JP2010260818A

JP2010260818A - チロシナーゼ阻害剤

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Publication number: JP2010260818A
Application number: JP2009112920A
Authority: JP
Inventors: Mitsuo Miyazawa; 三雄宮澤; Nobuo Yagi; 伸夫八木
Original assignee: Picaso Cosmetic Laboratory Ltd
Current assignee: Picaso Cosmetic Laboratory Ltd
Priority date: 2009-05-07
Filing date: 2009-05-07
Publication date: 2010-11-18

Abstract

【課題】チロシナーゼ活性を阻害できる新規なチロシナーゼ阻害剤を提供すること。
【解決手段】イエロー・バタイ（Peltophorum dasyrachis）のエステル及び／又はハロゲン化炭化水素抽出物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。抽出物は、アピゲニン、ジヒドロケンフェロール、ジヒドロクェルセチン、ジヒドロ−ａｒ−ターメロン及びａｒ−ターメロンからなる群から選択される少なくとも１種のフラボノイドを含んでいる。
【選択図】なし

Description

本発明は、イエロー・バタイ（Yellow batai）（Peltophorum dasyrachis）から得られる抽出物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤、並びに該チロシナーゼ阻害剤からなる食品添加剤及び化粧品添加剤に関する。

食物の褐変は、酵素的酸化及び非酵素的酸化に関与する２つの要素を包含するが、いずれも市場価格の低下につながるために防止する必要がある。非酵素的褐変は、抗酸化剤によって防ぐことができる。一方、酵素的褐変は、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）によって触媒されており、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）としてチロシナーゼが知られている。

チロシナーゼは、銅を含む多機能性オキシダーゼであって、微生物、動物組織、及び植物組織中に広く分布している。チロシナーゼは、メラニン生合成に関与しているため、（非特許文献１参照）、チロシナーゼ阻害剤は食品業界で活用されているだけでなく、色素沈着を防ぐ目的で医薬品及び化粧品にも添加されている。化粧品添加剤と使用されているチロシナーゼ阻害剤として、例えば、アスコルビン酸（非特許文献２参照）、アルブチン（非特許文献３参照）及びコウジ酸（非特許文献４参照）が挙げられる。
このように、数多くのチロシナーゼ阻害剤が報告されているが、天然のチロシナーゼ阻害剤は一般的に有害な副作用がないと考えられるので、さらに、天然物から有用なチロシナーゼ阻害剤が単離されることが望ましい。

一方、イエロー・バタイ(Yellow batai)(Peltophorum dasyrachis)は、タイハーブの１つであって、マメ科（Legminosae）に属する植物である。マメ科の種には、多くのフェノール化合物及びフラボノイドを含有していることが知られており、機能性食品又は化粧品の有効成分として使用されることが期待されている。イエロー・バタイについては、本発明者らが以前、その抽出物に含まれる抗変異活性効果を有する化合物を報告している（特許文献１参照）。また、本発明者らは、そのエタノール抽出物に美白効果があることについて報告しているが、その有効成分は解明されていなかった（特許文献２参照）。

特開２００６−１５１８５５号公報特開２００５−２３０３６号公報

Sanchez-Ferrer, A., et al., Biochimica et Biophysica Acta, Protein Structure and Molecular Enzymology, 1247(1), 1-11 (1995) Singh, R., et al., Haryana Agricultural University Journal of Research, 3(2), 93-6 (1973) Akiu, S., et al., 日本皮膚科学会雑誌, 101(6), 609-13 (1991) Hyun, S.K., et al., Biological & Pharmaceutical Bulletin, 31(1), 154-158 (2008)

本発明の主な目的は、チロシナーゼ活性を阻害できる新規なチロシナーゼ阻害剤を提供することである。詳しくは、食品として使用できる成分を原料とした、安全性が高く、しかもチロシナーゼ活性に対する優れた阻害作用を有する新規なチロシナーゼ阻害剤、並びにチロシナーゼ阻害剤からなる食品添加剤及び化粧品添加剤を提供することである。

本発明者らは、上記した目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、イエロー・バタイのエステル及び／又はハロゲン化炭化水素抽出物がチロシナーゼ活性に対する優れた阻害作用を有することを見出し、ここに本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、下記のチロシナーゼ阻害剤並びに該阻害剤からなる食品添加剤及び化粧品添加剤を提供することである。

項１．イエロー・バタイ（Peltophorum dasyrachis）のエステル及び／又はハロゲン化炭化水素抽出物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。

項２．前記抽出物が、式（Ｉ）：

で表されるアピゲニン(apigenin)、式（ＩＩ）:

（式中、Ｒ_１は水素原子又はラムノシド基を示す）
で表されるジヒドロケンフェロール(dihydrokaemferol)、式（ＩＩＩ）:

（式中、Ｒ_２は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ_３は水素原子又はラムノシド基を示し、Ｒ_４は水素原子又はメチル基を示す）
で表されるジヒドロクェルセチン(dihydroquercetin)、式（ＩＶ）：

で表されるジヒドロ−ａｒ−ターメロン(dihydro-ar-turmerone)、及び式（Ｖ）:

で表されるａｒ−ターメロン(ar-turmerone)からなる群から選択される少なくとも１種のフラボノイドを含む、項１に記載のチロシナーゼ阻害剤。

項３．前記抽出物が、式（ＩＩａ）:

で表される(＋)−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロケンフェロール、式（ＩＩＩａ）:

で表される(＋)−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロクェルセチン、及び式（Ｖａ）:

で表される（＋）−（Ｓ）−ａｒ−ターメロン((+)-(S)-ar-turmerone)の少なくとも１種を含む、項１又は２に記載のチロシナーゼ阻害剤。

項４．前記抽出物が、 (＋)−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロケンフェロール及び (＋)−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロクェルセチンの少なくとも１種を含む、項１〜３のいずれかに記載のチロシナーゼ阻害剤。

項５．項１〜４のいずれかに記載のチロシナーゼ阻害剤からなる食品添加剤。

項６．項１〜４のいずれかに記載のチロシナーゼ阻害剤からなる化粧品添加剤。

本発明のチロシナーゼ阻害剤は、天然植物であるイエロー・バタイのエステル及び／又はハロゲン化炭化水素抽出物を有効成分とするものであり、優れたチロシナーゼ活性阻害作用を有する。

また、今回、上記エステル抽出物における活性化合物を精製・同定することに成功し、（＋）−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロケンフェロール及び（＋）−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロクェルセチンがその有効成分であることをつきとめた。さらに、ハロゲン化炭化水素抽出物から単離した（＋）−（Ｓ）−ジヒドロ−ａｒ−ターメロン及び（＋）−（Ｓ）−ａｒ−ターメロンがチロシナーゼ阻害活性を有することをつきとめた。

本発明のチロシナーゼ阻害剤は、食品添加剤、化粧用添加剤等として利用することができる。

イエロー・バタイの抽出分離工程を示す図である。化合物１〜８の構造式を示す図である。化合物１〜８及びコウジ酸のチロシナーゼ活性阻害効果を示す図である。（Ａ）は、化合物２のチロシナーゼ阻害のLineweaver-Burkプロットを示す図であり、（Ｂ）は、化合物５のチロシナーゼ阻害のLineweaver-Burkプロットを示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明のチロシナーゼ阻害剤は、イエロー・バタイのエステル及び／又はハロゲン化炭化水素抽出物を有効成分とするものである。
本発明において、イエロー・バタイ（Peltophorum dasyrachis）とは、タイ、カンボジア、ラオス、ベトナム、マレーシア、スマトラ島等の東南アジア諸国で植栽されているマメ科（Legminosae）植物である。イエロー・バタイの抽出物は、その樹木の抽出物であればよく、特に樹皮の抽出物が好ましい。

上記のイエロー・バタイは、そのまま抽出に供することができるが、より細かく粉砕した後、抽出に供してもよい。また、粉末にした後更に乾燥して抽出したり、水中で粉砕してスラリー状にして抽出することもできる。また、市販されている乾燥樹皮を使用することも可能である。

抽出溶媒としては、エステル類及び／又はハロゲン化炭化水素を用いることができる。すなわち、エステル類及びハロゲン化炭化水素からなる群から選択される少なくとも１種の溶媒を用いることができる。抽出溶媒は、エステル類及びハロゲン化炭化水素のどちらか１種単独で用いてもよいし、両方を混合して用いてもよい。エステル類として、特に、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等の低級アルキルエステル類を用いる。ハロゲン化炭化水素として、ジクロロメタン、クロロホルム等を用いる。これらの中で、低級アルキルエステル類が、優れたチロシナーゼ阻害活性を有する抽出物を効率よく得ることができる点で好ましい。

抽出方法については、特に限定されるものではなく、イエロー・バタイに溶媒（エステル及び／又はハロゲン化炭化水素）を加えた後、抽出物の抗変異原活性を失活させない程度に加温加熱する加熱抽出法や、超臨界抽出法等を適宜適用できる。また、一定量の溶媒に米糠及び玄米からなる群から選ばれた少なくとも一種を浸漬してバッチ処理する浸漬抽出法や連続的に溶媒を送り続ける連続抽出法等、公知の種々の抽出法を適用できる。

