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JP2010539949A - 細胞ローリング分離 - Google Patents

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Abstract

本発明は、細胞接着分子でコーティングされた領域の縁部に沿った表面上の細胞ローリングに基づいた、細胞分離のためのシステムを提供する。コーティングされた領域および縁部の様々な設計が開示されている。一局面において、本発明の方法は、細胞接着分子の秩序化層で少なくとも部分的にコーティングされている表面を提供するステップであって、表面は、秩序化層でコーティングされた範囲と、秩序化層でコーティングされていない別の範囲との間に少なくとも１つの縁部を含む、ステップと、少なくとも１つの縁部とゼロではない角度αｓを形成する方向に、表面を横切って細胞集団を流すステップであって、細胞集団中の少なくとも１つの細胞は、細胞接着分子によって認識される表面部分を含み、少なくとも１つの細胞は、少なくとも１つの縁部の少なくとも一部と相互作用する結果として、流れの方向に対してαｓである方向に、ある時間回転する、ステップとを含む。

Description

関連出願の情報
この出願は、２００７年９月２７日に出願された、米国仮出願第６０／９７５，８１３号（この全体の内容は、その全体において参考として本明細書に援用される）への優先権およびその利益を主張する。
細胞ローリング（ｃｅｌｌ ｒｏｌｌｉｎｇ）は、血流中の特定の細胞を標的組織に動員するのに使用される重要な生理的および病的プロセスである。例えば、粘性剪断流における血管内皮に沿った細胞ローリングは、炎症部位への白血球の動員、静脈内注射後の造血前駆細胞のホーミング、腫瘍細胞転移および他の炎症過程におけるその役割を考慮すると、生物学的に第一に重要である。
細胞ローリングは、細胞速度の低減を通じて標的組織への接着過程を開始する、受容体−リガンド媒介事象である。細胞ローリングの後に、一般に、活性化、強力接着、および遊出が続く。ローリング応答は、白血球および活性化された内皮細胞の表面上で発現される、セレクチンと呼ばれる膜貫通糖タンパク質受容体のファミリーによって主に媒介される。セレクチンは、レクチン様細胞外ドメインを介して炭水化物に結合する。セレクチンの広いファミリーは、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）、およびＰ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）に分けられる。Ｌ−セレクチン（７４〜１００ｋＤａ）は、ほとんどの白血球上に見出され、細胞表面から急速に脱落し得る。Ｅ−セレクチン（１００ｋＤａ）は、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αに応答して血管内皮細胞上で一過性に発現される。Ｐ−セレクチン（１４０ｋＤａ）は、一般に、血小板および内皮細胞の分泌顆粒中に貯蔵される。
例えば、血管内皮上で白血球ローリングを媒介する接着機構は、細胞ローリングと呼ばれることが多い。この機構は、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチン（血管内皮細胞上に発現される）とセレクチン結合性炭水化物リガンド（循環造血幹細胞（ＨＳＣ）および白血球上に発現される）との間の弱い親和性を伴う。「捕獲される」と、細胞は、バルク流体中を急速に流れる捕獲されていない細胞と対照的に、表面上を徐々に回転する。
概要
本発明は、ローリング細胞の運動方向は、細胞が回転する表面上の分子の配置を変更することによって変更することができるという知見を包含する。特に、本発明者らは、細胞は、細胞ローリングを促進する分子でコーティングされた領域と、コーティングされていない範囲との間の縁部を使用して、流れの方向をそらすことができることを実証した（例えば、図１Ｃを参照されたい）。ある特定の実施形態では、流れのまったくないよどみ線は、そのような縁部の代わりに、またはそのような縁部に加えて作用することによって、流れの方向に対してある角度で細胞ローリングを促進することができる。
本明細書に記載される本発明は、これらの知見を活用することによって、細胞ローリングに基づく分離のためのシステムを提供する。分離された細胞は、限定することなく、診断または治療目的を含めた任意の目的のために使用することができる。
いくつかの態様では、細胞分離用途に有用となり得る方法が提供される。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞接着分子の秩序化層で少なくとも部分的にコーティングされている表面を提供するステップであって、この表面は、秩序化層でコーティングされている範囲と、秩序化層でコーティングされていない別の範囲との間に少なくとも１つの縁部を含むステップと、この少なくとも１つの縁部とゼロではない角度αｓを形成する方向に、この表面を横切って細胞集団を流すステップとを含む。そのような方法では、細胞集団中の少なくとも１つの細胞は、細胞接着分子によって認識される表面部分を含み、細胞集団中の少なくとも１つの細胞は、少なくとも１つの縁部の少なくとも一部と相互作用する結果として、流れの方向に対してαｓである方向に、ある時間回転する。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞接着分子の秩序化層で少なくとも部分的にコーティングされている三次元表面を提供するステップと、流れのまったくないよどみ線を作り出すような条件で、この表面を横切って細胞集団を流すステップとを含む。そのような実施形態では、流れの方向は、よどみ線とゼロではない角度αｓを形成し、細胞集団中の少なくとも１つの細胞は、細胞接着分子によって認識される表面部分を含み、細胞集団中の少なくとも１つの細胞は、流れの方向に対してαｓである方向で、少なくとも一部の時間回転する。
いくつかの態様では、分離流チャンバー、分離流チャンバー中に細胞を流すための入口、および分離流チャンバーから外へ細胞を流すための出口を備える、細胞分離のためのデバイスが提供される。そのようなデバイスでは、分離流チャンバーは、細胞接着分子の秩序化層で少なくとも部分的にコーティングされた表面を備え、この表面は、秩序化層でコーティングされた範囲と、秩序化層でコーティングされていない別の範囲との間に少なくとも１つの縁部を含む。そのようなデバイスにおいて、細胞が入口から出口に流されるとき、これらは、少なくとも１つの縁部の方向に対して角度αｓで流れる。
（Ａ）縁部を作成するためのマイクロ流体技術を用いたポリスチレン基質に固定化したＰ−セレクチン、設計物を表すためのＢＳＡ−ＦＩＴＣの吸着を示す。細片は１００μｍ幅である。（Ｂ）２ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断速度で基質全体で１×１０６細胞／ｍＬの濃度で流動させたローリングＨＬ−６０細胞の行路。Ｍａｔｌａｂコードを用いて、０．５Ｈｚで獲得された１９４画像を加工することによって軌跡を得た。（Ｃ）代表的な行路を示す入口の拡大画像は、Ｐ−セレクチン細片内の流量の方向に細胞が回転するが、縁部（マーカーＯ）に直面すると方向を変え、縁部に沿って回転することを表す。縁部（マーカー□）に直面しないＰ−セレクチン細片内の細胞は、流量の方向に回転し、細片の方向には回転しない。他の細胞は、縁部（マーカーｘ）上で回転しているのを見ることができる。細胞の回転方向は、縁部によって決定され、細胞が回転するコーティングされた領域の形状によっては決定されない。 反対方法の２つの細胞型の正味の置換に帰着するであろう縁部設計の例の略図を示す。表面は、流れの方向に対して異なる角度を作る２種の縁部を含む。細胞によって直面される第１の縁部は、両方の細胞型がそれに沿って進むことができるような角度を作成する。第２の縁部は、たった１つの細胞型（破線）がその縁部に沿って回転することができるように大きな角度で傾斜されているか、または受容体を有する。大きな領域全体で徐々に第２の縁部を変化させることによって得られる上記の繰り返し設計における空間的変動は、特定の細胞型の焦点調節に用いることができる。 細胞分離は、様々な角度（Ａ）または一定の角度（Ｂ）でのセレクチン縁部を有するフローチャンバーを用いて行ってもよいことを示す。チャンバー長（Ｌ）、幅（ｗ）、細胞入口幅（ｗｉｎｌｅｔ）、およびチャンバー高（ｈ）は、特に関連し得る設計パラメータである。示されるように、一実施形態では、１０個のデバイスは、スループットを増加させるために平行して細胞分離に用いられてもよい（Ｃ）。 縁部効果を利用する異なる設計スキームを示す。（Ａ）縁部に沿って進まない細胞から離れた細胞を回転させるネガティブ選択。（Ｂ）単一ファイルに細胞を配置するための縁部。（Ｃ）（細胞を捕捉するための接着パッチでもあり得る）マイクロウェルの組み込みによる単一細胞の単離。（Ｄ）縁部での直面する前に細胞を回転することができるための縁部へ導く接着範囲。 流れの方向に対して角度（αｓ）を作る縁部とともに、幅（ｗ）の受容体バンドを含むセレクチン／ｍＡｂ配置に対する設計パラメータを示す概略図である。また、縁部に直面し、ある距離で縁部を追跡し、およびその後、縁部から脱着するローリング細胞の可能な経路を示す。 図６Ａおよび図６Ｂは、細胞が回転するようにした縁部を含む三次元表面を示す。このような表面は沈滞線を作製してもよくまたは作製しなくてもよい；それにも関わらず、それらの表面は、縁部を通じて細胞ローリングの方向に影響を与えてもよい。 （Ａ）水で満たされた（スライドガラスに結合したＰＤＭＳデバイスの）マイクロチャネルは、散乱光の欠如により目で見ることが困難であってもよい（上部スライド）。細胞で満たされた同様のマイクロチャネルは、細胞によって散乱された光により容易に視覚化され、区別される（下部スライド）。（Ｂ）マイクロチャネルに捕捉された細胞を示す挿入図（（Ａ）における四角によって記される）の拡大図。 エポキシ官能化されたガラス基板上のＰ−セレクチンの共有結合的固定化の反応スキームを示す。Ｐ−セレクチンは、表面に予め固定化されたポリエチレングリコールの層の上部に固定化される。 共有結合的に固定化されたＰ−セレクチン対物理吸着されたＰ−セレクチン上で回転する細胞についての静止画像および日付を示す。２８日後の表面上で回転する細胞数の比較は、（Ａ）物理吸着されたＰ−セレクチン、対（Ｂ）共有結合的に固定化されたＰ−セレクチンにおいて示される。（Ｃ）では、剪断流下でのＰ−セレクチンをコーティングした表面上の好中球のローリング力学を示す。２．５×１０５／ｍＬの好中球溶液は、１〜１０ｄｙｎ／ｃｍ２の壁剪断ストレス下で３または２８日のＰ−セレクチン表面上で灌流される。細胞の速度が自由流速度の５０％未満である場合、ローリング細胞として細胞をカウントする。非常に多数の細胞が、物理吸着されたＰ−セレクチンを有する表面と比較して、共有結合的に固定化されたＰ−セレクチンを有する表面上で回転することに留意されたい。 ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いて異なる比でＯＥＧ−ＣＯＯＨ／ＯＥＧ−ＯＨの混合された自己集合した単層（ＳＡＭ）、および（Ｂ）Ｐ−セレクチンの−ＳＨ基を介したコンジュゲーションを通じてＰ−セレクチンのビオチン化後のＯＥＧ−ビオチン／ＯＥＧ−ＯＨの混合されたＳＡＭ上でのＰ−セレクチン固定化の概念図を示す。アミド結合を介して（Ａ）、およびビオチン−ストレプトアビジン結合を介して（Ｂ）固定化されたＰ−セレクチンは、それぞれ表面上にランダムおよび配向された立体構造を有することに留意されたい。 （Ａ）制御された密度を有するＰ−セレクチン固定化の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示す。ＯＥＧ−ＣＯＯＨとＯＥＧ−ＯＨの比率を変更することによって、固定化されたＰ−セレクチンの量が制御され、ＯＥＧ−ＣＯＯＨの濃度に比例する。（Ｂ）配向されていないＰ−セレクチン（ＥＤＣ／ＮＨＳ化学）と配向されたＰ−セレクチン（チオール特異的なビオチン−ストレプトアビジン化学）上に結合している抗体の比較による、結合している抗体に対するＰ−セレクチン配向の効果。固定化されたＰ−セレクチンの量は、互いに同程度である（両表面について約１２ｎｍの波長シフト（約１８０ｎｇ／ｃｍ２））ことに留意されたい。 縁部を作製するためのＰ−セレクチンの固定化を説明する概略図および画像を示す。シリコーンゴムマスクをガラス基板におき（Ａ）、Ｐ−セレクチンは、物理吸着によって、基板の曝露された範囲にコーティングされた（Ｂ）。次に、シリコーンマスクは基板から除去され（Ｃ）、ＢＳＡを用いて、Ｐ−セレクチンでコーティングされていない範囲をブロックした（Ｄ）。蛍光標識されたＢＳＡの使用は、落射蛍光顕微鏡を用いたＰ−セレクチン配置の視覚化を可能にした（Ｅ）。ＨＬ−６０細胞は、Ｐ−セレクチン領域に選択的に接着し、Ｐ−セレクチンを有する基板のある範囲がコーティングされていることが確かめられた。スケールバー：１００μｍ。 Ｐ−セレクチン縁部はローリング細胞の動きを指向することを説明する写真を示す。流体の流れ方向に対して角度を作るＰ−セレクチンをコーティングした範囲の縁部に直面したローリングＨＬ−６０細胞は、縁部に沿って回転することを強要された。縁部に沿って回転するように強要された細胞の動きは、流体の流れの方向に回転する別の細胞と比較され、丸で強調されている。縁部は、８．６°までローリング細胞の動きの方向を変化させることに成功し、その結果、流れの方向に沿って１ｍｍの長さごとに元の位置から０．１５ｍｍまで細胞を効果的に動かした。壁剪断応力は１．９ｄｙｎ／ｃｍ２であった。 細胞およびマイクロスフェアローリングの分析の結果を示す。（Ａ）一連の２３６画像から生じたローリング細胞のＭａｔｌａｂ追跡は、縁部の効果を示す。細胞が縁部を越えることができないことは、縁部での高密度の行路に起因した。細胞ローリングは、Ｐ−セレクチンをコーティングした領域（ピンク色）で観察されたが、ブロックされた領域（白色）では観察されなかった。スケールバー：３００μｍ。（Ｂ）縁部上であり、Ｐ−セレクチン領域内で回転する細胞のより長い（＞３００μｍ）追跡は、縁部がローリング方向に影響を及ぼすことを明確に示す。スケールバー：３００μｍ。（Ｃ）縁部から離れて回転している細胞（青色）と比較して、縁部近くで回転している細胞（赤色）の移動の方向の角度分布ヒストグラム。壁剪断応力は１．９ｄｙｎ／ｃｍ２（０．１９Ｐａ、３００μＬ／分）であった。（Ｄ）Ｐ−セレクチン上で回転する、直径９．９６μｍのｓＬｅｘをコーティングされたマイクロスフェアを用いてなされた同様の実験は、マイクロスフェアの移動方向が実質的に変化しなかったので、マイクロスフェア上で大きな効果がなかったことを表す。壁剪断応力は０．３３ｄｙｎ／ｃｍ２（０．０３Ｐａ、２００μＬ／分）であった。 セレクチン縁部に沿って回転する細胞の潜在的メカニズムを説明する。（Ａ）引きずっている縁部上の結合は最大の歪みを受ける。これらの結合が壊れると、縁部に沿って細胞を移動させる（Ｃ）、細胞の非対称の回転（Ｂ）をもたらす。このメカニズムは、表面上の細胞ローリングに類似しているが、表面と平行した軸に沿った回転に加えて、細胞はまた、（Ｂ）に示されるように、表面と垂直の軸に沿って、平面内でスピンしてもよい。硬いマイクロスフェアの場合には、接触範囲は小さく、流れによる力は、接触範囲を垂直に超えた点を介して作用し、この非対称な動きは困難となる。 （Ａ）受容体縁部に沿って回転することによる細胞の分離のためのマイクロ流体デバイスを示し、フローチャネルの高さは３０μｍである。（Ｂ）仕分けされた蛍光マイクロスフェア（直径約２〜３０μｍ）とＨＬ−６０細胞の流れ、および緩衝液の流れは、流体の流れに対する角度でＰ−セレクチンの配置を含むデバイスに注入された。ローリングＨＬ−６０細胞は、選択的に迂回され、元の流れにおいてマイクロスフェアから離れて分離され、複合蛍光および明るいフィールド画像において顕著であった。破線は、細胞およびマイクロスフェアの流れと緩衝液の流れの間の境界を描く。矢印は、縁部に沿って回転する細胞の方向を指す。縁部上の細胞は円で囲まれる。スケールバー：１００μｍ。 （Ａ）マイクロデバイスの設計を示す。（Ｂ）ＨＬ−６０細胞ローリングの軌道は、Ｐ−セレクチンをコーティングした範囲の縁部を用いた回転の制御を示す（ピンク色）。（Ｃ）低倍率の顕微鏡を用いて観察された回収チャネル内の細胞。 生体分子のマイクロ流体配置が、基板に可逆的に結合されたＰＤＭＳマイクロチャネルを介して生体分子を流すことによってどのようにして達成され得るかを説明する。この技術を用いてＰ−セレクチン縁部を作製し、設計物は、配置工程後に蛍光標識されたＢＳＡへの曝露によって視覚化されている。Ｐ−セレクチンを含まない領域上でＢＳＡを選択的に吸着し、明るくなる。 好中球上のＣＤ６４の部位密度次元に関する概略図を示す。好中球の表面に結合された抗体の部位密度を決定するために、標準的なＩｇＧビーズは、ＦＩＴＣ−ビオチン抗体に結合させ、供給者によって説明されるように、部位密度対蛍光強度の較正曲線を作成するために使用される。 活性化していない（ＣＤ６４−）好中球から活性化されたＣＤ６４＋好中球をソートするために使用することができるデバイスに関する概略図を示す。活性化された好中球（Ａ）は活性化していない好中球（Ｂ）から区別可能であることが期待され、これは、それらが異なる角度で移動し、出口Ａから出るためである。活性化していない好中球は、出口Ｂから出る。活性化された好中球は、２つの出口での細胞の相対分布におけるシフトから検出されてもよい。 三次元細胞分離の応用に関する、沈滞線を作製するために使用することができる表面の例を示す。（Ａ）シリンダーおよび（Ｂ）突起部は、細胞接着分子を有するそれらの外面上でコーティングされ、三次元の細胞ローリングに基づく分離システムにおいて使用可能である。矢印は、流体の流れの流線を指す。沈滞線は、表面近くでは流れがない領域を表す。
定義
明細書全体にわたって、以下の段落で定義されるいくつかの用語が使用される。
用語「約」および「およそ」は、数値に関して本明細書で使用する場合、一般に、別段の記載のない限り、または別段に脈絡から明白ではない限り、その数値の両方向において（その数値を超えるか、その数値未満）５％、１０％、または２０％の範囲内に入る数値を含む（そのような数値が、可能な値の１００％を超える場合を除く）。
語句「接着性パッチ」は、本明細書で使用する場合、細胞が接着することができる分子が配列されている領域（例えば、表面上など）を指す。そのような接着性分子は一般に、細胞接着分子より、細胞との強い相互作用を有する任意のリガンドを含むことができる。そのような分子の例には、抗体および抗体断片が含まれる。接着性パッチ中のそのような分子の密度（またはパッチの寸法）は、いくつかの実施形態では、パッチに遭遇する細胞が、減速するが停止しないように制御することができる。いくつかの実施形態では、接着性パッチ中の分子の密度（またはパッチの寸法）は、パッチに遭遇する細胞が停止するように制御される。
用語「吸着する」は、当技術分野においてその一般に認められた意味で、すなわち、「吸着によって収集すること」を意味するのに一貫して本明細書で使用される。「吸着」は、それによって溶液中の特定のガス、液体または物質が、接触している材料、通常固体の露出した表面に接着するプロセスを指す。
用語「細胞接着分子」は、本明細書で使用する場合、一般に、これが見出される細胞の、他の細胞または細胞外基質との結合（細胞接着を介して）に関与する、細胞表面上に位置したタンパク質を指す。細胞接着分子の例として、それだけに限らないが、セレクチンの全長、断片、類似体、および／または修飾体（例えば、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチンなど）、インテグリン（例えば、ＩＴＧＡ４など）、カドヘリン（例えば、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリンなど）、免疫グロブリン細胞接着分子、神経細胞接着分子、細胞内接着分子、血管細胞接着分子、血小板−内皮細胞接着分子、Ｌ１細胞接着分子、および細胞外基質細胞接着分子（例えば、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニンなど）が挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「細胞接着分子」は、その接着特性により細胞接着を促進することができる他の化合物も包含する。本発明のいくつかの実施形態では、アプタマー、炭水化物、ペプチド（例えば、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパルテート）ペプチドなど）、および／または葉酸などは、細胞接着分子として機能を果たすことができる。本明細書で使用する場合、そのような化合物は、用語「細胞接着分子」によって包含される。本明細書で使用する場合、それだけに限らないが、「細胞接着分子」、「セレクチン」、「インテグリン」、「カドヘリン」、「免疫グロブリン細胞接着分子」、「神経細胞接着分子」、「細胞内接着分子」、「血管細胞接着分子」、「血小板−内皮細胞接着分子」、「Ｌ１細胞接着分子」、「細胞外基質細胞接着分子」を含めた、細胞接着分子を指す用語は、別段の記載のない限り、そのようなタンパク質の全長型、ならびにその機能的断片、類似体、および修飾体を包含する。同様に、それだけに限らないが、「Ｅ−セレクチン」、「Ｐ−セレクチン」、「Ｌ−セレクチン」、「ＩＴＧＡ４」、「Ｅ−カドヘリン」、「Ｎ−カドヘリン」、「Ｐ−カドヘリン」、「ビトロネクチン」、「フィブロネクチン」、「ラミニン」などを含めた、特定の細胞接着分子を指す用語も、別段の記載のない限り、そのようなタンパク質の全長型、ならびにその機能的断片、類似体、および修飾体を包含する。本明細書で使用する場合、用語「細胞接着分子」は、抗体を包含しない。
語句「細胞培養」は、一般に制御された環境下における細胞の成長を指すのに本明細書で使用される。そのような細胞は、多細胞真核生物、特に動物細胞に由来することができ、または細菌などの微生物とすることができる。用語「組織培養」は、細胞が多細胞真核生物動物に由来する場合、用語「細胞培養」と互換的に使用されることが多い。
用語「細胞修飾リガンド」は、本明細書で使用する場合、一般に、細胞の生物学的挙動を修飾することができる分子を指す。例えば、細胞内の分子シグナル（例えば、別のタンパク質の発現）を誘発するタンパク質は、細胞修飾リガンドである。
用語「変形能」は、本明細書で使用する場合、これが細胞に言及する場合、例えば、細胞が狭い空間を通過する際、細胞が表面に沿って回転する際などに、細胞がその形状を変化させる能力を意味する。
用語「リンカー」は、本明細書で使用する場合、基または部分（例えば、細胞接着分子）を、別の官能基（例えば、表面上に固定化された官能基など）に結合させるのに使用される化学的部分を指す。限定することなく、いくつかの実施形態では、リンカー部分は、デキストラン、デンドリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（Ｌ−リシン）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（Ｄ−リシン）、ポリ（Ｄ−グルタミン酸）、ポリビニルアルコール、およびポリエチレンイミンのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、アミン、アルデヒド、エポキシ基、ビニル、チオール、カルボキシレート、およびヒドロキシル基のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、リガンド／受容体対の１つのメンバーを含み、細胞表面分子は、化学的に修飾されるとによってその対の他のメンバーを含んでいる。
語句「間葉幹／前駆細胞」（「ＭＳＰＣ」と省略される）は、本明細書で使用する場合、骨髄、皮膚、腎臓、肺および肝臓を含めた、様々な成人および胎児組織中に分布している自己複製細胞および多分化能細胞を指す。ＭＳＰＣは、分化を誘導して、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、肝実質細胞、および心筋細胞を含めた複数の細胞型にする前に、培養物中で維持し、増殖することができる。骨髄および脂肪組織は、ＭＳＰＣの最も豊富な供給源である。この語句は、「間葉幹細胞」（「ＭＳＣ」と省略される）と互換的に使用される。
用語「配向した」は、本明細書で使用する場合、限定された、または指定された空間的な配向、すなわちランダムではない配向を有する分子（例えば、細胞接着分子など）を記述するのに使用される。例えば、表面上の細胞接着分子の相当な部分が、表面に対して特定の空間的な配向を有する場合、その細胞接着分子は、表面上に「配向して」いる。本発明のある特定の実施形態では、「相当な部分」は、表面上の分子の少なくとも５０％を占める。
用語「配向していない」は、本明細書で使用する場合、特定の、または指定された配向をまったく有していない、すなわちランダムな配向を有する分子（例えば、細胞接着分子など）を記述するのに使用される。例えば、細胞接着分子が一般に、表面に対して限定された配向を有していない場合、その細胞接着分子は、表面上に「配向していない」と記述することができる。
用語「秩序化層」、本明細書で使用する場合、層の少なくとも５０％にわたって、実質的に均一、周期的、および／またはパターン状である特性を有する層を指す。いくつかの実施形態では、秩序化層は、実質的に均一な密度および実質的に均一な空間的な配向の細胞接着分子より選択される１つまたは複数の特徴を有する。いくつかの実施形態では、秩序化層は、パターン状の分布、パターン状の密度、およびパターン状の空間的な配向の細胞接着分子より選択される１つまたは複数の特徴を有する。いくつかの実施形態では、秩序化層の細胞接着分子は、この秩序化層に印加される剪断応力に実質的に比例した、秩序化層上の細胞ローリングの速度を可能にする。
