JP2010266813A - 観察装置 - Google Patents

Abstract

【課題】レーザ光の集光が光学素子に及ぼす影響を抑制しながら、良好な観察性能を実現する走査型観察装置を提供することを課題とする。
【解決手段】観察装置１００は、標本１を配置するステージ２と、レーザ光を標本１上に集光させる対物レンズ３と、レーザ光を対物レンズ３に導く照明手段１０と、標本１内の集光位置である標本集光位置を光軸方向に走査する集光位置走査手段２０と、照明手段１０と集光位置走査手段２０とを制御する制御手段４０と、を含んで構成される。このとき、制御手段４０は、照明光路中の集光位置である中間集光位置と、レーザ光の集光が制限される照明光路中の集光制限位置とに基づいて、照明手段１０と集光位置走査手段２０を制御する。
【選択図】図１

Description

本発明は、観察装置に関し、特にレーザ光源を用いた走査型の観察装置に関する。

共焦点効果によって光軸方向に高い分解能を有するレーザ走査型の観察装置がある。レーザ走査型の観察装置は、標本内部の観察や標本の３次元画像の取得に好適であり、生物用や工業用の観察装置として広く用いられている。

このような観察装置では、対物レンズや、標本を配置したステージを駆動することで焦点位置を光軸方向に走査する構成が一般的である。しかし、このような構成では、対物レンズやステージを駆動することにより標本が振動し、観察結果に影響を及ぼしてしまうことがある。また、対物レンズやステージを高速に駆動することができないため、標本を高速に走査することが困難な場合もある。

以上のような課題を解決するため、特許文献１から特許文献３では、対物レンズやステージを駆動することなく、照明光路中に配置された他の光学素子（以降、ｚ走査制御素子と記す。）を用いて、焦点位置を光軸方向に走査する技術が提案されている。

特許文献１では、参照レンズ（reference lens）と参照ミラー（reference mirror）を使用して、焦点位置を光軸方向に走査する技術が開示されている。
特許文献２では、液晶空間光変調器を使って、焦点位置を光軸方向に走査する技術が開示されている。
特許文献３では、デフォーマブルミラーを使って、焦点位置を光軸方向に走査する技術が開示されている。
これらの技術を用いてｚ走査制御素子を制御することで、対物レンズやステージを動かすことなく、標本上の焦点位置を走査することができる。
なお、特許文献２及び特許文献３の技術では、焦点位置の移動に伴って生じる球面収差も補正することができる。

国際公開第２００８／０７８０８３号パンフレット 特開平１１−３２６８６０号公報 特開２００４−３４１３９４号公報

ところで、レーザ光源から射出されるレーザ光は、強い指向性と収束性を有しているため、照明光路上の集光位置（以降、中間集光位置と記す。）や、焦点位置、つまり、標本内の集光位置（以降、標本集光位置と記す。）には、非常に強い光エネルギーが生じる。このような強い光エネルギーが光学素子に加わると、その光学素子が変形するなどし、観察装置で良好な観察性能が得られなくなってしまうことがある。
また、観察光路上の集光位置（以降、中間像位置と記す。）が光学素子上に位置する場合には、光学素子上のゴミや傷が画像に影響し観察性能を劣化させてしまうことがある。
このため、通常の観察装置は、観察装置内部の光学素子が中間集光位置や中間像位置に位置しないように、設計される。

ところが、上述した技術のようにｚ走査制御素子を制御することで標本集光位置を走査する構成の場合、中間集光位置や中間像位置も変化する。より具体的には、中間集光位置や中間像位置は、標本集光位置の走査量に対して対物レンズの倍率の２乗倍程度移動する。このため、わずかな標本集光位置の走査であっても中間集光位置や中間像位置は大きく変化するため、走査中に光学素子が中間集光位置や中間像位置に位置してしまうことになる。
以上のような実情を踏まえ、本発明は、良好な観察性能を実現する走査型の観察装置を提供することを課題とする。

本発明の第１の態様は、標本を配置するステージと、レーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、レーザ光を対物レンズに導く照明手段と、標本内の集光位置である標本集光位置を光軸方向に走査する第１走査手段と、照明光路中の集光位置である中間集光位置及びレーザ光の集光が制限される集光制限位置に基づいて、照明手段と第１走査手段とを制御する制御手段と、を含む観察装置を提供する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の観察装置において、制御手段は、第１走査手段の駆動を制御する走査制御手段と、中間集光位置を算出する中間集光位置算出手段と、集光制限位置を算出する集光制限位置算出手段と、照明手段を制御する照明制御手段と、を含む観察装置を提供する。

本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の観察装置において、照明手段は、光源を含み、照明制御手段は、集光制限位置と中間集光位置が重なるとき、光源から射出されるレーザ光の強度を低下させる観察装置を提供する。

本発明の第４の態様は、第２の態様に記載の観察装置において、照明手段は、光源と、光源と集光制限位置の間に配置された光量変調手段と、を含み、照明制御手段は、集光制限位置と中間集光位置が重なるとき、光量変調手段を通過するレーザ光の強度を低下させる観察装置を提供する。

本発明の第５の態様は、第３の態様または第４の態様に記載の観察装置において、レーザ光の強度は、集光制限位置と中間集光位置が重なる位置に応じて変化する観察装置を提供する。

本発明の第６の態様は、第２の態様に記載の観察装置において、照明手段は、光源と、光源と集光制限位置の間に配置されたシャッター装置と、を含み、照明制御手段は、集光制限位置と中間集光位置が重なるとき、シャッター装置にレーザ光を遮断させる観察装置を提供する。

本発明の第７の態様は、第２の態様に記載の観察装置において、走査制御手段は、集光制限位置と中間集光位置が重なる位置への第１走査手段による走査を制限する観察装置を提供する。

本発明の第８の態様は、第２の態様に記載の観察装置において、さらに、標本集光位置を光軸と垂直な方向に走査する第２走査手段を含み、走査制御手段は、集光制限位置と中間集光位置が重なる位置への第２走査手段による走査を制限する観察装置を提供する。

本発明の第９の態様は、第２の態様に記載の観察装置において、さらに、標本と対物レンズの間の距離を変化させる第３走査手段を含み、走査制御手段は、第３制御手段の駆動を制御する観察装置を提供する。
本発明の第１０の態様は、第９の態様に記載の観察装置において、第３走査手段は、対物レンズを光軸方向に駆動する観察装置を提供する。
本発明の第１１の態様は、第９の態様に記載の観察装置において、第３走査手段は、ステージを光軸方向に駆動する観察装置を提供する。

本発明の第１２の態様は、第９の態様に記載の観察装置において、走査制御手段は、第１走査手段及び第３走査手段により、集光制限位置と中間集光位置が重ならないように、標本集光位置を光軸方向に走査する観察装置を提供する。

本発明の第１３の態様は、第１２の態様に記載の観察装置において、走査制御手段は、集光制限位置と中間集光位置が重ならないとき、第１走査手段により標本集光位置を光軸方向に走査し、集光制限位置と中間集光位置が重なるとき、第３走査手段により標本集光位置を光軸方向に走査する観察装置を提供する。

本発明の第１４の態様は、第１２の態様に記載の観察装置において、走査制御手段は、集光制限位置を走査する前に、第３走査手段により、走査中に中間集光位置と集光制限位置が重ならない位置に標本を移動させる観察装置を提供する。

本発明の第１５の態様は、第２の態様に記載の観察装置において、さらに、標本を撮像する撮像手段を含み、撮像手段は、集光制限位置と中間集光位置が重なるとき、撮像しない観察装置を提供する。

本発明の第１６の態様は、第２の態様に記載の観察装置において、中間集光位置算出手段は、対物レンズ、照明手段及び第１走査手段を構成する光学素子の配置に基づいて、中間集光位置を算出する観察装置を提供する。

