JP2011163992A - Ｆｔｃｄとその自己抗体との複合体の免疫測定方法、それに用いるキット及びそれを用いた癌判定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、癌判定に応用することのできる、ホルミニノトランスフェラーゼ シクロデアミナーゼ（formininotransferase cyclodeaminase；ＦＴＣＤ）とその自己抗体との複合体の測定方法を提供することである。
【解決手段】検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体に、ＦＴＣＤに対する試薬抗体およびその自己抗体に対する結合可能物質を作用させ、得られる複合体と試薬抗体と結合可能物質との免疫複合物を測定することによりその複合体を測定することができ、それによって、原発性肝細胞癌などの癌判定が可能である。
【選択図】なし

Description

本発明は、ホルミニノトランスフェラーゼ シクロデアミナーゼ（formininotransferase cyclodeaminase；ＦＴＣＤ）とその自己抗体との複合体を測定するための免疫測定方法及び免疫測定用キットに関するものである。ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体は、特に担癌患者の血中に高値に出現するものであり、したがって、本発明は、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体を単に測定する方法を提供するだけでなく、癌の判定にも利用することができる。

ＦＴＣＤは、葉酸代謝及びグルタミン酸代謝の２種類の機能を持つ肝臓特異的に発現する酵素であることが知られている（非特許文献１）。
他方、アガロース２次元電気泳動に２Ｄ−ＤＩＧＥ法（two-dimensional fluorescence difference gel electrophrosis）を適用した改良アガロース２次元電気泳動法（非特許文献２）により、原発性肝細胞癌の癌部および周辺の非癌部組織の蛋白発現量の比較をプロテオーム解析を行ない、ＦＴＣＤが非癌部に多く発現されることが明らかになっている（非特許文献３）

Anne-Marie Bashour et al., J Biol Chem. 1998; 31: 19612-19617 Takeshi Tomonaga et al., Clin. Cancer Res. 2004;10:2007-2014 Masanori Seimiya et al., Hepatology 2008;48:519-30

本発明者らは、癌が疑われる患者または癌患者由来の組織検体中に存在する、ＦＴＣＤの発現レベルを測定して、組織中の癌部は非癌部に比べて弱く発現することにより、それらの組織の癌部と非癌部の判別することができることを見出し、これに対し特許出願した（特願２００８年２６４７９４号）。本発明者らは、さらに血液検体中のＦＴＣＤの存在について研究を続けたところ、驚くべきことに、血液検体中にＦＴＣＤとその自己抗体との複合体が存在し、癌患者の場合、組織部とは逆に、その複合体の量が多いことを見出した。したがって、本発明の目的は、癌判定に応用することのできる、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体の測定方法を提供することである。

本発明者らは、検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体を免疫測定することにより、該複合体を測定することができ、それによって癌判定が可能になることを見出し、本発明を完成させた。
従って、本発明は、検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体を免疫測定することを特徴とする、検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体の免疫測定方法に関する。
更に、本発明は、ＦＴＣＤに対する試薬抗体およびその自己抗体に対する結合可能物質を含む、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体の免疫測定用キットに関する。
更に、本発明は、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体を測定することにより、癌であることを判定する、癌判定方法に関する。

本発明においては、検体中、特に、血液由来検体中に存在するＦＴＣＤとその自己抗体との複合体を簡単に測定でき、原発性肝細胞癌などの癌患者の判定に有効である。

抗ＦＴＣＤ抗体を感作したＥＬＩＳＡプレートを用いて健常人血清検体、原発性肝細胞癌患者血清検体のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体を測定した結果である。

本発明のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体の免疫測定方法は、一般的な蛋白質とその抗体との免疫複合体の免疫測定方法で知られている公知の方法をそのまま、応用できる。
本発明の免疫測定方法においては、例えば、検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体に、ＦＴＣＤに対する試薬抗体およびその自己抗体に対する結合可能物質を作用させ、得られる複合体と試薬抗体と結合可能物質との免疫複合物を測定することによりその複合体を測定することができる。

本発明において、検体とは、生体由来の試料が好適で、特に、血液由来検体が好適であり、血液検体としては、全血、血漿、血清を例示できる。

本発明の免疫測定方法の測定対象は、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体である。本発明において、ＦＴＣＤは、正式名がホルムイミノトランスフェラーゼシクロデアミナーゼ（formiminotransferase cyclodeaminase）であり、Swiss-Prot entry O95954でコードされる分子量５９ｋＤａ、５４１アミノ酸で構成される蛋白質である。