用語「物理吸着する」は、当技術分野においてその一般に認められている意味で、すなわち、「物理吸着によって収集すること」で一貫して本明細書で使用される。「物理吸着」は、化学結合の形成を伴わない吸着を指す。
語句「前駆細胞」は、本明細書で使用する場合、分化して特定の型の細胞になる能力を有する細胞を指す。この用語は、幹細胞より、特定の系列に沿ってさらに分化した細胞を一般に指す。
用語「自己組織化単分子層」（「ＳＡＭ」と省略される）は、本明細書で使用する場合、基質上の単層の分子を含む表面を指し、これは、基質表面上に所望の分子の溶液を添加し、過剰量を洗い落とすことによって調製することができる。
語句「よどみ線」は、本明細書で使用する場合、物体の表面近傍の流れの速度がゼロの領域を指し、そこでは表面上の流れが、様々な方向から収束する。よどみ線に沿った剪断力はゼロであり、表面に近い流れの速度は、よどみ線を通過する面を画定する。この面において、流れの速度は、よどみ線に対して９０度以外の角度をなさなければならない。（垂直の柱の場合、角度は９０度である）。
語句「幹細胞」は、本明細書で使用する場合、有糸分裂の細胞分裂を通じて自己複製することができ、分化して多様な特殊化された細胞型になることができる細胞を指す。幹細胞の例には、それだけに限らないが、間葉幹細胞、造血幹細胞、および胚性幹細胞が含まれる。
ある特定の実施形態の詳細な説明
上述したように、本発明は、表面を横切る細胞ローリングを使用することによる、細胞分離に有用なシステムを提供する。
Ｉ．方法
細胞接着分子の秩序化層で少なくとも部分的にコーティングされた表面を提供するステップと、この表面を横切って細胞集団を流すステップとを含む方法が提供される。表面は、秩序化層でコーティングされた範囲と、秩序化層でコーティングされていない範囲との間に少なくとも１つの縁部を含む。細胞集団は、少なくとも１つの縁部と一緒になって、ゼロではない角度αｓを形成する方向に、表面を横切って流される。細胞集団中の少なくとも１つの細胞は、細胞接着分子によって認識される表面部分を含み、縁部と相互作用する結果として、流れの方向に対して方向αｓに、少なくとも一部の時間回転する。いくつかの実施形態では、そのような細胞は、少なくとも一部の時間、縁部に沿って回転する。
ある特定の実施形態では、方法は、集団中のある特定の細胞から少なくとも１つの細胞を分離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、表面部分を含む細胞は、コーティングされた範囲上であるが、縁部から少なくとも一細胞直径離れた距離で回転する。そのような実施形態では、細胞は、αｓより小さい角度で回転することができる。いくつかのそのような実施形態では、αｓより小さい角度はゼロであり、またはゼロに近づく。すなわち、少なくとも１つの縁部と相互作用しない細胞は、流れの方向に回転する。
Ａ．コーティングされた表面
表面は、一般に、細胞接着分子の秩序化層で部分的にコーティングされており、本明細書に記載される追加の分子を含んでも、含まなくてもよい。
細胞接着分子
様々な細胞接着分子を、本発明のある特定の実施形態を実践するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞接着分子の層は、約１×１０−８モル／リットル（Ｍ）より大きい、１つまたは複数の細胞表面部分（例えば、タンパク質、グリカンなど）と相互作用するための解離定数（ＫＤ）を有する細胞接着分子を含む。いくつかの実施形態では、細胞接着分子の層は、約１×１０−４モルから約１×１０−７Ｍ（両端を含む）の範囲にある、１つまたは複数の細胞表面部分と相互作用するための解離定数（ＫＤ）を有する細胞接着分子を含む。コーティングされた表面上の細胞の挙動は、解離定数にある程度依存することが理解されるであろう。
一般に、任意の細胞接着分子を使用することができる。本発明のある特定の実施形態において有用な細胞接着分子の例として、それだけに限らないが、セレクチンの全長、断片、類似体および／または修飾体（例えば、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチンなど）、インテグリン（例えば、ＩＴＧＡ４など）、カドヘリン（例えば、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリンなど）、免疫グロブリン細胞接着分子、神経細胞接着分子、細胞内接着分子、血管細胞接着分子、血小板−内皮細胞接着分子、Ｌ１細胞接着分子、および細胞外基質細胞接着分子（例えば、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニンなど）が挙げられる。いくつかの実施形態では、アプタマー、炭水化物、ペプチド（例えば、ＲＧＤペプチド）、葉酸などは、細胞接着分子として機能を果たすことができる。細胞接着分子の層は、単細胞接着分子、または様々な種類の細胞接着分子の組合せを含むことができる。
細胞接着分子は、様々な様式で表面に結合することができる。非共有結合性相互作用、例えば、ファンデルワールス相互作用、水素結合、および静電相互作用（イオン結合としても公知である）などを使用することができる。
共有結合も使用することができる。任意の共有結合化学反応を、細胞接着分子を基質表面に共有結合させるのに使用することができる。当業者は、実施例に記載されている方法は例示的であり、当技術分野における知見に基づいて容易に改変することができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、細胞接着分子は、１つまたは複数のリンカー部分を介して表面に結合している。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、その両末端の１つで細胞接着分子に結合し、別の末端で基質の表面に結合している。一般に、リンカー部分と表面の間の結合は共有結合性である。リンカー部分と細胞接着分子の間の結合は、共有結合性であっても、非共有結合性（例えば、結合が本明細書で論じられるリガンド／受容体対を伴う場合）であってもよい。限定することなく、いくつかの実施形態では、リンカー部分は、デキストラン、デンドリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（Ｌ−リシン）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（Ｄ−リシン）、ポリ（Ｄ−グルタミン酸）、ポリビニルアルコール、およびポリエチレンイミンのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、アミン、アルデヒド、エポキシ基、ビニル、チオール、カルボキシレート、およびヒドロキシル基のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、リガンド／受容体対の１つのメンバーを含み、細胞表面分子は、化学的に修飾されることによってその対の他のメンバーを含んでいる。
コーティングされた表面の長期安定性および挙動を改善することに加えて、物理吸着の代わりに共有結合を使用することにより、基質表面上の細胞接着分子の密度、配置、および配向を制御することが可能になる。例えば、密度は、共有結合に利用可能な表面上の基の密度に依存する。同様に、配置も、共有結合に利用可能な表面上の基の配置に依存する。共有結合に適した基の様々な密度および配置を有する表面を調製するための方法は当技術分野で周知である（例えば、その両方の内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｒｕｓｍｉｎｉら Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｃｈｉｐｓ． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００７年６月；８巻（６号）：１７７５〜８９頁およびＬｅｃｋｂａｎｄら Ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９１年；３７巻（３号）：２２７〜２３７頁を参照されたい）。いくつかの実施形態では、細胞接着分子の密度は、約１０ｎｇ／ｃｍ２〜約６００ｎｇ／ｃｍ２の範囲である。いくつかの実施形態では、細胞接着分子の密度は、約３０ｎｇ／ｃｍ２超である。例えば、いくつかの実施形態では、細胞接着分子の密度は、約３０ｎｇ／ｃｍ２〜約３６０ｎｇ／ｃｍ２の範囲である。いくつかの実施形態では、細胞接着分子の密度は、約５０ｎｇ／ｃｍ２〜約３００ｎｇ／ｃｍ２の範囲である。いくつかの実施形態では、細胞接着分子の密度は、約１００ｎｇ／ｃｍ２〜約２００ｎｇ／ｃｍ２の範囲である。
いくつかの実施形態では、表面上の細胞接着分子の配向は制御される。これは有利となり得るが、その理由は、例えば、細胞接着分子の特定の領域のみが細胞に接触可能である場合、細胞接着分子は細胞と相互作用することを強いられるためである。例えば、Ｐ−セレクチンは、１個のシステイン残基を含む。結果として、Ｐ−セレクチンが、システインと特異的に反応するリンカー部分を介して表面に結合する場合、すべてのＰ−選択分子は、同じ配向で表面に結合することになる。一般に、細胞接着分子がユニークな基を含む場合はいつでもこの手法を適用することができる。いくつかの実施形態では、細胞接着分子は、当技術分野で公知の方法を使用して操作され、または化学的に修飾されることによって、最適な配向を提供する位置で、そのようなユニークな基（例えば特定のアミノ酸残基）を含むことができる。例えば、適当なアミノ酸残基は、タンパク質に基づく細胞接着分子のＣ−またはＮ−末端で付加することができる。
いくつかの実施形態では、細胞接着分子は、残基の限定されたサブセットのみが、表面またはリンカー上の反応基と反応することができるように、合成および／または精製される。いくつかの実施形態では、表面またはリンカー上の反応基と反応することができる唯一の基または残基が、各細胞接着分子上に存在する。例えば、いくつかの実施形態では、細胞接着分子は、保護基とともに合成および／または精製され、この保護基は、これらが結合している残基が、表面またはリンカー上の反応基と反応することを防止する。そのような実施形態では、細胞接着分子内の１つまたは複数の残基は保護されない。細胞接着分子は、１つまたは複数の保護されていない残基を介してのみ、表面またはリンカーに結合することができるので、細胞接着分子は、特定の配向で表面またはリンカーに結合することができる。いくつかの実施形態では、保護基は、細胞接着分子が表面またはリンカーに結合した後に除かれる。（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｒｅｇｏｒｉｕｓら Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１年１２月１日；２９９巻（１号）：８４〜９１頁を参照されたい。）
抗体
いくつかの実施形態では、抗体（抗体断片を含む）は、細胞接着分子と共固定化することができる。一般に、抗体は、細胞接着分子と同様の様式で表面に結合することができる（例えば、同じリンカー部分を使用して）。ある特定の実施形態では、抗体は、異なる共有結合方法を使用して結合することができる。ある特定の実施形態では、抗体は、非共有結合的に結合することができる。ある特定の実施形態では、秩序化層は、表面に共有結合している少なくとも１つの抗体、および表面に非共有結合的に結合している少なくとも１つの抗体を含む。
ある特定の実施形態では、細胞表面部分に結合する抗体は、細胞接着分子と共固定化することができる。原理上は、抗体が表面リガンドに結合する限り、抗体と表面リガンドの任意の対を本発明に従って使用することができる。例えば、コーティングされた表面と、ＣＤ６４を発現する細胞型との間の相互作用を改変することが望まれる場合、抗ＣＤ６４抗体は、細胞接着分子と共固定化することができる。当業者は、これを当技術分野で公知の他の表面リガンドに適用する方法を理解するであろう。そのような実施形態における細胞接着分子対抗体のモル比は、所望のローリング特性（例えば、速度、細胞停止の割合など）に応じて変更することができる。適当な比の例には、約１００：１〜１：１００の範囲のものが含まれる。いくつかの実施形態では、モル比は、２０：１から１：１の間の範囲である。
いくつかの実施形態では、細胞が、コーティングされた表面上を回転する速さを調節するために、抗体を含めることができる。いくつかの実施形態では、これは、抗体の密度および／または配置を制御することによって実現することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、細胞を停止させることなく、ローリングの速さを減速するような密度で表面上に固定化することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、細胞ローリングを停止させるような密度で表面上に配置することができる。
細胞修飾リガンド
いくつかの実施形態では、細胞修飾リガンドは、細胞接着分子と共固定化することができる。一般に、細胞修飾リガンドは、細胞接着分子と同様の様式で表面に結合することができる（例えば、同じリンカー部分を使用して）。ある特定の実施形態では、細胞修飾リガンドは、異なる共有結合方法を使用して結合することができる。ある特定の実施形態では、細胞修飾リガンドは、非共有結合的に結合することができる。ある特定の実施形態では、秩序化層は、表面に共有結合している少なくとも１つの細胞修飾リガンド、および表面に非共有結合的に結合している少なくとも１つの細胞修飾リガンドを含む。
いくつかの実施形態では、表面上で流される細胞集団は、共通の特性を有する細胞の少なくとも１つの部分集団を含み、細胞修飾リガンドは、細胞の部分集団の表現型を修飾することができる。任意の様々な細胞型は、本明細書で論じられる部分集団を含むことができる。例として、ある特定の癌細胞は、正常細胞上で発現されない、ＴＮＦ受容体５および／または６などの受容体を発現することができる。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連受容体アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、ＴＮＦ受容体５および６に特異的に結合する。そのような細胞のアポトーシスまたはプログラム細胞死を誘発するために、ＴＲＡＩＬは、細胞接着分子と共固定化することができる。ＴＲＡＩＬなどの細胞修飾リガンドおよび／または他の化学療法剤は、細胞接着分子と共固定化することによって、癌細胞を死滅させ、または癌細胞の増殖を抑止するためのシグナルを付与することができる。他の細胞修飾リガンドを、基質上および／または基質内で固定化および／または提示することによって、細胞接着分子と相互作用する細胞の挙動に影響することができることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）を提示することによって、未分化状態で細胞を維持することを促進することができる。更なる例として、骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を提示することによって、幹細胞の骨形成分化などを刺激することができる。細胞修飾リガンドの組合せも一緒に使用することができる。
Ｂ．設計
一般に、コーティングされた表面は、コーティングされた範囲とコーティングされていない範囲の間に少なくとも１つの縁部を含む。１つまたは複数の縁部を実現するために使用することができる設計の型に制限はまったくない。
１つまたは複数の縁部
表面上の少なくとも１つの縁部は、一般に、流れの方向とゼロではない角度αｓを形成する。ある特定の実施形態では、αｓは、少なくとも０．５度である。αｓは、様々な実施形態では、少なくとも１度、少なくとも２度、少なくとも３度、少なくとも４度、少なくとも５度、少なくとも６度、少なくとも７度、または少なくとも８度とすることができる。αｓは、様々な実施形態では、約７０度未満、約６５度未満、約６０度未満、約５５度未満、約５０度未満、約４５度未満、約４０度未満、約３５度未満、約３０度未満、約２５度未満、約２０度未満、または約１５度未満とすることができる。
少なくとも１つの縁部は、実質的に直線とすることができ、かつ／または曲線状部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、縁部は、直線部分および曲線状部分の両方を含むことができる。本発明のいくつかの実施形態では、表面は、複数の縁部を含む。本発明のいくつかのそのような実施形態では、縁部のうちの少なくとも２つは、流体の流れの方向に対して異なる角度を形成する。図２は、異なる角度を有する複数の縁部を利用する設計物の一例を示す。
本発明のある特定の実施形態では、縁部は、鋭い縁部である。縁部の鋭さ（ｓｈａｒｐｎｅｓｓ）は、所与の距離にわたる密度のある特定の変化率によって特徴付けることができる。コーティングされた範囲とコーティングされていない範囲の間の縁部を参照する場合、秩序化層における分子（例えば、細胞接着分子）の密度を考慮し、比較のために、コーティングされた範囲において最大密度を使用することが有用となり得る。「１００％の密度」は、縁部に隣接するコーティングされた範囲における最大密度として定義することができる。例えば、小さい距離にわたる１０％から９０％の間の密度の変化は、鋭い縁部を示し、より大きな距離にわたる同じ変化は、ぼやけた（ｂｌｕｒｒｙ）縁部を示す。本発明のいくつかの実施形態では、縁部は、約５μｍ未満の距離にわたる１０％〜９０％の密度の変化に対応する鋭さによって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、距離は、約３μｍ未満、約２μｍ未満、約１μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．２μｍ未満、または約０．１μｍ未満である。
いずれの特定の理論によっても束縛されることを望むことなく、ある特定の程度の鋭さが、特定の方向に沿って細胞ローリングを誘発するために必要となる場合があることが提唱されている。鋭い縁部において、細胞は、細胞表面およびコーティングされていない表面と相互作用するリガンドでコーティングされた表面と同時に相互作用する場合のみ可能である非対称運動を開始することができることが可能である。
１つまたは複数の縁部の配置
秩序化層でコーティングされた範囲は、本明細書で論じられる縁部を提供する、任意の様々な設計物を形成することができる。設計物は、複数のコーティングされた範囲を含むことができる。設計物のいくつかの例を図２〜４に示す。
本発明のある特定の実施形態では、設計物は、１つまたは複数のコーティングされた範囲を含み、それぞれは、少なくとも２つの縁部を有する細片を画定する。細片の２つの縁部は、実質的に平行とすることができ、あるいは、またはさらに、細片自体は、互いに実質的に平行とすることができる。細片が互いに実施的に平行である、いくつかの実施形態では、細片は、隣接する細片間で実質的に固定された距離ｗｇによって分離することができ、実質的に同じ幅ｗｓを有することができる。両パラメータｗｇおよびｗｓは、適切な場合、例えば、特定の組の条件について細胞ローリングに基づく分離を実現するために変更することができる。例えば、ｗｓは、約０．０１μｍ〜約１０ｍｍの範囲であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、ｗｓは、約１００μｍ未満、約７５μｍ未満、または約５０μｍ未満である。本発明のいくつかの実施形態では、ｗｓは、約０．１μｍ超、または約１μｍ超である。
状況によって、誘発されて回転することができる細胞の平均直径ｄに関連してｗｓを定義することが有用となり得る。いくつかの実施形態では、ｗｓは、３ｄ未満、２ｄ未満、またはｄ未満である。
ｗｇは、例えば、約０．２μｍ〜約１０ｍｍの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ｗｇは、約１００μｍ未満、約７５μｍ未満、または約５０μｍ未満である。いくつかの実施形態では、ｗｇは、約１μｍ超、約５μｍ超、または約１０μｍ超である。
ｗｇは、ｗｓとおよそ等しくても、ｗｓ超であっても、ｗｓ未満であってもよい。
ある特定の実施形態では、ｗｇ、ｗｓ、またはその両方は、他のパラメータとある特定の関係を有することができる。例えば、細胞は、接触半径ｒｃｏｎｔａｃｔを有する縁部に沿って回転することができる。いくつかの実施形態では、ｗｇ＞ｒｃｏｎｔａｃｔである。いくつかの実施形態では、ｗｇは、ｒｃｏｎｔａｃｔよりわずかに大きく、例えば、ｗｇは、ｒｃｏｎｔａｃｔより大きくなり得るが、ｗｇ＜１．５・ｒｃｏｎｔａｃｔ、ｗｇ＜１．２・ｒｃｏｎｔａｃｔ、またはｗｇ＜１．１・ｒｃｏｎｔａｃｔのように限定され得る。
設計物は、互いに平行ではないコーティングされた範囲の細片を含むことができる。いくつかの実施形態では、そのような細片は、共通の点、または入口などの共通の範囲から始まり、異なる角度で外側へ放射状に広がる。そのような設計物の一例を、図３Ａに示す。
あるいは、またはさらに、設計物は、例えば、正方形、矩形、三角形、多角形、楕円、円、弧、波、および／またはこれらの組合せなどの形状によって画定されたコーティングされた範囲を含むことができる。複数のそのような形状および／または細片は、全体的な設計物が、表面を横切る流れの方向に対してゼロではない角度を有する少なくとも１つの縁部を提供する限り、任意の設計物中に配置することができることが理解されるであろう。例えば、図２および４を参照されたい。一般に、設計物の性質は、分離されている最中の、１つまたは複数の細胞の型および／または望まれている分離の型に応じて合わせることができる。例えば、単細胞型を分離するシステムが必要である場合、１つの型の縁部を有する単純な設計物で十分となり得る。しかし、複数の異なる細胞型を分離するためのシステムが必要である場合、様々な型の縁部を有する、より複雑な設計物が必要となり得る。
図４Ｃに示すように、表面は、特定の目的、例えば、表面内で細胞を捕獲するために追加のエレメントまたは特徴を組み込むことができる。エレメントは、物理的構造、例えば、ウェル（すなわち、表面におけるくぼみ）などとすることができ、これは、細胞が流れの方向に流れることを制限する。同様に、接着性パッチを表面中に組み込むことによって、表面上の特定の領域における細胞の固定化を促進することができる。接着性パッチは、例えば、細胞がその速度を低減し、かつ／または停止することを促進する抗体などの分子を含むことができる。ある特定の実施形態では、表面は、少なくとも１つの縁部に隣接し、かつ／またはこれに通じて位置した接着性パッチをさらに含む。いくつかの実施形態では、接着性パッチは、コーティングされた範囲の上流に位置する。「上流の」とは、表面上を流れる細胞が、コーティングされた範囲に遭遇する前に接着性パッチに遭遇するように、接着性パッチが位置していることを意味する。そのような接着性パッチは、細胞を誘引し、縁部に沿った細胞ローリングを促進することができる。
Ｃ．細胞
細胞集団は、任意の様々な細胞型を含むことができ、任意の様々な供給源から得ることができる。細胞集団は、一般に、共通の特性を有する細胞の少なくとも１つの部分集団を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、流すステップにおいて、部分集団中の少なくとも１つの細胞は、少なくとも一部の時間回転する。そのような細胞は、縁部との相互作用の結果として、流れの方向に対してαｓである方向で回転することができ、αｓは、縁部と流体の流れの方向との間に形成する角度である。いくつかの実施形態では、部分集団中の実質的にすべての細胞が、少なくとも一部の時間回転する。
共通の特性は、細胞表面部分の発現などの表現型、細胞型（例えば、系列型など）、分化潜在性などとすることができる。例えば、部分集団中の細胞はすべて、細胞接着分子によって認識される細胞表面部分を含むことができる。細胞表面部分の例には、Ｐ−セレクチンのリガンド、Ｅ−セレクチンのリガンド、Ｌ−セレクチンのリガンドなどが含まれる。そのような部分の例として、Ｐ−セレクチンリガンド１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ４４（Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンのためのリガンド）、グリコシル化依存性細胞接着分子１（ＧｌｙＣＡＭ−１、Ｌ−セレクチンのためのリガンド）、ＣＤ１５（Ｐ−セレクチンのためのリガンド）、ＣＤ３４（Ｌ−セレクチンのためのリガンド）、Ｅ−セレクチンリガンド１（ＥＳＬ−１）などが挙げられる。表面部分の更なる例には、最晩期抗原４（ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ−１のためのリガンド）、ｇｐ２００などが含まれる。
部分集団は、特定の細胞型および／または細胞型の組合せを含むことができる。例えば、部分集団中の細胞は、癌細胞であり得る。細胞型の更なる例は、幹細胞（例えば、間葉幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞など）、前駆細胞、赤血球、好中球、リンパ球、単球、白血球などが挙げられる。いくつかの実施形態では、部分集団中のすべての細胞は、特定の細胞型、例えば、すべて癌細胞、すべて幹細胞、すべて前駆細胞などである。血小板は、細胞に正式には分類されないが、これらは、本発明のシステムを使用して、誘発することによって回転し、分離することができる。
細胞は、それだけに限らないが、細胞を含有する体液（例えば、血液、リンパ液、腹水、尿、唾液、滑液、脳脊髄液、硝子体液、精液など）、組織試料、凍結貯蔵物、細胞培養物などを含めた、様々な供給源から得ることができる。
