JP2015503535A - 改変されたｃａｓｃａｄｅリボ核タンパク質およびそれらの用途 - Google Patents

Abstract

適応抗ウイルス防御のためのクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）；少なくともＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質サブユニットＣａｓ７、Ｃａｓ５、およびＣａｓ６（核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性または転写抑制する活性を保有するさらなるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのサブユニットが含まれる）を含むＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体。さらなる活性を有するＣａｓｃａｄｅ複合体を、ＲＮＡ分子と組み合わせてリボ核タンパク質複合体を産生する。標的配列と実質的な相補性を有するようにＲＮＡ分子を選択する。標的化リボ核タンパク質を、相同組換え、非相同末端結合、遺伝子改変、遺伝子組み込み、変異修復における核酸の正確な切断のため、またはその視覚化、転写活性化もしくは転写抑制のための遺伝子工学ツールとして使用し得る。

Description

本発明は、遺伝子工学分野、より詳細には、生物（原核生物および真核生物が含まれる）の遺伝子および／またはゲノム改変領域に関する。本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでのゲノム分析法および遺伝的改変方法で用いる部位特異的ツールの作製方法に関する。本発明は、より詳細には、配列特異的方法で核酸配列を認識して会合するリボ核タンパク質分野に関する。

細菌および古細菌は、広範な種々の侵入ＤＮＡに対する防御機構を有する。いわゆるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ防御システムは、宿主染色体上のクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）の遺伝子座内へのプラスミドおよびウイルスＤＮＡフラグメントの組み込みによって適応免疫を提供する。スペーサーとしての公知のウイルスまたはプラスミド由来配列は、宿主由来配列の反復によって相互に分離している。これらの反復エレメントはこの免疫系の遺伝記憶であり、各ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は以前の外来遺伝エレメントとの遭遇時に獲得された固有の「スペーサー」配列の多様なレパートリーを含む。

外来ＤＮＡの獲得は免疫化の最初の工程であるが、防御には、ＣＲＩＳＰＲが転写されること、およびこれらの長い転写物がそれぞれが外来核酸チャレンジャーに相補的な固有のスペーサー配列を含む短いＣＲＩＳＰＲ由来ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされることが必要である。

ｃｒＲＮＡに加えて、いくつかの生物における遺伝実験により、固有のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質セットが免疫獲得工程、ｃｒＲＮＡ生物発生、および標的干渉に必要であることが明らかとなった。また、系統学的に異なるＣＲＩＳＰＲシステム由来のＣａｓタンパク質のサブセットは、ｃｒＲＮＡを含む巨大な複合体にアセンブルすることが示されている。

多様なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの最近の再評価により、ｃａｓ遺伝子含有量が異なり、且つＣＲＩＳＰＲ防御経路全体で大きな相違を示す３つの異なる型（Ｍａｋａｒｏｖａ Ｋ．ら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−ＡＯＰ ９ Ｍａｙ ２０１１；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ２５７７）に分類されている（ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子についてのＭａｋａｒｏｖａ分類および命名法を、本明細書で採用している）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のＲＮＡ転写物（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）は、Ｉ型およびＩＩＩ型システムにおけるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドリボヌクレアーゼまたはＩＩ型システムにおけるＲＮアーゼＩＩＩによって反復配列中で特異的に切断され、生成されたｃｒＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡ侵入のいずれかの相補配列を検出するためのガイドＲＮＡとしてＣａｓタンパク質複合体によって利用される。標的核酸の切断は、ルーラーアンカード機構でＲＮＡを切断するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＩＩＩ−Ｂ型システムについてｉｎ ｖｉｔｒｏで証明されており、より最近では、相補標的配列（プロトスペーサー）中のＤＮＡを切断するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ ＩＩ型システムについてｉｎ ｖｉｖｏで証明されている。対照的に、Ｉ型システムについては、ＣＲＩＳＰＲ干渉機構は依然として殆ど知られていない。

モデル生物大腸菌Ｋ１２株は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｉ−Ｅ型（以前にＣＲＩＳＰＲ Ｅ亜型（Ｃｓｅ）として公知）を保有する。これは、８つのｃａｓ遺伝子群（ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃａｓ３、およびｃｓｅ１、ｃｓｅ２、ｃａｓ７、ｃａｓ５、ｃａｓ６ｅ）および下流ＣＲＩＳＰＲ（２型リピート）を含む。大腸菌Ｋ１２では、８つのｃａｓ遺伝子群がＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の上流でコードされている。Ｃａｓ１およびＣａｓ２は標的干渉に必要ないようであるが、新規の標的配列獲得に関与する可能性が高い。対照的に、６つのＣａｓタンパク質群：Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、およびＣａｓ６ｅ（以前にそれぞれＣａｓＡ、ＣａｓＢ、Ｃａｓ３、ＣａｓＣ／Ｃｓｅ４、ＣａｓＤ、およびＣａｓＥ／Ｃｓｅ３としても公知）は、λファージ攻撃からの防御に不可欠である。これらのタンパク質群のうちの５つ：Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、およびＣａｓ６ｅ（以前にそれぞれＣａｓＡ、ＣａｓＢ、ＣａｓＣ／Ｃｓｅ４、ＣａｓＤ、およびＣａｓＥ／Ｃｓｅ３として公知）は、ｃｒＲＮＡとアセンブリしてＣａｓｃａｄｅと呼ばれる多サブユニットリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成する。

大腸菌では、Ｃａｓｃａｄｅは、化学量論的に不等な５つの機能的に不可欠なＣａｓタンパク質群：Ｃｓｅ１_１Ｃｓｅ２_２Ｃａｓ７_６Ｃａｓ５_１Ｃａｓ６ｅ_１（すなわち、以前の命名法ではＣａｓＡ_１Ｂ_２Ｃ_６Ｄ_１Ｅ_１）および６１−ｎｔ ＣＲＩＳＰＲ由来ＲＮＡから構成される４０５ｋＤａのリボ核タンパク質複合体である。Ｃａｓｃａｄｅは、複合体のアセンブリおよび安定性ならびに侵入核酸配列の同定をｃｒＲＮＡに頼る絶対的ＲＮＰである。Ｃａｓｃａｄｅは、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列に相補的な外来核酸を発見して結合するサーベイランス複合体である。

Ｊｏｒｅら（２０１１）の名称「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｓｃａｄｅ」 Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８：５２９−５３７は、どのようにしてＣａｓｃａｄｅのＣａｓ６ｅサブユニットによってｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ転写物が切断され、それにより、成熟６１ ｎｔ ｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ複合体によって保持されるのかについて記載している。ｃｒＲＮＡは、いわゆるＲ−ループを形成するｃｒＲＮＡスペーサーと相補プロトスペーサーとの間の塩基対合によるＣａｓｃａｄｅの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子への配列特異的結合のためのガイドＲＮＡとしての機能を果たす。これはＡＴＰ依存性プロセスであることが知られている。

Ｂｒｏｕｎｓ Ｓ．Ｊ．Ｊ．ら（２００８）の名称「Ｓｍａｌｌ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ ｇｕｉｄｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０−９６４は、ｃｒＲＮＡを負荷したＣａｓｃａｄｅがｉｎ ｖｉｖｏファージ耐性にＣａｓ３を必要とすることを教示している。

Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ Ｌ．＆ Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ Ｅ．（２０１０）の名称「ＣＲＩＳＰＲ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ」 Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：１８１−１９０は、この分野の技術における既知知識をまとめた総説である。ＣＲＩＳＰＲベースの適用およびテクノロジーについてのいくつかの提案がなされているが、これは主に乳業用の馴化細菌（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）のファージ耐性株の生成領域における提案である。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓにおけるｃｒＲＮＰ複合体によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ分子の特異的切断については、さらなる展開が待たれると考えられる。ＣＲＩＳＰＲシステムの操作は、院内での抗生物質耐性菌株の伝播の軽減が可能な方法としても提案されている。著者は、これらの領域のテクノロジーの潜在的有用性を探求するためにさらなる研究が必要であると強調している。

ＵＳ２０１１２３６５３０Ａ１（Ｍａｎｏｕｒｙら）の名称「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｖｉｎｇ ｕｎｉｑｕｅ ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｏｒ ｄａｉｒｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ」は、高粘稠性かつわずかに糸を引くように乳を発酵する一定のＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株を開示している。定義された配列の特異的ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を開示している。

ＵＳ２０１１２１７７３９（Ａ１）（Ｔｅｒｎｓら）の名称「Ｃａｓ６ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ」は、Ｃａｓ６エンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを開示している。このポリペプチドは、Ｃａｓ６認識ドメインおよび切断部位を有する標的ＲＮＡポリヌクレオチドを切断する。切断をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。大腸菌またはＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉなどの微生物を、Ｃａｓ６エンドリボヌクレアーゼ活性を発現するように遺伝子改変している。

ＷＯ２０１００５４１５４号（Ｄａｎｉｓｃｏ）の名称「Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ ＣＲＩＳＰＲ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ビフィドバクテリウム属で見出された種々のＣＲＩＳＰＲ配列およびそのファージ耐性特性が変化する細菌の遺伝子操作株の作製におけるその使用を開示している。

ＵＳ２０１１１８９７７６（Ａ１）（Ｔｅｒｎｓら）の名称「Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ＲＮＡｉ−ｌｉｋｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは原核微生物におけるｉｎ ｖｉｖｏでの標的ポリヌクレオチドの不活化方法を記載している。この方法は、スペーサーからすぐ上流のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来のリピートから選択された５〜１０ヌクレオチドの５’領域を有するｐｓｉＲＮＡを使用する。３’領域は、標的ポリヌクレオチドの一部と実質的に相補的である。ｐｓｉＲＮＡおよび標的ポリヌクレオチドの存在下でエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドも記載している。

欧州特許第２３４１１４９（Ａ１）号（Ｄａｎｉｓｃｏ）の名称「Ｕｓｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ（ＣＡＳ）」は、１つ以上のＣａｓ遺伝子群を、バクテリオファージ、特に、乳製品においてスターター培養物または生菌培養物を提供する細菌に対する細菌細胞耐性の調整で使用することができる方法を記載している。

ＷＯ２０１００７５４２４号（Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｓ」は、ＣＲＩＳＰＲアレイを含む単離ポリヌクレオチドを開示している。ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、特に遺伝子がバイオ燃料産生に関連する場合に遺伝子発現を下方制御することができるように原核生物の遺伝子と相補的である。

ＷＯ２００８１０８９８９号（Ｄａｎｉｓｃｏ）の名称「Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｈａｇｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」は、細菌のバクテリオファージ耐性株の選択を開示しており、ファージＲＮＡ領域と１００％同一のさらなるスペーサーを有する株の選択も開示している。乳業で使用するための改良された株の組み合わせおよびスターター培養物ローテーションを記載している。生物的防除剤として使用するための一定のファージを記載している。

ＷＯ２００９１１５８６１号（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）の名称「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｌｏｃｉ」は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中に含まれるその可変ヌクレオチド配列の使用によるサルモネラ属細菌の検出および同定方法を開示している。

ＷＯ２００６０７３４４５号（Ｄａｎｉｓｃｏ）の名称「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ」は、食品、健康補助食品、および環境試料における細菌株の検出および分類を記載している。特異的ＣＲＩＳＰＲヌクレオチド配列によってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を同定している。

Ｕｒｎｏｖ Ｆら（２０１０）の名称「Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ」 Ｎａｔｕｒｅ １１：６３６−６４６は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよびこれらが一定範囲のモデル生物における逆遺伝学分野でどのように役立つのかについての総説である。正確にターゲティングされるゲノム切断およびその後の修復過程における遺伝子改変が可能なような亜鉛フィンガーヌクレアーゼが開発された。しかし、亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、多数の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ切断ドメインへの融合によって生成される。ＤＮＡ配列特異性は、それぞれ３つのヌクレオチドモチーフを認識する一連のいくつかの亜鉛フィンガーのカップリングによって達成される。このテクノロジーにおける有意な欠点は、切断される必要がある新規の各ＤＮＡ遺伝子座のために新規の亜鉛フィンガーを開発する必要がある点である。これには、ＤＮＡ結合特異性を保証するためのタンパク質工学および大規模のスクリーニングが必要である。

遺伝子工学およびゲノム研究分野では、配列／部位特異的核酸検出および／または切断のための改良された薬剤が依然として必要とされている。

米国特許出願公開第２０１１／２３６５３０号明細書 米国特許出願公開第２０１１／２１７７３９号明細書 国際公開第２０１０／０５４１５４号 米国特許出願公開第２０１１１８９７７６号明細書 欧州特許第２３４１１４９号明細書 国際公開第２０１０／０７５４２４号 国際公開第２００８／１０８９８９号 国際公開第２００９／１１５８６１号 国際公開第２００６／０７３４４５号

本発明者らは、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ活性を有する一定のＣａｓ３発現細菌がＣｓｅ１との融合物としてＣａｓ３を発現するという驚くべき発見をした。本発明者らは、予想外に、Ｃｓｅ１の他のヌクレアーゼ酵素との人為的融合物を産生することができた。

本発明者らは、ＣａｓｃａｄｅによるＣａｓ３依存性標的ＤＮＡ認識がＣａｓ３による切断のためにＤＮＡを標識し、Ｃａｓｃａｄｅ ＤＮＡ結合が標的ＤＮＡの位相的要求に支配されることも発見した。

本発明者らは、Ｃａｓｃａｄｅは弛緩した標的プラスミドに結合することができないが、驚いたことに、Ｃａｓｃａｄｅは負のスーパーコイル（ｎＳＣ）トポロジーを有する標的に高い親和性を示すことをさらに見出した。
したがって、第１の態様では、本発明は、少なくとも以下のＣＲＩＳＰＲタンパク質関連サブユニット：
−配列番号３のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１８％同一の配列を有するＣａｓ７（またはＣＯＧ１８５７）、
−配列番号４のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１７％同一の配列を有するＣａｓ５（またはＣＯＧ１６８８）、および
−配列番号５のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１６％同一の配列を有するＣａｓ６（またはＣＯＧ１５８３）を含み、
前記サブユニットの少なくとも１つが、核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を提供するさらなるアミノ酸配列を含む、抗ウイルス防御のためのクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）、Ｃａｓｃａｄｅタンパク質複合体、またはその一部を提供する。

核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列を含むサブユニットは「少なくとも１つの機能部分に連結したサブユニット」と呼ぶことができる例であり、機能部分はさらなるアミノ酸配列で構成されているポリペプチドまたはタンパク質である。転写活性化する活性は所望の遺伝子の活性化または上方制御を誘導する活性であり得、転写抑制する活性は所望の遺伝子の抑制または下方制御を誘導する活性であり得る。以下にさらに記載するように、ＲＮＡ分子を有する本発明のｃａｓｃａｄｅ複合体のターゲティングによって遺伝子が選択される。

核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列は、好ましくは、連続アミノ酸残基の形状を呈する。これらのさらなるアミノ酸を、連続しており、且つ関連するＣａｓまたはＣｓｅサブユニットの一部を形成するポリペプチドまたはタンパク質と見なすことができる。かかるポリペプチドまたはタンパク質配列は、好ましくは、常に任意のＣａｓまたはＣｓｅサブユニットアミノ酸配列の一部というわけではない。換言すれば、核酸もしくはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列は、ＣａｓまたはＣｓｅサブユニットアミノ酸配列またはその一部以外であり得る（すなわち、Ｃａｓ３サブユニットアミノ酸配列またはその一部以外であり得る）。

核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列を、必要に応じて、ＣａｓまたはＣｓｅサブユニットとして同一の生物（例えば、大腸菌）から得ることができるか、同一の生物に由来し得る。

上記に加えて、および／または上記の代わりに、核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列は、ＣａｓまたはＣｓｅサブユニットのアミノ酸配列に対して「異種」であり得る。したがって、さらなるアミノ酸配列を、Ｃａｓおよび／またはＣｓｅサブユニットが由来するか生じる生物と異なる生物から得ることができるか、異なる生物に由来し得る。

本明細書を通して、配列同一性を、国立生物工学情報センターＷｅｂサーバでのＢＬＡＳＴおよびその後のＣｏｂａｌｔ多配列アラインメント（問題の配列を基準配列（例えば、配列番号３、４、または５）と比較する）によって決定することができる。アミノ酸配列を、ＢＬＯＳＵＭ６２行列に基づいた配列類似率または所与の基準配列（例えば、配列番号３、４、または５）との同一率に関して定義することができる。配列の類似性または同一性は、最良のアラインメントを作製する最初の工程、その後の基準との保存率の計算工程を含み、この類似性または同一性は、配列の進化的関係の程度を反映する。

Ｃａｓ７は配列番号３と少なくとも３１％の配列類似性を有し得、Ｃａｓ５は配列番号４と少なくとも２６％の配列類似性を有し得る。Ｃａｓ６は配列番号５と少なくとも２７％の配列類似性を有し得る。

Ｃｓｅ１／ＣａｓＡ（５０２ＡＡ）について：
＞ｇｉ｜１６１３０６６７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４１７２４０．１｜Ｃａｓｃａｄｅ抗ウイルス複合体タンパク質を含むＣＲＩＳＰ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）［大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５亜株］

Ｃｓｅ２／ＣａｓＢ（１６０ＡＡ）について：
＞ｇｉ｜１６１３０６６６｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４１７２３９．１｜Ｃａｓｃａｄｅ抗ウイルス複合体タンパク質を含むＣＲＩＳＰ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）［大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５亜株］

Ｃａｓ７／ＣａｓＣ／Ｃｓｅ４（３６３ＡＡ）について：
＞ｇｉ｜１６１３０６６５｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４１７２３８．１｜Ｃａｓｃａｄｅ抗ウイルス複合体タンパク質を含むＣＲＩＳＰ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）［大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５亜株］

Ｃａｓ５／ＣａｓＤ（２２４ＡＡ）について：
＞ｇｉ｜９０１１１４８３｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４１７２３７．２｜Ｃａｓｃａｄｅ抗ウイルス複合体タンパク質を含むＣＲＩＳＰ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）［大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５亜株］

