JP2011188849A - miR-7 EXPRESSION PLASMID HAVING ANTITUMOR EFFECT - Google Patents
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Abstract
【課題】EGFR依存的に生存する腫瘍細胞に対し、EGFRの抑制を蛋白レベルではなく、mRNAレベルで抑制する方法を提供する。
【解決手段】ヒトDNA配列内に存在する、特定な配列からなる、２０〜２２０塩基長のオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドであって、少なくともmiR-7をコードするDNAを含むオリゴ（又はポリ）ヌクレオチド又はその相補配列からなるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドを含miR-7発現プラスミド。
【選択図】図５Provided is a method for suppressing EGFR suppression at the mRNA level, not at the protein level, for tumor cells that survive in an EGFR-dependent manner.
An oligo (or poly) nucleotide having a specific sequence and presenting in a human DNA sequence and having a length of 20 to 220 bases and comprising at least miR-7-encoding DNA. Alternatively, an miR-7 expression plasmid containing an oligo (or poly) nucleotide consisting of its complementary sequence
[Selection] Figure 5
Description
本発明は、miR-7を効果的に細胞内に導入しうるプラスミドに関する。より詳しくは、生体に導入効率がよく、毒性の低いmiR-7発現プラスミドに関する。 The present invention relates to a plasmid capable of effectively introducing miR-7 into cells. More specifically, the present invention relates to a miR-7 expression plasmid that has good introduction efficiency into a living body and low toxicity.
上皮成長因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR）が、上皮系腫瘍においてその増殖及び生存維持に重要な役割を果たしていることは既知のことである。そのEGFRを標的とした分子標的薬には、EGFRのチロシンキナーゼを選択的に阻害する、エルロチニブ（erlotinib）、ゲフィチニブ（gefitinib）などがある。EGFRに特有の変異、例えばエクソン19にコードされるアミノ酸が一部欠失したもの(delE746-A750)、エクソン21にコードされる858番目のアミノ酸であるロイシンがアルギニンに置換されたもの（L858R）、エクソン20にコードされる719番目のグリシンがセリン、アラニン、又はシステインへ置換されたもの（G719X）などが存在する肺癌患者に対して、これらの薬剤が臨床的に著効例を示すといわれている。かかる変異は、非喫煙者アジア人女性の肺腺癌患者において、ほぼ半数に認められる変異であることが徐々に明らかになっている（非特許文献１）。逆に、本願発明者らが開発したトランスジェニックマウスモデルにおいて、肺に前記の特有の変異が存在するEGFR（mutation EGFR）を強発現させると、臨床で見られるような肺腺癌が生じることが証明された。そのようなマウスモデルは、ヒトと同様にゲフィチニブ又はエルロチニブを投与すると腫瘍が劇的に縮小することが報告されている（非特許文献２）。したがって、現在市販されているエルロチニブやゲフィチニブは、主としてEGFRリン酸化活性部位を特異的に阻害することにより、EGFR依存的に生存する腫瘍細胞に細胞死をもたらし、臨床的に劇的な効果をあげていると考えられる。 It is known that Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) plays an important role in the growth and survival of epithelial tumors. Molecular targeting drugs targeting EGFR include erlotinib and gefitinib which selectively inhibit EGFR tyrosine kinase. Mutations peculiar to EGFR, for example, partial deletion of the amino acid encoded by exon 19 (delE746-A750), leucine, the 858th amino acid encoded by exon 21 (L858R) These drugs are said to be clinically effective for lung cancer patients in which exon 20 encoded 719th glycine is substituted with serine, alanine or cysteine (G719X). ing. It is gradually becoming clear that such mutations are found in almost half of non-smoker Asian female lung adenocarcinoma patients (Non-Patent Document 1). Conversely, in the transgenic mouse model developed by the inventors of the present application, when EGFR (mutation EGFR) in which the above-mentioned specific mutation is present in the lung is strongly expressed, lung adenocarcinoma as seen in clinical cases may occur. Proven. In such a mouse model, it has been reported that when gefitinib or erlotinib is administered as in humans, the tumor shrinks dramatically (Non-patent Document 2). Therefore, currently commercially available erlotinib and gefitinib mainly cause EGFR-dependent survival of tumor cells by specifically inhibiting the EGFR phosphorylation active site, resulting in clinically dramatic effects. It is thought that.
分子標的薬は、EGFRのリン酸化部位を効率的に阻害することで抗腫瘍活性をもたらしているが、主にEGFRの二次的変異(T790M in EGFR exon20)により、約半年から１年ほどでほぼ確実に分子標的薬に対して耐性となってしまい、患者は癌死から免れる事が出来ない。そこで、その耐性化過程を再現するため。本発明者らはゲフィチニブを、本来著効する変異(delE746-A750 in EGFR exon 19)を有するヒト肺腺癌細胞株(PC-9)に対し、長期低用量持続投与することにより、臨床で発生する耐性と同様な細胞株(RPC-9)を得、臨床にみられる前述の二次的変異を同様に獲得した。このことにより、従来技術であるEGFRリン酸化部位の抑制では、その分子標的薬の暴露下においても耐性化が生じるということが臨床的に観察され、さらにはin vitroでも証明された（非特許文献３）。 Molecularly targeted drugs have brought about anti-tumor activity by efficiently inhibiting the phosphorylation site of EGFR, but in about half to one year mainly due to secondary mutation of EGFR (T790M in EGFR exon20). Almost certainly it becomes resistant to molecular targeted drugs and patients cannot escape cancer death. Therefore, in order to reproduce the tolerance process. The present inventors clinically developed gefitinib by long-term, low-dose continuous administration to a human lung adenocarcinoma cell line (PC-9) having a mutation (delE746-A750 in EGFR exon 19) that is essentially effective. A cell line (RPC-9) similar to the above-mentioned resistance was obtained, and the aforementioned secondary mutation found in the clinic was similarly obtained. As a result, it has been clinically observed that suppression of the EGFR phosphorylation site, which is a conventional technology, occurs under the exposure of the molecular target drug, and further proved in vitro (non-patent literature). 3).
生物の遺伝子情報が解明されるにつれ、蛋白質をコードしていない非コードのDNAの割合が、高等生物ほど非常に多いことが判明されている。また、ヒトでは全ゲノムの2/3からRNAが転写されると推定されていることから、生物種の複雑さに応じて非コードRNAの種類と量が増加すると推定され、非コードのRNAであるmicro RNAが発見された。micro RNAは、18〜22塩基の非コードRNAの総称で、ヒトの遺伝子の約1/3がmicro RNAで制御されていると考えられている。micro RNAのプロセシングについては既に各種報告がなされている。このmicro RNAは真核生物で発現し、高度に保存されており、ヒトでは約1000種類あるものと推定されている。micro RNAに関し、低分子核酸の検出方法が特許文献１に開示されている。 As the genetic information of organisms has been elucidated, it has been found that the proportion of non-coding DNA that does not encode proteins is much higher in higher organisms. In addition, since it is estimated that RNA is transcribed from 2/3 of the whole genome in humans, it is estimated that the type and amount of non-coding RNA will increase according to the complexity of the organism, and non-coding RNA A microRNA was discovered. Micro RNA is a general term for non-coding RNAs of 18 to 22 bases, and it is considered that about 1/3 of human genes are regulated by micro RNA. Various reports on microRNA processing have already been made. This microRNA is expressed in eukaryotes, highly conserved, and is estimated to have about 1000 types in humans. Regarding micro RNA, Patent Document 1 discloses a method for detecting a low molecular nucleic acid.
micro RNAは、遺伝子発現の制御において重要な役割を担っている。micro RNAは、核内ではPri-micro RNAとしてDNAから転写され、ヘアピン二本鎖RNA（dsRNA）前駆体となる。dsRNAは細胞質内に移行し、Dicerの作用により成熟したmicro RNAが生成される。生成したmicro RNAはRISC（RNA-induced silencing complex）複合体に取込まれ、遺伝子機能制御に関与する。micro RNAは、例えばRNA干渉（RNAi）とよく似た作用を有するが、その作用は不明な点が多い。例えばRNAiは標的RNAを切断することにより翻訳を抑制するが、micro RNAの多くは標的RNAを切断せずに翻訳抑制すると考えられている。また、micro RNAは、発生、分化、細胞周期や癌疾患などに関与している可能性が報告され、例えば肺癌、結腸癌、胸部癌、前立腺癌、膀胱癌や膵臓癌患者の腫瘍組織では特定のmicro RNAからそれぞれの腫瘍タイプと正常サンプルとを識別できることが明らかとなっている（特許文献２）。 Micro RNA plays an important role in the control of gene expression. In the nucleus, micro RNA is transcribed from DNA as Pri-micro RNA and becomes a hairpin double-stranded RNA (dsRNA) precursor. dsRNA moves into the cytoplasm, and mature microRNA is produced by the action of Dicer. The generated microRNA is incorporated into a RISC (RNA-induced silencing complex) complex and is involved in gene function control. For example, micro RNA has an action similar to that of RNA interference (RNAi), but the action is unclear. For example, RNAi suppresses translation by cleaving the target RNA, but many microRNAs are thought to suppress translation without cleaving the target RNA. In addition, micro RNA has been reported to be involved in development, differentiation, cell cycle, and cancer diseases. For example, it is identified in tumor tissues of patients with lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, bladder cancer and pancreatic cancer. It has been clarified that each tumor type and normal sample can be distinguished from the microRNA (Patent Document 2).