細胞は、これらが流される前および／または流される際に薬剤で処理してもよい。例えば、細胞は、その変形能を改変する薬剤で処理することができる。そのような薬剤の例として、サイトカラシン、Ｎ−エチルマレイミド、ｐ−コロロメルクリベンゼン、ビンブラスチンなどが含まれる。ある特定の実施形態では、この処理ステップは、ある特定の型の細胞の細胞ローリングを促進することができる。
Ｄ．細胞ローリング
表面の近くを流れる細胞は、適切な条件下で、コーティングされた範囲の表面を横切って回転することができる。縁部からさらに離れている（例えば、縁部から一細胞直径より大きく離れている）細胞は一般に、流体の流れの方向に、またはほぼこの方向に回転し続ける。本発明のある特定の実施形態では、縁部における、または縁部近傍（例えば、縁部の一細胞直径以内）の細胞は、少なくとも一部の時間、縁部に沿って回転する。いくつかの実施形態では、縁部から離れた細胞は、これらが表面から離れるか、縁部に遭遇するまで、流体の方向に、またはほぼこの方向に回転することができ、縁部に遭遇した点で、これらは縁部に沿って回転し始めることができる。いくつかの実施形態では、縁部に沿って回転する細胞は、しばらくの間縁部をたどり、表面から離れ、再付着し（例えば、別の、または同じコーティングされた範囲上）、再び回転し始める（例えば、図５を参照されたい）。
所与の組の条件下で、細胞集団中のすべての細胞が、縁部に沿って回転することができるとは限らないことが理解されるであろう。細胞ローリングは、細胞のある特定の部分集団のみが回転するという点で選択的であり得る。例として、集団は、細胞接着分子によって認識される細胞表面部分を含まない細胞を含むことができる。そのような細胞は、ほとんどの条件下で表面に沿って回転しない。細胞接着分子によって認識される細胞表面部分を実際に発現する集団中の細胞の中で、１つまたは複数の部分集団にとって縁部に沿って回転することが許容できるが、他の部分集団にとって回転することが許容できない差異が存在し得る。いずれの特定の理論によっても束縛されることを望むことなく、いくつかの特性のいずれも、所与の組の条件下で、縁部に沿って回転する部分集団を、縁部に沿って回転しない部分集団と区別するのに機能を果たすことができる。そのような特性として、例えば、細胞表面部分の密度、細胞サイズ、細胞変形能などを挙げることができる。
方向
上述したように、細胞は、縁部に沿って回転することができ、縁部のうちの少なくとも１つは、流れの方向とゼロではない角度αｓを形成する。したがって、細胞は、いくつかの実施形態では、流れの方向からαｓである方向に回転することができる。上記に論じたように、αｓは変化することができる。ある特定の実施形態では、αｓは少なくとも０．５度である。αｓは、様々な実施形態では、少なくとも１度、少なくとも２度、少なくとも３度、少なくとも４度、少なくとも５度、少なくとも６度、少なくとも７度、または少なくとも８度とすることができる。αｓは、様々な実施形態では、約７０度未満、約６５度未満、約６０度未満、約５５度未満、約５０度未満、約４５度未満、約４０度未満、約３５度未満、約３０度未満、約２５度未満、約２０度未満、または約１５度未満とすることができる。
いずれの特定の理論によっても束縛されることを望むことなく、細胞は、より小さい角度でより容易に回転することができ、最大角度αｔｒまでの角度を許容することができる。ａｔｒは、細胞の特性、細胞分離システムの特定の条件などに依存して変化することができる。
速さ
細胞ローリングの速さも、細胞の特性、システムの特定の条件などに依存し得る。縁部に沿った細胞ローリングの速さは、いくつかの実施形態では、縁部から離れたコーティングされた範囲上の同様の細胞ローリングの速さより大きい場合がある。所与の細胞は、縁部に沿って回転する時間、調節可能な速さ、または実質的に一定の速さで回転することができる。いくつかの実施形態では、部分集団内の細胞は、所与の角度αｓの縁部に沿って回転するとき、均一な平均の速さを有する。いくつかの実施形態では、部分集団内の細胞は、所与の角度αｓの縁部に沿って回転するとき、様々な平均の速さを有する。
細胞は、例えば、少なくとも約０．１μｍ／ｓ、少なくとも約０．５μｍ／ｓ、少なくとも約０．８μｍ／ｓ、または少なくとも約１．０μｍ／ｓの平均の速さで、流れの方向に対してαｓである方向に、縁部に沿って回転することができる。
剪断力
線形の流体速度特性を仮定すると、細胞上の剪断力は、いくつかの実施形態では、以下のように流体速度と関係づけることができる：
式中、μは流体の粘度であり、Ｒｃｅｌｌは細胞の半径であり、Ｖｆｌｕｉｄは表面からの距離Ｒｃｅｌｌでの流体の流れの速度である。
いくつかの実施形態では、表面上を流される細胞上の剪断応力は、約０．０５ｄｙｎ／ｃｍ２〜約５０ｄｙｎ／ｃｍ２の間の範囲である。いくつかの実施形態では、剪断応力は、約０．２ｄｙｎ／ｃｍ２〜約５ｄｙｎ／ｃｍ２の間の範囲である。
細胞の変形能
いずれの特定の理論によっても束縛されることを望むことなく、所与の細胞の変形能は、縁部に沿って回転するその能力に影響し得る。例えば、いくつかの実施形態では、変形しやすさの小さい細胞は、より変形しやすい細胞ほど、ローリングを行いやすくない場合がある。
細胞が、回転する際に表面と接触する範囲は、細胞の変形能の目安を与えることができる。例えば、大きな接触範囲を有する表面と相互作用する細胞は、小さな接触範囲を有する表面と相互作用する細胞より、変形しやすくなり得る。接触範囲は、いくつかの実施形態では、接触半径ｒｃｏｎｔａｃｔによって画定することができる。
いくつかの実施形態では、縁部に沿って回転する細胞は、少なくとも約０．２５μｍの細胞接触半径ｒｃｏｎｔａｃｔで表面と接触する。様々な実施形態では、ｒｃｏｎｔａｃｔは、少なくとも約１μｍ、少なくとも約２μｍ、少なくとも約３μｍ、または少なくとも約４μｍとすることができる。
細胞の変形能は、本明細書で論じられるように、例えば、流れる前および／または間に、細胞変形能を改変する薬剤で処理することによって変えることができる。
パラメータの関係および組合せ
本発明のある特定の実施形態では、パラメータは、互いに関連して定義される。
いくつかの実施形態では、物理的な制約により、２つ以上のパラメータの間の関係が導かれる。例えば、αｓは、いくつかの実施形態において、およびある特定の設計物については、ｗｓ（ある特定の設計中のコーティングされた範囲の細片の幅）および／またはｗｇ（ある特定の設計物についての細片間のギャップの幅）に関係している場合がある。別の例として、細胞変形能は、細胞サイズに少なくともある程度依存し得る。
いくつかの実施形態では、２つ以上のパラメータは、設計によって意図的に制約される。例えば、本明細書で論じられるように、ｗｇは、ｒｃｏｎｔａｃｔ（細胞接触半径）に基づいてある特定の値に制約され得る。いくつかの実施形態では、ｗｓは、ｗｇに等しくするように固定することができる。
パラメータ間の関係は、実験的に求めることができる。例えば、ｗｓおよび／またはｗｇのそれぞれについて、細胞を、流れの方向に対して、縁部上を回転させることができる最大角度αｔｒを求めることができる。細胞接着分子の密度もａｔｒに影響し得る。
Ｅ．細胞分離および／または収集
本発明のある特定の実施形態では、方法は、細胞集団中のある特定の細胞から少なくとも１つの細胞を分離するステップをさらに含む。方法は、いくつかの実施形態では、細胞の１つまたは複数の部分集団を収集するステップをさらに含むことができる。細胞分離は、診断用途を促進することができる。例えば、本発明の方法は、ある特定の型の細胞、例えば、活性化好中球、循環腫瘍細胞などの分離、および結果として検出を可能にすることができる。生体試料中のそのような細胞型の存在は、ある特定の状態、疾患などを示すことができる。分離および／または収集された細胞は、いくつかの実施形態では、下流の用途において、例えば、細胞の開始集団、または流体において低量で存在する、細胞の部分集団を培養するために使用することができる。分離および／または収集された細胞は、治療的価値を有する場合がある。例えば、分離および／または収集された幹細胞は、組織および／または機能を再生するために使用することができる。本発明の方法は、ある特定の治療用途に特に適している場合があるが、これは、細胞ローリングが、細胞生理機能を妨害しない穏やかなプロセスであるためである。
分離は、集団からの他の細胞と比較して、少なくとも１つの細胞の異なるローリング特性に基づくことができる。例えば、共通の特性を共有する細胞の部分集団は、集団中の他の細胞より良好に（例えば、表面から離れる前のより長い時間、より大きな速さを伴ってなど）縁部に沿って回転することができる場合がある。そのような部分集団中の細胞は、例えば、流体の流れの方向に対して角度をなした縁部を使用して、特定の方向に沿って向けることができるが、容易に回転しない細胞は、流れの方向からそれない。
いくつかの実施形態では、対象とする少なくとも１つの細胞は、縁部に沿って回転し、ある特定の方向に、流れの方向から離れてそれる。細胞は、それた細胞の１つまたは複数の軌道に沿った、および／またはこれらの終端の１つまたは複数の収集箇所で収集することができる。
いくつかの実施形態では、「ネガティブ」選択スキームが使用され、この中で縁部に沿って回転しない細胞が、他の細胞から分離される。例えば、縁部は、縁部に沿って回転する細胞を、所与の収集箇所から離して向けるように設計することができる。したがって、縁部に沿って回転しない細胞は、他の細胞から分離することができ、かつ／または収集することができる。（例えば、図４Ａおよび実施例１４を参照されたい。）
細胞の分離および／または収集は、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される、本発明のデバイスによって促進することができる。
Ｆ．三次元の方法
本発明のある特定の実施形態では、方法は、三次元システムにおける使用に適応する。（例えば、実施例１５を参照されたい）。そのような方法は、既に述べたものと同様であり、ただし縁部効果が、縁部よりむしろ、または縁部に加えて、流れのまったくない「よどみ線」を使用して実現されることを除く。一般に、そのような方法は、細胞接着分子の秩序化層で少なくとも部分的にコーティングされた三次元表面を提供するステップと、この表面を横切って細胞集団を流すステップとを含む。流体は、そのような方法において、流体の流れの方向と角度αｓを形成する、流れのまったくないよどみ線を作り出すような条件下で流される。流されている細胞集団中の少なくとも１つの細胞は、細胞接着分子によって認識される細胞表面部分を含み、細胞集団中の少なくとも１つの細胞は、流れの方向に対してαｓである方向に、少なくとも一部の時間回転する。
流れている流体が、ある特定の種類の三次元物体と遭遇するとき、「よどみ線」が作り出される場合がある。流れの方向において差異を作り出す任意の物体および形状を、よどみ線を作り出すために潜在的に使用することができる。例えば、円柱、稜、溝、隆起などは、よどみ線を作り出すことができる。そのような物体および形状の外側および／または露出した表面の少なくとも一部は、細胞ローリングを誘発することができる細胞接着分子でコーティングすることができる。
表面上の細胞ローリングは、よどみ線に向かって回転し、次いで（ある特定の状態下で）よどみ線に沿って回転し、それによってよどみ線をたどる。よどみ線が、流体の流れの方向に対してある角度をなしているとき、細胞は、流体の流れの方向に対してある角度をなした方向に回転することができる。縁部に沿ったローリングの場合のように、細胞は、角度が最大角度αｔｒを超えない限り、よどみ線をたどることができ、最大角度の値は、細胞分離システムの特定の条件に依存する。よどみ線は、考慮中の表面、および表面周囲の流れの場に応じて曲線状とすることができる。したがって、よどみ線は、縁部として作用し、細胞ローリングを促進することができる。
ある特定の実施形態では、図６ＡおよびＢに示すように、三次元表面は、本明細書に論じられるような、少なくとも１つの縁部を含むが、よどみ線を含んでも、含んでいなくてもよい。例えば、縁部は、球状、円柱状などの表面上にあり得る。縁部はまた、波状の表面、周期的な隆起を含む表面などに沿ったものとすることができる。
ＩＩ．デバイス
本発明のいくつかの態様では、細胞分離のためのデバイスが提供される。ある特定の実施形態では、そのようなデバイスは、本発明の方法に従って使用されるために設計される。一般に、そのようなデバイスは、分離流チャンバー、分離流チャンバー中に細胞を流すための入口、および分離流チャンバーから外へ細胞を流すための出口を備え、分離流チャンバーは、細胞接着分子の秩序化層で少なくとも部分的にコーティングされている表面を備え、この表面は、秩序化層でコーティングされた範囲と、秩序化層でコーティングされていない別の範囲との間に少なくとも１つの縁部を含む。そのようなデバイスにおいて、細胞が入口から出口に流されるとき、これらの細胞は、少なくとも１つの縁部と相互作用しない限り、少なくとも１つの縁部の方向に対して角度αｓで流れる。
本発明のデバイスは、本発明の方法の考察において上記に開示された任意の特徴を含むことができる。
デバイスは、特定の用途に必要とされ得る場合、任意の数の入口または出口を含むことができることが理解されるべきである。例えば、ある特定の実施形態では、デバイスは、分離流チャンバー中に細胞を含まない緩衝液の流れを導入するための追加の入口をさらに備えることができる。複数の出口は、例えば、分離流チャンバーを通じて流れる結果として、差次的に分離される細胞を収集することが望ましい場合、有用となり得る。
分離流チャンバーは、任意の形状、例えば、限定することなく、正方形または矩形の形状を有することができる。
いずれの特定の理論によっても束縛されることを望むことなく、分離流チャンバーの高さは、表面と相互作用することを強いられる、流されている細胞の割合に影響する場合がある。いくつかの実施形態では、高さを制限し、その結果分離流チャンバーを通じて流れるより多くの細胞が、表面と相互作用することが望ましい場合がある。本発明のいくつかの実施形態では、分離流チャンバーを画定する壁は、約５μｍ〜約１ｍｍの範囲の高さを有する。様々な実施形態では、そのような壁の高さは、約１００μｍ未満、約７５μｍ未満、約５０μｍ未満、約２５μｍ未満、または約１５μｍ未満である。高さは、分離チャンバーの長さ全体にわたって均一でなくてもよい。例えば、高さは、分離チャンバーの長さ全体にわたって段階的に変化することができる。
ある特定の実施形態では、分離流チャンバーは、下部の部分的にコーティングされた表面、壁、および上部のコーティングされていない表面によって画定することができる。ある特定の実施形態では、１つのデバイスは、それぞれがそれ自体の１つまたは複数の入口および１つまたは複数の出口を有する、複数の分離流チャンバーを含むことができる。
ある特定の実施形態では、これらの分離流チャンバーは、離れていて、通じることができなくてもよい（すなわち、平行のシステム）。そのようなデバイスにおける各分離流チャンバーは、同じ、または異なる縁部設計物を含むことができる。同じ縁部の設計物を有する複数の分離流チャンバーを含むデバイスは、同様の条件下で分離を繰り返す必要がある場合（例えば、１つまたは複数の試験試料および対照試料）、有用となり得る。異なる設計物を有する複数の分離流チャンバーを含むデバイスは、最適な分離を生じる設計物を識別することが必要である場合（例えば、様々なアリコートの同じ試験試料を使用して）、有用となり得る。
ある特定の実施形態では、デバイスは、（例えば、第１の分離チャンバーの出口が、第２の分離チャンバーの入口に送り込む場合）流体連通している２つ以上分離チャンバーを含むことができる。そのようなデバイスにおける各分離流チャンバーは、同じ、または異なる縁部設計物を含むことができる。そのような連続の構成は、例えば、第１の分離段階によって単離された細胞の部分集団を、第２の分離段階に曝す（例えば、サブ部分集団を単離するために）ことが望ましい場合、有用となり得ることが理解されるであろう。
上述の実施形態の任意の組合せまたは順列は、本発明によって包含されることが理解されるであろう。
本発明のある特定の実施形態では、本発明のデバイスは、他のデバイスとともに使用することができる。例えば、１つのデバイスの出口から外へ流れる細胞は、別のデバイス中に流すことができる。あるいは、またはさらに、デバイスは、これらが、別のデバイスから流れる細胞を受け入れる（その入口中に）ように作製することができる。
ある特定の実施形態では、デバイスは、分離流チャンバーを通じて流される細胞の少なくとも１つの部分集団を収集するための、１つまたは複数の手段（例えば、分離流チャンバーの一端における１つまたは複数のチャネル）をさらに備える。任意の前述の方法は、細胞を収集するためのそのような手段を利用するステップを含むことができることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、多孔質フィルターを、チャネルの一端に位置させることができる。細胞の部分集団を収集するための複数のチャネルをデバイス中に使用することができる。いくつかのそのような実施形態では、デバイスはそれぞれ、例えば、収集チャネルの両端および／または連続したチャネルの間に位置させることができる、複数の多孔質フィルターをさらに備える。
デバイスは、収集した細胞を容易に視覚化することが可能であるように、設計および／または構築することができる。例えば、収集された細胞は、眼によって、低倍率の顕微鏡を使用して、ルーペ、またはこれらの組合せを使用して視覚化することができる（例えば、チャネルが、細胞で満たされているとき、眼によって視覚化することができるチャネルを示す図７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、チャネル内の収集された細胞の視覚化は、光を照射することによって促進される。細胞の視覚化を助長するデバイスエレメントを、いくつかの実施形態では、デバイス中に組み込むことができる。例えば、ルーペをデバイス中に内蔵し、それが、収集チャネルを拡大するように位置させることができる。あるいは、またはさらに、収集された細胞は、着色流体、色素など、またはこれらの組合せの手だてを用いて視覚化することができる。いくつかの実施形態では、収集された細胞の数の推定値は、更なる処理を伴うことなく得ることができる。いくつかのそのような実施形態では、デバイスは、収集チャネルに沿って、例えば目盛りを組み込むことができ、収集された細胞のカラムの高さは、細胞の体積および／または細胞数の目安を与える。
ある特定の実施形態では、デバイスは、流量を制御するための手段をさらに備える。いくつかの実施形態では、流量を制御するための手段は、シリンジポンプである。
一般に、液体流体の流れを、本明細書に記載された実施形態に関して使用してきたが、本発明の方法またはデバイスにおける細胞の流れは、様々な手段によって実現することができることが理解されるべきである。したがって、細胞は、流体中で流すことができるが、細胞は、毛管現象を使用して流すこともできる。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、減圧下で流される。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも部分的に、１つまたは複数の力、例えば、引力、界面動電力、遠心力、およびこれらの組合せなどによって流される。
以下の実施例は、本発明を構成し、実施するための好ましい態様のいくつかを記載する。しかしながら、これらの実施例は説明の目的のためだけにあり、本発明の範囲を限定することを意味しないことは理解されるべきである。さらに、実施例の記載が過去形で示されていなければ、テキストは明細書の残り部分のように、実験が実際に行われたか、データが実際に得られたことを示唆するようには意図されていない。
（実施例１）
Ｐ−セレクチンをコーティングした表面
表面上の生体分子の提示を制御することができることは、本明細書に記載されたものなどのある特定の適用において望ましい場合がある。例えば、表面上の生体分子の密度および立体構造を制御し、およびそのようにコーティングされた表面の安定性を増強することにより、特定の用途のためにこのような表面の調整が可能となろう。また、第２の分子の共固定化は、間充織幹／前駆細胞などのある特定のタイプの部分集団の選択的な分離を促進することができる。
生物学的に活性な種の共有結合的固定化は、密度、立体構造、および増大した安定性などのパラメータを制御するのに有利である場合がある。ペプチドおよび酵素のための共有結合的固定化手段は数十年間研究されてきたが、セレクチンなどの大きな分子量の生体分子を共有結合的に固定化することは重要な課題を提示する。このような挑戦の中には、非特異的な部位への結合の増加、およびタンパク質の不活性化を防ぐための穏やかな処理条件についての要件がある。
本実施例において、Ｐ−セレクチンは、ガラス基板上に共有結合的に固定化され、このようにコーティングされた表面の特徴（例えば、Ｐ−セレクチン分子の配向、密度、および安定性など）が検討された。
材料および方法
組換えヒトＰ−セレクチン／Ｆｃキメラ（Ｐ−セレクチン）およびヒトＦｃ抗体断片をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。ＳｕｐｅｒＣｌｅａｎの未修飾のスライドガラスおよびＳｕｐｅｒＥｐｏｘｙ（登録商標）（ＡｒｒａｙＩｔ（登録商標））を機能的にしたスライドをＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から得た。ヘテロ二機能性ポリ（エチレングリコール）（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）をＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）から得た。９．９５μｍの直径を備えたＳｕｐｅｒＡｖｉｄｉｎ（商標）をコーティングしたマイクロスフェアをＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。多価のビオチン化されたシアリルルイス（ｘ）−ポリ（アクリルアミド）（ｓＬｅｘ−ＰＡＡビオチン）および２５０μｍ厚のガスケットを備えた矩形の平行プレートのフローチャンバーをＧｌｙｃｏｔｅｃｈから得た。本実施例で使用される他のすべての化学薬品は、Ｓｉｇｎａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
指定がなければ、本実施例で使用された材料は、さらに精製せずに使用した。
表面の調製
図８に例証されるように、エポキシ基（ＳｕｐｅｒＥｐｏｘｙ（登録商標））を含んでいるガラス基板は、Ｐ−セレクチンおよび汚れていない表面に反応部位（カルボキシ末端）を与えるためのスペーサーとして、５ｍｇ／ｍＬの二機能性のポリ（エチレングリコール）（Ｍｎ５，０００）で最初にコーティングされた。ＰＥＧリンカー上のカルボン酸基は、ＥＤＣとＮＨＳを用いて予め活性化され、次に室温で一晩、Ｐ−セレクチン溶液（５μｇ／ｍＬ）と反応させた。得られた表面は、ＰＢＳで十分に洗浄し、後の使用のために４℃で貯蔵した。また、Ｐ−セレクチンを物理吸着させた表面は、平滑なガラス、および比較のために使用されるＥＤＣ／ＮＨＳを活性せずにＰＥＧ化されたガラス上で調製された。固定化プロセスの工程はそれぞれ、接触角測定およびＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって確認された（データ示さず）。
結果および検討
以下に検討されるように、Ｐ−セレクチンをコーティングした表面は、エポキシでコーティングされたスライド上で調製され、分析された。
マイクロスフェアおよび生細胞のローリングにより決定される増強された機能的な安定性
アビジンをコーティングしたマイクロスフェアは、多価のビオチン化されたシアリルルイス（ｘ）−ポリ（アクリルアミド）（ｓＬｅｘ−ＰＡＡ−ビオチン）とコンジュゲートされ、細胞模倣物として使用された。マイクロスフェアコンジュゲートを使用するフロー実験のために、厚さ２５０μｍのガスケットを備えた矩形の平行プレート・フローチャンバーは、Ｐ−セレクチンを用いてガラス表面上に置いた。多価のｓＬｅｘをコーティングしたマイクロスフェア（およそ５×１０５／ｍＬ）は、およそ０．２４ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断応力でフローチャンバーへ灌流させられた。画像は５秒ごとに得て、速度（少なくとも２０個のマイクロスフェアに対して平均される）は連続する画像中で各マイクロスフェアの置換を測定することにより計算された。
新たに調製された表面は、修飾されていない表面と比較して、顕著に低いマイクロスフェア速度を示した。マイクロスフェアコンジュゲートは、３０〜４０μｍ／ｓの平均速度でＰ−セレクチンなしでＰＥＧ化された表面で移動した。それは、ゴールドマンの計算によれば、５７μｍ／ｓという合理的な一致にあった（Ｇｏｌｄｍａｎら、１９６７年、「Ｓｌｏｗ ｖｉｓｃｏｕｏｓ ｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｐｈｅｒｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｔｏ ａ ｐｌａｎｅ ｗａｌｌ． ＩＩ Ｃｏｕｅｔｔｅ ｆｌｏｗ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２巻：６５３〜６６０頁、その全内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