本発明の第１７の態様は、第２の態様に記載の観察装置において、中間集光位置算出手段は、標本集光位置に基づいて、中間集光位置を算出する観察装置を提供する。

本発明の第１８の態様は、第２の態様に記載の観察装置において、さらに、レーザ光の波面を計測する波面計測手段を含み、中間集光位置算出手段は、波面計測手段による計測結果に基づいて、中間集光位置を算出する観察装置を提供する。

本発明の第１９の態様は、第２の態様に記載の観察装置において、集光制限位置算出手段は、対物レンズ、照明手段及び第１走査手段を構成する光学素子の配置に基づいて、集光制限位置を算出する観察装置を提供する。

本発明の第２０の態様は、標本を配置するステージと、レーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、標本内の集光位置である標本集光位置を光軸方向に走査する第１走査手段と、標本集光位置を観察する観察手段と、観察光路中の集光位置である中間像位置及びレーザ光の集光が制限される集光制限位置に基づいて、観察手段と第１走査手段とを制御する制御手段と、を含む観察装置を提供する。

本発明の第２１の態様は、第２０の態様に記載の観察装置において、制御手段は、第１走査手段の駆動を制御する走査制御手段と、中間像位置を算出する中間集光位置算出手段と、集光制限位置を算出する集光制限位置算出手段と、観察手段を制御する観察制御手段と、を含む観察装置を提供する。

本発明の第２２の態様は、第２１の態様に記載の観察装置において、走査制御手段は、集光制限位置と中間像位置が重なる位置への第１走査手段による走査を制限する観察装置を提供する。

本発明の第２３の態様は、第２１の態様に記載の観察装置において、さらに、標本集光位置を光軸と垂直な方向に走査する第２走査手段を含み、走査制御手段は、集光制限位置と中間像位置が重なる位置への第２走査手段による走査を制限する観察装置を提供する。

本発明の第２４の態様は、第２１の態様に記載の観察装置において、さらに、標本と対物レンズの間の距離を変化させる第３走査手段を含み、走査制御手段は、第３制御手段の駆動を制御する観察装置を提供する。
本発明の第２５の態様は、第２４の態様に記載の観察装置において、第３走査手段は、対物レンズを光軸方向に駆動する観察装置を提供する。
本発明の第２６の態様は、第２４の態様に記載の観察装置において、第３走査手段は、ステージを光軸方向に駆動する観察装置を提供する。

本発明の第２７の態様は、第２４の態様に記載の観察装置において、走査制御手段は、第１走査手段及び第３走査手段により、集光制限位置と中間像位置が重ならないように、標本集光位置を光軸方向に走査する観察装置を提供する。

本発明の第２８の態様は、第２７の態様に記載の観察装置において、走査制御手段は、集光制限位置と中間像位置が重ならないとき、第１走査手段により標本集光位置を光軸方向に走査し、集光制限位置と中間像位置が重なるとき、第３走査手段により標本集光位置を光軸方向に走査する観察装置を提供する。

本発明の第２９の態様は、第２７の態様に記載の観察装置において、走査制御手段は、集光制限位置を走査する前に、第３走査手段により、走査中に中間像位置と集光制限位置が重ならない位置に標本を移動させる観察装置を提供する。

本発明の第３０の態様は、第２１の態様に記載の観察装置において、観察手段は、撮像手段を含み、撮像手段は、集光制限位置と中間像位置が重なるとき、撮像しない観察装置を提供する。

本発明の第３１の態様は、第２１の態様に記載の観察装置において、中間集光位置算出手段は、対物レンズ、観察手段及び第１走査手段を構成する光学素子の配置に基づいて、中間像位置を算出する観察装置を提供する。

本発明の第３２の態様は、第２１の態様に記載の観察装置において、中間集光位置算出手段は、標本集光位置に基づいて、中間像位置を算出する観察装置を提供する。

本発明の第３３の態様は、第２１の態様に記載の観察装置において、集光制限位置算出手段は、対物レンズ、照明手段及び第１走査手段を構成する光学素子の配置に基づいて、集光制限位置を算出する観察装置を提供する。

本発明の第３４の態様は、顕微鏡照明方法であって、レーザ光の集光が制限される照明光路中の集光制限位置と照明光路中の集光位置である中間集光位置とが重なる範囲を表示する第１のステップと、標本内の集光位置である標本内集光位置を光軸方向に走査する範囲を設定する第２のステップと、レーザ光で標本を照明する第３のステップと、を含み、第３のステップでは、集光制限位置と中間集光位置とが重なるとき、レーザ光の強度を変調する顕微鏡照明方法を提供する。

本発明の第３５の態様は、顕微鏡観察方法であって、レーザ光の集光が制限される観察光路中の集光制限位置と観察光路中の集光位置である中間像位置とが重なる範囲を表示する第１のステップと、標本内の集光位置である標本内集光位置を光軸方向に走査する範囲を設定する第２のステップと、標本を観察する第３のステップと、を含み、第３のステップでは、集光制限位置と中間像位置とが重なるとき、標本を撮像しない顕微鏡観察方法を提供する。

本発明によれば、良好な観察性能を実現する走査型の観察装置を提供することができる。

実施例１に係る観察装置の構成を説明するための図である。 実施例１に係る制御手段の構成を説明するための図である。 実施例１に係る制御手段による集光制限位置の算出結果の一例を示す概念図である。 制御手段による集光可能位置の算出結果の一例を示す概念図である。 実施例１に係る観察装置の走査制御を示すフローチャートである。 実施例１に係る観察装置の走査制御の変形例を示すフローチャートである。 実施例２に係る観察装置の構成を説明するための図である。 実施例３に係る観察装置の構成を説明するための図である。 実施例３に係る波面計測手段の構成を示す概略図である。 実施例３に係る観察装置の走査制御を示すフローチャートである。 実施例４に係る観察装置の作用を説明するための図である。 実施例５に係る観察装置の構成を説明するための図である。 実施例５に係る観察装置の走査制御を示すフローチャートである。 実施例６に係る観察装置の構成を説明するための図である。 実施例７に係る観察装置の構成を説明するための図である。 実施例７に係る観察装置の走査制御を示すフローチャートである。

以下、図面を参照しながら、本発明の各実施例について説明する。

図１は、本実施例に係る観察装置の構成を説明するための図である。図１に例示される観察装置１００は、２光子励起蛍光顕微鏡である。観察装置１００は、標本１を配置するステージ２と、レーザ光を標本上に集光させる対物レンズ３と、レーザ光を対物レンズ３に導く照明手段１０と、標本集光位置を光軸方向に走査する集光位置走査手段２０と、標本からの生じる蛍光を観察する観察手段３０と、観察装置１００全体を制御する制御手段４０と、入力手段５０と、表示手段６０と、を含んで構成されている。

照明手段１０は、超短パルスレーザ光源１１と、ＡＯＭ（Acoustic Optics Modulator）シャッター装置１２と、分散補償器１３と、ビームエキスパンダ１４と、倍率変更機能を有するズーム式のビームエキスパンダ１５と、標本集光位置を光軸と垂直な方向に走査するガルバノミラー１６と、リレーレンズ１７と、結像レンズ１８とを含んで構成されている。

集光位置走査手段２０は、ビームエキスパンダ１４とビームエキスパンダ１５の間に配置され、偏光ビームスプリッタ２１と、１／２波長板２２と、ｚスキャンレンズ２３と、ピエゾミラー２４とを含んで構成されている。なお、集光位置走査手段２０は、観察装置１００の第１走査手段である。