前述のEGFRを標的とした分子標的薬、即ちチロシンキナーゼ阻害薬に対する臨床的、理論的に証明されている耐性機序では、耐性細胞におけるEGFR依存性は持続していることがイムノブロッティング法により予測されている。したがって、分子標的療法で耐性化した肺癌を代表とする腫瘍において、EGFRを別の手段で抑制することで、その耐性化に関わらず腫瘍抑制効果をもたらしうることが予測される。micro RNA-7（以下、「miR-7」という。）が脳腫瘍細胞中のEGFRを阻害し、Aktパスウェイを抑制すること（非特許文献４）や、miR-7がp21-activated kinase 1 (Pak1)を阻害することが報告されている（非特許文献５）。非特許文献４では、miR-7を発現するプラスミドについて言及している。また、miR-7が肺癌、乳癌、脳腫瘍由来の細胞株に発現しているEGFRを標的とし、抑制作用を示すことが報告されている（非特許文献６）。しかしながら、これらの文献には肺癌のin vivo（生体）のレベルで有効であるという記載は全くない。 Immunoblotting predicts that EGFR dependence in resistant cells persists in clinically and theoretically proven resistance mechanisms against the above-mentioned molecular targeting drugs targeting EGFR, ie tyrosine kinase inhibitors Has been. Therefore, in tumors represented by lung cancer that has been rendered resistant by molecular target therapy, it is predicted that EGFR can be suppressed by other means to produce a tumor suppressing effect regardless of its resistance. microRNA-7 (hereinafter referred to as “miR-7”) inhibits EGFR in brain tumor cells and suppresses the Akt pathway (Non-patent Document 4), and miR-7 is p21-activated kinase 1 (Pak1 ) Has been reported (Non-patent Document 5). Non-Patent Document 4 refers to a plasmid that expresses miR-7. It has also been reported that miR-7 targets EGFR expressed in cell lines derived from lung cancer, breast cancer, and brain tumor and exhibits an inhibitory action (Non-patent Document 6). However, these documents have no description that they are effective at the level of lung cancer in vivo.
本発明は、EGFR依存的に生存する腫瘍細胞に対し、EGFRの抑制を蛋白レベルではなくその鋳型となるmRNAレベルで行なう方法を提供することを課題とする。即ち、mRNAレベルで抑制するために有効なmiR-7を、効果的に細胞内に導入しうるプラスミドを提供することを課題とする。より詳しくは、生体に導入効率がよく、毒性の低いmiR-7発現プラスミドを提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for suppressing EGFR at the mRNA level as a template, not at the protein level, for tumor cells that survive in an EGFR-dependent manner. That is, an object of the present invention is to provide a plasmid capable of effectively introducing miR-7 effective for suppressing at the mRNA level into cells. More specifically, an object of the present invention is to provide a miR-7 expression plasmid having high introduction efficiency into a living body and low toxicity.
本発明者らは、上記課題を解決するためにEGFRを効率的に抑制するmiR-7を発現するのに有効なDNA配列を検索したところ、ヒトDNA配列内に存在する、配列表の配列番号１に示す塩基配列を見出し、当該塩基配列より選択される特定の配列をプラスミドベクターに導入することで、miR-7を効果的に細胞内に導入しうるプラスミドの作製に成功し、本発明を完成した。 In order to solve the above problems, the present inventors searched for a DNA sequence effective for expressing miR-7 that efficiently suppresses EGFR, and present in the human DNA sequence, SEQ ID NO: in the sequence listing. 1 was found, and by introducing a specific sequence selected from the base sequence into a plasmid vector, a plasmid capable of effectively introducing miR-7 into a cell was successfully produced. completed.
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．配列表の配列番号１に示す塩基配列から選択される２０〜２２０塩基長のオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドであって、少なくともmiR-7をコードするDNAを含むオリゴ（又はポリ）ヌクレオチド又はその相補配列からなるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドを含むことを特徴とする、miR-7発現プラスミド。
２．miR-7をコードするDNAが、以下に示すいずれかの塩基配列からなる前項１に記載のmiR-7発現プラスミド：
１）TGGAAGACTAGTGATTTTGTTGT（配列番号２）；
２）上記配列番号２に示す塩基配列のうち、１〜３個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加若しくは挿入されてなる塩基配列；
３）上記１）又は２）に示す塩基配列の相補配列。
３．miR-7をコードするDNAを含むオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドが、以下に示すいずれかの塩基配列からなる前項１又は２に記載のmiR-7発現プラスミド：
１）CTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCA（配列番号３）；
２）上記配列番号３に示す塩基配列のうち、１〜１０個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加若しくは挿入されてなる塩基配列；
３）上記１）又は２）に示す塩基配列の相補配列。
４．miR-7をコードするDNAを含むオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドが、以下に示すいずれかの塩基配列からなる前項１〜３のいずれか１に記載のmiR-7発現プラスミド：
１）CCTGGTGGCGAGGGGAGGGGGGTGGTCCTCGAACGCCTTGCAGAACTGGCCTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCAGCGGGGTGCAGGAAATGGGGGCAGCCCCCCTTTTTGGCTATCCTTCCACG（配列番号４）；
２）上記配列番号４に示す塩基配列のうち、１〜１０個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加若しくは挿入されてなる塩基配列；
３）上記１）又は２）に示す塩基配列の相補配列。
５．配列表の配列番号１に示す塩基配列から選択されるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドであって、以下の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、以下の配列番号６に示すオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして増幅させて得られるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドを含む、前項１〜４のいずれか１に記載のmiR-7発現プラスミド。
フォワードプライマー：5'-ATTGGATCCCTGACCTGGTGGCGAGGGGA-3'（配列番号５）
リバースプライマー：5'-TTAAAGCTTAACACGTGGAAGGATAGCCA-3'（配列番号６）
That is, this invention consists of the following.
1. An oligo (or poly) nucleotide having a length of 20 to 220 bases selected from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and comprising at least a DNA encoding miR-7, or a complementary sequence thereof An miR-7 expression plasmid comprising an oligo (or poly) nucleotide consisting of
2. The miR-7 expression plasmid according to item 1 above, wherein the DNA encoding miR-7 comprises any of the following nucleotide sequences:
1) TGGAAGACTAGTGATTTTGTTGT (SEQ ID NO: 2);
2) A base sequence in which 1 to 3 nucleotides of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted, deleted, added or inserted;
3) A complementary sequence of the base sequence shown in 1) or 2) above.
3. The miR-7 expression plasmid according to item 1 or 2, wherein the oligo (or poly) nucleotide containing DNA encoding miR-7 comprises any one of the following base sequences:
1) CTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCA (SEQ ID NO: 3);
2) A nucleotide sequence in which 1 to 10 nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 are substituted, deleted, added or inserted;
3) A complementary sequence of the base sequence shown in 1) or 2) above.
4). The miR-7 expression plasmid according to any one of the preceding items 1 to 3, wherein the oligo (or poly) nucleotide containing the DNA encoding miR-7 comprises any of the following base sequences:
1) CCTGGTGGCGAGGGGAGGGGGGTGGTCCTCGAACGCCTTGCAGAACTGGCCTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCAGCGGGGTGCAGGAAATGGCGGCTGCCCCTCTTTTGGTG
2) A nucleotide sequence in which 1 to 10 nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 are substituted, deleted, added or inserted;
3) A complementary sequence of the base sequence shown in 1) or 2) above.
5. Oligo (or poly) nucleotide selected from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, wherein the oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 below is used as a forward primer, and the oligo shown in SEQ ID NO: 6 below The miR-7 expression plasmid according to any one of 1 to 4 above, which comprises an oligo (or poly) nucleotide obtained by amplifying a nucleotide as a reverse primer.