Ｃａｓ６ｅ／ＣａｓＥ（１９９ＡＡ）について：
＞ｇｉ｜１６１３０６６３｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４１７２３６．１｜ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ前駆体切断酵素；Ｃａｓｃａｄｅ抗ウイルス複合体タンパク質を含むＣＲＩＳＰ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）［大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５亜株］

本発明の範囲に入る配列バリアントの範囲の定義では、誤解を避けるために、以下は、上記の各同一率に関して特定したバリアントの最も広い各範囲から始まる配列番号１、２、３、４、または５のそれぞれに適用すべき変動範囲の各最適限度である。したがって、バリアントの範囲には、以下が含まれ得る：少なくとも１６％、または少なくとも１７％、または少なくとも１８％、または少なくとも１９％、または少なくとも２０％、または少なくとも２１％、または少なくとも２２％、または少なくとも２３％、または少なくとも２４％、または少なくとも２５％、または少なくとも２６％、または少なくとも２７％、または少なくとも２８％、または少なくとも２９％、または少なくとも３０％、または少なくとも３１％、または少なくとも３２％、または少なくとも３３％、または少なくとも３４％、または少なくとも３５％、または少なくとも３６％、または少なくとも３７％、または少なくとも３８％、または少なくとも３９％、または少なくとも４０％、または少なくとも４１％、または少なくとも４２％、または少なくとも４３％、少なくとも４４％、または少なくとも４５％、または少なくとも４６％、または少なくとも４７％、または少なくとも４８％、または少なくとも４９％、または少なくとも５０％、または少なくとも５１％、または少なくとも５２％、または少なくとも５３％、または少なくとも５４％、または少なくとも５５％、または少なくとも５６％、または少なくとも５７％、または少なくとも５８％、または少なくとも５９％、または少なくとも６０％、または少なくとも６１％、または少なくとも６２％、または少なくとも６３％、または少なくとも６４％、または少なくとも６５％、または少なくとも６６％、または少なくとも６７％、または少なくとも６８％、または少なくとも６９％、または少なくとも７０％、または少なくとも７１％、少なくとも７２％、または少なくとも７３％、または少なくとも７４％、または少なくとも７５％、または少なくとも７６％、または少なくとも７７％、または少なくとも７８％、または少なくとも７９％、または少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％アミノ酸配列同一性。

本明細書を通して、Ｍａｋａｒｏｖａら（２０１１）の命名法を、Ｃａｓタンパク質サブユニットの定義で使用する。Ｍａｋａｒｏｖａらの文献の５頁の表２は、Ｃａｓ遺伝子群およびＣａｓ遺伝子群が属するファミリーおよびスーパーファミリーの名称を列挙している。本明細書を通して、Ｃａｓタンパク質またはＣｓｅタンパク質サブユニットの言及には、これらのサブユニットが一部を形成するファミリーまたはスーパーファミリーの相互参照が含まれる。

本明細書を通して、本発明のＣａｓおよびＣｓｅサブユニットの基準配列を、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と定義することができる。例えば、Ｃａｓ７の配列番号３のアミノ酸配列には、そのアミノ酸配列をコードする全核酸配列も含まれる。したがって、本発明の範囲内に含まれるＣａｓ７のバリアントには、少なくとも基準核酸配列との定義されたアミノ酸同一率または類似率；ならびに下限と１００％との間の全ての可能な同一率または類似率のヌクレオチド配列が含まれる。

本発明のＣａｓｃａｄｅ複合体は、１つを超える異なる細菌または古細菌の原核生物に由来するかこれらから改変されたサブユニットから構成され得る。また、異なるＣａｓ亜型由来のサブユニットを混合することができる。

好ましい態様では、Ｃａｓ６サブユニットは、以下の配列番号１７のＣａｓ６ｅサブユニットまたはこれと少なくとも１６％同一の配列である。

好ましいＣａｓ６ｅサブユニットの配列は、以下の＞ｇｉ｜１６１３０６６３｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４１７２３６．１｜ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ前駆体切断酵素；Ｃａｓｃａｄｅ抗ウイルス複合体タンパク質を含むＣＲＩＳＰ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）［大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５亜株］である：

本発明のＣａｓｃａｄｅ複合体またはその一部（核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのサブユニットを含む）は、配列番号２のアミノ酸配列またはこれと少なくとも２０％同一の配列もしくはその一部を有するＣｓｅ２（またはＹｇｃＫ様）サブユニットをさらに含むことができる。あるいは、Ｃｓｅサブユニットは、配列番号２と少なくとも３８％類似すると定義する。必要に応じて、本発明のタンパク質複合体内で、核酸またはクロマチンを改変する活性を有するさらなるアミノ酸配列を含むのはＣｓｅ２サブユニットである。

さらにまたはあるいは、本発明のＣａｓｃａｄｅ複合体は、配列番号１のアミノ酸配列またはこれと少なくとも９％同一の配列もしくはその一部を有するＣｓｅ１（またはＹｇｃＬ様）サブユニットをさらに含むことができる。必要に応じて、本発明のタンパク質複合体内で、核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列を含むのはＣｓｅ１サブユニットである。

好ましい実施形態では、本発明のＣａｓｃａｄｅ複合体は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムタンパク質複合体、より好ましくはＩ−Ｅ亜型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質複合体であるか、Ｉ−Ａ型またはＩ−Ｂ型複合体に基づき得る。Ｉ−Ｃ、Ｄ、またはＦ型複合体が可能である。

大腸菌システムに基づいた特に好ましい実施形態では、サブユニットは、以下の化学量論を有し得る：Ｃｓｅ１_１Ｃｓｅ２_２Ｃａｓ７_６Ｃａｓ５_１Ｃａｓ６_１またはＣｓｅ１_１Ｃｓｅ２_２Ｃａｓ７_６Ｃａｓ５_１Ｃａｓ６ｅ_１。

核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列を、少なくとも１つのサブユニットに、天然または人工のタンパク質発現系での発現によって翻訳的に融合することができるか、化学合成工程によって共有結合することができ、好ましくは、少なくとも１つの機能部分を、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、またはＣａｓ６ｅサブユニットのうちの少なくとも１つの少なくともＮ末端領域および／またはＣ末端領域に融合または連結する。特に好ましい実施形態では、核酸またはクロマチンを改変する活性を有するさらなるアミノ酸配列を、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、またはＣａｓ５サブユニットのＮ末端またはＣ末端に融合または連結し、より好ましくは、連結は、Ｃｓｅ１サブユニットのＮ末端領域内、Ｃｓｅ２サブユニットのＮ末端領域内、またはＣａｓ７サブユニットのＮ末端領域内に存在する。

核酸またはクロマチンを改変する活性、活性化する活性、抑制する活性、または視覚化する活性を有するさらなるアミノ酸配列は、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ−ヘリカーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｄａｍ）、またはＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（コ）アクチベーター、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構造化タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙまたは重金属結合タンパク質）、シグナルペプチド（例えば、Ｔａｔ−シグナル配列）、細胞内局在配列（例えば、核局在配列）または抗体エピトープから必要に応じて選択されるタンパク質であり得る。

関連しているタンパク質は、Ｃａｓｃａｄｅタンパク質サブユニットの配列が起源とする細菌種以外の種由来の異種タンパク質であり得る。

タンパク質がヌクレアーゼである場合、ヌクレアーゼは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（ＦｏｋＩなど）またはその変異体もしくは活性部分から選択されるヌクレアーゼであってもよい。使用することができる他のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼには、ＥｃｏＲ１、ＥｃｏＲＶ、ＢｇＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｇＩ、およびＢｓｐＭＩが含まれる。好ましくは、本発明の１つのタンパク質複合体をＦｏｋＩのＮ末端ドメインに融合することができ、本発明の別のタンパク質複合体をＦｏｋＩのＣ末端ドメインに融合することができる。次いで、これら２つのタンパク質複合体を共に使用して、核酸内の遺伝子座特異的二本鎖を有利に切断することができ、それにより、ＲＮＡ成分（以下に定義および記載している）によってガイドされ、且つ標的核酸鎖中のいわゆる「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）配列の存在によって遺伝子材料中の切断位置が使用者によってデザインおよび選択される（以下にもより詳細に記載している）。

１つの好ましい実施形態では、本発明のタンパク質複合体は、改変制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）であるさらなるアミノ酸配列を有する。改変は、触媒ドメイン中に存在することが好ましい。好ましい実施形態では、改変ＦｏｋＩは、タンパク質複合体のＣｓｅ１タンパク質に融合されるＫＫＲ ＳｈａｒｋｅｙまたはＥＬＤ Ｓｈａｒｋｅｙである。本発明のこれらの複合体の好ましい適用では、これらの複合体のうちの２つ（ＫＫＲ ＳｈａｒｋｅｙおよびＥＬＤ Ｓｈａｒｋｅｙ）を共に組み合わせることができる。異なる改変ＦｏｋＩを使用するタンパク質複合体のヘテロ二量体対は、核酸の標的化二本鎖切断で特に有利である。ホモ二量体を使用する場合、非特異的活性によって非標的部位でより多くの切断が行われる可能性がある。ヘテロ二量体アプローチは、材料サンプルにおける切断の信頼性が有利に増大する。

上記定義および記載の核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列を有するＣａｓｃａｄｅ複合体は、本明細書中に定義の任意の核酸もしくはクロマチンの改変物質、視覚化物質、転写活性化物質、または転写抑制物質を使用したいくつかの方法（例えば、メチル化）で切断、タグ化、そうでなければ変更することが望まれる正確な遺伝子座を所定の状況で使用者が有利に選択することが可能な本発明のシステム全体の構成部分である。システムの他の構成部分は、本発明のＣａｓｃａｄｅ複合体を改変、切断、またはタグ化を意図するＤＮＡまたはＲＮＡ上の正確な遺伝子座に誘導するガイドとして作用するＲＮＡ分子である。

本発明のＣａｓｃａｄｅ複合体はまた、好ましくは、所望の標的核酸配列と少なくとも５０％同一のリボヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を含み、ここで、タンパク質複合体およびＲＮＡ分子がリボ核タンパク質複合体を形成する。好ましくは、リボ核タンパク質複合体は、ＲＮＡ分子がその意図する標的核酸配列とハイブリッド形成する場合に形成される。リボ核タンパク質複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれであろうとＣａｓｃａｄｅ機能部分組み合わせの必要な成分およびＲＮＡ分子および核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が共に適切な生理学的条件下で存在する場合に形成される。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは、ｄｓＤＮＡ、特に負のスーパーコイルＤＮＡの状況下で、ｄｓＤＮＡに会合しているＣａｓｃａｄｅ複合体が二重鎖を部分的に解き、次いで、ＲＮＡを１つの鎖と会合させ、次いで、リボ核タンパク質複合体全体がＲＮＡ配列の少なくとも一部と実質的に相補的な標的配列に到達するまでＤＮＡ鎖に沿って移動し、この時点でＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間に安定な相互作用が生じ、その遺伝子座でのＤＮＡの改変、ヌクレアーゼ切断、またはタグ化のいずれかによって機能部分が機能すると考える。

好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子の一部は、標的核酸配列と少なくとも５０％同一であり、より好ましくは、標的配列と少なくとも９５％同一である。より好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子の一部は、その長さに沿って標的ＤＮＡ配列と実質的に相補的である（すなわち、連続または不連続であり得るたった１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのミスマッチが存在する）。ＲＮＡ分子（またはその一部）は、標的配列と少なくとも５１％、または少なくとも５２％、または少なくとも５３％、または少なくとも５４％、または少なくとも５５％、または少なくとも５６％、または少なくとも５７％、または少なくとも５８％、または少なくとも５９％、または少なくとも６０％、または少なくとも６１％、または少なくとも６２％、または少なくとも６３％、または少なくとも６４％、または少なくとも（ｌｅａｓｔ）６５％、または少なくとも６６％、または少なくとも６７％、または少なくとも６８％、または少なくとも６９％、または少なくとも７０％、または少なくとも７１％、または少なくとも７２％、または少なくとも７３％、または少なくとも７４％、または少なくとも７５％、または少なくとも７６％、または少なくとも７７％、または少なくとも７８％、または少なくとも７９％、または少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも（ｌｅａｓｔ）８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または１００％同一であり得る。

標的核酸は、ＤＮＡ（ｓｓまたはｄｓ）またはＲＮＡであり得る。

他の好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子またはその一部は、標的核酸と少なくとも７０％同一である。かかる同一レベルで、標的核酸は、好ましくはｄｓＤＮＡである。

ＲＮＡ分子は、好ましくは、標的核酸配列に対して高い特異性および親和性が必要であろう。好ましくは未変性ゲル電気泳動、あるいは等温滴定熱量計、表面プラズモン共鳴、または蛍光ベースの滴定法によって決定した場合の１ｐＭ〜１μＭ、好ましくは１〜１００ｎＭの範囲の解離定数（Ｋ_ｄ）が望ましい。親和性を、ゲル遅延度アッセイとも呼ばれる電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して決定することができる（Ｓｅｍｅｎｏｖａ Ｅら（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８：１００９８−１０１０３を参照のこと）。

ＲＮＡ分子を、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子として原核生物の既知の性質に基づいてモデル化する。ｃｒＲＮＡの分子構造は既に確立されており、Ｊｏｒｅら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８：５２９−５３７でより詳細に説明されている。簡潔に述べれば、Ｉ−Ｅ型の成熟ｃｒＲＮＡは、しばしば６１ヌクレオチド長であり、テトラヌクレオチドループを有するヘアピンを形成する８ヌクレオチドの５’「ハンドル」領域、３２ヌクレオチドの「スペーサー」配列、および２１ヌクレオチドの３’配列からなる。しかし、本発明で使用されるＲＮＡは、天然に存在するｃｒＲＮＡのデザインと比較して長さ、領域、または特異的ＲＮＡ配列が厳密にデザインされる必要はない。それにもかかわらず、明確なのは、本発明で用いるＲＮＡ分子を公的なデータベース中または新規に発見された遺伝子配列情報に基づいてデザインし、次いで、例えば、化学合成によってその全体または一部を人工的に作製することができるということである。本発明のＲＮＡ分子を、遺伝子改変細胞または無細胞発現系における発現によってデザインおよび産生することもでき、この選択肢には、いくつかまたは全部のＲＮＡ配列の合成が含まれ得る。

ｃｒＲＮＡの構造および要件は、Ｓｅｍｅｎｏｖａ Ｅら（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８：１００９８−１０１０３にも記載されている。スペーサー配列の５’末端を形成するいわゆる「シード」部分が存在し、シード部分の５’側に８ヌクレオチドの５’ハンドルが隣接している。Ｓｅｍｅｎｏｖａら（２０１１）は、シード配列の全残基は標的配列と相補的でなければならないが、６位の残基についてはミスマッチが許容され得ることを見出した。同様に、標的遺伝子座（すなわち、配列）に配向する本発明のリボ核タンパク質複合体のＲＮＡ成分をデザインおよび作製する場合、シード配列に必要なマッチおよびミスマッチ規則を適用することができる。

したがって、本発明は、核酸サンプルを前述の本発明のリボ核タンパク質複合体または前述の本発明のＣａｓｃａｄｅ複合体および個別のＲＮＡ成分と接触させる工程を含み、ＲＮＡ成分の配列（リボ核タンパク質複合体中の場合が含まれる）は８ヌクレオチド残基の連続配列の６位の単一塩基の変化によって正常な対立遺伝子と変異対立遺伝子が区別されるような配列である、標的核酸分子の単一塩基の変化を検出および／または位置づける方法を含む。

本発明の実施形態では、ＲＮＡ分子は、３５〜７５残基の範囲の長さを有し得る。好ましい実施形態では、所望の核酸配列と相補的であり、且つ所望の核酸配列のターゲティングのために使用されるＲＮＡの一部は３２または３３残基長である（Ｓｅｍｅｎｏｖａら（２０１１）の図１に示すように、天然に存在するｃｒＲＮＡの文脈では、これはスペーサー部分に対応するであろう）。

本発明のリボ核タンパク質複合体は、核酸標的配列と少なくとも実質的な相補性を有するＲＮＡ配列に対して５’側の８残基を含むＲＮＡ成分をさらに有し得る（核酸標的配列と少なくとも実質的な相補性を有するＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡの文脈では、スペーサー配列に対応すると理解されるであろう。ＲＮＡの５’隣接配列は、ｃｒＲＮＡの５’ハンドルに対応するとみなされるであろう。これは、Ｓｅｍｅｎｏｖａら（２０１１）の図１に示されている）。

本発明のリボ核タンパク質複合体は、ＤＮＡ標的配列と少なくとも実質的な相補性を有するＲＮＡ配列に対して３’側にヘアピンおよびテトラヌクレオチドループ形成配列を有し得る（Ｓｅｍｅｎｏｖａら（２０１１）の図１に示すように、ｃｒＲＮＡの文脈では、これは、スペーサー配列に隣接する３’ハンドルに対応するであろう）。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり得る。

本発明のＣａｓｃａｄｅタンパク質および複合体を、標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る）の存在下でリボ核タンパク質複合体を形成するためのＲＮＡガイド成分とのその会合活性に関してｉｎ ｖｉｔｒｏで特徴付けることができる。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を、本発明の複合体とその核酸標的との複合体についての機能アッセイとして使用することができる。基本的に、本発明のＣａｓｃａｄｅ機能部分複合体を核酸標的と混合し、Ｃａｓｃａｄｅ機能部分複合体の安定な相互作用を、ＥＭＳＡまたは機能部分（例えば、所望の部位での標的ＤＮＡの内ヌクレオチド結合分解性切断）の特異的読み出しによってモニタリングする。標的ＤＮＡ分子における既知の特異性および切断部位を有する市販の酵素を使用したさらなる制限フラグメント長分析によってこれを決定することができる。

ガイドＲＮＡの存在下での本発明のＣａｓｃａｄｅタンパク質または複合体のＤＮＡまたはＲＮＡへの結合の視覚化を、走査型力顕微鏡／原子間力顕微鏡（ＳＦＭ／ＡＦＭ）イメージングを使用して行うことができ、これにより、本発明の機能的複合体の存在についてアッセイすることができる。

