JP2013047264A - 生物学的物質の調節放出 - Google Patents

Abstract

【解決課題】生物学的物質を放出可能に封入するための過程が提供される。
【解決手段】本過程は、前駆体物質と生物学的物質と、非極性溶媒に溶解した界面活性剤溶液を混合して乳液を形成することを含む。この乳液は、非極性相に分散した極性相を含み、その際、極性相が生物学的物質を含む。次に、極性相から、生物学的物質を含む粒子が形成される。
【選択図】図１

Description

本発明は、生物学的物質の封入および調節放出のためのセラミック粒子に関する。

生体分子送達システムの必要特性は、封入、保存、および放出時において生体分子の構造的完全性を維持し、かつ、適切な放出速度特性を可能とする機構を備えることである。

一つの一般的応用は、タンパク質薬剤送達システムである。タンパク質薬剤送達応用における現在の技術は、主にポリマー使用に基づく。生物学的物質、例えば、タンパク質の封入体としてポリマー系システムを用いることにはいくつかの欠点がある。すなわち、
＊ポリマー生産は、薬品および／または高温の使用を含むが、これらはタンパク質を変性する可能性がある。
＊通常、ポリマー基質からのタンパク質の放出機構は、ポリマー基質の侵食（すなわち、溶解）である。侵食（従って、放出）速度は通常、ポリマー粒子の化学的環境に依存する（例えば、ｐＨ依存性）。侵食はまた分解副産物を生じる可能性があり、これがタンパク質を変性させる。
＊ポリマーは通常疎水性表面を持ち、従って、親水性を導入し、血中における安定性を強化するには、表面処理を必要とする。
＊保存中に、例えば、脱水によってタンパク質は損傷および／または変性される可能性がある。
＊ポリマーゲルは、乾燥中に重大な収縮を被る可能性があり、これによって、封入タンパク質がはみ出したり、その立体配座に変化を生じる可能性がある。

特許文献１は、セラミックカプセルへの生物学的活性物質の取り込みについて述べているが、該特許に記載される化学は、大型生体分子の封入および放出にとって理想的なものではない。シリカ球を形成するために使用されるシリコンアルコキシド前駆体の加水分解時に放出される短鎖アルコールは、タンパク質分子を変性し、その生物活性の相当部分を失わせることが知られる。さらに、ゾル-ゲル反応が、通常、酸性または塩基性触媒の存在下に行われるので、大抵の生物分子とは相容れないｐＨを招くことになる。さらに、タンパク質は、そのサイズが最大約3０００ kDaに渡るので、1０ ｎｍ直径を上回る可能性がある。酸性条件で形成される微小孔は、一般に、小さすぎて、このサイズの分子を放出させることはできない。ただし、塩基性条件下で形成される中間孔はより大きく、小型タンパク質の放出を可能とすると考えられる。理想的には、ｐＨが、5-8の通常の生理的範囲内に維持されるシステムが必要とされるが、このｐＨ範囲は、シリコンアルコキシドの加水分解を触媒するには適切な条件ではない。

特許文献２は、生体分子をセラミック基質に封入するための過程を記載する。しかしながら、この特許公認過程によって製造される粒子は、生体分子の調節放出用として設計されていない。さらに、この過程は、感受性の高い生体分子、特にタンパク質を変性させる、さもなくば損なう可能性のある過酷な条件に、例えば、極端なｐＨ値および高いせん断力に、生体分子を暴露する。さらに、この過程で用いられる急激な凝集は、極めて広範で、かつ、無統制な粒子サイズ分布を招くことが考えられる。

従って、所望の放出速度特性を示し、封入、保存、および放出時において、生物学的物質の構造的完全性を維持することが可能な、生物学的物質の送達システムに対しては需要がある。

ＷＯ０１／６２２３２（Ｂａｒｂｅ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ） ＪＰ５ ２６１２７４（Ｌｉｏｎ社）

前記欠点の内の少なくとも一つを克服すること、または実質的に緩和することが本発明の一つの目的である。前記需要に少なくとも部分的に応えることが本発明のもう一つの目的である。

本発明の第１局面では、生物学的物質を放出可能に封入するための過程であって：
−非極性溶媒の中に分散される乳液小滴であって、前駆物質および生物学的物質を含む乳液小滴を含む乳液を形成すること；
−乳液小滴から、その中および／またはその表面に生物学的物質を有する粒子を形成すること；
を含む過程が提供される。

乳液形成工程では、第１乳液は、非極性溶媒、界面活性剤、および前駆物質から形成され、かつ、生物学的物質は第1乳液と混合されるか、あるいは、第１乳液は、非極性溶媒、界面活性剤、および生物学的物質から形成され、かつ、前駆物質がその乳液と混合されるか、あるいは、生物学的物質が前駆物質と混合され、得られた混合物が非極性溶媒および界面活性剤と混合されて乳液を形成するか、あるいは、何か別の添加順序が採用されてもよい。それとは別に、乳液形成工程は、界面活性剤および非極性溶媒を、水溶液、要すれば任意に酸性水溶液と混合し、第1乳液を形成すること、および、第１乳液を、前駆物質および生物学的物質と混合して乳液を形成することを含んでもよい。第１乳液は、例えば、微細乳液、すなわち小滴サイズ乳液であってもよい。

従って、本発明は、生物学的物質を放出可能に封入するための過程であって：
ａ）非極性溶媒に溶解した界面活性剤の溶液を、前駆物質および生物学的物質と混合して、非極性相中に分散される、生物学的物質を含む極性相を含む乳液を形成すること；
ｂ）極性相から生物学的物質を含む粒子を形成すること、
を含む過程を提供する。

極性相はさらに、前駆物質を含んでもよい。前記過程の工程ａ）は：
ｃ）非極性溶媒に溶解した界面活性剤の溶液を前駆物質と混合し、第１乳液を形成すること、その際、前記第１乳液は、極性相を非極性相中に分散させ、かつ、前記前駆物質は極性相に局在し；および、
ｄ）生物学的物質を第1乳液と、極性相が生物学的物質を含むように混合すること、
を含んでもよい。

過程はさらに、第１乳液のｐＨを、問題の生物学的物質に適切なｐＨ、すなわち、生物学的物質を分解または変性することのないｐＨ、または、生物学的物質を劣化させることのないｐＨに調整する工程をさらに含んでもよい。ｐＨは、生物学的物質が活性を持続する、例えば、生物学的活性を持続するｐＨに調整されてもよい。そのｐＨは約１と約１１の間、または、約２と１１の間、３と１１、４と１１、５と１１、６と１１、７と１１、１と９、１と７、１と５、２と１０、２と８、２と７、３と９、３と７、３と５、５と６、６と７、７と８、８と９、９と１０、９と１０、５と８、５と７、５と８．５、１０と１１、５と７、８と１０、８．５と１０、９と１１、または８．５と１１、例えば、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、または１１であってもよい。ｐＨの調整は、工程ｄ）の前に実行してよい。

過程の工程ａ）は：
ｅ）非極性溶媒に溶解した界面活性剤の溶液を、酸性水溶液と混合して、第２乳液（要すれば任意に微細乳液または小滴サイズ乳液であってもよい）であって、非極性相に極性相を分散させた第２乳液を形成すること；
ｆ）前駆物質を、第2乳液に、該前駆物質が極性相に局在されるように加えること；および、
ｇ）生物学的物質を、極性相が該生物学的物質を含むように加えること、
を含んでもよい。

それとは別に、工程ａ）は：
ｈ）前駆物質と生物学的物質を混合して極性混合物を形成すること；および、
ｉ）極性混合物を界面活性剤の溶液と混合し、非極性相の中に極性相を分散させる乳液であって、該分散が、極性相が前駆物質および生物学的物質を含むように行われる乳液を形成すること、
を含んでもよい。

この別法もまた、前駆物質のｐＨを、約１と約１１の間、または、約３と１１、５と１１、７と１１、７．５と１１、１と９、１と７、１と５、３と９、３と７、５と９、５と７、７．５と９．５、８．５と９、９と１０、９．５と１０、９と９．５、５と８、５と７、５と８．５、１０と１１、５と７、８と１０、８．５と１０、９と１１、または８．５と１１、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、または１１に調整することを含んでもよい。この場合、生物学的物質は、ｐＨ調整された前駆物質のｐＨにおいて安定であることが好ましい。

別態様として、工程ａ）は：
ｊ）界面活性剤の溶液に生物学的物質を添加すること；および、
ｋ）ｐＨを約１と約１１の間、例えば、約７．５と約１１の間に調整した状態で前駆物質を添加し、乳液の極性相が前駆物質と生物学的物質を含むようにすること、
を含んでもよい。

前駆体は、セラミック前駆体を含んでもよい。前駆体は、コロイド状シリカ、または他の何かのセラミック前駆体を含んでもよく、あるいは、２種以上の異なるセラミック前駆体の混合物を含んでもよい。生物学的物質はタンパク質を含んでもよい。該物質は酵素を
含んでもよい。過程はさらに、工程ｂ）の前にゲル化支援剤を加えることを含んでもよい。ゲル化支援剤は、塩（例えば、塩化ナトリウム）および／または水溶性ポリマーを含んでもよい。ゲル化支援剤は、溶液として、要すれば任意に水溶液として添加してよい。過程は、非極性相から粒子を少なくとも部分的に分離することを含んでもよい。この少なくとも部分的に分離する工程は、粒子を含む乳液を、沈殿性溶媒と混合して粒子を沈殿させる工程を含んでもよい。その際、前記沈殿性溶媒は、非極性溶媒と混和可能である。好適な沈殿性溶媒は、アセトン、エタノール、またはそれらの混合物であってもよい。沈殿性溶媒は、生物学的物質を変性しない、またはその他のやり方で損傷しないように選ばれてもよい。少なくとも部分的に分離する工程は、上記に加えてさらに、または上記とは別に、粒子を含む乳液を遠心することを含んでもよい。少なくとも部分的に分離する工程の後、粒子を乾燥してもよい。

従って、一つの実施態様では、過程は：
−前駆物質であって、ジルコニウムテトラアルコキシドおよびチタンテトラアルコキシドから選ばれる少なくとも一つのアルコキシドを含む前駆物質に対し、ｐＨを約２と約４の間に調整した状態で、生物学的物質を加えること；および、
−生物学的／前駆物質混合物を、界面活性剤溶液に加え、非極性相中に極性相を分散させた乳液を形成すること、その際、極性相が生物学的物質および前駆物質を含み；および、
−極性相から生物学的物質を含む粒子を形成すること、
を含む。

別の実施態様では、過程は：
−水溶液としての生物学的物質を、界面活性剤の溶液に加え、非極性相中に極性相を分散させた乳液を形成すること、その際、極性相が生物学的物質を含み；
−ケイ酸塩を含む前駆物質を、乳液の極性相が前駆物質および生物学的物質を含むようにｐＨを約８と約１０の間に調整した状態で加えること；
−約６と約８の間にｐＨを調整すること；および、
−極性相から、生物学的物質を含む粒子を形成すること、
を含む。

ある実施態様では、過程は：
ａ）非極性溶媒に溶解した界面活性剤の液を、コロイド状ケイ酸塩と混合し、非極性相中に極性相を分散させた乳液を形成すること；
ｂ）乳液のｐＨを、約５と約１１の間のｐＨに調整すること；
ｃ）乳液を、生物学的物質と混合すること、その際、混合は、極性相が該生物学的物質を含むように行われ；および、
ｄ）極性相から生物学的物質を含む粒子を形成すること、
を含む。

別の実施態様では、過程は：
ａ）非極性溶媒に溶解した界面活性剤の液を、酸性水溶液と混合し、非極性相中に極性相を分散させた乳液を形成すること；
ｂ）乳液のｐＨが約５と約１１の間になるように、コロイド状シリカを乳液に加えること；
ｃ）生物学的物質を乳液に添加すること、その際、添加は、極性相が該生物学的物質を含むように行われ；および、
ｄ）極性相から生物学的物質を含む粒子を形成すること、
を含む。

別の実施態様では、過程は：
ａ）前駆物質と生物学的物質を混合して極性混合物を形成すること；
ｂ）極性混合物のｐＨを、約７．５と約１１の間に調整すること；
ｃ）極性混合物を界面活性剤溶液と混合して、非極性相の中に極性相を分散させた乳液を形成すること、その際、極性相が極性混合物を含み；および、
ｄ）極性相から生物学的物質を含む粒子を形成すること、
を含む。

別の実施態様では、過程は：
ａ）非極性溶媒に溶解した界面活性剤の液を、生物学的物質を含む溶液または懸濁液と混合すること；
ｂ）前駆物質のｐＨを約７．５と約１１の間に調整すること；
ｃ）生物学的物質を含む溶液にｐＨ−調整前駆物質を添加し、極性相を非極性相中に分散させた乳液を形成すること、その際、極性相が該生物学的物質を含み；および、
ｄ）極性相から生物学的物質を含む粒子を形成すること、
を含む。

第１局面の別態様では、生物学的物質を放出可能に封入するための過程であって：
−前駆物質、界面活性剤、および非極性溶媒を混合し、非極性溶媒中に分散される乳液小滴を含む乳液を形成すること、その際、乳液小滴は前駆物質を含み；
−乳液に生物学的物質を加えること；および、
−乳液小滴から、その中および／またはその表面に生物学的物質を有する粒子を形成すること；
を含む過程が提供される。

前駆物質、界面活性剤、および非極性溶媒を混合する工程は、界面活性剤と非極性溶媒を混合し（例えば、界面活性剤を非極性溶媒に溶解すること）、次に前駆物質を加えることを含んでもよい。

前駆物質は、溶液、懸濁液、分散液、ゾル、または乳液であってもよく、粒子を形成することが可能であってもよい。前駆物質は極性であってもよく、水性であってもよい。粒子形成工程は、下記の工程：
−要すれば任意に、乳液小滴のｐＨを、生物学的物質が安定で、および／または、活性を持つｐＨに調整すること；および、
−乳液小滴が粒子を形成するのに十分な時間待機すること、
を含んでもよい。