ＰＢＳ中、室温で２１日後、エポキシのガラス上に共有結合的に固定化されたＰ−セレクチンは、物理吸着されたＰ−セレクチンおよび不活性化された表面（ＮＨＳ／ＥＤＣなし）と比較して、著しく良好に長期安定性を示した。Ｐ−セレクチンを固定化した表面（予め活性化されている）は、Ｐ−セレクチンのないＰＥＧ化されたエポキシ表面上のそれらの速度の約４０％で移動するマイクロスフェアと共に、マイクロスフェア速度の最も高い減少を示した。ＥＤＣ／ＮＨＳで処理されていないエポキシガラスおよびＰ−セレクチン吸着された平らなガラス上に固定化されたＰ−セレクチンは、マイクロスフェアコンジュゲートが比較的速く移動するのを可能にした。ＥＤＣ／ＮＨＳで処理していない、Ｐ−セレクチンを固定化したエポキシ上で、およびＰ−セレクチンを吸着された平らなガラス上で、ｓＬｅｘ−ＰＡＡコンジュゲートしたマイクロスフェアは、Ｐ−セレクチンのないＰＥＧ化されたエポキシ表面上で、それぞれ、それらの速度の約８５％および約７０％で移動した。
固定化されたＰ−セレクチンとの好中球ローリング相互作用もフローの下の並列のプレートのチャンバーを使用して調査された。２．５×１０５／ｍＬの好中球の懸濁液は、１から１０ｄｙｎ／ｃｍ２に及ぶ壁剪断応力に対応する異なる流量でチャンバーに灌流された。細胞は、視野（１０×対物を用いた場合の８６４×６４８μｍ２）に維持しながら＞１０秒間回転し、相互作用していない細胞の計算された自由流速度の５０％未満の平均速度で平行移動した場合、回転として分類された。Ｐ−セレクチン（つまり平面ガラス、およびＰＥＧ化されたエポキシのスライドガラス）がない対照表面は、細胞粘着を示さなかった（データ示さず）。
共有結合的に固定化されたＰ−セレクチンの安定性は、４つの異なる壁剪断応力（１、３、５および１０ｄｙｎ／ｃｍ２）でのこのインビトロの細胞ローリングアッセイから明らかである。回転する細胞の数は、Ｐ−セレクチンの物理吸着によって調製された表面について、時間とともに顕著に減少したが、調製後の２８日でさえ共有結合的に固定化されたＰ−セレクチンについては影響されないままであった（図１０Ａおよび１０Ｂ）。具体的には、３ｄｙｎ／ｃｍ２で、共有結合的に固定化されたＰ−セレクチンを有する、時間が経過した表面上の回転フラックスは有意な減少は示さなかった（８０．６±１９．１％（平均±ＳＥＭ））が、時間が経過したＰ−セレクチンが吸着した表面のフラックスは、それぞれ３０．１±５．２％まで低下した。
ＳＰＲを使用する共有結合的な固定化のリアルタイム分析
定量的に固定化学およびリガンド結合に対するそれらの影響を特徴付けるために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が使用された。この流れに基づいたＳＰＲシステムは：１）金の層の存在により、チオール化学を用いて容易な表面機能化、および２）分析物をいかなる修飾もしないで、結合事象の定量的かつリアルタイムモニタリングを提供する。したがって、ＳＰＲ技術は、特にＰ−セレクチンの密度および配向の制御性を決定するために有用である。
本発明者らは、付着していない表面特性を達成し、オリゴ（エチレングリコール）−アルカンチオール（Ｐｒｏｃｈｉｍｉａ、Ｐｏｌａｎｄ）を使用して、金をコーティングしたＳＰＲチップ上へ、続くＰ−セレクチン固定化のための反応部位を提供するための化学を開発した。付着していないＰＥＧ表面上の固定化は有利である。それは以下の理由からである：１）ＰＥＧ−ＯＨ基の高い含有量による非特異的な相互作用を減少させ、２）二および単機能的ＰＥＧ成分間の比率を変更することによって密度／配向の調節性を促進し、様々なＰ−セレクチン濃度を使用することよりも容易であり、再現性があり、および３）同じ表面上への多数の化学の導入を潜在的に可能にする。
自己集合した単分子層（ＳＡＭ）は、室温で一晩、エタノール中のＯＥＧ−アルカンチオールの１００μＭ溶液に純金をコーティングした基板を浸すことにより形成された。様々なＯＥＧ−アルカンチオールの以下の混合物は指示されたモル比で使用された：
ＯＥＧ−ＣＯＯＨ：ＯＥＧ−ＯＨ（１：３９、１：９、３：７、５：５）およびＯＥＧビオチン：ＯＥＧ−ＯＨ（１：９）。ＳＰＲ機器導入に前に、ＳＡＭをリンスし、乾燥させ、および脱気体した。
Ｐ−セレクチンは、図１０Ａに示されるように、ＯＥＧ−ＣＯＯＨ／ＯＥＧ−ＯＨの混合されたＳＡＭの表面上に固定化された。１０ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢ）を、５０μＬ／分の流速で５分間、最初にチップに流した。過剰のＥＤＣとＮＨＳの１：１（ｖ／ｖ）混合物は、１０分間、ＳＡＭ上のカルボキシル基を活性化するために注入された。５分間流した後、ＰＢ中、２０μｇ／ｍＬ濃度のＰ−セレクチンを注入し、７分間、固定のために流した。その後、チップ表面はＰＢで５分間洗浄し、次にエタノールアミン（ＰＢ中、１００ｍＭ）で処理し、残っている活性なエステル基を不活性化し、表面から緩く結合されたＰ−セレクチンを取り除いた。
ＯＥＧ−ビオチン／ＯＥＧ−ＯＨの混合ＳＡＭ上のＰ−セレクチン固定化について、Ｐ−セレクチンは、図１０Ｂに示されるように、ＳＰＲ測定前にマレイミド−ＰＥＯ２−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して最初にビオチニル化された。１ｍｇ／ｍＬのＰ−セレクチン（ＰＢＳ中）の５０μＬのＰ−セレクチン溶液は、４℃で一晩、５０モルを超えるマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン溶液と混合した。反応混合物は、１０Ｋの分子量をカットオフするメンブレンを使用して、４サイクルの限外ろ過によって精製された。各サイクルは３０分間１４，０００×ｇで行われた。ＯＥＧビオチン／ＯＥＧ−ＯＨの混合ＳＡＭはＳＰＲ上に取り付けられ、１０μｇ／ｍＬストレプトアビジン（ＰＢＳ中）を１０分間流し、ビオチン化されたＰ−セレクチンのための結合部位を作成した。その後、Ｐ−セレクチンは、強いビオチン／アビジン結合を介して、他の混合ＳＡＭ表面のために使用されたのと同じ条件下で固定された。ＳＰＲにおける固定化は５０μＬ／分の流速で実行された。
ＳＰＲによって特徴付けられた安定した調整可能なＰ−セレクチンの固定化表面
共有結合的固定化を物理吸着と比較するために、いくつかのＳＰＲチャネルが参照チャネルとして使用され、この場合、Ｐ−セレクチンはＥＤＣ／ＮＨＳ活性化のない表面上に吸着された。共有結合的に固定化されたＰ−セレクチンは安定しているように見えたのに対し、１５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝食塩水で洗浄した場合、物理吸着されたＰ−セレクチンは表面から容易に脱着された（図１１）。Ｐ−セレクチンの密度を調節するために、異なる比率（図１０Ａに示される化学を使用して）でＯＥＧ−ＣＯＯＨ／ＯＥＧ−ＯＨの混合ＳＡＭを使用し、Ｐ−セレクチンは上記されたのと同じ条件下で固定化された。図１１Ａは、Ｐ−セレクチンの量が、−ＣＯＯＨを含むＳＡＭ成分の量に直線的に比例していることを示す。このようにして、固定化密度は、混合ＳＡＭを使用して制御することができる。
また、Ｐ−セレクチンの配向効果は、図１０Ａ（任意の構造）および図１０Ｂ（配向された構造）における２種の化学を比較することにより検討された。Ｐ−セレクチン分子は、表面上の−ＣＯＯＨ基と反応し得る多くのアミン基を有するため、Ｐ−セレクチンの構造は任意であるべきである。対照的に、Ｐ−セレクチンは、Ｎ末端の活性な結合部位の反対側にその７６６番目のアミノ酸（この研究の中で使用されるＰ−セレクチンはその自然な形態の１〜７７１アミノ酸からなる）として唯一のシステインを有することが公知である。両方の化学を使用して調製されたチャネルについては、比較可能な量のＰ−セレクチンが、最初に固定化され（波長シフトは約１２ｎｍ）、その後、２０μＬ／分の流速で、２０μｇ／ｍＬのＰ−セレクチン抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を流した。配向したＰ−セレクチンを有するチャネルは、任意に固定化されたＰ−セレクチンを有するチャネルよりも有意に大きな結合反応を示し（図１１Ｂ）、Ｐ−セレクチンの配向がチオエーテル化学の使用により制御されたことを示した。
共有結合的固定化に関するこの予備研究では、本発明者らは、Ｐ−セレクチンが表面上に共有結合的固定化できることを示し、それは、より良好な安定性（物理吸着と比較して）およびＰ−セレクチンの密度および配向の制御を提供する。これらの結果は、開発された化学を使用して、安定して調整可能な表面を調製することができることを示唆する。安定して調整可能な表面は、不変性、および細胞の部分集団の有効な分離に特に有利である場合がある。
（実施例２）
基板上のＰ−セレクチン縁部の作成
本明細書に記載されるように、縁部を有するコーティングされた表面は、細胞ローリングに基づく分離を促進することができる。本実施例において、Ｐ−セレクチンコーティング範囲とコーティングされていない範囲の間の縁部は、シリコーンゴムマスクを使用してガラス基板に作成された。
材料および方法
ヒトのＰ−セレクチン／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、Ｐ−セレクチンの物理吸着中にＰ−セレクチン吸着からガラス基板の一部を防ぐためにブロックとしてシリコーンガスケットを使用して、汚れていないスライドガラス（ＳｕｐｅｒＣｌｅａｎ２、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ Ｉｎｃ．）に置かれた。汚れていないシリコーン片は、スライドガラスの縁部への所望の角度で整列したそれらの縁部でスライドガラスに置かれた。スライドガラスは、１×ＰＢＳで２回リンスされ、５μｇ／ｍＬのＰ−セレクチン（１×ＰＢＳ中）が、スライドの露出した範囲で一晩吸着された。その後、スライドを１×ＰＢＳでリンスし、シリコーン片を取り除き、全表面は５％ＦＢＳまたはＢＳＡでブロックされた。いくつかのスライドについては、ＢＳＡ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が、Ｐ−セレクチンでコーティングされた範囲を視覚化するために、ブロック用にＢＳＡまたはＦＢＳの代わりに使用された。
結果および検討
Ｐ−セレクチンの共有結合的固定化は、機能的な安定性などの表面特性を増強するが、概念実証試験は長期安定性を必要とせず、ガラス基板上のＰ−セレクチンの物理吸着は十分である。ガラス基板にＰ−セレクチンを置くために、Ｐ−セレクチンの選択的物理吸着がシリコーンゴムマスクを使用して達成された（図１２）。ブロッキング工程中にフルオレセインイソチオシアネートでコンジュゲートされたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ−ＦＩＴＣ）の使用は、Ｐ−セレクチンをコーティングした範囲と比較して、シリコーンマスクによって占められた範囲でＢＳＡの選択吸着を示した。コーティング範囲は明確な縁部を有し、シリコーンマスクが物理吸着ステップ中に漏れなかったことを示す。さらに、細胞がこの基板上に流されたとき、細胞は、Ｐ−セレクチンでコーティングされた部位と選択的に相互作用し、技術の成功を確認した（図１Ａ、１Ｂおよび１３Ｅ）。
（実施例３）
角のある縁部を含む基板上での細胞ローリングの方向づけ
本実施例において、細胞ローリングの方向は、流体の流れの方向に角のある縁部を有するコーティングされた表面を形成するＰ−セレクチン分子を含む基板を使用すると影響を受け、角のある縁部に沿った細胞ローリングを用いて細胞を分離する潜在的な実施可能性を示した。
材料および方法
実施例２に記載されているように、Ｐ−セレクチンをコーティングした表面が生成され、コーティングされた領域とコーティングされていない領域の間に縁部を有する。流れの方法に関して、様々な方法で縁部に角度を付した。
フローチャンバーでの細胞およびマイクロスフェアのローリング実験
細胞およびマイクロスフェアのローリング実験は、市販されている、幅１ｃｍ、長さ６ｃｍ、深さ１２５μｍの矩形の平行板フローチャンバーで行われた（マイクロスフェアは２５０μｍ）（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）。細胞培地中の３〜５×１０５／ｍＬの密度のＨＬ−６０細胞、または１％のＢＳＡを含む１×ＰＢＳ緩衝液中の１０５／ｍＬの密度のマイクロスフェアは、流量の調節のためにシリンジポンプ（Ｎｅｗ Ｅｒａ Ｐｕｍｐ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）上に取り付けられた５ｍＬ注射器に装填された。流速は、５０〜２０００μＬ／分の間で変更し、対応剪断応力は０．３２〜１２．８ｄｙｎ／ｃｍ２（０．０３２〜１．２８Ｐａ）であった。細胞が流されたとき、５μｇ／ｍＬのヒトＦｃ断片は、Ｐ−セレクチンキメラのＦｃ部分とＨＬ−６０細胞の相互作用を最小にするために実験前に細胞懸濁液に添加された。フローチャンバーは、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００ Ｚｅｉｓｓ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｎｗｏｏｄ、ＮＹ）に取り付けられ、画像は、１０×対物を用いて、典型的には細胞ローリングについては１フレーム／秒、および１〜４分の持続期間に回転するマイクロスフェアについては３フレーム／秒で得た。フローは薄板であり（Ｒｅ約０．１〜３）、剪断応力（τ）は方程式
を使用して、平面Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅ流を用いて計算した。
式中、μは動粘性率であり、Ｑは体積流速であり、ｗはフローチャンバーの幅であり、ｈはフローチャンバーの高さである。
データ分析
データ分析を促進するために、画像は、明るさ、コントラスト、およびガンマ補正について同程度に調節され、粒子トラッキングフリーウェアの周辺で構築された社内製Ｍａｔｌａｂ粒子トラッキングソフトウェアを使用して処理された。画像は、細胞を同定するために空間フィルターと明るさ閾値を用いてフィルターにかけられた。このステップは、スプリアス効果が画像処理中になかったことを確証するために、Ｍａｔｌａｂによって生じた細胞位置のプロットと実像を比較することにより確認された。細胞位置は、ピクセル図心を位置づけるためにピクセル強度全体を平均することにより、サブピクセル解像度でさらに位置づけた。全セットの画像に関するこれらのデータは、各時点で回転している細胞の位置を列挙する粒子行路に統一された。１画像にも細胞がいない行路を廃棄し、細胞が有意な移動を示さなかった動かない細胞に対応する行路も同様であった（画像全体にわたって３０μｍ）。粒子工程プログラムは、１フレームあたり１５μｍの最大移動の閾値に設定された；したがって、流れるように動く細胞は追跡されなかった。最終結果は、各時間点で各細胞の位置のリストであり、それを視覚化および更なる分析に使用することができた。平均の細胞速度は、行路の開始位置と終了位置の間に移動を経過時間で割ることにより得られた。行路がＰ−セレクチンをコーティングした領域中にのみ存在していたので、Ｐ−セレクチンをコーティングした領域の縁部は粒子行路から容易に同定され、線によって表すことができた。細胞ローリングに対する縁部の影響を解明するために、縁部の１５μｍ内で開始した行路は速度について分析され、縁部の９０μｍを越えて開始した行路と比較した。平均速度および速度分布は、各セットの行路について得られた。また、マイクロスフェアデータを同様に分析した。
結果および検討
本発明者らは、回転しているＨＬ−６０細胞の運動に対するＰ−セレクチンの単一の縁部の影響を調査した。この細胞は、セレクチン上で回転する細胞を媒介する高レベルのＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）を発現するヒト骨髄性細胞株である。ＨＬ−６０細胞のローリング挙動は、剪断速度、細胞剛性およびトポロジーへの依存性、ならびにマイクロ流体デバイスへの捕捉を含む多くの研究において特徴付けられた。ＨＬ−６０細胞は、強健で、維持するのが容易であり、さらに、それらを概念実証に適した候補にさせる、白血球に匹敵するＰＳＧＬ−１のレベルを発現する。
３〜５×１０５細胞／ｍＬの密度のＨＬ−６０細胞の懸濁液は、市販のフローチャンバーを用いて、約０．３２〜約１２．８ｄｙｎ／ｃｍ２（０．０３〜１．２８Ｐａ）の剪断応力で、実施例２において生成された基板上に流された。フローチャンバーは、幅１ｃｍ、高さが１２５μｍ（細胞用）または２５０μｍ（マイクロスフェア用）、長さ６ｃｍの矩形であり、いずれかの末端には入口および出口を備えていた。
ほんのいくつかの細胞は表面と相互作用し、残りの細胞は、表面と相互作用せずにチャンバーを通過して流れた。表面と相互作用した細胞だけを分析した。ＨＬ−６０細胞の選択的なローリングはＰ−セレクチンをコーティングした領域上で観察され、細胞が接着結合の形成によって妨害されない、ＢＳＡをコーティングした領域上のものよりも遅い細胞ローリング速度であった。本発明者らの実験において、回転している細胞の典型的な速度は約０．３２から約１２．８ｄｙｎ／ｃｍ２の範囲の剪断応力については、約０．３〜約１．２μｍ／ｓの範囲であり、他の研究で報告されている細胞ローリング速度に匹敵するか、またはそれより小さい。
顕著には、回転しているＨＬ−６０細胞がＰ−セレクチン領域の縁部に直面した場合、それらの細胞は、縁部の方向に沿った移動の元の方向から転換され、縁部は、実際に、一時的な受容体−リガンドの接着結合を通じて細胞の輸送を制御するために使用され得ることを示した。この特定の実験の条件下では、この効果は、縁部と流れの方向の間で小さな角度（＜ｃａ．１０〜１５°）に関してのみ観察され、縁部に直面したほぼすべての細胞は、移動のそれらの元の方向から歪められ、Ｐ−セレクチンの縁部を追跡するように強いられた。縁部効果はより大きな縁部角度では観察されなかった；縁部に直面した細胞は、基板から離れ、流体の流れの方向に流れ続けた。したがって、この特定の実験条件では、細胞の移動方向は、より小さな縁部角度でのみ変更することができる。図１２は、２個の細胞をハイライトで表示して、１．９ｄｙｎ／ｃｍ２（３００μＬ／分）の剪断応力下で回転する細胞のスナップショットを示し、Ｐ−セレクチンをコーティングした領域の１個の細胞は縁部に直面しなかった。別の細胞は、縁部に直面し、縁部に沿って移動することを強いられた。縁部に直面した細胞は流体の流れの方向からそれ、縁部に直面しなかった他の細胞に関しては８．６°の角度で移動し、これは、単一のＰ−セレクチン縁部を使用して、細胞ローリングの方向を実質的に変更し、したがって回転している細胞の輸送を制御することができることを示した。
細胞のローリング挙動を分析するために、画像シーケンスをＭａｔｌａｂを使用して処理した。静的に接着した細胞をフィルターにかけ、個々の細胞の行路をプロットした。これは、縁部で回転する細胞、およびＰ−セレクチン領域内で回転する細胞の異なる移動方向を明らかに示した（図１４Ａ）。表面で回転した細胞だけが追跡されるように、画像獲得率および処理パラメータを設定した。回転した細胞と比較して、迅速にローリング移動しなかった細胞、および１つのフレームあたりのそれらの大きな置換は、回転し、自由に流れるように動く細胞を同時に追跡することを不可能にした。ブロックされた領域には行路は見られなかった。これは、細胞のどれもその領域で回転しなかったことを反映している。縁部に直面したＰ−セレクチン領域で回転する細胞は、縁部を越えて回転する代わりに、その上で回転することを強いられ、流体の流れに対する角度で輸送されている移動細胞の蓄積をもたらした。この効果は、ある期間に蓄積された静的に接着した細胞のために、プロットされた行路では明らかである（図１４Ａ）が、画像では明確ではない（図１４）。Ｐ−セレクチン縁部の影響は、より長い細胞行路だけをプロットすると非常に明らかである（図１４Ｂ）。
細胞ローリングに対する縁部の影響を解明するために、行路を２つのセットに分割した：（ａ）縁部から３０μｍの距離内で開始する行路（縁部に直面した細胞）、および（ｂ）縁部の９０μｍの距離を越えて開始した行路（縁部によって影響を受けなかった細胞）。各行路の移動方向が同定され、ヒストグラムとしてプロットされた（図１４Ｃ）。０の角度は、Ｐ−セレクチン領域で回転する細胞の平均方向に対応する。縁部に直面した細胞の移動方向は、４〜１０°の他の細胞の移動の平均方向と明らかに異なっていた。この分析は、回転している細胞の移動方向を制御する縁部の能力をさらに確認した。さらに、縁部近くの細胞は、およそ１μｍ／ｓの平均速度で回転したのに対して、縁部から離れた細胞は、およそ０．５μｍ／ｓの平均速度で回転していた。これらの結果は、Ｐ−セレクチン縁部が、（ａ）ローリング方向を変更し、（ｂ）ローリング速度を増加させることにより、回転している細胞の輸送の調節を可能にすることを示した。
同様の実験は、Ｐ−セレクチンとの一時的な結合を形成し、細胞ローリングを研究するためのモデルとして使用される、シアリルルイス（ｘ）（ｓＬｅｘ）をコーティングしたマイクロスフェアを用いて行われた。マイクロスフェアは、Ｐ−セレクチン領域上で選択的に回転し、平均速度が約３〜４μｍ／ｓであり、流速は約２００μＬ／分であった。これは、約０．３３ｄｙｎ／ｃｍ２（０．０３３Ｐａ）の剪断応力に相当する。この速度は、Ｐ−セレクチン上で回転する、ｓＬｅｘをコーティングしたマイクロスフェアに関する本発明者らの以前に取得したデータに合致している。それにも関わらず、Ｐ−セレクチン縁部は、マイクロスフェアのローリングの方向に有意な効果はなかった。縁部に直面したほとんどすべてのマイクロスフェアは、縁部を越え、それらの移動方向は変わらないままであった（図１４Ｄ）。これらのマイクロスフェアに対応する行路は、それを続ける代わりに縁部で終了した。一度、マイクロスフェアが縁部から離れていると、それらは流体の流れの方向に流れ続け、非常な高速度のためにもはや追跡されなかった。
この観察は、Ｐ−セレクチンをコーティングした表面上の同様のローリング挙動を示す２つのタイプの粒子がＰ−セレクチン縁部で劇的に異なるローリング挙動を示し得ることを示す。縁部の細胞およびマイクロスフェアのローリング挙動のこの顕著な相違は、一次元のローリングにおいては明らかでなく、縁部効果はそれらのナノ機構特性に基づいてローリング粒子を区別することができることを示唆する。理論に捕らわれることなしに、細胞が縁部に直面した場合、流体の流れに起因して細胞に作用する正味の力と、接着結合切断として発揮される力の消失は、細胞を非対称なローリングの動きにさせ、縁部を追跡するように引き起こすことが提案される（図１５）。流体の流れの方向にローリング運動を駆動するモーメントは、Ｆｄｒａｇ×ａのオーダーであることが期待されてもよく、この場合、ａは細胞またはマイクロスフェアの半径であり、およびＦｄｒａｇは細胞に作用する流体力である。細胞に縁部を追跡するようにさせる非対称モーメントは、Ｆｄｒｕｇ×ｌｃｏｎｔａｃｔとして計ることが期待されてもよく、この場合、ｌｃｏｎｔａｃｔは、細胞またはマイクロスフェアが基板と相互作用する接触領域の長さの尺度である。細胞またはマイクロスフェアに作用する正味の力が接着結合のために力と協調するので、接触の範囲が非常に小さい場合、すなわち、Ｆｄｒａｇ×ｌｃｏｎｔａｃｔがこの非対称の動きを持続するには十分に大きくないが、Ｆｄｒａｇ×ａが相対的に不変のままである場合、この非対称モーメントは消えることが期待されてもよい。硬いマイクロスフェアについては、接触長さは、約０．４〜約０．６μｍに制限され、結合または結合分子のいずれかは約５〜約１０ｎｍまで及ぶことができると想定される。それにも関わらず、細胞ローリングは、その変形能を含む細胞の機械的特性、ならびに絨毛様突起の大きさおよび伸長性に依存してもよく、接触長さは、回転しているＨＬ−６０細胞については、数マイクロメートルの長さであってもよい。さらに、回転している細胞は、回転している細胞と基板の間の相互作用の領域を効果的に増加させる数マイクロメートルに絨毛様突起の伸長に起因して、長い綱（ｔｅｔｈｅｒ）を伸ばすことができる。いずれかの特定の理論によって拘束されずに、長い綱を伸ばす能力の不足は、ｓＬｅｘをコーティングしたマイクロスフェアがＰ−セレクチン領域上で選択的に回転し、流体の流れの方向で小さな角度を作ったときさえ縁部を追跡しなかった理由であってもよい。
本実施例は、細胞ローリングを媒介する受容体の配置によって、標識なしの方法で特定の受容体−リガンドの相互作用に基づいた細胞の輸送を調節することができること示す。Ｐ−セレクチンの単一の縁部は、細胞が他には回転する流体の流れの方向に関して、回転しているＨＬ−６０細胞の軌道を実質的に変更することができた；同時に、Ｐ−セレクチンの単一の縁部は、非常に小さな程度まで回転しているマイクロスフェアに影響を及ぼした。
（実施例４）
マイクロ流体デバイス
本発明者らは、細胞分離用の縁部上でのローリングを使用するマイクロ流体デバイスを開発した。このデバイスは、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）にソフトリソグラフィーを用いて作製された。最初に、マイクロ流体パターニング（Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅ， Ｅ．ら、１９９７年、「Ｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｔｏ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｕｓｉｎｇ マイクロ流体 ｎｅｔｗｏｒｋｓ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６巻（５３１３号）：７７９〜７８頁、その全内容は参照により全体として本明細書に援用される）を用いて、ガラスまたはポリスチレン基板上のＰ−セレクチンのラインを規定した。その後、デバイスは、３０μｍ〜２５０μｍの範囲の高さを有するフローチャンバーを形成するための基板上にＰＤＭＳ成分を保持するのに真空マニホールドを使用して組み立てられた（図１６）。デバイスは、細胞と緩衝液の流れのための個別の入口を含んでいた。この配置は、いずれの細胞も含まない緩衝液の流れと共に細胞流の並列の流れを可能にする。