超短パルスレーザ光源１１から断続的に射出された超短パルスレーザ光は、音響光学素子を用いて構成されるＡＯＭシャッター装置１２に入射する。ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが開いた状態では、レーザ光は分散補償器１３に入射し、レーザ光の色分散によって生じる収差が補償される。そして、レーザ光は、ビームエキスパンダ１４でビーム径や広がり角が変更されて、集光位置走査手段２０へ入射する。集光位置走査手段２０へ入射したレーザ光は、偏光ビームスプリッタ２１で反射される。そして、偏光ビームスプリッタ２１とピエゾミラー２４との間の光路を往復して、再び偏光ビームスプリッタ２１へ入射する。この往復の間に、レーザ光は１／２波長板２２を２度通過する。これにより、レーザ光の偏光方向が９０度回転するため、レーザ光は偏光ビームスプリッタ２１を透過し、ビームエキスパンダ１５へ入射する。

ｚスキャンレンズ２３とピエゾミラー２４は、特許文献１における参照レンズと参照ミラーに対応する光学素子である。ピエゾミラー２４を光軸方向に駆動させて、ピエゾミラー２４とｚスキャンレンズ２３との相対的な距離を変更することで、標本集光位置を光軸方向に走査することができる。なお、対物レンズ３を含む光学系（第１光学系）とｚスキャンレンズ２３及びピエゾミラー２４を含む光学系（第２光学系）は、以下の条件式（１）を満たして構成される。ここで、ｆ_１は対物レンズ３の焦点距離であり、ｎ_１は標本１と対物レンズ３の間の屈折率である。ｆ_２はｚスキャンレンズ２３の焦点距離であり、ｎ_２はｚスキャンレンズ２３とピエゾミラー２４の間の屈折率である。また、Ｍ_１２は、第１光学系と第２光学系との間の投影倍率である。
ｎ_１ｆ_１＝Ｍ_１２ｎ_２ｆ_２ ・・・（１）
これにより、ハーシェルの条件が満されるため、観察装置１００は、標本集光位置の光軸方向の走査に伴う球面収差を補正することができる。

ビームエキスパンダ１５に入射したレーザ光は、ビームエキスパンダ１５の倍率変更機能により、条件式（１）が満たされるように、投影倍率Ｍ_１２が調整される。ビームエキスパンダ１５による投影倍率Ｍ_１２の調整は、例えば、対物レンズ３の交換により焦点距離ｆ_１が変化した場合や、光軸方向の走査により屈折率ｎ_１が変化した場合などに行われる。

その後、レーザ光は、ガルバノミラー１６、リレーレンズ１７、結像レンズ１８、及びダイクロイックミラー３１を介して対物レンズ３へ入射する。対物レンズ３は、レーザ光を標本１上の標本集光位置に照射する。なお、ガルバノミラー１６は、観察装置１００の第２走査手段である。

レーザ光が照射された標本では、２光子励起により蛍光が発生する。この蛍光は対物レンズ３を介して観察手段３０へ入射する。蛍光はダイクロイックミラー３１を反射し、バリアフィルタ３２を通過する。バリアフィルタ３２は２光子励起により生じた蛍光のみを透過させる。これにより、標本集光位置から生じた蛍光のみが集光レンズ３３で集光されて光電子倍増管３４に入射する。光電子倍増管３４は、撮像素子として機能し、蛍光を電気信号に変換して画像を生成する。

図２は、本実施例に係る制御手段の構成を説明するための図である。制御手段４０は、走査制御手段４１と、照明制御手段４２と、中間集光位置算出手段４３と、集光制限位置算出手段４４と、観察制御手段４５とを含んで構成されている。

走査制御手段４１は、標本集光位置の走査を制御する。より具体的には、走査制御手段４１は、ピエゾミラー２４を制御することで標本集光位置の光軸方向の走査を制御する。また、走査制御手段４１は、ガルバノミラー１６を制御することで標本集光位置の光軸と垂直な方向の走査を制御する。なお、走査制御手段４１は、ピエゾミラー２４とともに、条件式（１）を満たすようにズーム式のビームエキスパンダ１５も制御することが望ましい。

照明制御手段４２は、照明手段１０を制御する。より具体的には、照明制御手段４２は、超短パルスレーザ光源１１から射出されるレーザ光の強度や超短パルスレーザ光源１１のＯＮ／ＯＦＦを制御する。また、照明制御手段４２は、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターの開閉についても制御する。

中間集光位置算出手段４３は、照明光路上の集光位置である中間集光位置を算出する。中間集光位置は、例えば、光学素子の物理的な配置を基に算出される。具体的には、対物レンズ３と、照明手段１０及び集光位置走査手段２０を構成する光学素子の配置に基づいて算出される。また、中間集光位置は、標本集光位置を基に算出されてもよい。

また、中間集光位置算出手段４３は、観察光路上に中間像がある場合、観察光路上の中間像位置を算出してもよい。また、照明光路上の中間像位置を算出してもよい。ここで照明光路上の中間像位置とは、観察手段３０の物点位置に共役となる照明光路上の位置をさすものとする。本実施例では、観察光路上に中間像がないため、照明光路上の観察手段３０の物点に共役な位置となる。
中間像位置は、例えば、光学素子の物理的な配置を基に算出される。具体的には、対物レンズ３と、照明手段１０、集光位置走査手段２０及び観察手段３０のそれぞれを構成する光学素子の配置に基づいて算出される。また、中間像位置は、標本集光位置を基に算出されてもよい。

集光制限位置算出手段４４は、レーザ光の集光が制限される光路中の集光制限位置を算出する。図３Ａは、本実施例に係る制御手段による集光制限位置の算出結果の一例を示す概念図である。なお、ここでは、照明光路上の集光制限位置のみが示されている。図３Ａでは、集光制限位置の範囲は、ハッチングにより示されている。図３Ａに例示されるように、集光制限位置は、例えば、光学素子上や光学素子の周辺である。光学素子上を集光制限位置とする理由は、すでに上述したとおりである。光学素子の周辺を集光制限位置とする理由は、光学素子周辺に集光位置があると光学素子上のゴミや傷が画像に映りこんでしまうからである。なお、制御手段４０は、集光制限位置算出手段４４の代わりに、レーザ光の集光が制限されない光路中の集光可能位置を算出する集光可能位置算出手段を含んで構成されても良い。図３Ｂは、制御手段による集光可能位置の算出結果の一例を示す概念図である。図３Ｂでは、集光可能位置の範囲は、ハッチングにより示されている。
観察制御手段４５は、観察手段を制御する。より具体的には、観察制御手段４５は、光電子倍増管３４による標本１の撮像を制御する。

制御手段４０は、中間集光位置算出手段４３と集光制限位置算出手段４４から得られる情報を基に、中間集光位置または中間像位置と、集光制限位置とが重ならないように集光位置走査手段２０を制御する。例えば、走査制御手段４１は、中間集光位置または中間像位置と集光制限位置が重なる状態では、集光位置走査手段２０を停止させずに、中間集光位置または中間像位置と集光制限位置が重ならない状態まで集光位置走査手段２０を駆動する。

または、制御手段４０は、中間集光位置と集光制限位置が重なる場合には照明手段１０を制御してレーザ光の集光状態を制限する。例えば、照明制御手段４２は、中間集光位置と集光制限位置が重なる状態では、超短パルスレーザ光源１１にレーザ光の射出を停止させる、または、レーザ光の強度を低下させる。この他、照明制御手段４２は、ＡＯＭシャッター装置１２にシャッターを閉じた状態を維持させてもよい。なお、レーザ光の強度を低下させる場合、レーザ光の強度は、中間集光位置と集光制限位置が重なる位置に応じて変化させてもよい。制御手段４０は、例えば、上記の重なった位置にある光学素子の材質等を考慮して、レーザ光の強度を変化させてもよい。