粒子形成工程は、前駆物質を脱安定化すること、および／または、ゲル化すること、および／または、凝集することを含んでもよい。前駆物質は、水を含んでもよく、水溶液、懸濁液、分散液、乳液、またはゾルであってもよい。前駆物質は、セラミック前駆物質（すなわち、ゼラミック材料の前駆体）を含んでもよい。セラミック前駆物質は、金属酸化物前駆物質、例えば、金属オキソ陰イオンの水溶性塩であってもよい。金属オキソ陰イオンは、例えば、ケイ酸塩、アルミ酸塩、チタン酸塩、ジルコン酸塩、または他の何かのオキソ陰イオンであってもよい。セラミック前駆体は、シリカ前駆物質、例えば、コロイド状シリカ、シリカゾル、またはアルコキシシラン（例えば、テトラアルコキシシラン、例として、テトラメチルシラン）、または、金属ケイ酸塩（例えば、ケイ酸ナトリウム）、または、上記の内の任意の２種以上の混合物を含んでもよい。セラミック前駆体は、安定なコロイド状分散液を形成することが可能な、任意の、含水金属酸化物を含んでもよい。この酸化物は、２から４族元素であって、遷移元素およびランタノイドを含む元素の酸化物であってもよい。前駆物質は一次粒子を含んでもよく、一次粒子は、直径が約５と約５００ｎｍの間、または、約５と約１００の間、または約５と約５０ｎｍの間にあってもよい。前駆物質は、異なるサイズの一次粒子から成る混合物であってもよく、異なるサイズの一次粒子は、前駆物質を界面活性剤溶液と混合する工程の前に、混ぜ合わせてもよい。前駆物質はアルカリ性であってもよく、約９と約１２の間のｐＨを持ってもよく、あるいは、それは酸性であってもよく、約０．５と約３．５、約３．５と約５．５の間のｐＨを持ってもよく、あるいは、何か他のｐＨを持ってもよい。界面活性剤は、陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、または双性イオン性であってもよく、かつ、非極性溶媒に可溶性であってもよい。乳液は、油中水（Ｗ／Ｏ）乳液であってもよい。乳液は、約０．０１と約５００ミクロンの間の小滴サイズを持ってもよい。乳液小滴が粒子を形成するのに十分な時間は、約１分と２４時間の間、または、約１と１２時間の間であってもよい。乳液小滴から粒子を形成する間、乳液は、攪拌、掻き回し、またはその他のやり方で揺動してもよい。

混合工程は、攪拌、振とう、混ぜ合わせ、掻き回し、または揺動を含んでもよい。混合工程は、非極性溶媒に溶解した界面活性剤の溶液と前駆物質を混合することを含んでもよい。生物学的物質を添加する工程は、低いせん断力で実行してもよい。低いせん断力は、生物学的物質の損傷、例えば、変性を避けることが可能なほどに十分低くてよい。生物学的物質は溶液として、または懸濁液として加えてもよい。生物学的物質は生体分子であってもよく、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素、ポリサッカリド、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖または断片、または何か他の生体分子であってもよい。

粒子は中間多孔性であって、約１と約５０ｎｍの間の平均孔径を持っていてもよい。粒子は、それぞれが複数の一次粒子を含む、凝集体を含んでもよい。粒子は、約０．０５と約５００ミクロン、約０．０５と約１００ミクロン、または約０．５と約５０ミクロンの間の平均粒径を持ってもよい。粒子は、広い、中間的な、または狭い粒径分布を持っていてもよい。

過程はさらに、下記の工程の内の一つ以上をさらに含んでもよい。すなわち、
−生物学的物質を添加する工程の前に、後に、またはその最中に、ゲル化支援剤を添加する工程；
−非極性溶媒から粒子を少なくとも部分的に分離する工程；
−粒子を洗浄する工程；および、
−粒子を乾燥する工程。

ゲル化支援剤は、球形粒子の形成を支援するのに十分な量として存在してもよい。ゲル化支援剤は、溶液として加えられてもよく、溶液はまた生物学的物質を含んでもよい。ゲル化支援剤は、水溶性塩、例えば、塩化ナトリウムであってもよい。それとは別に、ゲル化支援剤は、何か他の物質、例えば、水溶性ポリマー、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、またはヒドロキシプロピルセルロースであってもよい。ゲル化支援剤は、溶液として、例えば、水溶液として、約０．１％と約４０％ｗ／ｖの間の濃度で添加されてもよい。ゲル化支援剤が塩である場合、該塩の溶液は、約０．５と６Ｍの間であってもよい。少なくとも部分的に分離する工程は、遠心、ろ過、微細ろ過、沈降、または何か他の適当な方法を含んでもよい。洗浄工程は、洗浄溶媒による洗浄を含んでもよい。洗浄溶媒は、有機溶媒、例えば、非極性溶媒または、非極性溶媒と混和が可能な溶媒であってもよく、あるいは、極性溶媒、例えば、極性有機溶媒、水、または水溶液であってもよい。洗浄工程は繰り返してもよく、各繰り返しにおいて、同じ、または異なる洗浄溶媒を用いてもよい。各洗浄工程の後には、例えば、ろ過、または遠心によって、洗浄溶媒から粒子を少なくとも部分的に分離する工程を行ってもよい。乾燥工程は、気体の流れ、例えば、空気、酸素、窒素、二酸化炭素、または、生物学的物質を損傷または変性しない何か他の気体の流れに、粒子を暴露することを含んでもよい。乾燥工程は、周囲温で、または、生物学的物質を損傷または変性しない別の温度において実行してもよい。乾燥工程は、上記に加えてさらに、または上記とは別に、生物学的物質に真空を印加すること、または凍結乾燥することを含んでもよい。

ある実施態様では、生体分子を放出可能に封入する過程であって：
−前駆物質、および、非極性溶媒に溶解した界面活性剤の溶液を混合し、非極性溶媒に乳液小滴を分散させた乳液を形成すること、その際、前記乳液小滴が前駆物質を含み；
−生物学的物質、および、要すれば任意にゲル化支援剤を乳液に添加すること；
−乳液小滴が粒子を形成するのに十分な時間待機すること、その際、前記粒子が、その内部および／またはその表面に生物学的物質を有し；
−非極性溶媒から粒子を少なくとも部分的に分離すること；
−粒子を洗浄すること；および、
−粒子を乾燥すること
を含む過程が提供される。

乳液小滴のｐＨを調整する工程は、生物学的物質を添加する工程の前に、と同時に、あるいは、の後に実行してもよい。可溶性塩は、添加する場合は、生物学的物質の添加の前、と同時、あるいは、の後に加えてもよい。

別の実施態様では、生体分子を放出可能に封入する過程であって：
−コロイド状シリカと、非極性溶媒に溶解した界面活性剤の溶液を混合し、非極性溶媒に乳液小滴を分散させた乳液を形成すること、その際、前記乳液小滴がコロイド状シリカを含み；
−乳液にｐＨ調整試薬を添加して、ｐＨを約５と約１１の間に調整すること；
−生体分子の溶液または懸濁液を添加すること；
−可溶性無機塩の溶液を添加すること；および、
−乳液小滴からシリカ粒子を形成させるために約１時間から約１２時間待機すること、その際、前記シリカ粒子が、その内部および／またはその表面に生物学的物質を放出可能に封入する、
を含む過程が提供される。生体分子は、例えばタンパク質、ペプチド、ＤＮＡ断片、抗体またはポリサッカリドであってもよい。

別の実施態様では、生体分子を放出可能に封入する過程であって：
−コロイド状シリカと、非極性溶媒に溶解した界面活性剤の溶液を混合し、非極性溶媒に乳液小滴を分散させた乳液を形成すること、その際、前記乳液小滴がコロイド状シリカを含み；
−乳液にｐＨ調整試薬を添加して、ｐＨを約５と約１０の間に調整すること；
−生体分子の溶液または懸濁液を添加すること；
−可溶性無機塩の溶液を添加すること；
−乳液小滴からシリカ粒子を形成させるために約１時間から約１２時間待機すること、その際、前記シリカ粒子が、その内部および／またはその表面に生物学的物質を放出可能に封入し、
−非極性溶媒からシリカ粒子を少なくとも部分的に分離すること；
−非極性溶媒でシリカ粒子を洗浄すること；
−要すれば任意に、非極性溶媒とは異なる溶媒でシリカ粒子を洗浄すること；および、
−シリカ粒子を乾燥すること
を含む過程が提供される。

本発明の第２局面では、放出可能な生物学的物質を含む粒子であって、約１と５０ｎｍの間の平均孔径、約０．０５と約５００ミクロンの間、または、約０．０５と約１００ミクロンの間の平均孔径を持つ粒子が提供される。さらに、複数の前記粒子が提供される。生物学的物質は、粒子の中に実質的に均一に分布してもよいし、または、不均一に分布してもよい。粒子は、生物学的物質が、粒子から放出された後でも生物学的に活性を持つような形として存在する。例えば生物学的物質が酵素であるなら、酵素は、粒子からの放出後も、その酵素活性を保持しなければならない。生物学的物質は、粒子からの放出後も、封入前のその活性の少なくとも約５０％、または、その活性の、少なくとも約６０、７０、８０、または９０％を保持しなければならない。

粒子は、
ａ）界面活性剤を非極性溶媒に溶解した溶液を、前駆物質および生物学的物質と混合し、非極性相中に極性相を分散させた乳液を形成すること、その際、前記極性相が生物学的物質を含み；および、
極性相から、生物学的物質を含む粒子を形成すること、
を含む過程によって製造されてもよい。

粒子は、本発明の第１局面の方法によって製造されてもよい。

粒子は、直径が約５と５００ｎｍの間の一次粒子から成る凝集体を含んでもよい。粒子は、その内部に、および／または、その表面に生物学的物質を放出可能に封入してもよい。粒子および一次粒子はセラミックを含んでもよく、かつ、金属酸化物、例えば、シリカ、ジルコニア、アルミナ、チタニア、または、上記の内の任意の２種以上の混合物を含んでもよく、あるいは、シリコン、チタン、ジルコニウム、およびアルミニウムの内の任意の２種以上の金属酸化物の混合物を含んでもよい。粒子は中間孔性であって、約１と約５０ｎｍの間の平均孔径を持ってもよい。粒子は、約０．０５と約５００ミクロン、または約０．５と約５０ミクロンの間の平均粒径を持ってもよい。生物学的物質は生体分子であってもよく、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素、ポリサッカリド、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖または断片、または何か他の生体分子であってもよい。

本発明の第３局面では、その内部に、および／またはその表面に放出可能に生物学的物質を封入したセラミック粒子が提供される。前記セラミック粒子は、本発明の第１局面の過程によって製造される。

本発明の第４局面では、生物学的物質を患者に送達する方法であって、本発明の第２または第３局面による１個以上の粒子を患者に投与することを含む方法が提供される。方法は、患者における病態であって、該生物学的物質が、その病態の治療に適応とされる病態、例えば、疾患の治療を目的とするものであってもよい。生物学的物質は、病態の治療に適応とされてもよい。投与は、注入、例えば、静注、筋注、皮下注射、または、何か他の注入方式によって行われてもよいし、あるいは、肺、鼻腔、経口、または経皮的送達、または何か他の適当な送達法によって行われてもよい。方法は、１個以上の粒子を臨床的に受容可能な担体に懸濁することを含んでもよい。その際、前記担体は、注入、または、肺、鼻腔、経口、または経皮送達に好適である。

本発明の第5局面では、生物学的物質を液体に送達する方法であって、本発明の第２または第３局面による１個以上の粒子に、該液体を暴露することを含む方法が提供される。この局面では、生物学的物質は、例えば、酵素であってもよい。生物学的物質は、液体における反応を触媒してもよい。

本発明の第６局面では、生物学的物質を患者または液体のいずれかに送達するために、本発明の第２または第３局面による１個の粒子、または複数個の粒子を用いる使用が提供される。この使用は、患者における病態の治療、または、液体における反応の触媒のためであってもよいし、あるいは、何か他の目的のためであってもよい。使用は、患者または液体に対する、生物学的物質の調節的放出を含んでもよい。

本発明の第７局面では、本発明の第２または第３局面による１個以上の粒子であって、患者における病態の治療用薬剤製造のための、それらの粒子の使用が提供される。生物学的物質は、前記治療に対し適応とされてもよい。患者は、動物またはヒトの患者であってよく、動物は、哺乳類、霊長類、または鳥類または他の何かの動物であってもよい。

本発明の第８局面では、患者の病態を治療するための薬剤であって、本発明による１個の粒子、または複数個の前記粒子を含む薬剤が提供される。その際、前記１個の粒子、または複数個の粒子の生物学的物質は、該病態の治療に適応とされる。薬剤は、１種以上の受容可能な担体および／または補助剤を含んでもよい。薬剤は、患者への注入、または、患者に対する、肺、鼻腔、経口、または経皮的送達に好適であってもよい。担体および／または補助剤は、患者への注入、または、患者に対する、肺、鼻腔、経口、または経皮的送達に好適であってもよい。

次に、本発明の好ましい形態を、付属の図面を参照しながら実施例を通じて説明する。
本発明は、粒子における生物学的物質（例えば、生体分子および／または微生物）の封入および放出に関する。一つの実施例では、粒子は、水性コロイド状シリカおよび／またはケイ酸塩溶液から得られたゾル−ゲルシリカを含む。ｐＨがほぼ中性であり、かつ有機薬品を含まないことから、比較的穏やかな条件が得られ、これは、生物学的物質の元々の構造の保持を助ける。前駆体としてシリカゾルを用いる場合、ゲルは、シリカの一次粒子の凝集の結果中間孔性となる場合がある。すなわち、凝集体のサイズが孔の大きさを決めるので、ゲルの多孔性の、特定目的に合わせた調整が可能となる。この多孔性調節は、粒子のサイズおよび形も調節可能となるならば、調節放出実用の可能性を与える。油中水乳液においてタンパク質注入コロイド状シリカを凝集することによって、本発明者達は、生体分子（例えば、タンパク質）の調節的放出のために使用することが可能なサイズ調節球体を生産した。本発明の過程は、生物学的物質がその中において実質的に均一に分布される粒子を生産することが可能である。これは、生物学的物質の調節放出を促進する可能性がある。