細胞分離用の概念実証として、本発明者らは、本デバイス中のＰ−セレクチン配置は、Ｐ−セレクチン縁部に沿って回転する細胞を導くことによって、細胞流の外側に細胞を軽く突くことができるかどうか調べた。ＨＬ−６０細胞およびマイクロスフェアおよび緩衝液流を含む流れがデバイスを通して流されると、細胞流中の細胞のいくつかは基板上のＰ−セレクチン縁部で束縛され、回転した。流れている細胞流に関して、縁部が作る角度により、これらの細胞は、細胞流から外に軽く突かれ、したがって、元の流れにおいてマイクロスフェアから分離された（図１６Ｂ）。この結果は、細胞ローリングに基づいた細胞分離デバイスを作成する実施可能性をさらに示す。
（実施例５）
縁部を含む基板上での間充織幹／先駆細胞（ＭＳＰＣ）ローリングの特徴付け
この実施例において、流体の流れ方向に関してＭＳＰＣのローリング方向に対するＰ−セレクチン配置の影響を調査する。この実験の目標は、回転している細胞の軌道を指向し、それが、大きさ、リガンド密度、および変形能などの細胞特性にどのように依存するかを調べる配置の能力を最大にすることである。
ローリング実験は、セレクチン縁部を有するスライドガラス（基板）を使用して、標準の市販のフローセル（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）中で行われる。ＧＦＰの細胞質発現を有するＭＳＰＣが使用される。製造業者によって指定されるように、細胞は、Ｌｏｎｚａ ＭＳＰＣ増殖培地中で維持される。ＭＳＣアイデンティティを確保するために、ＭＳＣは様々な陽性および陰性細胞マーカー（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ， ＣＪ．ら、２００１年、「ＣＤ４４ ｉｓ ａ ｍａｊｏｒ Ｅ− ｓｅｌｅｃｔｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５３巻（６号）：１２７７〜１２８６頁； Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ， Ｍ．Ｆ．、１９９９年、「Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４巻（５４１１号）：１４３〜７頁；およびＣａｐｌａｎ， Ａ．Ｉ．、１９９１年、「Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．」、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ、９巻（５号）：６４１〜５０頁、各々の文献の全内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。陽性のマーカーには、ＣＤ９０、ＣＤ１４６、ＣＤ４４およびＣＤ２９が含まれる。陰性の細胞マーカーには、ＣＤ４５とＣＤ３４を含む２つの特異的な造血性細胞表面マーカーが含まれる。細胞は非酵素性の細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ）で１０分間培養される。１％ＦＢＳおよび０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄後、４０μｍの細胞ろ過器を用いてろ過し、以下のマウスＩｇＧ、κ抗体を用いて３０分間インキュベートされる：１）ＣＤ３４フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）をコンジュゲートした抗体（ＦＡＣＳ緩衝液で希釈される）、２）ＣＤ４５ ＦＩＴＣコンジュゲート抗体、３）ＣＤ９０ ＦＩＴＣコンジュゲート抗体、４）ＣＤ１４６ Ｒフィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）をコンジュゲートした抗体、５）ＣＤ４４ ＦＩＴＣコンジュゲート抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ３０４０５）、およびＣＤ２９ ＰＥコンジュゲート抗体（ＦＡＢ１７７８１Ｐ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＸＣＲ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ１７３Ｐ）。
また、ＭＳＰＣは、Ｆｃ領域を含むＰ−セレクチンを使用してＰ−セレクチン部分の発現について特徴付けられる。さらに、細胞が分化する能力は、ＣＦＵ−ＦおよびＣＦＵ−Ｏアッセイを用いて確認される。（実施例７を参照）。また、ＭＳＣの多系統分化可能性を確保するために、Ｌｏｎｚａの脂質生成のＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔキットを用い、その後、オイル・レッドＯ染色、ならびにＦＡＢＰ４抗体（ＡＦ３１５０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＦＡＣ分析によって調べられる。ニコンＴＥ２０００Ｕ顕微鏡を用いて画像を獲得し、本明細書に記載された他の作業における場合などのＭａｔｌａｂを使用して分析される。特異的な共有結合的化学は、予め金でパターニングした基板上のＰ−セレクチンを固定化するために使用される。このアプローチは、物理吸着と比較した共有結合的化学の利点、ならびにマイクロ流体パターニングおよびマイクロ接触プリンティングなどの他のアプローチと比較した、反復、強健さおよび制御について選択される。
金の薄層（約１０ｎｍ）は、スライドガラス上で蒸着し、標準リソグラフィー技術を使用してパターン化される。１０ｎｍの金膜は、金膜を通じて回転する細胞の可視性を促進するために選ばれる（Ｍｒｋｓｉｃｈ， Ｍ．ら、１９９６年、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｎ ｃｏｎｔｏｕｒｅｄ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｗｉｔｈ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｆ ａｌｋａｎｅｔｈｉｏｌａｔｅｓ ｏｎ ｇｏｌｄ．」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、９３巻（２０号）：１０７７５〜１０７７８頁、その全内容は参照により全体として本明細書中に援用される）。金蒸着後、ガラス表面上のＰ−セレクチンの吸着をブロックするために、スライドガラスをＰＥＯ−シラン（２−（メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル）トリメトキシシラン、Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ．）で処理する。次に、Ｐ−セレクチンは、チオール化学を用いて金の表面上で固定される。金をコーティングした領域上で、オリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）を含むアルカンチオールを最初にコンジュゲートして、汚染のない自己集合した単層（ＳＡＭ）を調製する。Ｐ−セレクチンの密度および配向を制御するために、単および二機能性ＯＥＧ−アルカンチオールが使用される。例えば、ＳＨ−（ＣＨ２）ｍ−（ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＯＨと、ＳＨ−（ＣＨ２）ｍ−（ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＯＯＨまたはＳＨ−（ＣＨ２）ｍ−（ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＮＨ２のいずれかの間の混合比を変更させることによって、Ｐ−セレクチンと反応することができる反応部位（−ＣＯＯＨ または−ＮＨ２）の密度が制御され得て、結果として表面上のＰ−セレクチン密度が調節される。加えて、二機能性のＯＥＧ−アルカンチオールをさらに、スルホ−（スクシインイミジル ４−［Ｎ−マレイミドエチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（スルホ−ＳＭＣＣ）と反応させ、Ｐ−セレクチンの配向を制御することができる。Ｐ−セレクチンは、付着性アミン末端の配向の制御を許すチオール基を含む唯一のシステイン残基（付着部位の反対側に位置する７６６番目のアミノ酸）を有することに留意されたい（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｔ． ら、１９９３年、「Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ ｉｓ ａｃｙｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ ａｔ ｃｙｓｔｅｉｎ−７６６ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ ｌｉｎｋａｇｅ．」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６８巻（１５頁）：１１３９４〜１１４００頁）。次に、全表面は、１×ＰＢＳ中のＦＢＳの５％の溶液でブロックされる。
回転している細胞の偏向を最大にするＰ−セレクチン縁部の決定
セレクチン細片の幅（ｗｓ）、ギャップ幅（ｗｇ）、および流れ方向に対する角度（αｓ）によって規定されるセレクチンの細片（複数）を含む基本の配置を使用することになる。最小のパターン次元（約０．５μｍ）は、リソグラフィー解像度によって決定される。予備データは、これらの特定の実験の条件下で、細胞が、ラージαｓについての縁部によって指向することができないことを示す。それにも関わらず、複数の縁部の使用が、ラージαｓでさえ細胞を回転する軌道に有意な効果を有する場合があることが期待される。したがって、αｓは約１°〜約６０°の間で変わるであろう。
回転している細胞と基板の接触範囲、および基板への再付着前の細胞によって移動した距離は、ｗｓとｗｇの設計に特に関連する２つのパラメータであってもよい。細胞ローリングに関する従来の研究は、接触範囲が、典型的には約５〜約１０μｍの範囲にあることを示唆する（Ｄｏｎｇ， Ｃ．ら、２０００年、「Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｒｏｌｌｉｎｇ： ｓｈｅａｒ ｆｌｏｗ， ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ， ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｅｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ．」３３巻（１号）：３５〜４３頁、その全内容は参照により全体として本明細書に援用される）。リソグラフィー解像度によって規定される最小サイズ（約０．５μｍ）と、接触次元について上限であり得る１０μｍの間でｗｇは変化するであろう。いずれの特定の理論によっても束縛されることを望むことなく、再付着前に縁部から脱着する細胞によって移動した距離は、最大の効果的な分離のために最小化されるべきである。ｗｓ＜ｗｇについては、セレクチンでコートされた基板のフラクションは小さく、再付着動力学は悪影響を及ぼされる。それにも関わらず、大分部の表面がセレクチンで覆われ、縁部の数が減少するので、ｗｇを超えてｗｓを増加させることは収穫逓減を与える。したがって、縁部配置は幅ｗ≡ｗｓ＝ｗｇで設定されるだろう。縁部の配置は、αｓとｗのいくつかの組合せは、単一の実験における単一のスライドガラスで実験し得るように縁部が設計される。
軌道は、αｓとｗの異なる値に関する各配置で回転するＭＳＰＣについて得られる。幅（ｗ＝ギャップ幅ｗｇおよびセレクチン幅ｗｓ）は、０．５、１、２、５、および１０μｍとして変えられる。縁部角度αｓは、１°、２°、５°、１０°、２０°、４０°、および６０°として変えられる。各幅については、細胞が流れ方向に回転するようにし得る最大の軌道角度αｔｒが決定されるだろう。さらに、縁部に沿って回転している最中に細胞が移動した距離は、本明細書に記載されている作業の場合のようなＭａｔｌａｂを用いて定量される。幅が細胞と基板の接触範囲より大きい場合、最大の軌道角度が幅（ｗ）と無関係になるであろうことが期待される。また、細胞軌道の角度分布は、各セレクチン配置のために評価される。（図１４に示される評価に類似したものを参照）。コーティングされた範囲と縁部の形状（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）に加えて、Ｐ−セレクチン密度の効果は、Ｐ−セレクチンの密度を減少させ、最大の軌道角度αｔｒに対するその影響を観察することによって決定される。
回転している細胞の軌道を指向するための縁部を含む基板の能力に対する細胞のサイズおよび変形能の影響に関する調査
ＭＳＰＣの生体力学特性が細胞ローリングおよびホーミングプロセスに役割を果たすと期待されてもよい。細胞のサイズおよび細胞変形能の影響は、独立して、各パラメータを調節することにより調査される。いずれの特定の理論によっても束縛されることを望むことなく、縁部に沿ったローリングが、小さいαｓについてでさえ硬いマイクロスフェアの場合には観察されなかったので、細胞変形能は重要な役割を果たす場合がある。細胞のサイズは、接触範囲に影響し、同様に、細胞上の流体の流れによって発揮される剪断力に影響する。細胞のサイズの効果を検討するために、ＭＳＰＣは、より均質のサイズ分布を含む３〜４の部分集団に、フローサイトメトリーによって細胞のサイズに従ってソートされる。細胞変形能は、細胞変形能を増加させるサイトカラシンＤで細胞を処理することにより調節される。サイトカラシンＤは細胞の浸透性のマイコトキシンであり、アクチンサブユニットの結合および解離の両方を引き起こす。サイトカラシンＤはアクチンフィラメントを分裂させ、アクチン重合を阻害し、結果として細胞骨格を崩壊させる。また、サイトカラシンＤは基板と相互作用する偽足伸長を生じさせる細胞の能力を妨げるので、代替のメチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）も使用され、細胞の剛性を減少される。ＭβＣＤは、細胞膜からのコレステロールを消耗させて、膜流動性の実質的な増加をもたらすことが公知である。
ローリング挙動に対する細胞のサイズおよび変形能の効果を決定するために、ローリング実験は、特定のＭＳＰＣ部分集団について繰り返される。細胞の大きさの効果を試験するために、最大の軌道角度αｔｒは、細胞のサイズに基づいてソートされたＭＳＰＣの３〜４の部分集団について決定される。同様に、細胞変形能の効果は、サイトカラシンＤ（またはＭβＣＤ）がどのように最大αｔｒに影響するかを観察することによって決定される。
（実施例６）
Ｐ−セレクチン上でのローリングによるＭＰＳＣ部分集団の濃縮
本実施例は、本発明の方法およびデバイスを用いて、細胞集団を部分集団に分離することを示す。
ＭＳＰＣは、ローリングによって３〜４の部分集団に分離され、得られた部分集団間の差異（例えば、サイズおよび受容体密度など）はフローサイトメトリーを用いて調べられる。分離は、実施例５の細胞ローリングの特徴付けに基づく、マイクロ流体デバイスの設計および作製によって達成される。サイズ、リガンド密度、細胞変形能、またはそれらの組合せに基づいて、細胞を分離することが期待される。
デバイス設計
デバイスは、細胞懸濁液のための入口、緩衝液／培地のための別の入口、分離フローチャンバー、およびいくつかの出口を含む（図３）。実施例５の結果は、デバイス、およびセレクチン配置の形状の設計を導くために使用される。この幅を増加させることが恐らく分離距離を増加させて、それによって細胞がデバイスを通って流れるのに必要な時間を増加させるので、細胞懸濁液の入口幅は約３０μｍに維持される。セレクチンの縁部は、実施例５における各細胞集団について決定された最大軌道角度αｔｒに基づいて設計される。意図される設計の例は、（ａ）一定の縁部角度、および（ｂ）変化する縁部角度を含む（図３Ａおよび３Ｂ）。
縁部の選択とコーティング範囲の設計は、その設計に対する細胞軌道の感受性によって影響を受ける：特定の部分集団についてαｔｒを最大にする設計については、αｔｒが他の部分集団について非常に小さい場合、変わる縁部角度の設計が適切であってもよい。一定の縁部角度の設計は、他の状況に適していてもよい。フローチャンバーの最小の長さは、およそ
によって与えられる。
ここで、Ｎはフラクションの所望の数である。ｗｉｎｌｅｔ＝３０μｍ、Ｎ＝４、およびαｍａｘ＝８°について、フローチャンバーの最小の長さは約８５０μｍである。細胞分離は、この形状に関する本実験において観察される典型的な回転速度については５〜１０分である。細胞ローリングは本質的に遅いので、並列のデバイス操作が十分なスループットには必要であってもよい。１０ｄｙｎ／ｃｍ２の生理学的剪断応力については、細胞懸濁液の流入量はおよそ１μＬ／分であると計算される。目標は、１０６／ｍＬの細胞密度で１００μＬ中およそ１０５個の細胞を分離することである。１０個のデバイスを並行して使用し、１０μＬ／分の速度で個別の細胞懸濁液を分離する（図３）。
デバイス作成
デバイスは、ＳＵ−８（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ．の光硬化可能なエポキシ）マスター鋳型で、標準的なマイクロ成形プロセスを用いて、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）から作製される。所望の高さを有する接続マイクロチャネルを備えたＳＵ−８パターンは、４”のシリコンウェーハ上に標準的な手法を用いて作製され、鋳型へのＰＤＭＳ押し付けを防ぐためにシラン処置される。１０：１の重量比のＰＤＭＳと硬化剤の混合物は、マスター上に注がれ、６０℃で１時間、硬化される。硬化後に、ＰＤＭＳ成分が剥がされ、のぞき穴が入口と出口のために開けられるだろう。接続多様体を備えたＰＤＭＳの第２層が同様に作製され、酸素プラズマ処理を使用してこの層に結合される。流入および流出管は、シリコーン接着剤を使用してこの層に接続される。ＰＤＭＳ成分は、ある範囲で、実験のためにセレクチンで予めコートされた他のスライドガラス上に置かれる。ＰＤＭＳ成分およびスライドガラスはともに機械的クランプまたは真空を使用して保持される。
ＭＳＰＣの分離
継代とともにリガンド発現の変化を調べるために、ＦＡＣＳ分析によって、ＭＳＰＣが異なる継代数でのＰ−セレクチン密度について特徴付けられる。製造業者のプロトコールに従って、抗体標識キット（５３０２７、Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ＦＩＴＣで標識されたＰ−セレクチンはこの特徴付けに使用されるだろう。１０５〜１０６個の細胞／ｍＬの密度のＭＳＰＣおよび緩衝液または細胞培養培地は、１０μＬ／分および３０〜１００μＬ／分の流速で（デバイス形状に依存する）デバイスにそれぞれ流される。３〜５個の部分集団が、（ａ）細胞サイズ、（ｂ）リガンド密度、および（ｃ）変形能のために回収され、分析される。細胞サイズおよびＰ−セレクチンリガンド密度は、上述されるようなＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを使用して、各部分集団のために特徴付けられる。細胞変形能は、強いて細胞を、制御された圧力低下で狭いマイクロ流体チャネルに入れ、細胞がチャネルに入るのにかかった時間を観察することにより評価される。よりよく別々の部分集団間の違いを理解するために、統計モデルはＭＳＰＣ受容体発現プロフィール、およびＣＦＵ−Ｆを形成する能力に対するサイズ、変形能、およびリガンド密度の影響を関連させるために構築される（実施例７）。このモデルは、分離の増加のための設計パラメータを調整し、細胞ローリングを用いて特性に基づいてＭＳＰＣを分離することができるかどうかを決定するのを助けるのに有用である。
（実施例７）
分化亢進および細胞移動可能性を有するＭＳＰＣ部分集団の同定
本実施例は、本明細書に開示された細胞分離システムの別の潜在的な使用を説明する。骨形成系統細胞などのＭＳＰＣ部分集団の分化および移動可能性を調べる。
ＭＳＰＣのローリングに基づく分離が、分化する異なる能力（例えば、コロニーを形成し、骨マトリックスを生産する能力によって測定される）、および／または移動挙動における相違を示す部分集団を生じるであろうことが期待される。
骨形成系統は、細胞集団内の先駆体の数を効果的に評価するために使用することができる魅力的な機能的なアッセイを提供する。骨結節は各々、単一のＭＳＰＣによって開始され、固体表面上でデノボの骨形成に生じる。デノボの骨形成は骨形成原細胞の分化によって開始され、セメント線マトリックスの存在によって示される。
インビトロでの骨形成の順番は、胚形成および骨内創傷治癒中の細胞膜内の骨形成の順番と並行であり、ラットおよびヒトを含む様々な種に対して、ならびにヒトおよび胚幹細胞由来の骨形成原細胞について示されている（Ｄａｖｉｅｓ， Ｊ．Ｅ．ら、１９９１年、「Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｆｉｅｄ ｍａｔｒｉｘ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｒａｎｔ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ．」、Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ．、１巻（１号）：３〜１５頁； Ｂａｋｓｈ， Ｄ．ら、２００３年、「Ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．」、Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．、３１巻（８号）：７２３〜３２頁； およびＫａｒｐら、２００６年（本明細書に引用される）；各々の文献の全内容は参照により全体として本明細書中に援用される）。骨形成原細胞によって生産される細胞外マトリックスは、骨結節と呼ばれる鉱石化されたマトリックスの別々の島に集合される。細胞数をインプットするために標準化された骨結節数の回顧分析を通じて、当業者は、間接的に動員されたＭＳＰＣ（骨幹細胞）の数（頻度）を決定することができる。骨髄は、１つの接着細胞あたり、１０，０００個のＭＳＰＣのうちおよそ１個〜１００，０００個のＭＳＰＣのうちのおよそ１個を含んでいる；この数は、ヒト場合の２０代の半ばから後期にそのピークに達した後に年齢とともに減少する。ＭＳＰＣを増殖する培地に相当な関心があるが、ＭＳＰＣの増殖率および産出は各継代のプレーティング密度およびインキュベーション時間に反比例する。
骨幹細胞（すなわち、ある場合には、ストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）に応答して移動事象後、骨結節を形成する能力を有する前駆細胞）の集団を濃縮および／または単離する能力は、縁部に基づく細胞ローリング分離技術のための概念の証拠として役立つであろう。
また、対照実験として、分離されたＭＳＰＣ部分集団は、実施例５に記載されている公知のＭＳＰＣマーカーＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ４４、およびＣＤ２９の発現におけるいずれかの差異があるかどうか決定するためにＦＡＣＳ分析によって調べられる。
分離された部分集団のＭＳＰＣホーミング受容体（ＣＸＣＲ４）の発現の特徴付け
ＭＳＰＣは、白血球および造血幹細胞のホーミングに関与している、多くの主要なサイトカイン受容体およびインテグリン、例えばストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）受容体（ＣＸＣＲ４）を欠如しているか、またはその非常に変化する細胞表面の発現を有する。ＭＳＣおよび他の細胞型のトラフィッキングおよび移植を改善する方法は、細胞療法では優先順位が高い。ＣＸＣＲ４などのホーミング受容体をコードするレトロウイルスベクターは、典型的には炎症部位に存在するＣＸＣＲ４のリガンドであるストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）に応答して、細胞侵入を増加させることによってＨＳＣおよびＭＳＣのホーミングおよび移植を増強するために最近使用されている。より適切な選択肢は、（ＦＡＣＳソートで必要とされる）受容体を標識しないでＣＸＣＲ４を発現するＭＳＰＣを分離することだろう。
ＣＸＣＲ４陽性細胞が異なるローリング挙動を示すかどうかを調べるために、（ＦＡＣＳソートにより得られた）ＣＸＣＲ４を発現するＭＳＰＣのローリングは、ＣＸＣＲ４を発現しないＭＳＰＣのローリングと比較される。ＣＸＣＲ４が公知のローリング受容体ではないので、ＣＸＣＲ４抗体は細胞ローリングに影響しないであろうことが予想される。ＣＸＣＲ４を発現する細胞が異なるローリング挙動を示す場合、ＣＸＣＲ４を発現する細胞はＣＸＣＲ４を発現しない細胞とは区別される。ＭＳＰＣは各部分集団に区別され、各部分集団におけるＣＸＣＲ４の発現は、ＣＸＣＲ４を発現しているＭＳＰＣの標識なしの分離が、本明細書に開示されている細胞ローリング挙動分離システムを用いて達成可能かどうかを評価するために調べられる。
ＳＤＦ−１に応答して移動する単離された部分集団の能力の決定
