JP2013035812A - Protein for surface layer-presenting two or more species of proteins and use thereof - Google Patents
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Abstract
【課題】酵母などの真核微生物の表層において、２種以上のタンパク質を配置制御して保持させるためのタンパク質を提供する。
【解決手段】２種類以上の所望のタンパク質を真核微生物に表層提示させるためのタンパク質に、R. flavefacience由来のＳｃａＥコヘシンドメインを備えるようにする。
【選択図】なしPROBLEM TO BE SOLVED: To provide a protein for controlling the arrangement of two or more kinds of proteins in the surface layer of a eukaryotic microorganism such as yeast.
An ScaE cohesin domain derived from R. flavefacience is provided in a protein for displaying two or more kinds of desired proteins on the surface of a eukaryotic microorganism.
[Selection figure] None
Description
本発明は、２種以上のタンパク質の表層提示用のタンパク質及びその利用に関する。 The present invention relates to a protein for surface display of two or more proteins and use thereof.
近年、有限である石油資源を代替するものとして、植物の光合成作用に由来するバイオマス資源への期待が高まってきており、バイオマスをエネルギーや各種材料に利用するための各種の試みがなされている。バイオマスを、エネルギー源やその他の原料として有効利用するためには、バイオマスを動物や微生物が容易に利用可能な炭素源に糖化することが必要である。 In recent years, as an alternative to finite oil resources, expectations for biomass resources derived from the photosynthesis of plants have increased, and various attempts have been made to use biomass for energy and various materials. In order to effectively use biomass as an energy source and other raw materials, it is necessary to saccharify biomass into a carbon source that can be easily used by animals and microorganisms.
典型的なバイオマスであるセルロースやヘミセルロースを利用するには、これらを糖化（分解）する優れたセルラーゼが必要である。セルラーゼは、エンドグルカナーゼ、エキソグルタミナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼなど、セルロースに作用する複数種類の酵素の包括概念であり、これらが協働してセルロースを分解する。 In order to use cellulose and hemicellulose, which are typical biomasses, an excellent cellulase that saccharifies (decomposes) these is required. Cellulase is a comprehensive concept of multiple types of enzymes that act on cellulose, such as endoglucanase, exoglutaminase, cellobiohydrolase, and β-glucosidase, and these cooperate to break down cellulose.
こうしたセルラーゼ源として、一部の細菌が生産するセルロソームが着目されている。セルロソームは、細菌の細胞表層に形成されるセルラーゼとそのセルラーゼが結合する骨格タンパク質（スキャホールディンタンパク質）との複合体である。スキャホールディンタンパク質は、コヘシンドメインを有するタンパク質である。セルロソームは、スキャホールディンタンパク質中のコヘシンドメインに結合するドッケリンドメインを介してセルラーゼが結合して構成されることが知られている。こうしたセルロソームによれば、細菌細胞表層に多種のセルラーゼを高密度でかつ大量に提供される。 As such a cellulase source, a cellulosome produced by some bacteria has attracted attention. Cellulosome is a complex of cellulase formed on the surface layer of bacteria and a backbone protein (scaffoldin protein) to which the cellulase binds. Scaffoldin protein is a protein having a cohesin domain. Cellulosomes are known to be composed of cellulases bound via dockerin domains that bind to the cohesin domain in a scaffoldin protein. According to such cellulosome, various cellulases are provided in high density and in large quantities on the bacterial cell surface layer.
天然セルロソームを人工的に構築する試みもなされている（特許文献１）。また、コヘシンドメインとドッケリンドメインとの結合性を利用して、人工的なセルロソームを細胞外や細胞表層に構築しようとする試みがいくつかなされている。例えば、大腸菌で生産した各種コヘシンドメインとドッケリンドメインとの結合選択性が報告されている（非特許文献１）。また、Clostridium thermocellum、Ruminococcus flavefaciens、Clostridium cellulolyticumの各コヘシンドメインを連結した人工骨格タンパク質を酵母で生産して表層提示し、別途、酵母で生産したドッケリンドメインと各種セルラーゼとの融合タンパク質を、この人工骨格タンパク質上のドッケリンドメインに結合させたことが報告されている（非特許文献２）。 Attempts have been made to artificially construct natural cellulosomes (Patent Document 1). In addition, several attempts have been made to construct an artificial cellulosome outside the cell or on the cell surface using the binding property between the cohesin domain and the dockerin domain. For example, binding selectivity between various cohesin domains produced in E. coli and dockerin domains has been reported (Non-patent Document 1). In addition, artificial skeletal proteins linking the cohesin domains of Clostridium thermocellum, Ruminococcus flavefaciens, and Clostridium cellulolyticum were produced in yeast and displayed on the surface, and separately fused proteins of dockerin domains and various cellulases produced in yeast were produced. It has been reported that it binds to a dockerin domain on an artificial skeletal protein (Non-patent Document 2).
本発明者らは、細胞表層においてセルロースを効率的に分解するためには、各種セルラーゼをその配置を制御して酵母などの真核微生物上に表層提示させて、効果的に複数種のセルラーゼが作用させるようにすることが望ましいと考えている。 In order to efficiently decompose cellulose in the cell surface layer, the present inventors controlled the arrangement of various cellulases to display them on the surface of eukaryotic microorganisms such as yeast. I think it is desirable to make it work.
配置制御のためには、本来的にコヘシン−ドッケリン結合の選択性が高いことが要請される。すなわち、一つのコヘシン−ドッケリン結合を構成するドッケリンドメインが、他のコヘシン−ドッケリン結合を構成するコヘシンドメインに結合するという交差性が回避されるべきである。また、真核微生物の表層に提示する、複数のコヘシンドメインを一つのタンパク質上に配列した（連結した）状態において、コヘシンドメインへのドッケリンドメインの結合強度が高いことが要請される。すなわち、一つのコヘシン−ドッケリン結合が隣接するコヘシン−ドッケリン結合により阻害されることが回避されるべきである。 In order to control the arrangement, it is essential that cohesin-dockerin bond selectivity is high. That is, the crossing property that a dockerin domain constituting one cohesin-dockerin bond binds to a cohesin domain constituting another cohesin-dockerin bond should be avoided. Further, in the state where a plurality of cohesin domains presented on the surface layer of a eukaryotic microorganism are arranged (linked) on one protein, it is required that the binding strength of the dockerin domain to the cohesin domain is high. That is, it should be avoided that one cohesin-dockerin bond is inhibited by an adjacent cohesin-dockerin bond.
本発明者らは、各種のセルロソーム生産菌に由来するコヘシンドメインについて結合選択性や結合強度について種々検討したところ、C. thermocellum、R. flavefacience、B. cellulosolvens及びA. fulgidusに由来するコヘシン−ドッケリン結合が好ましいという知見を得た。 The present inventors have conducted various studies on the binding selectivity and binding strength of cohesin domains derived from various cellulosome-producing bacteria. Cohesin-derived from C. thermocellum, R. flavefacience, B. cellulosolvens and A. fulgidus The knowledge that dockerin binding is preferable was obtained.
そして、さらに、高度な配置制御の観点から、複数のコヘシンドメインの連結時における結合強度等を確認したところ、コヘシンドメインによっては、コヘシン−ドッケリン結合によっては、結合力が低下したりすることがあることがわかった。すなわち、配置制御には、結合選択性と連結時においても結合強度が低下しないというコヘシンドメインを選択する必要があることがわかった。 Furthermore, from the viewpoint of advanced arrangement control, the binding strength, etc. at the time of linking multiple cohesin domains was confirmed. Depending on the cohesin domain, the binding power may be reduced depending on the cohesin-dockerin bond. I found out that In other words, it was found that the cohesin domain must be selected so that the binding selectivity and the binding strength do not decrease even at the time of ligation for the arrangement control.
コヘシンドメインを表層提示させた酵母にドッケリンドメインを有する融合タンパク質を自己生産させる際には、複数の融合タンパク質の製造量をコントロールすることは困難である。そうすると、こうした融合タンパク質を自己生産させる場合には、用いるコヘシンドメインが高い結合力や結合選択性を有していないと、配置制御のほか量的制御も困難となってしまう。 When a yeast having a cohesin domain displayed on the surface is allowed to self-produce a fusion protein having a dockerin domain, it is difficult to control the production amount of a plurality of fusion proteins. Then, when such a fusion protein is self-produced, if the cohesin domain to be used does not have a high binding force or binding selectivity, quantitative control as well as arrangement control becomes difficult.
そこで、本明細書の開示は、酵母表層上で２以上のタンパク質を配置制御して表層提示するのに適した酵母表層提示用のタンパク質及びその利用を提供することを一つの目的とする。 Accordingly, an object of the present disclosure is to provide a yeast surface display protein suitable for arranging two or more proteins on the surface of the yeast to display the surface and use thereof.
本発明者らは、高度な配置制御に有効なコヘシン−ドッケリン結合に用いるコヘシンドメインを探索したところ、R. flavefacience由来のＳｃａＥコヘシンドメインが連結時のドッケリン結合力及び結合選択性に優れていることのほか、R. flavefacience由来のＳｃａＢコヘシンドメインが連結時のドッケリン結合力及び結合選択性に優れていることを見出した。さらに、本発明者らは、C. thermocellum由来のＣｉｐＡコヘシンドメインが、連結時のドッケリン結合力及び結合選択性に優れていることを見出した。本開示によれば以下の手段が提供される。 When the present inventors searched for a cohesin domain used for cohesin-dockerin binding effective for high-level arrangement control, the ScaE cohesin domain derived from R. flavefacience is excellent in dockerin binding power and binding selectivity at the time of linking. In addition, it was found that the ScaB cohesin domain derived from R. flavefacience is excellent in dockerin binding strength and binding selectivity at the time of ligation. Furthermore, the present inventors have found that the CipA cohesin domain derived from C. thermocellum is excellent in dockerin binding strength and binding selectivity at the time of ligation. According to the present disclosure, the following means are provided.
（１）２種類以上の所望のタンパク質を真核微生物に表層提示させるためのタンパク質であって、
R. flavefacienceのＳｃａＥ由来コヘシンドメインを備える、タンパク質。
（２） 前記ＳｃａＥ由来コヘシンドメインは、以下のアミノ酸配列から選択されるいずれかを有する、（１）記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ変異を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列であって、配列番号２で表されるアミノ配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（３） さらに、R. flavefacienceのＳｃａＢ由来コヘシンドメインを備える、（１）又は（２）に記載のタンパク質。
（４） 前記ＳｃａＢコヘシンドメインは、以下のアミノ酸配列から選択されるいずれかを有する、（３）に記載のタンパク質。
（ｆ）配列番号４で表されるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ変異を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（ｈ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（ｉ）配列番号３で表される塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
（ｊ）配列番号３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列であって、配列番号４で表されるアミノ配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（５）さらに、C. thermocellumのＣｉｐＡ由来コヘシンドメインを備える、（１）〜（４）のいずれかに記載のタンパク質。
（６） 前記ＣｉｐＡコヘシンドメインは、以下のアミノ酸配列から選択されるいずれかを有する、（５）に記載のタンパク質。
（ｋ）配列番号６で表されるアミノ酸配列
（ｌ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ変異を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（ｍ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（ｎ）配列番号５で表される塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
（ｏ）配列番号５で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列であって、配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（７）前記ＣｉｐＡコヘシンドメインに対応するドッケリンドメインは、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する、（１）〜（６）のいずれかに記載のタンパク質。
（８）真核微生物であって、
（１）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質を前記真核微生物の表層側に備える、真核微生物。
（９）前記タンパク質は、セルロース結合ドメインを含む、請求項８に記載の真核微生物。
（１０）前記タンパク質を前記真核微生物内で自己生産するための外来性ＤＮＡを保持する、（８）又は（９）に記載の真核微生物。
（１１）さらに、前記タンパク質を選択的に結合可能な結合ドメインを有して前記細胞の表層に配置される１又は２以上の第２の骨格タンパク質を備える、（８）〜（１０）のいずれかに記載の真核微生物。
（１２）２種類以上のタンパク質を細胞表層に保持する真核微生物であって、
（８）〜（１１）のいずれかに記載の真核微生物の前記タンパク質上に、前記コヘシンドメインに選択的に結合するドッケリンドメインを有する２種類以上タンパク質を保持する、真核微生物。
（１３）前記２種類以上のタンパク質を、前記真核微生物が分泌生産する、（１２）に記載の真核微生物。
（１４）前記２種類以上のタンパク質は、セルロースを分解する酵素群から選択される、（１２）又は（１３）に記載の真核微生物。
（１５）前記タンパク質は、少なくともβ−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼからなる群から選択される２種以上を含む、（１４）に記載の真核微生物。
（１６）酵母である、（１２）〜（１５）のいずれかに記載の真核微生物。
（１７）有用物質の生産方法であって、
（１２）〜（１６）のいずれかに記載の真核微生物の前記２種以上のタンパク質を利用して前記有用物質を生産する工程、を備える、生産方法。
（１８）前記生産工程は、前記２種以上のタンパク質が、セルロースを分解する酵素群から選択され、前記２種以上のタンパク質を利用してセルロース含有材料を糖化し、発酵することを含む、（１７）に記載の生産方法。
(1) A protein for causing a eukaryotic microorganism to display two or more kinds of desired proteins on the surface,
A protein comprising the ScaE-derived cohesin domain of R. flavefacience.