本発明はまた、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列またはこれと少なくとも９％同一の配列を有するＣｓｅ１サブユニット；
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列またはこれと少なくとも２０％同一の配列を有するＣｓｅ２サブユニット；
ｃ．配列番号３のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１８％同一の配列を有するＣａｓ７サブユニット；
ｄ．配列番号４のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１７％同一の配列を有するＣａｓ５サブユニット；
ｅ．配列番号５のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１６％同一の配列を有するＣａｓ６サブユニットから選択され、
ここで、少なくともａ、ｂ、ｃ、ｄ、またはｅが、核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質サブユニットをコードする核酸分子を提供する。

核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列を、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質サブユニットに融合する。

上記定義の本発明の核酸では、ヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５をコードするヌクレオチド配列であり得るか、これらのバリアント配列の範囲の定義では、好ましくはストリンジェントな条件下、より好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下でそのヌクレオチド配列にハイブリッド形成可能な配列であり得る。種々のストリンジェントなハイブリッド形成条件は、当業者によく知られているであろう。核酸分子のハイブリッド形成は、２つの相補核酸分子がワトソン・クリック塩基対合として公知の一定量の相互水素結合を生じた場合に起こる。ハイブリッド形成のストリンジェンシーは、核酸周囲の環境（すなわち、化学的／物理的／生物学的）条件、温度、ハイブリッド形成法の性質、ならびに使用した核酸分子の組成および長さに応じて変化し得る。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに必要なハイブリッド形成条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）；およびＴｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３）で考察されている。Ｔ_ｍは、所与の核酸分子鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッド形成する温度である。以下は、一連のハイブリッド形成条件の例であるが、本発明を制限しない。

非常に高ストリンジェンシー（少なくとも９０％同一の配列がハイブリッド形成可能）
ハイブリッド形成：５×ＳＳＣにて６５℃で１６時間
２回洗浄：２×ＳＳＣにて室温（ＲＴ）でそれぞれ１５分間
２回洗浄：０．５×ＳＳＣにて６５℃でそれぞれ２０分間

高ストリンジェンシー（少なくとも８０％同一の配列がハイブリッド形成可能）
ハイブリッド形成：５×〜６×ＳＳＣにて６５℃〜７０℃で１６〜２０時間
２回洗浄：２×ＳＳＣにてＲＴでそれぞれ５〜２０分間
２回洗浄：１×ＳＳＣにて５５℃〜７０℃でそれぞれ３０分間

低ストリンジェンシー（少なくとも５０％同一の配列がハイブリッド形成可能）
ハイブリッド形成：６×ＳＳＣにてＲＴ〜５５℃で１６〜２０時間
少なくとも２回洗浄：２×〜３×ＳＳＣにてＲＴ〜５５℃でそれぞれ２０〜３０分間。

核酸分子は単離核酸分子であり得、且つＲＮＡまたはＤＮＡ分子であり得る。

さらなるアミノ酸配列を、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ−ヘリカーゼ（例えば、Ｃａｓ３）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｄａｍ）、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（コ）アクチベーター、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構造化タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙまたは重金属結合タンパク質）、シグナルペプチド（例えば、Ｔａｔ−シグナル配列）、細胞内局在配列（例えば、核局在配列）、または抗体エピトープから選択することができる。さらなるアミノ酸配列は、関連するＣａｓｃａｄｅタンパク質サブユニットが由来する生物と異なるタンパク質であり得るか、この生物に由来し得る。

本発明は、前述で定義の核酸分子を含む発現ベクターを含む。１つの発現ベクターは、単一のＣａｓｃａｄｅタンパク質サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含むことができ、さらなるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列も含むことができる。それにより、発現の際にサブユニットおよびさらなる配列が融合する。他の発現ベクターは、いかなるさらなるアミノ酸配列にも融合されないただの１つ以上のＣａｓｃａｄｅタンパク質サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

核酸またはクロマチンを改変する活性を有するさらなるアミノ酸配列を、リンカーポリペプチドを介して任意のＣａｓｃａｄｅサブユニットに融合することができる。リンカーは、約６０アミノ酸残基までまたは約１００アミノ酸残基までの任意の長さのリンカーであり得る。好ましくは、リンカーは、１０〜６０、より好ましくは１０〜２０の範囲の多数のアミノ酸を有する。アミノ酸は、好ましくは、極性および／または小型および／または荷電アミノ酸である（例えば、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ）。リンカーペプチドを、好ましくは、融合した機能部分およびＣａｓｃａｄｅのサブユニットについて、前記部分が標的ヌクレオチドと適切に相互作用するように融合される正確な間隔および位置が得られるようにデザインする。

本発明の発現ベクター（発現の際にＣａｓｃａｄｅタンパク質サブユニットに融合するであろうアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を持つか持たない）は、上記定義のＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含むことができる。その結果、かかる発現ベクターを適切な宿主中で使用して、所望のヌクレオチド配列をターゲティングすることができる本発明のリボ核タンパク質を生成することができる。

したがって、本発明はまた、標的核酸を改変するか、視覚化するか、転写を活性化するか、転写を抑制する方法であって、前記核酸を上記定義のリボ核タンパク質複合体と接触させる工程を含む、方法を提供する。核酸の切断または核酸への結合によって改変することができる。

本発明はまた、標的核酸を改変するか、視覚化するか、転写を活性化するか、転写を抑制する方法であって、前記核酸を本明細書中に定義のＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体および本明細書中に定義のＲＮＡ分子と接触させる工程を含む、方法を含む。

したがって、上記方法にしたがって、標的核酸の改変、視覚化、転写活性化、転写抑制を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび無細胞環境下で行うことができる（すなわち、方法を、溶液中に遊離しているか、固相に関与する生化学反応として行う）。標的核酸を、例えば、固相に結合することができる。

無細胞環境下では、標的核酸、Ｃａｓｃａｄｅタンパク質複合体、およびＲＮＡ分子の各々の添加順序は、当業者が任意に選択する。３成分を、同時にか、任意の所望の順序で連続的にか、または異なる時間および所望の順序で個別に添加することができる。したがって、標的核酸およびＲＮＡを反応混合物に同時に添加し、本発明のＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体を一連の特定の方法工程で個別且つその後に添加することが可能である。

標的核酸の改変、視覚化、転写活性化、または転写抑制を、細胞内にて（単離細胞または多細胞組織、器官、もしくは生物の一部として）ｉｎ ｓｉｔｕで行うことができる。したがって、組織および器官全体の文脈ならびに生物の文脈では、本方法をｉｎ ｖｉｖｏで行うことができるか、組織、器官、または生物全体から細胞を単離し、次いで、リボ核タンパク質複合体で処置した細胞を同一もしくは異なる生物内のその以前の位置または異なる位置に戻すことによって行うことができる。したがって、本方法は、同種移植片、自家移植片、同系移植片、および異種移植片を含むであろう。

これらの実施形態では、本発明のリボ核タンパク質複合体またはＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体は、当業者に周知の適切な細胞への送達形態（細胞質内または核内への微量注入が含まれる）が必要である。

また、個別に存在する場合、ＲＮＡ分子は、同時、個別、または連続的にＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体を使用した適切な細胞への送達形態が必要である。かかる細胞へのＲＮＡの導入形態は当業者に周知であり、従来のトランスフェクション法によるｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ送達が含まれ得る。物理的方法（微量注入およびエレクトロポレーションなど）ならびにカルシウム共沈、市販のカチオン性ポリマーおよび脂質、細胞透過性ペプチド、および細胞透過性粒子（遺伝子銃）をそれぞれ使用することができる。例えば、ウイルスを、例えば、本発明のＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体または本発明のリボ核タンパク質複合体のウイルス粒子への（可逆的）融合による細胞質および／または核への送達ビヒクルとして使用することができる。ウイルス送達（例えば、アデノウイルス送達）またはアグロバクテリウム媒介送達を使用することができる。

本発明はまた、細胞を前述の任意の発現ベクターでトランスフェクション、形質転換、または形質導入する工程を含む、細胞内で標的核酸を、改変するか、視覚化するか、転写を活性化するか、または転写を抑制する方法を含む。トランスフェクション法、形質転換法、または形質導入法は、当業者に周知の型のものである。本発明のＣａｓｃａｄｅ複合体を発現させるための１つの発現ベクターが存在し、ＲＮＡを細胞に直接添加する場合、同一または異なるトランスフェクション法、形質転換法、または形質導入法を使用することができる。同様に、本発明のＣａｓｃａｄｅ−機能融合複合体を発現させるために使用される１つの発現ベクターが存在し、別の発現ベクターが発現によるｉｎ ｓｉｔｕでのＲＮＡ生成のために使用される場合、同一または異なるトランスフェクション法、形質転換法、または形質導入法を使用することができる。

他の実施形態では、本発明のＣａｓｃａｄｅ複合体をコードするｍＲＮＡを、Ｃａｓｃａｄｅ複合体が細胞内で発現するように細胞に導入する。Ｃａｓｃａｄｅ複合体を所望の標的配列にガイドするＲＮＡも、必要なリボ核タンパク質複合体が細胞内で形成されるようにｍＲＮＡと同時、個別、または連続的に細胞内に導入する。

上記の標的核酸の改変または視覚化方法では、さらなるアミノ酸配列はマーカーであり得、このマーカーは標的核酸に会合し、好ましくは、マーカーはタンパク質、必要に応じて、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）またはｍＣｈｅｒｒｙ）である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれの場合でも、本発明の方法を使用して、好ましくはより高次の構造（スーパーコイルのプラスミドもしくは染色体など）または一本鎖標的核酸（ｍＲＮＡなど）の形態で核酸分子中の標的遺伝子座を直接視覚化することができる。標的遺伝子座の直接的視覚化には、電子顕微鏡検査または蛍光顕微鏡法を使用することができる。

他の種類の標識（小分子であり得る有機色素分子、放射性標識、およびスピン標識が含まれる）を使用して、標的核酸を標識することができる。

上記の本発明の方法では、標的核酸はＤＮＡ、好ましくはｄｓＤＮＡであるが、標的はＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡであり得る。

標的核酸がｄｓＤＮＡである標的核酸の改変、視覚化、転写活性化、または転写抑制のための本発明の方法では、核酸またはクロマチンを改変する活性を有するさらなるアミノ酸配列はヌクレアーゼまたはヘリカーゼ−ヌクレアーゼであり得、改変は、好ましくは、望ましい遺伝子座での一本鎖または二本鎖の切断（ｂｒｅａｋ）である。このような方法で、ＤＮＡの固有の配列特異的切断（ｃｕｔｔｉｎｇ）を、Ｃａｓｃａｄｅ機能部分複合体の使用によって操作することができる。最終リボ核タンパク質複合体のＲＮＡ成分の選択配列により、さらなるアミノ酸配列作用に望ましい配列特異性が得られる。

したがって、本発明はまた、ｄｓＤＮＡ分子からヌクレオチド配列の少なくとも一部を除去するため、必要に応じて、遺伝子の機能をノックアウトするための所望の遺伝子座での細胞内のｄｓＤＮＡ分子の非相同末端結合方法であって、前述の任意の標的核酸を改変する方法を使用して二本鎖の切断（ｂｒｅａｋ）を作る工程を含む、方法を提供する。

本発明は、既存のヌクレオチド配列を改変するか、所望のヌクレオチド配列を挿入するための所望の遺伝子座での細胞内のｄｓＤＮＡ分子中への核酸の相同組換え方法であって、前述の任意の標的核酸を改変する方法を使用して所望の遺伝子座で二本鎖または一本鎖の切断（ｂｒｅａｋ）を作る工程を含む、方法をさらに提供する。

したがって、本発明はまた、前述の任意の方法にしたがって標的核酸配列を改変するか、転写を活性化するか、転写を抑制する工程を含む生物における遺伝子発現を改変するか、活性化するか、抑制する方法であって、前記核酸がｄｓＤＮＡであり、機能部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、デメチラーゼまたはデアセチラーゼ）、転写アクチベーター、または転写リプレッサーから選択される、方法を提供する。

本発明は、さらに、前述の任意の方法にしたがって標的核酸配列を改変するか、転写を活性化するか、転写を抑制する工程を含む生物における遺伝子発現を改変するか、活性化するか、抑制する方法であって、前記核酸がｍＲＮＡであり、機能部分が、エンドヌクレアーゼ、３’エキソヌクレアーゼ、または５’エキソヌクレアーゼから必要に応じて選択されるリボヌクレアーゼである、方法を提供する。

上記の任意の本発明の方法では、方法に供する細胞は原核生物であり得る。同様に、細胞は真核細胞（例えば、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞）であり得る。細胞が哺乳動物細胞またはヒト細胞である場合、細胞は、幹細胞であり得る（しかし、いかなるヒト胚性幹細胞でないかもしれない）。本発明で用いるかかる幹細胞は、好ましくは単離幹細胞である。必要に応じて、任意の本発明の方法によれば、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションする。

しかし、好ましくは、任意の本発明の方法では、標的核酸は、特異的三次構造、必要に応じてスーパーコイルを有し、より好ましくは、標的核酸は負のスーパーコイルである。有利には、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたか、細胞内で形成されたか、細胞の発現機構を介して細胞内で形成された本発明のリボ核タンパク質複合体を使用して、使用しなければアクセスが困難であろう遺伝子座をターゲティングし、所望の成分の機能活性（特異的配列の標識またはタグ化、核酸構造の改変、遺伝子発現のスイッチオンまたはオフ、または標的配列自体の改変（一本鎖または二本鎖切断およびその後の１つ以上のヌクレオチド残基またはカセットの挿入が含まれる）のいずれか）を適用することができる。

本発明はまた、前述の本発明のＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体またはリボ核タンパク質複合体を含む薬学的組成物を含む。

本発明は、前述の本発明の単離核酸または発現ベクターを含む薬学的組成物をさらに含む。

前述の本発明のＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体および前述の本発明のＲＮＡ分子を含むキットも提供する。

本発明は、医薬として使用するための前述のＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体、リボ核タンパク質複合体、核酸、またはベクターを含む。

本発明は、原核生物宿主または真核生物宿主の特定されたゲノム遺伝子座のＤＮＡを物理的に変更するか所与の遺伝子座での遺伝子の発現パターンを変化させる種々の可能性がある。宿主ゲノムＤＮＡを、メチル化によって切断または改変し、蛍光によって視覚化し、適切なＣａｓｃａｄｅ−サブユニットに融合した機能ドメイン（それぞれ、ヌクレアーゼ、メチラーゼ、蛍光タンパク質、転写アクチベーターまたはリプレッサーなど）によって転写を活性化または抑制することができる。さらに、ＣａｓｃａｄｅのＲＮＡガイドＲＮＡ結合能により、蛍光Ｃａｓｃａｄｅ融合タンパク質を使用した生細胞内のＲＮＡ輸送のモニタリングが可能であり、宿主ｍＲＮＡを隔離または破壊して遺伝子発現レベルで宿主細胞を干渉する方法を提供する。

本発明の任意の方法では、標的核酸を、少なくとも１つの以下のヌクレオチドトリプレットの存在によって定義することができる（好ましくはｄｓＤＮＡの場合）：５’−ＣＴＴ−３’、５’−ＣＡＴ−３’、５’−ＣＣＴ−３’、または５’−ＣＴＣ−３’（または、標的がＲＮＡである場合、５’−ＣＵＵ−３’、５’−ＣＡＵ−３’、５’−ＣＣＵ−３’、または５’−ＣＴＣ−３’）。トリプレットの位置は、本発明のリボ核タンパク質のＲＮＡ分子成分がハイブリッド形成する配列に隣接する標的鎖内に存在する。トリプレットは、リボ核タンパク質のＲＮＡ分子成分との塩基対合が標的の５’→３’（下流）方向で起こらない標的鎖配列中のポイントを標識する（一方、本発明のリボ核タンパク質のＲＮＡ分子成分の好ましい長さのＲＮＡ配列に影響を受けるそのポイントから標的配列の上流で起こる）。未変性Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では、トリプレットは、「ＰＡＭ」（プロトスペーサー隣接モチーフ）として公知のものに対応する。ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ標的について、これらのトリプレットのうちの１つが存在する必要はあまりない。