具体的な抽出方法の一例を挙げると、例えば、イエロー・バタイの乾燥重量に対して、０．５〜５重量倍程度、好ましくは、２〜２．５重量倍程度の抽出溶媒（エステル及び／又はハロゲン化炭化水素）を加えて浸漬して加熱し、３０〜６０分間程度溶媒を還流させることにより、チロシナーゼ阻害活性を有する成分を抽出することができる。或いは、イエロー・バタイの乾燥重量に対して０．５〜５重量倍程度、好ましくは、２〜２．５重量倍程度の抽出溶媒（エステル）を加えて浸漬し、室温で１〜１４日間程度放置するか、或いは４０〜６０℃程度に加熱して１０〜２０時間程度加熱することにより有効成分を抽出することも可能である、勿論、溶媒量や加熱温度、加熱時間等については、優れたチロシナーゼ阻害活性を有する成分を抽出できるように適宜調整すればよい。

上記した方法によってイエロー・バタイからエステル及び／又はハロゲン化炭化水素を用いて抽出することにより抽出物を得た後、通常、濾過、遠心分離等の常法によって残渣と固液分離することによって、抽出液を得ることができる。本発明では、得られた抽出液をそのままチロシナーゼ阻害剤として用いることが可能であるが、活性が低い場合もあるため、適宜濃縮又は溶媒を留去して、エキス状や粉末状として用いることもできる。

更に、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、ベンゼン等の有機溶媒を１種又は２種以上用いた溶媒分画操作により得られた抽出画分から、活性画分を分取したものをチロシナーゼ阻害剤として用いることも可能である。

更に、必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて、チロシナーゼ活性阻害作用のある画分又は化合物を取り出して、チロシナーゼ阻害剤とすることできる。これにより、少量の摂取で優れた活性を発揮させることができる。

上記方法により得られた抽出物は、式（Ｉ）：

で表されるアピゲニン(apigenin)、式（ＩＩ）:

で表されるａｒ−ターメロン(ar-turmerone)からなる群から選択される少なくとも１種のフラボノイドを含んでいる。
ここで、ジヒドロケンフェロール及びジヒドロクェルセチンには、Ｃ２位及びＣ３位の置換基同士の相対配置、及び各置換基の立体配置に係る異性体が存在する。また、ジヒドロ−ａｒ−ターメロン及びａｒ−ターメロンには不斉炭素が存在することから、立体配置に係る異性体が存在する。本発明は、これらの異性体すべてを包含するものであり、単一の異性体であってもよく、任意の比率での異性体混合物であってもよい。
ジヒドロケンフェロール及びジヒドロクェルセチンの相対配置としては、いずれもトランス（trans）体が好ましく、絶対配置として、Ｃ２位及びＣ３位がともにＲ配置である、（２Ｒ，３Ｒ）体がさらに好ましい。また、旋光度は、（＋）であることが好ましい。ジヒドロ−ａｒ−ターメロン及びａｒ−ターメロンの絶対配置としては、いずれも（Ｓ）体が好ましく、旋光度は、（＋）であることが好ましい。

次に、図１を参照して、イエロー・バタイからの活性化合物の精製・同定の手順を具体的に示す。

イエロー・バタイをジクロロメタン及び酢酸エチルで抽出し、それらの画分を減圧下濃縮して、ジクロロメタン画分及び酢酸エチル画分を得る。チロシナーゼ活性阻害作用のある酢酸エチル画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分画し、チロシナーゼ活性阻害作用のある画分を炭酸ナトリウム水溶液で分配し、酸性化して酢酸エチルで抽出した後、更にシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画して、化合物１〜２及び４〜５を得る。

また、チロシナーゼ活性阻害作用のある酢酸エチル画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分画し、得られたメタノール画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分画し、炭酸ナトリウム水溶液で分配し、フェノール性にして酢酸エチルで抽出した後、更にシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画して、化合物３及び６を得る。

各種スペクトル分析により、化合物１は、式（Ｉ）：

で表されるアピゲニンと同定された。化合物２は、式（ＩＩ）：

においてＲ_１が水素原子である、（＋）−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロケンフェロールと同定され、化合物３は、上記式（ＩＩ）においてＲ_１がラムノシド基である、（＋）−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロケンフェロール３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドと同定された。また、化合物４は、式（ＩＩＩ）：

においてＲ_２がメチル基であり、Ｒ_３が水素原子であり、Ｒ_４がメチル基である、（＋）−４’，７−ジメトキシ−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロクェルセチンと同定された。