(2) The protein according to (1), wherein the ScaE-derived cohesin domain has one selected from the following amino acid sequences.
(A) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has one or more amino mutations and has the same dockerin binding as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence having activity (c) Amino acid sequence (d) having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having the same dockerin binding activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (e) an amino acid sequence encoded by a base sequence having 90% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, An amino acid sequence having the same dockerin binding activity as the amino sequence represented by (3), further comprising a ScaB-derived cohesin domain of R. flavefacience, (1) Protein according to (2).
(4) The protein according to (3), wherein the ScaB cohesin domain has any one selected from the following amino acid sequences.
(F) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (g) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 has one or more amino mutations and has the same dockerin binding as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence having activity (h) Amino acid sequence (i) having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and having the same dockerin binding activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 An amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (j) an amino acid sequence encoded by a base sequence having 90% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, An amino acid sequence having dockerin binding activity identical to the amino sequence represented by (4), further comprising a CipA-derived cohesin domain of C. thermocellum, (1) to ( Protein according to any one of).
(6) The protein according to (5), wherein the CipA cohesin domain has one selected from the following amino acid sequences.
(K) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (l) the dockerin bond having one or more amino mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 and the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence having activity (m) Amino acid sequence (n) having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 and having the same dockerin binding activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 (o) an amino acid sequence encoded by a base sequence having 90% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, The amino acid sequence having the same dockerin binding activity as the amino acid sequence represented by (7) The dockerin domain corresponding to the CipA cohesin domain is SEQ ID NO: Having the amino acid sequence represented by 8 protein according to any one of (1) to (6).
(8) a eukaryotic microorganism,
A eukaryotic microorganism comprising the protein according to any one of (1) to (7) on a surface layer side of the eukaryotic microorganism.
(9) The eukaryotic microorganism according to claim 8, wherein the protein comprises a cellulose-binding domain.
(10) The eukaryotic microorganism according to (8) or (9), which retains exogenous DNA for self-producing the protein in the eukaryotic microorganism.
(11) Any one of (8) to (10), further comprising one or more second skeletal proteins having a binding domain capable of selectively binding the protein and disposed on the surface layer of the cell The eukaryotic microorganism according to crab.
(12) A eukaryotic microorganism that retains two or more types of proteins on the cell surface,
(8) A eukaryotic microorganism having two or more proteins having a dockerin domain that selectively binds to the cohesin domain on the protein of the eukaryotic microorganism according to any one of (8) to (11).
(13) The eukaryotic microorganism according to (12), wherein the eukaryotic microorganism secretes and produces the two or more types of proteins.
(14) The eukaryotic microorganism according to (12) or (13), wherein the two or more types of proteins are selected from an enzyme group that degrades cellulose.
(15) The eukaryotic microorganism according to (14), wherein the protein includes at least two kinds selected from the group consisting of β-glucosidase, endoglucanase, and cellobiohydrolase.
(16) The eukaryotic microorganism according to any one of (12) to (15), which is a yeast.
(17) A method for producing useful substances,
(12) A production method comprising a step of producing the useful substance using the two or more proteins of the eukaryotic microorganism according to any one of (16) to (16).
(18) The production process includes the two or more proteins selected from the group of enzymes that decompose cellulose, and saccharification and fermentation of the cellulose-containing material using the two or more proteins. The production method according to 17).
本明細書の開示は、コヘシン−ドッケリン結合を利用してタンパク質を細胞表層提示するためのタンパク質及びその利用に関する。本明細書に開示されるタンパク質（以下、コヘシンタンパク質ともいう。）によれば、R. flavefacienceのScaE由来のコヘシンドメインを備えることができる。このコヘシンドメインは、R. flavefacienceのScaB由来のコヘシンドメインやC. thermocellumのCipA由来のコヘシンドメインと交差性なく選択特異性を維持してコヘシン−ドッケリン結合が可能であるとともに、連結時においても、コヘシン−ドッケリン結合の結合強度を維持することができる。このため、ScaE由来のコヘシンドメインは、真核微生物の細胞表層への２種以上のタンパク質の配置制御に好適に用いることができる。すなわち、当該コヘシンドメインを備える骨格タンパク質は、２種類以上のタンパク質の細胞表層配置制御に好適である。ScaE由来のコヘシンドメインと組み合わせて用いるのに好ましい他のコヘシンドメインは、R. flavefacienceのScaB由来のコヘシンドメインが挙げられる。さらにまた、他の好ましいコヘシンドメインとしては、C. thermocellumのCipA由来のコヘシンドメインが挙げられる。これらの他のコヘシンドメインは、相互に交差性なく、しかも、これらを組み合わせて一つのタンパク質に配置した際においても、結合強度を維持できるため、コヘシンタンパク質上での高度な配置制御が可能となっている。また、本明細書に開示されるタンパク質の表層提示用の真核微生物は、こうしたコヘシン−ドッケリン結合の選択性を利用して所望のタンパク質が配置制御されたものとなっている。さらに、こうした真核微生物を利用することで、有用物質を効率的に生産することができる。以下、本明細書の開示についての各種実施形態について詳細に説明する。 The disclosure of the present specification relates to a protein for displaying a protein on the cell surface using a cohesin-dockerin bond and the use thereof. According to the protein disclosed herein (hereinafter also referred to as a cohesin protein), a cohesin domain derived from ScaE of R. flavefacience can be provided. This cohesin domain maintains co-hesin-dockerin binding without cross-linking with the cohesin domain derived from ScaB of R. flavefacience and the cohesin domain derived from CipA of C. thermocellum. In this case, the binding strength of the cohesin-dockerin bond can be maintained. For this reason, the ScaE-derived cohesin domain can be suitably used for controlling the arrangement of two or more proteins on the cell surface of eukaryotic microorganisms. That is, the skeletal protein having the cohesin domain is suitable for controlling cell surface arrangement of two or more proteins. Other preferred cohesin domains for use in combination with a ScaE derived cohesin domain include the R. flavefacience ScaB derived cohesin domain. Furthermore, other preferred cohesin domains include C. thermocellum CipA-derived cohesin domains. These other cohesin domains do not cross each other, and even when they are combined and placed in a single protein, the binding strength can be maintained, so that highly precise arrangement control on the cohesin protein is possible. It has become. Moreover, the eukaryotic microorganism for displaying the surface of the protein disclosed in the present specification is such that the desired protein is arranged and controlled using the selectivity of the cohesin-dockerin bond. Furthermore, useful substances can be produced efficiently by using such eukaryotic microorganisms. Hereinafter, various embodiments relating to the disclosure of this specification will be described in detail.
（コヘシンタンパク質）
本発明のコヘシンタンパク質は、２以上のコヘシンドメインを備えるタンパク質であって、少なくとも一つが、R. flavefacience ScaE由来のコヘシンドメインである。本発明のコヘシンタンパク質は、２種類以上の所望のタンパク質を真核微生物に表層提示させるためのタンパク質である。
(Cohesin protein)
The cohesin protein of the present invention is a protein comprising two or more cohesin domains, at least one of which is a cohesin domain derived from R. flavefacience ScaE. The cohesin protein of the present invention is a protein for causing a eukaryotic microorganism to display two or more kinds of desired proteins on the surface.
R. flavefacience ScaE由来のコヘシンドメインとは、R. flavefacience ScaEのコヘシンドメイン（配列番号２）を有するもののか、当該コヘシンドメインに由来して、当該コヘシンドメインと同等のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列を有していてもよい。こうしたアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ変異を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の、より好ましくは９８％以上、一層好ましくは９９％以上の同一性を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列、配列番号１で表される塩基配列によってコードされるアミノ酸配列、配列番号１で表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の、より好ましくは９８％以上、一層好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列であって、配列番号２で表されるアミノ配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列が挙げられる。配列番号１で表される塩基配列は、酵母最適化コドンを適用した配列である。なお、ドッケリン結合活性及びアミノ酸配列及び塩基配列の同一性については後述する。R. flavefacienceのScaE由来のコヘシンドメインのアミノ酸配列としては、配列番号２６で表されるアミノ酸配列（配列番号２５によってコードされるアミノ酸配列）であってもよい。 The cohesin domain derived from R. flavefacience ScaE has a cohesin domain of R. flavefacience ScaE (SEQ ID NO: 2) or is derived from the cohesin domain and has dockerin binding activity equivalent to the cohesin domain. It may have an amino acid sequence. As such an amino acid sequence, an amino acid sequence having one or more amino mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having the same dockerin binding activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2 Having the identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and is identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The amino acid sequence having dockerin binding activity, the amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% More preferably, the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence having 99% or more identity, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence with the same dockerin binding activity and sequence. The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a sequence to which a yeast optimized codon is applied. The dockerin binding activity and the identity of the amino acid sequence and base sequence will be described later. The amino acid sequence of the cohesin domain derived from ScaE of R. flavefacience may be the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 (amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 25).
本コヘシンタンパク質は、ScaE由来のコヘシンドメインのほか、好ましくは、ScaE由来のコヘシンドメインと交差結合性の少ないコヘシンドメインを備えることができる。コヘシンドメインは、通常、セルロソーム生産微生物のセルロソームのスキャホールディンタンパク質が備えるコヘシンドメインに由来している。セルロソームは、以下の表１に挙げられるセルロソーム生産微生物に由来して多数知られている。 In addition to the ScaE-derived cohesin domain, the present cohesin protein can preferably include a cohesin domain that is less cross-linked to the ScaE-derived cohesin domain. The cohesin domain is usually derived from a cohesin domain provided in a cellulosome scaffolding protein of a cellulosome-producing microorganism. Many cellulosomes are known from cellulosome-producing microorganisms listed in Table 1 below.
コヘシンドメインは、セルロソーム生産微生物の形成するセルロソームにおけるタイプＩ〜III骨格タンパク質に備えられる触媒活性のあるセルラーゼ等を非共有結合で結合するドメインとして知られている（粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10（1999）、p41-p50、Demain, A. L., et al., Microbiol Mol. Biol Rev., 69(1), 124-54(2005), Doi, R. H., et al., J. Bacterol., 185(20), 5907-5914(2003)等）。すなわち、コヘシンドメインとしては、セルロソームのタイプＩ骨格タンパク質上のタイプＩコヘシンドメイン、同タイプII骨格タンパク質上のタイプIIコヘシンドメイン及びタイプIII骨格タンパク質上のタイプIIIコヘシンドメインが挙げられる。こうした各種タイプのコヘシンドメイン及び対応するドッケリンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプのコヘシンのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。 The cohesin domain is known as a domain that binds a catalytically active cellulase or the like provided in type I to III skeletal proteins in cellulosomes formed by cellulosome-producing microorganisms (Nakaku et al., Protein nucleic acid enzyme, Vol.44, No.10 (1999), p41-p50, Demain, AL, et al., Microbiol Mol. Biol Rev., 69 (1), 124-54 (2005), Doi, RH, et al., J. Bacterol., 185 (20), 5907-5914 (2003), etc.). That is, the cohesin domain includes a type I cohesin domain on a cellulosome type I skeletal protein, a type II cohesin domain on the same type II skeletal protein, and a type III cohesin domain on a type III skeletal protein. Many of these various types of cohesin domains and corresponding dockerin domains have been sequenced in various cellulosome-producing microorganisms. The amino acid sequences and DNA sequences of these various types of cohesins are various protein databases and DNA sequence databases accessible via NCBI HP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), etc. Can be obtained more easily.