本発明における使用に好適な溶媒／界面活性剤混合物を選ぶ際に重要な注意点は、生物学的実施態様に対する破壊を最小にすること、および、コロイド状ナノ粒子とはっきりと相互作用を持つことが予想される物質を避けることである。非極性溶媒は、生物学的物質が分解、変性、または劣化する温度よりも低いレベルに融点を持っていなければならない。その温度は生物学的物質に依存する。融点は、約６０℃未満、または、約５５、５０、４５、または３５℃未満であってもよい。使用してもよい好適な溶媒としては、アルカン、例えば、長鎖アルカンが挙げられる。アルカンは、直鎖、分枝鎖、または環状であってもよい。アルカンは、約５と２４の間の炭素原子、または、約１０と２４、２０と２４、５と２０、５と１０、または１０と２０の間の炭素原子を持っていてもよく、約５、６、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、または２４個の炭素原子を持っていてもよい。溶媒は、種々の化合物の混合物、例えば、種々のアルカンの混合物であってもよい。使用してもよい溶媒としては、ドデカン、ケロシン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、およびトルエンが挙げられる。使用が可能なその他の溶媒としては、ハロゲン化溶媒が挙げられる。溶媒は、極性の低い溶媒であってもよく、一般に界面活性剤用溶媒である。溶媒は、生物学的物質を変性したり、その他のやり方でそれを劣化または分解してはならない。溶媒は、本発明の製造過程と関連する条件において製造中生物学的物質と反応してはならない。溶媒は、低コストとなるように選ばれてもよい。

十分に長いポリエトキシ（−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）鎖（例えば、Ｂｒｉｊ５２）を含む界面活性剤は、シリカ球の形成を妨げることが判明している。本発明者等は、これは、一次粒子表面に水素が結合し、これが凝集およびゲル化を阻止する立体障壁となるためではないかと仮定した。本発明に使用するのに好適な界面活性剤は、陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、または双性イオン性であってもよく、例えば、ソルビタンエステル、例えば、Ｓｐａｎ ２０、および、スルフォこはく酸、例えば、エロゾルＯＴを含んでもよい。ゲル化ｐＨにおいてコロイド状粒子と同じ電荷符号（すなわち、陽性または陰性）を持つ非イオン性またはイオン性界面活性剤が好ましい。従って、低いｐH（例えば、約ｐＨ８以下）で粒子が形成される場合、長いポリエトキシ（−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）鎖を持つ界面活性剤は避けるのが一般的に有利である。粒子が比較的高いｐＨ（例えば、約ｐＨ８以上）で形成される場合、ポリエチレン鎖を持ついくつかの界面活性剤が、好適な粒子を生産することが判明している。ゲル化のｐＨは、前駆物質の性質に依存する。

前駆物質は、シリカゾルまたはコロイド状シリカであってもよく、上記に加えて、または上記とは別に、金属オキソ陰イオンの水溶性塩を含んでもよい。水溶性塩は、ケイ酸塩、例えば、アルカリケイ酸塩、例えば、ケイ酸ナトリウム、あるいは、ジルコン酸塩、または他の何かのセラミック前駆体（すなわち、セラミック材料の前駆体）であってもよい。好適な前駆物質は、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０（Ｅｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、すなわち、約９ｎｍの一次粒子を持ち、ｐＨを１０から６に下げることによって数時間内にゲル体を形成するコロイド状シリカである。同様のサイズを持つコロイド状シリカの他のブランド品、例えば、Ｓｎｏｗｔｅｘ ＳＴ−４０（Ｎｉｓｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）も好適である。Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０（Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｄｓｏｎ）も使用が可能である。ただし、これは、殺生物剤を含むので、本発明のある用途には不適である可能性がある。前駆物質は、直径が、約５と５００ｎｍの間の一次粒子、約５と２５０の間、５と１００、５と５０、５と４０、５と３０、５と２０、１０と１００、２０と１００、１０と３０、１０と２０、１００と５００、１００と２５０、２５０と５００、または５０と２５０ｎｍの間の一次粒子を持ってもよく、かつ、直径が、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ｎｍの一次粒子を持ってもよい。種々のサイズを持つ一次粒子を有する前駆物質の混合物を使用してもよい。他の前駆物質としては、アルミン酸塩、ジルコン酸塩、チタン酸塩、その他の金属オキソ陰イオン、およびそれらの混合物が挙げられる。

本発明の過程は、前駆物質と、非極性溶媒に溶解した界面活性剤の溶液とを混合して乳液を形成する工程を含む。乳液は、油中水（Ｗ／Ｏ）乳液であってもよい。乳液は、約０．０５と５００ミクロンの間、または約０．０５と２５０ミクロンの間、０．０５と１００ミクロン、０．０５と５０ミクロン、０．０５と２５ミクロン、０．０５と１０ミクロン、０．０５と５ミクロン、０．０５と２ミクロン、０．０５と１ミクロン、０．０５と０．５ミクロン、０．１と５０ミクロン、０．５と５０ミクロン、１と５０ミクロン、１０と５０ミクロン、２５と５０ミクロン、１と２０ミクロン、１と１０ミクロン、１と５ミクロン、１００と５００ミクロン、５０と５００ミクロン、２５０と５００ミクロン、１と２５０ミクロン、１と１００ミクロン、１と５０ミクロン、１と２０ミクロン、０．１と１００ミクロン、０．１と１０ミクロン、または１と２ミクロンの間の小滴サイズを持っていてもよく、かつ、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ミクロンの小滴サイズを持ってもよい。

界面活性剤の、非極性溶媒に対する比は、ｗ／ｗまたはｗ／ｖに基づいて、約５と３０％の間、または約５と２０、５と１５、５と１０、１０と３０、１５と３０、または１０と２０％の間であり、約５、１０、１５、２０、２５、または３０％である。存在する全水分量（これは、添加される前駆物質の量を決める）は、水：界面活性剤のモル比として約２：１と１０：１の間、または５：１と１０：１の間、または約２：１と５：１の間、または約３：１と７：１の間であってもよく、また、水：界面活性剤のモル比として、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１であってもよい。添加される生体分子の量は、該生体分子の、水溶液に対する可溶性に依存する。問題の量は、例えば、シリカ１ｇ当たり約２０ｍｇであってもよい。生体分子の量は、シリカ１ｇ当たり、約１と５０ｍｇの間、約１と２０、１と１０、１と５、５と５０、１０と５０、２５と５０、１０と４０、または、１０と３０ｍｇであってもよく、また、シリカ１ｇ当たり、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇであってもよく、あるいは、少なくとも一部は、生物学的物質の性質、および／または、所望の、その放出プロフィールに応じて、何か他の量であってもよい。

本発明の過程において、前駆物質は、その内部および／または表面に生物学的物質を有する粒子に変換される。粒子は、多孔性であってもよく、約１と５０ｎｍの間、または約１と２、１と１０、１と２０、２と５０、２と２０、２と１０、２と５、５と２０、１０と２０、２０と５０、１０と４０、５と３０、または５と１０ｎｍの間の平均直径を持つ孔を有していてもよく、また、約、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｍの径の孔を有してもよい。粒子は、約０．０５と５００ミクロンの間の直径（例えば、平均直径）を持ってもよく、または、約０．０５と２５０ミクロンの間、０．０５と１００ミクロン、０．０５と５０ミクロン、０．０５と２５ミクロン、０．０５と１０ミクロン、０．０５と５ミクロン、０．０５と２ミクロン、０．０５と１ミクロン、０．０５と０．５ミクロン、０．１と５０ミクロン、０．５と５０ミクロン、１と５０ミクロン、１０と５０ミクロン、２５と５０ミクロン、１と２０ミクロン、１と１０ミクロン、１と５ミクロン、１００と５００ミクロン、５０と５００ミクロン、２５０と５００ミクロン、１と２５０ミクロン、１と１００ミクロン、１と５０ミクロン、１と２０ミクロン、０．１と１００ミクロン、０．１と１０ミクロン、または１と２ミクロンの間の直径を持ってもよく、また、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ミクロンの直径を持ってもよい。

標的粒子サイズの選択を支配する二つの因子は：
−凝集体を含む一次粒子が、封入の対象となる生物学的物質（例えば、タンパク質）に匹敵するサイズを持つ可能性のあることである。例えば、一次粒子は、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０では約９ｎｍである。従って、生物学的物質を十分に封入するためには、最小数の一次粒子が必要とされる。
−タンパク質は、親水性領域と疎水性領域の両方を含むことがある。従って、タンパク質分子は、油中水乳液の水相に存在はしているけれども、該タンパク質分子は、界面活性剤／溶媒境界近くに好んで局在し、タンパク質負荷外「殻」を形成する可能性がある。従って、粒子中の過剰なデッドスペース（すなわち、関連タンパク質を持たないスペース）を最小化し、かつ、タンパク質を保持するのに十分な一次粒子を確保するためには、約１ミクロンの標的粒子サイズが適当であると考えられる。

本発明者等は、乳液にゲル化支援剤を加えると、シリカの場合、球形粒子の形成が促進されることを見出した。このゲル化支援剤は塩であってもよいが、あるいは、何か他の物質、例えば、水溶性ポリマー、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、またはヒドロキシプロピルセルロースであってもよい。ゲル化支援剤は、溶液として、例えば、水溶液として、約０．１と４０％ｗ／ｗまたはｗ／ｖの間の濃度で、または約０．１と２０の間、０．１と１０、０．１と５、０．１と１、０．５と４０、１と４０、５と４０、１０と４０、２０と４０、１と２０、または５と２０％ｗ／ｗまたはｗ／ｖの間の濃度で加えられてもよく、また、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０％ｗ／ｗまたはｗ／ｖの濃度の溶液として加えられてもよい。ゲル化支援剤は水溶性であってもよく、溶液として、例えば、水溶液として加えられてもよい。ゲル化支援剤が塩である場合、溶液の塩は約０．５と６Ｍの間にあってもよく、約０．５と３の間、約０．５と１、約１と６、約３と６、約０．５と２、または約１と２Ｍの間にあってもよく、また、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、または６Ｍであってもよい。ゲル化支援剤と共にリン酸二水素カリウム（０．００３７−０．０１５Ｍ）を含めると、ｐＨを５−７範囲に維持するのがやり易くなる。リン酸二水素カリウムの濃度は、０．００３７−０．０１Ｍ、０．００３７−０．００５Ｍ、０．００５−０．０１５Ｍ、０．０１−０．０１５Ｍ、または０．００５−０．０１Ｍの範囲にあってよく、また、約０．００３７、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０１１、０．０１２、０．０１３、０．０１４、または０．０１５Ｍであってもよい。他のバッファー液も使用が可能である。ゲル化支援剤は、生物学的物質の添加前、最中、または後に、あるいは、生物学的物質と一緒に加えてもよい。添加される、ゲル化支援剤の量は、用いる前駆体および支援剤の性質に依存するが、コロイド状シリカの場合、ゲル化支援剤：シリカの質量比として、通常、約１：１０と１：２００の間、または約１：１０と１：２０の間の範囲を持つ。ゲル化支援剤の量は、ゲル化支援剤：シリカの質量比として、約１：１０と１：１００の間、１：１０と１：５０、１：１０と１：２０、１：２０と１：１００、１：５０と１：１００、１：１００と１：２００、１：１００と１：１５０、１：１５０と１：２００、１：２０と１：８０、１：２０と１：５０、１：１０と１：１５、１：１５と１：２０、または１：１３と１：１７の間にあってよく、また、ゲル化支援剤：シリカの質量比として、約１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：１２０、１：１４０、１：１６０、１：１８０、または１：２００であってもよい。

粒子が損傷無く洗浄・乾燥されるようになるためには、粒子が形成され、熟成するためにある時間待機することが必要とされる。その時間は、約１分と約２４時間の間、または約１０分と２４時間の間、または約３０分と２４時間の間、または約０．５と１２時間の間、または０．５と６、または１と２４、または６と２４、または１２と２４、または１と１２、または２と８、または４と８時間、または約１と６０分、または約１と３０、１と１０、１と５、５と６０、５と３０、または１５と３０分の間であってもよく、また、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５５分、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２０、または２４時間であってもよい。待機中、乳液は、攪拌、掻き回し、またはその他のやり方で揺動してもよく、あるいは、揺動せずに安置させてもよい。

粒子が形成され、熟成した後、それらを洗浄してよい。洗浄前に、粒子を、非極性溶媒から少なくとも部分的に分離してもよい。少なくとも部分的に分離する工程は、遠心、ろ過、微細ろ過、沈降、または何か他の適当な方法、または上記方法の内の任意の２種以上の組み合わせを含んでもよい。洗浄工程は繰り返してもよく、繰り返しのいくつかにおいて、または全てにおいて、異なる洗浄溶媒を用いて行ってもよい。使用される洗浄溶媒としては、非極性溶媒、水、アルコール類（例えば、生物学的物質の感受性に応じて、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール）、アルカン類、ハロゲン化アルカン類、ケトン類、エステル類、および他の一般的溶媒、または、上記の混合物が挙げられる。洗浄は、粒子を洗浄溶媒に浸すことを含んでもよく、洗浄溶媒を、その中に浸した粒子とともに搖動する（例えば、かき回す、振とうする、攪拌する）ことを含んでもよく、および／または、洗浄溶媒を粒子の間を、例えば、ろ過によってすり抜けさせることを含んでもよい。洗浄はさらに、洗浄溶媒から、少なくとも部分的に粒子を分離することを含んでもよい。

粒子は、例えば、気体の流れの中で、および／または、加熱によって、および／または、真空の印加によって乾燥してもよい。粒子が乾燥される温度は、生物学的物質の性質に依存するが、生物学的物質が損傷されない、または変性しない温度未満でなければならない。温度は、例えば、約１５と５０℃の間、または、約１５と４０、１５と３０、１５と２０、２０と５０、３０と５０、または２０と４０℃の間であってもよく、また、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０℃であってもよい。それとは別に粒子は凍結乾燥してもよい。凍結乾燥の温度は約−８０℃であってもよい。凍結乾燥温度は、約−３０℃未満、または約−４０、−５０、−６０、−７０、−９０、−１００、−１２０、−１４０、−１６０、または−１８０℃未満であってもよい。凍結乾燥温度は、約−３０と約−２００の間、または約−１３０と−１５０の間、−３０と−１００、−３０と−８０、−３０と−６０、−５０と−１００、−５０と−８０、−１００と−２００、−１００と−１５０、−１５０と−２００、−１５０と−５０、または−７０と−９０℃の間にあってよく、また、約−３０、−４０、−５０、−６０、−７０、−８０、−９０、−１００、−１１０、−１２０、−１３０、−１４０、−１５０、−１６０、−１７０、−１８０、−１９０、−１９６、または−２００℃であってもよい。凍結乾燥の圧は、例えば、約１と約２００ミリトールの間、または約１と１５０、１と１００、１と５０、１と２０、１と１０、１０と１００、１０と５０、５０と２００、１００と２００、１５０と２００、１００と１５０、５０と１００、または１２０と１７０ミリトールの間にあってもよく、また、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ミリトールであってもよい。乾燥中の圧は、０と１気圧の間、または０．０１と１の間、０．１と１、０．５と１、０．０１と０．５、０．０１と０．１、または０．１と０．５気圧の間であってもよく、また、約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１気圧、または、何か他の適当な気圧であってもよい。