Forward primer: 5'-ATTGGATCCCTGACCTGGTGGCGAGGGGA-3 '(SEQ ID NO: 5)
Reverse primer: 5'-TTAAAGCTTAACACGTGGAAGGATAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 6)
本発明のmiR-7発現プラスミドは、in vitro及びin vivoにおいて、抗腫瘍効果を持つことが明らかとなった。本発明のmiR-7発現プラスミドは、臨床上問題とされている肺腺癌EGFR分子標的薬耐性モデルにおいて、強力な抗腫瘍効果をin vivoで証明することができた。この抗腫瘍効果は、EGFRをmRNAレベルで直接抑制することにより発揮されることはin vitroにおいても確認され、上市されているいずれの分子標的薬とも全く異なる機序で抗腫瘍効果を発揮しうるため、単体のみでの使用のみならず併用療法も期待することができる。さらには頭頚部癌や食道癌、大腸癌などに見られるEGFR高発現型の固形癌に対しても有用性が期待される。 It was revealed that the miR-7 expression plasmid of the present invention has an antitumor effect in vitro and in vivo. The miR-7 expression plasmid of the present invention was able to demonstrate a strong antitumor effect in vivo in a lung adenocarcinoma EGFR molecular target drug resistance model, which is regarded as a clinical problem. It has been confirmed in vitro that this anti-tumor effect can be exerted by directly suppressing EGFR at the mRNA level, and it can exert an anti-tumor effect by a mechanism completely different from any marketed molecular target drug. Therefore, not only single use but also combination therapy can be expected. Furthermore, it is expected to be useful for EGFR-expressing solid cancer found in head and neck cancer, esophageal cancer, colon cancer and the like.
本発明は、miR-7を効果的に細胞内に導入しうるプラスミドに関する。より詳しくは、生体に導入効率がよく、毒性の低いmiR-7発現プラスミドに関する。 The present invention relates to a plasmid capable of effectively introducing miR-7 into cells. More specifically, the present invention relates to a miR-7 expression plasmid that has good introduction efficiency into a living body and low toxicity.
miR-7は、以下の配列番号７に示す塩基配列からなり、その前駆体であるpre miR-7の１種であると確認されているmiR-7-2は、以下の配列番号８に示す塩基配列からなる（図１参照）。miR-7は、配列番号９−１１のいずれかで特定されるEGFRの3'-UTR領域の少なくとも３箇所を認識することが公知である。ここで、配列番号９−１１のいずれかで特定されるEGFRの3'-UTR領域は、miR-7を構成する塩基配列と必ずしも完全一致している必要はなく、互いにハイブリダイズ可能な配列であればよい（図２参照）。
miR-7：uggaagacuagugauuuuguugu（配列番号７）
miR-7-2：guggaccggcuggccccaucuggaagacuagugauuuuguuguugucuuacugcgcucaacaacaaaucccagucuaccuaauggugccagccaucgca（配列番号８）
EGFR 3'-UTR領域 (442-464)：GACTGACTTGTTTGTCTTCCA（配列番号９）
EGFR 3'-UTR領域 (726-747)：ACTTGAATTGTTTGTCTTCCA（配列番号１０）
EGFR 3'-UTR領域 (357-377)：TTACTTGAATGGGCTCTTCCA（配列番号１１）
miR-7 has the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 below, and miR-7-2, which has been confirmed to be one of the precursors, pre miR-7, is shown in SEQ ID NO: 8 below. It consists of a base sequence (see FIG. 1). miR-7 is known to recognize at least three of the 3′-UTR regions of EGFR identified by any of SEQ ID NOs: 9-11. Here, the 3′-UTR region of EGFR specified by any of SEQ ID NOs: 9-11 does not necessarily need to be completely identical to the base sequence constituting miR-7, and is a sequence that can hybridize to each other. What is necessary (see FIG. 2).
miR-7: uggaagacuagugauuuuguugu (SEQ ID NO: 7)
miR-7-2: guggaccggcuggccccaucuggaagacuagugauuuuguuguugucuuacugcgcucaacaacaaaucccagucuaccuaauggugccagccaucgca (SEQ ID NO: 8)
EGFR 3'-UTR region (442-464): GACTGACTTGTTTGTCTTCCA (SEQ ID NO: 9)
EGFR 3'-UTR region (726-747): ACTTGAATTGTTTGTCTTCCA (SEQ ID NO: 10)
EGFR 3'-UTR region (357-377): TTACTTGAATGGGCTCTTCCA (SEQ ID NO: 11)
本発明のmiR-7発現プラスミドを調製するための適切なプラスミドベクターは、自体公知の、又は今後開発されるあらゆるプラスミドベクターのうちmicro RNAを発現可能なものであればよく、特に限定されない。このようなプラスミドベクターとして、例えば大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばpBR322、pBR325、pUC18又はpUC118等）、枯草菌由来のプラスミドベクター（例えばpUB110、pTP5又はpC194）、酵母由来のプラスミドベクター（例えばpsH19又はpSH15）等が挙げられる。 A suitable plasmid vector for preparing the miR-7 expression plasmid of the present invention is not particularly limited as long as it is known per se or can express microRNA among all plasmid vectors to be developed in the future. Examples of such plasmid vectors include plasmid vectors derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC18 or pUC118), plasmid vectors derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5 or pC194), and plasmid vectors derived from yeast (eg, psH19 or pSH15). ) And the like.
本発明のmiR-7発現プラスミドには、配列表の配列番号１に示す塩基配列から選択される２０〜２２０塩基長、好ましくは１１０〜２２０塩基長、最も好ましくは、２１０〜２１８塩基長のDNAであって、少なくともmiR-7をコードするDNAを含むオリゴ（又はポリ）ヌクレオチド又はその相補配列からなるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドが含まれる。ここで、配列表の配列番号１に示す塩基配列は図３に示すとおりである。 The miR-7 expression plasmid of the present invention includes DNA having a length of 20 to 220 bases, preferably 110 to 220 bases, most preferably 210 to 218 bases selected from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. An oligo (or poly) nucleotide comprising a DNA encoding at least miR-7 or an oligo (or poly) nucleotide consisting of a complementary sequence thereof is included. Here, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is as shown in FIG.
本発明のmiR-7発現プラスミドに含まれるmiR-7をコードするDNAを含むオリゴ（若しくはポリ）ヌクレオチド又はその相補配列からなるオリゴ（若しくはポリ）ヌクレオチドは、少なくとも以下に示すいずれかの塩基配列からなるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドを含んでいれば良い。ここで、配列表の配列番号２に示す塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列から選択される部分である（図３参照）。
１）TGGAAGACTAGTGATTTTGTTGT（配列番号２）；
２）上記配列番号２に示す塩基配列のうち、１〜３個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加若しくは挿入されてなる塩基配列；
３）上記１）又は２）に示す塩基配列の相補配列。
The oligo (or poly) nucleotide comprising a DNA encoding miR-7 contained in the miR-7 expression plasmid of the present invention or an oligo (or poly) nucleotide comprising a complementary sequence thereof is at least from any of the following base sequences: The oligo (or poly) nucleotide should just be included. Here, the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is a portion selected from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (see FIG. 3).
1) TGGAAGACTAGTGATTTTGTTGT (SEQ ID NO: 2);
2) A base sequence in which 1 to 3 nucleotides of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted, deleted, added or inserted;
3) A complementary sequence of the base sequence shown in 1) or 2) above.
上述のmiR-7をコードするDNAを含むオリゴ（又はポリ）ヌクレオチド又はその相補配列からなるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドを含むプラスミドには、さらに以下に示すいずれかの塩基配列からなるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドを含むのが好適である。以下に示す配列はmiR-7の前駆型であり、Pre-miR-7、即ちmiR-7-2をコードするDNAである。ここで、配列表の配列番号３に示す塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列から選択され、配列番号２に示す塩基配列を含む塩基配列からなる（図３参照）。
１）CTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCA（配列番号３）；
２）上記配列番号３に示す塩基配列のうち、１〜１０個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加若しくは挿入されてなる塩基配列；
３）上記１）又は２）に示す塩基配列の相補配列。
The plasmid containing an oligo (or poly) nucleotide comprising a DNA encoding miR-7 as described above or an oligo (or poly) nucleotide comprising a complementary sequence thereof further comprises an oligo (or poly) comprising any of the following base sequences: It is preferred to include nucleotides. The sequence shown below is a precursor of miR-7, and is Pre-miR-7, that is, DNA encoding miR-7-2. Here, the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is selected from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consists of a base sequence containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (see FIG. 3).
1) CTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCA (SEQ ID NO: 3);
2) A nucleotide sequence in which 1 to 10 nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 are substituted, deleted, added or inserted;
3) A complementary sequence of the base sequence shown in 1) or 2) above.
上述のmiR-7をコードするDNAを含むオリゴ（又はポリ）ヌクレオチド又はその相補配列からなるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドを含むプラスミドには、さらに以下に示すいずれかの塩基配列からなるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドを含むのが最も好適である。以下に示す配列は、miR-7-2の前駆型、即ちpri-miR-7(-2)をコードするDNAである。ここで、配列表の配列番号４に示す塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列から選択され、配列番号２、３に示す塩基配列を含む塩基配列からなる（図３、４参照）。
１）CCTGGTGGCGAGGGGAGGGGGGTGGTCCTCGAACGCCTTGCAGAACTGGCCTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCAGCGGGGTGCAGGAAATGGGGGCAGCCCCCCTTTTTGGCTATCCTTCCACG（配列番号４）；
２）上記配列番号４に示す塩基配列のうち、１〜１０個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加若しくは挿入されてなる塩基配列；
３）上記１）又は２）に示す塩基配列の相補配列。
The plasmid containing an oligo (or poly) nucleotide comprising a DNA encoding miR-7 as described above or an oligo (or poly) nucleotide comprising a complementary sequence thereof further comprises an oligo (or poly) comprising any of the following base sequences: Most preferably it contains nucleotides. The sequence shown below is a DNA encoding the precursor form of miR-7-2, that is, pri-miR-7 (-2). Here, the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is selected from the base sequences shown in SEQ ID NO: 1 and consists of base sequences including the base sequences shown in SEQ ID NOS: 2 and 3 (see FIGS. 3 and 4).