ScaE由来のコヘシンドメイン以外のコヘシンドメインは、公知のコヘシンドメインとドッケリンドメインの配列を利用し、これらのドメインを有するタンパク質を人工的に取得するなどして、結合性を評価することで取得することができる。コヘシン−ドッケリンの選択的結合の評価は、コヘシンタンパク質に結合したドッケリンドメインを有するタンパク質の特異的な活性を測定してもよい。例えば、ドッケリンタンパク質がセルラーゼ活性部位を有するものであるときは、上記のごとくの対照ドッケリンタンパク質とそのセルラーゼ活性を比較してもよい。具体的には、例えば、ドッケリンタンパク質がエンドグルカナーゼなどのセルラーゼ活性部位を有するとき、採取した培養上清又はドッケリンタンパク質を表層提示した真核微生物につき、適当なセルラーゼ基質（カルボキシメチルセルロース、リン酸セルロース、結晶性セルロース等）と反応させて反応生成物量や基質量等を測定することで酵素活性を評価できる。反応温度、ｐＨ及び時間は、酵素の種類等において適宜設定することができる。なお、酵素反応の結果生じる還元糖量の定量法としてはSomogyi法、Tauber-Kleiner法、Hanes法（滴定法）、Park-Johnson法、3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）法、ＴＺ法（Journal of Biochemical Methods, 11(1985)109-115）等の公知の方法を適宜採用すればよい。さらに、エンドグルカナーゼなどのセルラーゼ活性は、カルボキシルメチルセルロースなどのセルロースを含有する固相体からなる評価領域に本発明としての可能性のある被験タンパク質を供給し、当該領域の固相体中のセルロースを分解させて、固相体中でセルロースが分解されて消失した領域（ハロー：固相体においてバイオマスの分解により淡色化又は無色化する領域）の大きさで評価することもできる。選択的な結合の評価は、また、ドッケリンドメインを有するタンパク質に付した蛍光標識の蛍光強度で評価してもよい。タンパク質の活性と蛍光強度との双方において選択的結合性が肯定された組み合わせがより好ましい。 Cohesin domains other than the ScaE-derived cohesin domain should be evaluated for binding by using a known cohesin domain and dockerin domain sequence and artificially obtaining proteins having these domains. Can be obtained at. Evaluation of cohesin-dockerin selective binding may measure the specific activity of a protein having a dockerin domain bound to a cohesin protein. For example, when the dockerin protein has a cellulase active site, the cellulase activity may be compared with the control dockerin protein as described above. Specifically, for example, when the dockerin protein has a cellulase active site such as endoglucanase, an appropriate cellulase substrate (carboxymethylcellulose, phosphate) is used for the collected culture supernatant or the eukaryotic microorganism displaying the dockerin protein on the surface. The enzyme activity can be evaluated by measuring the amount of the reaction product, the base mass and the like by reacting with cellulose, crystalline cellulose and the like. The reaction temperature, pH, and time can be appropriately set depending on the type of enzyme. In addition, methods for quantifying the amount of reducing sugar resulting from the enzyme reaction include the Somogyi method, Tauber-Kleiner method, Hanes method (titration method), Park-Johnson method, 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method, TZ method (Journal of Biochemical Methods, 11 (1985) 109-115) or the like may be employed as appropriate. Furthermore, cellulase activity such as endoglucanase is supplied to the evaluation region consisting of a solid phase containing cellulose such as carboxymethyl cellulose, and the test protein that has the potential as the present invention is supplied. It can also be evaluated by the size of a region where the cellulose is decomposed and disappeared in the solid phase (halo: a region where the solid phase is lightened or colorless due to decomposition of biomass). The evaluation of selective binding may also be evaluated by the fluorescence intensity of the fluorescent label attached to the protein having the dockerin domain. A combination in which selective binding is positive in both protein activity and fluorescence intensity is more preferable.
他のコヘシンドメインとしては、例えば、R. flavefacience、C. thermocellum、B. cellulosolvens及びA. fulgidusの天然コヘシン由来のコヘシンドメインが挙げられる。これらのコヘシンドメインは、R. flavefacience ScaE由来のコヘシンドメインとの間で一定以上の選択的結合性が確保されるからである。なかでも、R. flavefacience、C. thermocellumに由来することが好ましい。さらには、R. flavefacienceのScaB由来のコヘシンドメインが挙げられる。 Examples of other cohesin domains include cohesin domains derived from natural cohesins of R. flavefacience, C. thermocellum, B. cellulosolvens, and A. fulgidus. This is because these cohesin domains ensure a certain degree of selective binding with the cohesin domain derived from R. flavefacience ScaE. Among these, it is preferable to be derived from R. flavefacience and C. thermocellum. Furthermore, a cohesin domain derived from ScaB of R. flavefacience can be mentioned.
R. flavefacience ScaB由来のコヘシンドメインは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するほか、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ変異を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の、より好ましくは９８％以上、一層好ましくは９９％以上の同一性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列、配列番号３で表される塩基配列によってコードされるアミノ酸配列、及び配列番号３で表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の、より好ましくは９８％以上、一層好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列であって、配列番号４で表されるアミノ配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有することができる。配列番号３で表される塩基配列は、酵母最適化コドンを適用した配列である。R. flavefacienceのScaB由来のコヘシンドメインのアミノ酸配列としては、配列番号２８で表されるアミノ酸配列（配列番号２７によってコードされるアミノ酸配列）であってもよい。 The cohesin domain derived from R. flavefacience ScaB has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and has one or more amino mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and is represented by SEQ ID NO: 4. The amino acid sequence having the same dockerin binding activity as the amino acid sequence to be determined, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more An amino acid sequence having identity and having the same dockerin binding activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, an amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and represented by SEQ ID NO: 3 Depending on the base sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more identity with the base sequence. An amino acid sequence encoded, may have an amino acid sequence selected from the amino acid sequence having an amino sequence identical to the dockerin binding activity of SEQ ID NO: 4. The base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is a sequence to which a yeast optimized codon is applied. The amino acid sequence of the cohesin domain derived from ScaB of R. flavefacience may be the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 (amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 27).
また、C. thermocellum CipA由来コヘシンドメインが挙げられる。このCipA由来コヘシンドメインは、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するほか、配列番号６で表されるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ変異を有し、配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列、配列番号６で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の、より好ましくは９８％以上、一層好ましくは９９％以上の同一性を有し、配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列、配列番号５で表される塩基配列によってコードされるアミノ酸配列、配列番号５で表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の、より好ましくは９８％以上、一層好ましくは９９％以上、好ましくは９５％以上の、より好ましくは９８％以上、一層好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列であって、配列番号６で表されるアミノ配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有することができる。配列番号５で表される塩基配列は、酵母最適化コドンを適用した配列である。 Moreover, the C. thermocellum CipA origin cohesin domain is mentioned. This CipA-derived cohesin domain has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and has one or more amino mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 6 The amino acid sequence having the same dockerin binding activity as the sequence, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 has 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more identity And an amino acid sequence having the same dockerin binding activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, an amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and 90 % Or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, preferably 95% or more, more preferably 98%. % Or more, more preferably 99% or more of an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having the same dockerin binding activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 Can have an array. The base sequence represented by SEQ ID NO: 5 is a sequence to which a yeast optimized codon is applied.
C. thermocellumのCipAコヘシンドメインとコヘシン−ドッケリン結合により結合するC. thermocellum CipA由来のドッケリンドメインは、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有することが好ましい。このアミノ酸配列であると、酵母などの真核微生物において糖鎖修飾部位が変異の導入により機能しなくなっているため、糖鎖修飾を受けず、その結果、本来のコヘシン−ドッケリン結合強度を確保することができる。 The C. thermocellum CipA-derived dockerin domain that binds to the C. thermocellum CipA cohesin domain by a cohesin-dockerin bond preferably has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8. With this amino acid sequence, the sugar chain modification site has become nonfunctional due to the introduction of mutation in eukaryotic microorganisms such as yeast, so that it does not undergo sugar chain modification, and as a result, the original cohesin-dockerin binding strength is ensured. be able to.
本コヘシンタンパク質においては、C. cellulolyticumのコヘシンドメイン、特に、C. cellulolyticumのCipC由来のコヘシンドメインを備えていないことが好ましい。この種のコヘシンドメインは、酵母や真核微生物などのほか、例えば、R. flavefacience、C. thermocellum等のコヘシン−ドッケリン結合のドッケリンドメインにも結合性を示すからである。 This cohesin protein preferably does not have a cohesin domain of C. cellulolyticum, particularly a cohesin domain derived from CipC of C. cellulolyticum. This is because this type of cohesin domain exhibits binding properties to yeast and eukaryotic microorganisms as well as dockerin domains of cohesin-dockerin binding such as R. flavefacience and C. thermocellum.
なお、本明細書においてアミノ酸配列及び塩基配列における同一性及び類似性とは、当業者にいて知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術分野で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する好ましい方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公に利用可能なプログラムにコードされている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。 In the present specification, the identity and similarity in the amino acid sequence and the base sequence are determined by comparing the sequences, as known in the art, two or more proteins or two or more polynucleotides The relationship between. In the art, “identity” refers to a protein or polynucleotide sequence as determined by alignment between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by alignment between a series of such sequences. Means the degree of sequence invariance between. Similarity is also the correlation between protein or polynucleotide sequences, as determined by alignment between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by alignment between a series of such sequences. Means the degree of More specifically, it is determined by sequence identity and conservation (substitutions that maintain specific amino acids in the sequence or physicochemical properties in the sequence). Similarity is referred to as Similarity in the BLAST sequence homology search results described below. Preferred methods for determining identity and similarity are designed to align the longest between the sequences being compared. The method for determining identity and similarity is coded in a publicly available program. For example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program by Altschul et al. (Eg Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)). The conditions for using software such as BLAST are not particularly limited, but it is preferable to use default values.
本コヘシンタンパク質は、２以上のコヘシンドメインを備えている。２以上のコヘシンドメインは、１つのコヘシンタンパク質にタンデム状に備えられていることが好ましい。２以上のコヘシンドメインの配置パターンは、適宜決定される。例えば、ScaE由来のコヘシンドメインは、本コヘシンタンパク質の細胞表層側基部の反対側の自由端側に備えられることが好ましい。また、ScaB由来のコヘシンドメインは、本コヘシンタンパク質上のいずれの箇所にあってもよく、自由端側であっても細胞表層側であっても中央部であってもよい。さらに、CipA由来のコヘシンドメインは、本コヘシンタンパク質上のいずれの箇所にあってもよく、自由端側であっても細胞表層側であっても中央部であってもよい。一つのコヘシンタンパク質に２以上のコヘシンドメインを備えるとき、２以上のコヘシンドメインは、ドッケリンドメインを有するタンパク質の結合を妨げない程度のインターバルを置いて配置される。コヘシンタンパク質におけるコヘシンドメイン以外のアミノ酸配列は、天然のセルロソームの骨格タンパク質のアミノ酸配列を適宜参考にして決定することができる。 The cohesin protein has two or more cohesin domains. Two or more cohesin domains are preferably provided in one cohesin protein in tandem. The arrangement pattern of two or more cohesin domains is appropriately determined. For example, the ScaE-derived cohesin domain is preferably provided on the free end side opposite to the cell surface side base of the cohesin protein. Further, the ScaB-derived cohesin domain may be located anywhere on the present cohesin protein, and may be on the free end side, on the cell surface side, or in the center. Further, the CipA-derived cohesin domain may be located anywhere on the cohesin protein, and may be on the free end side, on the cell surface side, or in the center. When two or more cohesin domains are provided in one cohesin protein, the two or more cohesin domains are arranged at intervals that do not prevent binding of a protein having a dockerin domain. The amino acid sequence other than the cohesin domain in the cohesin protein can be determined by appropriately referring to the amino acid sequence of the natural cellulosome skeletal protein.
２以上のコヘシンドメインを異なるコヘシンタンパク質にそれぞれ備えるようにしてもよい。所望のタンパク質を近接して配置するには、一つのコヘシンタンパク質に２以上のコヘシンドメインを備えて、これらのそれぞれに所望のタンパク質を保持させるのが好都合であるが、種々の要請を考慮すると、２以上のコヘシンタンパク質を利用した分散形態であってもよい。 Two or more cohesin domains may be provided in different cohesin proteins. In order to place desired proteins close to each other, it is convenient to provide two or more cohesin domains in one cohesin protein, each of which holds the desired protein. Then, the dispersion form using two or more cohesin proteins may be sufficient.
なお、所望のタンパク質をどの程度の配置順序でどのような量的比率で表層提示するかは、特定のコヘシンドメインを有するコヘシンタンパク質の発現量（プロモーターの選択やコピー数等による）の調整や一つのコヘシンタンパク質における特定コヘシンドメインのリピート数によって調整できる。さらに、あえてコヘシン−ドッケリン結合における結合量の差を利用することもできる。 It should be noted that the amount of the desired protein to be presented on the surface and in what quantitative ratio is adjusted by the expression level of the cohesin protein having a specific cohesin domain (depending on the choice of promoter, copy number, etc.) Or the number of repeats of a specific cohesin domain in one cohesin protein. Furthermore, the difference in the binding amount in the cohesin-dockerin bond can also be used.