本発明の粒子は、その内部またはその表面に封入される生物学的物質を送達するために使用されてもよい。この生物学的物質は、治療物質であってもよく、粒子を患者に投与することによって患者に送達されてもよい。この送達は、生物学的物質が適応とされる病態の治療のためであってもよい。病態は疾患であってもよい。生物学的物質が適応とされる病態の例としては、モノクロナール抗体で治療が可能な自己免疫疾患、および、その治療には酵素による薬剤前駆体の活性化が必要とされる癌が挙げられる。投与は、例えば、流体における粒子の懸濁液の注入によってもよく、あるいは、投与は、経口的に、肺を通じて、または何か他のルートを通じて行われてもよい。患者は脊椎動物であってもよく、該脊椎動物は、哺乳類、有袋類、または爬虫類であってもよい。哺乳類は、霊長類または非ヒト霊長類、またはその他の非ヒト哺乳類であってもよい。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ類、げっ歯類、ウシ類、ウサギ類、ヒツジ類、ヤギ類、ネコ類、およびイヌ類からなるグループから選ばれてもよい。哺乳類は、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、牝牛、雄牛、バッファロー、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヤギ、リャマ、ウサギ、類人猿、サル、およびラクダから選ばれてもよい。

本発明の粒子はまた、生物学的物質を、液体、例えば、反応混合液に輸送するために用いてもよい。生物学的物質は、例えば、触媒物質、例えば、酵素であってもよく、粒子は、該触媒物質によって触媒される反応混合液に該生物学的物質を輸送するために用いてもよい。一つの例は、タンパク質切断酵素、例えば、ズブチリシンを含む粒子の、粉末洗剤への取り込みであって、これは、その後、洗剤の分散とともに放出される。第２の例は、口腔衛生目的に一般に使用される酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、および／または、ラクトペルオキシダーゼの、歯磨きに含まれてもよい粒子の中への取り込みである。

本発明の粒子に対する生物学的物質の封入は、有害な環境条件、例えば、高いせん断力から該生物学的物質を保護することになるので、生物学的物質の取り扱いを用意にし、その寿命を延長する。封入はまた、生物学的物質の調節的放出、すなわち、生物学的物質の、患者または液体への調節速度における送達をも実現する。速度は、粒子の孔径を調節することによって調節される。

ゲル化過程
本発明者達は、コロイド状シリカが界面活性剤液中で分散され、その後数分以内に、粒子が形成され、熟成すると、ゲル化が自然に起こることを見出した。最初のコロイド状懸濁液のｐＨは通常約ｐＨ１０である。界面活性剤液に添加する前に、コロイド懸濁液のｐＨを下げることも可能であるが、ｐＨ範囲には、これを超えると、球形粒子が形成されるという限界（用いるコロイド液／界面活性剤／酸に依存するが、約７．５−１０）がある。

本過程において使用される界面活性剤は、例えば、ＮＰ−５、ＡＯＴ、Ｓｐａｎ ２０、Ｓｐａｎ ４０、Ｓｐａｎ ６０、Ｓｐａｎ ８０等であってもよい。使用が可能なコロイドとしては、Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０、Ｌｕｄｏｘ ＨＳ−４０、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０、Ｂｉｎｄｚｉｌ １５／５００、Ｓｎｏｗｔｅｘ ４０、Ｓｎｏｗｔｅｘ ＵＰ等が挙げられる。コロイド粒子は、その直径が約３０ｎｍ未満であることが好ましい。ただし、それよりもやや大きい粒子も使用が可能である。コロイドシリカおよび界面活性剤の濃度は広範囲であってもよく、溶媒は、ある範囲の非極性溶媒から選ばれてもよい。

コロイド状シリカの性質
コロイド状シリカ懸濁液は、水に、陰性荷電、非晶質シリカ粒子を分散させることによって製造される。粒子は、全体として、その形が球形である。粒子の表面にはＯＨ⁻イオンが存在し、アルカリイオンによって形成される電気的二重層が伴う。安定化は、陰性荷電粒子間の反発によって実現される。荷電バランスの擾乱は凝集を招き、懸濁液の粘度の上昇および／またはゲル化をもたらす。コロイド状シリカは、ｐＨ変化、または塩、電解質、有機溶媒、または界面活性剤の添加によって脱安定化させてもよい。

上記因子それぞれのゲル化時間に及ぼす影響は、ゾルの性質および脱安定化を含むパラメータの両方に依存する。例えば、濃度が高ければ高いほど、あるいは、粒径が小さければ小さいほど、ｐＨのゲル化時間に及ぼす作用は大きくなる、すなわち、ゲル化時間は短くなる。しかしながら、ゲル化時間は、ｐＨ調節に用いる酸の種類によって異なる。有機酸は一般に、ＳｉＯ_２濃度および粒径に依存して、ゲル化時間に関してより優れた安定性を与える。例えば、同じＳｉＯ_２濃度および酸濃度の下では、酢酸ではゲル化時間が、強酸例えばＨＣｌよりも遅くなる。これは、弱酸からは放出されるＨ^＋が少なく、そのため、粒子表面におけるＨ^＋および−Ｏ⁻間の反応が減るためによるものと考えられる。

合成過程
ｐＨ約１０において粒子を形成するための全体的合成過程の例の概略を図１に示す。
５０ｍＬの非極性有機溶媒に溶解した０．２ｍｏｌ／Ｌの界面活性剤溶液を準備した。次に、生物学的物質、例えば、タンパク質を含む、２．１６ｍＬのコロイド状シリカ（ｐＨ＝９以上）を周囲温で加えた。約１０分攪拌した後、４０ｍＬの極性溶媒を加え、乳液を脱安定化し、希釈した。次に得られた粒子をろ過収集し、溶媒で濯いだ。次に、この粒子を室温で乾燥した。

ある特定の例では、ＮＰ−５およびシクロヘキサンを用いて界面活性剤溶液を準備し、コロイド状シリカはＬｕｄｏｘ ＳＭ−３０であった。アセトンを、極性溶媒として、乳液を脱安定化、希釈し、かつ、粒子を洗浄するのに用いた。

それとは別に、生物学的物質を含む粒子は、それから乳液を除去するために、２０００ｒｐｍで３分間遠心し、次に、粒子を、穏やかな溶媒、例えば、ケロシンおよび／またはｎ−ヘキサンで洗浄してもよい。粒子は、窒素気流の下で室温で乾燥してもよい。

ゲル化の予想される機構
コロイド液には、主に二つの力がある。すなわち、ファンデルワールス力（ＦＶＤＷ）および静電気力（ＦＥＬ）である。全体力（ＦＴＯＴ）は、ＦＶＤＷとＦＥＬの合計である（ＤＬＶＯ理論による）。大型ポリマーを含むコロイド液には、さらにもう一つの力が存在する。減損力ＦＯＳである。この状況下では、全体力ＦＴＯＴ＝ＦＶＤＷ＋ＦＥＬ＋ＦＯＳである。コロイドの安定性は、ｐＨを変える、塩を加える、または界面活性剤を加える等によってこれらの力を再編成することにより破壊される。

熱力学的に安定な微細乳液（Ｗ／Ｏ）（これは、通常、界面活性剤が、約１０と約１３の間のＨＬＢを持つ場合に出現する）では、界面張力はきわめて低い。コロイド液を微細乳液と混合すると、局所の界面力がコロイドシリカを駆動して、水の小滴に凝集させ、大型の粒子を形成させる。この凝集における一つの重要な因子は、コロイド濃度である。凝集を起す機構は下記の通りと考えられる。すなわち、コロイド懸濁液が、界面活性剤・溶媒混合物に加えられると、水とコロイドを含む親水性ドメインが形成される。水分子の内のあるものは、界面活性剤分子の親水性ヘッドと相互作用を持ち、液体・液体界面において水和層を形成する。このため、ある数の水分子が吸着・捕捉されるために、プール内の遊離水の量が減少し、このために、水プールの中のコロイドの濃度が人工的に増大され、これがコロイドのゲル化をもたらす。球状微小粒子の形成に対しては沢山のパラメータが影響を及ぼす可能性がある。中でも、コロイド中のシリカ濃度、界面活性剤濃度、および水対界面活性剤のモル比が大きい。

本過程に従って粒子を形成するためには、界面活性剤は、その極性ヘッドと水プールとの間に中等強度の相互作用を持つ必要がある。この分子相互作用は、界面活性剤の足型（Ａ）で測定される。足型は、水小滴表面の表面積（π＊ｄ^２、式中ｄは水プールの直径である）を、界面活性剤の凝集数（Ｎ）で割ることによって計算される。

Ａ＝（π＊ｄ^２）／Ｎ

文献から得られる数値を用い、足型を、使用する界面活性剤の範囲について計算した。

媒体相互作用は、１分子当たり約１と約５ｎｍ^２の間の足型に相当し、これは、１０ｎｍ^２当たり約１０^２個の界面活性剤分子に一致する。１分子当たり約１ｎｍ^２未満の足型値を持つ界面活性剤（例えば、Ｂｒｉｊ ３０）は、それがいずれのものであれ、小径水プールと共に極めて安定な微細乳液を形成することが可能である。従って、ミクロン以下の球形粒子のみが生産される。比較的大きな足型（＞約５ｎｍ^２／分子）を持つ乳液システムは、本過程によって球形粒子を形成するのに適当ではないかもしれない。

もう一つの仮説は、界面活性剤分子のオキシエチレン単位が、一次粒子をゲル化してミクロン以下粒子を形成するのに一役買っている可能性である。界面活性剤分子の極性ヘッドを形成するオキシエチレン単位は、水素結合によって粒子表面と相互作用を持ち、そうすることによって、シリカ粒子表面と水との間の相互作用に影響を及ぼし、これが粒子の集合過程の調節をもたらす可能性がある。これが、(−ＯＨ）と（−Ｏ⁻）の数比が比較的高く、従って、水素結合が比較的強い、低いｐＨにおいて、一次コロイドの集合がうまく行われず、従って微細粒子が形成されない理由であるのかもしれない。

前記仮説は、微細乳液、すなわち、界面活性剤が約１０から１３のＨＬＢを持つ場合にのみ当てはまる。約９未満のＨＬＢを持つ界面活性剤の場合、別のやり方による粒子形成の機構を理解することが必要である。ＨＬＢ値が３−９の範囲にある材料は、油中水型乳液おける乳化剤として、または湿潤剤として好適であることは広く認められている。用いたＳｐａｎ界面活性剤は全て同じ親水性ヘッドを持つが、親油尾部は異なり、かつ、そのＨＬＢ値は、Ｓｐａｎ ８０の４．３、Ｓｐａｎ ２０の８．６の間にあった。従って、これらの界面活性剤によってＷ／Ｏ型の乳液が製造される。提案される機構は下記の通りである。コロイド状シリカ水性懸濁液に導入されると、界面活性剤は、液体−液体界面を貫通し、親水性ドメイン（水小滴）を形成する。この親水性ドメインでは、界面力が、コロイドを安定化する力を撹乱する。その結果、コロイド液はゲル化し、大きな球を形成する。Ｓｐａｎ ２０によって形成される粒子は、Ｓｐａｎ ８０によって形成されるものよりもはるかに滑らかであることが観察されるが、その理由について考えられる説明は、Ｓｐａｎ ８０のＨＬＢは小さいので、界面力がきわめて強いためである。コロイド懸濁液が界面活性剤溶液に出会うと、コロイドシリカのゲル化速度は速やかで、そのため、先ず比較的小さい粒子が造られる。従って、水小滴の融合および分裂過程を通じて、粗い表面の微小粒子が形成される。

界面活性剤タイプの作用
試験した界面活性剤を下記の表に列挙する。シクロヘキサン溶液とした０．２ｍｏｌ／Ｌの界面活性剤液を準備した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ−９、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００システムについては、乳液の安定性を増進するために、０．２ｍｏｌ／Ｌの共同界面活性剤（１−ペンタノール）を加えた。ＴｗｅｅｎおよびＳｐａｎ界面活性剤では不安定な乳液が得られた。コロイドシリカとして１．０８ｍＬ Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０を加えたことを除いては、過程は、図１に記載する典型的な合成過程によった。対応するＳＥＭ画像を図３に示す。

球形の微小粒子は、ＮＰ−５、ＡＯＴ、および各種Ｓｐａｎ界面活性剤を用いることによって形成された。Ｂｒｉｊ ３０およびＮＰ−６によって形成される微粒子は凝集しているように見えた。他のシステムは全て、不規則な形の産物を生産した。

球形微粒子の形成をもたらす界面活性剤の構造を図２に列挙する。提案される選択規則を、最近の実験結果に基づいて下記の節で論ずる。

界面活性剤濃度の作用
界面活性剤濃度の粒子形態に及ぼす作用を調べるための界面活性剤としてＮＰ−５を選んだ。界面活性剤濃度を０．０５ｍｏｌ／Ｌから０．５ｍｏｌ／Ｌまで変化させた。対応するＳＥＭ画像を図４に示す。ＮＰ−５の濃度を０．５ｍｏｌ／Ｌよりも増してもなお、球形粒子を製造することが可能であるように見える。しかしながら、界面活性剤の最小濃度は約０．１ｍｏｌ／Ｌで、これよりも低い濃度では、球形の粒子は少なくなり、凝集ゲル産物がより多くなる。

乳液溶媒の作用
図１で概説した典型的合成過程に従って、７種の異なる溶媒を用いてシリカ粒子を製造した。その溶媒とは、石油エーテル（ＰＥ、低分子炭化水素の混合物）、ペンタン、ヘキサン、オクタン、デカン、ドデカン、ケロシン、およびシクロヘキサンである。得られた粒子のＳＥＭ画像を第５図に示す。画像は、長鎖のアルカン、例えば、ケロシン（中等重量のアルカンの混合物）が、より球に近い粒子を生産することを示しており、アルカン鎖が長ければ長いほど、生産される粒子が小さくなるようである。