本発明を、ここに、詳細且つ特定の例および図面を参照して記載するであろう。

図１は、Ｃａｓｃａｄｅが負のスーパーコイル（ｎＳＣ）プラスミドＤＮＡに結合するが弛緩したＤＮＡに結合しないゲルシフトアッセイの結果を示す。Ａ）ターゲティング（Ｊ３）ｃｒＲＮＡを含むＪ３−Ｃａｓｃａｄｅを使用したｎＳＣプラスミドＤＮＡのゲルシフト。ｐＵＣ−λを２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅと、１：０．５〜１：２５６のｐＵＣ−λ：Ｃａｓｃａｄｅモル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−λのみを含む。Ｂ）非ターゲティング（Ｒ４４）ｃＲＮＡを含むＲ４４−Ｃａｓｃａｄｅを使用した（Ａ）と同様のゲルシフト。Ｃ）Ｎｔ．ＢｓｐＱＩニッキングしたｐＵＣ−λを使用した（Ａ）と同様のゲルシフト。Ｄ）ＰｄｍＩ直鎖状化ｐＵＣ−λを使用した（Ａ）と同様のゲルシフト。Ｅ）遊離Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ濃度に対してプロットしたＪ３−ＣａｓｃａｄｅへのｐＵＣ−λ結合比のフィッティングにより、特異的結合の解離定数（Ｋｄ）が得られる。Ｆ）遊離Ｒ４４−Ｃａｓｃａｄｅ濃度に対してプロットしたＲ４４−ＣａｓｃａｄｅへのｐＵＣ−λ結合比のフィッティングにより、非特異的結合の解離定数（Ｋｄ）が得られる。Ｇ）プロトスペーサー配列中の固有のＢｓｍＩ制限部位を使用した制限分析によってモニタリングしたプロトスペーサーへのＣａｓｃａｄｅの特異的結合。レーン１および５はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および６はＣａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＢｓｍＩを添加したｐＵＣ−λを含む。レーン４および８は、ＢｓｍＩと混合したｐＵＣ−λを含む。Ｈ）Ｃａｓｃａｄｅに結合し、その後にプラスミドの１つの鎖をＮｔ．ＢｓｐＱＩ切断したｐＵＣ−λのゲルシフト。レーン１および６はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および８は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩニッキングしたｐＵＣ−λを含む。レーン４および９は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＲ−ループ中の置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを添加し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩでニッキングしたｐＵＣ−λを含む。レーン５および１０は、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩでニッキングしたｐＵＣ−λを含む。Ｈ）Ｃａｓｃａｄｅに結合し、その後にプラスミドをＮｔ．ＢｓｐＱＩニッキングしたｐＵＣ−λのゲルシフト。レーン１および６はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および８は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩ切断したｐＵＣ−λを含む。レーン４および９は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＲ−ループ中の置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを添加し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩで切断したｐＵＣ−λを含む。レーン５および１０は、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩで切断したｐＵＣ−λを含む。Ｉ）Ｃａｓｃａｄｅに結合し、その後にプラスミドの両鎖をＥｃｏＲＩ切断したｐＵＣ−λのゲルシフト。レーン１および６はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および８は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＥｃｏＲＩ切断したｐＵＣ−λを含む。レーン４および９は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＲ−ループ中の置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを添加し、その後にＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ−λを含む。レーン５および１０は、ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ−λを含む。 図１は、Ｃａｓｃａｄｅが負のスーパーコイル（ｎＳＣ）プラスミドＤＮＡに結合するが弛緩したＤＮＡに結合しないゲルシフトアッセイの結果を示す。Ａ）ターゲティング（Ｊ３）ｃｒＲＮＡを含むＪ３−Ｃａｓｃａｄｅを使用したｎＳＣプラスミドＤＮＡのゲルシフト。ｐＵＣ−λを２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅと、１：０．５〜１：２５６のｐＵＣ−λ：Ｃａｓｃａｄｅモル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−λのみを含む。Ｂ）非ターゲティング（Ｒ４４）ｃＲＮＡを含むＲ４４−Ｃａｓｃａｄｅを使用した（Ａ）と同様のゲルシフト。Ｃ）Ｎｔ．ＢｓｐＱＩニッキングしたｐＵＣ−λを使用した（Ａ）と同様のゲルシフト。Ｄ）ＰｄｍＩ直鎖状化ｐＵＣ−λを使用した（Ａ）と同様のゲルシフト。Ｅ）遊離Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ濃度に対してプロットしたＪ３−ＣａｓｃａｄｅへのｐＵＣ−λ結合比のフィッティングにより、特異的結合の解離定数（Ｋｄ）が得られる。Ｆ）遊離Ｒ４４−Ｃａｓｃａｄｅ濃度に対してプロットしたＲ４４−ＣａｓｃａｄｅへのｐＵＣ−λ結合比のフィッティングにより、非特異的結合の解離定数（Ｋｄ）が得られる。Ｇ）プロトスペーサー配列中の固有のＢｓｍＩ制限部位を使用した制限分析によってモニタリングしたプロトスペーサーへのＣａｓｃａｄｅの特異的結合。レーン１および５はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および６はＣａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＢｓｍＩを添加したｐＵＣ−λを含む。レーン４および８は、ＢｓｍＩと混合したｐＵＣ−λを含む。Ｈ）Ｃａｓｃａｄｅに結合し、その後にプラスミドの１つの鎖をＮｔ．ＢｓｐＱＩ切断したｐＵＣ−λのゲルシフト。レーン１および６はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および８は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩニッキングしたｐＵＣ−λを含む。レーン４および９は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＲ−ループ中の置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを添加し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩでニッキングしたｐＵＣ−λを含む。レーン５および１０は、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩでニッキングしたｐＵＣ−λを含む。Ｈ）Ｃａｓｃａｄｅに結合し、その後にプラスミドをＮｔ．ＢｓｐＱＩニッキングしたｐＵＣ−λのゲルシフト。レーン１および６はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および８は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩ切断したｐＵＣ−λを含む。レーン４および９は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＲ−ループ中の置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを添加し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩで切断したｐＵＣ−λを含む。レーン５および１０は、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩで切断したｐＵＣ−λを含む。Ｉ）Ｃａｓｃａｄｅに結合し、その後にプラスミドの両鎖をＥｃｏＲＩ切断したｐＵＣ−λのゲルシフト。レーン１および６はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および８は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＥｃｏＲＩ切断したｐＵＣ−λを含む。レーン４および９は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＲ−ループ中の置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを添加し、その後にＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ−λを含む。レーン５および１０は、ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ−λを含む。 図１は、Ｃａｓｃａｄｅが負のスーパーコイル（ｎＳＣ）プラスミドＤＮＡに結合するが弛緩したＤＮＡに結合しないゲルシフトアッセイの結果を示す。Ａ）ターゲティング（Ｊ３）ｃｒＲＮＡを含むＪ３−Ｃａｓｃａｄｅを使用したｎＳＣプラスミドＤＮＡのゲルシフト。ｐＵＣ−λを２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅと、１：０．５〜１：２５６のｐＵＣ−λ：Ｃａｓｃａｄｅモル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−λのみを含む。Ｂ）非ターゲティング（Ｒ４４）ｃＲＮＡを含むＲ４４−Ｃａｓｃａｄｅを使用した（Ａ）と同様のゲルシフト。Ｃ）Ｎｔ．ＢｓｐＱＩニッキングしたｐＵＣ−λを使用した（Ａ）と同様のゲルシフト。Ｄ）ＰｄｍＩ直鎖状化ｐＵＣ−λを使用した（Ａ）と同様のゲルシフト。Ｅ）遊離Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ濃度に対してプロットしたＪ３−ＣａｓｃａｄｅへのｐＵＣ−λ結合比のフィッティングにより、特異的結合の解離定数（Ｋｄ）が得られる。Ｆ）遊離Ｒ４４−Ｃａｓｃａｄｅ濃度に対してプロットしたＲ４４−ＣａｓｃａｄｅへのｐＵＣ−λ結合比のフィッティングにより、非特異的結合の解離定数（Ｋｄ）が得られる。Ｇ）プロトスペーサー配列中の固有のＢｓｍＩ制限部位を使用した制限分析によってモニタリングしたプロトスペーサーへのＣａｓｃａｄｅの特異的結合。レーン１および５はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および６はＣａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＢｓｍＩを添加したｐＵＣ−λを含む。レーン４および８は、ＢｓｍＩと混合したｐＵＣ−λを含む。Ｈ）Ｃａｓｃａｄｅに結合し、その後にプラスミドの１つの鎖をＮｔ．ＢｓｐＱＩ切断したｐＵＣ−λのゲルシフト。レーン１および６はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および８は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩニッキングしたｐＵＣ−λを含む。レーン４および９は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＲ−ループ中の置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを添加し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩでニッキングしたｐＵＣ−λを含む。レーン５および１０は、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩでニッキングしたｐＵＣ−λを含む。Ｈ）Ｃａｓｃａｄｅに結合し、その後にプラスミドをＮｔ．ＢｓｐＱＩニッキングしたｐＵＣ−λのゲルシフト。レーン１および６はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および８は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩ切断したｐＵＣ−λを含む。レーン４および９は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＲ−ループ中の置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを添加し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩで切断したｐＵＣ−λを含む。レーン５および１０は、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩで切断したｐＵＣ−λを含む。Ｉ）Ｃａｓｃａｄｅに結合し、その後にプラスミドの両鎖をＥｃｏＲＩ切断したｐＵＣ−λのゲルシフト。レーン１および６はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および８は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＥｃｏＲＩ切断したｐＵＣ−λを含む。レーン４および９は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＲ−ループ中の置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを添加し、その後にＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ−λを含む。レーン５および１０は、ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ−λを含む。 図１は、Ｃａｓｃａｄｅが負のスーパーコイル（ｎＳＣ）プラスミドＤＮＡに結合するが弛緩したＤＮＡに結合しないゲルシフトアッセイの結果を示す。Ａ）ターゲティング（Ｊ３）ｃｒＲＮＡを含むＪ３−Ｃａｓｃａｄｅを使用したｎＳＣプラスミドＤＮＡのゲルシフト。ｐＵＣ−λを２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅと、１：０．５〜１：２５６のｐＵＣ−λ：Ｃａｓｃａｄｅモル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−λのみを含む。Ｂ）非ターゲティング（Ｒ４４）ｃＲＮＡを含むＲ４４−Ｃａｓｃａｄｅを使用した（Ａ）と同様のゲルシフト。Ｃ）Ｎｔ．ＢｓｐＱＩニッキングしたｐＵＣ−λを使用した（Ａ）と同様のゲルシフト。Ｄ）ＰｄｍＩ直鎖状化ｐＵＣ−λを使用した（Ａ）と同様のゲルシフト。Ｅ）遊離Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ濃度に対してプロットしたＪ３−ＣａｓｃａｄｅへのｐＵＣ−λ結合比のフィッティングにより、特異的結合の解離定数（Ｋｄ）が得られる。Ｆ）遊離Ｒ４４−Ｃａｓｃａｄｅ濃度に対してプロットしたＲ４４−ＣａｓｃａｄｅへのｐＵＣ−λ結合比のフィッティングにより、非特異的結合の解離定数（Ｋｄ）が得られる。Ｇ）プロトスペーサー配列中の固有のＢｓｍＩ制限部位を使用した制限分析によってモニタリングしたプロトスペーサーへのＣａｓｃａｄｅの特異的結合。レーン１および５はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および６はＣａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＢｓｍＩを添加したｐＵＣ−λを含む。レーン４および８は、ＢｓｍＩと混合したｐＵＣ−λを含む。Ｈ）Ｃａｓｃａｄｅに結合し、その後にプラスミドの１つの鎖をＮｔ．ＢｓｐＱＩ切断したｐＵＣ−λのゲルシフト。レーン１および６はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および８は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩニッキングしたｐＵＣ−λを含む。レーン４および９は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＲ−ループ中の置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを添加し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩでニッキングしたｐＵＣ−λを含む。レーン５および１０は、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩでニッキングしたｐＵＣ−λを含む。Ｈ）Ｃａｓｃａｄｅに結合し、その後にプラスミドをＮｔ．ＢｓｐＱＩニッキングしたｐＵＣ−λのゲルシフト。レーン１および６はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および８は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩ切断したｐＵＣ−λを含む。レーン４および９は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＲ−ループ中の置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを添加し、その後にＮｔ．ＢｓｐＱＩで切断したｐＵＣ−λを含む。レーン５および１０は、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩで切断したｐＵＣ−λを含む。Ｉ）Ｃａｓｃａｄｅに結合し、その後にプラスミドの両鎖をＥｃｏＲＩ切断したｐＵＣ−λのゲルシフト。レーン１および６はｐＵＣ−λのみを含む。レーン２および７は、Ｃａｓｃａｄｅと混合したｐＵＣ−λを含む。レーン３および８は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＥｃｏＲＩ切断したｐＵＣ−λを含む。レーン４および９は、Ｃａｓｃａｄｅと混合し、その後にＲ−ループ中の置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを添加し、その後にＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ−λを含む。レーン５および１０は、ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ−λを含む。 図２は、どのようにしてＣａｓｃａｄｅがプロトスペーサー結合の際に標的ＤＮＡの屈曲を誘導するのかを証明する走査型力顕微鏡写真を示す。Ａ〜Ｐ）ターゲティング（Ｊ３）ｃｒＲＮＡを含むＪ３−Ｃａｓｃａｄｅを使用したｎＳＣプラスミドＤＮＡの走査型力顕微鏡イメージング。ｐＵＣ−λを、ｐＵＣ−λ：Ｃａｓｃａｄｅ比１：７でＪ３−Ｃａｓｃａｄｅと混合した。各画像は５００×５００ｎｍの表面積を示す。白点はＣａｓｃａｄｅに対応する。 図３は、どのようにしてＢｉＦＣ分析によって標的認識の際にＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３が相互作用することが明らかになるのかを示す。Ａ）ＣａｓｃａｄｅΔＣｓｅ１およびＣＲＩＳＰＲ ７Ｔｍ（λファージゲノム上の７つのプロトスペーサーをターゲティングする）ならびにＣｓｅｌ−Ｎ１５５ＶｅｎｕｓおよびＣａｓ３−Ｃ８５Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質を発現する細胞のＶｅｎｕｓ蛍光。Ｂ）（Ａ）における細胞の明視野画像。Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）の重ね合わせ。Ｄ）ＣａｓｃａｄｅΔＣｓｅ１およびＣＲＩＳＰＲ ７Ｔｍ、ならびにＣｓｅ１−Ｎ１５５ＶｅｎｕｓおよびＣａｓ３−Ｃ８５Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質を発現するλファージ感染細胞のＶｅｎｕｓ蛍光。Ｅ）（Ｇ）における細胞の明視野画像。Ｆ）（Ｇ）および（Ｈ）の重ね合わせ。 Ｇ）ＣａｓｃａｄｅΔＣｓｅ１および非ターゲティングＣＲＩＳＰＲ Ｒ４４、ならびにＮ１５５ＶｅｎｕｓおよびＣ８５Ｖｅｎｕｓタンパク質を発現するλファージ感染細胞のＶｅｎｕｓ蛍光。Ｈ）（Ｊ）における細胞の明視野画像。Ｉ）（Ｊ）および（Ｋ）の重ね合わせ。Ｊ）ＬＳＭ ｖｉｅｗｅｒ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）のプロファイルツールを使用して決定した各株の４〜７つの各細胞の蛍光強度の平均。 図３は、どのようにしてＢｉＦＣ分析によって標的認識の際にＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３が相互作用することが明らかになるのかを示す。Ａ）ＣａｓｃａｄｅΔＣｓｅ１およびＣＲＩＳＰＲ ７Ｔｍ（λファージゲノム上の７つのプロトスペーサーをターゲティングする）ならびにＣｓｅｌ−Ｎ１５５ＶｅｎｕｓおよびＣａｓ３−Ｃ８５Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質を発現する細胞のＶｅｎｕｓ蛍光。Ｂ）（Ａ）における細胞の明視野画像。Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）の重ね合わせ。Ｄ）ＣａｓｃａｄｅΔＣｓｅ１およびＣＲＩＳＰＲ ７Ｔｍ、ならびにＣｓｅ１−Ｎ１５５ＶｅｎｕｓおよびＣａｓ３−Ｃ８５Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質を発現するλファージ感染細胞のＶｅｎｕｓ蛍光。Ｅ）（Ｇ）における細胞の明視野画像。Ｆ）（Ｇ）および（Ｈ）の重ね合わせ。 Ｇ）ＣａｓｃａｄｅΔＣｓｅ１および非ターゲティングＣＲＩＳＰＲ Ｒ４４、ならびにＮ１５５ＶｅｎｕｓおよびＣ８５Ｖｅｎｕｓタンパク質を発現するλファージ感染細胞のＶｅｎｕｓ蛍光。Ｈ）（Ｊ）における細胞の明視野画像。Ｉ）（Ｊ）および（Ｋ）の重ね合わせ。Ｊ）ＬＳＭ ｖｉｅｗｅｒ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）のプロファイルツールを使用して決定した各株の４〜７つの各細胞の蛍光強度の平均。 図４は、ＣＲＩＳＰＲ−干渉中のＣａｓ３ヌクレアーゼおよびヘリカーゼ活性を示す。Ａ）Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃａｓ３変異体、およびＣＲＩＳＰＲ Ｊ３を発現するコンピテントＢＬ２１−ＡＩ細胞を、ｐＵＣ−λで形質転換した。１μｇのｐＵＣ−λあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／μｇ ＤＮＡ）を、Ｃａｓ３変異体を発現する各株について示す。ｗｔ Ｃａｓ３およびＣＲＩＳＰＲ Ｊ３またはＣＲＩＳＰＲ Ｒ４４を発現する細胞は、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとしての機能を果たす。Ｂ）Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃａｓ３変異体、およびＣＲＩＳＰＲをコードするプラスミドならびにｐＵＣ−λを保有するＢＬ２１−ＡＩ細胞を、ｃａｓ遺伝子群およびＣＲＩＳＰＲの発現を抑制する条件下で成長させる。ｔ＝０で発現を誘導する。アンピシリン感受性細胞とアンピシリン耐性細胞との比によって決定した経時的なｐＵＣ−λを喪失する細胞の百分率を示す。 図４は、ＣＲＩＳＰＲ−干渉中のＣａｓ３ヌクレアーゼおよびヘリカーゼ活性を示す。Ａ）Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃａｓ３変異体、およびＣＲＩＳＰＲ Ｊ３を発現するコンピテントＢＬ２１−ＡＩ細胞を、ｐＵＣ−λで形質転換した。１μｇのｐＵＣ−λあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／μｇ ＤＮＡ）を、Ｃａｓ３変異体を発現する各株について示す。ｗｔ Ｃａｓ３およびＣＲＩＳＰＲ Ｊ３またはＣＲＩＳＰＲ Ｒ４４を発現する細胞は、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとしての機能を果たす。Ｂ）Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃａｓ３変異体、およびＣＲＩＳＰＲをコードするプラスミドならびにｐＵＣ−λを保有するＢＬ２１−ＡＩ細胞を、ｃａｓ遺伝子群およびＣＲＩＳＰＲの発現を抑制する条件下で成長させる。ｔ＝０で発現を誘導する。アンピシリン感受性細胞とアンピシリン耐性細胞との比によって決定した経時的なｐＵＣ−λを喪失する細胞の百分率を示す。 図５は、どのようにしてＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体がｉｎ ｖｉｖｏ耐性を提供し、ｉｎ ｖｉｔｒｏヌクレアーゼ活性を有するかを示す。Ａ）精製したＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体のクーマシー・ブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｂ）Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体およびターゲティング（Ｊ３）または非ターゲティング（Ｒ４４）ＣＲＩＳＰＲを発現する細胞ならびにＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３をターゲティング（Ｊ３）ＣＲＩＳＰＲと共に個別に発現する細胞上のλファージのプラーク形成功率。Ｃ）Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体を使用したｎＳＣ標的プラスミドのゲルシフト（二価金属イオンの非存在下）。ｐＵＣ−λを２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３と、１：０．５〜１：１２８のｐＵＣ−λ：Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３モル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−λのみを含む。Ｄ）Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体を使用したｎＳＣ非標的プラスミドのゲルシフト（二価金属イオンの非存在下）。ｐＵＣ−ｐ７を２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３と、１：０．５〜１：１２８のｐＵＣ−ｐ７：Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３モル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−ｐ７のみを含む。Ｅ）１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２の存在下でのｎＳＣ標的プラスミド（ｐＵＣ−λ、左）またはｎＳＣ非標的プラスミド（ｐＵＣ−ｐ７、右）のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３とのインキュベーション。レーン１および７はプラスミドのみを含む。Ｆ）２ｍＭ ＡＴＰの存在下での（Ｅ）と同様のアッセイ。Ｇ）変異Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３Ｋ３２０Ｎ複合体を使用した（Ｅ）と同様のアッセイ。Ｈ）２ｍＭ ＡＴＰの存在下での（Ｇ）と同様のアッセイ。 図５は、どのようにしてＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体がｉｎ ｖｉｖｏ耐性を提供し、ｉｎ ｖｉｔｒｏヌクレアーゼ活性を有するかを示す。Ａ）精製したＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体のクーマシー・ブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｂ）Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体およびターゲティング（Ｊ３）または非ターゲティング（Ｒ４４）ＣＲＩＳＰＲを発現する細胞ならびにＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３をターゲティング（Ｊ３）ＣＲＩＳＰＲと共に個別に発現する細胞上のλファージのプラーク形成功率。Ｃ）Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体を使用したｎＳＣ標的プラスミドのゲルシフト（二価金属イオンの非存在下）。ｐＵＣ−λを２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３と、１：０．５〜１：１２８のｐＵＣ−λ：Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３モル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−λのみを含む。Ｄ）Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体を使用したｎＳＣ非標的プラスミドのゲルシフト（二価金属イオンの非存在下）。ｐＵＣ−ｐ７を２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３と、１：０．５〜１：１２８のｐＵＣ−ｐ７：Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３モル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−ｐ７のみを含む。Ｅ）１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２の存在下でのｎＳＣ標的プラスミド（ｐＵＣ−λ、左）またはｎＳＣ非標的プラスミド（ｐＵＣ−ｐ７、右）のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３とのインキュベーション。レーン１および７はプラスミドのみを含む。Ｆ）２ｍＭ ＡＴＰの存在下での（Ｅ）と同様のアッセイ。Ｇ）変異Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３Ｋ３２０Ｎ複合体を使用した（Ｅ）と同様のアッセイ。Ｈ）２ｍＭ ＡＴＰの存在下での（Ｇ）と同様のアッセイ。 図５は、どのようにしてＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体がｉｎ ｖｉｖｏ耐性を提供し、ｉｎ ｖｉｔｒｏヌクレアーゼ活性を有するかを示す。Ａ）精製したＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体のクーマシー・ブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｂ）Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体およびターゲティング（Ｊ３）または非ターゲティング（Ｒ４４）ＣＲＩＳＰＲを発現する細胞ならびにＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３をターゲティング（Ｊ３）ＣＲＩＳＰＲと共に個別に発現する細胞上のλファージのプラーク形成功率。Ｃ）Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体を使用したｎＳＣ標的プラスミドのゲルシフト（二価金属イオンの非存在下）。ｐＵＣ−λを２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３と、１：０．５〜１：１２８のｐＵＣ−λ：Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３モル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−λのみを含む。Ｄ）Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体を使用したｎＳＣ非標的プラスミドのゲルシフト（二価金属イオンの非存在下）。ｐＵＣ−ｐ７を２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３と、１：０．５〜１：１２８のｐＵＣ−ｐ７：Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３モル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−ｐ７のみを含む。Ｅ）１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２の存在下でのｎＳＣ標的プラスミド（ｐＵＣ−λ、左）またはｎＳＣ非標的プラスミド（ｐＵＣ−ｐ７、右）のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３とのインキュベーション。レーン１および７はプラスミドのみを含む。Ｆ）２ｍＭ ＡＴＰの存在下での（Ｅ）と同様のアッセイ。Ｇ）変異Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３Ｋ３２０Ｎ複合体を使用した（Ｅ）と同様のアッセイ。Ｈ）２ｍＭ ＡＴＰの存在下での（Ｇ）と同様のアッセイ。 図５は、どのようにしてＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体がｉｎ ｖｉｖｏ耐性を提供し、ｉｎ ｖｉｔｒｏヌクレアーゼ活性を有するかを示す。Ａ）精製したＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体のクーマシー・ブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｂ）Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体およびターゲティング（Ｊ３）または非ターゲティング（Ｒ４４）ＣＲＩＳＰＲを発現する細胞ならびにＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３をターゲティング（Ｊ３）ＣＲＩＳＰＲと共に個別に発現する細胞上のλファージのプラーク形成功率。Ｃ）Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体を使用したｎＳＣ標的プラスミドのゲルシフト（二価金属イオンの非存在下）。ｐＵＣ−λを２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３と、１：０．５〜１：１２８のｐＵＣ−λ：Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３モル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−λのみを含む。Ｄ）Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体を使用したｎＳＣ非標的プラスミドのゲルシフト（二価金属イオンの非存在下）。ｐＵＣ−ｐ７を２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３と、１：０．５〜１：１２８のｐＵＣ−ｐ７：Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３モル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−ｐ７のみを含む。Ｅ）１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２の存在下でのｎＳＣ標的プラスミド（ｐＵＣ−λ、左）またはｎＳＣ非標的プラスミド（ｐＵＣ−ｐ７、右）のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３とのインキュベーション。レーン１および７はプラスミドのみを含む。Ｆ）２ｍＭ ＡＴＰの存在下での（Ｅ）と同様のアッセイ。Ｇ）変異Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３Ｋ３２０Ｎ複合体を使用した（Ｅ）と同様のアッセイ。Ｈ）２ｍＭ ＡＴＰの存在下での（Ｇ）と同様のアッセイ。 図５は、どのようにしてＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体がｉｎ ｖｉｖｏ耐性を提供し、ｉｎ ｖｉｔｒｏヌクレアーゼ活性を有するかを示す。Ａ）精製したＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体のクーマシー・ブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｂ）Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体およびターゲティング（Ｊ３）または非ターゲティング（Ｒ４４）ＣＲＩＳＰＲを発現する細胞ならびにＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３をターゲティング（Ｊ３）ＣＲＩＳＰＲと共に個別に発現する細胞上のλファージのプラーク形成功率。Ｃ）Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体を使用したｎＳＣ標的プラスミドのゲルシフト（二価金属イオンの非存在下）。ｐＵＣ−λを２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３と、１：０．５〜１：１２８のｐＵＣ−λ：Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３モル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−λのみを含む。Ｄ）Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体を使用したｎＳＣ非標的プラスミドのゲルシフト（二価金属イオンの非存在下）。ｐＵＣ−ｐ７を２倍ずつ増加する量のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３と、１：０．５〜１：１２８のｐＵＣ−ｐ７：Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３モル比で混合した。最初および最後のレーンはｐＵＣ−ｐ７のみを含む。Ｅ）１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２の存在下でのｎＳＣ標的プラスミド（ｐＵＣ−λ、左）またはｎＳＣ非標的プラスミド（ｐＵＣ−ｐ７、右）のＪ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３とのインキュベーション。レーン１および７はプラスミドのみを含む。Ｆ）２ｍＭ ＡＴＰの存在下での（Ｅ）と同様のアッセイ。Ｇ）変異Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３Ｋ３２０Ｎ複合体を使用した（Ｅ）と同様のアッセイ。Ｈ）２ｍＭ ＡＴＰの存在下での（Ｇ）と同様のアッセイ。 図６は、大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲ−干渉Ｉ型経路モデルを示す略図である。 図７は、非相同末端結合過程または相同組換え過程の一部としてどのようにして本発明のＣａｓｃａｄｅ−ＦｏｋＩ融合実施形態を使用してＦｏｋＩ二量体を作製し、これがｄｓＤＮＡを切断して平滑末端を生成するのかを示す略図である。 図８は、どのようにしてＢｉＦＣ分析によって標的認識の際にＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３が相互作用することが明らかになるのかを示す。Ｃｓｅ１を持たないＣａｓｃａｄｅ、Ｃｓｅ１−Ｎ１５５Ｖｅｎｕｓ、およびＣａｓ３−Ｃ８５ＶｅｎｕｓならびにＣＲＩＳＰＲ ７Ｔｍ（λファージゲノム上の７つのプロトスペーサーをターゲティングする）または非ターゲティングＣＲＩＳＰＲ Ｒ４４のいずれかを発現する細胞の明視野画像およびＶｅｎｕｓ蛍光の重ね合わせ。ＣＲＩＳＰＲ ７Ｔｍを発現する細胞はλファージに感染した場合のみ蛍光性を示す一方で、ＣＲＩＳＰＲ Ｒ４４発現細胞は非蛍光である。高強度蛍光点（細胞外）は、光反射塩結晶に起因する。白色バーは１０ミクロンに対応する。 図９は、ＣＲＩＳＰＲ Ｊ３、Ｃａｓｃａｄｅ、およびＣａｓ３（ｗｔまたはＳ４８３ＡＴ４８５Ａ）をコードする４クローンのｐＵＣ−λ配列（配列番号３９〜４２）を示す。これらはプロトスペーサーの（部分的）欠失を保有するかシード領域中に単一の点変異を保有するエスケープ変異体であることを示し、これらのプラスミドをキュアリングする能力がないことを説明している。 図１０は、Ｉ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む生物由来のｃａｓ３遺伝子の配列アラインメントを示す。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＰＢ７８（第１の配列、受入番号：ＺＰ＿０７２７２６４３．１）（配列番号４３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（第２の配列、受入番号 ＹＰ＿００１８２５０５４）（配列番号４４）、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ ＤＳＭ ４４９２８（第３の配列、受入番号 ＹＰ＿００３１１４６３８）（配列番号４５）、およびＳ．ｇｒｉｓｅｕｓ由来のポリペプチドリンカー配列を含む人工大腸菌Ｃａｓ３−Ｃｓｅ１融合タンパク質（配列番号４６）由来のｃａｓ３−ｃｓｅ１遺伝子のアラインメント。 図１０は、Ｉ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む生物由来のｃａｓ３遺伝子の配列アラインメントを示す。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＰＢ７８（第１の配列、受入番号：ＺＰ＿０７２７２６４３．１）（配列番号４３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（第２の配列、受入番号 ＹＰ＿００１８２５０５４）（配列番号４４）、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ ＤＳＭ ４４９２８（第３の配列、受入番号 ＹＰ＿００３１１４６３８）（配列番号４５）、およびＳ．ｇｒｉｓｅｕｓ由来のポリペプチドリンカー配列を含む人工大腸菌Ｃａｓ３−Ｃｓｅ１融合タンパク質（配列番号４６）由来のｃａｓ３−ｃｓｅ１遺伝子のアラインメント。 図１１は、ＫＫＲおよびＥＬＤヌクレアーゼドメインからなるヘテロ二量体のみが存在し、反対の結合部位間の距離がＣａｓｃａｄｅヌクレアーゼ対間の最適な距離が決定されるように変動することができるようにＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが変異したＣａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}ヌクレアーゼ対のデザインを示す。 図１２は、Ｃａｓｃａｄｅ−ＦｏｋＩヌクレアーゼ対によるゲノムターゲティングを示す略図である。 図１３は、Ｃａｓｃａｄｅ−ヌクレアーゼ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 図１４は、プラスミドＤＮＡにおけるＣａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイの電気泳動ゲルを示す。 図１５は、Ｃａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}の切断パターンおよび頻度を示す（配列番号４７）。