さらに、制御手段４０は、走査制御手段４１によって制御された光軸方向の位置（ｚ位置）を含む平面の一部でのみ中間集光位置または中間像位置と集光制限位置が重なる場合、例えば、光路中に斜めに角度を持って配置されたミラーなどの光学素子の一部が集光制限位置にかかる場合など、ガルバノミラー１６を制御して標本集光位置の光軸と垂直な方向の走査範囲を制限してもよい。
入力手段５０及び表示手段６０は、例えば、観察者による走査範囲を入力や変更などに用いられる。

図４は、本実施例に係る観察装置の走査制御を示すフローチャートである。以下、図４を参照しながら、観察装置１００の制御手段４０による走査制御の一例について説明する。

まず、観察装置１００の走査制御が開始されると、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが閉じられる（ステップＳ１−１）。次に、集光制限位置が算出され、集光制限位置に対応する標本集光位置のｚ位置の範囲が表示手段６０に表示される（ステップＳ１−２）。観察者は、表示手段６０を参照しながら入力手段５０を用いて、標本１を走査する範囲（以降、走査範囲と記す。）を入力する（ステップＳ１−３）。

次に、入力された走査範囲内の各位置に対応する中間集光位置及び集光制限位置が算出される。これらの中間集光位置と集光制限位置を比較し、走査範囲内で中間集光位置と集光制限位置が重なることがあるかどうかが判断される（ステップＳ１−４）。走査範囲内で重なることがない場合、制御はステップＳ１−７へ遷移する。

走査範囲内で中間集光位置と集光制限位置が重なることがある場合、表示手段６０に、中間集光位置と集光制限位置が重なる位置や、中間集光位置と集光制限位置が重なるときの標本集光位置等が表示される（ステップＳ１−５）。

観察者は、表示手段６０に表示された情報に基づいて、走査範囲を変更するかどうかを選択する（ステップＳ１−６）。走査範囲の変更が選択された場合には、制御はステップＳ１−３に遷移する。観察者により走査範囲の変更が不要と判断され、走査範囲の変更が選択されなかった場合には、制御はステップＳ１−７へ遷移する。
ステップＳ１−７では、集光位置操作手段２０は、標本集光位置を走査開始位置まで移動させる。

ステップＳ１−８では、現時点の中間集光位置と集光制限位置が重なっているかどうかが判断される。中間集光位置と集光制限位置が重なっている場合には、制御はステップＳ１−１２へ遷移する。

中間集光位置と集光制限位置が重なっていない場合には、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが開かれ（ステップＳ１−９）、標本１が撮像される（ステップＳ１−１０）。撮像終了後、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが閉じられる（ステップＳ１−１１）。

ステップＳ１−１２では、現時点の標本集光位置が走査終了位置かどうか判断される。標本集光位置が走査終了位置でない場合には、集光位置操作手段２０は、標本集光位置を次のｚ位置まで移動させる（ステップＳ１−１３）。その後、制御はステップＳ１−８に遷移する。標本集光位置が走査終了位置である場合には、走査制御が終了する。
なお、上記の制御において、中間集光位置と集光制限位置の重なりに加えて、中間像位置と集光制限位置の重なりについても考慮して制御することが望ましい。

以上、図４に例示される制御を実施することで、光学素子等にレーザ光が集光することを防止することができる。また、光軸方向の走査に伴う標本の振動及び球面収差も抑えることができる。その結果、観察装置の良好な観察性能が実現される。

図５は、本実施例に係る観察装置の走査制御の変形例を示すフローチャートである。以下、図５を参照しながら、観察装置１００の制御手段４０による走査制御の変形例について説明する。
図５に例示される走査制御のステップＳ１−１からステップＳ１−７までは、図４に例示される走査制御と同様である。このため、説明を省略する。

ステップＳ１−８では、標本集光位置が走査開始位置にある状態で、中間集光位置と集光制限位置が重なっているかどうかが判断される。中間集光位置と集光制限位置が重なっていない場合には、図４に例示される走査制御と同様の制御が実施される。具体的には、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが開かれて（ステップＳ１−９）、標本１が撮像される（ステップＳ１−１０）。撮像終了後、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが閉じられる（ステップＳ１−１１）。その後、制御はステップＳ１−１２へ遷移する。

一方、中間集光位置と集光制限位置が重なっている場合は、図４に例示される走査制御と異なる制御が実施される。まず、超短パルスレーザ光源１１から射出されるレーザ光の強度を低下させる（ステップＳ１−１４）。レーザ光の強度は、上述ように、中間集光位置と集光制限位置が重なる位置に応じて変化させてもよい。その後、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが開かれて（ステップＳ１−１５）、標本１が撮像される（ステップＳ１−１６）。撮像終了後、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが閉じられて（ステップＳ１−１７）、さらに、レーザ光の強度も強度低下前の強度に戻される（ステップＳ１−１８）。その後、制御はステップＳ１−１２へ遷移する。

ステップＳ１−１２では、現時点の標本集光位置が走査終了位置かどうか判断される。標本集光位置が走査終了位置でない場合には、標本集光位置を次のｚ位置まで移動させる（ステップＳ１−１３）。その後、制御はステップＳ１−８に遷移する。標本集光位置が走査終了位置である場合には、走査制御が終了する。

以上、図５に例示される制御を実施することで、すべてのｚ位置で標本１を撮像することができる。この制御では、撮像時にレーザ光が光学素子上に集光している場合であってもレーザ光の強度が低下しているため、レーザ光が光学素子に及ぼす影響が抑制される。また、光軸方向の走査に伴う標本の振動や球面収差も抑えることができ、その結果、良好な観察性能が実現される。

図６は、本実施例に係る観察装置の構成を説明するための図である。図６に例示される観察装置１０１は、図１に例示される観察装置１００と同様に、２光子励起蛍光顕微鏡である。なお、観察装置１０１の構成要素のうち、観察装置１００の構成要素と同様のものには同符号を付し、説明を省略する。

観察装置１０１は、観察装置１００と同様に、標本１を配置するステージ２と、レーザ光を標本上に集光させる対物レンズ３と、レーザ光を対物レンズ３に導く照明手段１０と、標本集光位置を光軸方向に走査する集光位置走査手段２０と、標本からの生じる蛍光を観察する観察手段３０と、観察装置１０１全体を制御する制御手段４０と、入力手段５０と、表示手段６０と、を含んで構成されている。

観察装置１０１は、照明手段１０が偏光ビームスプリッタ２１とビームエキスパンダ１５の間に光量変調手段１９を含んで構成されている点が観察装置１００と異なっている。その他の構成は、観察装置１００と同様である。また、制御手段４０の構成は、観察装置１００と同様に、図２に例示される構成である。

光量変調手段１９は、照明制御手段４２によって制御され、集光位置走査手段２０により変化した中間集光位置に応じて、光量変調手段１９を通過するレーザ光の強度を調整する。光量変調手段１９は、例えば、減光フィルタ（ＮＤフィルタ）で構成される。

観察装置１０１では、図５に例示される走査制御が実施される。ただし、観察装置１０１では、超短パルスレーザ光源１１から射出されるレーザ光の強度を制御する代わりに、光量変調手段１９を透過するレーザ光の強度を制御する。これにより、超短パルスレーザ光源１１から射出されるレーザ光の強度を変更することなく、第１の実施例と同様の効果を得ることができる。

図７は、本実施例に係る観察装置の構成を説明するための図である。図７に例示される観察装置１０２は、図６に例示される観察装置１０１と同様に、２光子励起蛍光顕微鏡である。なお、観察装置１０２の構成要素のうち、観察装置１０１の構成要素と同様のものには同符号を付し、説明を省略する。