1) CCTGGTGGCGAGGGGAGGGGGGTGGTCCTCGAACGCCTTGCAGAACTGGCCTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCAGCGGGGTGCAGGAAATGGCGGCTGCCCCTCTTTTGGTG
2) A nucleotide sequence in which 1 to 10 nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 are substituted, deleted, added or inserted;
3) A complementary sequence of the base sequence shown in 1) or 2) above.
具体的には、例えば配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの5'末端側にCTGA、3'末端側にGTTを付加したポリヌクレオチド（配列番号１２）をプラスミドベクターに導入することができる（図４参照）。 Specifically, for example, a polynucleotide (SEQ ID NO: 12) in which CTGA is added to the 5 ′ end side and GTT is added to the 3 ′ end side of a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 can be introduced into a plasmid vector. (See FIG. 4).
CTGACCTGGTGGCGAGGGGAGGGGGGTGGTCCTCGAACGCCTTGCAGAACTGGCCTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCAGCGGGGTGCAGGAAATGGGGGCAGCCCCCCTTTTTGGCTATCCTTCCACGTGTT（配列番号１２） CTGA CCTGGTGGCGAGGGGAGGGGGGTGGTCCTCGAACGCCTTGCAGAACTGGCCTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCAGCGGGGTGCAGGAAATGGGGGCAGCCCCCCTTTTTGGCTATCCTTCCACG TGTT (SEQ ID NO: 12)
本発明のmiR-7発現プラスミドを作製するために、上述したいずれかのオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドを、自体公知の、若しくは今後開発される新たなプラスミドベクターに導入することが必要である。そのようなオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドは、例えばポリメラーゼ・チェーン・リアクション（PCR）のような遺伝子増幅方法により作製することができる。上記に示すいずれかのオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドを作製するために、プライマーを調製することが必要である。例えば、上記配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを調製するために、以下の配列番号５及び６に示す塩基配列からなるプライマーを作製することができる。プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの合成は、自体公知の方法によることができる。本発明は、以下のプライマーにも及ぶ。鋳型となるDNAは、miR-7をコードするDNAが含まれるものであればよく、例えばヒト第７染色体に位置するDNAが挙げられ、具体的には配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを鋳型とすることができる。 In order to prepare the miR-7 expression plasmid of the present invention, it is necessary to introduce any of the above-mentioned oligo (or poly) nucleotides into a new plasmid vector known per se or developed in the future. Such oligo (or poly) nucleotides can be made by gene amplification methods such as polymerase chain reaction (PCR). In order to make any of the oligo (or poly) nucleotides shown above, it is necessary to prepare a primer. For example, in order to prepare a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, a primer consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 below can be prepared. Synthesis of the oligonucleotide used as a primer can be performed by a method known per se. The present invention also extends to the following primers. The template DNA may be any DNA containing miR-7-encoding DNA, such as DNA located on human chromosome 7, and specifically a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. Can be used as a mold.
フォワードプライマー：5'-ATTGGATCCCTGACCTGGTGGCGAGGGGA-3'（配列番号５）
リバースプライマー：5'-TTAAAGCTTAACACGTGGAAGGATAGCCA-3'（配列番号６）
Forward primer: 5'-ATTGGATCCCTGACCTGGTGGCGAGGGGA-3 '(SEQ ID NO: 5)
Reverse primer: 5'-TTAAAGCTTAACACGTGGAAGGATAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 6)
本発明のmiR-7発現プラスミドに含まれるプロモータや選択マーカーの導入は、自体公知の方法や、今後開発されるあらゆる方法によることができる。例えば、制限酵素処理、クレノー断片処理による末端の平滑化、ライゲーション反応などを用いて導入することができる。 Introduction of the promoter and selectable marker contained in the miR-7 expression plasmid of the present invention can be carried out by a method known per se or any method developed in the future. For example, it can be introduced using restriction enzyme treatment, terminal blunting by Klenow fragment treatment, ligation reaction, and the like.
上述したいずれかのオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドを含む本発明のmiR-7発現プラスミドには、miR-7を発現させるためにプロモータを備えることができる。このプロモータは、miR-7を発現し得るものであれば、その種類、数、位置などは任意に定めることができる。miR-7発現プラスミドの簡易な構成としては、上記に示すいずれかのオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドの上流に、プロモータをそれぞれ備えたタンデム型に配置することができる。ステムループ型でmiR-7を発現するプラスミドの場合は、上述のいずれかのオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドと、その相補配列からなるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドの間に、リンカーDNAにより接続したユニットを配置することができ、このユニットの片側にプロモータを連結することにより、ステム型miR-7発現プラスミドを構築することができる。なおリンカーDNAの長さや配列には特に限定はないが、miR-7の生成を阻害するようなターミネーション配列などでなく、成熟RNAまで生成された際にステム部分の対合に支障のないリンカーの長さ、配列であればよい。 The miR-7 expression plasmid of the present invention containing any of the oligo (or poly) nucleotides described above can be provided with a promoter for expressing miR-7. As long as this promoter can express miR-7, its type, number, position and the like can be arbitrarily determined. As a simple structure of the miR-7 expression plasmid, it can be arranged in a tandem type, each having a promoter, upstream of any of the oligo (or poly) nucleotides shown above. In the case of a plasmid expressing miR-7 in a stem loop type, a unit connected by linker DNA between any of the above-mentioned oligo (or poly) nucleotides and an oligo (or poly) nucleotide consisting of the complementary sequence thereof. A stem-type miR-7 expression plasmid can be constructed by ligating a promoter to one side of this unit. There is no particular limitation on the length or sequence of the linker DNA, but it is not a termination sequence that inhibits miR-7 production, but a linker that does not interfere with stem pairing when mature RNA is produced. Any length and arrangement may be used.
また、タンデム型、ステム型発現プラスミドのいずれの場合にも、上述のいずれかのオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドの5'末端にプロモータからの転写を促進し得る配列を備えてもよい。具体的にはタンデム型の場合には、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとの5'末端それぞれに、また、ステム型の場合には上記ユニットの5'末端に、プロモータからの転写を促進し得る配列を備えることにより、miR-7の生成を効率化してもよい。例えば、ATTやTTAなどの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを付加することができる。 In either case of a tandem type or stem type expression plasmid, a sequence capable of promoting transcription from a promoter may be provided at the 5 ′ end of any of the above-mentioned oligo (or poly) nucleotides. Specifically, in the case of the tandem type, transcription from the promoter is promoted at the 5 ′ end of each of the antisense coding DNA and the sense coding DNA, and in the case of the stem type, at the 5 ′ end of the above unit. By providing the resulting sequence, the production of miR-7 may be made more efficient. For example, an oligonucleotide having a base sequence such as ATT or TTA can be added.
上述したタンデム型、ステム型のいずれの場合でも、プロモータはmicro RNAを発現し得るものであれば、pol II系、pol III系のいずれであってもよい。miR-7のような短いRNAの発現には、好ましくはpol III系を用いることができる。このpol III系のプロモータとしては、例えば、U6プロモータ、tRNAプロモータ、レトロウイルス性LTRプロモータ、アデノウイルスVA1プロモータ、5S rRNAプロモータ、7SK RNAプロモータ、7SL RNAプロモータ、H1 RNAプロモータなどを挙げることができる。なお、上記U6プロモータはRNAの3'末端に例えば４塩基のウリジン塩基を付加することができる。また、pol III系のプロモータを用いた場合には、短いRNAのみを発現させ適切に転写を終結させるために、さらにセンスコードDNA、アンチセンスコードDNAの3'末端にターミネーターを備えることができる。ターミネーターは、プロモータの転写を終結し得る配列であれば、特に限定はなく、例えば、A(アデニン)塩基が４つ以上連続した配列、パリンドローム構造を形成し得る配列などを用いることができる。 In either case of the tandem type or the stem type described above, the promoter may be either pol II or pol III as long as it can express microRNA. For the expression of short RNAs such as miR-7, the pol III system can preferably be used. Examples of the pol III promoter include U6 promoter, tRNA promoter, retroviral LTR promoter, adenovirus VA1 promoter, 5S rRNA promoter, 7SK RNA promoter, 7SL RNA promoter, H1 RNA promoter, and the like. The U6 promoter can add, for example, 4 uridine bases to the 3 ′ end of RNA. When a pol III promoter is used, a terminator can be further provided at the 3 ′ end of the sense code DNA and the antisense code DNA in order to express only short RNA and appropriately terminate transcription. The terminator is not particularly limited as long as it can terminate the transcription of the promoter. For example, a sequence in which four or more A (adenine) bases are continuous, and a sequence capable of forming a palindromic structure can be used.