化合物５は、上記式（ＩＩＩ）においてＲ_２が水素原子であり、Ｒ_３が水素原子であり、Ｒ_４が水素原子である、（＋）−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロクェルセチンと同定された。化合物６は、上記式（ＩＩＩ）においてＲ_２が水素原子であり、Ｒ_３がラムノシド基であり、Ｒ_４が水素原子である、（−）−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロクェルセチン−３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドと同定された。

また、チロシナーゼ活性阻害作用のあるジクロロメタン画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分画し、チロシナーゼ活性阻害作用のある画分について、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り返すことにより分画して、化合物７〜８を得る。

化合物７は、式（ＩＶａ）：

で表される（＋）−（Ｓ）−ジヒドロ−ａｒ−ターメロンと同定され、化合物８は、式（Ｖａ）：

で表される（＋）−（Ｓ）−ａｒ−ターメロンと同定された。

これらのことから、マメ科植物イエロー・バタイは、フラボノイドを多量に含有していることが明らかとなった。

上述のイエロー・バタイからのエステル及び／又はハロゲン化炭化水素抽出物に含まれる、式（ＩＩａ）:

で表される化合物２、式（ＩＩＩａ）:

で表される化合物５、及び式（Ｖａ）：

で表される化合物８は、後述する実施例で示すように、優れたチロシナーゼ活性の阻害作用を有している。そして、これらの中でも化合物２及び化合物５は、特に優れたチロシナーゼ活性の阻害作用を有している。このため、人及び動物に対するチロシナーゼ阻害剤として用いることができる。また、本発明のイエロー・バタイからのエステル抽出物は、チロシナーゼ活性を阻害する作用を有することから、美白（色素沈着やくすみの改善）作用を有しており、美白剤の有効成分として有用である。

本発明のチロシナーゼ阻害剤の使用形態については、特に限定はなく、経口、非経口の何れも可能であるが、例えば、経口的に摂取する場合には、食品添加剤として食品に添加して摂取することができる。また、化粧品等に添加して皮膚等に塗布することによって、日焼け後の色素沈着、しみ、そばかす、紅斑等の淡色化、くすみの改善等に有効に使用できる。

食品添加剤として用いる場合には、その添加量については、特に限定的ではなく、食品の種類に応じ適宜決めればよい。例えば、清涼飲料、炭酸飲料などの液体食品や菓子類やその他の各種食品等の固形食品に添加して用いることができるが、これらの場合の添加量については、食品の種類に応じて適宜決めればよく、一例としては、上記した抽出物の乾燥重量として、含有量が０．００５重量％〜５重量％程度の範囲内となるように添加すればよい。

また、化粧品添加剤として用いる場合には、例えば、化粧料成分として一般に使用されている成分、例えば、界面活性剤、油分、保湿剤、皮膜形成剤、色素、香料等と任意に組み合わせて配合することにより調製することができる。その形態は特に制限されず、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール、エッセンス、パック、洗浄剤、ファンデーション、打粉、各種メーク剤（口紅、チーク等）とすることができる。

化粧品に添加する場合には、化粧品の本来の機能を阻害しない範囲において、添加量を適宜決めればよく、一例としては、上記した抽出物の乾燥重量として、含有量が０．０５重量％〜１０重量％程度の範囲内となるように添加すればよい。

また、その他に、本発明のチロシナーゼ阻害剤を人体に投与する場合の投与方法及び投与量の一例を示すと次の通りである。

投与は、種々の方法で行うことができ、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与とすることができる。投与量については、経口投与の場合には、通常、成人において、有効成分量として０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ程度が適当であり、これを１日１回〜数回に分けて投与すればよい。経口投与剤は、通常の製造方法に従って製造することができる。例えば、デンプン、乳糖、マンニット等の賦形剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、軽質無水ケイ酸等の流動性向上剤等を適宜組み合わせて処方することにより、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等として製造することができる。

以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明する。

＜実施例１＞
イエロー・バタイの抽出物についてチロシナーゼ阻害活性試験を行った。

（１）イエロー・バタイからの化合物の抽出及び単離
イエロー・バタイからの化合物の抽出及び単離は、図１に従って行った。なお、減圧濃縮は、ロータリーエバポレーターを用い、樹皮原料以外の試薬及び溶剤は、和光純薬（株）から購入した。イエロー・バタイの乾燥樹皮（株式会社ピカソ美化学研究所製）（４．５ｋｇ）を、室温下でジクロロメタン（１０リットル）及び酢酸エチル（８リットル）により順次６時間還流した。各可溶性画分を減圧濃縮することにより、ジクロロメタン抽出物（１０ｇ）及び酢酸エチル抽出物（２４ｇ）を得た。

酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ジクロロメタン−アセトン）に付すことにより３つのフラクション（以下、Ｆｒ．とする）１〜Ｆｒ．３に分画した。Ｆｒ．２（４．０ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ジクロロメタン−酢酸エチル）に付すことで４つのフラクション（Ｆｒ．４〜７）に分画した。Ｆｒ．６(１．１８ｇ)を５％炭酸ナトリウム水溶液で分配し、水層を希塩酸溶液で酸性化して酢酸エチルで抽出することにより、Ｆｒ．８を得た。Ｆｒ．８についてシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ヘキサン−酢酸エチル）を繰り返すことにより、化合物１（１７ｍｇ）、化合物２（２４ｍｇ）、化合物３（７．７ｍｇ）及び化合物４（１１０ｍｇ）を単離した。Ｆｒ．３について同様の方法を用いることにより、Ｆｒ．１２から化合物５（９００ｍｇ）及び化合物６（２．０ｇ）を単離した。

ジクロロメタン抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ヘキサン−ジクロロメタン）に付すことにより２つのフラクション（Ｆｒ．１３〜Ｆｒ．１４）に分画した。Ｆｒ．１３（２．０ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ヘキサン−ジエチルエーテル）に付すことで２つのフラクション（Ｆｒ．１６〜１７）に分画した。Ｆｒ．１６(５００ｍｇ)についてシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ヘキサン−ジエチルエーテル）を繰り返すことにより、化合物７（３０ｍｇ）及び化合物８（３００ｍｇ）を単離した。

（２）化合物１〜８の構造決定
化合物１〜８の構造を決定する目的で、ＩＲ、ＦＡＢ−ＭＳ、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲを測定した。

ＩＲ（赤外線吸収）スペルトルの測定には、日本分光株式会社製のJASCO FT/IR-470 plus Fourier transform infrared spectrometerを使用した。

ＦＡＢ−ＭＳの測定には、日本電子株式会社製JEOL the Tandem MS station JMS-700を使用した。

^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲ、異核多量子コヒーレンス（ＨＭＱＣ）及び異核多重結合コヒーレンス（ＨＭＢＣ）スペクトルは、ＪＥＯＬＥＣＡ分光光度計で、内部基準としてＴＭＳを用い、^１Ｈ−ＮＭＲでは４００、５００及び７００ＭＨｚで、^１３Ｃ−ＮＭＲでは１００、１２５及び１７５ＭＨｚでそれぞれ測定した。

また、旋光度は、日本分光（株）のLTDDIP-1000で測定した。

化合物１〜８の物性は、以下のとおりである。
化合物１：淡い帯黄色粉末. IR ν^KBｒ _maxcm^-1: 3491 (OH), 1653 (C=O);¹H-NMR (DMSO-d₆, 400 MHz):δ 12.9 (1H, s, 5’-OH), 7.88 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2’ and H-6’), 6.93 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3’ and H-5’), 6.69 (1H, s, H-3), 6.47 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6) and ¹³C-NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ 181.8 (C-4), 164.0 (C-2), 163.7 (C-7), 161.6 (C-9), 161.4 (C-4’), 157.3 (C-5), 128.5 (C-2’, 6’), 121.4 (C-1’), 129.5 (C-2’, 6’), 116.0 (C-3’, 5’), 103.8 (C-10), 102.8 (C-3). 98.8 (C-6), 94.0 (C-8), Positive FAB-MS : m/z271 [M+H]⁺.

化合物２：無色粉末; [α]²⁹ _D +25.0°(c = 0.18, MeOH); IR ν^KBｒ _max cm^-1: 3372 (OH), 1636 (C=O);¹H-NMR (Acetone-d₆, 400 MHz) δ 11.7 (1H, s, 5-OH), 7.41 (2H, d , J = 8.8 Hz, H-2’, H-6’), 6.88 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3’, H-5’), 5.98 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 5.93 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 5.08 (1H, d, J =11.6 Hz, H-2), 4.65 (1H, d, J = 11.6 Hz, H-3) and ¹³C-NMR (Acetone-d₆, 100 MHz) δ 198.2 (C-4), 168.4 (C-7), 164.2 (C-9), 164.9 (C-5), 158.3 (C-4’), 158.2 (C-3’, 5’), 130.2 (C-2’, 6’), 129.1 (C-1’), 101.5 (C-10), 97.0 (C-6), 96.0 (C-8), 84.4 (C-2), 73.1 (C-3). Positive FAB-MS: m/z 289 [M+H]⁺.