観察装置１０２は、観察装置１０１と同様に、標本１を配置するステージ２と、レーザ光を標本上に集光させる対物レンズ３と、レーザ光を対物レンズ３に導く照明手段１０と、標本集光位置を光軸方向に走査する集光位置走査手段２０と、標本からの生じる蛍光を観察する観察手段３０と、観察装置１０２全体を制御する制御手段４０と、入力手段５０と、表示手段６０と、を含んで構成されている。

観察装置１０２は、さらに、照明光路中の光束の波面を計測する波面計測手段７０を含んで構成される点が観察装置１０１と異なっている。その他の構成は、観察装置１０１と同様である。また、制御手段４０の構成は、観察装置１０１と同様に、図２に例示される構成である。

図８は、本実施例に係る波面計測手段の構成を示す概略図である。波面計測手段７０は、図８に例示されるように、いわゆるシャックハルトマン方式の波面計測装置であり、マイクロレンズアレイ７１と、電荷結合素子（ＣＣＤ）７２を含んで構成される。

図９は、本実施例に係る観察装置の走査制御を示すフローチャートである。以下、図９を参照しながら、観察装置１０２の制御手段４０による走査制御の一例について説明する。

まず、観察装置１０２の走査制御が開始されると、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが閉じられる（ステップＳ３−１）。さらに、光量変調手段１９を制御し、光量変調手段１９を通過するレーザ光の強度を低下させる（ステップＳ３−２）。光量変調手段１９を通過するレーザ光の強度は、例えば、照明光路中の光学素子のうち、最もレーザ光の影響を受けやすい光学素子に合わせて決定する。

次に、集光制限位置が算出され、集光制限位置に対応する標本集光位置のｚ位置が表示手段６０に表示される（ステップＳ３−３）。観察者は、表示手段６０を参照しながら入力手段５０を用いて、走査範囲を入力する（ステップＳ３−４）。
その後、集光位置操作手段２０により標本集光位置を走査開始位置まで移動させて（ステップＳ３−５）、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが開かれる（ステップＳ３−６）。

ステップＳ３−７では、波面計測手段７０を用いて照明光路中の光束の波面を計測する。そして、波面計測手段７０による波面の計測結果に基づいて、中間集光位置算出手段４３が現時点の中間集光位置を算出する（ステップＳ３−８）。

現時点の中間集光位置と集光制限位置とが重なっているかどうかが判断される（ステップＳ３−９）。中間集光位置と集光制限位置が重なっている場合には、制御はステップＳ３−１３へ遷移する。

中間集光位置と集光制限位置が重なっていない場合には、光量変調手段１９を制御し、光量変調手段１９を通過するレーザ光の強度を元に戻し（ステップＳ３−１０）、標本１が撮像される（ステップＳ３−１１）。撮像終了後、光量変調手段１９を制御し、光量変調手段１９を通過するレーザ光の強度を再び低下させる（ステップＳ３−１２）。

ステップＳ３−１３では、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが閉じられる。そして、現時点の標本集光位置が走査終了位置かどうか判断される（ステップＳ３−１４）。標本集光位置が走査終了位置でない場合には、標本集光位置を次のｚ位置まで移動させる（ステップＳ３−１５）。その後、制御はステップＳ３−６に遷移する。標本集光位置が走査終了位置である場合には、走査制御が終了する。
なお、上記の制御において、中間集光位置と集光制限位置の重なりに加えて、中間像位置と集光制限位置の重なりについても考慮して制御することが望ましい。

以上、図９に例示される制御を実施することで、走査中に光学素子にレーザ光が集光した場合であっても、集光位置におけるレーザ光の強度は低下している。また、光学素子にレーザ光が集光している状態では撮像は行われない。このため、光学素子上にレーザ光が集光する時間は波面計測に要する時間だけとなる。このように、レーザ光は弱い強度で短い時間だけ光学素子上に集光するため、レーザ光が光学素子に及ぼす影響は抑制される。また、光軸方向の走査に伴う標本の振動や球面収差も抑えることができる。その結果、観察装置の良好な観察性能が実現される。

図１０は、本実施例に係る観察装置の作用を説明するための図である。図１０では、本実施例に係る観察装置１０３の構成の一部のみが示されている。なお、観察装置１０３の全体構成は、図１に例示される観察装置１００と同様である。観察装置１０３は、ビームエキスパンダ１４が走査制御手段４１によって制御される点が、観察装置１００と異なっている。

ビームエキスパンダ１４がレーザ光を平行光として射出する場合、レーザ光は、偏光ビームスプリッタ２１及び１／２波長板２２を介して、平行光のままでｚスキャンレンズ２３に入射する。このため、ピエゾミラー２４がｚスキャンレンズ２３の焦点距離だけｚスキャンレンズ２３から離れた位置にあるときには、レーザ光がピエゾミラー２４上に集光してしまう。

観察装置１０３では、ピエゾミラー２４上にレーザ光が集光してしまうことを防止するため、走査制御手段４１が集光位置走査手段２０とビームエキスパンダ１４を制御する。これにより、ピエゾミラー２４の位置に応じてビームエキスパンダ１４から射出されるレーザ光の広がり角を制御することが可能となり、ピエゾミラー２４上にレーザ光が集光する状態を避けることができる。なお、図１０では、ビームエキスパンダ１４から射出されるレーザ光を収束光とすることで、ピエゾミラー２４上にレーザ光が集光することを避けている様子が例示されている。

以上、本実施例に係る観察装置１０３においても、実施例１と同様の効果を得ることができる。それに加えて、ピエゾミラー２４上へのレーザ光の集光も防止することができる。

図１１は、本実施例に係る観察装置の構成を説明するための図である。図１１に例示される観察装置１０４は、図１に例示される観察装置１００と同様に、２光子励起蛍光顕微鏡である。なお、観察装置１０４の構成要素のうち、観察装置１００の構成要素と同様のものには同符号を付し、説明を省略する。

観察装置１０４は、観察装置１００と同様に、標本１を配置するステージ２と、レーザ光を標本上に集光させる対物レンズ３と、レーザ光を対物レンズ３に導く照明手段１０と、標本集光位置を光軸方向に走査する集光位置走査手段２０と、標本からの生じる蛍光を観察する観察手段３０と、観察装置１０４全体を制御する制御手段４０と、入力手段５０と、表示手段６０と、を含んで構成されている。

観察装置１０４は、さらに、対物レンズ３の光軸方向の駆動に用いられるピエゾ素子２５と、ステージ２の光軸方向の駆動に用いられるピエゾ素子２６を含んで構成される点が観察装置１００と異なっている。その他の構成は、観察装置１００と同様である。また、制御手段４０の構成は、観察装置１００と同様に、図２に例示される構成である。

観察装置１０４では、対物レンズ３はピエゾ素子２５を介して走査制御手段４１により制御される。また、ステージ２もピエゾ素子２６を介して走査制御手段４１に制御される。つまり、ピエゾ素子２５及びピエゾ素子２６は、走査制御手段４１に制御されることにより、対物レンズ３とステージ２の間の相対的な距離を変化させる第３走査手段として機能する。

図１２は、本実施例に係る観察装置の走査制御を示すフローチャートである。以下、図１２を参照しながら、観察装置１０４の制御手段４０による走査制御について説明する。

まず、観察装置１０４の走査制御が開始されると、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが閉じられる（ステップＳ５−１）。そして、集光制限位置に対応する標本集光位置のｚ位置が表示手段６０に表示される（ステップＳ５−２）。観察者は、表示手段６０を参照しながら入力手段５０を用いて、走査範囲を入力する（ステップＳ５−３）。その後、標本集光位置を走査開始位置まで移動させる（ステップＳ５−４）。

ステップＳ５−５では、現時点の中間集光位置と集光制限位置とが重なっているかどうかが判断される。中間集光位置と集光制限位置が重なっていない場合には、制御はステップＳ５−８へ遷移する。

