌクレオチド領域へのアクセスが制限され得るという潜在的なリスクにより、あまり魅力的ではない。

オリゴヌクレオチドに結合した検出可能要素は、一本鎖ヌクレオチド領域から離れて位置することが好ましい。２つの別々のオリゴヌクレオチドが用いられる場合、検出可能要素は、ヌクレオチド領域から離れたその末端の１つまたは両方にまたはこれに向かって、位置または集合していることが好ましい。最後に、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、好適には検出可能要素が位置または集合している領域に隣接した、少なくとも１つの制限酵素認識部位を備える。こうした制限酵素認識部位は、一般的には、２〜８のヌクレオチド対の特定の配列を備える。本発明の１つの実施形態において、制限酵素認識部位は、ヌクレオチド領域への単一ヌクレオチドの結合によりもたらされる。

本発明の方法において好適に用いられる生体プローブは、原則として、Ｈ−ホスホネート法、ホスホジエステル合成、ホスホトリエステル合成およびホスファイトトリエステル合成を含む、当技術分野において知られるヌクレオチドアセンブリ方法のいずれかにより製造することができる。それらの反応性のため、好ましくは、ヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックを用いる方法である。これらの方法において、合成は、デブロッキング、カップリング、キャッピングおよび酸化を含む循環４段階プロセスにおいて、選択されたヌクレオチドホスホラミダイトを、成長ヌクレオチド鎖の５’位へ逐次付加することにより行われる。このプロセスの循環性により、特に自動化が可能であり、これを行う装置は市場で容易に入手可能である。クエンチャおよび／またはフルオロフォアが導入される場合、適切に標識されたヌクレオチドホスホラミダイトは、必要な時点で用いられる。もっとも好適な実施形態において、ホスホラミダイト法は、急速加熱および徐冷のサイクルにより折り畳まれた一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体を、所望の特徴を有するプローブとするのに用いられる。

本発明の方法のステップ（ａ）では、その少なくともいくつかが単一ヌクレオチドを含有する液滴のストリームが生成される。配列決定を目的として、液滴ストリーム中の単一ヌクレオチドの順序は、検体中のヌクレオチドの配列に対応することが重要である。適切には、こうした順序の液滴ストリームが、単一ヌクレオチドを厳密に順に対応する空の液滴のストリーム中に導入することによりもたらされる。これは、例えば、水性ストリームを単一ヌクレオチドが検体から放出されるレジームに通した後、ストリームを、非混合性担体液のストリーム中に排出するためのオリフィスに通すことにより達成することができる。所定の液滴が２つ以上の単一ヌクレオチドを含有するというリスクを回避するため、単一ヌクレオチドは、水性ストリーム中に各充填液滴が１〜２０（好適には２〜１０）個の空の液滴により離されるような割合で放出することが好ましい。その後、担体中の充填液滴のストリームを、流路、適切にはマイクロ流体流路に沿って、液滴が離散状態に維持され、互いに合体する機会を持たないような割合および方法で流動させる。１つの特に適切な実施形態の１つの例において、担体は、フルオロカーボン油（例えば３Ｍ Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ ＦＣ４０）および親フルオロ性界面活性剤（例えばＳｐｈｅｒｅ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｐｉｃｏｓｕｒｆ １）の混合物を備え、水性液滴は、水、グリセロール、イオン性塩およびプローブ反応に必要な他の添加物の混合物を含有する。好適には、マイクロ流体流路は、疎水性を与えるコーティングまたは表面改質剤で処理され、これにより、微小液滴がそれと相互作用することまたはそれに付着することを防止する。より好適には、この表面改質剤は、親油性でもあり、流路上の担体のコーティング層の形成をもたらし、水性液滴をチャネル壁からさらに分離する。適切には、用いられる液滴は、１００ミクロン未満、好適には５０ミクロン未満（例えば２０ミクロン未満）、より好適には１０ミクロン未満、さらにより好適には５ミクロン未満の直径を有する。すべてのそれら直径のうち、２〜２０ミクロンの範囲内がもっとも好適である。通常、単一ヌクレオチドは、自然発生のポリヌクレオチド検体、好適には自然発生のＤＮＡまたはＲＮＡに由来するものである。