一方、pol II系プロモータとしては、サイトメガロウイルス(CMV)プロモータ、T7プロモータ、T3プロモータ、SP6プロモータ、RSVプロモータ、EF-1αプロモータ、β-アクチンプロモータ、γ-グロブリンプロモータ、SRαプロモータなどを挙げることができる。ただし、pol II系を用いた場合には、pol III系のような短いRNAではなく、ある程度の長さのRNAとして合成される。そのため、pol II系のプロモータを用いた場合には、このある程度の長さとして合成されるRNAより、例えばリボザイムなどのRNAをセルフプロセッシングにより切断し得る手段を用いて、アンチセンスRNA又はセンスRNAを生成させることもできる。Pol II系プロモータの直後にステムループ配列を挿入し、その後ろにpolyA付加シグナルをいれて、ステムループRNAを生成させることもできる。 On the other hand, examples of pol II promoters include cytomegalovirus (CMV) promoter, T7 promoter, T3 promoter, SP6 promoter, RSV promoter, EF-1α promoter, β-actin promoter, γ-globulin promoter, SRα promoter, etc. Can do. However, when the pol II system is used, it is synthesized as RNA having a certain length rather than a short RNA like the pol III system. Therefore, when a pol II promoter is used, antisense RNA or sense RNA can be isolated from RNA synthesized as a certain length using, for example, RNA such as ribozyme by self-processing. It can also be generated. A stem loop RNA can also be generated by inserting a stem loop sequence immediately after the Pol II promoter, followed by a polyA addition signal.
本発明のmiR-7発現プラスミドには、必要に応じて、プラスミドが導入された細胞を選択し得る選択マーカーなどをさらに保持させることができる。選択マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子のような薬剤耐性マーカー、ガラクトシダーゼなどの酵素活性を指標に選択し得るマーカー、あるいはGFPなどの蛍光発光などを指標に選択し得るマーカーなどが挙げられる。また、EGFレセプター、B7-2、又はCD4などの表面抗原を指標に選択し得る選択マーカーなどを用いてもよい。このように選択マーカーを用いることにより、該プラスミドが導入された細胞、すなわち、miR-7発現プラスミドが導入された細胞のみを選択することができる。 The miR-7 expression plasmid of the present invention can further retain a selection marker or the like that can select cells into which the plasmid has been introduced, if necessary. Selectable markers include neomycin resistance genes, hygromycin resistance genes, drug resistance markers such as puromycin resistance genes, markers that can be selected using enzyme activity such as galactosidase, or fluorescence emission such as GFP. And markers to obtain. In addition, a selection marker that can select a surface antigen such as EGF receptor, B7-2, or CD4 as an indicator may be used. By using the selection marker in this manner, only cells into which the plasmid has been introduced, that is, cells into which the miR-7 expression plasmid has been introduced can be selected.
本発明のmiR-7発現プラスミドを、そのまま細胞内の染色体に導入し、細胞内でアンチセンスRNA、センスRNAを発現させmiR-7を発現させることもできるが、効率的な細胞導入などを行うために、上記miR-7発現プラスミドをベクターに保持させることが好ましい。ここで使用されるベクターは、導入したい細胞などに対応して選択することができる。例えば哺乳動物細胞では、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドDNA複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられるが（Y. Niitsuら, Molecular Medicine 35: 1385-1395 (1998)）、これらに限定されるものではない。 The miR-7 expression plasmid of the present invention can be directly introduced into a chromosome in a cell, and antisense RNA or sense RNA can be expressed in the cell to express miR-7. Therefore, it is preferable to hold the miR-7 expression plasmid in a vector. The vector used here can be selected according to the cell to be introduced. For example, in mammalian cells, virus vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, vaccinia virus vectors, lentivirus vectors, herpes virus vectors, alphavirus vectors, EB virus vectors, papilloma virus vectors, foamy virus vectors, etc. And non-viral vectors such as cationic liposomes, ligand DNA complexes, and gene guns (Y. Niitsu et al., Molecular Medicine 35: 1385-1395 (1998)), but are not limited thereto.
本発明のmiR-7発現プラスミドは、当該プラスミドと親和性を有する任意の蛋白質、糖、ステロイド、又は脂質に含ませることができる。例えば、天然化合物（ヒストン、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、及び可動性の高い基を有する蛋白質など）、合成カチオン性化合物（DEAE-デキストラン、ポリブレン、ポリリジン、ポリヒスチジン、ポリペプチド、ポリアミドアミンカスケードポリマーもしくはデンドリマー、リポポリアミン、及びポリエチレンイミンなど）、及びカチオン性脂質又はカチオン性リポソーム製剤（トランスフェクタム(R)(Promega)、ドータップ(R)(Roche)、ヒュージーン６(R)(Roche)、エックストリームジーンＱ２(R)(Roche)、ジーンジェイマー(R)(Stratagene)、ジーンポーター(R)(Gene Therapy Systems)、イフェクテン(R)(Quiagen)、スーパーフェクト(R)(Quiagen)、リポフェクチン（LIPOFECTIN）(R)(Invitrogen)、リポフェクトエース(R)(Invitrogen)、リポフェクタミン(R)(Invitrogen)、リポフェクタミン2000(R)(Invitrogen)、LipoTrustTM(北海道システムサイエンス)）などを挙げることができる。特に好適には、カチオン性リポソーム製剤とともに使用することができる。 The miR-7 expression plasmid of the present invention can be contained in any protein, sugar, steroid, or lipid having affinity with the plasmid. For example, natural compounds (such as histone, protamine, spermine, spermidine, and proteins having highly mobile groups), synthetic cationic compounds (DEAE-dextran, polybrene, polylysine, polyhistidine, polypeptides, polyamidoamine cascade polymers or dendrimers) , lipopolyamines, and polyethylene imine), and cationic lipids or cationic liposome formulation (Transfectam (R) (Promega), Dotappu (R) (Roche), Hugh Gene 6 (R) (Roche), Eck stream Gene Q2 (R) (Roche), Gene J. mer (R) (Stratagene), Gene Porter (R) (Gene Therapy Systems) , Ifekuten (R) (Quiagen), Superfect (R) (Quiagen), lipofectin (lIPOFECTIN ) (R) (Invitrogen), Lipofectamine Ace (R) (Invitrogen), Lipofectamine (R) (Invitrogen) Lipofectamine 2000 (R) (Invitrogen), LipoTrust TM ( Hokkaido System Science)), and the like. Particularly preferably, it can be used together with a cationic liposome preparation.
miR-7発現プラスミドを含むベクターを導入する宿主細胞は、プロモータの種類にもよるが、哺乳類細胞が好ましく、より好ましくは、マウスもしくはラット等の齧歯類又は他の動物（例えば、ヤギもしくはウシのような他の哺乳動物又は鳥類）、霊長類及び非霊長類等に由来する細胞が挙げられる。ヒト細胞としては、形質転換細胞が安定に培養できるものであれば特に限定されず、例えば、リンパ球、造血細胞、肝細胞、心臓細胞、血管内皮細胞、脾臓細胞や各種腫瘍細胞が挙げられる。各種腫瘍細胞としては、肺癌、肝臓癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、大腸癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病等由来の細胞が挙げられる。特に肺癌由来の細胞が好ましい。肺癌としては、いずれの組織型の肺癌であってもよいが、例えば、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、大細胞神経内分泌癌及び腺扁平上皮癌などの非小細胞癌並びに小細胞癌が挙げられる。好ましい細胞の具体的な例としては、ヒト腎臓由来HEK293細胞、ヒト子宮頸癌由来Hela細胞、ヒト結腸癌由来CACO-2細胞、ヒト白血病Ｔ細胞由来Jurkat細胞、ヒト肺癌由来PC-9やRPC-9細胞、H3255やH1975細胞等が挙げられ、特に好ましくはヒト肺癌由来PC-9やRPC-9細胞、H3255やH1975細胞が挙げられる。 The host cell into which the vector containing the miR-7 expression plasmid is introduced depends on the type of promoter, but is preferably a mammalian cell, more preferably a rodent such as a mouse or a rat or other animal (for example, a goat or a cow). Other mammals or birds), primates, non-primates and the like. The human cells are not particularly limited as long as the transformed cells can be stably cultured. Examples thereof include lymphocytes, hematopoietic cells, hepatocytes, heart cells, vascular endothelial cells, spleen cells and various tumor cells. Various tumor cells include lung cancer, liver cancer, glioblastoma, myeloma, gastric cancer, pancreatic cancer, brain tumor, colon cancer, renal cancer, bladder cancer, ovarian cancer, cervical cancer, prostate cancer, leukemia, etc. Is mentioned. In particular, cells derived from lung cancer are preferred. The lung cancer may be any tissue type of lung cancer, for example, non-small cell cancer such as adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell cancer, large cell neuroendocrine cancer and adenosquamous cell carcinoma, and small cell cancer Is mentioned. Specific examples of preferable cells include human kidney-derived HEK293 cells, human cervical cancer-derived Hela cells, human colon cancer-derived CACO-2 cells, human leukemia T-cell-derived Jurkat cells, human lung cancer-derived PC-9 and RPC- 9 cells, H3255 and H1975 cells, and the like, particularly preferably human lung cancer-derived PC-9 and RPC-9 cells, and H3255 and H1975 cells.