「反応条件および溶媒の、乳液法によって調製されるシリカ粉末のサイズと形態に及ぼす作用」(“Effect of reaction condition and solvent on the size and morｐＨology of silica powder prepared by an emulsion technique”)、W-Kyu Part, et al., Korean J. Ceram., 8, 229-235(2０００)において、乳液中の小滴サイズ、従って、シリカゲル粒径は、有機溶媒の立体作用によって有意に影響されることが明らかにされた。このことを確かめるために、論文の著者らは、乳液を生産するために、同じ化学式を持つが様々な構造を持つオクタン異性体、および一連のCnH2n+2アルカンを用いた。オクタン異性体およびアルカン基シリーズにおける粒子の平均径は、予想通り、鎖長の増加と共に減少した。イソオクタンから得られた平均サイズは６４μｍであり、オクタンのものは４６μｍであった。シリカゲル粉末の平均サイズは、鎖長の増加と共に７５μｍから２８μｍへ徐々に減少した。ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ノナン、および、ｎ−デカンの使用によって得られた粒径は、それぞれ、７５、５１、４６、４４および２８μｍであった。これらの結果は、本明細書の結果と一致する。

別の参考文献、「AOT逆ミセルシステムにおける銅ナノ粒子の成長行動に及ぼす溶媒作用」（”Solvent Effects on Copper Nanoparticle Growth Behaviour in AOT Reverse Micelle Systems”）, J. P. Cason, et al., J. ＰＨys. Chem. B, 1０5, 2297-23０2, (2００1)では、銅粒子の成長が、シクロヘキサン溶媒よりも、イソオクタン溶媒中の方が、有意に高速となることが判明した。この文献は、シクロヘキサンの方が、イソオクタンよりも、最終的にやや大きな粒子サイズを支持すると述べている。この依存性は、シクロヘキサンは、ミセル尾部に浸透し、界面活性剤尾部を効果的に溶媒和するのに対し、一方、イソオクタンの方は、その嵩高な性質のために、該尾部をそれほど速やかに溶媒和することができないという事実に基づく。

コロイド濃度の作用
１０ｎｍｏｌ ＮＰ−５を含む５０ｍｌの乳液に、種々の量のＬｕｄｏｘ ＳＭ−３０を加えて、シリカ微小粒子を生産した。結果を下表に示し、かつ、ＳＥＭ画像を図６に示す。これらの結果から、５．４ｍＬもの高容量のコロイドが、主に球形の産物を生産するようである。コロイドシリカの量の増大と共に、粒子は凝集する傾向が強まるようである。典型的合成のために２．１６ｍＬコロイドシリカを選んだ。乳液の中に存在する粒子が少なければ少ないほど、粒子が衝突しにくくなるから、凝集産物を形成する確率は下がる。この結果は、1個の粒子当たりの界面活性剤分子の数は、比較的少数の粒子の場合、大きくなるので、凝集の発生率を下げるという事実によるものと考えられる。

図７は、最初に添加されたシリカの量に対する、製造過程から得られた粒子の収量をプロットしたものであるが、この図から、Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０（シリカ：３０ｗｔ％；密度：１．２２ｇ／ｃｍ^３）の最初に添加した純粋なシリカよりも生産量の方が僅かに高いことが見て取れる。この余分の質量は、吸着された界面活性剤と水によるものと考えられる。高濃度のコロイドシリカでは、重量差はさらに大きくなるようである。これは恐らくより多くの界面活性剤が吸着されるためと考えられる。

コロイドｐＨの作用
図８は、ＬｕｄｏｘとＢｉｎｄｚｉｌの滴定曲線（ｐＨ対添加した酸の量）を示す。Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０（３０ｍＬ）およびＢｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０（３０ｍＬ）のｐＨは、０．５ｍｏｌ／Ｌの硝酸の添加と共に約５．５まで徐々に減少する。両システムともに、ｐＨ範囲５．５−２．０において急激なｐＨ低下が起こる。この後、ｐＨの減少はふたたびゆっくりになる。一方、Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０を１２ｍｏｌ／Ｌの酢酸で滴定すると、ｐＨ変化は、２種類の減少速度を示す。その二つの速度の転移点は、ほぼｐＨ５に見られる。滴定中（約２時間）、上記システムにゲル化は起こらなかった。しかしながら、Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０を２ｍｏｌ／Ｌ硝酸で滴定した場合、４ｍｍｏｌ ＨＮＯ_３を加えるとコロイドがゲル化した。ｐＨはその点で６．６５であった。これは、コロイド濃度作用によるものと考えられる。

図９は、硝酸滴定Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０によって形成されるシリカ産物の、ＳＥＭおよびＴＥＭ画像を示す。ｐＨが９を超えると、球形粒子が生産された。ｐＨ９未満では、図９ｄおよびｅに見られるように、コロイドシリカはゲル化するが、球形粒子を形成しなかった。

一方、Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０のｐＨを酢酸を使って下げると、ｐＨが９を超えた場合（図１０ａおよびｂ）、大抵の粒子は球形であった。これは、硝酸による滴定の結果と一致する。これは、コロイドの凝集が、媒体のｐＨには強度に依存するが、ｐＨを下げるのに用いられた酸の性質とは独立することによるものと考えられる。ｐＨ８．５７では、不規則な形の産物が生産された（図１０ｃ）。ｐＨ７．７５４、６．７０７、５．８６９、および５．３７８では固体産物は生産されなかった。

コロイドタイプの作用
各種コロイドシリカ１．６２ｍＬの添加を用いた後、典型的合成過程に従った。結果は下表に列記する通りである。対応するＳＥＭ／ＴＥＭ画像を図１１に示す。Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０、Ｌｕｄｏｘ Ｈｓ−４０、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０、Ｂｉｎｄｚｉｌ １５／５００、Ｓｎｏｗｔｅｘ ４０、およびＳｎｏｗｔｅｘ ＵＰは微小球を形成したが、一方、Ｌｕｄｏｘ ＴＭ−５０、Ｓｎｏｗｔｅｘ ５０、およびＳｎｏｗｔｅｘ ２０Ｌは、凝集産物（初期のコロイドは約７０−１００ｎｍ）を生産した。Ｓｎｏｗｔｅｘ Ｎはゲル化しなかったが、これは、供給業者によって、コロイド懸濁液に何かの界面活性剤が既に取り込まれていることを示唆するものと思われる。

粒径分布
粒子の粒径分布は、光散乱によって定量される（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００）。Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０の量を１．６２ｍＬから５０．４０ｍＬまで変動させ、典型的な合成法を用いて生産されたシリカ粒子の粒径分布を図１２に示す。一般に、３種の、それぞれ別々のピークが、３０ｎｍから１００μｍにおいて出現する。約１３０ｎｍに中央値を持つ最小ピークは、コロイド濃度とは独立するようである。中間ピークは、Ｌｕｄｏｘ濃度が増すにつれて、１．４５μｍから２．２μｍへとやや増加した。最大ピーク（１−１００μｍ）は、Ｌｕｄｏｘ １．６２ｍＬでは１７．４μｍであったのが、２３μｍ（３．２４ｍＬ、Ｌｕｄｏｘ）、２６μｍ（４．３２ｍＬ、Ｌｕｄｏｘ）から、Ｌｕｄｏｘ ５．４０ｍＬでは３０μｍへと変化した。用いたコロイド懸濁液の容量の増加は、水対界面活性剤比の増加による粒径の増加を、従って、水小滴のサイズの増加をもたらす。

粒径分布を下げるためには、より多くのエネルギーをシステムに供給しなければならない。これは、例えば、より高速の攪拌、またはせん断混合によって達成される。図１３は、実施例３（酵素の添加は無し）に記載する方法を用いて、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０から調製された粒子について得られた粒径分布を示す。この方法では、乳液を混ぜ合わせるのに攪拌を用いず、操作の最初の１時間におけるシステムの搖動を増すために超音波プローブを用いた。超音波パルスは、２秒当たり１秒間パルス（５０％動作サイクル）で動作させた。１時間後、乳液からプローブを取り出し、合成過程の残りの５時間のために攪拌を開始した。粒径は、典型的なサイズ範囲（図１２に示す）から明らかに減少し、約１ミクロンに中央値を持つ。大型粒子から成る小さな成分がある。エネルギーインプットの増大のために、システムの温度は、超音波振動の１時間後には６０℃と著明に上昇した。これは明らかに、多くのタンパク質にとって適切ではないが、超音波プローブの動作サイクルを調節することによって、または、温度を下げるよう氷浴を用いることによって修正することが可能である。

タンパク質の封入
いくつかのタンパク質は、そのｐＫａに応じて、高いｐＨで封入することが可能である。アルカリフォスファターゼは、９．５のｐＫａを持つが、この酵素を、完全な酵素活性を保持しながら、封入するための過程が実施例１に示される（下記参照）。しかしながら、大多数の酵素は、中性ｐＨの周辺に最適活性を持つ。前述のように界面活性剤液に添加する前にコロイド前駆体のｐＨを下げることが可能であり、アルファ−キモトリプシン、ズブチリシン、およびアルカリフォスファターゼを、ｐＨ＝７．５の下げたコロイドに封入する方法が実施例２（下記参照）に示される。しかしながら、本発明者達は、界面活性剤液に水性前駆体を加え、次いで酸を加えてｐＨを適当な値に下げ、その後、生物学的物質を加えることによって、封入粒子を形成することが可能であることを見出した。ｐＨ１０における添加の後、粒子が急速に形成されるけれども、形成直後では粒子は十分に密ではなく、従って、粒子が乳液の水小滴において熟成する間に、タンパク質、または他の生物学的物質が粒子の中に浸透することが可能であると、本発明者等は仮定する。通常、水小滴中のｐＨは、タンパク質の添加の前に６．０に下げられる。この方法を用い、様々のサイズの酵素、アルファ-キモトリプシン（〜２５ｋＤａ）、ズブチリシン（〜２７ｋＤａ）、アルカリフォスファターゼ（〜１６０ｋＤａ）、およびウレアーゼ（〜４８０ｋＤａ）が封入される。この封入（すなわち、乳液内のｐＨを６．０に下げること）の多くに使用される界面活性剤はＳｐａｎ ２０である。もっともＡＯＴも使用され、いずれの場合も同様の粒子が形成される。Ｓｐａｎ ２０によるこの方法を用いて形成される粒子の、典型的ＳＥＭ画像を図１４に示す。

このような粒子からの、アルファ−キモトリプシン、アルカリフォスファターゼ、およびウレアーゼの放出速度調節機構を、実施例３（下記参照）において調べた。粒子の平均孔径に影響を及ぼす各種サイズのコロイド前駆体を用い、実施例４（下記参照）でも、ズブチリシンの放出量を調節するために様々なサイズのコロイド溶液の使用を記載する。実施例５（下記参照）では、微小粒子におけるフェリチンの分布を、ＴＥＭ断面を用い、フェリチン分子の局在をマップすることによって調べた。封入過程のズブチリシン活性に及ぼす作用を実施例６（下記参照）において調べた。ズブチリシンおよびアルカリフォスファターゼの保存安定性試験は、実施例７（下記参照）において記載する。別のセラミック（すなわち、シリカ以外の）基質における酵素の封入を実施例８（下記参照）に記載する。

ｐＨ＝９．７におけるアルカリフォスファターゼの封入
０．５ｍｏｌ／Ｌの硝酸０．５ｍＬを、１０ｍＬのＢｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０に加え９．７のｐＨとした。アルカリフォスファターゼ（８ｍｇを４００μｌのバッファーにｐＨ＝９．５で溶解したもの）を、２．５ｍＬの上記コロイドシリカ懸濁液と混合し、次に、５０ｍＬケロシンに溶解したＳｐａｎ ２０溶液（０．２ｍｏｌ／Ｌ）に攪拌しながら加えた。約１０分攪拌した後、粒子を、２０００ｒｐｍで３分の遠心によって分離した。得られた粒子を、ケロシンで一度洗浄し、その後ヘキサンで３回洗浄し（各洗浄後、固体から上清を分離するために遠心を用いた）、次に、窒素気流の下で室温で乾燥し、凍結器に保存した。

アルカリフォスファターゼは、約０．６％（重量で）のタンパク質負荷によって封入した（タンパク質含量の定量については下記参照）。酵素活性は、乾燥直後に測定したが、実際には、溶液中の遊離酵素の活性よりも高いことが判明した。これは、記載の封入過程が、タンパク質を目立つほどに変性しないことを示す。

図１５は、前述のようにｐＨ＝９．７において封入されたアルカリフォスファターゼの放出率を示す。

タンパク質含量の定量
微小粒子のタンパク質含量、および微小粒子から放出されるタンパク質の定量は、下記のようにビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）を用いて行った。

標準アッセイ：
試薬Ａ：ビシンコニン酸ナトリウム（０．１ｇ）、Ｎａ_２ＣＯ_３・２Ｈ_２Ｏ（２ｇ）、酒石酸ナトリウム（二水和物）（０．１６ｇ）、ＮａＯＨ（０．４ｇ）、ＮａＨＣＯ_３（０．９５ｇ）を１００ｍＬとした。要すれば、ＮａＯＨを用いてｐＨを１１．２５に調整する。
試薬Ｂ：ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ（０．４ｇ）を１０ｍＬとした。
標準作業試薬（ＳＷＲ）＝１００容量の試薬Ａ＋２容量の試薬Ｂ
方法：
微小粒子中のタンパク質の定量
タンパク質含有微小粒子（２０ｍｇ）を、リン酸塩バッファー生食液（ＰＢＳ液）（４００μＬ）に懸濁し、該懸濁液を５分超音波処理する。懸濁液サンプル（５０μＬ）を三重に取り出し、ＳＷＲ（１ｍＬ）と合わせ、６０℃で６０分インキュベートする。サンプルを３０００ｒｐｍで５秒遠心し、溶液の吸光度を５６２ｎｍで測定し、それを、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、および１．０ｍｇ／ｍＬにおける標準シリーズと比較する。
微小粒子から放出されるタンパク質の定量
タンパク質含有微小粒子（１００ｍｇ）を、ＰＢＳ液（２ｍＬ）に懸濁し、揺動する。必要な時点で、この懸濁液を遠心し、サンプル（５０μＬ）を取り出す。各時点で得られたサンプルをＳＷＲ（１ｍＬ）を合わせ、６０℃で６０分インキュベートする。サンプルの吸光度を５６２ｎｍで測定し、それを、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、および１．０ｍｇ／ｍＬにおける標準シリーズと比較する。