本発明において、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体とは、ＦＴＣＤとＦＴＣＤに対する自己抗体との免疫複合体を意味し、本明細書では単に複合体と記載することもある。
本発明において、自己抗体とは、自己の身体に存在する物質に対して自己の身体で産生される抗体であって、自己の身体に存在する物質がＦＴＣＤであり、そのＦＴＣＤに対する抗体をいう。
本発明において、ＦＴＣＤに対する試薬抗体とは、試薬として用いるＦＴＣＤと特異的に結合する抗体をいい、本明細書では単に試薬抗体と記載することもある。その試薬抗体は、その産生動物種としてヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等があり、それぞれに所定範囲の免疫グロブリンがある。その試薬抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。また、試薬抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びこれらの断片（抗原と結合能を有するもので例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２等）のいずれでもよい。このような試薬抗体は、ＦＴＣＤ全長蛋白質またはその断片ペプチドを抗原として、上記した産生動物種に免疫して、その免疫動物から抗血清として得ることができ、また、免疫動物からの脾細胞とミエローマ細胞とを融合して、融合細胞から、ＦＴＣＤに対する抗体を産生する融合細胞をスクリーニングして、得られるハイブリドーマからモノクローナル抗体として得ることもできる。また、ＦＴＣＤに対する試薬抗体は、抗ＦＴＣＤ抗体として市販されており、それらの市販品を使用することもできる。

本発明において、その自己抗体に対する結合可能物質とは、ＦＴＣＤに対する自己抗体と結合可能な物質であれば特に限定しないが、本明細書では単に結合可能物質と記載することがある。この様な結合可能物質としては、抗ＩｇＧ抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、試薬としてのＦＴＣＤ抗原を用いることができ、そのうち、抗ＩｇＧ抗体が好ましい。
試薬としてのＦＴＣＤ抗原を用いる場合、ＦＴＣＤに対する自己抗体と抗原抗体反応しうる抗原であれば特に限定しないが、ＦＴＣＤ全長蛋白質、ＦＴＣＤ全長蛋白質の変異体であって該蛋白質と同様のＦＴＣＤに対する自己抗体と抗原抗体反応しうる機能を有し且つ該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する蛋白質もしくはＦＴＣＤ全長蛋白質のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である変異体、ＦＴＣＤの断片ペプチドであってＦＴＣＤの自己抗体と抗原抗体反応しうるペプチドを例示できる。ＦＴＣＤ全長蛋白質は、Ａｂｎｏｖａ社より入手可能であるが、全アミノ酸配列が既知であるので、ＦＴＣＤ全長蛋白質やその変異体は、遺伝子組換え技術によっても合成できる。本発明においてＦＴＣＤの断片ペプチドを用いるときは、ＦＴＣＤ全長蛋白質を酵素分解等によって各種のペプチド断片に切断して作成してもよいし、市販の自動ペプチド合成装置を用いても容易に作成することができる。また、標的のＦＴＣＤの断片ペプチドを遺伝子組み換え技術によっても作成することができる。
そのようにして得られたＦＴＣＤ全長蛋白質の変異体や断片ペプチドを、ＦＴＣＤに対する自己抗体と反応させ抗原抗体反応をするものを選択して試薬としてのＦＴＣＤ抗原として用いることができる。本発明においては、上記した各ペプチド断片の全体のほか、その一部も使用できるし、それらの混合物も使用でき、これらも試薬としてのＦＴＣＤ抗原に包含される。

本発明においては、検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体に、ＦＴＣＤに対する試薬抗体およびその自己抗体に対する結合可能物質を作用させると、複合体と試薬抗体と結合可能物質との免疫複合物が生成する。その免疫複合物を測定するには、ＦＴＣＤに対する試薬抗体（試薬抗体）およびその自己抗体に対する結合可能物質（結合可能物質）のいずれかを標識成分で標識し、生成する免疫複合物中の標識成分を測定することによって、免疫複合物を測定するのが好ましい。
標識成分としては、酵素、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質等常用される標識成分を使用することができるが、酵素や放射性物質が好ましい。
標識するための酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、ウシ小腸アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素免疫分析法（ＥＩＡ）に常用される酵素が適宜使用され、これらの酵素に適合しＥＩＡで常用される発色基質が適宜使用される。発色基質としては、例えばＨＲＰの場合は、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、ＴＭＢＺ・ＨＣｌ、ＴＭＢＺ・ＰＳ、ＡＢＴＳ、ｏ−フェニレンジアミン、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸等が使用され、アルカリフォスファターゼの場合は、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート、４−メチルウンベリフェリルフォスフェート等が使用され、β−ガラクトシダーゼの場合は、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド等が使用される。
標識するための放射性物質としては放射性ヨウ素原子等を、蛍光物質としてはＦＩＴＣやローダミン等を、化学発光物質としてはルミノール等を例示することができる。