実施例−使用した材料および方法
株、遺伝子クローニング、プラスミド、およびベクター

本研究を通して大腸菌 ＢＬ２１−ＡＩ株および大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用した。表１は、本研究で使用した全プラスミドを列挙している。以前に記載のｐＷＵＲ４０８、ｐＷＵＲ４８０、ｐＷＵＲ４０４、およびｐＷＵＲ５４７をＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ Ｒ４４−Ｃａｓｃａｄｅの産生のために使用し、ｐＷＵＲ４０８、ｐＷＵＲ５１４、およびｐＷＵＲ６３０をＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅの産生のために使用した（Ｊｏｒｅら，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，５２９−５３６；Ｓｅｍｅｎｏｖａら，（２０１１）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０８，１００９８−１０１０３）。ｐＵＣ−λ（ｐＷＵＲ６１０）およびｐＵＣ−ｐ７（ｐＷＵＲ６１３）は、他で記載されている（Ｊｏｒｅら、２０１１；Ｓｅｍｅｎｏｖａら、２０１１）。Ｃ８５Ｖｅｎｕｓタンパク質は、ｐＷＵＲ６４７（ＢａｍＨＩ部位とＮｏｔＩ部位との間でクローン化された合成ＧＡ１０７０９４３構築物（表２）（Ｇｅｎｅａｒｔ）を含むｐＥＴ５２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に対応する）によってコードされる。Ｎ１５５Ｖｅｎｕｓタンパク質は、ｐＷＵＲ６４８（ＮｏｔＩ部位とＸｈｏＩ部位との間でクローン化された合成ＧＡ１０７０９４１構築物（表２）（Ｇｅｎｅａｒｔ）を含むｐＲＳＦ１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に対応する）によってコードされる。Ｃａｓ３−Ｃ８５Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質は、ｐＷＵＲ６４９（ＮｃｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にプライマーＢＧ３１８６およびＢＧ３２１３（表３）を使用したＣａｓ３増幅産物を含むｐＷＵＲ６４７に対応する）によってコードされる。ＣａｓＡ−Ｎ１５５Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質は、ｐＷＵＲ６５０（ＮｃｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にプライマーＢＧ３３０３およびＢＧ３２１２（表３）を使用したＣａｓＡ増幅産物を含むｐＷＵＲ６４８に対応する）によってコードされる。ＣＲＩＳＰＲ ７Ｔｍは、ｐＷＵＲ６５１（ＮｃｏＩ部位とＫｐｎＩ部位との間でクローン化された合成ＧＡ１０６８８５９構築物（表２）（Ｇｅｎｅａｒｔ）を含むｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）に対応する）によってコードされる。ＣａｓｃａｄｅをコードするｐＷＵＲ４００、ＣａｓｃａｄｅΔＣｓｅ１をコードするＷＵＲ４０１、およびＣａｓ３をコードするｐＷＵＲ３９７は、以前に記載されていた（Ｊｏｒｅら，２０１１）。Ｃａｓ３Ｈ７４ＡをコードするｐＷＵＲ６５２を、プライマーＢＧ３０９３、ＢＧ３０９４（表３）を使用したｐＷＵＲ３９７の部位特異的変異誘発を使用して構築した。

上記表中の供給元１は、Ｂｒｏｕｎｓら（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１，９６０−９６４である。

上記表中の供給元２はＪｏｒｅら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８：５２９−５３７である。

タンパク質の産生および精製
Ｃａｓｃａｄｅを、記載のように発現および精製した（Ｊｏｒｅら、２０１１）。精製を通して、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液を、再懸濁および洗浄のために使用した。４ｍＭ デスチオビオチンを含む同一の緩衝液中でタンパク質溶離を行った。Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体を同一の様式で発現および精製し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＤＴＴを使用して洗浄工程を行い、４ｍＭデスチオビオチンを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴで溶離した。

電気泳動移動度シフトアッセイ
精製したＣａｓｃａｄｅまたはＣａｓｃａｄｅサブ複合体を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中でｐＵＣ−λと混合し、３７℃で１５分間インキュベーションした。サンプルを０．８％ＴＡＥアガロースゲル上で一晩泳動し、ＳｙｂＲ ｓａｆｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＴＡＥでの１００００倍希釈物で３０分間後染色した。ＢｓｍＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）またはＮｔ．ＢｓｐＱＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）での切断を、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を補足したＨＥＰＥＳ反応緩衝液中で行った。

走査型力顕微鏡法
精製したＣａｓｃａｄｅを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＤＴＴ、０．３ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中でｐＵＣ−λ（７：１の比、２５０ｎＭ Ｃａｓｃａｄｅ、３５ｎＭ ＤＮＡ）と混合し、３７℃で１５分間インキュベーションした。その後、ＡＦＭサンプル調製のために、インキュベーション混合物を、２回蒸留水で１０倍希釈し、最終濃度１．２ｍＭまでＭｇＣｌ_２を添加した。タンパク質−ＤＮＡ複合体の沈着およびイメージングを以前に記載のように行った（Ｄａｍｅら，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：３５０４−３５１０）。

蛍光顕微鏡法
ＣＲＩＳＰＲ ｅｎ ｃａｓ遺伝子をコードするプラスミドを保有するＢＬ２１−ＡＩ細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ）中にて３７℃で一晩成長させた。一晩培養物を新鮮な抗生物質含有ＬＢで１００倍希釈し、３７℃で１時間成長させた。ｃａｓ遺伝子群およびＣＲＩＳＰＲの発現を、最終濃度０．２％のＬ−アラビノースおよび最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって１時間誘導した。感染のために、細胞を感染多重度（ＭＯＩ）４でλファージと混合した。細胞をポリ−Ｌ−リジン被覆顕微鏡スライドに適用し、４０倍油浸対物レンズ（開口数１．３）、励振源（５１４ｎｍ）としてのアルゴンレーザー、および５３０〜６００ｎｍでの検出を使用したＡｘｉｏｖｅｒｔ倒立顕微鏡に基づいてＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共焦点レーザ走査型顕微鏡を使用して分析した。全測定のためにピンホールを２０３μｍに設定した。