ｐＨ＝７．５（乳液の内部ではｐＨ＝６に下げる）におけるアルファ−キモトリプシン、ズブチリシン、およびアルカリフォスファターゼの封入
Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０で形成される粒子の中に、アルファ−キモトリプシン、ズブチリシン、およびアルカリフォスファターゼを下記の方法を用いて封入する。４．５ｇのＳｐａｎ ２０を、３０ｍＬのケロシンに攪拌しながら溶解する。１．２５ｍｌのＢｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０を、１５８ｍｌの１Ｍ ＨＣｌと混合し、ｐＨを１０から７．５に下げる。４ｍｇのタンパク質を２００μｌの水に溶解し、次いで攪拌しながらＢｉｎｄｚｉｌ液に分散させる。このタンパク質を含む前駆体液を、前記乳液に加える。数分間攪拌の後、７２μｌの１Ｍ ＨＣｌを加え、ｐＨをさらに下げて６．０とする。最後に、１７５μｌの塩溶液２（組成については実施例６参照）を乳液に加える。６時間の攪拌後、乳液を遠心し、固形物をケロシンで一度洗浄し、次にヘキサンで二度洗浄し、一晩乾燥させた。

１００ｍｇの前記サンプルを、ズブチリシンおよびアルファ−キモトリプシンの場合は２ｍｌのＰＢＳに、アルカリフォスファターゼの場合はエタノールアミンバッファー（ｐＨ＝９．５）に分散させる。指定の時点において、サンプルを１０，０００ｒｐｍで１０秒遠心し、５０μｌを取り出す。タンパク質含量は、実施例１に記載する通りに定量し、放出曲線を計算する。図１６は、６時間の期間における、アルファ-キモトリプシン、ズブチリシン、およびアルカリフォスファターゼの放出を示す。急激な放出（１０分後にはほぼ完全に放出）は、本法によって形成される大孔径（８．７ｎｍ）によるもののようである（下記の実施例４の考察を参照されたい）。

ｐＨ＝６．０におけるアルファ−キモトリプシン、アルカリフォスファターゼ、およびウレアーゼの封入
アルファ−キモトリプシン、アルカリフォスファターゼ、およびウレアーゼは、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０によって形成された粒子の中に下記の方法を用いて封入した。
粒子合成を記述するフローダイアグラムを図１７に示す。放出率は、実施例１に記載する通りに測定した。ケロシンに溶解したＳｐａｎ ２０（１８ｇ）の液を、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０コロイドシリカ（３０ｍＬ、ｐＨ１０）と、５００ｒｐｍの攪拌下に混合し白色乳液を生成する。この場合、生体分子（タンパク質）は、乳液に加える前に、塩溶液に溶解する。生体分子と塩の溶液（１．６９ｍｌ）の添加、および、塩酸（０．４８ｍＬ、１Ｍ）によるｐＨの調整によって、約６のｐＨを持つ白色乳液が得られる。６時間の攪拌の後、粒子を、２０００ｒｐｍの遠心によって分離し、さらに新たなケロシンによって洗浄し、次にイソプロパノールによって２回洗浄し、窒素気流の下で乾燥させた。得られた粉末は、前記生体分子を封入する。

シリカの孔径を増すために、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０およびＳｎｏｗｔｅｘ ＺＬの混合物を用いた。Ｓｎｏｗｔｅｘ ＺＬは、７０−１００ｎｍのコロイド粒子から成り、これは、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０の、９ｍｌのコロイド粒子よりもかなり大きい。アルファ−キモトリプシン、アルカリフォスファターゼ、およびウレアーゼは、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０およびＳｎｏｗｔｅｘ ＺＬの混合物によって形成された粒子の中に下記の方法を用いて封入した。

１８ｇのＳｐａｎ ２０を、攪拌しながら１２０ｍＬのケロシンに溶解した。１．５ｍＬのＢｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０を、１．５ｍＬのＳｎｏｗｔｅｘ−ＺＬと混合し、これを攪拌しながら乳液に加えた。０．３１ｍＬの１Ｍ ＨＣｌおよび０．４２２ｍｌの濃縮塩溶液（４倍に濃縮）の溶液に３０ｍｇのタンパク質を溶解し、これを乳液に加えた。６時間後、固形物を遠心にて除去し、ケロシンおよびイソプロパノールで洗浄し、一晩乾燥させる。放出率を実施例１に記載する通りに測定し、図１８に示す。Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０／Ｓｎｏｗｔｅｘ ＺＬ混合物からのウレアーゼの放出はこの図には再現されていない。それは、吸収液の白濁がタンパク質の定量を妨げるからである。Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０／Ｓｎｏｗｔｅｘ ＺＬ粒子（平均ＤＦＴ孔径が、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０粒子の５．５ｎｍに対して、６．７ｎｍである）からの、アルファ−キモトリプシンおよびアルカリフォスファターゼの放出の上昇は、より大きな孔は酵素の放出に著明な作用を及ぼすことを示す。

Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０およびＢｉｎｄｚｉｌ １５／５００の両方を用いた粒子の調製を、実施例４に概説する方法によって、ただし塩溶液の添加は行わずに実行した。産物は主に球形成分から成るが、少量の非球形成分を含んでいた。粒径および孔度測定値は、粒子のサイズおよび内部の微小構造は、塩溶液を用いて製造した粒子のものとほとんど同一であることを示した。塩添加および塩無添加の下に製造した粒子同士を比較することによって、塩を添加することによって主に二つの利点が得られることが示唆された。第１は、非球形物質の割合を下げることである。第２は、塩の添加は、封入タンパク質の収率をより高くすることである。生物学的物質としてアルカリフォスファターゼを用い、塩溶液の添加を省略した場合、タンパク質負荷は４０％減少した（コロイドおよび酵素水溶液の同じ初回量において、１．５ｗｔ％から１．１ｗｔ％への低下）。塩溶液は、ゲル化コロイド溶液が、例えばＳｎｏｗｔｅｘ−４０のように、比較的大型の一次粒子(１０−２０ｎｍ)を含む場合は、さらに重要性を増すと考えられる。しかしながら、特に塩の存在が問題を引き起こす可能性のある場合には、塩は省略してもよい。

２００ｍＬ（塩の濃縮液の場合は５０ｍＬ）における塩溶液の組成
０．１ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４
０．２ｇ ＮＨ_４Ｃｌ
０．２１ｇ Ｎａ_２ＳＯ_４
０．２２３ｇ ＣａＣｌ_２
１．２ｇ 乳酸ナトリウム
０．０６ｇ クエン酸ナトリウム
４．１ｇ ＮａＣｌ
１．９７３ｇ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ

ｐＨ＝６．０におけるズブチリシンの封入。孔径作用の定量
Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０を用いて製造した粒子からの、ズブチリシンの放出率測定値から、タンパク質放出の大部分は、０．０２Ｍ ＰＢＳ液に対する粉末の浸潤後１時間以内に起こることが示された。孔径を下げるための一つの可能な方法は、シリカ前駆体として比較的小さいコロイドを用いることである。Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０は、３０ｗｔ％溶液において９ｎｍシリカ粒子を含む。ｐＨを６．０に下げるのに必要な酸の量には僅かな違いがある（Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０の１ｍＬ当たり０．１８３ｍＬの１Ｍ ＨＣｌが必要なのに比べ、Ｂｉｎｄｚｉｌ １５／５００では１ｍＬ当たり０．１１５ｍＬの１Ｍ ＨＣｌが必要である）。この産物の孔度については下記に論じる。

別態様として、コロイドシリカの代わりに、前駆体としてケイ酸ナトリウムを用いてもよい。先ず、９ｇのＳｐａｎ ２０、６０ｍＬのケロシン、および、１ｍＬの４Ｍ ＨＣｌを含む乳液を調製することによって球形粒子が製造される。１ｍｌのケイ酸ナトリウム溶液（２７％）を加えることによって、約１−１００ミクロンのサイズ範囲を持つ球形粒子が形成される。しかしながら、この製造過程は、出現するｐＨが極端であるためにタンパク質の封入には適切ではない。ケイ酸ナトリウムのｐＨの低下は直ちに沈殿を生じる。ｐＨを下げるためには、ケイ酸ナトリウム液を希釈し、イオン交換樹脂を用いてナトリウム含量を下げる必要がある。

脱イオン化ケイ酸塩液の例示調製
３３ｍＬのケイ酸ナトリウム液（２７％）を、蒸留水で９９ｍＬに希釈した。３４．５ｇのＤｕｏｌｉｔｅ陽イオン交換樹脂（Ｈ^＋形）を攪拌しながら加え、ｐＨを１１．４５に下げた。Ｄｕｏｌｉｔｅ樹脂をろ過除去し、３１．１６ｇの新鮮樹脂を加えてｐＨを９．８に下げた。

２０ｇのＳｐａｎ ２０を攪拌しながら１３５ｍＬのケロシンに溶解した。ｐＨ＝９．８におけるクエン酸液６ｍｌを加え、数分間攪拌し界面活性剤液中に分散させた。１ｍＬの１Ｍ ＨＣｌを加え、乳液を攪拌状態に放置した。６時間後、固形物を遠心によって取り出し、ケロシン、およびエタノール（×２）を用いて洗浄した。凍結乾燥サンプルの平均孔径を、下表において他のコロイド前駆体のものと比較する。

ズブチリシンの封入
４．５ｇのＳｐａｎ ２０を３０ｍＬのケロシンに投じ、攪拌して溶解した。Ｂｉｎｄｚｉｌ １５／５００またはＢｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０のいずれか１．２５ｍＬを、前記混合液に加えて乳液を形成した。乳液を、１Ｍ ＨＣｌ（Ｂｉｎｄｚｉｌ １５／５０の場合は１４４μＬ、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０の場合は１９８μＬ）によって酸性とし、その後、２００μＬの水に溶解した１０ｍｇのズブチリシン、および９８μｌの塩溶液４を加えた。この反応液を５時間攪拌した。粒子を遠心分離し、ケロシンで、次にシクロヘキサンでは２回洗浄し、窒素気流で乾燥し、淡白色の粉末を得た。

ズブチリシンは、下記の方法によってケイ酸塩粒子の中に封入した。すなわち、
１８ｇのＳｐａｎ ２０を攪拌しながら１２０ｍＬのケロシンに溶解した。８ｍｇのズブチリシンを２００μｌの水に溶解して得た溶液を、上記界面活性剤液に加え、次いで、前述のように調製した４ｍＬの脱イオン化ケイ酸塩を加えた。０．６７ｍＬの１Ｍ ＨＣｌを加えｐＨを７．２に下げた。この溶液を６時間攪拌し、次いで、固形物を遠心によって取り出した。粒子を一度ケロシンで、次いでヘキサンで二度洗浄した（各洗浄の後で遠心によって上清を取り除く）。

図１９は、上に概説したように合成した、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０、Ｂｉｎｄｚｉｌ １５／５００、およびケイ酸塩の微粒子から得られたズブチリシン放出曲線を描くグラフを示す。放出曲線は類似の形をしているが、放出される合計パーセントは、粒子の孔径に応じて変動する。図２０は、本実施例で用いた三つの異なるサンプルにおける孔径分布を示す。孔径が小さければ小さいほど、粒子から放出されるタンパク質の合計パーセントは低くなる。用いた典型的前駆体の平均孔径を下表に示す。

気体の吸着の振る舞いを分子レベルで記述する密度関数理論（ＤＦＴ）を用いて窒素吸着がモデル化されているが、この理論は、広範囲の孔径をモデル化するのに適切である。円筒形の孔を仮定する。平均孔径を、下表に見るように、様々のシリカ前駆体についてまとめた。平均孔径は、最初のコロイド粒子の大きさ、およびゲル化ｐＨによって決められるようである。別様に指示しない限り、調製に用いた界面活性剤はＳｐａｎ ２０である。

微小粒子におけるフェリチンの分布
本発明者達は、タンパク質分子の中に疎水性領域が存在するために、タンパク質は、水小滴の内部ではなく、乳液の界面領域に留まる傾向を持つ可能性を考慮した。この偏向作用によって、タンパク質が、乳液小滴の内部に形成される微粒子の外殻に封入されるかもしれないと考えたのである。粒子の本体全体に渡る封入タンパク質の分布を調べるために、鉄コアを含み、従って、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって簡単に検出されるフェリチンをシリカ粒子にドープした。

調製の詳細
Ｓｐａｎ ２０（１．６ｇ）をケロシン(１２ｍＬ)に溶解した。フェリチン液（〜１００ｍｇ／ｍＬ、１２６μＬ）をＢｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０（３００μＬ）と混合した。次に、この混合物を、前記界面活性剤液に５００ｒｐｍで攪拌しながら滴下した。ＨＣｌ（１Ｍ、４８０μＬ）、および塩の濃縮液を混合した。この液の９１μＬを乳液に加えた。乳液を２．５時間攪拌放置した。その時点で固形物質が反応容器の底に出現した。混合液を遠心し（２０００ｒｐｍ、３分）、固形物をケロシンで一度、イソプロパノールで二度洗浄した。固形物質を窒素流下で乾燥した。最後の粉末は「黄土」色をしており、フェリチンが上手く粒子の中に封入されたことを示していた。

粒子におけるタンパク質分布のマッピング
粒子を樹脂の中に包埋し、８０ｎｍ厚の切片を、Ｌｅｉｃａ Ｕｌｔｒａｃｕｔ ＵＣＴウルトラマイクロトーム上で3０°のＤｉａｔｏｍｅダイヤモンドナイフで薄切し、ホールカーボン被覆銅グリッドの上に載せた。図２１は、粒子の典型的走査像であり、中央の粒子には若干のナイフ傷が明白である。シリカ粒子の断面の一部におけるＦｅ分布を、走査ＴＥＭ（ＳＴＥＭ）エネルギー散乱Ｘ線分光光度（ＥＤＸ）画像法によってマッピングした。この技術では、ＳＴＥＭ画像における各ピクセルについて完全なＥＤＸスペクトラムを収集し、次いで、各スペクトラムを処理して背景Ｘ線を除去する。要素分布のマップは、各興味の要素に対応するスペクトラム領域においてＸ線強度をプロットすることによって生成される。Ｆｅ分布マップは、フェリチンが調べた領域全体に均一に分布することを示した。これは、タンパク質が、小滴内で、界面活性剤／溶媒界面に留まる方向性を持たないことを示唆する。

図２２は、ＳＴＥＭ暗視野画像法（ＤＦＩ）による画像（上段左）の大型ボックスに対応する５０ピクセル×５０ピクセル領域におけるＣ、Ｆｅ、Ｓｉ、およびＯの分布マップを示す。下段パネルに表示されるスペクトラムは、ＳＴＥＭ ＤＦＩの小さなバツ印の位置にフェリチンによるＦｅ−Ｋ Ｘ線ピークを明瞭に示す。