本発明は、本発明のmiR-7発現プラスミドを含む抗腫瘍剤にも及ぶ。本発明の抗腫瘍剤は、分子標的薬に対して耐性を持つ腫瘍、特に分子標的薬に対して耐性を持つ肺癌に対しても治療効果を発揮すると考えられる。 The present invention also extends to an antitumor agent comprising the miR-7 expression plasmid of the present invention. The antitumor agent of the present invention is considered to exert a therapeutic effect also on a tumor resistant to a molecular target drug, particularly a lung cancer resistant to the molecular target drug.
本発明の理解を助けるために、参考例において、本発明を完成するに至った経緯を説明し、さらに実施例、実験例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例、実験例に限定されるものでないことはいうまでもない。 In order to help the understanding of the present invention, in the reference examples, the background to the completion of the present invention will be described, and further the present invention will be specifically described by showing examples and experimental examples. Needless to say, the present invention is not limited to Examples and Experimental Examples.
（参考例）miR-7を発現するのに有効なDNA配列の検索
背景技術の欄でも示したように、EGFRのリン酸化部位を効率的に阻害する分子標的薬に対する臨床的、理論的に証明されている耐性について、耐性細胞おけるEGFR依存性が持続されていることが、イムノブロッティングの結果より予測された。したがって、EGFRの発現自体を効率的に抑制することができれば、ふたたび腫瘍縮小効果が得られると考えた。micro RNAは、標的となるmRNAをRNAレベルで抑制することにより、結果的に蛋白質の発現量を制御することは公知であり、miR-7とEGFRの関係についても公知である（非特許文献４−６）。本発明者らは、さらに検討を重ね、EGFRを効率的に抑制するmicro RNAをin silicoで予測し、ヒトEGFRの3'UTR領域においてmiR-7とマッチする箇所を確認した（図２参照）。さらに検討を重ね、miR-7を発現するのに有効なDNA配列を検索したところ、ヒトDNA配列内に存在する、配列表の配列番号１に示す配列を見出した。
(Reference example) Search for a DNA sequence effective to express miR-7 As shown in the background section, clinical and theoretical evidence for a molecular target drug that efficiently inhibits the phosphorylation site of EGFR It was predicted from the results of immunoblotting that the EGFR dependence in the resistant cells was maintained with respect to the resistance that was observed. Therefore, it was thought that if the EGFR expression itself can be efficiently suppressed, a tumor reduction effect can be obtained again. It is known that microRNA suppresses target mRNA at the RNA level and consequently controls the expression level of the protein, and the relationship between miR-7 and EGFR is also known (Non-Patent Document 4). -6). The present inventors have conducted further studies, predicted in silico microRNA that efficiently suppresses EGFR, and confirmed a location that matches miR-7 in the 3′UTR region of human EGFR (see FIG. 2). . Further investigation was made and a DNA sequence effective for expressing miR-7 was searched. As a result, the sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was found in the human DNA sequence.
（実施例１）miR-7発現プラスミドの作製
上記の参考例により見出したmiR-7の発現効率にかかわると考えられるイントロン配列より選択されるポリヌクレオチドを汎用型の発現ベクターに挿入し、miR-7発現プラスミドの作製について検討した。その結果、配列番号４に示す塩基配列の5'末端及び3'末端に、各々下線で示した４個のヌクレオチドを含む配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１２）をプラスミドベクターに導入することで、効果的にmiR-7が発現しうることを確認した。
(Example 1) Preparation of miR-7 expression plasmid A polynucleotide selected from intron sequences considered to be related to the expression efficiency of miR-7 found in the above reference example was inserted into a general-purpose expression vector, and miR- 7 Preparation of expression plasmid was examined. As a result, by introducing into the plasmid vector a polynucleotide (SEQ ID NO: 12) comprising a sequence containing 4 nucleotides each underlined at the 5 ′ end and 3 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. It was confirmed that miR-7 can be expressed effectively.
CTGACCTGGTGGCGAGGGGAGGGGGGTGGTCCTCGAACGCCTTGCAGAACTGGCCTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCAGCGGGGTGCAGGAAATGGGGGCAGCCCCCCTTTTTGGCTATCCTTCCACGTGTT（配列番号１２） CTGA CCTGGTGGCGAGGGGAGGGGGGTGGTCCTCGAACGCCTTGCAGAACTGGCCTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCAGCGGGGTGCAGGAAATGGGGGCAGCCCCCCTTTTTGGCTATCCTTCCACG TGTT (SEQ ID NO: 12)
本実施例において、汎用型の発現ベクターは、市販のpSilencerTM4.1- CMV neo(Ambion)を用いた。市販のプラスミドベクターに導入するポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを鋳型とし、以下の配列番号５及び６を用いてPCRの手法により増幅を行ない、作製した。作製したポリヌクレオチドのプラスミドベクターへの導入方法そのものは、汎用的な方法に従った。作製したmiR-7発現プラスミドの概要を図５に示した。 In this example, a commercially available pSilencer ™ 4.1-CMV neo (Ambion) was used as a general-purpose expression vector. A polynucleotide to be introduced into a commercially available plasmid vector was prepared by using the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing as a template and amplifying by PCR using the following SEQ ID NOs: 5 and 6. The method of introducing the prepared polynucleotide into the plasmid vector itself followed a general method. An outline of the prepared miR-7 expression plasmid is shown in FIG.
フォワードプライマー：5'-ATTGGATCCCTGACCTGGTGGCGAGGGGA-3'（配列番号５）
リバースプライマー：5'-TTAAAGCTTAACACGTGGAAGGATAGCCA-3'（配列番号６）
Forward primer: 5'-ATTGGATCCCTGACCTGGTGGCGAGGGGA-3 '(SEQ ID NO: 5)
Reverse primer: 5'-TTAAAGCTTAACACGTGGAAGGATAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 6)
（実験例１）細胞へmiR-7発現プラスミドの導入効果
ヒト肺腺癌細胞株PC-9の分子標的薬耐性株であるヒト肺腺癌細胞株RPC-9（以下、「耐性株RPC-9」という。）を用いて、実施例１で作製したプラスミドの効果をin vitroで確認した。in vitroでの、実験フローを図６に示した。
(Experimental Example 1) Effect of introducing miR-7 expression plasmid into cells Human lung adenocarcinoma cell line RPC-9 (hereinafter referred to as “resistant strain RPC-9”) which is a molecular target drug resistant strain of human lung adenocarcinoma cell line PC-9 The effect of the plasmid prepared in Example 1 was confirmed in vitro. The experimental flow in vitro is shown in FIG.
実施例１で作製したmiR-7発現プラスミドについて、耐性株RPC-9への導入効果を定量的PCRにより確認した。各細胞を70%コンフルエントにした後にトリプシンで処理し、約10×105個/mLの細胞に対し、48時間後に核酸導入試薬LipotrustTM EX（北海道システムサイエンス）のプロトコルに従い、リポソームに導入されたプラスミドを細胞溶液10mLあたり24μgトランスフェクションし、当該プラスミドを細胞へ導入した。37℃下で細胞の培養を継続し、24時間後に細胞を回収した。回収した細胞を、miR-7発現解析に用いた。定量的PCRにはTaqMan法（Applied Biosystems）を用いた。定量的PCRの内部標準としてU44を用いて、導入されたmiR-7発現量を解析した。比較対照用のコントロールプラスミドとして、市販のpSilencerTM4.1- CMV neo(Ambion)（発現しても蛋白に変化をきたさないことが分かっているsiRNAが導入されたもの（http://www.ambion.com/techlib/misc/vectors/4.1_cmv_neo.html））を用いた。 About the miR-7 expression plasmid produced in Example 1, the introduction effect into the resistant strain RPC-9 was confirmed by quantitative PCR. Each cell was made 70% confluent and then treated with trypsin, and about 10 × 10 5 cells / mL were introduced into liposomes 48 hours later according to the protocol of the nucleic acid transfer reagent Lipotrust ™ EX (Hokkaido System Science). The plasmid was transfected at 24 μg per 10 mL of cell solution, and the plasmid was introduced into the cells. The cell culture was continued at 37 ° C., and the cells were collected after 24 hours. The collected cells were used for miR-7 expression analysis. TaqMan method (Applied Biosystems) was used for quantitative PCR. Using U44 as an internal standard for quantitative PCR, the introduced miR-7 expression level was analyzed. As a control plasmid for comparison, commercially available pSilencer ™ 4.1-CMV neo (Ambion) (introduced with siRNA that is known not to change the protein even when expressed (http: //www.ambion. com / techlib / misc / vectors / 4.1_cmv_neo.html)).