化合物３：無色粉末; [α]²⁶ _D -10.3° (c = 0.75, Acetone); IR ν^KBｒ _max cm^-1: 3412 (OH), 1642 (C=O);¹H-NMR (CD₃OD, 700 MHz) δ7.35 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2’, H-6’), 6.83 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-3’, H-5’), 5.91 (1H, d, J = 2.2 Hz, H=6), 5.89 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 5.14 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-2), 4.62 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-3), 4.25 (1H, dq, J = 9.7, 6.4 Hz, Rha H-5”), 4.00 (1H, d, J = 1.6 Hz, Rha H-1”), 3.64 (1H, dd, J = 9.6, 3.2 Hz, Rha H-3”), 3.49 (1H, dd, J = 3.2, 1.6 Hz, Rha H-2”), 3.30 (1H, under the MeOH, Rha H-4”), 1.18 (1H, d, J= 6.4 Hz, Rha H-6”) and ¹³C-NMR (Methanol-d₄, 175 MHz) δ 196.0 (C-4), 168.7 (C-9), 165.4 (C-5), 164.1 (C-7), 130.0 (C-2’ and C-6’), 128.6 (C-1’), 116.5 (C-3’) 3.8 (Rha C-4”), 72.2 (Rha C-3”), 71.8 (Rha C-2”), 70.5 (Rha C-5”), 17.8 (Rha C-6”); Positive FAB-MS: m/z 435 [M+H]⁺.

化合物４：無色粉末. [α]²⁸ _D+3.5°(c = 0.26, MeOH). IR ν^KBｒ _maxcm^-1: 3429 (OH), 1627 (C=O);¹H-NMR (Acetone-d₆, 500 MHz) δ 11.7 (1H, s, 5-OH), 7.72 (1H, s, 3’-OH), 7.08 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-2’), 7.01 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6’ ), 6.97 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5’), 6.05 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-8), 6.07 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-6), 5.08 (1H, d, J = 11.7 Hz, H-2), 4.77 (1H, d, J = 4.2 Hz, 3-OH), 4.66 (1H, dd, J = 11.7, 4.2 Hz, H-3), 3.87 (3H, s, 4’-OCH₃), 3.85 (3H, s, 7-OCH₃) and ¹³C -NMR (Acetone-d₆, 175 MHz) δ 198.6 (C-4), 169.2 (C-7), 163.9 (C-9), 164.7 (C-5), 148.9 (C-4’), 147.3 (C-3’), 130.9 (C-1’), 120.5 (C-6’), 115.5 (C-2’), 112.0 (C-5’), 102.1 (C-10), 95.7 (C-6), 94.7 (C-8), 84.4 (C-2), 73.1 (C-3), 56.2 and 56.3 (2-OCH₃). Positive FAB-MS: m/z 333 [M+H]⁺.

化合物５：無色粉末; [α]²⁶ _D +3.6° (c = 0.61, Acetone); IR ν^KBｒ _max cm^-1: 3371 (OH), 1636 (C=O); ¹H-NMR (Acetone-d₆, 400 MHz) δ 6.96 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2’), 6.84 (1H, dd, J = 8.4, 2.0 Hz, H-6’), 6.80 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-5’), 5.92 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-8), 5.88 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 4.91 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-2), 4.50 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-3) and ¹³C-NMR (Acetone-d₆, 175 MHz) δ 198.2 (C-4), 168.9 (C-7), 165.0 (C-5), 164.2 (C-9), 158.8 (C-4’), 130.3 (C-2’, 6’), 129.1 (C-1’), 115.9 (C-3’, 5’), 101.5 (C-10), 97.0 (C-6), 96.0 (C-8), 84.4 (C-2), 73.1 (C-3). Positive FAB-MS: m/z 305 [M+H]⁺.