本コヘシンタンパク質は、コヘシンドメイン以外に、タイプＩ〜IIIから選択される骨格タンパク質のセルロース結合ドメイン（CBD）を有していることが好ましい。CBDは、各種骨格タンパク質において基質であるセルロースに結合するドメインとして知られている（前述粟冠ら）。セルロース結合ドメインは、１又は２以上有していてもよい。各種のセルロソーム生産微生物のセルロソームにおけるCBDのアミノ酸配列及びDNA配列の多くが決定されている。これらの各種のCBDのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。 The cohesin protein preferably has a cellulose-binding domain (CBD) of a skeletal protein selected from types I to III in addition to the cohesin domain. CBD is known as a domain that binds to cellulose, which is a substrate in various skeletal proteins (as described above). The cellulose binding domain may have one or two or more. Many of the amino acid sequences and DNA sequences of CBD in the cellulosome of various cellulosome-producing microorganisms have been determined. The amino acid sequence and DNA sequence of these various CBDs can be easily obtained from various protein databases and DNA sequence databases accessible via NCBI website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Can be obtained.
なお、本コヘシンタンパク質は、後述するように、そのコヘシンドメインに基づくコヘシン−ドッケリン結合を介して、後述するドッケリンドメインを有する所望のタンパク質を保持する、複合タンパク質の形態も採ることができる。 In addition, this cohesin protein can also take the form of the composite protein which hold | maintains the desired protein which has the dockerin domain mentioned later through the cohesin-dockerin coupling | bonding based on the cohesin domain so that it may mention later. .
本コヘシンタンパク質は、真核微生物の細胞表層に提示されるように構成されてもよい。本コヘシンタンパク質に細胞表層提示性を付与するには、公知の分泌シグナルや表層提示用のシステムを用いることができる。例えば、分泌シグナルや凝集性タンパク質又はその一部のアミノ酸配列が付与される。分泌シグナルとしては、例えば、Rhizopus oryzaeやC. albicansのグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーなどが挙げられる。また、凝集性タンパク質としては、α−アグルチニンをコードするSAG1遺伝子の５’領域の３２０アミノ酸残基からなるペプチドが挙げられる。また、所望のタンパク質を細胞表層に提示するためのポリペプチドや手法は、ＷＯ０１／７９４８３号公報や、特開２００３−２３５５７９号公報、ＷＯ２００２／０４２４８３号パンフレット、ＷＯ２００３／０１６５２５号パンフレット、特開２００６−１３６２２３号公報、藤田らの文献（藤田ら，2004. Appl Environ Microbiol 70:1207-1212および藤田ら, 2002. Appl Environ Microbiol 68:5136-5141.）、村井ら, 1998. Appl Environ Microbiol 64:4857-4861.に開示されている。 The cohesin protein may be configured to be displayed on the cell surface of eukaryotic microorganisms. In order to impart cell surface display properties to the cohesin protein, a known secretion signal or surface display system can be used. For example, a secretory signal, an aggregating protein, or a part of the amino acid sequence is given. Examples of the secretion signal include secretion signals of glucoamylase genes of Rhizopus oryzae and C. albicans, yeast invertase leader, α factor leader and the like. Examples of the aggregating protein include a peptide consisting of 320 amino acid residues in the 5 'region of the SAG1 gene encoding α-agglutinin. Polypeptides and techniques for displaying a desired protein on the cell surface are disclosed in WO01 / 79483, JP2003-235579, WO2002 / 042483, WO2003 / 016525, and JP2006. No. 136223, Fujita et al. (Fujita et al., 2004. Appl Environ Microbiol 70: 1207-1212 and Fujita et al., 2002. Appl Environ Microbiol 68: 5136-5141.), Murai et al., 1998. Appl Environ Microbiol 64: 4857 -4861.
本コヘシンタンパク質は、例えば、上記したコヘシンドメインをコードする塩基配列と、適度なインターバルのアミノ酸配列をコードする塩基配列と、その他、必要に応じてＣＢＤをコードする塩基配列や分泌シグナルや表層提示用のアミノ酸配列をコードする塩基配列とを組み合わせた塩基配列をコードする塩基配列等を組み合わせて本コヘシンタンパク質をコードするＤＮＡを取得して、公知の方法により発現ベクター等を構築し、酵母などの真核細胞等の適当な宿主を形質転換し、形質転換細胞を、当業者に公知の通常の方法に従って培養し、当該培養細胞または培地から本コヘシンタンパク質を回収することによって得ることができる。すなわち、培養細胞から、当該細胞の破砕後、遠心分離等の分離操作によりタンパク質含有画分を得、この画分からタンパク質を回収することにより得ることができる。さらに、本コヘシンタンパク質は、慣用の精製技術を組み合わせて単離することができる。なお、本コヘシンタンパク質におけるコヘシンドメイン間のアミノ酸配列は、隣接するコヘシンドメインの取得源の骨格タンパク質において、当該コヘシンドメインの上下流にもともと存在する数個〜２０個以下程度のアミノ酸を必要数連結するなどして決定することができる。 This cohesin protein includes, for example, a base sequence encoding the above-described cohesin domain, a base sequence encoding an amino acid sequence at an appropriate interval, a base sequence encoding CBD as necessary, a secretion signal, and a surface layer. A DNA encoding the cohesin protein is obtained by combining a base sequence encoding a base sequence combined with a base sequence encoding the amino acid sequence for presentation, and an expression vector or the like is constructed by a known method. Obtained by transforming a suitable host such as eukaryotic cells, etc., culturing the transformed cells according to a conventional method known to those skilled in the art, and recovering the cohesin protein from the cultured cells or medium. it can. That is, from the cultured cells, the cells can be obtained by crushing the cells, obtaining a protein-containing fraction by a separation operation such as centrifugation, and recovering the protein from the fraction. Further, the cohesin protein can be isolated by a combination of conventional purification techniques. In addition, the amino acid sequence between cohesin domains in the present cohesin protein includes several to 20 or less amino acids originally present upstream and downstream of the cohesin domain in the skeleton protein from which the adjacent cohesin domain is obtained. It can be determined by connecting the required number.
コヘシンドメインに対するアミノ酸の置換、欠失または付加等は、常用される技術、例えば、既に説明したように、部位特異的突然変異誘発法等により、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を改変することにより導入することができる。 For substitution, deletion or addition of amino acids to the cohesin domain, the base sequence encoding the amino acid sequence is altered by a commonly used technique such as site-directed mutagenesis as described above. Can be introduced.
（コヘシンドメイン及びコヘシンタンパク質をコードするＤＮＡ）
コヘシンドメインをコードするＤＮＡは、配列番号２等で表される各種コヘシンドメインのアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と上記のように一定の関連性のあるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである。こうした各種態様のＤＮＡの塩基配列は、遺伝暗号の縮重や発現させようとする真核生物におけるコドン用法に従い、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく所定のアミノ酸配列をコードする配列番号１等で表される塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置換されていてもよい。例えば、公知の酵母最適化コドンが適用されていてもよい。
(DNA encoding cohesin domain and cohesin protein)
The DNA encoding the cohesin domain is a DNA encoding an amino acid sequence of various cohesin domains represented by SEQ ID NO: 2 or the like, or an amino acid sequence having a certain relationship with the amino acid sequence as described above. The DNA base sequence of these various aspects is represented by SEQ ID NO: 1 or the like that encodes a predetermined amino acid sequence without changing the amino acid sequence of the protein in accordance with the codon usage in eukaryotes to be degenerated or expressed in the genetic code. At least one base of the base sequence may be replaced with another type of base. For example, a known yeast optimized codon may be applied.
本発明で用いるコヘシンドメインをコードする各種態様のＤＮＡは、例えば、配列番号１等の配列に基づいて設計したプライマーを用いて、セルロソーム生産微生物等から抽出した核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、上記核酸を鋳型とし、配列番号１等の配列に基づいたプローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。 The DNA of various embodiments encoding the cohesin domain used in the present invention is subjected to PCR amplification using, for example, a nucleic acid extracted from a cellulosome-producing microorganism or the like using a primer designed based on the sequence of SEQ ID NO: 1 or the like. Thus, it can be obtained as a nucleic acid fragment. Moreover, it can obtain as a nucleic acid fragment by performing hybridization using the above nucleic acid as a template and using a probe based on the sequence such as SEQ ID NO: 1. Alternatively, it may be synthesized as a nucleic acid fragment by various nucleic acid sequence synthesis methods known in the art such as chemical synthesis methods.
また、上記各種態様のＤＮＡは、例えば、配列番号２等で表されるアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ（たとえば、配列番号１で表される塩基配列からなる）を、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって取得することができる。このような手法としては、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法が挙げられ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。 In addition, the DNAs of the various embodiments described above are, for example, a DNA encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like (for example, consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1) by a conventional mutagenesis method, It can be obtained by modification by a site-specific mutation method, a molecular evolution method using error-prone PCR, or the like. As such a technique, a known technique such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a similar method can be mentioned. For example, a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis (for example, Mutant-K (manufactured by TAKARA) ), Mutant-G (manufactured by TAKARA)), or the like, or the LA PCR in vitro Mutagenesis series kit from TAKARA.
そのほか、当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）等を参照することにより、例えば、配列番号１又は２等の公知配列に基づいて、各種態様のコヘシンドメインをコードするＤＮＡを取得することができる。 In addition, those skilled in the art should refer to Molecular Cloning (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)). Thus, for example, based on a known sequence such as SEQ ID NO: 1 or 2, DNAs encoding various forms of cohesin domains can be obtained.
本コヘシンタンパク質をコードするＤＮＡは、コヘシンドメインとして、上述の各種のコヘシンドメインをコードする塩基配列を含むことができる。 The DNA encoding the present cohesin protein can include base sequences encoding the various cohesin domains described above as the cohesin domain.
（真核微生物）
本発明の真核微生物は、本コヘシンタンパク質を真核微生物の表層側に備えることができる。本発明の微生物は、本コヘシンタンパク質を微生物内で自己生産するための外来性ＤＮＡを保持することが好ましい。こうすることで、表層提示を簡素化し、効率的かつ安定的に所望のタンパク質を表層提示できることとなる。
(Eukaryotic microorganism)
The eukaryotic microorganism of the present invention can have the cohesin protein on the surface layer side of the eukaryotic microorganism. The microorganism of the present invention preferably holds exogenous DNA for self-producing this cohesin protein in the microorganism. By doing so, surface layer presentation can be simplified, and a desired protein can be efficiently and stably displayed on the surface layer.
本コヘシンタンパク質をコードするＤＮＡは、真核微生物内において当該タンパク質を発現可能に保持されていればよく、その保持形態は特に限定されない。例えば、宿主微生物で作動可能なプロモーターの制御下に連結されるとともに適切なターミネーターをその下流に有した状態で保持されている。プロモーターは、構成的プロモーターであっても誘導的プロモーターであってもよい。このような状態のＤＮＡは、宿主染色体内に組み込まれた形態であってもよいし、宿主核内に保持される２μプラスミドや核外に保持されるプラスミドのような形態であってもよい。一般には、こうした外来ＤＮＡの導入に伴って、宿主において利用可能な選択マーカー遺伝子も同時に保持されていてもよい。 The DNA encoding this cohesin protein is not particularly limited as long as the protein can be expressed in a eukaryotic microorganism so that the protein can be expressed. For example, it is linked under the control of a promoter operable in the host microorganism and is held in a state having an appropriate terminator downstream thereof. The promoter may be a constitutive promoter or an inducible promoter. The DNA in such a state may be in a form incorporated in the host chromosome, or in a form such as a 2μ plasmid retained in the host nucleus or a plasmid retained outside the nucleus. In general, with the introduction of such foreign DNA, a selectable marker gene that can be used in the host may also be held at the same time.
真核微生物の表層において、本コヘシンタンパク質は、既に説明した公知の細胞表層提示技術に基づいて保持されるのに限定されるものではなく、公知の他の形態で保持されていてもよい。 In the surface layer of a eukaryotic microorganism, the present cohesin protein is not limited to be retained based on the known cell surface display technology described above, and may be retained in another known form.