ｐＵＣ−λ形質転換研究
カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含むＬＢに一晩前接種材料を接種し、０．３のＯＤ_６００まで成長させた。ｃａｓ遺伝子群およびＣＲＩＳＰＲの発現を、０．２％Ｌ−アラビノースおよび１ｍＭ ＩＰＴＧで４５分間誘導した。細胞を４℃の遠心分離によって回収し、１００ｍＭ ＲｂＣｌ_２、５０ｍＭ ＭｎＣｌ_２、３０ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、および１５％グリセロール（ｐＨ５．８）を含む氷冷緩衝液での再懸濁によってコンピテントにした。インキュベーション３時間後、細胞を回収し、１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ ＲｂＣｌ、７５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１５％グリセロール（ｐＨ６．８）を含む緩衝液に再懸濁した。８０ｎｇのｐＵＣ−λを添加し、その後に４２℃で１分間熱ショックを与え、氷上で５分間寒冷ショックを与えることによって形質転換させた。次に、細胞をＬＢ中にて３７℃で４５分間成長させ、０．２％Ｌ−アラビノース、１ｍＭ ＩＰＴＧ、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ−寒天プレート上にプレートした。

プラスミドキュアリングを、ｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲをコードするプラスミドを含むＢＬ２１−ＡＩ細胞をｐＵＣ−λで形質転換する一方で、Ｔ７−ポリメラーゼ遺伝子の発現を抑制するために０．２％グルコースの存在下でこの細胞を成長させることによって分析した。ｃａｓ遺伝子群およびＣＲＩＳＰＲの発現を、細胞の回収ならびに０．２％アラビノースおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢでの再懸濁によって誘導した。細胞を、ストレプトマイシン、カナマイシン、およびクロラムフェニコール（ｐＵＣ−λ非感受性）またはアンピシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、およびクロラムフェニコール（ｐＵＣ−λ感受性）のいずれかを含むＬＢ−寒天上にプレートした。一晩の成長後、プラスミド喪失率を、選択的プレートおよび非選択的プレート上のコロニー形成単位の比から計算することができる。

λファージ感染研究
ファージ感染に対する宿主感受性を、（Ｂｒｏｕｎｓら（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１，９６０−９６４）において見られるように病原性λファージ（λ_ｖｉｒ）を使用して試験した。宿主の感染感受性を、Ｂｒｏｕｎｓら（２００８）に記載のようにプラーク形成効率（アンチ−λ ＣＲＩＳＰＲを含む株の非ターゲティングＲ４４ ＣＲＩＳＰＲを含む株に対するプラーク数の比）として計算した。

実施例１−Ｃａｓｃａｄｅは負のスーパーコイル標的ＤＮＡに排他的に結合する

ｐＵＣ−λと示す３ｋｂのｐＵＣ１９由来のプラスミドは、Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ（スペーサーＪ３を含むｃｒＲＮＡに会合したＣａｓｃａｄｅ（Ｗｅｓｔｒａら（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７７，１３８０−１３９３））によってターゲティングされるλファージのＪ遺伝子の一部に対応する３５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを含む。電気泳動移動度シフトアッセイは、Ｃａｓｃａｄｅが負のスーパーコイル（ｎＳＣ）標的プラスミドのみに対して高親和性を有することを示す。６：１のＪ３−ＣａｓｃａｄｅのｐＵＣ−λに対するモル比で、全ｎＳＣプラスミドはＣａｓｃａｄｅによって結合された一方で（図１Ａを参照のこと）、非ターゲティングｃｒＲＮＡ Ｒ４４を保有するＣａｓｃａｄｅ（Ｒ４４−Ｃａｓｃａｄｅ）は１２８：１のモル比で非特異的結合を示した（図１Ｂを参照のこと）。ｎＳＣ ｐＵＣ−λの解離定数（Ｋｄ）は、Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅについては１３±１．４ｎＭ（図１Ｅを参照のこと）、Ｒ４４−Ｃａｓｃａｄｅについては４２９±１５２ｎＭ（図１Ｆを参照のこと）であると決定された。

Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅは、弛緩した標的ＤＮＡ（ニッキングしたｐＵＣ−λ（図１Ｃを参照のこと）または直鎖状ｐＵＣ−λ（図１Ｄを参照のこと）など）と測定可能な親和性で結合することができなかった。これは、ＣａｓｃａｄｅがｎＳＣトポロジーを有するより大きなＤＮＡ基質に対して高親和性を有することを示した。

非特異的結合を特異的結合と区別するために、プロトスペーサー内に存在するＢｓｍＩ制限部位を使用した。ＢｓｍＩ酵素のｐＵＣ−λへの添加によってＲ４４−Ｃａｓｃａｄｅの存在下で直鎖状産物が得られる一方で（図１Ｇ、レーン４を参照のこと）、ｐＵＣ−λがＪ３−Ｃａｓｃａｄｅの存在下でのＢｓｍＩ切断から保護され（図１Ｇ、レーン７を参照のこと）、これはプロトスペーサーへの特異的結合を示す。これは、Ｃａｓ３がｎＳＣプラスミド中のＣａｓｃａｄｅのプロトスペーサー配列へのｉｎ ｖｉｔｒｏ配列特異的結合に必要ないことを示す。

ｎＳＣ ｐＵＣ−λへのＣａｓｃａｄｅ結合後のＮｔ．ＢｓｐＱＩでのニッキングによってＯＣトポロジーを得た。移動度シフトが存在しないことから認められるように、Ｃａｓｃａｄｅは鎖ニッキング後にプラスミドから放出される（図１Ｈを参照し、レーン８とレーン１０とを比較のこと）。対照的に、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩによるＤＮＡ切断前に置換鎖に相補的なｓｓＤＮＡプローブを反応物に添加した場合に、ＣａｓｃａｄｅはそのＤＮＡ標的に結合したままである（図１Ｈレーン９を参照のこと）。プローブは、弛緩した標的ＤＮＡ上のＣａｓｃａｄｅ Ｒ−ループを人為的に安定化する。Ｃａｓｃａｄｅ結合後にｐＵＣ−λの両ＤＮＡ鎖を切断した場合に類似の所見が認められる（図１Ｉ、レーン８およびレーン９を参照のこと）。

実施例２−Ｃａｓｃａｄｅは結合した標的ＤＮＡの屈曲を誘導する

精製したＣａｓｃａｄｅおよびｐＵＣ−λとの間に形成された複合体を視覚化した。単一の結合Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ複合体を含む特異的複合体が形成された一方で、非特異的Ｒ４４−Ｃａｓｃａｄｅによって同一条件下でのこのアッセイにおいてＤＮＡ結合複合体は得られない。８１のＤＮＡ分子のうちの７６％がＪ３−Ｃａｓｃａｄｅに結合していたことが見出された（図２Ａ〜Ｐを参照のこと）。これらの複合体のうち、ほとんどの場合、Ｃａｓｃａｄｅはループの頂点で見出されたのに対して（８６％）、非頂点に小画分のみが見出された（１４％）。これらのデータは、Ｃａｓｃａｄｅ結合によってＤＮＡが屈曲しておそらく包み込まれ、高い確率でＤＮＡ二重鎖の局所融解を容易にすることを示している。

実施例３−Ｃａｓ３およびＣｓｅ１の天然に存在する融合物：Ｃａｓ３はプロトスペーサー認識の際にＣａｓｃａｄｅと相互作用する

図Ｓ３は、Ｉ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む生物由来のｃａｓ３遺伝子の配列分析がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＰＢ７８（受入番号：ＺＰ＿０７２７２６４３．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（受入番号 ＹＰ＿００１８２５０５４）、およびＣａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ ＤＳＭ ４４９２８（受入番号 ＹＰ＿００３１１４６３８）においてＣａｓ３およびＣｓｅ１が融合タンパク質として生じることを明らかにしていることを示す。

実施例４−二分子蛍光補完法（ＢｉＦＣ）は、どのようにしてＣａｓｃａｄｅのＣｓｅ１融合タンパク質形成部分がＣａｓ３と相互作用し続けるかを示す

ＢｉＦＣ実験を使用して、λファージ感染前後のｉｎ ｖｉｖｏでのＣａｓ３とＣａｓｃａｄｅとの間の相互作用をモニタリングした。ＢｉＦＣ実験は、蛍光タンパク質（例えは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ））の非蛍光の半分が、この２つの半分が近接近で生じる場合に、再折りたたみされて蛍光分子を形成する能力に依存する。そのようなものとして、局所濃度が高い場合（例えば、蛍光タンパク質の２つの半分が相互作用パートナーに融合する場合）に再折りたたみ効率が非常に増大するので、ＢｉＦＣ実験はタンパク質間相互作用を明らかにするためのツールを提供する。Ｃｓｅ１を、Ｃ末端でＶｅｎｕｓのＮ末端の１５５アミノ酸と融合した（Ｃｓｅ１−Ｎ１５５Ｖｅｎｕｓ）（ＹＦＰの改良バージョン）（Ｎａｇａｉら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，８７−９０）。Ｃａｓ３をＣ末端でＶｅｎｕｓのＣ末端８５アミノ酸に融合した（Ｃａｓ３−Ｃ８５Ｖｅｎｕｓ）。

ＢｉＦＣ分析により、Ｃａｓｃａｄｅが侵入ＤＮＡの非存在下でＣａｓ３と相互作用しないことが明らかである（図３ＡＢＣ、図３Ｐ、および図８）。しかし、λファージ感染の際、ＣａｓｃａｄｅΔＣｓｅｌ、Ｃｓｅｌ−Ｎ１５５Ｖｅｎｕｓ、およびＣａｓ３−Ｃ８５Ｖｅｎｕｓを発現する細胞は、これらがアンチ−λ ＣＲＩＳＰＲ ７Ｔｍを同時発現する場合に蛍光性を示す（図３ＤＥＦ、図３Ｐ、および図８）。これらの細胞が非ターゲティングＣＲＩＳＰＲ Ｒ４４を同時発現する場合（図３ＧＨＩ、図３Ｐ、および図８）、細胞は非蛍光性のままである。これは、ＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３がプロトスペーサー認識の際に感染中に特異的に相互作用すること、および、Ｃｓｅ１およびＣａｓ３がＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３二元エフェクター複合体中で相互に近接近していることを示す。

これらの結果はまた、Ｃｓｅ１の異種タンパク質との融合物がＣａｓｃａｄｅおよびｃｒＲＮＡのリボ核タンパク質形成を破壊せず、Ｃａｓ３自体も融合タンパク質である場合でさえＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３の標的ファージＤＮＡとの相互作用を破壊することもないことを非常に明確に示す。

実施例５−デザインされたＣａｓ３−Ｃｓｅ１融合物の調製によりｉｎ ｖｉｖｏ機能活性を有するタンパク質が得られる

Ｃａｓ３ ＤＮＡ切断活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで証明するには精製された活性Ｃａｓ３が必要であった。種々の可溶化ストラテジーにもかかわらず、大腸菌ＢＬ２１内で過剰産生されたＣａｓ３（Ｈｏｗａｒｄら（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４３９、８５−９５）は主に不活性凝集物および封入体中に存在する。したがって、Ｃａｓ３は、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓにおけるＣａｓ３−Ｃｓｅ１融合タンパク質のリンカーと同一のリンカーを含むＣａｓ３−Ｃｓｅ１融合タンパク質として産生された（図１０を参照のこと）。ＣａｓｃａｄｅΔＣｓｅ１およびＣＲＩＳＰＲ Ｊ３と同時発現した場合、融合複合体は可溶性を示し、Ｃａｓｃａｄｅと同一の見かけ上の化学量論にて高純度で得られた（図５Ａ）。この複合体の機能性を、λファージ感染に対する耐性を提供することについて試験した場合、融合複合体Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３を発現する細胞におけるプラーク形成効率（ｅｏｐ）は、個別のタンパク質を発現する細胞におけるｅｏｐと同一であった（図５Ｂ）。

Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体がｉｎ ｖｉｖｏで機能的であったので、この複合体を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ切断アッセイを行った。Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３を二価金属の非存在下でｐＵＣ−λとインキュベーションした場合、Ｃａｓｃａｄｅで認められたモル比と類似のモル比でプラスミド結合が認められた一方で（図５Ｃ）、非標的プラスミド（ｐＵＣ−ｐ７、ｐＵＣ−λと同一サイズのｐＵＣ１９由来のプラスミドであるが、プロトスペーサーを欠く）への非特異的結合は高モル比のみで起こった（図５Ｄ）。これは、複合体への非特異的ＤＮＡ結合もＣａｓｃａｄｅのみのものと類似することを示している。

興味深いことに、Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３融合複合体は、ｎＳＣ標的プラスミドに対してマグネシウム依存性エンドヌクレアーゼ活性を示す。１０ｍＭ Ｍｇ^２＋の存在下では、Ｊ３−Ｃａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３はｎＳＣ ｐＵＣ−λをニッキングするが（図５Ｅ、レーン３〜７）、標的配列を含まないか（図５Ｅ、レーン９〜１３）弛緩トポロジーを有する基質では切断は認められない。得られたＯＣバンドのシフトは認められず、ＡＴＰ依存性Ｃａｓ３ヘリカーゼ活性を必要とせずに切断後にＣａｓｃａｄｅが自発的に解離するという以前の所見と一致する。その代わりとして、Ｃａｓ３のヘリカーゼ活性は、末端から１ヌクレオチドずつの分解による（exonucleolytic）プラスミド分解に関与するようである。マグネシウムおよびＡＴＰの両方を反応物に添加する場合、完全なプラスミド分解が生じた（図５Ｈ）。

本発明者らは、Ｃａｓｃａｄｅのみでは弛緩したＤＮＡ上にプロトスペーサーを結合することができないことを見出した。対照的に、本発明者らは、Ｃａｓｃａｄｅが負のスーパーコイルＤＮＡ中の標的を効率的に位置づけ、その後にＣｓｅ１サブユニットを介してＣａｓ３を動員することを見出した。Ｃａｓ３ ＨＤ−ヌクレアーゼドメインによる内ヌクレオチド結合分解性切断により、スーパーコイル化の喪失によってＤＮＡからＣａｓｃａｄｅを自発的に放出させ、Ｃａｓｃａｄｅを再可動化して新規の標的を位置づける。次いで、Ｃａｓ３の共同のＡＴＰ依存性ヘリカーゼ活性およびＨＤ−ヌクレアーゼ活性によってこの標的が徐々に巻き戻されて切断され、それにより、侵入者の標的ＤＮＡが完全に分解および中和される。

図６に関して、いかなる特定の理論に拘束されることを望まないが、大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲ−干渉Ｉ型経路の操作機構は、（１）第１に、ｃｒＲＮＡを保有するＣａｓｃａｄｅが隣接ＰＡＭを使用してプロトスペーサーについてｎＳＣプラスミドＤＮＡをスキャニングする工程を含み得る。この段階中に鎖分離が起こるかどうかは知られていない。（２）ｃｒＲＮＡとＤＮＡの相補鎖との間の塩基対合によって配列特異的プロトスペーサー結合が起こり、Ｒ−ループが形成される。結合の際、ＣａｓｃａｄｅはＤＮＡの屈曲を誘導する。（３）ＣａｓｃａｄｅのＣｓｅ１サブユニットはＤＮＡ結合の際にＣａｓ３を動員する。核酸結合の際に起こるＣａｓｃａｄｅの高次構造の変化によってこれを果たすことができる。（４）Ｃａｓ３のＨＤ−ドメイン（暗色部分）はＲ−ループの置換鎖のＭｇ^２＋依存性ニッキングを触媒し、それにより、標的プラスミドのトポロジーをｎＳＣから弛緩したＯＣに変化させる（５ａおよび５ｂ）。プラスミド弛緩により、Ｃａｓｃａｄｅが自発的に解離する。一方、Ｃａｓ３は、標的プラスミドに対するＡＴＰ依存性エキソヌクレアーゼ活性を示し、これには標的ｄｓＤＮＡの巻き戻しのためのヘリカーゼドメインおよび連続切断活性のためのＨＤ−ヌクレアーゼドメインが必要である。（６）Ｃａｓ３は、標的ｄｓＤＮＡに沿って徐々に移動し、巻き戻し、切断するにつれてＡＴＰ依存性様式で全プラスミドを分解する。

実施例６−人工Ｃａｓ−ｓｔｒｅｐタグ融合タンパク質の調製およびＣａｓｃａｄｅ複合体のアセンブリ

Ｃａｓｃａｄｅ複合体を、Ｊｏｒｅら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８：５２９−５３７の補足表３に列挙した発現プラスミドを使用して、Ｂｒｏｕｎｓら（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０−４（２００８）に記載のように産生および精製する。Ｃａｓｃａｄｅを、ＣａｓＢ（またはＣａｓＣＤＥ中のＣａｓＣ）に融合したＮ末端Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩを使用して日常的に精製する。サイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０（ＧＥ））を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）を使用して行う。Ｃａｓｃａｄｅ調製物（約０．３ｍｇ）を、ＤＮアーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２の存在下にて３７℃で１５分間インキュベーション後、サイズ排除分析する。同時精製された核酸を、等体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）（ｐＨ８．０）（Ｆｌｕｋａ）を使用した抽出によって単離し、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を補足したＤＮアーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲＮアーゼＡ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）のいずれかと３７℃で１０分間インキュベーションする。Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇのアミノ酸配列に融合したＣａｓサブユニットタンパク質を産生する。

Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ Ｃａｓｃａｄｅサブユニットの生物学的活性を示すプラークアッセイをバクテリオファージλを使用して行い、プラーク形成効率（ＥＯＰ）をＢｒｏｕｎｓら（２００８）に記載のように計算した。

ｃｒＲＮＡの精製のために、サンプルを、ＤＮＡｓｅｐカラム５０ｍｍ×４．６ｍｍ（内径）（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用したＵＶ_{２６０ｎｍ}検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣでのイオン対逆相ＨＰＬＣによって分析する。クロマトグラフ分析を、以下の緩衝液条件を使用して行う：Ａ）０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセタート（ＴＥＡＡ）（ｐＨ７．０）（Ｆｌｕｋａ）；Ｂ）２５％ＬＣ ＭＳグレードのアセトニトリル（ｖ／ｖ）（Ｆｉｓｈｅｒ）を有する緩衝液Ａ。ｃｒＲＮＡを、１．０ｍｌ／分の流速で１５％緩衝液Ｂから開始した１２．５分間で６０％Ｂまで及ぶ直線勾配、その後の２分間にわたる１００％Ｂまでの線形増加を使用した７５℃での精製したインタクトなＣａｓｃａｄｅの注入によって得る。環状リン酸末端の加水分解を、最終濃度０．１ＭのＨＣｌ中にて４℃で１時間のＨＰＬＣ精製したｃｒＲＮＡのインキュベーションによって行った。サンプルを真空濃縮器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で５〜１０μｌに濃縮後、ＥＳＩ−ＭＳ分析を行う。