化合物６：淡い帯黄色粉末;IR ν^KBｒ _max cm^-1: 3400 (OH), 1642 (C=O);¹H-NMR (Acetone-d₆, 400 MHz) δ11.9/11.8 (1H, s, 5-OH), 7.09/7.09 (1H, s, H-2’), 6.93/6.86 (2H, H-5’, H-6’), 6.00/5.99 (1H, d, J = 2.0 Hz, H=8), 5.97/5.99 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 5.19/5.96 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-2), 4.73/5.10 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-3), 4.25/4.69 (1H, dq, m, Rha H-5”), 4.12/ 4.25 (1H, d, J = 2.0 Hz, Rha H-1”), 3.70/4.02 (1H, dd, J = 9.6 and 3.6Hz, Rha H-3”), 3.41/3.60 (1H, dd, J = 3.6 and 2.0 Hz, Rha H-2”), 3.30/3.25 (1H, m, Rha H-4”), 1.16/0.85 (1H, d, J= 6.4 Hz, Rha H-6”);¹³C-NMR (Acetone-d₆, 125 MHz) δ195.9/197.7 (C-4), 167.6/167.8 (C-7), 165.2/165.2 (C-5), 163.6/163.8 (C-9), 146.7/146.8 (C-4’), 146.0/146.0 (C-3’), 129.0/129.7 (C-1’), 120.4/120.7 (C-6’), 115.4/116.0 (C-2’), 115.4/115.8 (C-5’), 102.0/102.4 (C-10), 102.0/101.6 (Rha C-1”), 97.1/97.2 (C-6), 96.0/96.0 (C-8), 83.0/83.2 (C-2), 77.3/75.7 (C-3), 73.2/73.5 (Rha C-4”), 72.0/72.2 (Rha C-3”), 71.3/71.5 (Rha C-2”), 69.8/69.5 (Rha C-5”), 17.9/17.9 (Rha C-6”) are common to (-)-(2R,3R)-dihydroquercetin-3-O-α-L-rhamnoside and (-)-(2S,3S)-dihydroquercetin-3-O-α-L-rhamnoside. Positive FAB-MS: m/z 451 [M+H]⁺.

化合物７：無色油状物; [α]²⁹ _D + 15.4° (c = 0.15,CHCl₃); EIMS m/z (relative intensity) 218 (M⁺26 %), 203 (18 %), 161 (17 %), 133 (10 %), 119 (100 %), 105 (8 %), 91 (6 %), 85 (17 %), 57 (22 %) ; IR (KBr) cm^-1: 1685 (C=O), 1620 (C=C);¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.10 (4H, brs, ArH), 3.28 (1H, ddd, J = 8.0, 7.2, 6.3 Hz, H-7), 2.68 (1H, dd, J = 16.1, 6.3 Hz, H-8), 2.58 (1H, dd, J = 16.1, 8.0 Hz, H-8), 2.31 (3H, s, H-15), 2.19 (2H, m, H-10), 2.08(1H, m, H-11), 1.23 (3H, d, J = 7.2 Hz, H-14) ,0.85 (6H,d, J = 4.6 Hz,, H-12,13); ¹³C-NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 209.9 (C-9), 9143.3 (C-4), 135.7 (C-1), 129.1 (C-3,5), 126.6 (C-2, 6), 52.5 (C-10), 51.7 (C-8), 34.9 (C-7), 24.4 (C-11), 22.5 (C-12,13), 22.0 (C-14), 21.0 (C-15). MS: m/z 217 [M+H]⁺.

化合物８：淡黄色油状物; [α]²⁹ _D +63.7°(c = 0.995,CHCl₃); EIMS m/z (relative intensity) 216 (M⁺20 %), 201 (7 %), 132 (15 %), 119 (100 %), 105 (8 %), 98 (3 %), 91 (10 %), 83 (98 %), 77 (3 %), 55 (17 %) ; IR ν^KBｒ _max cm^-1: 1685 (C=O), 1620 (C=C);¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ7.10 (4H, brs, ArH), 6.02 (1H, brs, H-10), 3.29 (1H, ddd, J = 8.8, 7.6, 6.8 Hz, H-7), 2.71 (1H, dd, J = 16.4, 7.6 Hz, H-8), 2.61 (1H, dd, J = 16.4, 8.8 Hz, H-8), 2.31 (3H, s, H-15), 2.10 (3H, s, H-12), 1.86 (3H, s, H-13), 1.24 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-14); ¹³C-NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 200.0 (C-9), 155.1 (C-11), 143.7 (C-4), 135.3 (C-1), 129.1 (C-3,5), 126.7 (C-2, 6), 124.1 (C-10), 52.7 (C-8), 35.3 (C-7), 27.6 (C-15), 22.0 (C-13), 21.0 (C-12), 20.7 (C-14).