真核微生物は、表層に提示タンパク質を、典型的には外来タンパク質として生産するのに好適な宿主微生物である。こうした真核微生物としては、特に限定されないで、例えば、公知の各種酵母を利用できる。後述するエタノール発酵等を考慮すると、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピヒア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。 Eukaryotic microorganisms are suitable host microorganisms for producing display proteins on the surface, typically as foreign proteins. Such eukaryotic microorganisms are not particularly limited, and various known yeasts can be used, for example. In consideration of ethanol fermentation described later, yeasts of the genus Saccharomyces cerevisiae such as Saccharomyces cerevisiae, yeasts of the genus Schizosaccharomyces pombe such as Schizosaccharomyces pombe, Candida shehatae, etc. Yeast of the genus Candida, yeast of the genus Pichia such as Pichia stipitis, yeast of the genus Hansenula, yeast of the genus Trichosporon, yeast of the genus Brettanomyces, the genus Pachysolen And yeast of the genus Yamadazyma, yeasts of the genus Kluyveromyces such as Kluyveromyces marxianus and Kluveromyces lactis. Of these, Saccharomyces yeasts are preferable from the viewpoint of industrial availability. Of these, Saccharomyces cerevisiae is preferable.
真核微生物は、また、コヘシンドメインに選択的に結合するドッケリンドメインを有する２種類以上の所望のタンパク質を保持するものであってもよい。すなわち、本コヘシンタンパク質を利用しコヘシン−ドッケリン結合を介して所望のタンパク質を表層に保持したものであってもよい。 A eukaryotic microorganism may also retain two or more desired proteins having a dockerin domain that selectively binds to a cohesin domain. That is, the desired protein may be retained on the surface layer through the cohesin-dockerin bond using the present cohesin protein.
（ドッケリンドメインを有するタンパク質）
ドッケリドメインを有するタンパク質は、コヘシンタンパク質上にコヘシン−ドッケリン結合により結合されて真核微生物の細胞表層に提示される。ドッケリンドメインとしては、例えば、表１に挙げられるセルロソーム生産微生物に由来して多数知られているが、本コヘシンタンパク質に備えられているコヘシンドメインにコヘシン−ドッケリン結合により結合するドッケリンドメインを用いる。こうしたドッケリンドメインは、すでに説明した方法によって、コヘシンドメインとの組み合わせで決定される。好ましいドッケリンドメインとしては、すでに記載した好ましいコヘシンドメインに結合するドッケリンドメインが挙げられる。例えば、R. flavefacienceのScaE由来のコヘシンドメインに対するR. flavefacienceのScaB-X由来ドッケリンドメイン、R. flavefacienceのScaB由来のコヘシンドメインに対するR. flavefacienceのScaA由来ドッケリンドメイン、C. thermocellumのCipA由来コヘシンドメインに対するC. thermocellumのC48SDD由来ドッケリンドメインが挙げられる。
(Protein having dockerin domain)
A protein having a dockeri domain is bound to the cohesin protein by a cohesin-dockerin bond and displayed on the cell surface of a eukaryotic microorganism. As the dockerin domain, for example, many are known from cellulosome-producing microorganisms listed in Table 1, but the dockerin domain binds to the cohesin domain provided in the cohesin protein by a cohesin-dockerin bond. Is used. Such dockerin domains are determined in combination with the cohesin domain by the methods already described. Preferred dockerin domains include dockerin domains that bind to the preferred cohesin domains already described. For example, R. flavefacience ScaB-X derived dockerin domain to ScaE-derived cohesin domain, R. flavefacience ScaB-derived cohesin domain to R. flavefacience ScaA-derived dockerin domain, C. thermocellum A C48SDD-derived dockerin domain of C. thermocellum with respect to the CipA-derived cohesin domain.
ドッケリンドメインは、セルロソーム生産微生物に由来する天然のドッケリンドメイン又は対応するコヘシンドメインに対する結合性を有する限りそのドッケリンドメインのアミノ酸配列において１又は２以上の変異（付加、挿入、欠失及び置換）を導入した改変ドッケリンドメインであってもよい。例えば、ドッケリンドメイン中に酵母などの真核微生物による糖鎖修飾部位を有する場合には、当該部位のアミノ酸配列中の例えばアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換する変異を導入することで、糖鎖修飾を回避して、本来のコヘシン−ドッケリン結合強度を確保できる。 The dockerin domain has one or more mutations (additions, insertions, deletions and deletions) in the amino acid sequence of the dockerin domain as long as it has binding to the natural dockerin domain derived from the cellulosome-producing microorganism or the corresponding cohesin domain. It may be a modified dockerin domain into which (substitution) has been introduced. For example, when the dockerin domain has a sugar chain modification site by a eukaryotic microorganism such as yeast, a mutation that substitutes aspartic acid (D) for example asparagine (N) in the amino acid sequence of the site is introduced. Thus, sugar chain modification can be avoided and the original cohesin-dockerin bond strength can be secured.
ドッケリンドメインを有するタンパク質は、ドッケリンドメイン以外に活性部位を備えることができる。すなわち、融合タンパク質とすることができる。活性部位の種類は用途に応じて適宜決定される。ドッケリンタンパク質は、ドッケリンと活性部位とを適宜組み合わせた人工的なタンパク質であってもよい。活性部位に相当するタンパク質は、特に限定されないが、例えば、セルロソームの構成タンパク質であるセルラーゼであって、ドッケリンを本来的に有するセルラーゼをそのままあるいは適宜改変して用いることもできる。 A protein having a dockerin domain can have an active site in addition to the dockerin domain. That is, it can be a fusion protein. The type of active site is appropriately determined according to the application. The dockerin protein may be an artificial protein in which dockerin and an active site are appropriately combined. The protein corresponding to the active site is not particularly limited. For example, a cellulase that is a constituent protein of cellulosome, and a cellulase that originally has dockerin may be used as it is or after being appropriately modified.
ドッケリンタンパク質は、バイオマスに由来するセルロース含有材料の糖化利用に際しては、例えば、セルラーゼ等の各種酵素活性部位を備えることができる。こうした活性部位は、公知のセルラーゼにおける活性部位を適宜利用できる。セルラーゼとしては、エンドグルカナーゼ（EC 3.2.1.74）、セロビオヒドロラーゼ（EC 3.2.1.91）及びβ−グルコシダーゼ（EC23.2.4.1、EC 3.2.1.21）が挙げられる。なお、セルラーゼは、そのアミノ酸配列の類似性に基づきＧＨＦ（Glycoside Hydrolase family）(http://www.cazy.org/fam/acc.gh.html)の１３（５，６，７，８，９，１０，１２，４４，４５，４８，５１，６１，７４）のファミリーに分類されている。異なるファミリーに分類される同種又は異種のセルラーゼを組み合わせてもよい。 Dockerin protein can be provided with various enzyme active sites, such as cellulase, when saccharifying and utilizing a cellulose-containing material derived from biomass. As such an active site, an active site in a known cellulase can be appropriately used. Cellulases include endoglucanase (EC 3.2.1.74), cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) and β-glucosidase (EC 23.2.4.1, EC 3.2.1.21). Note that cellulase 13 (5, 6, 7, 8, 9) of GHF (Glycoside Hydrolase family) (http://www.cazy.org/fam/acc.gh.html) is based on the similarity of amino acid sequences. , 10, 12, 44, 45, 48, 51, 61, 74). You may combine the same or different cellulases classified into a different family.
セルロースの分解を考慮すると、セルラーゼとしては、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼからなる群から選択される２種以上を含むことが好ましい。また、セルラーゼとしては、特に限定しないが、それ自体活性の高いセルラーゼであることが好ましい。このようなセルラーゼとしては、例えば、ファネロケーテ（Phanerochaete）属菌、Trichoderma reeseiなどのトリコデルマ属（Trichoderma）菌、フザリウム属（Fusarium）菌、トレメテス属（Tremetes）菌、ペニシリウム属（Penicillium）菌、フミコーラ属（Humicola）菌、アクレモニウム属（Acremonium）菌、アスペルギルス属（Aspergillus）菌等の糸状菌の他に、クロストリジウム属（Clostridium）菌、シュードモナス属（Pseudomonas）菌、セルロモナス属（Cellulomonas）菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）菌、バチルス属（Bacillus）菌等の細菌、スルフォロバス属（Sulfolobus）菌等の始原菌、さらにストレプトマイセス属（Streptomyces）菌、サーモアクチノマイセス属（Thermoactinomyces）菌などの放射菌由来のセルラーゼが挙げられる。なお、こうしたセルラーゼ又はその活性部位は、人工的に改変されていてもよい。 In consideration of cellulose degradation, the cellulase preferably contains two or more selected from the group consisting of β-glucosidase, endoglucanase and cellobiohydrolase. The cellulase is not particularly limited, but is preferably a cellulase having high activity by itself. Such cellulases include, for example, Phanerochaete bacteria, Trichoderma bacteria such as Trichoderma reesei, Fusarium bacteria, Tresartes bacteria, Penicillium bacteria, Humicola bacteria In addition to filamentous fungi such as (Humicola), Acremonium, and Aspergillus, Clostridium, Pseudomonas, Cellulomonas, and Luminococcus Bacteria such as genus (Ruminococcus) and Bacillus, primordial fungi such as Sulfolobus, and more, such as Streptomyces and Thermoactinomyces Derived cellulase. Such cellulase or its active site may be artificially modified.
ドッケリンドメインを有するタンパク質は、バイオマスの有効利用を考慮したとき、ヘミセルラーゼ活性部位を備えていてもよい。さらに、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ及びラッカーゼなどのリグニン分解酵素が挙げられる。また、例えば、セルロース緩和タンパク質であるスウォレニンやエクスパンシン、セルロソームやセルラーゼの構成部分であるセルロース結合ドメイン（タンパク質）が挙げられる。また、キシラナーゼやヘミセルラーゼ等のその他のバイオマス分解酵素も挙げられる。これらのタンパク質は、いずれもセルロースへのセルラーゼのアクセシビリティを向上させることができる。 A protein having a dockerin domain may have a hemicellulase active site in consideration of effective use of biomass. Further examples include lignin degrading enzymes such as lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase. In addition, examples include cellulose binding domains (proteins) that are constituent parts of cellulose relieving proteins swollenin and expansin, cellulosome and cellulase. In addition, other biomass degrading enzymes such as xylanase and hemicellulase can also be mentioned. Any of these proteins can improve the accessibility of cellulase to cellulose.
ドッケリンドメインを有するタンパク質は、好ましくは２以上表層提示される。本真核微生物は、その表層において２以上のタンパク質を所望の位置に配置できるからである。２以上の、ドッケリンドメインを有するタンパク質は、ドッケリンドメインの種類、活性部位の種類等において区別される。 Two or more proteins having dockerin domains are preferably displayed on the surface. This is because the present eukaryotic microorganism can arrange two or more proteins at desired positions on its surface layer. Two or more proteins having a dockerin domain are distinguished by the type of dockerin domain, the type of active site, and the like.
コヘシンタンパク質を表層提示する真核微生物は、ドッケリンドメインを有するタンパクを自己生産し、細胞外に分泌することが好ましい。すなわち、真核微生物は、ドッケリンドメインを有するタンパク質をコードするＤＮＡを、当該タンパク質を自己生産可能でかつ細胞外に分泌可能に保持していることが好ましい。こうすることで、真核微生物は増殖と同時に、細胞表層にコヘシンタンパク質を提示し、同時に細胞表層にドッケリンドメインを有するタンパク質が提示される。特に、本コヘシンタンパク質は、結合選択性と結合強度が確保されたコヘシンドメインを備えているため、ドッケリンドメインを有するタンパク質を分泌発現させた場合であっても、高度に配置制御と量的制御が可能となっている。 It is preferable that the eukaryotic microorganism displaying the cohesin protein on its surface self-produces a protein having a dockerin domain and secretes it outside the cell. That is, it is preferable that the eukaryotic microorganism holds DNA encoding a protein having a dockerin domain so that the protein can be self-produced and secreted extracellularly. By doing so, the eukaryotic microorganism presents the cohesin protein on the cell surface simultaneously with the growth, and at the same time, the protein having the dockerin domain is displayed on the cell surface. In particular, this cohesin protein has a cohesin domain that ensures binding selectivity and binding strength, so that even when a protein having a dockerin domain is secreted and expressed, it has a high degree of arrangement control and quantity. Control is possible.
なお、セルラーゼなどの酵素は、本来的に細胞外分泌のためのシグナルを有していることが多い。ドッケリンタンパク質に細胞外分泌性を付与するには、公知の分泌シグナルを用いることができる。分泌シグナルは、すでに説明したように、用いる真核微生物の種類に応じて適宜選択される。 In many cases, enzymes such as cellulase inherently have a signal for extracellular secretion. A known secretion signal can be used to impart extracellular secretion to the dockerin protein. As described above, the secretion signal is appropriately selected according to the type of eukaryotic microorganism to be used.