中間集光位置と集光制限位置が重なっている場合には、集光位置走査手段２０（第１走査手段）によりｚ位置を前の位置に戻す（ステップ５−６）。なお、標本集光位置が走査開始位置にある場合には、中間集光位置と集光制限位置が重ならない位置まで戻す。その後、第３走査手段（ピエゾ素子２５及びピエゾ素子２６）によりｚ位置を次の位置まで移動させる（ステップＳ５−７）。

ステップＳ５−８では、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが開かれる。そして、標本１が撮像される（ステップＳ５−９）。撮像終了後、ＡＯＭシャッター装置１２のシャッターが閉じられる（ステップＳ５−１０）。

ステップＳ５−１１では、現時点の標本集光位置が走査終了位置かどうか判断される。標本集光位置が走査終了位置でない場合には、第１走査手段により標本集光位置を次のｚ位置まで移動させる（ステップＳ５−１２）。その後、制御はステップＳ５−６に遷移する。標本集光位置が走査終了位置である場合には、走査制御が終了する。
なお、上記の制御において、中間集光位置と集光制限位置の重なりに加えて、中間像位置と集光制限位置の重なりについても考慮して制御することが望ましい。

以上、図１２に例示される制御を実施することで、すべてのｚ位置で標本１を必要なレーザ強度で照明しながら撮像することができる。この制御では、第１走査手段を用いた走査でレーザ光が光学素子上に集光してしまう場合のみ、第３走査手段を走査に用いる。第１走査手段でのみ走査する場合に比べて、第３走査手段では大きく集光位置を走査できる。このため、第１走査手段により光軸方向に走査しているときに中間集光位置または中間像位置が集光制限位置に重なってしまう場合に、第３走査手段は、中間集光位置または中間像位置が集光制限位置を素早く通過するように、中間集光位置または中間像位置を移動させることができる。その結果、観察装置の良好な観察性能が実現される。

なお、上記制御では、走査後のｚ位置で中間集光位置または中間像位置と集光制限位置が重なるかどうかを予め算出し、走査に用いる走査手段を選択しても良い。この場合、中間集光位置または中間像位置と集光制限位置が重なる場合には、第３走査手段で走査し、重ならない場合には、第１走査手段で走査するように制御する。

なお、上記の制御の他に、走査範囲が入力された後で、走査中に中間集光位置または中間像位置と集光制限位置が重なることがあるかどうかを判断する制御を行っても良い。この場合、重なることがある場合には、第３走査手段により走査開始位置を走査中に中間集光位置または中間像位置と集光制限位置が重ならない位置まで移動させてもよい。

図１３は、本実施例に係る観察装置の構成を説明するための図である。図１３に例示される観察装置１０５は、図７に例示される観察装置１０２と同様に、２光子励起蛍光顕微鏡である。なお、観察装置１０５の構成要素のうち、観察装置１０２の構成要素と同様のものには同符号を付し、説明を省略する。

観察装置１０５は、観察装置１０２と同様に、標本１を配置するステージ２と、レーザ光を標本上に集光させる対物レンズ３と、レーザ光を対物レンズ３に導く照明手段１０と、標本集光位置を光軸方向に走査する集光位置走査手段２０と、標本からの生じる蛍光を観察する観察手段３０と、観察装置１０５全体を制御する制御手段４０と、入力手段５０と、表示手段６０と、を含んで構成されている。

観察装置１０５は、集光位置走査手段２０の構成が観察装置１０２と異なっている。より具体的には、観察装置１０２のｚスキャンレンズ２３及びピエゾミラー２４の代わりに、デフォーマブルミラー２７が含まれる。観察装置１０５では、走査制御手段４１がデフォーマブルミラー２７を制御することで、標本集光位置を光軸方向に走査することができる。なお、デフォーマブルミラー２７の代わりに、特許文献２に記載の液晶空間光変調器などの反射型液晶デバイス２８を用いてもよい。

また、デフォーマブルミラー２７や反射型液晶デバイス２８では、光軸方向の走査に伴う球面収差もそれ自体で補正することができる。このため、照明手段１０に含まれるビームエキスパンダ１５は、変倍機能を有するズーム式である必要はない。

観察装置１０５では、観察装置１０２と同様に、図９に例示される走査制御が実施される。これにより、実施例３と同様の効果を得ることができる。

図１４は、本実施例に係る観察装置の構成を説明するための図である。図１４に例示される観察装置１０６は、光刺激のための光源と観察のための光源を有する蛍光顕微鏡である。

観察装置１０６は、標本１を配置するステージ２と、レーザ光を標本上に集光させる対物レンズ３と、光刺激の為のレーザ光（以降、刺激光と記す。）と観察のためのレーザ光（以降、照明光と記す。）を対物レンズ３に導く照明手段８０と、集光位置走査手段２０と、標本からの生じる蛍光を観察する観察手段３０と、観察装置１０６全体を制御する制御手段４０と、対物レンズ３の駆動に用いられるピエゾ素子２５と、ステージ２の駆動に用いられるピエゾ素子２６と、入力手段５０と、表示手段６０と、を含んで構成されている。なお、制御手段４０の構成は、観察装置１００と同様に、図２に例示される構成である。
照明手段８０は、第１照明手段と、第２照明手段と、ダイクロイックミラー９２と、結像レンズ９３と、を含んで構成されている。

第１照明手段は、断続的に超短パルスレーザ光を射出する超短パルスレーザ光源８１と、ＡＯＭシャッター装置８２と、分散補償器８３と、ビームエキスパンダ８４と、倍率変更機能を有するズーム式のビームエキスパンダ８５と、ガルバノミラー８６と、リレーレンズ８７と、を含んでいる。

一方、第２照明手段は、継続的にレーザ光を射出するＣＷレーザ光源８８と、ＡＯＭシャッター装置８９と、ガルバノミラー９０と、リレーレンズ９１と、を含んでいる。

集光位置走査手段２０は、ビームエキスパンダ８４とビームエキスパンダ８５の間に配置され、偏光ビームスプリッタ２１と、１／２波長板２２と、ｚスキャンレンズ２３と、ピエゾミラー２４とを含んで構成されている。なお、集光位置走査手段２０のｚスキャンレンズ２３及びピエゾミラー２４の代わりに、デフォーマブルミラーや反射型液晶デバイスを用いることもできる。その場合、ビームエキスパンダ１５は、ズーム式のビームエキスパンダである必要はない。

観察装置１０６では、集光位置走査手段２０は、刺激光の標本集光位置を光軸方向に走査する第１走査手段である。ガルバノミラー８６は、刺激光の標本集光位置を光軸と垂直な方向に走査する第２走査手段である。ピエゾ素子２５及びピエゾ素子２６は、刺激光と照明光の標本集光位置を光軸方向に走査する第３走査手段である。ガルバノミラー９０は、照明光の標本集光位置を光軸と垂直な方向に走査する第４走査手段である。

超短パルスレーザ光源８１から射出された刺激光の作用は、観察装置１００の超短パルスレーザ光源１１から射出されたレーザ光の作用と同様である。このため、説明を省略する。

ＣＷレーザ光源８８から射出されたレーザ光（照明光）は、音響光学素子を用いて構成されるＡＯＭシャッター装置８９に入射する。ＡＯＭシャッター装置８９のシャッターが開いた状態では、照明光はダイクロイックミラー３１で反射され、ガルバノミラー９０及びリレーレンズ９１を介してダイクロイックミラー９２へ入射する。さらに、照明光はダイクロイックミラー９２を透過して、結像レンズ９３を介して対物レンズ３へ入射する。対物レンズ３は、照明光を標本１上の標本集光位置に照射する。ここで、通常、刺激光の標本集光位置と照明光の標本集光位置は異なる。