分離された骨幹細胞の数の差に加えて、ＭＳＰＣの部分集団は、標的組織に血管内皮を通じて移住する異なる能力を有してもよい。ＭＳＰＣの部分集団に発現されるＣＸＣＲ４受容体と、造血細胞のホーミング機構に類似しているそのリガンドＳＤＦ−１４４の間の相互作用によって、ＭＳＰＣ移住が媒介されると考えられている。単離されたフラクションが、移動事象、その後の骨結節生成を受ける異なる可能性を示すかどうかを決定するために、前述されたような（Ｋａｒｐら、２００５年）変更されたボイデンチャンバー分析を使用した。各フラクションから分離されたおよそ５０，０００個の細胞が、６ウェルプレートのウェルに入れられたトランスウェルフィルターに添加されるだろう。１５％ＦＢＳの存在下で１０時間、細胞を接着させるようにし、その後、ウェルをＰＢＳでリンスする。下部のコンパートメントへの１０または１００ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１の添加後、細胞を２４時間培養する。次に、フィルターの上部にある細胞を綿棒で除去する。ＰＢＳで３回、上部および下部のコンパートメントをリンス後、上部および下部のコンパートメントにＣＦＵ−Ｏ培地を添加する。さらに２〜３週間、細胞をインキュベートし、２日または３日ごとに培地交換した。鉱石化された範囲を含んでいる範囲がテトラサイクリンを使用して定量される（Ｋａｒｐら、２００５年）。
ＣＦＵ−Ｏ培地にスイッチする前のフィルターの下側にあった細胞数（つまり、ＳＤＦ−１に応答して各フラクションから移動した細胞の総数）を決定するために、いくつかのフィルターの上部にある細胞を綿棒でこすることによって除去する。その後、全フィルターをトルイジンブルーで染色し、次に光学顕微鏡で観察する。
分離された部分集団からの骨結節数の定量
ローリングに基づく分離によって得られた部分集団の分化能を定量し、Ｐ−セレクチンリガンド密度に基づいて、ＦＡＣＳによって得られた部分集団の分化能と比較する。ＦＡＣＳ分離については、Ｆｃ領域を有するＰ−セレクチンを使用する。ＭＳＰＣの３〜４の部分集団は、Ｐ−セレクチンリガンド密度に基づいたＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを使用して分離される。
骨幹細胞数はコロニー形成単位骨芽細胞（ＣＦＵ−Ｏ）アッセイを使用して定量される（Ｋａｒｐら、２００５年）。骨形成原細胞への分化を刺激するために、α−ＭＥＭおよびＦＢＳを含む培地に１０−８Ｍのデキサメタゾン（ＤＥＸ）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＡＡ）、および５ｍＭベータグリセロホスフェート（βｇＰ）、ならびに抗生物質およびファンギゾンを補充した。特定のグルココルチコイド受容体との相互作用を介して、ＤＥＸは多数の組織に由来した前駆細胞に関して骨形成分化を刺激することを示した。ＡＡはコラーゲン集合を促進し、およびβｇＰはコラーゲンの鉱化作用を促進する。培地は２〜３日ごとに交換し、鉱石化された範囲を光顕顕微鏡および電子顕顕微鏡によって観察する。培養物を骨形成サプリメントの有無で処理し、それぞれ骨形成原細胞への直接的な分化対自然の分化を評価する。
コロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）（ＭＳＰＣのための機能的な分析）の数を調べるために、Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐｉｎａら、１９８０年、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ （ＣＦＵ−Ｆ） ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｇｅｎｙ．」、Ｂｌｏｏｄ．、５６巻（２号）：２８９〜３０１頁、その全内容は参照により全体として本明細書に援用される、によって報告されるように細胞を培養する。陽性のＣＦＵ−Ｆコロニーは、α−ナフチルアセテートエステラーゼ陰性であり、ヘマトキシリン＆エオシン陽性である、５０個を超える細胞を含む接着コロニーとして定義される（Ｂａｋｓｈ、Ｄ．ら、２００３年）。コロニー成形能についてのＣＦＵ−Ｆアッセイは、各フラクション中のＭＳＰＣ数の概算を与える。ＣＦＵ−Ｏ分析に加えて、ＣＦＵ−Ｆは、各フラクション中のＭＳＰＣの可能性に関する関連データを提供する。
（実施例８−１０）
活性化された好中球を分離および検出するためのシステム
今年、世界中の何十万もの幼児が臓器不全および死に至り、感染に対する身体の炎症反応の結果である敗血症になるだろう。死亡率は、処置しない幼児では５０％程度であり、敗血症に関連した死亡のほぼ半数が早産の幼児で生じている。敗血症の検出システムのほとんどは、集中した実験室を必要とするある特定の因子の血漿レベルまたは血液培養物の同定、または特異的ではない臨床症状に依存する。陰性の血液培養物についての結果は、典型的には５日を必要とし、多くの場合、それは遅すぎて、治療の決定に影響する。ポイントオブケアで敗血症を迅速に検出するための単純な方法は、必要とされる医学的処置を時間通りに与えることができ、幼児の死亡率を大幅に減少させる。
最近の研究は、好中球上のＣＤ６４の発現が、熱あるいは化学療法などの条件によって著しく影響されない新生児敗血症用の非常に特異的なバイオマーカーであることを指示する（Ｂｈａｎｄａｒｉ， Ｖら、２００８年、「Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｓｅｐｓｉｓ ｉｎ ｎｅｏｎａｔｅｓ： ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ＣＤ６４ ａｓ ａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ．」１２１巻（１号）：１２９〜１３４頁、およびＮｇ， Ｐ．、２００２年、「Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ＣＤ６４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｌａｔｅ−ｏｎｓｅｔ ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈｗｅｉｇｈｔ ｉｎｆａｎｔｓ．、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５１巻（３号）：２９６〜３−３頁）。酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびフローサイトメトリー技術は、好中球上のＣＤ６４レベルを調べるのに有用であるが、これらの技術は広範囲な試料処理および適切な貯蔵条件を要求し、典型的にはポイントオブケア診断に受け入れられない。
（本明細書に記載されている）受容体の非対称配置を用いたローリング細胞の軌道を検出する本発明の方法は、敗血症の迅速であり、しかも標識をしない診断用に活性化したＣＤ６４を発現している好中球を分離および検出するために利用され得る。例えば、図１７Ａに示される設計を備えた細胞ローリング用デバイスは、他の細胞から活性化されたＣＤ６４＋好中球を分離および検出するのに有用である場合がある。
さらに、本発明者らは、保存期間の長期化とともに、セレクチンの配置、ならびにセレクチンの表面密度および配向を調節する、セレクチンおよびＣＤ６４などの抗体の共有結合的固定化技術を開発した。このアプローチは、物理吸着と比較して、ｓＬｅｘリガンドを結合させたマイクロスフェアおよび生きている好中球のローリング反応の調節亢進に使用することができる。本実施例によって提供される基板は、いずれの処理工程を含まず、分のタイムスケールでＣＤ６４を発現する好中球の迅速な分離および検出のための、細胞ローリングに基づいた単純で無類のデバイスを開発する目標に向けられる。
いずれの特定の理論によっても束縛されることを望むことなく、ローリング細胞の特性は、細胞のサイズ、受容体発現、および細胞変形能に依存するように見える。したがって、再度、いずれの特定の理論によっても束縛されることを望むことなく、ＣＤ６４を発現している活性化された好中球は、全血内の他の細胞型から分離することができることが仮定される。以下の実施例は、高い特異性を有する、活性化されていない好中球から活性化された好中球の分離を示すことが期待される。その後、これらの方法を使用して、有効に全血からＣＤ６４好中球を分離することができる。
（実施例８）
Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４抗体を同時に固定化された基板の開発
本実施例では、活性化された好中球を検出するのに有用な基板が開発される。このような基板は、細胞接着分子の混合物（本実施例ではＰ−セレクチン）、および活性化された好中球によって発現されるマーカーに対する抗体（本実施例ではＣＤ６４）を含む。
表面コーティング
マイクロ流体パターニングを用いて、コーティングされた範囲およびコーティングされていない範囲の間に縁部を作り出すように、Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４抗体を表面にコーティングするであろう（図１８）。この技術では、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）中のマイクロ流体チャネルは、スライドガラスに可逆的に結合され、所望の受容体溶液が固定化のためのマイクロ流体チャネルを通じて流される。マイクロ流体チャネルは、ＳＵ−８マスター鋳型およびソフトリソグラフィー技術を用いて調製される（Ｄｕｆｆｙ， Ｄ． Ｃ．ら、「Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）．」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．、７０巻（２３号）：４９７４〜４９８４頁、その全内容は参照により全体として本明細書に援用される）。
厚さがおよそ５０μｍのＳＵ−８フォトレジストは、４インチのシリコンウエハー上のマイクロチャネルを規定する５０μｍ幅の線に引かれる。処理後、鋳型はおよそ１５０℃で１５分間焼かれ、ＳＵ−８の縁部を滑らかにする。次に、ＳＵ−８の鋳型をデシケータに置き、ＰＤＭＳの将来的な除去を助けるために、数滴のトリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル−１−トリクロロシラン（Ｕｎｉｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）が含まれる。モノマーおよび硬化剤は１０：１の比率で混合され、鋳型に注がれ、脱気され、９０℃で３０分間で硬化され、次に鋳型から取り出される。入口と出口の穴が開けられ、ＰＤＭＳマイクロチャネルをガラス基板に置き、シリンジポンプを用いて溶液を流すことができる密閉したマイクロチャネルを形成する。本発明者らは、既に物理吸着によってガラス上のＰ−セレクチン縁部のマイクロ流体の作製を示している（図１８）。Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂの表面密度に対する良好な制御については、本発明者らは、さらに、２つの受容体の共有結合的な同時固定化のための技術を開発している。
固定化スキーム
エポキシ化学を用いて、共有結合的にガラス基板上に受容体を固定化する。エポキシ官能化スライドガラスは、ＡｒｒａｙＩｔ Ｉｎｃ．から得て、さらに処理せずに、共有結合的固定化に直接使用される。ＰＤＭＳのマイクロ流体コンポーネントは、エポキシスライドに置かれ、ＰＢＳ緩衝液中のＰ−セレクチンおよび／または抗ＣＤ６４ ｍＡｂ溶液はマイクロ流体チャネルを通じて流される。固定化後、ＰＤＭＳコンポーネントが剥がされ、全表面は５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで１時間ブロックされる。
同時固定化されたＰ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂの密度制御
Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂの表面密度の制御は、最適化された細胞分離デバイスの開発にとって重要である場合がある。Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂの異なる密度を試験するために、マイクロ流体パターニングの最中に、それらの濃度を溶液で変更する。最初の実験は、１：１、１０：１および２０：１のＰ−セレクチン：抗ＣＤ６４ ｍＡｂ濃度の異なる比率（Ｐ−セレクチン濃度は約５μｇ／ｍＬで維持される）を使用する。全密度は、同じＰ−セレクチン濃度で２つの受容体の固定化時間（約５分および約１時間）を変えることにより変更させ、３つの比率で低いおよび高い表面密度を得る。受容体の配置後、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで１時間、表面をブロックする。表面は蛍光測定を使用して定性的に、および後述される放射線標識技術を用いて、Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂの表面密度については定量的に特徴付けられる。
Ｐ−セレクチンの蛍光特徴付け
ビオチン化されたシアリルルイス（ｘ）（ｓＬｅｘ）は、Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈから得られ、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン濃度で、１：１のモル比中でアレクサ４８８ ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）とともにインキュベートされる。ｓＬｅｘは、Ｐ−セレクチンに結合する糖であり、細胞ローリングを模倣するマイクロスフェアの表面コーティングのために用いられる（Ｈｏｎｇ， Ｓ．ら、２００７年、「Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｅｌｌ ｒｏｌｌｉｎｇ．」、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．、２３巻（２４号）：１２２６１〜１２２６８頁、その全内容は参照により本明細書に援用される）。抗ＣＤ６４ ｍＡｂ固定化の特徴付けについて、Ｆｃγ受容体の細胞外ドメインからなる組換えヒトＦｃγ受容体Ｉ（ＣＤ６４）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得られ、タンパク質ラベリングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いてアレクサ６４７で標識される。表面は、ストレプトアビジン−ｓＬｅｘコンジュゲートの１０μｇ／ｍＬ溶液および１０μｇ／ｍＬ Ｆｃγ受容体とともに一晩４℃でインキュベートされる。インキュベーション後、１×ＰＢＳで１０分間で２回、スライドをリンスし、画像用のアンドール８８５カメラを装備したニコンＴＥ２０００−Ｕ倒立落射蛍光顕微鏡で撮像される。アレクサ４８８およびアレクサ６４７用のフィルターを用いた蛍光画像は、同一の条件下、ならびにＰ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂの固定化制御を確認するために定量されるそれらの強度で取得される。
ヨウ素（１２５Ｉ）による放射線標識を用いた部位密度測定
基板に結合したリガンドの部位密度は、基板上への曝露前に、ヨウ素（１２５Ｉ）化された抗ＣＤ６４抗体またはＰ−セレクチンを介した放射線活性によって測定される。リガンドの放射線ヨウ素化は、製造業者のプロトコールに従って、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）ヨウ素化試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ、ＩＬ）を用いて行う。ヨウ素化前に、プロテインＡビーズ（Ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ、ＩＬ）を用いて抗体を精製し、次に、ｉｏｄｏｇｅｎ（典型的には、１００μｇの抗体あたり１０μｇ以下のＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）試薬の比）でコーティングされた管を用いてヨウ素化する。リガンドの酸化を防ぐために、担体フリーのＮａ１２５Ｉの５００μＣｉが、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ管に最初に添加され、１０〜１５分間、撹拌しながらインキュベートし、リガンド溶液（１００μＬのＰＢＳに溶解させた、１００μｇの精製された抗体試料）を添加する。
反応管から試料を取り出して、活性のある放射性ヨウ素に結合する４−ヒドロキシフェニルプロピオン酸または４−ヒドロキシフェニル酢酸（１０ｍｇ／ｍＬの約５０μＬ）などのチロシン様分子を添加することによって試料のヨウ素化を停止する。次に、放射線ヨウ素化されたリガンドフラクションは、ゲルろ過カラム（Ｐｉｅｒｃｅのキットに提供される）を通過させることによって、ヨードチロシンおよび未標識リガンドから精製され、分離される。放射線ヨウ素化されたリガンドは、緩衝液中、４℃で貯蔵され、放射線活性の喪失を最小にするために各分析のために未使用で用いられる。
単位質量あたりの標識されたリガンドの放射線活性（比放射能）は、μＣｉ／ｍｍｏｌとしてガンマカウンターを用いて測定される。抗体の所定の質量または濃度（例えば、タンパク質ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって測定される）に関して、放射線活性を測定することは可能である；抗体の分子量から、単位質量あたり、または明確には抗体あたりの放射線活性の量を計算することができる。
固定化されたＰ−セレクチンまたは抗ＣＤ６４の部位密度を決定するために、１２５Ｉ標識されたリガンドが、上述されるように共有結合的に固定化される。Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂの部位密度は、各表面に対して別々に分析される。その後、表面は、ＰＢＳ、１．５ｍＭ Ｃａ２＋、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で３回洗浄される。結合したリガンドは、０．１Ｍ ＮａＯＨによって取り除かれ、放射線活性をガンマカウンターを用いて測定する。
（実施例９）
同時固定化された基板上の好中球の特徴付け
本実施例では、流体の流れ方向に関して好中球のローリング方向に対する縁部（Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂでコートされた範囲によって生成される）の効果を調査する。この試験の目標は、Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂの表面密度および縁部角度を変えることにより、活性化されていない好中球と比較して、活性化された好中球の軌道を指向する配置の能力を最大にすることである。この試験は、細胞分離用デバイスの設計を促進し、好中球活性化に対する分離技術の相対的感度の決定を支援する。
ローリング実験は、Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂの同時固定化された配置を含むスライドガラス（基板）を使用して、標準的な市販のフローセル（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）で行われる。ＡｌｌＣｅｌｌｓ Ｉｎｃ．から得られた好中球は、従来報告されている（Ｈｏｎｇら、２００７年）ように、フロー実験が行われるまで、０．５％ヒト血清アルブミン、２ｍＭ Ｃａ２＋、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含んでいる無菌ハンクス平衡塩類溶液に維持される。好中球を活性化させるために、ＨＢＳＳの中の５×１０６細胞／ｍＬは、３０分間、３７℃で２ｎＭ ＴＮＦ−α（予め４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含むＰＢＳで溶解される）とともにインキュベートされる。好中球は、生理学的な剪断応力の範囲内にある、約１ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断応力でスライドガラス上に流される。ニコンＴＥ２０００Ｕ顕微鏡を用いて画像を取得し、本発明者らの現在の作業における場合のようにＭａｔｌａｂを使用して分析する。
活性化された好中球に関するＣＤ６４発現の部位密度の定量化
主なヒト好中球の表面上のＣＤ６４の部位密度を決定するために、フローサイトメトリーは、特定の抗体を結合する能力のマイクロビーズ（ＡＢＣ）（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒキット；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて行う（図１９）。特定の抗体でマイクロビーズを標識する場合、それらは、ＡＢＣのユニットにおけるフローサイトメーターの蛍光尺度（細胞またはマイクロビーズあたりの結合した抗体の数）を較正するために、一連の標準として役立つことができる。Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒキットは、公知の抗体を結合する能力の４つの非常に均一なマイクロビーズ集団の混合物である。マイクロビーズは、細胞と同じ条件の下で、および実験試料としての等量の試験抗体を用いて標識される。４つのマイクロビーズ集団に対応する４つのピークの蛍光強度の中央値は較正曲線を構築するために使用される。
４つのＩｇＧ標識ビーズ（様々な密度を有する）の各々およそ５００μＬを５０μＬの細胞培地に添加し、ボルテックスを行った。およそ１０μｇ／ｍＬの抗ビオチン−ＦＩＴＣ抗体（抗ＣＤ６４、Ａｂｃａｍ、ａｂ３４２２４）は、各々の標識されたビーズ試料、または細胞懸濁液とともに３０分間遮光してインキュベートされる。約２ｍＬの細胞懸濁液を添加し、２５００×ｇで５分間遠心分離される。試料を２回リンスし（２５００×ｇで５分間遠心分離される）、次に、細胞と同じ溶液の５００μＬに入れ、分析する。マイクロスフェアと細胞はフローサイトメトリーを使用して分析される。１秒あたりおよそ１００〜２００イベントの流速を使用し、１ビーズ集団あたりおよそ１０００イベントを回収する。染色していないブランクビーズを負の対照として用いる。
前方散乱対側面散乱ドットプロットを使用して、マイクロスフェアの一重項集団の周辺のライブゲートを構築し、マイクロスフェアの５集団の各々のピーク（中央値）ヒストグラムチャネルは、ＱｕｉｃｋＣａｌ（登録商標）集計表（ｗｗｗ．ｂａｎｇｓｌａｂｓ．ｃｏｍで利用可能なソフトウェア）へのエントリーのために対応する蛍光チャネルで決定される。染色されていない細胞は負の対照として用い、ビーズ標準と同じ機器設定で稼働する。染色されていない細胞試料のＡＢＣ値は、染色された細胞試料のＡＢＣ値から差し引かれる。
ＱｕｉｃｋＣａｌ（登録商標）を用いて、較正曲線を作製し、機器検出閾値を決定し、未知試料のＡＢＣ値を定量する。較正曲線を確立するために、ＡＢＣ（ｙ軸）は４つの抗体を結合しているマイクロスフェアの各々のためにピークチャネル（ｘ軸）に対してプロットされる。線形の蛍光については、データのｌｏｇ−ｌｏｇプロットは４５°線を与えるべきである。ＡＢＣ検出閾値決定については、ＡＢＣの較正手順を完成し、較正曲線をプロットした後、参照ブランクのピーク（中央値）チャネルを記録する（いくつかの実験では、染色されていない細胞試料を参照ブランクとして使用する）。その後、較正プロットは参照ブランク（または染色されていない細胞）の蛍光に関連したＡＢＣ値を決定するために使用される。これは、これらの機器設定の機器のＡＢＣ検出閾値である。検出閾値は、機器ノイズを超えて検出できるＡＢＣユニットの最低数である。試料のＡＢＣ定量化について、上記されるＡＢＣ較正手段を完了し、較正曲線をプロットした後、未知の細胞試料は、フローサイトメーター（ＡＢＣ較正に使用されるのとまったく同じ機器設定を有する）を使用して決定される。各集団に対する試料のピーク（中央値または幾何平均）チャネル値を決定し、較正プロットを使用して、試料のピークチャネルの各々に相当するＡＢＣ値を決定する。染色されていない細胞試料のＡＢＣ値は、染色された細胞試料のＡＢＣ値から差し引かれる。細胞範囲は、４０×で、懸濁液中の１０個の細胞の径を調べることによって決定され、ＣＤ６４の部位密度を計算するために使用される。
Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂの最適な表面密度の決定
活性化された好中球および活性化されていない好中球のローリングは、いずれの角度のある縁部を伴わずに、同時固定化されたＰ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂを含む平坦な表面上でそれらのローリング挙動における差を最大にするために最初に特徴付けられる。およそ５×１０４細胞／ｍＬの密度の細胞懸濁液は、約１ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断速度でシリンジポンプを使用して、フローチャンバー内で受容体をコーティングした基板上に流される。この試験については、コーティングされた範囲とコーティングされていない範囲の間の縁部を含む表面は使用されない。これは、目標が縁部効果がないローリング挙動を分析するためだからである。細胞ローリングは、活性化された好中球および活性化されていない好中球について別々に試験され、ローリング細胞の数、動けなくなった細胞の数、およびローリング速度についてＭａｔｌａｂを用いて分析される。