本方法のステップ（ｂ）では、複数の生体プローブ、好適には複数の上述したものが各液滴中に導入される。好適には、すべての検体の各種ヌクレオチドを検出するのに必要なすべてのプローブの混合物が、各液滴中に導入される。すべてのうちもっとも好適には、これらのプローブは、それぞれ、検出不能な状態の複数の検出可能要素が結合し、且つ、少なくとも１つの制限酵素認識部位またはその前駆体を有する。液滴中へのプローブの導入は、液滴の生成前かつヌクレオチド放出後に２つのストリームを混合する、液滴中へ注入する、または、好適には液滴ストリームと第２の液滴ストリームとの両方（各液滴はプローブ混合物を含有する）を、２つのストリームが互いに連続的に合体し、単一ヌクレオチドおよびプローブの両方を含有するより大きな液滴の第３ストリームをもたらす条件下におく、ことにより行うことができる。同時に、各液滴中には、ポリメラーゼおよび／またはリガーゼを導入することが好ましい；これらは、所望に応じ、別々に導入することができる。この導入を行った後、ステップ（３）では、他を犠牲にして、液滴中の単一ヌクレオチドをプローブ混合物中のその相補的なプローブに結合させる。好適な実施形態において、この結合は、まずポリメラーゼを用いて単一ヌクレオチドの５’末端をオリゴヌクレオチドの３’末端に結合させ、次いで、リガーゼを用いて単一ヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチドまたは他のオリゴヌクレオチドの残りの自由末端を結合させることによって連続的に行われる。これらに限定されないが、バクテリオファージＴ４、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）およびテルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ Ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ））等の容易に入手可能な細菌源に由来するものを含む、広範囲のポリメラーゼおよびリガーゼを用いることができる。好適には、このステップは、水性媒体中で、適切には１：１〜１：２０００、好適には１：１〜１：２００、より好適には１：２〜１：５０、もっとも好適には１：２０〜１：５０の範囲内の標的対プローブのモル比を有する、過剰なプローブの存在下で行われる。あるいは、１：５〜１：２０の範囲内の比を用いることができる。

ステップ（ｃ）の生成物、すなわちここでは相補的なプローブ（以降、使用済プローブと呼ぶ）に結合した単一ヌクレオチドおよび他の未反応プローブを含有する液滴は、次にステップ（ｄ）において、使用済プローブ上の検出可能要素が液滴媒体中に検出可能な状態に解放されるように処理される。これにより、それらは、従来技術を用いてその後検出することができる。例えば、プローブ中の検出可能要素および使用済プローブが非蛍光性フルオロフォアである場合、ステップ（ｄ）は、それらを後者（前者または液滴中の他のプローブタイプではなく）から、それらが十分に蛍光し始めることができる形態に解放する。こうして生成された蛍光は、その後、各液滴中で従来の光学または分光技術を用いて検出および測定することができ、もとの検体の配列に特徴的な出力データセットまたはデータストリームをもたらすことができる。適切には、ステップ（ｄ）は、例えば、注入、または好適には上述したタイプ、制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）およびエキソヌクレアーゼの第２の合体などといった、液滴中に導入することにより、行われる。この例において、検出可能要素がフルオロフォアである場合、フルオロフォアの解放は、まず、制限酵素が、使用済プローブにおける上記制限酵素認識部位で二本鎖を切断することにより行われる。こうしてもたらされた短い断片は、次いで、エキソヌクレアーゼによりさらに単一ヌクレオチドに分解され、そのいくつかがフルオロフォアで標識される。プローブが複数のクエンチされたフルオロフォアを備える場合、好適な実施形態では、これによって一連の解放フルオロフォアがもたらされ、ここでこれらが互いにおよび／またはそれらの関連クエンチャから離れることにより、通常の方法で自由に蛍光する。好適には、この蛍光は、フルオロフォアの特徴的な蛍光波長または波長包絡線に対して調整された光検出器または同等の装置を用いて検出される。１つの実施形態の１つの例において、光検出器は、液滴の画像を対物レンズ（ＵＰＬＳＡＰＯ ６０ＸＷ、オリンパス）および標準的な色消しチューブレンズの組み合わせを用いて形成する高感度ｓＣＭＯＳカメラ（Ｚｙｌａ １０タップ ｓＣＭＯＳ、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を備える。この実施形態における蛍光発光の励起には、ダイクロイックミラーによって光路に導入される一連のレーザーを用いる。外部走査装置は、液滴にわたってレーザービームを偏向させる。このプロセスからもたらされる蛍光発光により、光検出器は、通常の方法で処理および分析することができる電気信号を発生する。上記のように、検出可能要素は、光学または分光手段により検出することが好ましい。