なお、コヘシンタンパク質を表層提示する真核微生物に対してドッケリンドメインを有するタンパク質を供給して、コヘシン−ドッケリン結合による自己集合を利用してもドッケリンドメインを有するタンパク質を表層提示した真核微生物を作製できる。表層提示用微生物とドッケリンドメインを有するタンパク質の接触させる方法は特に限定しない。真核微生物が生存でき、タンパク質が変成しないｐＨ、塩濃度、温度の液体中において、両者を混合等させればよい。適宜、撹拌により接触確率を向上させてもよい。 In addition, a protein having a dockerin domain is supplied to a eukaryotic microorganism displaying the cohesin protein on the surface, and a protein having the dockerin domain is displayed on the surface even if self-assembly by a cohesin-dockerin bond is used. Can produce microorganisms. The method for contacting the surface layer-presenting microorganism with the protein having the dockerin domain is not particularly limited. What is necessary is just to mix both etc. in the liquid of pH, salt concentration, and temperature which a eukaryotic microorganism can survive and protein does not denature. The contact probability may be improved by stirring as appropriate.
以上説明した本明細書に開示されるコヘシンタンパク質、真核微生物及びタンパク質を細胞表層提示した真核微生物は、いずれも、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて作製することができる。真核微生物の形質転換のためのベクター及びその構築方法は、当業者において周知であって、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に開示されている。また、コヘシンタンパク質やドッケリンドメインを有するタンパク質を真核微生物において発現させるためのベクター及びその構築方法も、同様に、当業者において周知である。なお、ベクターの形態は、使用形態に応じて様々な形態を採ることができる。例えば、ＤＮＡ断片の形態を採ることができるほか、２マイクロプラスミドなどの適当な酵母用ベクターの形態を採ることもできる。 As described above, the cohesin protein, eukaryotic microorganism and eukaryotic microorganism displaying the protein on the cell surface are all molecular cloning 3rd edition, Current Protocols in Molecular Biology, etc. It can be produced according to the method described in 1. Vectors for transformation of eukaryotic microorganisms and methods for their construction are well known to those skilled in the art and are disclosed in Molecular Cloning 3rd Edition, Current Protocols in Molecular Biology and the like. Similarly, vectors for expressing cohesin proteins and proteins having dockerin domains in eukaryotic microorganisms and methods for constructing them are also well known to those skilled in the art. In addition, the form of a vector can take various forms according to a usage form. For example, it can take the form of a DNA fragment, and can also take the form of a suitable yeast vector such as a 2 microplasmid.
このようなベクターで真核微生物を形質転換することによって本明細書に開示される真核微生物を得ることができる。形質転換にあたり、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることができる。 The eukaryotic microorganism disclosed in the present specification can be obtained by transforming a eukaryotic microorganism with such a vector. For the transformation, various conventionally known methods such as transformation method, transfection method, conjugation method, protoplast method, electroporation method, lipofection method, lithium acetate method and the like can be used.
（有用物質の生産方法）
本明細書に開示される有用物質の生産方法は、本発明の真核微生物の表層に保持された２以上のタンパク質を利用して前記有用物質を生産する工程、を備えることができる。また、前記生産工程は、２種以上のタンパク質が、セルロースを分解する酵素群から選択され、これらのタンパク質を利用してセルロース含有材料を糖化し、発酵する工程であってもよい。この生産方法によれば、この真核微生物を用いてセルロース含有材料を直接分解糖化し、グルコース等として利用できることになる。前記発酵工程の実施により、用いた真核微生物が有している有用物質生産能力に応じて有用物質が生産される。
(Useful substance production method)
The method for producing a useful substance disclosed in the present specification can comprise a step of producing the useful substance using two or more proteins retained on the surface layer of the eukaryotic microorganism of the present invention. Further, the production step may be a step in which two or more kinds of proteins are selected from an enzyme group that decomposes cellulose, and the cellulose-containing material is saccharified and fermented using these proteins. According to this production method, this eukaryotic microorganism can be used to directly decompose and saccharify the cellulose-containing material and use it as glucose or the like. By carrying out the fermentation step, useful substances are produced according to the useful substance production capacity of the eukaryotic microorganism used.
有用物質は、真核微生物がグルコースなどの栄養源を発酵することにより得る生産物であり、真核微生物の種類によっても異なるし、発酵条件によっても異なる。有用物質としては特に限定しないが、酵母やその他の真核微生物がグルコースを利用して生産可能なものであればよい。有用物質は、酵母などの真核微生物におけるグルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して合成できるようになった本来の代謝物でない化合物であってもよい。有用物質としては、例えば、エタノールなどのほか、Ｃ３〜Ｃ５の低級アルコール、乳酸などの有機酸の他、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。有用物質の生産工程終了後、培養液から有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを精製又は濃縮する工程を実施することもできる。回収工程や精製等の工程は有用物質の種類等に応じて適宜選択される。 A useful substance is a product obtained by fermenting a nutrient source such as glucose by a eukaryotic microorganism, and varies depending on the type of eukaryotic microorganism and also on the fermentation conditions. Although it does not specifically limit as a useful substance, What is necessary is just what yeast and other eukaryotic microorganisms can produce using glucose. Useful substances are non-original metabolites that can be synthesized by replacing or adding one or more enzymes in the metabolic system from glucose in eukaryotic microorganisms such as yeast. May be. Useful substances include, for example, ethanol, etc., C3-C5 lower alcohols, organic acids such as lactic acid, fine chemicals (coenzyme Q10, vitamins and their raw materials, etc.), glycolysis modification by addition of isoprenodo synthesis pathway Materials for biorefinery technology, such as glycerin produced from plastics and raw materials for plastics and chemical products. After completion of the useful substance production step, a step of recovering a useful substance-containing fraction from the culture solution, and a step of purifying or concentrating the fraction can also be performed. The recovery process and the purification process are appropriately selected according to the type of useful substance.
本方法に用いるセルラーゼ活性を有するドッケリンタンパク質は、２種類以上のセルラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼ等）活性をそれぞれ有する２種類以上を用いることが好ましい。２以上のドッケリンタンパク質は、本真核微生物においてコヘシンタンパク質と同時発現させてもよいし、また、他の一種又は２種以上の真核微生物において別に発現させてもよい。 As the dockerin protein having cellulase activity used in the present method, it is preferable to use two or more types each having two or more types of cellulase (for example, endoglucanase and cellobiohydrolase) activities. Two or more dockerin proteins may be co-expressed with the cohesin protein in the eukaryotic microorganism, or may be separately expressed in one or more other eukaryotic microorganisms.
なお、セルロース含有材料は、Ｄ−グルコースがβ−１，４結合でグリコシド結合したβ−グルカンであるセルロースを含有する材料である。セルロース含有材料としては、セルロースを含有していればよく、どのような由来や形態であってもよい。したがって、セルロース系材料としては、例えば、リグノセルロース系材料、結晶性セルロース材料、可溶性セルロース材料（非晶性セルロース材料）、不溶性セルロース材料などの各種セルロース系材料等が含まれる。リグノセルロース系材料としては、例えば、木本植物の木質部や葉部及び草本植物の葉、茎、根等においてリグニン等を複合した状態のリグノセルロース系材料が挙げられる。こうしたリグノセルロース系材料としては、例えば、稲ワラ、麦ワラ、トウモロコシの茎葉、バガス等の農業廃棄物、収集された木、枝、枯葉等又はこれらを解繊して得られるチップ、おがくず、チップなどの製材工場廃材、間伐材や被害木などの林地残材、建設廃材等の廃棄物であってもよい。結晶性セルロース系材料及び不溶性セルロース系材料としては、リグノセルロース系材料からリグニン等を分離後の結晶性セルロース及び不溶性セルロースを含む結晶性又は不溶性セルロース系材料が挙げられる。セルロース材料としては、また、使用済み紙製容器、古紙、使用済みの衣服などの使用済み繊維製品、パルプ廃液を由来としてもよい。 The cellulose-containing material is a material containing cellulose which is β-glucan in which D-glucose is glycosidically bonded with β-1,4 bonds. As a cellulose containing material, what is necessary is just to contain a cellulose, and what kind of origin and form may be sufficient as it. Accordingly, examples of the cellulosic material include various cellulosic materials such as lignocellulosic material, crystalline cellulose material, soluble cellulose material (amorphous cellulose material), and insoluble cellulose material. Examples of the lignocellulosic material include lignocellulosic materials in a state in which lignin and the like are combined in the woody part and leaf part of a woody plant and the leaves, stems, roots and the like of a herbaceous plant. Examples of such lignocellulosic materials include rice straw, wheat straw, corn stover, bagasse and other agricultural waste, collected trees, branches, dead leaves, etc. or chips obtained by defibrating these, sawdust, chips, etc. It may be a waste from a sawmill factory, a forest residue such as thinned wood or damaged trees, and a construction waste. Examples of the crystalline cellulose material and the insoluble cellulose material include crystalline or insoluble cellulose materials containing crystalline cellulose and insoluble cellulose after separating lignin and the like from the lignocellulose material. As the cellulose material, used paper products such as used paper containers, used paper, used clothes, and pulp waste liquid may be used.
セルロース含有材料は、セルラーゼと接触させるのに先立ってセルラーゼによる分解を容易化するために適当な前処理等がなされていてもよい。例えば、硫酸、塩酸、リン酸、硝酸などの無機酸による酸性条件下、セルロースを部分加水分解することにより、セルロースを非晶質化あるいは低分子化できる。この他、超臨界水、アルカリ、加圧熱水などの処理によってもセルロースの非晶質化又は低分子化を行うことができる。 Prior to contact with the cellulase, the cellulose-containing material may be subjected to an appropriate pretreatment or the like in order to facilitate degradation by the cellulase. For example, cellulose can be made amorphous or low molecular by partially hydrolyzing cellulose under acidic conditions with inorganic acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, and nitric acid. In addition, the cellulose can be made amorphous or low molecular by treatment with supercritical water, alkali, pressurized hot water, or the like.
セルロース含有材料は、グルコースがβ-1,4-グリコシド結合により重合した重合体及びその誘導体を含んでいる。グルコースの重合度は特に限定しない。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。セルロース は、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよい。 The cellulose-containing material includes a polymer in which glucose is polymerized by β-1,4-glycoside bonds and derivatives thereof. The degree of polymerization of glucose is not particularly limited. In addition, examples of the derivative include derivatives such as carboxymethylation, aldehyde formation, or esterification. The cellulose may be crystalline cellulose or non-crystalline cellulose.
なお、以上の各種の実施形態を通じて、真核微生物、ドッケリン−コヘシン結合を利用するタンパク質、ドッケリンタンパク質、コヘシンタンパク質、セルラーゼ、セルロース含有材料等の用語が用いられる場合には、これらは本明細書中で定義された内容で共通して用いられる。 In addition, when terms such as eukaryotic microorganisms, proteins utilizing dockerin-cohesin bonds, dockerin proteins, cohesin proteins, cellulases, cellulose-containing materials, etc. are used throughout the various embodiments described above, these are the present specification. Commonly used for the contents defined in the book.
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に述べる遺伝子組換え操作はモレキュラークローニング第３版に従い行った。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, this invention is not limited to these Examples. The gene recombination operation described below was performed according to Molecular Cloning 3rd edition.
（R. flavefacience由来遺伝子の取得及び酵母発現ベクターの作成）
R. flavefacience由来ScaAコヘシン（ScaAcoh）、Cel44Aドッケリン（GH44doc)、ScaEコヘシン（ScaEcoh）およびScaB-Xドッケリン（ScaBdoc）、以上4つのアミノ酸配列（配列番号１０、配列番号１２、配列番号２６、配列番号１４）をUniProt（アドレス）から取得し、それぞれを酵母最適化コドンを使用して合成遺伝子（配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号１３）を作製した。
(Acquisition of R. flavefacience-derived gene and creation of yeast expression vector)
R. flavefacience-derived ScaA cohesin (ScaAcoh), Cel44A dockerin (GH44doc), ScaE cohesin (ScaEcoh) and ScaB-X dockerin (ScaBdoc), the above four amino acid sequences (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 14) were obtained from UniProt (address), and a synthetic gene (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 13) was prepared using yeast optimized codons.