図２３は、ＳＴＥＭ ＤＦＩ画像（上段左）のボックスに対応する７５ピクセル×７５ピクセル領域におけるＣ、Ｆｅ、Ｓｉ、およびＯの分布マップを示す。下段パネルに表示されるスペクトラムは、ＳＴＥＭ ＤＦＩの小さなバツ印の位置にフェリチンによるＦｅ−Ｋ Ｘ線ピークを明瞭に示す。Ｆｅ分布マップは、フェリチンが分析領域全体に均等に分布していることを示す。

図２４は、封入フェリチンを持たないコントロール標本から得られたＳＴＥＭ ＥＤＸスペクトラム画像であって、１枚の微小球切片におけるＣ、Ｆｅ、Ｓｉ、およびＯの分布を示す。予期した通り、Ｆｅは検出されなかった。

封入時に使用される各種成分の、アルファ−キモトリプシン、ズブチリシン、およびアルカリフォスファターゼの活性に及ぼす作用
タンパク質の放出後活性は、本発明の粒子の使用にとって明らかに重要問題である。全体アッセイの内のどの成分が活性損失を招くのかを特定する試みとして、アルファ−キモトリプシンおよびズブチリシンの両方を用いてアッセイを行った。これらのアッセイに用いた各種塩溶液の組成を下記に示す。全ての溶液は、脱イオン水によって最大５０ｍｌとした。

図２５は、封入過程の各種成分の、アルファ−キモトリプシン活性に及ぼす作用を示す。Ｂｉｎｄｚｉｌの添加は、該酵素の完全な変性をもたらした。しかしながら、これは、もっとも考えられる理由として、Ｂｉｎｄｚｉｌの高いｐＨ（約１０）のせいであろう。ｐＨ１０のＢｉｎｄｚｉｌを除けば、もっとも有害な化学成分は、粒子を洗浄するのに用いられたイソプロパノールが考えられる。塩溶液も、酵素の活性に対して様々な影響を及ぼすようである。

図２６は、同じ成分／薬品、プラス、さらに別のいくつかの洗浄溶媒の、ズブチリシン活性に及ぼす作用を示す。ズブチリシン活性にたいしてもっとも有害な二つの化学成分は、酸性条件（ｐＨ約２）、および塩溶液４のようである。酸性条件（＜ｐＨ６）は、ズブチリシンに対して有害であることが知られる。さらに塩溶液４、すなわち、カルシウム塩の濃縮液も有害であることが判明した。上に見られるように、時に粒子を洗浄するために用いられる二つの薬品、エタノールおよびイソプロパノールは共に酵素活性にとっては極めて有害のようである。ヘキサンおよびシクロヘキサンは、酵素活性に対し有害作用が認められなかった。

９．５のｐＫａを持つアルカリフォスファターゼは、比較的高いｐＨでは、大抵の酵素よりも著明に安定である。この酵素を用いて、ｐＨ約１０における封入の活性に及ぼす影響を調べ、その結果を、ｐＨ６での封入過程に用いられる酵素の活性と関連させた。図２７は、アルカリフォスファターゼの放出後活性であって、ａ）図１７に記述する通りのｐＨ＝６．０における封入過程後の活性、および、ｂ）塩を用いない場合の同じ過程後の活性を示す。この過程は、塩の存在の如何を問わず、同様に約５０％の活性減少をもたらす。一方、ｐＨ９．７における過程（実施例１に記載する通りの）は、酵素のｐＫａと極めて近似するが、その触媒作用を強化するようである。このことは、ｐＨ約１０における封入は、約９を超えるｐＨを耐えることのできる、またはそのようなｐＨを好むシステムにとっては有用である可能性のあることを示す。

本発明による粒子から放出される酵素に関する、さらに別の反応速度論実験を下記に述べる。図２８は、標準（酵素溶液）と比較した場合の、三つのサンプルの酵素反応速度を示す。このグラフでは、直線の勾配は、単位時間当たり、単位の酵素当たり形成される基質の単位数によって記載される、酵素の活性を表す。曲線ａ）およびｂ）は、微粒子に封入されたズブチリシンを表す。その際、微粒子には、塩溶液の代わりに、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）が、それぞれ、Ｂｉｎｄｚｉｌ ２ｍｇ／ｍＬおよびＢｉｎｄｚｉｌ ５ｍｇ／ｍＬの濃度として加えられた。塩をＨＰＣで置換すると、反応速度は低下した。これは、ＨＰＣの存在が、ズブチリシンの活性を下げるように働くことを示す。（下記の合成の詳細を参照）。ＨＰＣの濃度が増すにつれて、反応速度は遅くなる。曲線ｃ）は、後述するＢｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０とケイ酸ナトリウムの１：１（ｗ／ｗ）混合物の中に封入されたズブチリシンを表す。これらの粒子は、標準とほぼ近似の活性を示すことが見て取れる。

合成の詳細
ＨＰＣを含むサンプルの先駆体は、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０に対してＨＰＣを２種類の異なる濃度で、すなわち、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０ １ｍＬ当たり、それぞれ、２ｍｇおよび５ｍｇのＨＰＣに相当する濃度で溶解することによって調製した。第３サンプルの場合、前駆体は、実施例４に記載する通りに調製した、０．６２５ｍＬのＢｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０、および１．８７５ｍＬの脱イオン化ケイ酸塩液から成っていた。

各サンプルについて、６０ｍＬのケロシンに９ｇのＳｐａｎ ２０を溶解し、前述の前駆体液２．５ｍＬを攪拌しながら加えた。０．４６ｍＬの１Ｍ ＨＣｌを加えることによって乳液内部のｐＨを６．０に下げた。次に、２００μｌの水に８ｍｇのズブチリシンを含む溶液を加え、次いで０．３５ｍＬの塩溶液１（前述）を加えた。遠心にて粒子を分離し、ケロシンおよびヘキサンで洗浄し、その後乾燥した。

封入されたズブチリシンおよびアルカリフォスファターゼの保存安定性
微粒子の中に封入された酵素の保存安定性は、考慮すべき重要な点である。タンパク質の多くは、長期の保存には０℃未満の温度における保存を必要とする。後述の過程によって形成される微粒子の構造的有効性を凍結乾燥過程時に調べた。凍結過程時に起こる粒子の水分含量の膨張が、粒子の破壊または亀裂の発生率を増し、長期保存に対する粒子の有効性を下げることが最初疑われた。図２９は、（ａ）室温で保存されたサンプル、および、（ｂ）＜０℃で保存されたサンプルのＳＥＭ顕微鏡写真を示す。図２９には、二つの保存条件のどちらかに、破壊または亀裂粒子の広がりが増加することを示す証拠は見られない。

微粒子全体の構造的完全性は重要ではあるが、微粒子の基質の内部に保存されるタンパク質の有効性についても調べた。図３０は、粒子合成直後のサンプルの活性と比べた場合の、約４℃、および０℃未満で保存したズブチリシンの酵素活性を示す。図示の保存期間の間に、酵素活性において約８０−９０％の低下があることが見て取れる。しかしながら、４℃、または０℃未満の保存の間には有意差は見られなかった。

セリンプロテアーゼであるズブチリシンは頑丈で、広範囲の化学的環境において安定である。しかしながら、プロテアーゼ酵素であることは自己破壊的となるため、長期の保存性を下げることになる。タンパク質は、長期の場合フリーザーで凍結乾燥状態で保存することが重要であるが、一方、酵素の活性は、同じ条件下で、微粒子の内部で明らかに減少した。このことは、微粒子内部の環境は、事実上擬似水性である可能性のあることを示唆する。この推測を、後述のように二つのズブチリシン封入サンプルを調製し、一方を凍結乾燥することによって試験した。次に両サンプルをフリーザーに保存した。二日間の保存後、凍結乾燥サンプルの活性は、乾燥させないサンプルよりも３倍高く、９日間の保存後も事実上不変であった。このことは、材料は乾燥固体のように見えるけれども、プロテアーゼの場合は、存在する水の量が問題となる可能性のあることが考えられ、サンプルは、保存前に凍結乾燥するべきである。逆に、図３１から見て取れるように、アルカリフォスファターゼ活性は（合成の詳細は実施例１に示す）、２週間の保存によって目立った影響は受けず、全体として図示の期間においてごく僅かな低下を示しただけであった。

合成の詳細
１８ｇのＳｐａｎ ２０を１２０ｍＬのケロシンに溶解した。５ｍＬのＢｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０を攪拌しながら加えた。０．９１５ｍＬの１Ｍ ＨＣｌを加えてｐＨを６．０に下げた。４００μＬの水に１６ｍｇのズブチリシンを溶解して得られた溶液をこの乳液に加え、次いで、０．３９ｍＬの塩溶液１を加えた。粒子を遠心にて分離し、ケロシンおよびヘキサンで洗浄し、その後乾燥した。

タンパク質封入のための代替え基質
２種類の、代替用セラミック基質について調べた。第１のもの、アルミナは、後述のようにアルミナゾルから調製した。アルミナゾルは、水に溶解したアルミニウムｓｅｃ−ブトキシドを、１０：１の水対アルコキシド比を用い、かつ、７５℃の反応温度で加水分解することによって調製した。この混合物を３０分攪拌し、温度を８１℃に上げ、生産されたアルコールを除去した。次に、硝酸を、０．０７１：１のＨ^＋：アルコキシド分子比において加え、溶液を８１℃で１時間攪拌した。次に、混合物を密封し、８０℃で保存し、ペプチド化を完了した。光散乱から、コロイドの平均粒径は９ｎｍであることが示された。ゾルを回転蒸発させることによって濃縮し１０ｗｔ％アルミナ濃度とした。

９ｇのＳｐａｎ ２０を６０ｍＬのケロシンに溶解し、１０ｗｔ％のアルミナ２ｍＬを、５００ｒｐｍで攪拌しながら、このＳｐａｎ ２０／ケロシン混合液に加えた。０．１ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４、６．６９ｇ ＮａＣｌ、および１．３ｇ ＣａＣｌ_２を含む５０ｍＬの水溶液から採取した０．０５ｍＬ分液を加えた。攪拌を５時間続け、次に混合液を２０００ｒｐｍで遠心し、固形物を取り出し、これをケロシンで一度、エタノールで二度洗浄し、その後乾燥した。光学顕微鏡写真（図３２）から、粒子は大きく（平均粒径は約６０ミクロン）、サンプルは、比較的大型の球が乾燥および取り扱いによって揺さぶられたことによる、非球形断片をかなりの比率で含んでいることが示される。このアルミナ粒子はさらに、恐らくアルミナゲルの柔軟な性質によると思われるが、いく分奇形である。アルミナ粒子の被る傷害のために、比較的硬いゲルをもたらすことが知られる、第２のセラミック、ジルコノチタネートを調べた。

ジルコニウムテトラブトキシド（ＺＢＴ）とチタニウムテトラブトキシド（ＴＢＴ）の１：１（モル）混合物を用いて、ジルコノチタネートゾルを調製した。酢酸（５：１（モル）の酢酸：（Ｔｉ＋Ｚｒ））を加え、ＺＢＴとＴＢＴの加水分解の進行をゆるめ、次に水（２５：１（モル）の水：（Ｔｉ＋Ｚｒ））を加えた。ＰＣＳ測定から、ゾルは、２８ｎｍのコロイド粒子から成ることが示された。ゾルのｐＨは３．０であった。上記ゾル２．５ｍＬを、９ｇのＳｐａｎ ２０を６０ｍＬのケロシンに溶解して得た溶液に加えた。１時間の攪拌後、固形物を遠心で取り出し、ケロシンとエタノールを用いて洗浄した。光学顕微鏡によって球形微粒子が観察された。図３３は、典型的ＳＥＭ画像を示す。光散乱測定によって、粒子は、そのサイズが約１−１００ミクロンの範囲を持ち、平均サイズは約２６ミクロンであることが示された（図３４参照）。表面積および孔度測定値から、物質は、微小多孔性であり、孔径分布は１．１と２．０ｎｍに二つのピークを持っていることが示された。

ジルコノチタネート粒子に生体分子を封入する例として、ブロメライン（パイナップルから得られるプロテイナーゼ）が、そのサイズが比較的小型（〜２８ｋＤ）で酸性条件でも安定であるために選ばれた。その放出曲線を図３５に示す。

合成の詳細：
９ｇのＳｐａｎ ２０を６０ｍＬのケロシンに溶解し、８ｍｇのブロメラインを２００μｌの水に部分的に溶解した。サンプルを遠心し、不溶のタンパク質を除去し、その後、前述のように調製したジルコノチタネートゾル２．５ｍＬに加えた。ゾル／タンパク質混合物を、攪拌下に、界面活性剤溶液に分散させ、６時間攪拌した。固形物を遠心にて取り出し、ケロシンで一度、ヘキサンで二度洗浄した。各洗浄の後で遠心により上清を除去した。

本発明の利点
ポリマーシステムと比べた場合、本発明に記載されるセラミック封入の使用は、下記の利点を提供する。すなわち、
＊製造は、タンパク質および他の生物学的物質に対し比較的穏やかな条件を用いるので、放出時高いタンパク質活性を維持する（実施例６に示されたように）。合成中、比較的無害な長鎖有機物にほんの僅か暴露されるだけなので、生物学的物質の封入は周囲温で実行することが可能である。
＊放出機構は、そのサイズが調節可能な内部孔を介する拡散による。拡散速度は、局所の化学的環境に依存する度合いが比較的少ない（すなわち、様々な環境においても変動性比較的少ない）。
＊金属酸化物は内因的に親水性であり、従って血管内で比較的安定である筈である。新規の体内分布が可能かもしれない。
＊水性コロイドによって生産されるゲルは、内在的に擬似水性環境を与え、得られた粒子は〜１０ｗｔ％の水を含む可能性がある。これは、実施例７に示したように、ある種の生物剤の保存安定性を強化する可能性がある。

さらに、このセラミックシステムは、タンパク質剤送達用途にとって魅力的な、下記のような内因的特性を持つ。
＊セラミック粒子は、化学的、生物学的に不活性であり、ポリマーが感受性を持つ溶媒／薬品とも反応しない。セラミック粒子は、強酸条件（例えば、胃）においても安定である。
＊セラミック粒子は熱的に安定であり、引火性を持たない。
＊シリカおよびその他の軽金属酸化物は、内因的に生体適合性であり、あるものは天然において生体内でも見られる。
＊粒子の合成は、「生体分子フレンドリー」であって、シリカゲル前駆体はタンパク質に対して無害である。
＊セラミック粒子は、親水性表面を持つ。これは血中における安定を強化する。これらの粒子によって、新規の生体分布特性が得られる可能性がある。
＊セラミック粒子は、機械的に強く、外力によっては簡単に損傷されない。
＊粒子のサイズおよび放出速度に対し独立的調節を実行することが可能である。これらのパラメータは、優れた再現性をもって導入される。
＊全ての合成は周囲温で実行することが可能である。
＊同じ一般的封入過程を、全てのタンパク質に使用してよいかもしれない。
＊この過程は、工業的規模の量で市販される、比較的安価な成分を使用する。
＊この過程は、低資本投資しか必要としない。
＊粒子表面を機能化することも可能である。これは、タンパク質の標的送達に対する可
能性を開くことになるかもしれない。