本発明において標識成分を用いる場合、例えば、検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体に、水不溶性担体に結合しているＦＴＣＤに対する試薬抗体を作用させ、次いで、標識成分で標識されたその自己抗体に対する結合可能物質を作用させ、複合体と試薬抗体と結合可能物質との免疫複合物を生成させ、その免疫複合物に結合している標識成分を測定することによりその複合体を測定することが好ましい。また、検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体に、その自己抗体に対する結合可能物質が結合した水不溶性担体を作用させ、次いで、標識成分で標識されたＦＴＣＤに対する試薬抗体を作用させ、複合体と結合可能物質と試薬抗体との免疫複合物を生成させ、その免疫複合物に結合している標識成分を測定することによりその複合体を測定することもできる。

水不溶化担体の調製は、蛋白質を固相面に結合する既知の方法を用いて容易に行うことができる。例えば、固相化担体としては、通常、ビーズ、マイクロプレート、チューブ等が用いられる。これらの固相面にＦＴＣＤに対する試薬抗体を結合する方法としては、物理吸着、化学結合等既知の固定化技術が適宜利用できる。
このようにして固相化したＦＴＣＤに対する試薬抗体に、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体とを含む検体とを接触させると、複合体中のＦＴＣＤ部分と試薬抗体とが結合する。さらに、その結合物に対し、標識成分で標識されたその自己抗体に対する結合可能物質（例えば標識抗ＩｇＧ抗体）を作用させると複合体と試薬抗体と結合可能物質との免疫複合物が生成する。その結果、生成する免疫複合物中の標識成分を測定することにより、検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体を測定することができる。
上記と同様にして、固相化担体にＦＴＣＤの自己抗体に対する結合可能物質を結合させて、固相化した結合可能物質に、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体とを含む検体とを接触させて、複合体中の自己抗体部分と結合可能物質とを結合させ、さらに、その結合物に対し、標識成分で標識されたＦＴＣＤに対する試薬抗体（例えば、抗ＦＴＣＤ抗体）を作用させて、複合体と結合可能物質と試薬抗体との免疫複合物を生成させて、同様にして、検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体を測定することもできる。

本発明の免疫測定方法の典型的な例を以下に示す。
プレートに抗ＦＴＣＤ抗体を加え、低温例えば４℃で静置して感作し、その後、ＰＢＳ等の洗浄液で洗浄する。ついで、そのプレートをＢＳＡでコーティングし、抗ＦＴＣＤ抗体ＥＬＩＳＡプレートを作成する。希釈した検体を抗ＦＴＣＤ抗体ＥＬＩＳＡプレートに加え、加温例えば３７℃で静置し、次いでＰＢＳ等の洗浄液で洗浄をする。得られるプレートのウェルにＨＲＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を加え、加温例えば３７℃で静置する。ついで、ウェルをＰＢＳ等の洗浄液で洗浄した後、ＴＭＢＺを加え、例えば室温で静置した後、反応停止剤として１Ｎ硫酸を加える。吸光度はマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、波長４５０ｎｍにて吸光度を測定する。吸光度の値とあらかじめ作成しておいた検量線から、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体の値を求める。

本発明の測定方法は、ＦＴＣＤに対する試薬抗体およびその自己抗体に対する結合可能物質を含む、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体の免疫測定用キットにより実施することができる。そのためのＦＴＣＤに対する試薬抗体、その自己抗体に対する結合可能物質は、本発明の測定方法で説明したとおりである。すなわち、例えば、ＦＴＣＤに対する試薬抗体およびその自己抗体に対する結合可能物質のいずれかを水不溶性担体に結合させた形態で、他のいずれかを標識成分で標識した形態で、キットの試薬成分とすることができる。その他の試薬成分として、界面活性剤、緩衝剤等の免疫測定法で常用されるものを適宜、加えてもよい。