ScaAコヘシン（ScaAcoh）及びScaEコヘシン（ScaEcoh）を用いて発現ベクターを作製した。すなわち、図１に示すように、合成したScaAコヘシンとScaEコヘシンの各遺伝子の上流にBglII、下流にXhoIの制限酵素サイトをそれぞれPCRで付加した。この制限酵素サイトを利用し、上流にADH3相同領域、HOR7プロモーターおよびSSRGシグナル配列、下流にV5タグ、AGA2配列、Tdh3ターミネーター、Leu3マーカーおよびADH3相同領域を持つ、pDL-ScaAcohAGA2ベクターとpDL-ScaEcohAGA2ベクターを作製した。 An expression vector was prepared using ScaA cohesin (ScaAcoh) and ScaE cohesin (ScaEcoh). That is, as shown in FIG. 1, restriction sites for BglII and XhoI were added upstream and downstream of the synthesized ScaA and ScaE cohesin genes, respectively, by PCR. Utilizing this restriction enzyme site, pDL-ScaAcohAGA2 vector and pDL-ScaEcohAGA2 vector having ADH3 homology region upstream, HOR7 promoter and SSRG signal sequence, downstream V5 tag, AGA2 sequence, Tdh3 terminator, Leu3 marker and ADH3 homology region Was made.
Cel44Aドッケリン（GH44doc)及びScaB-Xドッケリン（ScaBdoc）を用いた発現ベクターを作製した。すなわち、図２に示すように、同様に合成したGH44ドッケリンとScaB-Xドッケリンの各遺伝子及びクロストリジウムサーモセラム48ドッケリンCt48SDDの上流にXhoI、下流にBamHIの制限酵素サイトをそれぞれPCRで付加した。この制限酵素サイトを利用し、上流にHXT3相同領域、HOR7プロモーター、SSRGシグナル配列およびHis-tag、下流にTdh3ターミネーター、Ura3マーカーおよびHXT3相同領域を持つ、pXU-GH44Adocベクター、pXU-ScaBdocベクターを作製した。 Expression vectors using Cel44A dockerin (GH44doc) and ScaB-X dockerin (ScaBdoc) were prepared. That is, as shown in FIG. 2, similarly synthesized GH44 dockerin and ScaB-X dockerin genes and clostridium thermocellum 48 dockerin Ct48SDD were added with XhoI upstream and BamHI restriction enzyme site downstream with PCR. Using this restriction enzyme site, create the pXU-GH44Adoc and pXU-ScaBdoc vectors with HXT3 homology region upstream, HOR7 promoter, SSRG signal sequence and His-tag, Tdh3 terminator, Ura3 marker and HXT3 homology region downstream. did.
（酵母表層での各種遺伝子の生産）
まず、図３に示すように、PCR法により増幅後クローニングしたaga1遺伝子の上流にAAP1相同領域とHOR7プロモーター、下流にTdh3ターミネーターとHis3マーカーおよびAAP1相同領域を持つ、pAI-HOR7p-AGA1ベクターを作製した。このベクターを用いて酵母S.cerevisiae BY4741に形質転換を行い、aga1を細胞表層に提示する酵母BYAGA1を取得した。
(Production of various genes on the surface of yeast)
First, as shown in FIG. 3, a pAI-HOR7p-AGA1 vector having an AAP1 homology region and a HOR7 promoter upstream of the aga1 gene cloned by PCR and having a Tdh3 terminator, His3 marker and AAP1 homology region downstream is prepared. did. Using this vector, yeast S. cerevisiae BY4741 was transformed to obtain yeast BYAGA1 that displays aga1 on the cell surface.
作製したBYAGA1株に実施例１で作成した各種ベクターpDL-ScaAcohAGA2、pDL-ScaEcohAGA2を導入し、コヘシン表層提示酵母 BYScaA、BYScaE株とした。また、BY4741株にBpXU-GH44Adoc、pXU-ScaBdocを導入し、ドッケリン分泌酵母BYGHDoc、BYScaBDoC株とした。 Various vectors pDL-ScaAcohAGA2 and pDL-ScaEcohAGA2 prepared in Example 1 were introduced into the prepared BYAGA1 strain to obtain cohesin surface display yeast BYScaA and BYScaE strains. In addition, BpXU-GH44Adoc and pXU-ScaBdoc were introduced into the BY4741 strain to obtain dockerin-secreting yeasts BYGHDoc and BYScaBDoC.
なお、使用したプラスミドの抽出は以下の方法で行った。プラスミドを形質転換したEscherichia coli （DH5α株）を、カナマイシン（終濃度100μg/ml）またはアンピシリン（終濃度50μg/ml）を含むLB plate培地（5g/l yeast extract, 10g/l peptone, 5g/l NaCl, 15g/l agarose）に塗布し、37℃で1晩静置培養することで形質転換株を取得した。得られた形質転換株をカナマイシン(終濃度100μg/ml)またはアンピシリン（終濃度50μg/ml）を含むLB 液体培地（5g/l yeast extract, 10g/l peptone, 5g/l NaCl）に添加し、120rpm、37℃で1晩振盪培養し得られた菌体からプラスミドを抽出した。 In addition, the used plasmid was extracted by the following method. Escherichia coli (DH5α strain) transformed with the plasmid was transformed into LB plate medium (5 g / l yeast extract, 10 g / l peptone, 5 g / l) containing kanamycin (final concentration 100 μg / ml) or ampicillin (final concentration 50 μg / ml). NaCl, 15 g / l agarose), and left to culture overnight at 37 ° C. to obtain a transformant. Add the resulting transformant to LB liquid medium (5g / l yeast extract, 10g / l peptone, 5g / l NaCl) containing kanamycin (final concentration 100μg / ml) or ampicillin (final concentration 50μg / ml) The plasmid was extracted from the cells obtained by shaking culture at 120 rpm and 37 ° C. overnight.
また酵母の相同組み換え株の取得は以下の方法で行った。形質転換した酵母Saccharomyces cerevisiae（BY4741株）を、SD-His plate培地（6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acid, 20g/l glucose, 0.024g/l adenine sulfate, 0.096 g/l uracil, 0.096g/l L-tryptophan, 0.096g/l L-methionine, 0.096g/l L-leucine, 0.096g/l L-lysine-HCl, 20g/l agarose）、またはSD-Leu plate培地（6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acid, 20g/l glucose, 0.024g/l adenine sulfate, 0.096 g/l uracil, 0.096g/l L-tryptophan, 0.096g/l L -histidine-HCl, 0.096g/l L-methionine, 0.096g/l L-lysine-HCl, 20g/l agarose）、またはSD-Ura plate培地（6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acid, 20g/l glucose, 0.024g/l adenine sulfate, 0.096g/l L-tryptophan, 0.096g/l L -histidine-HCl, 0.096g/l L-methionine, 0.096g/l L-leucine, 0.096g/l L-lysine-HCl, 20g/l agarose）に塗布し、30℃で24時間静置培養することで形質転換株を取得した。得られた形質転換株をYPD液体培地（10g/l yeast extract, 20g/l peptone, 20g/l glucose）1mlに添加し、120rpm、30℃で24時間振盪培養した。 Yeast homologous recombination strains were obtained by the following method. Transformed yeast Saccharomyces cerevisiae (BY4741 strain) was added to SD-His plate medium (6.7 g / l yeast nitrogen base w / o amino acid, 20 g / l glucose, 0.024 g / l adenine sulfate, 0.096 g / l uracil, 0.096 g / l L-tryptophan, 0.096g / l L-methionine, 0.096g / l L-leucine, 0.096g / l L-lysine-HCl, 20g / l agarose), or SD-Leu plate medium (6.7g / l yeast nitrogen base w / o amino acid, 20g / l glucose, 0.024g / l adenine sulfate, 0.096 g / l uracil, 0.096g / l L-tryptophan, 0.096g / l L -histidine-HCl, 0.096g / l L -methionine, 0.096g / l L-lysine-HCl, 20g / l agarose) or SD-Ura plate medium (6.7g / l yeast nitrogen base w / o amino acid, 20g / l glucose, 0.024g / l adenine sulfate , 0.096g / l L-tryptophan, 0.096g / l L-histidine-HCl, 0.096g / l L-methionine, 0.096g / l L-leucine, 0.096g / l L-lysine-HCl, 20g / l agarose) The transformant was obtained by applying the solution to the culture medium and statically culturing at 30 ° C. for 24 hours. The obtained transformant was added to 1 ml of YPD liquid medium (10 g / l yeast extract, 20 g / l peptone, 20 g / l glucose) and cultured with shaking at 120 rpm at 30 ° C. for 24 hours.
（フローサイトメトリー（FCM）によるＳｃａＥ及びＳｃａＡの酵母表層提示量の評価）
コヘシン表層提示酵母 BYScaA及びBYScaE株をそれぞれYP+2%グルコース培地で30℃、24時間培養し、回収、洗浄した菌体を、OD600=0.5、62.5μl相当量集菌し、PBS溶液で洗浄を行い、PBS + 1mg/ml BSA + anti-V5-FITC溶液と混合して4℃、30分間反応し、PBS溶液で2回洗浄後、フローサイトメトリーで酵母細胞表層上のコヘシン提示量を評価した。結果を図４（ａ）に示す。
(Evaluation of ScaE and ScaA yeast surface display amount by flow cytometry (FCM))
Cohesin surface display yeast BYScaA and BYScaE strains were cultured in YP + 2% glucose medium at 30 ° C for 24 hours, collected, washed, and collected in an amount equivalent to OD600 = 0.5, 62.5 μl, and washed with PBS solution. And mixed with PBS + 1 mg / ml BSA + anti-V5-FITC solution, reacted at 4 ° C for 30 minutes, washed twice with PBS solution, and evaluated the cohesin display amount on the surface of yeast cells by flow cytometry . The results are shown in FIG.
図４（ａ）に示すように、これらの酵母において、ScaAコヘシンの表層提示量は非常に少なかったが、ScaEコヘシンの表層提示は十分量認められた。すなわち、同じR. flavefacience由来のセルロソームのコヘシンタンパク質であっても、ＳｃａＡは、そのアミノ酸配列等によって酵母などの真核生物での発現に不適であり、これに対してＳｃａＥは、真核生物での表層発現に好適であることがわかった。 As shown in FIG. 4 (a), the surface display amount of ScaA cohesin was very small in these yeasts, but a sufficient amount of surface display of ScaE cohesin was recognized. That is, even if it is a cellulosomal cohesin protein derived from the same R. flavefacience, ScaA is unsuitable for expression in eukaryotes such as yeast due to its amino acid sequence and the like, whereas ScaE is eukaryote. It was found to be suitable for surface layer expression.
さらに、これらのコヘシン提示酵母へのドッケリンの結合性を確認した。すなわち、これらコヘシン提示酵母に、これら酵母上の２種のコヘシンに対してそれぞれ対応するドッケリンを分泌生産するBYGHDoc株（ＳｃａＡに対応するドッケリンを分泌生産）、BYScaBDoc株（ＳｃａＥに対応するドッケリンを分泌生産）の培養上清を添加することで、酵母表層上でミニセルロソームを再構成し、コヘシンに結合したドッケリンを上述の方法によりAntiHis-FITC抗体で標識、フローサイトメトリーで結合量を評価した。結果を図４（ｂ）に示す。 Furthermore, the binding property of dockerin to these cohesin-presenting yeasts was confirmed. That is, BYGHDoc strain (secretory production of dockerin corresponding to ScaA) and BYScaBDoc strain (secretory dockerin corresponding to ScaE) are secreted and produced in these cohesin-presenting yeasts, respectively. The production cell culture supernatant was added to reconstitute minicellulosomes on the yeast surface, dockerin bound to cohesin was labeled with the AntiHis-FITC antibody by the method described above, and the amount of binding was evaluated by flow cytometry. The results are shown in FIG.
図４（ｂ）に示すように、ScaAコヘシン−ドッケリンの組み合わせはドッケリンの提示量が非常に低く、ScaEコヘシン-ドッケリンの組み合わせは十分量のドッケリンが提示された。すなわち、これらの２種のドッケリンは、酵母表層上のコヘシンドメインの提示量に応じて表層保持されたことがわかった。 As shown in FIG. 4B, the ScaA cohesin-dockerin combination showed a very low amount of dockerin, and the ScaE cohesin-dockerin combination presented a sufficient amount of dockerin. That is, it was found that these two types of dockerins were retained on the surface according to the amount of cohesin domain presented on the surface of the yeast.
次いで、このR. flavefacienceのScaE由来コヘシン- ScaB-X由来ドッケリンの組み合わせと、C. thermocellum CipA由来コヘシンとCel48S 由来CtC48SDDドッケリン（糖鎖修飾部位の削除変異導入体）の組み合わせ、およびR. flavefacienceのScaB由来コヘシンとScaA由来ドッケリンの組み合わせとの交差結合性を評価した。 Next, a combination of this R. flavefacience ScaE-derived cohesin-ScaB-X-derived dockerin, a combination of C. thermocellum CipA-derived cohesin and Cel48S-derived CtC48SDD dockerin (deletion mutant introducing a glycosylation site), and R. flavefacience The cross-linking property between the combination of ScaB-derived cohesin and ScaA-derived dockerin was evaluated.