いずれの特定の理論によっても束縛されることを望むことなく、抗ＣＤ６４ ｍＡｂの表面密度が増加されるので、活性化された細胞と活性化されていない細胞の間のローリング挙動の相違が増加してもよく、表面と相互作用する細胞のローリング速度および数に影響することが予測される。それにも関わらず、静的な接着細胞の数はまた、抗ＣＤ６４ ｍＡｂのより高い表面密度で増加してもよい。中間値は、活性化されていない好中球から活性化された好中球の分離には最適であり得る。したがって、ローリング細胞の数および速度が定量され、ならびにＰ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂの異なる表面密度に対する静的な接着細胞の数が定量される（実施例８に記載される）。この試験は、静的な接着細胞の数を最小にしながら、活性化された細胞と活性化されていない細胞の間のローリング速度の差を最大にする、Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂの密度を用いて表面調製を同定するべきである。
活性化された好中球と活性化されていない好中球の軌道間の差を最大にするための縁部角度の決定
Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂ表面密度を同定後、最適な縁部角度（αｓ）は活性化された好中球と活性化されていない好中球の分離を最大にするために同定される。セレクチン細片の幅（ｗ）と流れ方向に関する角度（αｓ）によって規定されるセレクチン／ｍＡｂのストライプを含む設計（図５）が使用される。ｗはおよそ５０μｍに固定され、活性化された好中球と活性化されていない好中球の移動方向間の差を最大にする端角度（αｓ）が決定される。
最終デバイスにおける条件を最もしっかりと合致させるために、提案されたデバイス設計（実施例１０に記載される）に見られるようなチャネルの高さが１５μｍであるマイクロ流体フローチャンバーは、この一連の実験のための市販のフローチャンバーの代わりに使用される。軌道は、５°、１０°、２０°、３０°、４０°、および５０°の範囲の様々な値のαｓについての配置上で回転する、活性化された好中球および活性化されていない好中球について得られる。細胞行路のＭａｔｌａｂ分析を実行して、（ａ）細胞が縁部に直面する場合に、自由流に続くローリング細胞のフラクション、（ｂ）縁部の追跡を開始するローリング細胞のフラクション、（ｃ）脱着する前に縁部を追跡しながら各細胞によって移動する経路、および（ｄ）各細胞のローリング速度を決定する。これらのデータは、本発明者らが現在使用しているＭａｔｌａｂプログラムに小さな修正を施して容易に抽出することができる。Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂ配置により、ローリング細胞が受ける場合がある流れ方向に垂直な正味の平均偏差は、ｓｉｎ（αｓ）を掛けた平均経路長として計算される。活性化された好中球と活性化されていない好中球のローリング間の差を最大にする縁部角度（αｓ）が同定される。
偏差の差異が確かにＣＤ６４によることを確認するために、単にＰ−セレクチンを使用する対照実験を行う。活性化された好中球および活性化されていない好中球のローリング挙動がＰ−セレクチンをコーティングした表面上で類似している場合、その差は活性化された好中球でのＣＤ６４発現に寄与してもよい。さらに、抗ＣＤ６４ ｍＡｂだけでコーティングされた表面に接着する、活性化されていない好中球および活性化された好中球の数が定量される。これは、活性化された好中球の変更されたローリング挙動が確かにＣＤ６４発現によることを確かめることが期待される。
（実施例１０）
ＣＤ６４＋の活性化された好中球と活性化されていない好中球を区別するためのマイクロ流体デバイス
本実施例は、活性化された好中球と活性化されていない好中球を区別することができるデバイスの提供に関する。
活性化された好中球と活性化されていない好中球の軌道間の差を最大にする受容体密度および配置を同定した後、２つの細胞状態間を区別するためのマイクロ流体デバイスを作製する。好中球のＣＤ６４発現に関する試験は、好中球のＣＤ６４発現が単一のガウス分布を提示することを示した；さらに、敗血症である場合に全分配がシフトするので、ＣＤ６４発現は１０以上の因子によって数倍増加する（Ｄａｖｉｓ， Ｂ．Ｈ．ら、２００６年、「Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ＣＤ６４ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｐｓｉｓ ｉｎ ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ．」、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．、１３０巻（５号）：６５４〜６６１頁）。したがって、ＣＤ６４＋またはＣＤ６４−の好中球を区別するデバイスは、敗血症の状態を検出するのに有用であるべきである。
ローリングを使用する細胞の分離について、市販のフローチャンバーへの２つの主な変更が有利であろう。細胞ローリング試験（Ｈｏｎｇら、２００７年）に典型的に使用される市販のフローチャンバーは、高さが約１２５μｍ以上の範囲にあり、それは、受容体をコーティングした表面または縁部に直面することさえなく、大部分の細胞をチャンバーを通じてちょうど流れるようにする。このようなフローチャンバーは、たった１つの入口と１つの出口を有し、細胞の分離に有用ではない。
本実施例の意図されたデバイスでは、チャネルの高さは約１５μｍまで減少され、細胞と表面の間の相互作用を促進する。さらに、２つの入口（細胞と緩衝液）および２つの出口は、分離された細胞のために組み込まれる。フローチャンバーの径を減少させることは、デバイスのスループットに悪影響を及ぼす場合がある。他方では、血液中の高密度の好中球は、非常に微細な試料体積の分析を必要とし、したがって、恐らくスループットの問題を回避する。より高いスループットが必要な他の適用では、並行して操作するためにこれらのデバイスが製造され得る。実際に、単一のデバイスに統合された何千ものチャンバーを作製する技術（Ｔｈｏｒｓｅｎ， Ｔ．ら、２００２年、「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８巻（５５９３号）、５８０〜５８４頁、その内容は参照により全体として本明細書に援用される）は、既に商業化されており（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ，Ｉｎｃ．）、世界中のいくつかの学術的な研究所では日常的に使われている。
デバイス設計
デバイスは、細胞懸濁液のための入口、緩衝液のための別の入口、分離流チャンバー、および２つの出口を含む（図２０）。デバイスは、ＳＵ−８（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．の光硬化可能なエポキシ）上での標準的なマイクロ成形プロセス（Ｄｕｆｆｙら、１９９８年）を使用して、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）から作製される。必要ならば、支柱またはスライドガラスを用いた硬い裏打ちを用いて、マイクロチャネルの崩壊を防ぐ。Ｐ−セレクチンおよび抗ＣＤ６４ ｍＡｂは、マイクロ流体パターニングを使用して、スライドガラス上で別々に固定化される。デバイスは、受容体を有するガラス基板に対してＰＤＭＳ成分を保持するための真空マニホールドを使用して組み立てられるだろう。
実施例９の結果は、例えば、幾何学、受容体密度、および縁部角度の点からデバイスの設計を導くために使用される。細胞懸濁液の入口幅は約２０μｍに維持され、それは、この幅を増加させることは分離距離を増加させ、それによって細胞がデバイスを通じて流れるのに必要とする時間を増加させるからである。１０°のオーダーの偏向角度に対して、１〜１０ｍｍオーダーの長さを有するフローチャンバーは分離に必要とされ、１〜１０分の範囲の時間を介して細胞を流れるようにすることが予測される。約１ｄｙｎ／ｃｍ２の生理学的な剪断応力については、細胞懸濁液入口流速はゆっくりであり、約１μＬ／分のオーダーである。それにも関わらず、血液中では好中球は非常に高密度であり、少量の血液（約１〜１０μＬ）は分離された細胞の収集および定量に十分であるべきである。したがって、単一のデバイスは分の時間スケールでＣＤ６４＋好中球を分離し定量するために使用されてもよい。
長い分離チャンバーを用いると、分離チャネルに沿った異なる位置の細胞の流出の側面分配は、同じ流れおよび表面の設計条件下でＣＤ６４＋およびＣＤ６４−好中球について独立して決定される。この情報はデバイスの出口の設計を促進し、その結果、ＣＤ６４＋好中球が出口Ａに選択的に迂回され、一方、ＣＤ６４−および回転しない細胞が出口Ｂに流れ込む（図２０）。
細胞分離
５×１０４細胞／ｍＬ（典型的な血中の生理学的密度）のおよそ１０μＬの好中球懸濁液および緩衝液は、１ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断応力でデバイスへ流される。各出口における分離された細胞のフラクションは、各出口における細胞の相対的な分配のために回収され、定量される（図２０）。回収された体積はピペットを用いて測定され、９６ウェルプレートに添加される。細胞をウェルの底に沈殿させ、顕微鏡下で目視計数する。各分離実験について、最終出口（φ）は、出口Ｂ（ｎＢ）での細胞数と比較した出口Ａ（ｎＡ）での細胞数の相対比である：
分離実験は、活性化された好中球（敗血症条件を模倣する）および活性化されていない好中球（健常な状態）について行われる。活性化された好中球と活性化されていない好中球の間の相対分配（φ）の有意差は、活性化されていない好中球からの活性化された好中球の成功した同定を示す。
φについての客観的基準は、カットオフ比φＣとして、活性化されていない細胞と活性化された細胞の間を区別するためのこれらの予備的結果に基づいて確立される。φ＜φＣである場合、ＣＤ６４＋好中球の存在については結果の誤りであり、そうでなければ結果は正しい。次に、いくつかの分離実験（活性化された好中球と活性化されていない好中球については各々＞１０）は、技術の特異性および感度を定量するために、この客観的基準を用いて行われる。
分離効率に対するＣＤ６４部位密度の影響を決定するために、本発明者らは、およそ０．５ｎＭ、２ｎＭ、または５ｎＭのＴＮＦ−αで主要なヒトの好中球を処理し、実施例９に記載されるビーズ方法を使用して、それらの部位密度を決定し、本明細書記載の分離効率を決定する。この試験は、好中球での様々なレベルのＣＤ６４発現について、デバイスの感度を上げることが期待される。
（実施例１１）
縁部に沿ったＨＴ２９細胞の選択的ローリングのための表面の開発
本実施例では、白血球から癌細胞を分離するための表面が開発される。このような細胞のローリングを媒介とした癌細胞の分離は、診断的適用に有用であってもよい。ＨＴ２９は、Ｅ−セレクチンと相互作用し、転移に関する循環腫瘍細胞モデルとして使用されている、十分に確立した細胞株である。ＨＬ６０細胞は、白血球の細胞ローリングのモデルとして使用される骨髄性細胞株である。本実施例は、本発明の分離システムに基づく細胞ローリングを使用して、ＨＬ６０細胞より選択的にＨＴ２９細胞を分離することができることを示すことを意図する。
コーティングされた範囲とコーティングされていない範囲の間の縁部を含む表面は、ローリングによりＨＴ２９細胞の分離を可能にする、同時固定化されたＥ−セレクチンおよびｅｐＣＡＭ Ａｂを用いて開発されている。共有結合の化学は、Ｅ−セレクチンおよびｅｐＣＡＭ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を同時固定化するために使用される。
ガラス基板上の抑制された密度を有するＥ−セレクチンおよびｅｐＣＡＭ ｍＡｂの共有結合的固定化
エポキシ化学を用いて、ガラス基板上に受容体を共有結合的に固定化する。エポキシ官能化されたスライドガラスは、ＡｒｒａｙＩｔ Ｉｎｃ．から得て、さらに処理しないで、共有結合的固定化に直接用いられる。Ｅ−セレクチンおよびｅｐＣＡｍ ｍＡｂはマイクロ流体パターニング（Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅら、１９９７年）を使用して、表面に配置される。この技術では、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）におけるマイクロ流体チャネルはスライドガラスに可逆的に結合し、Ｅ−セレクチンおよびｅｐＣＡＭ ｍＡｂの適切な混合物を含む所望の受容体溶液は、固定化のためにマイクロ流体チャネルを通じて流される。固定化後、ＰＤＭＳ成分は剥がされ、全表面は５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで１時間ブロックされる。
Ｅ−セレクチンおよびｅｐＣＡＭ ｍＡｂの表面密度の制御は、最適化された細胞分離デバイスの開発にとって重要である場合がある。種々の密度のＥ−セレクチンおよびｅｐＣＡＭ ｍＡｂを試験するために、それらの濃度はマイクロ流体パターニングの最中に溶液で変更される。最初の実験は、（約５μｇ／ｍＬで維持されたＥ−セレクチン濃度を用いて）１：１、１０：１、および２０：１の異なる比のＥ−セレクチン：ｅｐＣＡＭ ｍＡｂ濃度を使用する。表面は、以下に記載される放射性標識技術を使用して、Ｅ−セレクチンおよびｅｐＣＡＭ ｍＡｂの表面密度について特徴付けられる。
部位密度は、ヨウ素（１２５Ｉ）による放射性標識を用いて、および実施例８で記載されているのと類似した方法を用いて測定される。ＨＴ２９細胞のｅｐＣＡＭ発現の部位密度は、実施例９に記載されているフローサイトメトリーを用いて定量される。
同時固定化された基板上で回転するＨＴ２９とＨＬ６０の特徴付け
Ｅ−セレクチンおよびｅｐＣＡＭ ｍＡｂをコーティングした範囲と、流体の流れ方向に対してＨＴ２９およびＨＬ６０細胞のローリング方向上でコーティングされていない範囲の間の縁部の効果を調べる。本試験の目標は、Ｅ−セレクチンおよびｅｐＣＡＭ ｍＡｂ表面密度および縁部角度を変えることにより、縁部がＨＴ２９細胞の軌道対ＨＬ６０細胞の軌道を指向する能力を最大にすることである。この試験は、細胞分離用デバイスを設計することを促進し、好中球の活性化に対する分離技術の相対感度の決定を支援することが期待される。ローリング実験は、本発明者らがＰＤＭＳマイクロ処理を用いて開発されたマイクロ流体細胞ローリングデバイスで行われる。細胞は、生理学的な剪断応力の範囲内にある１ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断応力でスライドガラス上に流される。画像はニコンＴＥ２０００Ｕ顕微鏡を使用して取得され、Ｍａｔｌａｂを使用して分析される。Ｅ−セレクチンおよびｅｐＣＡＭ ｍＡｂの最適な表面密度は、実施例９に記載されているのと類似している方法を用いて決定される。
ＨＴ２９とＨＬ６０の細胞の軌道間の差を最大にするための縁部角度の決定
Ｅ−セレクチンおよびｅｐＣＡＭ ｍＡｂ表面密度の同定後、ＨＴ２９とＨＬ６０の細胞の分離を最大にするための最適な縁部角度（αｓ）を決定する。セレクチン細片の幅（ｗ）および流れ方向に対する角度（αｓ）（図５）によって規定されるセレクチン／ｍＡｂのストライプを含む設計が使用される。セレクチン細片の幅はｗ＝１０μｍ（ローリング細胞の接着範囲よりわずかに大きい）で固定され、ＨＴ２９（循環腫瘍細胞）とＨＬ６０（白血球）の移動方向間の差を最大にする縁部角度（αｓ）が決定される。
細胞ローリング軌道は、実施例９および１０に記載されているマイクロ流体フローチャンバーを使用して、ＨＴ２９とＨＬ６０細胞について得られる。
（実施例１２）
ＨＴ２９とＨＬ６０の細胞を分離するマイクロ流体なデバイス
本実施例では、ＨＴ２９細胞の選択的なローリングのために最適化された表面（実施例１１において開発される）が、ＨＬ６０細胞からＨＴ２９細胞を分離するためのマイクロ流体デバイスに組み入れられる。このようなデバイスは、診断的適用を有してもよい他の細胞分離デバイス用に変更されてもよい。例えば、それらは、血液または血液産物から循環腫瘍細胞を分離し、その検出を可能にするために変更されてもよい。（実施例１３を参照）。
デバイス設計
デバイスは、標準的なマイクロ成形プロセス（Ｄｕｆｆｙら、１９９８年）を用いてＰＤＭＳから作製される細胞懸濁液のための入口、緩衝液のための別の入口、分離流チャンバー、および２つの出口を含む（図２０に示されているデバイス図に類似する）。必要ならば、支柱またはスライドガラスを使用した硬い裏打ちを使用して、マイクロチャネルの崩壊を防ぐ。Ｅ−セレクチンおよびｅｐＣＡＭ ｍＡｂは、実施例１１に記載されるマイクロ流体パターニングを使用して、スライドガラス上で別々に固定化される。デバイスは、受容体を有するガラス基板に対してＰＤＭＳ成分を保持するための真空マニホールドを用いて組み立てられる。
実施例１１の結果は、例えば、幾何学、受容体密度、および縁部角度の点からデバイスの設計を導くために使用される。細胞懸濁液の入口幅は約２０μｍに維持され、それは、この幅を増加させることは分離距離を増加させ、それによって細胞がデバイスを通じて流れるのに必要とされる時間を増加させるからである。１０°のオーダーの偏向角度に対して、１〜１０ｍｍオーダーの長さを有するフローチャンバーは分離に必要とされることがあり、１〜１０分の範囲の時間を介して細胞を流れるようにすることが予測される。約１０ｄｙｎ／ｃｍ２の生理学的な剪断応力については、細胞懸濁液入口流速は、１μＬ／分のオーダーである。長い分離チャンバーを使用して、分離チャネルに沿った異なる位置での細胞の流出の側面分配は、同じ流れおよび表面の配置条件下のＨＴ２９とＨＬ６０の細胞のために独立して決定される。この情報を用いてデバイス出口を設計し、その結果、ＨＴ２９細胞は１つの出口に選択的に迂回され、ＨＬ６０細胞は他の出口に流れ込む。（同様のデバイス図については図２０を参照。）
分離処理能力
単一のデバイスは、例えば、およそ１μＬ／分の速度で細胞分離を可能にする。このような速度は、デバイスの初期の開発および試験には十分であるが、大量の試料処理には不適切である場合がある。それにも関わらず、デバイス形状の固有の単純性により並行して操作する複数の分離チャンバーを構築することができる。１０ｍｍ２の推定される設置面積を有し、単一のデバイスは、１００μＬ／分のスループットを可能にする並行して約１００個のチャンバーを収納することができた（このスループットは大型デバイスにおいて、最大にして数倍のｍＬ／分の速度に拡大することができた）。これらのデバイスは、複数のＰＤＭＳに作製することができ、受容体配置を有すると同じ基板に付けることができる。
細胞分離
ＨＴ２９細胞で固定された、１０５個の細胞／ｍＬの密度（典型的な血中の生理学的な白血球密度）でＨＬ６０細胞を含む細胞懸濁液は、１ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断応力でデバイスに流される。ＨＴ２９細胞は、その後の分析のためにカルセインで染色される。臨床的に関連する濃度の範囲（Ｎａｇｒａｔｈ， Ｓ．ら、２００７年、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｎａｔｕｒｅ、４５０巻（７１７３号）：１２３５〜Ｕ１０頁、その全内容は参照により全体として本明細書に援用される）に広げるために、ＨＴ２９細胞の濃度を１〜１０３個の細胞／ｍＬで変化させる。各出口の分離された細胞のフラクションが回収され、フローサイトメトリーによって、各出口の細胞の相対的な分配について定量される。分離プロセスの選択性は、分離された試料中のＨＴ２９細胞のフラクションとして定量される。収率は、試料中のＨＴ２９細胞の総数と比較して、分離されるＨＴ２９細胞のフラクションとして定量される。細胞懸濁液中にＨＴ２９を添加した濃度の関数として、選択性および収率が定量される。
（実施例１３）
癌患者の全血試料由来の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の分離
本実施例において、血液試料などの体液由来の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分離するためのシステムを開発し、実施例１１〜１２から結果に基づいている。
転移のある、後期結腸癌患者からの血液の生きている臨床試料を得る。このような試料中のＣＴＣの予期されるレベルは高い。細胞ローリング実験は、試料を予め標識しないかまたは処理せずに、白血球からＣＴＣを分離するために、ｅｐＣＡＭおよびＥ−セレクチンを同時固定化された基板を用いて全血試料で行われる。高いフラクションのＣＴＣを有する血液試料は、血液中のＣＴＣ密度を定量するためのｅｐＣＡＭ ｍＡｂを用いて、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用する）によって分析される。およそ１００μＬ〜１ｍＬの血液の同試料（デバイスのスループットに依存する）は、実施例１２と同じ表面配置および流れ条件を使用して、分離用デバイスを通じて流される。
得られたフラクションをフローサイトメトリーによって分析し、血液から分離されたＣＴＣの数を定量する。ＣＴＣのローリングは、他の細胞と比較して少数であるために直接特徴付けることができないので、反復アプローチを用いて、ローリングＣＴＣの特徴付けを促進してもよい。実施例１２で得られた表面および流量で、分離が得られない場合、縁部角度は、ＣＴＣが受容体縁部に沿って回転することができる角度をまさに超えて増大する。ヒトの血液試料において、これらの条件下でＣＴＣが検出されない場合、ＨＴ２９細胞が血液中に添加され、それらを検出し、分離することができる最低濃度を決定する。ＨＴ２９細胞分離を追跡する能力を増強するために、ＨＴ２９細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）を用いて予め標識する。
（実施例１４）
細胞分離システムで使用されるための追加の配置
実施例６で検討され、図３に記載された配置に加えて、様々な他の配置を用いて、細胞分離を達成してもよい。いくつかのこのような配置は、図２および４に記載されている。ローリング細胞の「ネガティブ」選択は、例えば、望ましくない細胞を迂回させるために縁部を使用することにより、達成されてもよい。（例えば、図４Ａを参照。）このような細胞分離スキームでは、所望の細胞集団は、縁部によって迂回されず、流体の流れ方向に移動する。望ましくない細胞は、望ましくない細胞の細胞型（単数または複数）のローリングを誘導するように設計された縁部に沿って回転する。
配置は、単一のファイルに細胞を分離するように設計されてもよく、それはある特定の下流の分析および／または応用に有用であってもよい。（例えば、図４Ｂを参照。）代わりにまたは加えて、配置は、図４Ｃに記載されるように、表面上のある特定の位置に細胞を捕捉するように設計されたエレメントを組み込んでもよい。例えば、エレメントは、流れの方向で流れから細胞を妨げる物理的な構造であってもよい。このような物理的なエレメントにはマイクロウェルが含まれ、細胞が捕捉されるようになってもよい表面のくぼみであり得る。いくつかの実施形態では、細胞固定化などを促進する接着性リガンドのパッチ（例えば抗体など）を用いて細胞を捕捉する。配置を接着範囲に組み込んで、細胞が縁部に直面する前に回転することを可能にする縁部をもたらしてもよい。（例えば、図４Ｄを参照）。
２つの細胞型の正味の置換は、流れの方向に対する異なる角度を形成する少なくとも２つの縁部を含む配置の使用によって達成されてもよい。（例えば、図２を参照）。両タイプの細胞が縁部に沿って回転するように、第１の縁部が角度を作ってもよい。第２の縁部は、ただ１つの細胞型（軌道が図２において破線によって指示される）がその縁部に沿って回転できるように、より大きな角度を作るかまたは異なる受容体組成を有してもよい。図２に示される繰り返しパターンは、例えば広い範囲で次第に第２の縁部を変更することによって、空間的に変化させることができる；このような変化は、特定の細胞型の分離を促進することができる。
本実施例、および本明細書に記載される他の配置によって例証されるように、配置は、様々な数の幾何学的設計のいずれかを有してもよく、その適用に応じて、ある特定のエレメント（例えば、マイクロウェル、接着性リガンドのパッチなど）を組み込んでもよく、または組み込まれなくてもよい。
（実施例１５）
細胞分離用の三次元（３Ｄ）デバイス
本実施例において、細胞分離用の三次元（３Ｄ）デバイスが提供されるだろう。本明細書において検討され、例示されたように、本発明の二次元システムでは、細胞接着分子（例えば、Ｐ−セレクチンおよび／またはＥ−セレクチンなど）でコーティングされた範囲と、コーティングされていない範囲の縁部は、細胞ローリングを促進する。細胞は縁部に沿って回転し、流体の流れ方向に対する角度で、特定の方向に沿って指向される。
三次元の表面では、縁部効果に類似した効果が生じる場合がある。三次元デバイス図を図２１に示す。流体の流れを示す流線は、矢印によって示される。液体を流すことが、例えばシリンダー（図２１Ａ）または突起部（図２１Ｂ）などの物体に直面すると、「沈滞線」が作られる。このような３Ｄデバイスでは、沈滞線は、以下に説明されるように、縁部として作用し、細胞ローリングを促進することができる。
本明細書に定義される沈滞線は、表面上の流れが異なる方向から集まる物体の表面近くの流速がゼロの領域である。沈滞線に沿った剪断はゼロであり、表面に近い流速は、沈滞線を通過する平面を規定する。この平面では、流速は、沈滞線に対して９０度以外の角度を作らなければならない。角度は、垂直の柱の場合には９０度である。
本発明の意図された３Ｄデバイスでは、外表面は、細胞ローリングを誘導することができる細胞接着分子でコーティングされている。表面を横切って流れる流体中の細胞は、表面上で回転するように誘導されてもよい。表面上で回転する細胞は、沈滞点に向かって回転し、次に（ある特定の条件下で）沈滞線に沿って回転し、それによってそれを追跡するだろう。沈滞線が流体の流れ方向に対する角度である場合、細胞は、流体の流れ方向に対する角度の方向に回転してもよい。縁部に沿って回転する場合のように、角度は、角度の値が細胞分離システムの特定の条件に依存する最大角αｔｒを超えない限り、細胞は沈滞線を追跡してもよい。沈滞線は、検討中の表面および表面のまわりの流動場に依存して曲げられてもよい。