刺激光と照明光が照射された標本では、それぞれの光によって蛍光が発生する。この際、刺激光は２光子過程を経て標本を励起し蛍光を発生させるのに対して、照明光は１光子過程を経て標本を励起し蛍光を発生させる。超短パルスレーザ光源８１を用いて２光子過程を経て標本を励起する場合、ＣＷレーザ光源８８を用いて１光子過程を経て標本を励起する場合に比べて、標本を強いレーザ密度で照射する必要がある。その結果、刺激光の中間集光位置のレーザ強度の方が、照明光の中間集光位置のレーザ強度より強くなる。このため、観察装置１０６では、超短パルスレーザ光源８１を含む第１照明手段の照明光路中にのみ、集光位置走査手段２０を設けている。なお、ＣＷレーザ光源８８を含む第２照明手段の照明光路中に、さらに、集光位置走査手段を設けることもできる。

標本から発生した蛍光は、対物レンズ３、結像レンズ９３、ダイクロイックミラー９２、リレーレンズ９１及びガルバノミラー９０を介して観察手段３０へ入射する。蛍光はダイクロイックミラー３１を透過し、集光レンズ３３により共焦点ピンホール３５上に集光する。照明光の標本集光位置から生じた蛍光のみが共焦点ピンホール３５を通過し、光電子倍増管３４に入射する。光電子倍増管３４は、撮像素子として機能し、蛍光を電気信号に変換して画像を生成する。

観察装置１０６では、刺激光の標本集光位置（以降、刺激座標）と、照明光の標本集光位置を別々に走査することができる。このため、光刺激を与える刺激座標を変化させた際の標本の変化を観察することができる。

図１５は、本実施例に係る観察装置の走査制御を示すフローチャートである。以下、図１５を参照しながら、観察装置１０６の制御手段４０による走査制御の一例について説明する。なお、図１５は、刺激座標の走査にのみ着目している。

まず、観察装置１０６の走査制御が開始されると、ＡＯＭシャッター装置８２のシャッターが閉じられる（ステップＳ７−１）。次に、刺激光の集光制限位置が算出され、集光制限位置に対応する刺激座標のｚ位置の範囲が表示手段６０に表示される（ステップＳ７−２）。観察者は、表示手段６０を参照しながら入力手段５０を用いて、刺激座標を入力する（ステップＳ７−３）。

次に、入力された複数の刺激座標の各座標に対応する中間集光位置及び集光制限位置が算出される。これらの中間集光位置と集光制限位置を比較し、刺激座標で中間集光位置と集光制限位置が重なることがあるかどうかが判断される（ステップＳ７−４）。刺激座標において重なることがない場合、制御はステップＳ７−９へ遷移する。

刺激座標で中間集光位置と集光制限位置が重なることがある場合、表示手段６０に、中間集光位置と集光制限位置が重なる位置や、中間集光位置と集光制限位置が重なるときの刺激座標等が表示される（ステップＳ７−５）。

観察者は、表示手段６０に表示された情報に基づいて、刺激座標を変更するかどうかを選択する（ステップＳ７−６）。刺激座標の変更が選択された場合には、制御はステップＳ７−３に遷移する。刺激座標の変更が選択されなかった場合には、中間集光位置と集光制限位置が重なる刺激座標を削除する（ステップＳ７−７）。
ステップＳ７−８では、刺激座標を走査開始位置まで移動させる。

そして、ＡＯＭシャッター装置８２のシャッターが開かれて、標本１が刺激光により刺激される。この際、観察手段３０により標本１が撮像される。撮像終了後、ＡＯＭシャッター装置８２のシャッターが閉じられる（ステップＳ７−９）。

ステップＳ７−１０では、現在の刺激座標が入力された最後の刺激座標かどうか判断される。最後の刺激座標でない場合には、刺激座標を次のｚ位置まで移動する（ステップＳ７−１１）。その後、制御はステップＳ７−９に遷移する。現在の刺激座標が最後の刺激座標である場合には、走査制御が終了する。
なお、上記の制御において、中間集光位置と集光制限位置の重なりに加えて、中間像位置と集光制限位置の重なりについても考慮して制御することが望ましい。

以上、図１５に例示される制御を実施することで、光学素子等に刺激光が集光することを防止することができる。また、刺激座標の光軸方向の走査に伴う標本の振動及び球面収差も抑えることができる。その結果、観察装置の良好な観察性能が実現される。

１・・・ 標本
２・・・ ステージ
３・・・ 対物レンズ
４・・・ 集光制限位置
５・・・ 集光可能位置
１０、８０・・・ 照明手段
１１、８１・・・ 超短パルスレーザ光源
１２、８２、８９・・・ ＡＯＭシャッター装置
１３、８３・・・ 分散補償器
１４、１５、８４、８５・・・ ビームエキスパンダ
１６、８６、９０・・・ ガルバノミラー
１７、８７、９１・・・ リレーレンズ
１８、９３・・・ 結像レンズ
１９・・・ 光量変調手段
２０・・・ 集光位置走査手段
２１・・・ 偏光ビームスプリッタ
２２・・・ １／２波長板
２３・・・ ｚスキャンレンズ
２４・・・ ピエゾミラー
２５、２６・・・ ピエゾ素子
２７・・・ デフォーマブルミラー
２８・・・ 反射型液晶デバイス
３０・・・ 観察手段
３１、９２・・・ ダイクロイックミラー
３２・・・ バリアフィルタ
３３・・・ 集光レンズ
３４・・・ 光電子倍増管
３５・・・ 共焦点ピンホール
４０・・・ 制御手段
４１・・・ 走査制御手段
４２・・・ 照明制御手段
４３・・・ 中間集光位置算出手段
４４・・・ 集光制限位置算出手段
４５・・・ 観察制御手段
５０・・・ 入力手段
６０・・・ 表示手段
７０・・・ 波面計測手段
７１・・・ マイクロレンズアレイ
７２・・・ 電荷結合素子（ＣＣＤ）
８８・・・ ＣＷレーザ光源
１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６・・・ 観察装置

Claims (35)