一般的に、ステップ（ｄ）もまた、過剰の酵素を含む水性媒体中で存在下で行われる。未使用生体プローブを分解することを回避するため、制限酵素認識部位は、単一ヌクレオチドを一本鎖ヌクレオチド領域に付加することにより形成されるものであるか、あるいは、制限酵素、中にニックを含有する二本鎖オリゴヌクレオチドとは反応しないように選択されることが好ましい。よって、制限酵素は、制限酵素部位の特徴を考慮して選択され、特にプローブが最適に機能する場合、部位について高い忠実度を示すものである。適切なエキソヌクレアーゼとしては、ＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼフリー）、エキソヌクレアーゼＩまたはＩＩＩ（例えば大腸菌）、エキソヌクレアーゼＴ、エキソヌクレアーゼＶ（ＲｅｃＢＣＤ）、λエキソヌクレアーゼ、マイクロコッカルヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、ＲｅｃＪ_ｆ、Ｔ５エキソヌクレアーゼおよびＴ７エキソヌクレアーゼ等が挙げられる。

一般的に、装置を通る液滴流量は、１秒当たり５０〜３０００、好適には１００〜２０００の液滴の範囲内である。

１つの適切な実施形態の１つの例では、２セットの試薬を含有する共流動水性ストリームを用いて液滴を生成する。液滴生成部位の近くで２つのストリームを組み合わせることにより、反応混合物の構成成分を、できるだけ長時間別々に保持することができる。

ここで、本発明の液滴配列決定方法を、ここで下記の装置を参照して例示する。

それぞれ単一ヌクレオチドを含有する液滴に対し、上述したような生体プローブとの反応を行うマイクロ流体ユニットを概略的に示す。

ヒトＤＮＡおよびクレノウ断片ポリメラーゼから誘導される１００ヌクレオチド塩基のポリヌクレオチド検体から得られる単一ヌクレオチドを含有する水性ストリーム１を、直径１０ミクロンのマイクロ流体チューブを通って流動させる。液滴ストリーム中のヌクレオチドの順序は、検体の配列に対応する。単一ヌクレオチドストリームは、チューブの内表面上に位置する検体の一本鎖の分解により、生成することができる。１は、液滴ヘッド２から第１チャンバー３に入り、ここで、軽質シリコーン油４の１つ以上のストリームと接触する。これらのストリームの速度は、乱流混合を回避し、油中に懸濁したそれぞれ約８ミクロンの直径を有する実質的に水性で球形の液滴５をもたらすように選択される。５のストリームは、次に、同じ直径の第２マイクロ流体チューブに沿って１秒当たり１０００液滴の割合で、５ミクロンの水性球形液滴７の第２ストリームが第２液滴ヘッド８を用いて供給される第２チャンバー６まで推進させる。液滴５および７は、連続的に合体し、直径約９ミクロンの肥大した水性液滴９が形成される。７は、それぞれ、後述するプローブ混合物、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、および、それぞれ異なる使用済プローブタイプを関連単一ヌクレオチドの結合によりもたらされた特異的な認識部位で特異的に切断するのに適した４つの制限酵素を含有する。この例において、制限酵素認識部位は、４ヌクレオチド塩基長である。９のそれぞれにおいて、単一ヌクレオチド対各プローブのモル比は、１：２０である。