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討または本明細書に開示された発明の実施から当業者に明確になる。本明細書および実施例は例示としてのみ考慮されることが意図され、本発明の真の範囲は以下の特許請求の範囲によって示される。

Claims (158)

  1. 細胞接着分子の秩序化層で少なくとも部分的にコーティングされている表面を提供するステップであって、前記表面は、前記秩序化層でコーティングされた範囲と、前記秩序化層でコーティングされていない別の範囲との間に少なくとも１つの縁部を含む、ステップと、
    前記少なくとも１つの縁部とゼロではない角度αｓを形成する方向に、前記表面を横切って細胞集団を流すステップであって、前記細胞集団中の少なくとも１つの細胞は、前記細胞接着分子によって認識される表面部分を含み、前記少なくとも１つの細胞は、前記少なくとも１つの縁部の少なくとも一部と相互作用する結果として、流れの方向に対してαｓである方向に、ある時間回転する、ステップと
    を含む方法。
  2. 前記少なくとも１つの細胞が、前記少なくとも１つの縁部の少なくとも一部に沿って回転する結果として、前記流れの方向に対してαｓである方向に、ある時間回転する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞集団の残りから前記少なくとも１つの細胞を分離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記縁部から一細胞直径より大きい距離で、前記コーティングされた範囲上を回転している、前記表面部分を含む細胞が、前記流れの方向に対してαｓより小さい角度で回転する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記縁部から一細胞直径より大きい前記コーティングされた範囲上を回転している、前記表面部分を含む細胞が、前記流れの方向と同じ方向に回転する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記縁部が実質的に直線である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記縁部が曲線状部分を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記少なくとも１つの縁部が、直線部分および曲線状部分を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記縁部が、約５μｍ未満の距離にわたる、細胞接着分子の密度の約１０％から約９０％への変化に対応する鋭さによって特徴付けられ、ここで、細胞接着分子の密度のパーセンテージが、前記縁部に隣接する前記コーティングされた範囲内の細胞接着分子の最大密度と比較して測定される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記鋭さが、約３μｍ未満の距離にわたる、細胞接着分子の密度の約１０％から約９０％への変化に対応する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記鋭さが、約２μｍ未満の距離にわたる、細胞接着分子の密度の約１０％から約９０％への変化に対応する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記鋭さが、約１μｍ未満の距離にわたる、細胞接着分子の密度の約１０％から約９０％への変化に対応する、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記鋭さが、約０．５μｍ未満の距離にわたる、細胞接着分子の密度の約１０％から約９０％への変化に対応する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記鋭さが、約０．２μｍ未満の距離にわたる、細胞接着分子の密度の約１０％から約９０％への変化に対応する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記鋭さが、約０．１μｍ未満の距離にわたる、細胞接着分子の密度の約１０％から約９０％への変化に対応する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記表面が複数の縁部を含む、請求項１に記載の方法。
  17. 少なくとも１つのコーティングされた範囲が、２つの縁部を有する細片を画定する、請求項１に記載の方法。
  18. 前記２つの縁部が実質的に平行である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記表面が、複数のコーティングされた範囲を含む、請求項１に記載の方法。
  20. それぞれのコーティングされた範囲が、２つの縁部を有する細片を画定する、請求項１９に記載の方法。
  21. それぞれの細片の前記２つの縁部が、実質的に平行である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記細片が互いに実質的に平行である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記細片が、隣接する細片間の実質的に固定された距離ｗｇを有するギャップによって互いに分離され、前記細片がそれぞれ、実質的に同じ幅ｗｓを有する、請求項２２に記載の方法。
  24. ｗｓが約０．０１μｍ〜約１０ｍｍの範囲にある、請求項２３に記載の方法。
  25. ｗｓが約１００μｍ未満である、請求項２４に記載の方法。
  26. ｗｓが約７５μｍ未満である、請求項２５に記載の方法。
  27. ｗｓが約５０μｍ未満である、請求項２６に記載の方法。
  28. ｗｓが約０．１μｍ超である、請求項２４に記載の方法。
  29. ｗｓが約１μｍ超である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記少なくとも１つの細胞が平均直径ｄを有し、ｗｓ＜３ｄである、請求項２９に記載の方法。
  31. ｗｓ＜２ｄである、請求項３０に記載の方法。
  32. ｗｓ＜ｄである、請求項３１に記載の方法。
  33. ｗｇが約０．２μｍ〜約１０ｍｍの範囲にある、請求項２３に記載の方法。
  34. ｗｇが約１００μｍ未満である、請求項３３に記載の方法。
  35. ｗｇが約７５μｍ未満である、請求項３４に記載の方法。
  36. ｗｇが約５０μｍ未満である、請求項３５に記載の方法。
  37. ｗｇが約１μｍ超である、請求項３６に記載の方法。
  38. ｗｇが約５μｍ超である、請求項３７に記載の方法。
  39. ｗｇが約１０μｍ超である、請求項３８に記載の方法。
  40. ｗｇがｗｓにおよそ等しい、請求項３９に記載の方法。
  41. ｗｇがｗｓより大きい、請求項４０に記載の方法。
  42. ｗｇがｗｓより小さい、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記少なくとも１つの細胞が、接触半径ｒｃｏｎｔａｃｔで前記縁部に沿って回転し、ｗｇ＞ｒｃｏｎｔａｃｔである、請求項４２に記載の方法。
  44. ｗｇ＜１．５・ｒｃｏｎｔａｃｔである、請求項４３に記載の方法。
  45. ｗｇ＜１．２・ｒｃｏｎｔａｃｔである、請求項４４に記載の方法。
  46. ｗｇ＜１．１・ｒｃｏｎｔａｃｔである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記細片が互いに平行ではない、請求項２０に記載の方法。
  48. 少なくとも１つのコーティングされた範囲が、正方形、矩形、三角形、多角形、楕円、円、弧、波、およびこれらの組合せからなる群より選択される形状を画定する、請求項１に記載の方法。
  49. 前記細胞集団が、共通の特性を有する細胞の少なくとも１つの部分集団を含み、前記流すステップにおいて、前記部分集団中の少なくとも１つの細胞が、前記少なくとも１つの縁部の少なくとも一部と相互作用する結果として、前記流れの方向に対してαｓである方向に、ある時間回転する、請求項１に記載の方法。
  50. 前記部分集団からの実質的にすべての細胞が、前記縁部の少なくとも一部に沿って回転する結果として、前記流れの方向に対してαｓである方向に、ある時間回転する、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記部分集団中の細胞すべてが、前記細胞接着分子によって認識される表面部分を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記表面部分が、Ｐ−セレクチンのリガンド、Ｅ−セレクチンのリガンド、Ｌ−セレクチンのリガンド、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記表面部分が、Ｐ−セレクチンリガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、グリコシル化依存性細胞接着分子−１（ＧｌｙＣＡＭ−１）、ＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ４４、Ｅ−セレクチンリガンド−１（ＥＳＬ−１）、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記表面部分が、ＶＬＡ−４、ｇｐ２００、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
  55. 前記部分集団中の細胞がすべて幹細胞である、請求項５１に記載の方法。
  56. 前記部分集団中の細胞が、間葉幹細胞、造血幹細胞、および胚性幹細胞からなる群より選択される幹細胞である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記部分集団中の細胞がすべて癌細胞である、請求項５１に記載の方法。
  58. 前記部分集団中の細胞がすべて前駆細胞である、請求項５１に記載の方法。
  59. 前記部分集団中の細胞がすべて、赤血球、好中球、リンパ球、単球、白血球、およびこれらの組合せからなる群より選択される細胞型である、請求項５１に記載の方法。
  60. 前記細胞接着分子が、前記表面に非共有結合的に結合している、請求項１に記載の方法。
  61. 前記細胞接着分子が、前記表面に共有結合している、請求項１に記載の方法。
  62. 前記細胞接着分子が、リンカー部分を介して前記表面に共有結合している、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記リンカー部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記細胞接着分子が、セレクチン、インテグリン、カドヘリン、免疫グロブリン細胞接着分子、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  65. 前記細胞接着分子が、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記細胞接着分子が、アプタマー、炭水化物、およびペプチドからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  67. 前記細胞接着分子が、１つまたは複数の細胞外基質細胞接着分子を含む、請求項１に記載の方法。
  68. 前記細胞外基質細胞接着分子が、ビトロネクチン、フィブロネクチン、およびラミニンからなる群より選択される、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記秩序化層が、様々な種類の細胞接着分子の組合せを含む、請求項１に記載の方法。
  70. 前記細胞接着分子の秩序化層が抗体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  71. 前記抗体が前記表面部分に結合する、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記秩序化層が、１００：１〜１：１００の範囲の細胞接着分子対抗体のモル比で、細胞接着分子および抗体を含む、請求項７０に記載の方法。
  73. 前記秩序化層が、２０：１〜１：１の範囲の細胞接着分子対抗体のモル比で、細胞接着分子および抗体を含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記細胞接着分子の秩序化層が、１つまたは複数の細胞修飾リガンドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  75. 前記１つまたは複数の細胞修飾リガンドが、前記秩序化層に非共有結合的に結合している、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記細胞集団が、共通の特性を有する細胞の少なくとも１つの部分集団を含み、前記細胞修飾リガンドが、前記細胞の部分集団の表現型を修飾することができる、請求項７４に記載の方法。
  77. 前記部分集団中の細胞がすべて幹細胞である、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記部分集団中の細胞が、間葉幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、およびこれらの組合せからなる群より選択される幹細胞である、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記部分集団中の細胞がすべて癌細胞である、請求項７７に記載の方法。
  80. 前記部分集団中の細胞がすべて前駆細胞である、請求項７７に記載の方法。
  81. 前記部分集団中の細胞がすべて、赤血球、好中球、リンパ球、単球、白血球、およびこれらの組合せからなる群より選択される細胞型である、請求項７７に記載の方法。
  82. 前記流すステップにおいて、前記細胞集団が、前記縁部と少なくとも約０．５度の角度αｓを形成する方向に流される、請求項１に記載の方法。
  83. αｓが少なくとも約１度である、請求項８２に記載の方法。
  84. αｓが少なくとも約２度である、請求項８３に記載の方法。
  85. αｓが少なくとも約３度である、請求項８４に記載の方法。
  86. αｓが少なくとも約４度である、請求項８５に記載の方法。
  87. αｓが少なくとも約５度である、請求項８６に記載の方法。
  88. αｓが少なくとも約６度である、請求項８７に記載の方法。
  89. αｓが少なくとも約７度である、請求項８８に記載の方法。
  90. αｓが少なくとも約８度である、請求項８９に記載の方法。
  91. αｓが約７０度未満である、請求項８２に記載の方法。
  92. αｓが約６５度未満である、請求項９１に記載の方法。
  93. αｓが約６０度未満である、請求項９２に記載の方法。
  94. αｓが約５５度未満である、請求項９３に記載の方法。
  95. αｓが約５０度未満である、請求項９４に記載の方法。
  96. αｓが約４５度未満である、請求項９５に記載の方法。
  97. αｓが約４０度未満である、請求項９６に記載の方法。
  98. αｓが約３５度未満である、請求項９７に記載の方法。
  99. αｓが約３０度未満である、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記少なくとも１つの細胞が、少なくとも約０．１μｍ／ｓの平均の速さで、前記流れの方向に対してαｓである方向に回転する、請求項１に記載の方法。
  101. 前記少なくとも１つの細胞が、少なくとも約０．５μｍ／ｓの平均の速さで、前記流れの方向に対してαｓである方向に回転する、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記少なくとも１つの細胞が、少なくとも約０．８μｍ／ｓの平均の速さで、前記流れの方向に対してαｓである方向に回転する、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記少なくとも１つの細胞が、少なくとも約１．０μｍ／ｓの平均の速さで、前記流れの方向に対してαｓである方向に回転する、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記表面上を流される細胞上の剪断応力が、約０．０５ｄｙｎ／ｃｍ２〜約５０ｄｙｎ／ｃｍ２の間の範囲である、請求項１に記載の方法。
  105. 前記表面上を流される細胞上の剪断応力が、約０．２ｄｙｎ／ｃｍ２〜約５ｄｙｎ／ｃｍ２の間の範囲である、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記少なくとも１つの細胞が、少なくとも約０．２５μｍの細胞接触半径（ｒｃｏｎｔａｃｔ）で前記表面範囲と接触する、請求項１に記載の方法。
  107. ｒｃｏｎｔａｃｔが少なくとも約１μｍである、請求項１０６に記載の方法。
  108. ｒｃｏｎｔａｃｔが少なくとも約２μｍである、請求項１０７に記載の方法。
  109. ｒｃｏｎｔａｃｔが少なくとも約３μｍである、請求項１０８に記載の方法。
  110. ｒｃｏｎｔａｃｔが少なくとも約４μｍである、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記流すステップの前に、細胞変形能を改変する薬剤で前記細胞集団を処理するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  112. 前記細胞変形能を修飾する薬剤が、サイトカラシン、Ｎ−エチルマレイミド、ｐ−クロロメルクリベンゼン、ビンブラスチン、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記細胞の部分集団を収集するステップをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  114. 前記細胞集団が、共通の特性を有する細胞の少なくとも１つの部分集団を含み、前記流すステップにおいて、前記部分集団由来の細胞の大多数が前記縁部に沿って回転しない、請求項１に記載の方法。
  115. 前記細胞の部分集団を収集するステップをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記表面が、前記表面上の前記少なくとも１つの細胞を捕獲するためのエレメントをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  117. 前記エレメントが、細胞が前記流れの方向に流れることを妨げる物理的構造である、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記エレメントがマイクロウェルである、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記エレメントが接着性パッチである、請求項１１６に記載の方法。
  120. 前記接着性パッチが抗体を含む、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記表面が、少なくとも１つのコーティングされた範囲に隣接する、少なくとも１つの接着性パッチをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  122. 前記少なくとも１つの接着性パッチが、前記流れの方向に関して、前記コーティングされた範囲の上流に位置する、請求項１２１に記載の方法。
  123. 少なくとも２つの縁部が、前記流体の流れの方向に対して異なる角度を形成する、請求項１６に記載の方法。
  124. 分離流チャンバーであって、細胞接着分子の秩序化層で少なくとも部分的にコーティングされている表面を含み、前記表面が、前記秩序化層でコーティングされた範囲と、前記秩序化層でコーティングされていない別の範囲との間に少なくとも１つの縁部を含む、分離流チャンバーと、
    前記分離流チャンバー中に細胞を流すための入口と、
    前記分離流チャンバーから外へ細胞を流すための出口と
    を備えるデバイスであって、
    細胞が前記入口から前記出口に流されるとき、前記細胞は、前記少なくとも１つの縁部と相互作用しない限り、前記少なくとも１つの縁部の方向に対して角度αｓで流れるデバイス。
  125. 前記分離流チャンバーに接続された、少なくとも１つの追加の出口をさらに含む、請求項１２４に記載のデバイス。
  126. 前記分離チャンバーに接続された、少なくとも１つの追加の入口をさらに含む、請求項１２４に記載のデバイス。
  127. 少なくとも１つの入口が、前記分離流チャンバー中に細胞集団を導入し、少なくとも１つの入口が、前記分離流チャンバー中に細胞を含まない緩衝液を導入する、請求項１２６に記載のデバイス。
  128. 前記分離流チャンバーが、約５μｍから１ｍｍの間の高さを有する壁によって画定される、請求項１２４に記載のデバイス。
  129. 前記分離流チャンバーが、約１００μｍ未満の高さを有する壁によって画定される、請求項１２８に記載のデバイス。
  130. 前記分離流チャンバーが、約７５μｍ未満の高さを有する壁によって画定される、請求項１２９に記載のデバイス。
  131. 前記分離流チャンバーが、約５０μｍ未満の高さを有する壁によって画定される、請求項１３０に記載のデバイス。
  132. 前記分離流チャンバーが、約２５μｍ未満の高さを有する壁によって画定される、請求項１３１に記載のデバイス。
  133. 前記分離流チャンバーが、約１５μｍ未満の高さを有する壁によって画定される、請求項１３２に記載のデバイス。
  134. 前記分離流チャンバーが矩形の形状を有する、請求項１２４に記載のデバイス。
  135. 前記分離流チャンバーが、不均一な高さを有する壁によって画定される、請求項１２４に記載のデバイス。
  136. 前記分離流チャンバーが、段階的に変化する高さを有する壁によって画定される、請求項１３５に記載のデバイス。
  137. 前記出口から外へ流れる細胞が、別のデバイス中に流れる、請求項１２４に記載のデバイス。
  138. 前記入口へ流れる細胞が、別のデバイスから流れる、請求項１２４に記載のデバイス。
  139. 前記分離流チャンバーを通じて流される細胞の少なくとも１つの部分集団を収集するためのチャネルをさらに備える、請求項１２４に記載のデバイス。
  140. 前記チャネルの一端に多孔質フィルターをさらに備える、請求項１３９に記載のデバイス。
  141. 前記分離チャンバーを通じて流される細胞の部分集団を収集するための複数のチャネルをさらに備える、請求項１２４に記載のデバイス。
  142. 多孔質フィルターをさらに含む、請求項１４１に記載のデバイスであって、前記多孔質フィルターがチャネル間に位置しているデバイス。
  143. 収集された細胞を、眼、低倍率の顕微鏡、ルーペ、またはこれらの組合せによって視覚化することができる、請求項１３９に記載のデバイス。
  144. レンズが前記収集チャネルを拡大するように位置したルーペをさらに含む、請求項１４３に記載のデバイス。
  145. 前記チャネル内の収集された細胞の視覚化が、着色流体、色素、またはこれらの組合せによって促進される、請求項１３９に記載のデバイス。
  146. 前記チャネル内の収集された細胞の視覚化が、光を照射することによって促進される、請求項１３９に記載のデバイス。
  147. 前記表面が接着性パッチをさらに含む、請求項１２４に記載のデバイス。
  148. 流量を制御するための手段をさらに含む、請求項１２４に記載のデバイス。
  149. 前記流量を制御するための手段が、シリンジポンプを備える、請求項１４８に記載のデバイス。
  150. 収集された細胞の数の推定値が、更なる処理を伴うことなく得ることができる、請求項１３９に記載のデバイス。
  151. 請求項１５０に記載のデバイスであって、前記収集チャネルに沿ってしるしをさらに含み、その結果、収集された細胞のカラムの高さが、細胞の体積および／または細胞数の目安を与えるデバイス。
  152. 細胞が流体中で流される、請求項１２４に記載のデバイス。
  153. 細胞が毛管現象によって流される、請求項１２４に記載のデバイス。
  154. 細胞が減圧下で流される、請求項１２４に記載のデバイス。
  155. 細胞が、少なくとも部分的に、引力、界面動電力、遠心力、およびこれらの組合せより選択される力によって流される、請求項１２４に記載のデバイス。
  156. 細胞接着分子の秩序化層で少なくとも部分的にコーティングされた三次元表面を提供するステップと、
    流れのまったくないよどみ線を作り出すような条件で、前記表面を横切って細胞集団を流すステップと
    を含む方法であって、流れの方向は、前記よどみ線とゼロではない角度αｓを形成し、前記細胞集団中の少なくとも１つの細胞は、前記細胞接着分子によって認識される表面部分を含み、前記細胞集団中の少なくとも１つの細胞は、前記流れの方向に対してαｓである方向に、少なくとも一部の時間回転する、方法。
  157. 前記三次元表面が、円柱の外側表面の少なくとも一部を含む、請求項１５６に記載の方法。
  158. 前記三次元表面が、稜線、溝、隆起、またはこれらの組合せの外側表面の少なくとも一部を含む、請求項１５６に記載の方法。
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