本発明の過程は、Ｂａｒｂｅ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ，ＷＯ０１／６２２３２（２００１）に詳述される調節送達技術を、薬剤のような小型分子の放出から、比較的大型の生体分子、例えば、タンパク質（酵素を含む）、ポリペプチド、およびＤＮＡ／ＲＮＡ断片の放出まで拡張するために開発された。本過程は、球形シリカ粒子を形成するのに溶媒／界面活性剤乳液システムの使用に基づいてはいるが、タンパク質や、その他の生物学的物質により適合した化学を用いている。本発明に使用される好適な前駆体材料は、市販のシリカコロイド、またはコロイド混合物で、要すれば任意に、さらに粒子の孔径を調節するためにケイ酸ナトリウム液を加えてもよい。水性のシリカ前駆体の使用は二つの問題点の克服に役立つ。先ず、タンパク質は、通常、シリコンアルコキシドの加水分解の際に生産されるアルコールによって変性されるが、この欠点は、本システムを用いることによって回避される。第二に、水性シリカゲル前駆体の使用によって、中間孔度の産物であって、タンパク質の放出にとって好適なサイズ範囲、１−１５ｎｍのサイズ範囲の孔を持つ産物が得られる。水性シリカ前駆体は、その低コストと調製し易さのために好ましいが、要すれば、他の水性セラミック前駆体、例えば、チタン酸塩、ジルコン酸塩、またはアルミン酸塩によって置換されてもよい。

本発明に記載される技術に対する予想される応用として下記が挙げられる。すなわち、
＊タンパク質、医用／薬剤送達（タンパク質薬剤送達、皮膚移植、骨再生、遺伝子治療）
＊バイオテクノロジー応用、例えば、酵素の調節的放出（生体触媒）、例えば、界面活性剤における、でん粉加水分解／フルクトース生産、果物ジュース製造、醸造、織布、動物飼養、製パン醗酵、パルプおよび紙生産、皮革産業、食物生産（例えば、チーズ）。
＊酵素の特殊な工業的使用、例えば、バイオセンサーおよび他の分析器、個人の保健用品（例えば、歯磨き、コンタクトレンズクリーニング）、微細化学生産（例えば、キラル的に純粋なアミノ酸、希少糖、半合成ペニシリン）、DNA技術（遺伝子工学）における運用。
＊美容品、化粧品。
＊食品、栄養補助品。
＊獣医学応用。

図１は、ｐＨ−１０における粒子形成の過程を示すフローチャートである。 図２は、ｐＨ−１０において球形粒子の形成を可能とする、いくつかの界面活性剤の構造を示す。 図３は、各種の界面活性剤を用いて製造したシリカ産物の走査電子顕微鏡画像を示す。 図４は、各種の界面活性剤を用いて製造したシリカ粒子の走査電子顕微鏡画像を示す。 図５は、各種の乳液溶媒を用いて製造したシリカ産物の走査電子顕微鏡画像を示す。 図６は、種々の濃度のＬｕｄｏｘ ＳＭ−３０を用いて製造したシリカ粒子の走査電子顕微鏡画像を示す。 図７は、図１に概説した製造過程を用いた場合の、Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０の添加容量に対する生産量を示すグラフである。 図８は、酸の関数として表したコロイドシリカ（３０ｍＬ）のｐＨのグラフである。（ａ）Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０およびＢｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０を、０．５ｍｏｌ／Ｌ硝酸で滴定した。（ｂ）Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０を１２ｍｏｌ／Ｌ酢酸で滴定した。 図９は、硝酸滴定Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０を用いた場合に形成されるシリカ産物の、走査電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡画像を示す。 図１０は、酢酸滴定Ｌｕｄｏｘ ＳＭ−３０を用いた場合に形成されるシリカ産物の、走査電子顕微鏡画像を示す。 図１１は、種々のタイプのコロイドシリカを用いて形成されるシリカ産物の、走査電子顕微鏡画像を示す。 図１２は、図１に概説した合成過程を用いて形成される粒子の、光散乱で定量した粒径分布を描くグラフを示す。 図１３は、粒子の製造に超音波プローブを用いる本発明の合成過程によって製造される粒子の粒径分布を描くグラフである。 図１４は、乳液内部においてｐＨを６．０に下げることによって形成されるシリカ粒子の走査電子顕微鏡写真である。 図１５は、ｐＨ＝９．７において形成された粒子からのアルカリフォスファターゼの放出を示すグラフである。 図１６は、６時間の期間における、アルファ-キモトリプシン、ズブチリシン、およびアルカリフォスファターゼの、正規化放出を示すグラフである。 図１７は、Ｓｐａｎ ２０／ケロシン乳液を用い、タンパク質をｐＨ＝６．０で封入させた粒子合成を示すフローチャートである。 図１８は、本発明によるシリカ粒子で、平均孔径が５．５および６．７ｎｍである粒子からの、キモトリプシン、アルカリフォスファターゼ、およびウレアーゼの放出を示すグラフである（６．７ｎｍの孔を持つ粒子からのウレアーゼの放出はこの図には表されていないことに注意）。 図１９は、Ｂｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０（◆）、Ｂｉｎｄｚｉｌ １５／５００（■）、およびケイ酸塩（▲）を用いて生産されたシリカからの、ズブチリシンの放出を示すグラフである。 図２０は、実施例４で概説したように、ケイ酸塩、Ｂｉｎｄｚｉｌ １５／５００（６ｎｍ）、およびＢｉｎｄｚｉｌ ３０／３６０（９ｎｍ）から製造される粒子の孔径分布を示すグラフである。 図２１は、本発明によるシリカ粒子の走査電子顕微鏡写真である。 図２２は、コントロール標本から得られた、ＳＴＥＭ（走査透過型電子顕微鏡）ＥＤＸスペクトラム画像である。粒子の薄切においてフェリチンは、Ｃ、Ｆｅ、Ｓｉ、およびＯの分布を示さない。 図２３は、本発明による粒子の薄切切片におけるＣ、Ｆｅ、Ｓｉ、およびＯの分布を示すＳＴＥＭ ＥＤＸスペクトラム画像である。 図２４は、コントロール標本から得られたＳＴＥＭ ＥＤＸスペクトラム画像であって、粒子の薄切においてフェリチンは、Ｃ、Ｆｅ、Ｓｉ、およびＯの分布を示さない。 図２５は、本発明の封入過程の各種成分の、アルファ−キモトリプシン活性に及ぼす作用を示すグラフである。 図２６は、本発明の封入過程の各種薬品による処理後におけるズブチリシン活性を示すグラフである。 図２７は、各種封入過程による封入後２週間におけるアルカリフォスファターゼの活性を示すグラフである。 図２８は、ａ）ＨＰＣ ２ｍｇ／ｍＬ（◆）、ｂ）５ｍｇ／ｍＬ ＨＰＣ（■）、ｃ）３０／３６０とケイ酸ナトリウムの１：１混合物（▲）、標準の酵素液（●）を用いて製造した、ズブチリシン含有粒子における封入酵素活性率を示すグラフである。 図２９は、（Ａ）室温で保存された、および、（Ｂ）０℃未満で保存された本発明による粒子を示す、走査電子顕微鏡写真である。 図３０は、種々の保存条件下におけるズブチリシンの活性を示すグラフである。 図３１は、０℃未満で2週間保存した後の封入アルカリフォスファターゼ活性の変化を示すグラフである。 図３２は、本発明に従って製造されたアルミナ粒子の光学顕微鏡写真である。 図３３は、本発明によるジルコノチタネート微粒子の走査電子顕微鏡画像である。 図３４は、本発明によるＳｐａｎ ２０／ケロシン乳液を用いて得られたジルコノチタネート粒子の粒径分布を示すグラフである。 図３５は、本発明によるジルコノチタネート粒子からの、ブロメラインの正規化放出を示すグラフである。

Claims (29)

1. 生物学的物質を放出可能に封入するための過程であって：
   ａ）非極性溶媒に溶解した界面活性剤の溶液を、前駆物質および生物学的物質と混合して、非極性相中に分散される、生物学的物質を含む極性相を含む乳液を形成すること；
   ｂ）極性相から生物学的物質を含む粒子を形成すること、
   を含む前記過程。
2. 工程ａ）は：
   ｃ）非極性溶媒に溶解した界面活性剤の溶液を前駆物質と混合し、第１乳液を形成すること、その際、前記第１乳液は、極性相を非極性相中に分散させ、かつ、前記前駆物質は極性相に局在し；および、
   ｄ）第１乳液を生物学的物質と、極性相が生物学的物質を含むように混合すること、
   を含むことを特徴とする、請求項１の過程。
3. 第１乳液のｐＨを、生物学的物質が活性を維持するｐＨに調整する工程であって、工程ｄ）の前に実行される工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２の過程。
4. 工程ａ）は：
   ｅ）非極性溶媒に溶解した界面活性剤の溶液を、酸性水溶液と混合して、第２乳液であって、非極性相に極性相を分散させた第２乳液を形成すること；
   ｆ）前駆物質を、第２乳液に、該前駆物質が極性相に局在されるように加えること；および、
   ｇ）生物学的物質を、極性相が該生物学的物質を含むように加えること、
   を含むことを特徴とする、請求項１の過程。
5. 工程ａ）は：
   ｈ）前駆物質と生物学的物質を混合して極性混合物を形成すること；および、
   ｉ）極性混合物を界面活性剤の溶液と混合し、非極性相の中に極性相を分散させる乳液であって、該分散が、極性相が前駆物質および生物学的物質を含むように行われる乳液を形成すること、
   を含むことを特徴とする、請求項１の過程。
6. 極性混合物のｐＨを、工程ｉ）の前に、約７．５と約１１の間に調整することを含む、請求項５の過程。
7. 乳液が、約１と約１１の間のｐＨにあることを特徴とする、請求項１の過程。
8. 前駆体がセラミック前駆体を含むことを特徴とする、請求項１の過程。
9. 前駆体がコロイドシリカを含むことを特徴とする、請求項１の過程。
10. 生物学的物質がタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１の過程。
11. 生物学的物質が酵素を含むことを特徴とする、請求項１の過程。
12. 工程ｂ）の前にゲル化支援剤を添加することをさらに含む請求項１の過程。
13. ゲル化支援剤は、塩、および水溶性ポリマーから成るグループから選ばれることを特徴とする、請求項１２の過程。
14. 非極性相から粒子を少なくとも部分的に分離する工程をさらに含む請求項１の過程。
15. 少なくとも部分的に分離する工程は、非極性溶媒と混和可能である沈殿性溶媒と、粒子を含む乳液を混合して粒子を沈殿させる工程を含むことを特徴とする、請求項１４の過程。
16. 少なくとも部分的に分離する工程は、粒子を含む乳液を遠心する工程を含むことを特徴とする、請求項１４の過程。
17. 粒子を乾燥する工程をさらに含む、請求項１４の過程。
18. ｊ）非極性溶媒に溶解した界面活性剤の液を、コロイドシリカと混合し、非極性相中に極性相を分散させた第１乳液を形成すること；
    ｋ）第１乳液のｐＨを、約１と約１１の間のｐＨに調整すること；
    ｌ）第１乳液を、生物学的物質と混合すること、その際、混合は、極性相が該生物学的物質を含むように行われ；および、
    ｍ）極性相から生物学的物質を含む粒子を形成すること、
    を含むことを特徴とする、請求項１の過程。
19. ｎ）非極性溶媒に溶解した界面活性剤の液を、酸性水溶液と混合し、非極性相中に極性相を分散させた第２乳液を形成すること；
    ｏ）第２乳液のｐＨが約１と約１１の間になるように、コロイド状シリカを第２乳液に加えること；
    ｐ）生物学的物質を第２乳液に添加すること、その際、添加は、極性相が該生物学的物質を含むように行われ；および、
    ｑ）極性相から生物学的物質を含む粒子を形成すること、
    を含むことを特徴とする、請求項１の過程。
20. ｒ）前駆物質と生物学的物質を混合して極性混合物を形成すること；
    ｓ）極性混合物のｐＨを、約１と約１１の間に調整すること；
    ｔ）極性混合物を界面活性剤溶液と混合して、非極性相の中に極性相を分散させた乳液を形成すること、その際、前記極性相が極性混合物を含み；および、
    ｕ）極性相から生物学的物質を含む粒子を形成すること、
    を含むことを特徴とする、請求項１の過程。
21. 放出可能な生物学的物質を含む粒子であって、約１と５０ｎｍの間の平均孔径を持ち、約０．０５と約５００ミクロンの間の平均粒径を持つことを特徴とする粒子。
22. ａ）非極性溶媒に溶解した界面活性剤の液を、前駆物質および生物学的物質と混合し、非極性相中に極性相を分散させた乳液を形成すること、その際、前記極性相が生物学的物質を含み；および、
    ｂ）極性相から生物学的物質を含む粒子を形成すること、
    を含む過程によって製造されることを特徴とする、請求項２１の粒子。
23. 直径が約５と約５００nmの間の一次粒子から成る凝集体を含むことを特徴とする、請求項２１の粒子。
24. 生物学的物質がタンパク質を含むことを特徴とする、請求項２１の粒子。
25. 生物学的物質が、粒子全体に渡って実質的に均一に分布していることを特徴とする、請求項２１の粒子。
26. 生物学的物質が、粒子から放出された後でも生物学的に活性を持つことを特徴とする、
    請求項２１の粒子。
27. 生物学的物質を患者に送達する方法であって、請求項２１による１個以上の粒子を患者に投与することを含む前記方法。
28. 生物学的物質を液体に送達する方法であって、請求項１による１個以上の粒子に、液体を暴露することを含む、前記方法。
29. 患者における病態の治療用薬剤製造のための粒子の使用であって、生物学的物質が前記治療に対し適応とされることを特徴とする、請求項２１による粒子の使用。