９のストリームは、次に、同じ割合でマイクロ流動チューブによって第３チャンバー１０まで推進させ、ここで、同様に、液滴ヘッド１２を通ってこれに供給される５ミクロンの水性球形液滴１１の第３ストリームと接触させる。９のそれぞれがチャンバー間を移動するのにかかる時間は、３０分である。

９および１１は、１０中で合体し、液滴１３（直径約１０ミクロン）が生成される。１１は、それぞれ、λエキソヌクレアーゼを触媒量で含有する。液滴１３のストリームは、その後、検出システムの開口部中に推進させる。この時間中カートリッジ内では、エキソヌクレアーゼが、次いで、ここではクエンチされていないフルオロフォアが結合した一連の単一ヌクレオチドを解放するプロセスにおいて制限酵素によりもたらされた切断されたオリゴヌクレオチド断片を分解する。液滴の内容は、常に７．９〜８の範囲内のｐＨに緩衝される。

検出システム（図示せず）は、一般的に、１３の液滴のそれぞれがそれらの完全性を確保する条件下で保存される、チャネルまたはリザーバーで構成されるカートリッジを備える。前記カートリッジは、こうして保存された各液滴を顕微鏡／レーザー／光検出器からの入射光で調査することを可能にする透明なプラスチックまたは同様の材料からなる少なくとも１つの面を備える。これにより、順に、各液滴中の解放されたフルオロフォアが、それがもともと含有していた単一ヌクレオチドに特徴的な方法で蛍光する（または、液滴がもともと空だった場合には、まったく蛍光しない）。よって、液滴が順に調査される際には、もとのポリヌクレオチド中のヌクレオチド塩基の配列を、実際に読み取ることができる。使用において、カートリッジは充填され、封止され、エキソヌクレアーゼがフルオロフォアを解放し終わった後（一般的には１〜２時間以内に）、調査される。所望に応じ、液滴担体液は、その重合を紫外線により開始し、必要に応じてカートリッジを容易に無期限に保存することを可能にする液滴の透明な固体マトリックスをもたらすことができる有機または無機モノマー（例えばエポキシド）とする、またはこれを含有することができる。

下記は、上述した装置における使用に適したプローブ混合物をどのように調製することができるかを例示する。

ヌクレオチド塩基配列：
（５’）ＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＸＸＡＸＸＧＣＣＣＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＧＧＧＣＡＡＹＡＡＣＣＡＴＣＧＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＧＡＣＣＴＴＴＡＴＴＣＧＣＧＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＧＡＡＴＡＡＡＧＧＴＣＧＡＧＣＣＴＧＣ（３’）
［ＸはＱｕａｓａｒ ５７０（フルオロフォア）で標識されたＴ塩基であり、ＹはＢＨＱ−２クエンチャで標識されたＴ塩基である］を有する１０３ヌクレオチド一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体（例えばＡＴＤＢｉｏ）を、その水溶液を９５℃まで加熱した後、１℃当たり１０分の割合で室温までゆっくり冷却することにより、第４９ヌクレオチド塩基辺りで折り畳む。この時間の終わりに、第４９ヌクレオチド塩基（ここではＴ）が一本鎖ヌクレオチド領域ならびにその両側にそれぞれ２４および２７ヌクレオチド塩基対長の２つの二本鎖オリゴヌクレオチドを備えた、本発明によるクローズドループプローブが形成される。

次に、この場合ではその中の第４９塩基がＡ、ＧまたはＣである３つの同様の１０３ヌクレオチド塩基オリゴヌクレオチドから出発することにより、他の３つのヌクレオチド塩基を捕捉するのに適した３つの他のプローブを調製する。これらの場合では、Ｘ塩基は、それぞれ、フルオレセイン（５１７ｎｍ）、テキサスレッド（６１２ｎｍ）およびシアニン−５(６６７ｎｍ)で標識されたＴ塩基を備える。その後、プローブ混合物を、４つのプローブを等モル量で混合することにより調製する。