なお、C. thermocellum CipA由来コヘシンを表層提示する酵母は、当該コヘシンのアミノ酸配列（配列番号６）に基づくとともに酵母最適化コドンを用いて遺伝子（配列番号５）を合成し、当該遺伝子を用いて実施例１と同様にして発現ベクターを構築し、実施例２と同様にして当該コヘシン表層提示酵母BYCipA株を取得した。また、Cel48S由来ドッケリンCt48SDD（２箇所のＮをＤに置換した変異体、配列番号８）をコードする遺伝子（配列番号７）を合成により取得し（酵母最適化コドンは用いていない）、当該遺伝子を用いて実施例１と同様にして発現ベクターを構築し、この遺伝子を利用して、実施例２と同様にしてドッケリン分泌酵母BYCt48SDD株を得た。なお、Cel48S由来ドッケリンCt48S（上記変異なし）（配列番号１８）をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号１７で表される。
さらに、R. flavefacience ScaB由来コヘシンを表層提示する酵母は、当該コヘシンのアミノ酸配列（配列番号２８）に基づくとともに酵母最適化コドンを用いて遺伝子（配列番号２７）を合成し、当該遺伝子を用いて実施例１と同様にして発現ベクターを構築し、実施例２と同様にして当該コヘシン表層提示酵母を取得した。また、R. flavefacience ScaA由来ドッケリンRfScaAdocのアミノ酸配列（配列番号１６）に基づくとともに酵母最適化コドンを用いて遺伝子（配列番号１５）を合成により取得し、当該遺伝子を用いて実施例１と同様にして発現ベクターを構築し、この遺伝子を利用して実施例２と同様にして、ScaAドッケリン泌酵母株を得た。
The yeast displaying the cohesin derived from C. thermocellum CipA on the surface is synthesized based on the amino acid sequence of the cohesin (SEQ ID NO: 6) and synthesized using the yeast optimized codon (SEQ ID NO: 5). An expression vector was constructed in the same manner as in Example 1, and the cohesin surface display yeast BYCipA strain was obtained in the same manner as in Example 2. In addition, a gene (SEQ ID NO: 7) encoding Cel48S-derived dockerin Ct48SDD (mutant in which two Ns are replaced by D, SEQ ID NO: 8) is obtained by synthesis (no yeast optimized codon is used), and the gene Using this gene, an expression vector was constructed in the same manner as in Example 1. Using this gene, a dockerin-secreting yeast BYCt48SDD strain was obtained in the same manner as in Example 2. The base sequence of DNA encoding Cel48S-derived dockerin Ct48S (no mutation described above) (SEQ ID NO: 18) is represented by SEQ ID NO: 17.
Further, the yeast displaying the cohesin derived from R. flavefacience ScaB on the surface is synthesized based on the amino acid sequence of the cohesin (SEQ ID NO: 28) and synthesized using the yeast optimized codon (SEQ ID NO: 27). An expression vector was constructed in the same manner as in Example 1, and the cohesin surface-displaying yeast was obtained in the same manner as in Example 2. In addition, a gene (SEQ ID NO: 15) was obtained by synthesis using the yeast optimized codon based on the amino acid sequence of R. flavefacience ScaA-derived dockerin RfScaAdoc (SEQ ID NO: 16), and the gene was used in the same manner as in Example 1. An expression vector was constructed, and a ScaA dockerin yeast strain was obtained using this gene in the same manner as in Example 2.
各コヘシン提示酵母をそれぞれYP+2%グルコース培地で30℃、24時間培養し、各ドッケリン分泌酵母の培養上清をそれぞれ全ての組み合わせで添加し、酵母表層上でミニセルロソームを再構成して、コヘシンに結合したドッケリンをAntiHis-FITC抗体で標識し、フローサイトメトリーで結合量を評価した。結果を図５に示す。 Each cohesin-presenting yeast was cultured in YP + 2% glucose medium at 30 ° C. for 24 hours, the culture supernatant of each dockerin-secreting yeast was added in all combinations, and the minicellulosome was reconstituted on the yeast surface layer. Dockerin bound to cohesin was labeled with an AntiHis-FITC antibody, and the binding amount was evaluated by flow cytometry. The results are shown in FIG.
図５に示すように、酵母で生産したR. flavefacience ScaE由来コヘシン- ScaB-Xドッケリン結合、R. flavefacience ScaB由来コヘシン−ScaＡドッケリン結合、及びC. thermocellum CipＡ由来コヘシン−C48SDDドッケリン結合は、それぞれ他の組み合わせの間において選択結合性を保持していることがわかった。 As shown in FIG. 5, R. flavefacience ScaE-derived cohesin-ScaB-X dockerin bond, R. flavefacience ScaB-derived cohesin-ScaA dockerin bond, and C. thermocellum CipA-derived cohesin-C48SDD dockerin bond produced in yeast It was found that selective binding was maintained between the combinations.
（酵母表層での３種のコヘシンを備えるタンパク質による配置制御）
実施例４で選択結合性を評価したR. flavefacienceScaE由来コヘシン、C. thermocellum CipA由来コヘシンおよびR. flavefacience ScaB由来のコヘシンを図６下段のように連結し、キメラコヘシンタンパク質（配列番号２０）をコードするＤＮＡ（配列番号１９）を合成取得した。なお、これらのコヘシンドメインのＤＮＡの塩基配列は、それぞれ、配列番号１、配列番号５及び配列番号３であり、及びこれらのコヘシンドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、配列番号６及び配列番号４である。キメラコヘシンタンパク質は、各コヘシンドメイン間には、隣接するコヘシンドメインの上下流に元々存在していた１０アミノ酸を配置した。すなわち、ScaE由来コヘシンとCipA由来コヘシンとの間には、ScaE由来のコヘシンの下流の１０アミノ酸とCipA由来コヘシンの上流１０アミノ酸からなるアミノ酸配列をリンカー配列（配列番号２２、塩基配列は、配列番号２１）とし、CipA由来コヘシンとScaB由来コヘシンとの間には、CipA由来コヘシンの下流１０アミノ酸ScaB由来のコヘシンの上流の１０アミノ酸とからなるアミノ酸配列をリンカー配列（配列番号２４、塩基配列は配列番号２３）とした。このキメラコヘシンタンパク質遺伝子につき、実施例２と同様にして表層提示発現用ベクターを作製し、さらに、当該タンパク質の表層提示用酵母BYEAB株を取得した。
(Arrangement control by protein with 3 cohesins on the surface of yeast)
The cohesin derived from R. flavefacience ScaE, the cohesin derived from C. thermocellum CipA and the cohesin derived from R. flavefacience ScaB evaluated for selective binding in Example 4 were ligated as shown in the lower part of FIG. 6, and a chimeric cohesin protein (SEQ ID NO: 20) was ligated. The encoding DNA (SEQ ID NO: 19) was synthesized and obtained. The base sequences of these cohesin domain DNAs are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 3, respectively, and the amino acid sequences of these cohesin domains are SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 4. In the chimeric cohesin protein, 10 amino acids that originally existed upstream and downstream of adjacent cohesin domains were arranged between the cohesin domains. That is, between the ScaE-derived cohesin and the CipA-derived cohesin, an amino acid sequence consisting of 10 amino acids downstream of the ScaE-derived cohesin and 10 amino acids upstream of the CipA-derived cohesin is a linker sequence (SEQ ID NO: 22, the base sequence is SEQ ID NO: 21), and between the CipA-derived cohesin and the ScaB-derived cohesin, an amino acid sequence consisting of 10 amino acids downstream of the CipA-derived cohesin and 10 amino acids upstream of the ScaB-derived cohesin is a linker sequence (SEQ ID NO: 24, the nucleotide sequence is the sequence) No. 23). For this chimeric cohesin protein gene, a surface display expression vector was prepared in the same manner as in Example 2, and a yeast BYEAB strain for surface display of the protein was obtained.
このBYEAB株をYP+2%グルコース培地で30℃、24時間培養し、回収、洗浄し、BYScaADoc、BYScaBDoc、BYCt48SDD株の培養上清を各1種類ずつ、及び2種類同時、3種類同時に添加することで、酵母表層上でミニセルロソームを再構成させた。コヘシンに結合したドッケリンをAntiHis-FITC抗体で標識、フローサイトメトリーで結合量を評価した。結果を図６に示す。図６に示すように、添加するドッケリン種の増加に比例して結合提示量の増加が認められたことから3種の配置制御が可能であるこが示された。 This BYEAB strain is cultured in YP + 2% glucose medium at 30 ° C for 24 hours, collected, washed, and BYScaADoc, BYScaBDoc, BYCt48SDD strain culture supernatants are added one by one, two at the same time, and three at the same time. Thus, the minicellulosome was reconstituted on the yeast surface layer. Dockerin bound to cohesin was labeled with an AntiHis-FITC antibody, and the binding amount was evaluated by flow cytometry. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 6, an increase in the amount of binding presentation was recognized in proportion to the increase in the added dockerin species, indicating that three types of arrangement control are possible.
配列番号１、３、５、９、１１、１３、１５、２５、２７：S. cerevisiae最適化配列
配列番号１９、２０：コヘシンタンパク質
配列番号２１〜２４：リンカー
SEQ ID NO: 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 25, 27: S. cerevisiae optimized sequence SEQ ID NO: 19, 20: cohesin protein SEQ ID NO: 21-24: linker
Claims (18)
R. flavefacienceのＳｃａＥ由来コヘシンドメインを備える、タンパク質。 A protein for causing a eukaryotic microorganism to display two or more kinds of desired proteins on the surface,
A protein comprising the ScaE-derived cohesin domain of R. flavefacience.
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ変異を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列であって、配列番号２で表されるアミノ配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列 The protein according to claim 1, wherein the ScaE-derived cohesin domain has any one selected from the following amino acid sequences.
(A) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has one or more amino mutations and has the same dockerin binding as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence having activity (c) Amino acid sequence (d) having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having the same dockerin binding activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (e) an amino acid sequence encoded by a base sequence having 90% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, Amino acid sequence having the same dockerin binding activity as the amino sequence represented by 2.
（ｆ）配列番号４で表されるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ変異を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（ｈ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（ｉ）配列番号３で表される塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
（ｊ）配列番号３で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列であって、配列番号４で表されるアミノ配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列 The protein according to claim 3, wherein the ScaB-derived cohesin domain has any one selected from the following amino acid sequences.
(F) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (g) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 has one or more amino mutations and has the same dockerin binding as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence having activity (h) Amino acid sequence (i) having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and having the same dockerin binding activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 An amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (j) an amino acid sequence encoded by a base sequence having 90% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, Amino acid sequence having dockerin binding activity identical to the amino sequence represented by 4.
（ｋ）配列番号６で表されるアミノ酸配列
（ｌ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ変異を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（ｍ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列
（ｎ）配列番号５で表される塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
（ｏ）配列番号５で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列であって、配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一のドッケリン結合活性を有するアミノ酸配列 The protein according to claim 5, wherein the CipA-derived cohesin domain has any one selected from the following amino acid sequences.
(K) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (l) the dockerin bond having one or more amino mutations in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 and the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence having activity (m) Amino acid sequence (n) having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 and having the same dockerin binding activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 An amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 (o) an amino acid sequence encoded by a base sequence having 90% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, Amino acid sequence having dockerin binding activity identical to the amino acid sequence represented by 6
請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質を前記真核微生物の表層側に備える、真核微生物。 A eukaryotic microorganism,
A eukaryotic microorganism comprising the protein according to any one of claims 1 to 7 on a surface layer side of the eukaryotic microorganism.
（表層にコヘシンタンパク質と所望のタンパク質とを提示した真核微生物） Furthermore, the true protein according to any one of claims 8 to 10, further comprising one or more second skeletal proteins having a binding domain capable of selectively binding the protein and disposed on a surface layer of the cell. Nuclear microorganism.
(Eukaryotic microorganisms displaying cohesin protein and desired protein on the surface)
請求項８〜１１のいずれかに記載の真核微生物の前記タンパク質上に、前記コヘシンドメインに選択的に結合するドッケリンドメインを有する２種類以上タンパク質を保持する、真核微生物。 A eukaryotic microorganism that retains two or more types of proteins in the cell surface,
12. A eukaryotic microorganism having two or more proteins having a dockerin domain that selectively binds to the cohesin domain on the protein of the eukaryotic microorganism according to any one of claims 8 to 11.
請求項１２〜１６のいずれかに記載の真核微生物の前記２種以上のタンパク質を利用して前記有用物質を生産する工程、を備える、生産方法。 A method for producing useful substances,
A method for producing the useful substance using the two or more proteins of the eukaryotic microorganism according to any one of claims 12 to 16.
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