その結果、比較対照用のコントロールプラスミドを導入した場合と比較して、本実施例のmiR-7発現プラスミドの場合は、miR-7が約30〜35倍程度強発現することが証明された（表１、図７）。 As a result, it was proved that miR-7 expression was about 30 to 35 times stronger in the case of the miR-7 expression plasmid of this example than when the control plasmid for comparison control was introduced ( Table 1, FIG. 7).
（実験例２）miR-7発現プラスミドの各細胞への細胞死誘導効果
実施例１で作製したmiR-7発現プラスミドについて、ヒト肺腺癌細胞株PC-9及び耐性株RPC-9に及ぼす細胞死誘導効果を顕微鏡検鏡及び細胞数のカウントにより確認した。各細胞を70%コンフルエントにした後にトリプシンで処理し、約10×105個/mLの細胞に対し、48時間後にLipotrustTM EX（北海道システムサイエンス）のプロトコルに従いリポソームに導入されたプラスミドを、細胞溶液10mLあたり24μgトランスフェクションした。37℃下で培養を継続し、72時間にトリプシンで細胞を回収し、トリパンブルー染色で細胞数をカウントした。
(Experimental example 2) Cell death-inducing effect of miR-7 expression plasmid on each cell About the miR-7 expression plasmid prepared in Example 1, cells affecting human lung adenocarcinoma cell line PC-9 and resistant strain RPC-9 The death induction effect was confirmed by microscopic examination and counting of the number of cells. Each cell was treated with trypsin after 70% confluent, to about 10 × 10 5 cells / mL cells, the plasmid was introduced into the liposome according to the protocol after 48 hours Lipotrust TM EX (Hokkaido System Science), cells 24 μg was transfected per 10 mL of solution. The culture was continued at 37 ° C., cells were collected with trypsin at 72 hours, and the number of cells was counted by trypan blue staining.
その結果、miR-7発現用ベクターを導入した場合に、コントロールに比べて細胞死誘導効果が明らかに優れていることが確認された（図８−１０）。 As a result, it was confirmed that when the miR-7 expression vector was introduced, the cell death induction effect was clearly superior to the control (FIGS. 8-10).
（実験例３）細胞におけるmiR-7発現プラスミドの抗EGFR-3'UTR作用の確認
ヒト肺腺癌細胞株（耐性株）RPC-9におけるmiR-7発現プラスミドの抗EGFR-3'UTR作用を、ルシフェラーゼアッセイにより確認した。miR-7の標的であるEGFR-3'UTRが阻害されることによって蛍光が阻害されるルシフェラーゼ発現ベクターを構築し、実施例１で作製したプラスミドをルシフェラーゼ発現ベクターに作用させ、ルシフェラーゼの発光度によりEGFR-3'UTRの作用へ及ぼす影響を調べた（図１１参照）。ルシフェラーゼの発光は、デュアル-ルシフェラーゼ定量システム（ホモジニアス長時間発光タイプDual-GloTM Luciferase Assay System）により確認した（図１２）。その結果、miR-7発現ベクターをRPC-9細胞株にトランスフェクトすると、ルシフェラーゼ活性は阻害され、miR-7が確かにEGFR-3'UTRを阻害することが証明された（図１３）。
(Experimental example 3) Confirmation of anti-EGFR-3'UTR action of miR-7 expression plasmid in cells Anti-EGFR-3'UTR action of miR-7 expression plasmid in human lung adenocarcinoma cell line (resistant strain) RPC-9 Confirmed by luciferase assay. By constructing a luciferase expression vector in which fluorescence is inhibited by inhibiting EGFR-3'UTR, which is the target of miR-7, the plasmid prepared in Example 1 is allowed to act on the luciferase expression vector, The influence on the action of EGFR-3′UTR was examined (see FIG. 11). The luminescence of luciferase was confirmed by a dual-luciferase quantification system (homogeneous long-time luminescence type Dual-Glo ™ Luciferase Assay System) (FIG. 12). As a result, when miR-7 expression vector was transfected into RPC-9 cell line, luciferase activity was inhibited, and it was proved that miR-7 surely inhibits EGFR-3′UTR (FIG. 13).
（実験例４）miR-7発現プラスミドによる蛋白質の発現抑制効果
イムノブロッティングにより、miR-7発現プラスミドによるヒト肺腺癌細胞株PC-9及び耐性株RPC-9における蛋白質の発現抑制効果を確認した。イムノブロッティングは、ECL法（GE Healthcare社）により行なった。具体的には、Ichihara, E., K. Ohashi, et al. (2009). "Effects of vandetanib on lung adenocarcinoma cells harboring epidermal growth factor receptor T790M mutation in vivo." Cancer Res 69(12): 5091-5098.のimmunoblottingの項に示す方法により行なった。その結果、miR-7発現プラスミドが導入された細胞では、EGFRの抑制と、その下流の最も重要な蛋白であるAKTのリン酸化が抑制されることを確認した（図１４）。
(Experimental example 4) Protein expression suppression effect by miR-7 expression plasmid The protein expression suppression effect in human lung adenocarcinoma cell line PC-9 and resistant strain RPC-9 by miR-7 expression plasmid was confirmed by immunoblotting. . Immunoblotting was performed by the ECL method (GE Healthcare). Specifically, Ichihara, E., K. Ohashi, et al. (2009). "Effects of vandetanib on lung adenocarcinoma cells harboring epidermal growth factor receptor T790M mutation in vivo." Cancer Res 69 (12): 5091-5098 The method described in the section of immunoblotting was performed. As a result, it was confirmed that suppression of EGFR and phosphorylation of AKT, which is the most important protein downstream thereof, were suppressed in cells into which the miR-7 expression plasmid was introduced (FIG. 14).
以上により、実施例１で作製したmiR-7発現プラスミドは、in vitroにおいてEGFR発現抑制効果を持つことが明らかとなった。 From the above, it was revealed that the miR-7 expression plasmid prepared in Example 1 has an EGFR expression inhibitory effect in vitro.
（実験例５）in vivoでのmiR-7発現プラスミドによる抗腫瘍効果の確認
免疫不全マウスを用いて、実施例１で作製したmiR-7発現プラスミドによる抗腫瘍効果をin vivoで確認した。７週齢の雌免疫不全マウスに、耐性株RPC-9を皮下注射し、約１週間で皮下に測定可能な腫瘍を形成させる異種移植(xenograft)モデルを樹立した（図１５）。これに対し、実施例１で作製したmiR-7発現プラスミド各々3μg相当をカチオニックリポソームを用いて直接注入し、その抗腫瘍活性を測定した。その結果、実験系においては週１回の投与を２回投与するのみで60%のマウスに腫瘍の完全消失を得た（図１６、１７）。
(Experimental example 5) Confirmation of antitumor effect by miR-7 expression plasmid in vivo The antitumor effect by the miR-7 expression plasmid prepared in Example 1 was confirmed in vivo using immunodeficient mice. A 7-week-old female immunodeficient mouse was subcutaneously injected with the resistant strain RPC-9, and a xenograft model was established in which a measurable tumor was formed subcutaneously in about 1 week (FIG. 15). On the other hand, 3 μg of each miR-7 expression plasmid prepared in Example 1 was directly injected using a cationic liposome, and its antitumor activity was measured. As a result, in the experimental system, complete disappearance of the tumor was obtained in 60% of the mice only by administering once a week twice (FIGS. 16 and 17).
以上により、臨床上問題とされている肺腺癌EGFR分子標的薬耐性モデルにおいて、本発明のmiR-7発現プラスミドは、強力な抗腫瘍効果を有することをin vivoで証明することができた。 As described above, it was proved in vivo that the miR-7 expression plasmid of the present invention has a strong antitumor effect in a pulmonary adenocarcinoma EGFR molecule targeted drug resistance model, which is regarded as a clinical problem.
（実験例６）miR-7発現プラスミドの各細胞への細胞増殖抑制効果
実施例１で作製したmiR-7発現プラスミドについて、ヒト肺腺癌細胞株H3255及び分子標的薬耐性株であるヒト肺腺癌細胞株H1975（以下、「耐性株H1975」という。）に及ぼす細胞増殖抑制効果を顕微鏡検鏡及び細胞数のカウントにより確認した。ヒト肺腺癌細胞株H3255はEGFR exon 21の変異（L858R point mutation）を持つ細胞株であり、分子標的薬ゲフィチニブ高感受性株であることが分かっている。また耐性株H1975は、EGFR exon 21の変異（L858R point mutation）を持つが、T790M変異が加わることにより、分子標的薬への耐性を獲得したものである。H3255細胞およびH1975細胞を用いた以外は、実験例２と同様の手法により実験を行った。
(Experimental Example 6) Cell growth inhibitory effect of miR-7 expression plasmid on each cell About miR-7 expression plasmid prepared in Example 1, human lung adenocarcinoma cell line H3255 and human lung gland which is a molecular target drug resistant strain The cell growth inhibitory effect on the cancer cell line H1975 (hereinafter referred to as “resistant strain H1975”) was confirmed by microscopic examination and cell count. Human lung adenocarcinoma cell line H3255 is a cell line having a mutation of EGFR exon 21 (L858R point mutation), and is known to be a highly sensitive molecular target drug gefitinib. The resistant strain H1975 has an EGFR exon 21 mutation (L858R point mutation), and has acquired resistance to a molecular target drug by adding a T790M mutation. Experiments were performed in the same manner as in Experimental Example 2, except that H3255 cells and H1975 cells were used.