ｃｒＲＮＡのエレクトロスプレーイオン化質量分析を、オンラインキャピラリー液体クロマトグラフィシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００，Ｄｉｏｎｅｘ，ＵＫ）に接続したＵＨＲ−ＴＯＦ質量分析計（ｍａＸｉｓ）またはＨＣＴ Ｕｌｔｒａ ＰＴＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ装置（共にＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用してネガティブモードにて行う。ＲＮＡ分離を、一体化（ＰＳ−ＤＶＢ）キャピラリーカラム（２００μｍ×５０ｍｍ（内径）、Ｄｉｏｎｅｘ、ＵＫ）を使用して行う。クロマトグラフィを、以下の緩衝液条件を使用して行う：Ｃ）トリエチルアミン（ＴＥＡ）でｐＨ７．０に調製した０．４Ｍ １，１，１，３，３，３，−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．１ｍＭ ＴＥＡＡ、およびＤ）５０％メタノール（ｖ／ｖ）（Ｆｉｓｈｅｒ）を有する緩衝液Ｃ。ＲＮＡ分析を、５０℃にて、２μｌ／分の流速での２０％緩衝液Ｄ、５分間で４０％Ｄまでの増加、その後８分間にわたる６０％Ｄまで線形増加を使用して行う。

Ｃａｓｃａｄｅタンパク質を、タンパク質濃度５μＭでの０．１５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ８．０）中でのネイティブ質量分析によって分析する。タンパク質調製物を、カットオフが１０ｋＤａの遠心濾過器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した４℃での５連続の濃縮および希釈工程によって得る。タンパク質をホウケイ酸ガラスキャピラリーからスプレーし、高質量分析での最適なパフォーマンスのために調整されたＬＣＴエレクトロスプレー飛行時間型装置または修正四重極飛行時間型装置（共にＷａｔｅｒｓ、ＵＫ）にて分析する（Ｔａｈａｌｌａｈ Ｎら（２００１）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ １５：５９６−６０１（２００１）およびｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｕｖｅｌ，Ｒ．Ｈ．ら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ７８：７４７３−８３（２００６）を参照のこと）。各Ｃａｓタンパク質群の正確な質量測定値を、変性条件下（５０％アセトニトリル、５０％ＭＱ、０．１％ギ酸）で得た。溶液中のサブ複合体を、最終濃度５％（ｖ／ｖ）まで２−プロパノールをスプレー溶液に添加することによって生成した。装置の設定は以下であった：ニードル電圧約１．２ｋＶ、コーン電圧約１７５Ｖ、電圧源９ｍｂａｒ。キセノンをタンデム質量分析のための衝突ガスとして１．５×１０^−２ｍｂａｒの圧力で使用した。衝突電圧を１０〜２００Ｖの間で変化させた。

電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して、標的核酸に対するＣａｓｃａｄｅ複合体の機能活性を証明する。ＥＭＳＡを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ中でのＣａｓｃａｄｅ、ＣａｓＢＣＤＥ、またはＣａｓＣＤＥの１ｎＭの標識核酸とのインキュベーションによって行う。サケ精子ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を競合物質として使用する。ＥＭＳＡ反応物を３７℃で２０〜３０分間インキュベーション後、５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。ゲルを乾燥させ、ホスファーストレージスクリーンおよびＰＭＩホスホイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して分析する。Ｃａｓｃａｄｅの標的ＤＮＡ結合および切断活性を、１〜１０ｍＭのＣａイオン、Ｍｇイオン、またはＭｎイオンの存在下で試験する。

ＤＮＡ標的は、Ｊｏｒｅら（２０１１）の補足表３に列挙したゲル精製した長オリゴヌクレオチド（Ｉｓｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｒ Ｂｉｏｌｅｇｉｏ）である。オリゴヌクレオチドを、γ^３２ Ｐ−ＡＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）およびＴ４キナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して末端標識する。二本鎖ＤＮＡ標的を、相補オリゴヌクレオチドのアニーリングおよび残存ｓｓＤＮＡのエキソヌクレアーゼＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）での消化によって調製する。標識ＲＮＡ標的を、α^３２Ｐ−ＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と共にＴ７ ＭａｘｉｓｃｒｉｐｔまたはＴ７ Ｍｅｇａ Ｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、ＤＮアーゼＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）消化によってテンプレートを除去する。二本鎖ＲＮＡ標的を、相補ＲＮＡのアニーリングおよびＲＮアーゼＴ１（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用した過剰なｓｓＲＮＡの消化、その後のフェノール抽出によって調製する。

プラスミド移動度シフトアッセイを、Ｒ４４プロトスペーサーを含むプラスミドｐＷＵＲ６１３を使用して行う。プロトスペーサーを含むフラグメントを、プライマーＢＧ３２９７およびＢＧ３２９８を使用してバクテリオファージＰ７ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅する（Ｊｏｒｅら（２０１１）の補足表３を参照のこと）。プラスミド（０．４μｇ）およびＣａｓｃａｄｅを、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および２０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中に１：１０のモル比で混合し、３７℃で３０分間インキュベーションする。次いで、Ｃａｓｃａｄｅタンパク質をプロテイナーゼＫ処理（Ｆｌｕｋａ）（０．１５Ｕ、１５分間、３７℃）によって除去し、その後にフェノール／クロロホルム抽出した。次いで、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体をＲＮａｓｅＨ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（２Ｕ、１時間、３７℃）で処置した。

ＲＮＡ成分（ｃｒＲＮＡと等価）とＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体または活性サブ複合体を形成するＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ−Ｃａｓタンパク質サブユニット融合物は、核酸標的のスキャニング、特異的結合、および切断の生物活性および機能活性を有すると予想される。Ｃａｓサブユニットの蛍光色素のアミノ酸鎖との融合により、生物活性および機能活性を保持し、且つ、例えば、ｄｓＤＮＡ中の標的核酸配列の位置を視覚化することが可能であるＲＮＡ成分（ｃｒＲＮＡと等価）とのＣａｓｃａｄｅ複合体およびサブ複合体が形成される。

実施例７−Ｃａｓｃａｄｅ−ヌクレアーゼ対およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのヌクレアーゼ活性の試験

「Ｓｈａｒｋｅｙ」と命名された６つの変異を、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓ制限酵素ＦｏｋＩ由来の非特異的ヌクレアーゼドメインのヌクレアーゼ活性および安定性を改良するためにランダム変異誘発およびスクリーニングによって導入した（Ｇｕｏ，Ｊ．，ら（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００：９６−１０７を参照のこと）。オフターゲット切断活性を軽減する他の変異を導入した。ＺＦＮ対のＦｏｋＩ二量体界面での静電相互作用を操作し、正電荷界面を有する１つのＦｏｋＩバリアント（ＫＫＲ、Ｅ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、Ｈ５３７Ｒ）および負電荷界面を有する別のＦｏｋＩバリアント（ＥＬＤ、Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、Ｎ４９６Ｄ）を作製することによってこれを行う（Ｄｏｙｏｎ，Ｙ．，ら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：７４−９を参照のこと）。これらのバリアントの各々はホモ二量体として触媒的に不活性であり、それにより、オフターゲット切断の頻度が軽減される。

Ｃａｓｃａｄｅ−ヌクレアーゼデザイン
本発明者らは、改良されたＦｏｋＩヌクレアーゼをＣｓｅ１のＮ末端に翻訳的に融合して、それぞれＦｏｋＩ^ＫＫＲ−Ｃｓｅ１およびＦｏｋＩ^ＥＬＤ−Ｃｓｅ１であるＣｓｅ１のバリアントを生成した。これら２つのバリアントを、Ｃａｓｃａｄｅサブユニット（Ｃｓｅ２、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、およびＣａｓ６ｅ）および均一なスペーサーを有する２つの異なるＣＲＩＳＰＲプラスミドのうちの１つと同時発現させる。これにより、Ｃａｓｃａｄｅ^ＫＫＲ複合体に均一のＰ７−ｃｒＲＮＡが負荷され、Ｃａｓｃａｄｅ^ＥＬＤ複合体に均一のＭ１３ ｇ８−ｃｒＲＮＡが負荷される。これらの複合体を、Ｊｏｒｅ、Ｍ．Ｍ．、ら、（２０１１）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８（５）：５２９−５３６に記載のようにＮ末端ＳｔｒｅｐＩＩタグ化Ｃｓｅ２を使用して精製する。さらに、Ｎ末端ＨＩＳタグ化ＦｏｋＩを使用したさらなる精製工程を行って、全長およびインタクトなＣａｓｃａｄｅ−ヌクレアーゼ融合複合体を確実に精製することができる。

本実施例で使用した融合タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は以下であった：

ＤＮＡ切断アッセイ
複合体の特異性および活性を、基質として人為的に構築した標的プラスミドを使用して試験した。このプラスミドは、両ＦｏｋＩドメインが相互に対面するように相反する鎖上にＭ１３およびＰ７結合部位を含む（図１１を参照のこと）。Ｃａｓｃａｄｅ結合部位間の距離は、２５塩基対と５０塩基対との間（５ｂｐづつ増加）で変化する。Ｃａｓｃａｄｅの結合部位が４つの公知のＰＡＭ配列のいずれかと隣接する必要があるので（５’−プロトスペーサー−ＣＴＴ／ＣＡＴ／ＣＴＣ／ＣＣＴ−３’）、この距離範囲により、ほとんどの任意の所与の配列のためのかかる対をデザインするのに十分な柔軟性が得られる。

使用した標的プラスミドの配列は以下である。数字は、Ｍ１３標的部位とＰ７標的部位との間の距離を示した。プロトスペーサーを太字で示し、ＰＡＭに下線を引いた。
標的プラスミドの配列。数字は、Ｍ１３標的部位とＰ７標的部位との間の距離を示す（プロトスペーサーは太字、ＰＡＭに下線）。
標的プラスミドの切断を、アガロースゲル（負のスーパーコイル（ｎＳＣ）プラスミドを直鎖状化プラスミドまたはニッキングしたプラスミドと区別することができる）で分析した。標的ベクター中のＣａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}対の切断部位を、アガロースゲルからの直鎖状切断産物の単離および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを使用したＦｏｋＩ切断によって残存した３’陥没末端をフィルインして平滑末端を作製することによって決定した。直鎖状ベクターを自己ライゲーションし、形質転換し、増幅し、単離し、配列決定した。３’陥没末端のフィルインおよび再ライゲーションにより、ＦｏｋＩ切断によって残存したオーバーハングを示す配列中に余剰ヌクレオチドが得られるであろう。配列読み取りの元の配列とのアラインメントにより、クローンレベルで切断部位を見出し、マッピングすることができる。以下は、ＦｏｋＩ切断によって残存した３’陥没末端のフィルイン後に配列中に組み込まれたさらなる塩基に下線を引いている。

上から下に読んで、上記５’−３’配列はそれぞれ配列番号３２〜３５である。

ヒト細胞中の標的遺伝子座の切断

ヒトＣＣＲ５遺伝子は、白血球表面上でヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の受容体としての役割を果たすＣ−Ｃケモカイン受容体５型タンパク質をコードする。人工ＧＦＰ遺伝子座に加えてＣａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}ヌクレアーゼ対を使用してＣＣＲ５遺伝子をターゲティングする。適切な結合部位対を、ＣＣＲ５のコード領域について選択する。各結合部位をターゲティングする均一のスペーサーを含む２つの個別のＣＲＩＳＰＲアレイを、ＤＮＡ合成（Ｇｅｎｅａｒｔ）を使用して構築する。
使用したヒトＣＣＲ５標的遺伝子選択およびＣＲＩＳＰＲデザインは以下である。

＞全ＯＲＦを含むゲノムヒトＣＣＲ５配列の一部（３４７〜１４４６位）。

Ｒｅｄ１／２：選択された標的部位（距離：３４ｂｐ、ＰＡＭ ５’−ＣＴＴ−３’）。“Ｒｅｄ１は、上記の最初に出現した下線を引いた配列である。Ｒｅｄ２は、第２の下線を引いた配列である。

＞ＣＲＩＳＰＲアレイｒｅｄ１（斜体＝スペーサー、太字＝リピート）

＞ＣＲＩＳＰＲアレイｒｅｄ２（斜体：スペーサー、太字：リピート）

ヒト細胞の核内へのＣａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}の送達
Ｃａｓｃａｄｅは、多サブユニットタンパク質−ＲＮＡ複合体として非常に安定しており、ｍｇ単位の量にて大腸菌内で容易に産生される。大腸菌から精製されたそのインタクトな形態での複合体のトランスフェクションまたは微量注入を、送達方法として使用する（図１２を参照のこと）。図１２に示すように、Ｃａｓｃａｄｅ−ＦｏｋＩヌクレアーゼを大腸菌から精製し、タンパク質トランスフェクション小胞中に被包する。次いで、これらをヒトＨｅｐＧ２細胞の細胞膜と融合して細胞質内にヌクレアーゼを放出させる（工程２）。次いで、ＮＬＳ配列は、核孔通過を容易にするインポーチンタンパク質によって認識される（工程３）。次いで、Ｃａｓｃａｄｅ^ＫＫＲ（白抜きの四角）およびＣａｓｃａｄｅ^ＥＬＤ（黒塗りの四角）は、その標的部位を見出して切断し（工程４）、それにより、標的部位を変化させるＤＮＡ修復経路を誘導して所望の変化を誘導するであろう。Ｃａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}ヌクレアーゼは１回のみ作用することが必要であり、ＤＮＡ上にコードされて細胞内に恒久的に存在する必要はない。

Ｃａｓｃａｄｅをヒト細胞内に送達させるために、種々の供給元（Ｐｉｅｒｃｅ，ＮＥＢ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、およびＣｌｏｎｔｅｃｈが含まれる）から得られるタンパク質トランスフェクション試薬を使用する。これらの試薬は、抗体送達のために最近開発され、広範なヒト細胞株を９０％までの効率でトランスフェクションするのに有用である。ヒトＨｅｐＧ２細胞をトランスフェクションする。また、他の細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ−７、ＨｅＬａ、および非胚性幹細胞が含まれる）をトランスフェクションする。

Ｃａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}ヌクレアーゼ対を核内に輸送するために、サルウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原由来のタンデムモノパータイト核局在シグナル（ＮＬＳ）をＦｏｋＩのＮ末端に融合する。これにより、インタクトなＣａｓｃａｄｅ^{ＥＬＤ／ＫＫＲ}のみの核への輸送が保証される（核膜孔複合体はＲＮＡポリメラーゼ（５５０ｋＤａ）および他の巨大タンパク質複合体を転位置させる）。形質転換前のチェックポイントとして、Ｃａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}ヌクレアーゼ対のヌクレアーゼ活性を、精製された複合体および非産生性Ｃａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}ヌクレアーゼ対のトランスフェクションを排除するためのＣＣＲ５ ＰＣＲアンプリコンを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでチェックする。

サーベイヤーアッセイ
トランスフェクションした細胞を、数日間培養および継代する。次いで、ｉｎ ｖｉｖｏでの標的ＤＮＡ切断効率を、Ｇｕｓｃｈｉｎ，Ｄ．Ｙ．，ら（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６４９：２４７−２５６のサーベイヤーアッセイの使用によってアッセイする。簡潔に述べれば、標的ＤＮＡ遺伝子座のＰＣＲアンプリコンを、未処置細胞由来のＰＣＲアンプリコンと１：１で混合するであろう。これらを加熱し、アニーリングさせ、ＮＨＥＪによって誤って修復された標的部位でミスマッチが生じる。次いで、ミスマッチヌクレアーゼを使用して、ミスマッチしたＤＮＡ分子のみを切断し、これにより、Ｃａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}による標的ＤＮＡ切断の完了時に最大で５０％切断される。次いで、この手順を、処置した細胞の標的ＤＮＡアンプリコンの配列決定によって追跡した。本アッセイにより、送達手順が迅速に評価および至適化される。

Ｃａｓｃａｄｅ−ヌクレアーゼ対の産生
上記で説明するようにＣａｓｃａｄｅ−ヌクレアーゼ複合体を構築した。ＳｔｒｅｐＩＩタグ化Ｃｓｅ２サブユニットを使用した大腸菌からの親和性精製により、未変性Ｃａｓｃａｄｅと比較した場合に予想される化学量論を有する複合体が得られる。図１３を参照すると、これは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎのみを使用した精製２４時間後の未変性Ｃａｓｃａｄｅ（１）、Ｐ７ ＣｒＲＮＡを有するＣａｓｃａｄｅ^ＫＫＲ、およびＭ１３ ＣｒＲＮＡを有するＣａｓｃａｄｅ^ＥＬＤの化学量論を示す。未変性Ｃａｓｃａｄｅ（１）中のバンドは、上から下に以下を示す：Ｃｓｅ１、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６ｅ、Ｃｓｅ２。Ｃａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}は、ＦｏｋＩ−Ｃｓｅ１融合バンドおよびタンパク質分解の結果としてのＦｏｋＩの小部分を有するＣｓｅ１を示すさらなるバンドを示す。

インタクトなＦｏｋＩ−Ｃｓｅ１融合タンパク質は別として、本発明者らは、ＦｏｋＩ−Ｃｓｅ１−融合タンパク質画分がタンパク質分解的に切断されてリンカーのみを有するＣｓｅ１タンパク質およびリンカーに結合したＦｏｋＩの小部分（質量分析によって確認、データ示さず）が得られることを認めた。ほとんどのタンパク質単離物では、融合タンパク質の分解画分はおよそ４０％である。単離タンパク質を、さらなる０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および５０％グリセロールを有する溶離緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭデスチオビオチン）中にて−２０℃で安定に保存する。これらの保存条件下では、複合体の完全性および活性は少なくとも３週間安定であることが見出された（データ示さず）。