本発明においては、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体を測定することにより、癌判定をすることができる。
また、一般にＦＴＣＤとその自己抗体との複合体の量が多いと、原発性肝細胞癌（原発性肝細胞癌、原発性胆管細胞癌など）、転移性肝癌等の肝癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌、皮膚癌などの癌が疑われ、本発明によりＦＴＣＤに対する自己抗体を測定することは、患者の癌疾患の判別に有効である。本発明においては、原発性肝細胞癌の判別に有効であり、例えば、健常人と、初発原発性肝細胞癌患者や再発原発性肝細胞癌患者との判別に有効である。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に何ら制限されるものではない。
実施例１
ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体の測定
健常人、初発原発性肝細胞癌患者、及び再発原発性肝細胞癌患者から採取した血清検体について、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体の測定を、以下に具体的に説明するようにして行なった。

１．方法
（１）抗ＦＴＣＤ抗体ＥＬＩＳＡプレートの作成
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製，Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に抗ＦＴＣＤ抗体（Ａｂｎｏｖａ社製，５μｇ／ｍＬ，１００μＬ／ｗｅｌｌ）を１晩４℃静置して感作し、その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄を行った。ついで、１．５％ＢＳＡ、１０％サッカロースを含むＰＢＳ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で１晩コーティングし、抗ＦＴＣＤ抗体ＥＬＩＳＡプレートを作成した。

（２）ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体の測定
検出抗体としてＨＲＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて４０００倍に希釈したものを用いた。サンプル血清はＰＢＳにて１００倍に希釈した。その希釈したサンプルを抗ＦＴＣＤ抗体ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、１時間３７℃で静置し、その後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄を行った。得られるプレートのウェルに希釈したＨＲＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、３０分間３７℃で静置した。ついで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄した後、ＴＭＢＺを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、１０分間室温で静置の後、反応停止剤として１００μＬ／ｗｅｌｌの１Ｎ硫酸を加えた。吸光度はマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、波長４５０ｎｍにて測定を行った。
なお、検体は健常人１６例、初発原発性肝細胞癌患者検体１６症例、再発原発性肝細胞癌患者１６例を用いた。

２．結果
ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体を測定した結果を用いた結果を、図１に示す。有意差検定はＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ４．０を用い、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの２標本検定にて統計処理した。
図１に示すように、健常人群と比較し、特に再発原発性肝細胞癌患者検体群のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体は、大きな有意差を認めた。

以上に詳細に説明したように、血液由来検体などの検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体に、ＦＴＣＤに対する試薬抗体およびその自己抗体に対する結合可能物質を作用させ、得られる複合体と試薬抗体と結合可能物質との免疫複合物を測定することによりその複合体を測定することができ、それによって、原発性肝細胞癌などの癌判定が可能である。

Claims (13)

1. 検体中のホルミニノトランスフェラーゼ シクロデアミナーゼ（formininotransferase cyclodeaminase；ＦＴＣＤ）とその自己抗体との複合体を免疫測定することを特徴とする、検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体の免疫測定方法。
2. 検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体に、ＦＴＣＤに対する試薬抗体およびその自己抗体に対する結合可能物質を作用させ、得られる複合体と試薬抗体と結合可能物質との免疫複合物を測定することによりその複合体を測定する、請求項１に記載の免疫測定方法。
3. 試薬抗体および結合可能物質のいずれかが標識成分で標識されており、免疫複合物中の標識成分を測定して免疫複合物を測定することにより複合体を測定する、請求項２に記載の免疫測定方法。
4. 検体中のＦＴＣＤとその自己抗体との複合体に、水不溶性担体に結合しているＦＴＣＤに対する試薬抗体を作用させ、次いで、標識成分で標識されたその自己抗体に対する結合可能物質を作用させ、複合体と試薬抗体と結合可能物質との免疫複合物を生成させ、その免疫複合物に結合している標識成分を測定することによりその複合体を測定する、請求項３に記載の免疫測定方法。
5. その自己抗体に対する結合可能物質が、抗ＩｇＧ抗体である、請求項２から４のいずれかに記載の免疫測定方法。
6. 標識成分が酵素または放射性物質である、請求項３から５のいずれかに記載の免疫測定方法。
7. 癌判定用である、請求項１から６のいずれかに記載の免疫測定方法。
8. 癌が原発性肝細胞癌である、請求項７に記載の免疫測定方法。
9. 検体が血液由来検体である、請求項１から８のいずれかに記載の免疫測定方法。
10. ＦＴＣＤに対する試薬抗体およびその自己抗体に対する結合可能物質を含む、ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体の免疫測定用キット。
11. ＦＴＣＤとその自己抗体との複合体を測定することにより、癌であることを判定する、癌判定方法。
12. 血液由来検体中の複合体を測定する、請求項１１に記載の癌判定方法。
13. 癌が原発性肝細胞癌である、請求項１２に記載の癌判定方法。