Claims (22)

1. ａ．その少なくともいくつかが単一ヌクレオチドを含有する液滴のストリームを生成するステップであって、前記液滴のストリーム中の単一ヌクレオチドの順序が検体中のヌクレオチドの配列に対応する、ステップ；
   ｂ．各液滴中に複数の生体プローブタイプを導入するステップであって、各タイプが（ｉ）異なる検出可能要素を検出不能な状態で備え、（ｉｉ）検体を構成する異なる相補的な単一ヌクレオチドを捕捉するように構成された、ステップ；
   ｃ．前記液滴中に含有される単一ヌクレオチドをその相補的なプローブに結合させ、使用済プローブをもたらすステップ；および
   ｄ．前記検出可能要素を使用済プローブから検出可能な状態に解放させるステップ
   により特徴づけられる、ポリヌクレオチド検体中のヌクレオチド塩基の配列を決定する方法。
2. 前記生体プローブが、末端が２つの異なる二本鎖オリゴヌクレオチド領域に結合した一本鎖ヌクレオチド領域を備えることを特徴とし、前記オリゴヌクレオチド領域の少なくとも１つは、特徴的な検出特性を有する検出可能要素を備え、前記検出可能要素は、前記オリゴヌクレオチド領域上において、同じ数の検出可能要素が対応する数の単一ヌクレオチドに結合した場合よりも検出可能特性が検出できないように配置される、請求項１に記載の方法。
3. 前記検出可能要素は、フルオロフォアを備え、前記プローブは、フルオロフォアが検出される波長または波長包絡線において本質的に非蛍光性であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 前記オリゴヌクレオチド領域が、前記一本鎖ヌクレオチド領域によって互いに接続された第１および第２の二本鎖オリゴヌクレオチドを備え、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、互いに近接した複数のフルオロフォアで標識されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 前記二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、前記フルオロフォアに近接したクエンチャで標識されることを特徴とする、請求項３または請求項４に記載の方法。
6. 前記単一ヌクレオチドが、チミン、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルの１つから選択されるヌクレオチド塩基からなることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
7. 各二本鎖オリゴヌクレオチドが、１０〜３０のヌクレオチド対からなることを特徴とする、請求項２〜６の１項に記載の方法。
8. 二本鎖オリゴヌクレオチドにおける最大で１０のヌクレオチド対が、フルオロフォアで標識されることを特徴とする、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 二本鎖オリゴヌクレオチドにおける最大で１０のヌクレオチド対が、クエンチャで標識されることを特徴とする、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. クローズドループである前記一本鎖ヌクレオチド領域から離れた末端をそれぞれ備える２つの別々の二本鎖オリゴヌクレオチドが用いられることを特徴とする、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
11. 前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、末端を折り畳み、前記一本鎖ヌクレオチド領域を備えるギャップを残すことにより、一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体から誘導されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 前記生体プローブが、少なくとも１つの制限酵素認識部位を備えることを特徴とする、前請求項のいずれかに記載の方法。
13. 前記制限酵素認識部位が、単一ヌクレオチドを生体プローブの一本鎖ヌクレオチド領域に結合させることによりもたらされることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
14. 前記検出可能要素が、フルオロフォアであることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記使用済プローブが、一本鎖ヌクレオチド領域への単一ヌクレオチドの結合により形成された制限酵素認識部位を備えることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記生体プローブのそれぞれが、異なる検出可能要素を有することを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
17. ステップｃが、ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で行われることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
18. ステップｄが、制限酵素およびエキソヌクレアーゼの存在下で行われることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記検出可能要素が、光学または分光手段により検出されることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記液滴のストリームが、油担体中の水性液滴のストリームを備えることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記液滴が直径５０ミクロン未満であることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ポリヌクレオチド検体が、自然発生のＤＮＡおよびＲＮＡに由来することを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。

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