Ｈｉｓ_６−ｔａｇおよびＮＬＳのＣａｓｃａｄｅ−ヌクレアーゼへの導入
Ｃａｓｃａｄｅヌクレアーゼ融合物のデザインを、真核細胞の核内輸送を可能にするための核小体局在シグナル（ＮＬＳ）が組み込まれるように改変した。この目的のために、サルウイルスＳＶ４０のラージＴ抗原由来のタンデムモノパータイトＮＬＳ（配列：ＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶ）をＦｏｋＩ−Ｃｓｅ１融合タンパク質のＮ末端に翻訳的に融合し、Ｎ末端にはＨｉｓ_６−タグが直接先行していた。Ｈｉｓ_６−タグ（配列：ＭＨＨＨＨＨＨ）により、ＳｔｒｅｐＩＩ精製後にさらなるＮｉ^２＋−樹脂による親和性精製工程が可能である。このさらなる工程により、全長Ｃａｓｃａｄｅ−ヌクレアーゼ融合複合体のみの単離が保証され、非産生性ヌクレアーゼ対を形成する標的部位への非インタクトなＣａｓｃａｄｅ複合体の結合を排除することによって切断効率が増大する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイ
Ｃａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}の活性および特異性を、上記のようにｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイした。図１４Ａは、Ｃａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}と３７℃で３０分間インキュベーションしたプロトスペーサー間の距離が２５〜５０ｂｐ（５ｂｐずつ増加、レーン１〜６）であるプラスミドを示す。レーン１０は、以下のその３つの可能なトポロジーでの標的プラスミドを含む：最も下のバンドはプラスミドの最初の負のスーパーコイル（ｎＳＣ）形態を示し、真ん中のバンドは直鎖状化形態（ＸｂａＩによって切断）を示し、一方、上のバンドは開環（ＯＣ）形態（Ｎｔ．ＢｂｒＣＩでのニッキング後）を示す。レーン７は、両方の結合部位を除去したプラスミドのインキュベーションを示す（ネガティブコントロール）。したがって、図１４Ａは、結合部位が２５〜５０塩基対（５ｂｐずつ増加）によって分離している種々の標的プラスミドを使用した典型的な切断アッセイを示す（レーン１〜６）。２５〜５０ｂｐの距離を有するこれらのプラスミドを、それぞれアンチＰ７およびＭ１３ ｃｒＲＮＡを保有するＣａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}とインキュベーションした。結合部位を含まないプラスミドはコントロールとしての役割を果たした（レーン７）。元のプラスミドは負のスーパーコイル形態で存在し（ｎＳＣ、コントロールレーン８）、ニッキングまたは直鎖状化した産物は明確に区別可能である。インキュベーションの際、結合部位が３０、３５、および４０塩基対によって分離された場合に直鎖状切断産物が形成される（レーン２、３、４）。２５、４５、および５０塩基対の距離で（レーン１、５、６）、標的プラスミドは不完全に切断されてニッキングされた形態（ＯＣ）が得られるようであった。これらの結果は、３０ｂｐと４０ｂｐとの間の距離を有するプラスミドにおける切断が最良であり、それにより、任意の所与の遺伝子座のためにｃｒＲＮＡ対をデザインする場合に十分な柔軟性が得られる。より短い距離およびより長い距離は共にニッキング活性が増加し、ＤＳＢが減少する。２つのプロトスペーサーが除去されたプラスミドはほとんど活性がなく、標的特異性を示す（レーン７）。

切断条件
切断アッセイに最適な緩衝液条件を評価するためおよび複合体の活性が生理学的条件で予想されるかどうかを評価するために、以下の２つの緩衝液を選択した：（１）ＮＥＢ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、５０ｍＭ 酢酸カリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオトレイトール、ｐＨ７．９）および（２）緩衝液Ｏ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．５）。２つのうちで、市販のインタクトなＦｏｋＩ酵素の最適な活性にはＮＥＢ４が推奨される。良好な活性および特異性を得るためにクイックスクリーンから緩衝液Ｏを選択した（データ示さず）。図１４Ｂは、異なる緩衝液および異なるインキュベーション時間を使用したインキュベーションを示す。レーン１〜４は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ緩衝液Ｏを使用してインキュベーションし（レーン１、２は１５分間、レーン３、４は３０分間）、レーン５、６はＮＥＢ４とインキュベーションした（３０分間）。レーン１、３、５は３５ｂｐ間隔の標的プラスミドを使用し、レーン２、４、６は非標的プラスミド（結合部位なし）を使用した。レーン７、８は、Ｃａｓｃａｄｅ^ＫＫＲまたはＣａｓｃａｄｅ^ＥＬＤのみをそれぞれ使用してインキュベーションした（緩衝液Ｏ）。レーン９は（Ａ）と同様のトポロジーマーカーである。レーン１０および１１は、Ｃａｓｃａｄｅを添加せずにインキュベーションした標的プラスミドおよび非標的プラスミドを示す。したがって、図１４Ｂでは、３５塩基対の距離を有する標的プラスミド（レーン１、３、５）および非標的コントロールプラスミド（レーン２、４、６）についての活性を試験した。ＮＥＢ４において大量の非特異的ニッキングおよびより少ない切断が認められ（レーン５，６）、一方で緩衝液Ｏは大量の特異的切断およびわずかなニッキングを有する標的プラスミドにおける活性のみを示す（レーン１〜４）。この差異は緩衝液Ｏ中のＮａＣｌ濃度に原因する可能性が高く、イオン強度が高いほどタンパク質間相互作用が弱くなり、非特異的活性が少なくなる。１５分間または３０分間のインキュベーションは、標的プラスミドおよび非標的プラスミドの両方でほとんど差異がない（それぞれ、レーン１，２、または３，４）。予想通り、１つのＣａｓｃａｄｅ型のみ（Ｐ７^ＫＫＲまたはＭ１３^ＥＬＤ）の添加によって切断活性は得られない（レーン７、８）。この実験は、ＮａＣｌ濃度が少なくとも１００ｍＭ（細胞内の生理食塩水濃度（１３７ｍＭ ＮａＣｌ）に近い）である場合にデザインされた対による特異的Ｃａｓｃａｄｅヌクレアーゼ活性が生じることを示す。Ｃａｓｃａｄｅヌクレアーゼ対はｉｎ ｖｉｖｏ（真核細胞内）で完全な活性を示すことが予想される一方で、無視できるオフターゲット切断活性を示す。

切断部位
３５ｂｐの間隔を有する標的プラスミド（ｐＴａｒｇｅｔ３５）中の切断部位を決定した。図１５は、どのようにして配列決定によって３５塩基対間隔を有する標的プラスミド中のＣａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}による上流および下流の切断部位が明らかになるかを示す。図１５Ａは、注釈付きの潜在的切断部位を有するｐＴａｒｇｅｔ３５内の標的領域を示す。プロトスペーサー部分を赤色および青色で示す。Ｂ）バーチャートは、配列決定したクローンにおける４つの異なる切断パターンおよびこれらの相対存在量を示す。青色バーは生成されたオーバーハングを示し、一方で、各バーの左または右の境界は左または右の切断部位を示す（注釈付けについてはＢを参照のこと）。

図１５Ａは、２つのプロトスペーサー（赤色および青色で示す）の間の中央を０とする−７から＋７までの番号をつけた切断部位を有するｐＴａｒｇｅｔ３５の元の配列を示す。１７クローンを配列決定し、これら全ては約０位を切断して３ｂｐと５ｂｐとの間の種々のオーバーハングを生成する（図１５Ｂを参照のこと）。４のオーバーハングが最も豊富であり（累積的に８８％）、一方、３および５のオーバーハングは１回しか生じない（各６％）。予想通り正確に切断され、オフターゲット切断を示すクローンは存在しなかった。

ヒト細胞中での標的遺伝子座の切断
Ｃａｓｃａｄｅ^{ＫＫＲ／ＥＬＤ}ヌクレアーゼを、Ｎ末端Ｈｉｓ_６−タグおよびその後に二重モノパータイト核小体局在シグナルを含むように首尾よく改変した。これらの改変されたＣａｓｃａｄｅヌクレアーゼ融合タンパク質を、２つの合成的に構築されたＣＲＩＳＰＲアレイ（それぞれヒトＣＣＲ５遺伝子中の結合部位をターゲティングする）のうちのいずれか１つと同時発現させた。第１に、この新規のヌクレアーゼ対の活性を、このＣＣＲ５遺伝子領域を含むプラスミドの活性を試験することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで確認する。ヌクレアーゼ対を、ヒト細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞株）にトランスフェクションする。標的の切断効率を、上記のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して評価する。

Claims (46)

1. 少なくとも以下のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質サブユニット：
   −配列番号３のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１８％同一の配列を有するＣａｓ７、
   −配列番号４のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１７％同一の配列を有するＣａｓ５、および
   −配列番号５のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１６％同一の配列を有するＣａｓ６を含み、
   該サブユニットの少なくとも１つが、核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を提供するさらなるアミノ酸配列を含む、
   抗ウイルス防御のための、クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）、Ｃａｓｃａｄｅタンパク質複合体、またはその一部。
2. 前記Ｃａｓ６サブユニットが、配列番号１７のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１６％同一の配列を有するＣａｓ６ｅサブユニットである、請求項１に記載のタンパク質複合体。
3. 配列番号２のアミノ酸配列またはこれと少なくとも２０％同一の配列を有するＣｓｅ２サブユニットをさらに含み、必要に応じて、さらなるアミノ酸配列を含むのはＣｓｅ２サブユニットである、請求項１または請求項２に記載のタンパク質複合体。
4. 配列番号１のアミノ酸配列またはこれと少なくとも９％同一の配列を有するＣｓｅ１サブユニットをさらに含み、必要に応じて、さらなるアミノ酸配列を含むのはＣｓｅ１サブユニットである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
5. Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムタンパク質複合体、好ましくはＩ−Ｅ亜型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質複合体である、請求項４に記載のタンパク質複合体。
6. 前記さらなるアミノ酸配列が、前記少なくとも１つのサブユニットに翻訳的に融合するかまたは共有結合しており、好ましくは、前記さらなるアミノ酸配列が、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、またはＣａｓ６ｅサブユニットのうちの少なくとも１つの少なくともＮ末端および／またはＣ末端に融合または連結している、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
7. 前記さらなるアミノ酸配列がＣｓｅ１、Ｃｓｅ２、またはＣａｓ５サブユニットのＮ末端またはＣ末端、好ましくは、Ｃｓｅ１サブユニットのＮ末端、Ｃｓｅ２サブユニットのＮ末端、またはＣａｓ７サブユニットのＮ末端に融合または連結している、請求項６に記載のタンパク質複合体。
8. 前記さらなるアミノ酸配列がタンパク質であり、該タンパク質が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ−ヘリカーゼ（例えば、Ｃａｓ３）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｄａｍ）、またはＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（コ）アクチベーター、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構造化タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙまたは重金属結合タンパク質）、シグナルペプチド（例えば、Ｔａｔ−シグナル配列）、細胞内局在配列（例えば、核局在配列）、または抗体エピトープから必要に応じて選択される、請求項７に記載のタンパク質複合体。
9. 前記ヌクレアーゼが、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはＦｏｋＩ、より好ましくは改変ＦｏｋＩ（例えば、ＫＫＲ ＳｈａｒｋｅｙまたはＥＬＤ Ｓｈａｒｋｅｙ）から選択される、請求項８に記載のタンパク質複合体。
10. 標的核酸配列と少なくとも５０％同一のリボヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子をさらに含む前記いずれかの請求項に記載のタンパク質複合体であって、該タンパク質複合体および該ＲＮＡ分子がリボ核タンパク質複合体を形成する、タンパク質複合体。
11. 前記ＲＮＡ分子の一部が前記標的配列と少なくとも５０％同一である、請求項１０に記載のリボ核タンパク質複合体。
12. 前記ＲＮＡ分子の前記一部がその長さに沿って前記標的配列と少なくとも実質的に相補的である、請求項１１に記載のリボ核タンパク質複合体。
13. 前記ＲＮＡ分子の長さが３５〜７５残基の範囲である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体。
14. 所望の核酸配列をターゲティングするために使用した前記ＲＮＡ分子の前記一部が３２または３３残基長である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体。
15. 前記ＲＮＡ分子が前記標的配列と少なくとも実質的な相補性を有するＲＮＡ配列の５’側にある８残基を含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体。
16. 前記ＲＮＡ分子が、前記標的配列に少なくとも実質的な相補性を有する前記ＲＮＡ配列の３’側にヘアピンおよびテトラヌクレオチドループ形成配列を有する、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体。
17. ａ．配列番号１のアミノ酸配列またはこれと少なくとも９％同一の配列を有するＣｓｅ１サブユニット；
    ｂ．配列番号２のアミノ酸配列またはこれと少なくとも２０％同一の配列を有するＣｓｅ２サブユニット；
    ｃ．配列番号３のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１８％同一の配列を有するＣａｓ７サブユニット；
    ｄ．配列番号４のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１７％同一の配列を有するＣａｓ５サブユニット；
    ｅ．配列番号５のアミノ酸配列またはこれと少なくとも１６％同一の配列を有するＣａｓ６サブユニットから選択され、
    ここで、少なくともａ、ｂ、ｃ、ｄ、またはｅが、核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を提供するさらなるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質サブユニットをコードする単離核酸分子。
18. 前記核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を提供するさらなるアミノ酸配列が前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質サブユニットに融合している、請求項１７に記載の単離核酸分子。
19. 前記さらなるアミノ酸配列が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ−ヘリカーゼ（例えば、Ｃａｓ３）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｄａｍ）、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（コ）アクチベーター、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構造化タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙまたは重金属結合タンパク質）、シグナルペプチド（例えば、Ｔａｔ−シグナル配列）、細胞内局在配列（例えば、核局在配列）、または抗体エピトープから選択される、請求項１８に記載の単離核酸分子。
20. 請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
21. 請求項１０〜１６のいずれか１項に定義のＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２０に記載の発現ベクター。
22. 標的核酸の改変、視覚化、転写活性化、または転写抑制の方法であって、該核酸を、
    ａ．請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体、または
    ｂ．請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質複合体および請求項１０〜１６のいずれか１項に定義のＲＮＡ分子
    と接触させる工程を含む、方法。
23. 細胞内の標的核酸を改変するか、視覚化するか、転写活性化するか、または転写抑制する方法であって、該細胞を請求項２２に記載の発現ベクターおよび請求項１０〜１８のいずれか１項に定義のＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現ベクターでトランスフェクションするか、形質転換するか、または形質導入する工程を含む、方法。
24. 細胞内の標的核酸を改変するか、視覚化するか、転写活性化するか、または転写抑制する方法であって、該細胞を請求項２２に記載の発現ベクターでトランスフェクションするか、形質転換するか、または形質導入し、次いで、請求項１０〜１８のいずれか１項に定義のＲＮＡ分子を該細胞へまたは該細胞内に投与する工程を含む、方法。
25. 細胞内の標的核酸を改変するか、視覚化するか、転写活性化するか、または転写抑制する方法であって、該細胞を請求項２１に記載の発現ベクターでトランスフェクションするか、形質転換するか、または形質導入する工程を含む、方法。
26. 前記核酸またはクロマチンを改変または視覚化する活性を有するさらなるアミノ酸配列がマーカーであり、前記マーカーが前記標的核酸またはクロマチンと会合し、好ましくは、前記マーカーがタンパク質であり、該タンパク質は必要に応じて蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ））である、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の標的核酸を改変するかまたは視覚化する方法。
27. 前記標的核酸がＤＮＡ、好ましくはｄｓＤＮＡである、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記標的核酸がＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記核酸またはクロマチンを改変する活性を有するさらなるアミノ酸配列がヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ−ヘリカーゼであり、前記改変が所望の遺伝子座での一本鎖切断または二本鎖切断である、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の標的核酸を改変する方法。
30. ｄｓＤＮＡ分子からヌクレオチド配列の少なくとも一部を除去するため（必要に応じて、遺伝子の機能をノックアウトするため）の所望の遺伝子座での細胞内のｄｓＤＮＡ分子の非相同末端結合方法であって、請求項２９に記載の標的核酸を改変する方法を使用して二本鎖切断をつくる工程を含む、方法。
31. 既存のヌクレオチド配列を改変するかまたは所望のヌクレオチド配列を挿入するための所望の遺伝子座での細胞内のｄｓＤＮＡ分子中への核酸の相同組換え方法であって、請求項２９に記載の標的核酸を改変する方法を使用して所望の遺伝子座で一本鎖または二本鎖切断をつくる工程を含む、方法。
32. 請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法で標的核酸配列を改変する工程を含む生物における遺伝子発現を改変するか、活性化するか、または抑制する方法であって、前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記核酸またはクロマチンを改変する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、デメチラーゼまたはデアセチラーゼ）、転写アクチベーター、または転写リプレッサーから選択される、方法。
33. 請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法に記載のとおりに標的核酸配列を改変する工程を含む生物における遺伝子発現を改変するか、活性化するか、または抑制する方法であって、前記核酸がｍＲＮＡであり、前記核酸またはクロマチンを改変する活性、または転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列が、リボヌクレアーゼであり、該リボヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、３’エキソヌクレアーゼ、または５’エキソヌクレアーゼから必要に応じて選択される、方法。
34. 前記細胞が原核生物である、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記細胞が、真核細胞であり、例えば、植物細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞である、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記哺乳動物またはヒトの細胞がヒト胚性幹細胞以外の幹細胞、好ましくは単離幹細胞である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションする、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記標的核酸が三次構造を有し、該三次構造が必要に応じてスーパーコイルであり、好ましくは、前記標的核酸が負のスーパーコイルである、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
39. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体を含む薬学的組成物。
40. 請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体を含む薬学的組成物。
41. 請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の単離核酸または請求項２０もしくは請求項２１に記載の発現ベクターを含む薬学的組成物。
42. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体および請求項１０〜１６のいずれか１項に定義のＲＮＡ分子を含むキット。
43. 医薬として使用するための請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣａｓｃａｄｅタンパク質複合体。
44. 医薬として使用するための請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のリボ核タンパク質複合体。
45. 医薬として使用するための請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の単離核酸。
46. 医薬として使用するための請求項２０または請求項２１に記載の発現ベクター。