1. 標本を配置するステージと、
   レーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、
   前記レーザ光を前記対物レンズに導く照明手段と、
   前記標本内の集光位置である標本集光位置を光軸方向に走査する第１走査手段と、
   照明光路中の集光位置である中間集光位置及び前記レーザ光の集光が制限される集光制限位置に基づいて、前記照明手段と前記第１走査手段とを制御する制御手段と、を含むことを特徴とする観察装置。
2. 請求項１に記載の観察装置において、
   前記制御手段は、
   前記第１走査手段の駆動を制御する走査制御手段と、
   前記中間集光位置を算出する中間集光位置算出手段と、
   前記集光制限位置を算出する集光制限位置算出手段と、
   前記照明手段を制御する照明制御手段と、を含むことを特徴とする観察装置。
3. 請求項２に記載の観察装置において、
   前記照明手段は、光源を含み、
   前記照明制御手段は、前記集光制限位置と前記中間集光位置が重なるとき、前記光源から射出されるレーザ光の強度を低下させることを特徴とする観察装置。
4. 請求項２に記載の観察装置において、
   前記照明手段は、
   光源と、
   前記光源と前記集光制限位置の間に配置された光量変調手段と、を含み、
   前記照明制御手段は、前記集光制限位置と前記中間集光位置が重なるとき、前記光量変調手段を通過するレーザ光の強度を低下させることを特徴とする観察装置。
5. 請求項３または請求項４に記載の観察装置において、
   前記レーザ光の強度は、前記集光制限位置と前記中間集光位置が重なる位置に応じて変化することを特徴とする観察装置。
6. 請求項２に記載の観察装置において、
   前記照明手段は、
   光源と、
   前記光源と前記集光制限位置の間に配置されたシャッター装置と、を含み、
   前記照明制御手段は、前記集光制限位置と前記中間集光位置が重なるとき、前記シャッター装置にレーザ光を遮断させることを特徴とする観察装置。
7. 請求項２に記載の観察装置において、
   前記走査制御手段は、前記集光制限位置と前記中間集光位置が重なる位置への前記第１走査手段による走査を制限することを特徴とする観察装置。
8. 請求項２に記載の観察装置において、
   さらに、前記標本集光位置を光軸と垂直な方向に走査する第２走査手段を含み、
   前記走査制御手段は、前記集光制限位置と前記中間集光位置が重なる位置への前記第２走査手段による走査を制限することを特徴とする観察装置。
9. 請求項２に記載の観察装置において、
   さらに、前記標本と前記対物レンズの間の距離を変化させる第３走査手段を含み、
   前記走査制御手段は、前記第３制御手段の駆動を制御することを特徴とする観察装置。
10. 請求項９に記載の観察装置において、
    前記第３走査手段は、前記対物レンズを光軸方向に駆動することを特徴とする観察装置。
11. 請求項９に記載の観察装置において、
    前記第３走査手段は、前記ステージを光軸方向に駆動することを特徴とする観察装置。
12. 請求項９に記載の観察装置において、
    前記走査制御手段は、前記第１走査手段及び前記第３走査手段により、前記集光制限位置と前記中間集光位置が重ならないように、前記標本集光位置を光軸方向に走査することを特徴とする観察装置。
13. 請求項１２に記載の観察装置において、
    前記走査制御手段は、
    前記集光制限位置と前記中間集光位置が重ならないとき、前記第１走査手段により前記標本集光位置を光軸方向に走査し、
    前記集光制限位置と前記中間集光位置が重なるとき、前記第３走査手段により前記標本集光位置を光軸方向に走査することを特徴とする観察装置。
14. 請求項１２に記載の観察装置において、
    前記走査制御手段は、前記集光制限位置を走査する前に、前記第３走査手段により、走査中に前記中間集光位置と前記集光制限位置が重ならない位置に前記標本を移動させることを特徴とする観察装置。
15. 請求項２に記載の観察装置において、
    さらに、前記標本を撮像する撮像手段を含み、
    前記撮像手段は、前記集光制限位置と前記中間集光位置が重なるとき、撮像しないことを特徴とする観察装置。
16. 請求項２に記載の観察装置において、
    前記中間集光位置算出手段は、前記対物レンズ、前記照明手段及び前記第１走査手段を構成する光学素子の配置に基づいて、前記中間集光位置を算出することを特徴とする観察装置。
17. 請求項２に記載の観察装置において、
    前記中間集光位置算出手段は、前記標本集光位置に基づいて、前記中間集光位置を算出することを特徴とする観察装置。
18. 請求項２に記載の観察装置において、
    さらに、前記レーザ光の波面を計測する波面計測手段を含み、
    前記中間集光位置算出手段は、前記波面計測手段による計測結果に基づいて、前記中間集光位置を算出することを特徴とする観察装置。
19. 請求項２に記載の観察装置において、
    前記集光制限位置算出手段は、前記対物レンズ、前記照明手段及び前記第１走査手段を構成する光学素子の配置に基づいて、前記集光制限位置を算出することを特徴とする観察装置。
20. 標本を配置するステージと、
    レーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、
    前記標本内の集光位置である標本集光位置を光軸方向に走査する第１走査手段と、
    前記標本集光位置を観察する観察手段と、
    観察光路中の集光位置である中間像位置及び前記レーザ光の集光が制限される集光制限位置に基づいて、前記観察手段と前記第１走査手段とを制御する制御手段と、を含むことを特徴とする観察装置。
21. 請求項２０に記載の観察装置において、
    前記制御手段は、
    前記第１走査手段の駆動を制御する走査制御手段と、
    前記中間像位置を算出する中間集光位置算出手段と、
    前記集光制限位置を算出する集光制限位置算出手段と、
    前記観察手段を制御する観察制御手段と、を含むことを特徴とする観察装置。
22. 請求項２１に記載の観察装置において、
    前記走査制御手段は、前記集光制限位置と前記中間像位置が重なる位置への前記第１走査手段による走査を制限することを特徴とする観察装置。
23. 請求項２１に記載の観察装置において、
    さらに、前記標本集光位置を光軸と垂直な方向に走査する第２走査手段を含み、
    前記走査制御手段は、前記集光制限位置と前記中間像位置が重なる位置への前記第２走査手段による走査を制限することを特徴とする観察装置。
24. 請求項２１に記載の観察装置において、
    さらに、前記標本と前記対物レンズの間の距離を変化させる第３走査手段を含み、
    前記走査制御手段は、前記第３制御手段の駆動を制御することを特徴とする観察装置。
25. 請求項２４に記載の観察装置において、
    前記第３走査手段は、前記対物レンズを光軸方向に駆動することを特徴とする観察装置。
26. 請求項２４に記載の観察装置において、
    前記第３走査手段は、前記ステージを光軸方向に駆動することを特徴とする観察装置。
27. 請求項２４に記載の観察装置において、
    前記走査制御手段は、前記第１走査手段及び前記第３走査手段により、前記集光制限位置と前記中間像位置が重ならないように、前記標本集光位置を光軸方向に走査することを特徴とする観察装置。
28. 請求項２７に記載の観察装置において、
    前記走査制御手段は、
    前記集光制限位置と前記中間像位置が重ならないとき、前記第１走査手段により前記標本集光位置を光軸方向に走査し、
    前記集光制限位置と前記中間像位置が重なるとき、前記第３走査手段により前記標本集光位置を光軸方向に走査することを特徴とする観察装置。
29. 請求項２７に記載の観察装置において、
    前記走査制御手段は、前記集光制限位置を走査する前に、前記第３走査手段により、走査中に前記中間像位置と前記集光制限位置が重ならない位置に前記標本を移動させることを特徴とする観察装置。
30. 請求項２１に記載の観察装置において、
    前記観察手段は、撮像手段を含み、
    前記撮像手段は、前記集光制限位置と前記中間像位置が重なるとき、撮像しないことを特徴とする観察装置。
31. 請求項２１に記載の観察装置において、
    前記中間集光位置算出手段は、前記対物レンズ、前記観察手段及び前記第１走査手段を構成する光学素子の配置に基づいて、前記中間像位置を算出することを特徴とする観察装置。
32. 請求項２１に記載の観察装置において、
    前記中間集光位置算出手段は、前記標本集光位置に基づいて、前記中間像位置を算出することを特徴とする観察装置。
33. 請求項２１に記載の観察装置において、
    前記集光制限位置算出手段は、前記対物レンズ、前記照明手段及び前記第１走査手段を構成する光学素子の配置に基づいて、前記集光制限位置を算出することを特徴とする観察装置。
34. 顕微鏡照明方法であって、
    レーザ光の集光が制限される照明光路中の集光制限位置と前記照明光路中の集光位置である中間集光位置とが重なる範囲を表示する第１のステップと、
    標本内の集光位置である標本内集光位置を光軸方向に走査する範囲を設定する第２のステップと、
    前記レーザ光で前記標本を照明する第３のステップと、を含み、
    前記第３のステップでは、前記集光制限位置と前記中間集光位置とが重なるとき、レーザ光の強度を変調することを特徴とする顕微鏡照明方法。
35. 顕微鏡観察方法であって、
    レーザ光の集光が制限される観察光路中の集光制限位置と前記観察光路中の集光位置である中間像位置とが重なる範囲を表示する第１のステップと、
    標本内の集光位置である標本内集光位置を光軸方向に走査する範囲を設定する第２のステップと、
    前記標本を観察する第３のステップと、を含み、
    前記第３のステップでは、前記集光制限位置と前記中間像位置とが重なるとき、前記標本を撮像しないことを特徴とする顕微鏡観察方法。
    

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