その結果、miR-7発現用ベクターを導入した場合に、コントロールに比べて細胞増殖抑制効果が明らかに優れていることが確認された（図１８，１９）。 As a result, it was confirmed that when the miR-7 expression vector was introduced, the cell growth inhibitory effect was clearly superior to the control (FIGS. 18 and 19).
（実験例７）miR-7発現プラスミドによる蛋白質の発現抑制効果
イムノブロッティングにより、実施例１で作製したmiR-7発現プラスミドによるヒト肺腺癌細胞株H3255及び耐性株H1975における蛋白質の発現抑制効果を確認した。H3255細胞およびH1975細胞を用いた以外は、実験例４と同様の手法により実験を行った。
(Experimental Example 7) Protein Suppression Effect by miR-7 Expression Plasmid By immunoblotting, the miR-7 expression plasmid prepared in Example 1 was used to suppress protein expression in human lung adenocarcinoma cell line H3255 and resistant strain H1975. confirmed. Experiments were performed in the same manner as in Experimental Example 4 except that H3255 cells and H1975 cells were used.
その結果、miR-7発現プラスミドが導入された細胞では、EGFRの抑制と、その下流の最も重要な蛋白であるAKTのリン酸化が抑制されることを確認した（図２０）。実施例１で作製したmiR-7発現プラスミドは、in vitroにおいて、EGFR exon 21の変異を持つ細胞に対してEGFR発現抑制効果を持つことが明らかとなった。 As a result, it was confirmed that suppression of EGFR and phosphorylation of AKT, which is the most important protein downstream thereof, were suppressed in cells into which the miR-7 expression plasmid was introduced (FIG. 20). It was revealed that the miR-7 expression plasmid prepared in Example 1 has an EGFR expression inhibitory effect on cells having EGFR exon 21 mutation in vitro.
（実験例８）n vivoでのmiR-7発現プラスミドによる抗腫瘍効果の確認
免疫不全マウスを用いて、実施例１で作製したmiR-7発現プラスミドによる抗腫瘍効果をin vivoで確認した。異種移植(xenograft)モデルの樹立に、耐性株H1975を用いた以外は、実験例５と同様の手法により実験を行った。
(Experimental example 8) Confirmation of antitumor effect by miR-7 expression plasmid in vivo The antitumor effect by the miR-7 expression plasmid prepared in Example 1 was confirmed in vivo using immunodeficient mice. Experiments were performed in the same manner as in Experimental Example 5 except that the resistant strain H1975 was used to establish a xenograft model.
その結果、臨床上問題とされている肺腺癌EGFR分子標的薬耐性モデルにおいて、本発明のmiR-7発現プラスミドは、強力な抗腫瘍効果を有することをin vivoで証明することができた（図２１，２２）。 As a result, it was proved in vivo that the miR-7 expression plasmid of the present invention has a strong antitumor effect in a pulmonary adenocarcinoma EGFR molecular target drug resistance model that is regarded as a clinical problem ( 21 and 22).
EGFRを標的とした分子標的薬は、EGFR依存性の高い肺腺癌において劇的な効果をもたらすが、上記背景技術の欄で示した如く、分子標的薬に対して耐性を生じることが分かっている。以上詳述したように、本発明のmiR-7発現プラスミドにより、EGFRのmRNAレベルが抑制され、当該分子標的薬に対する耐性を克服することが可能である。また、従来型の分子標的薬のターゲットは、EGFRのチロシンキナーゼ、即ち蛋白質であるのに対し、本発明のmiR-7発現プラスミドは、EGFRにおけるmRNAレベルで抑制し、蛋白質の発現を抑制することをターゲットとする。このため、単に蛋白質の変異による耐性克服のみならず、従来療法との併用によって、さらに強い臨床効果を得ることも期待される。肺癌は日本だけでも年間罹患率は７万人を超え、年間死亡数も６万人を超えている。そのうちの半数が肺腺癌であり、かつその半数がEGFR変異を有するが、本発明において証明されている効果は、国内だけでも少なくとも年間約２万人に及ぶものと考えられる。また、EGFRは種々の固形癌に対する重要なシグナルとなるため、固形癌に広く応用できることが期待される。 Molecular targeting drugs targeting EGFR have a dramatic effect in lung adenocarcinoma with high EGFR dependence, but as shown in the background section above, it has been found that they are resistant to molecular targeting drugs Yes. As described above in detail, the miR-7 expression plasmid of the present invention suppresses the mRNA level of EGFR and can overcome resistance to the molecular target drug. The target of conventional molecular target drugs is EGFR tyrosine kinase, ie, protein, whereas miR-7 expression plasmid of the present invention suppresses the expression of protein by suppressing at the mRNA level in EGFR. Target. For this reason, it is expected not only to overcome resistance due to protein mutation, but also to obtain a stronger clinical effect by combination with conventional therapy. In Japan alone, lung cancer has an annual morbidity rate of over 70,000 and annual deaths of over 60,000. Half of them are lung adenocarcinoma and half of them have EGFR mutations, but the effect demonstrated in the present invention is considered to reach at least about 20,000 people per year in Japan alone. Moreover, since EGFR becomes an important signal for various solid cancers, it is expected to be widely applicable to solid cancers.
Claims (5)
１）TGGAAGACTAGTGATTTTGTTGT（配列番号２）；
２）上記配列番号２に示す塩基配列のうち、１〜３個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加若しくは挿入されてなる塩基配列；
３）上記１）又は２）に示す塩基配列の相補配列。 The miR-7 expression plasmid according to claim 1, wherein the DNA encoding miR-7 has any one of the following nucleotide sequences:
1) TGGAAGACTAGTGATTTTGTTGT (SEQ ID NO: 2);
2) A base sequence in which 1 to 3 nucleotides of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted, deleted, added or inserted;
3) A complementary sequence of the base sequence shown in 1) or 2) above.
１）CTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCA（配列番号３）；
２）上記配列番号３に示す塩基配列のうち、１〜１０個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加若しくは挿入されてなる塩基配列；
３）上記１）又は２）に示す塩基配列の相補配列。 The miR-7 expression plasmid according to claim 1 or 2, wherein the oligo (or poly) nucleotide containing DNA encoding miR-7 has any of the following nucleotide sequences:
1) CTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCA (SEQ ID NO: 3);
2) A nucleotide sequence in which 1 to 10 nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 are substituted, deleted, added or inserted;
3) A complementary sequence of the base sequence shown in 1) or 2) above.
１）CCTGGTGGCGAGGGGAGGGGGGTGGTCCTCGAACGCCTTGCAGAACTGGCCTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCAGCGGGGTGCAGGAAATGGGGGCAGCCCCCCTTTTTGGCTATCCTTCCACG（配列番号４）；
２）上記配列番号４に示す塩基配列のうち、１〜１０個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加若しくは挿入されてなる塩基配列；
３）上記１）又は２）に示す塩基配列の相補配列。 The miR-7 expression plasmid according to any one of claims 1 to 3, wherein the oligo (or poly) nucleotide comprising DNA encoding miR-7 comprises any of the following base sequences:
1) CCTGGTGGCGAGGGGAGGGGGGTGGTCCTCGAACGCCTTGCAGAACTGGCCTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCAGCGGGGTGCAGGAAATGGCGGCTGCCCCTCTTTTGGTG
2) A nucleotide sequence in which 1 to 10 nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 are substituted, deleted, added or inserted;
3) A complementary sequence of the base sequence shown in 1) or 2) above.
フォワードプライマー：5'-ATTGGATCCCTGACCTGGTGGCGAGGGGA-3'（配列番号５）
リバースプライマー：5'-TTAAAGCTTAACACGTGGAAGGATAGCCA-3'（配列番号６） Oligo (or poly) nucleotide selected from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, wherein the oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 below is used as a forward primer, and the oligo shown in SEQ ID NO: 6 below The miR-7 expression plasmid according to any one of claims 1 to 4, comprising an oligo (or poly) nucleotide obtained by amplifying a nucleotide as a reverse primer.
Forward primer: 5'-ATTGGATCCCTGACCTGGTGGCGAGGGGA-3 '(SEQ ID NO: 5)
Reverse primer: 5'-TTAAAGCTTAACACGTGGAAGGATAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 6)
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