上記スペクトルデータと文献中の化合物の物理的及びスペクトルデータとを比較することにより、化合物１〜５及び７〜８をそれぞれ、アピゲニン（Itokawa, H., et al., Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 29(1), 254-256 (1981); Markham, K.R., et al., Tetrahedron 34, 1389-1397 (1977)）、(＋)−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロケンフェロール(Takahashi, H., et al., Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 36(5), 1877-1881 (1988))、（＋）−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロケンフェロール３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド(Reisch, J., et al., Phytochemistry, 23, 2114-2115 (1984))、（＋）−４’，７−ジメトキシ−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロクェルセチン(Islam, M.T., et al., Phytochemistry, 54, 901-907 (2000))、及び(＋)−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロクェルセチン(Nonaka, G.,et al., Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 35, 1105-1108 (1987))、（＋）−（Ｓ）−ジヒドロ−ａｒ−ターメロン（Honwad, V.K.; Rao, A.S. Terpenoids-LXIX ABSOLUTE CONFIGURATION OF (-)-α-CURCUMENE*. Tetrahedron. 2004, 21, 2593-2604、及びCrawford, R.J.; Erman, W.F.; Broaddus, C.D. Metalation of Limonene. A novel Method for the Synthesis of Bisabolene Sesquiterpens. J. Amer. Chem. Soc. 94(12), 1972, 4298-4306）、及び（＋）−（Ｓ）−ａｒ−ターメロン（Zhang, A.; Rajanbabu, T.V. Chiral Benzyl Centers through Asymmetric Catalysis. A Three-Step Synthesis of (R)-(-)-α-Curcumene via Asymmetric Hydrovinilation. Org. Lett. 2004, 6(18), 3159-3161、及び Mori, K. Synthesis of (R)-ar-turmerone and its conversion to (R)-ar-himachalene, a pheromone component of the flea beetle: (R)-ar-himachalene is dextrorotary in hexane, while levorotatory in chloroform. Tetrahedron: Asymmetry. 2005, 16, 685-692）と同定した。

化合物６は、陽イオンＦＡＢ−ＭＳにおいてｍ/ｚ４５１に分子イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］^＋を与え、これは分子量が４５０であることを示している。^１H-NMR[δ6.00/5.99 (1H, d, J = 2.0 Hz, H=8), 5.97/5.99 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 7.09/7.09 (1H, s, H-2’), 6.93/6.86 (2H, H-5’, H-6’)]は、化合物６がアグリコンとしてジヒドロクェルセリンを有していることを示した。さらに、フラバノールの[δ5.19/5.96 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-2)及び 4.73/5.10 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-3)]間のカップリング定数は、化合物６がtrans−立体配置であることを示唆した（Gaffield, W., et al., Journal of Organic Chemistry, 40(8), 1057-1061 (1974）)。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの分析により、δ4.12/4.25（1H, d, J=2.0Hz）の芳香族プロトン共鳴及びδ1.16/0.85（1H, d, J=6.4Hz）のメチル共鳴（これら両方ともα−L−ラムノピラノシル残基に典型的である）を含むことから、糖部分の存在が示された。さらにラムノシドの芳香族プロトン（H-1”）は、ジヒドロクェルセリンのC-3に相当した。それゆえ、化合物６は、疑いなく（−）−（２Ｒ，３Ｒ）−及び(-)−（２Ｓ，３Ｓ）−ジヒドロクェルセチン−３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシドと同定した(Kasai, R., Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 36, 4167-4170 (1988）)。化合物６の（−）−（２Ｒ，３Ｒ）体及び（−）−（２Ｓ，３Ｓ）体の割合は、C-1”プロトン共鳴の積分により１：１と観測された。

化合物１〜８の構造式を図２に示す。なお、式中の「ｒｈａ」は「ラムノシド基」を示す。

これらのフラボノイド（化合物１〜８）は、Peltophorum属から初めて単離された。特に、イエロー・バタイの主成分である化合物２〜６（ジヒドロフラボノール）及び化合物７〜８は、Peltophorum属において有用な化学分類学的マーカーとなる見込みがある。

（３）チロシナーゼ阻害活性試験（インビトロ）
チロシナーゼ阻害活性を、Ｌ−ＤＯＰＡを用いて評価した。評価試験は、Masudaによって以前報告された９６ウェルのマイクロプレート法（Masuda, T., et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 69(1), 197-201 (2005)）を改良した方法で行った。以下、簡単に説明する。なお、マッシュルームチロシナーゼ（EC 1-14-18-1）及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０はSigma-Aldrich社から購入した。その他の試薬及び溶剤はすべて和光純薬（株）から購入した。

全部で１２ウェルをそれぞれＡ−Ｄ（各３ウェル）と指定し、以下の反応混合液を入れた。Ａには、１２０μＬの１／１５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）と、４０μＬの２．５ｍＭＬ−ＤＯＰＡの該リン酸バッファー溶液と、の混合液を；Ｂには、１６０μＬの該リン酸バッファーを；Ｃには、８０μＬの該リン酸バッファーと、４０μＬの２．５ｍＭＬ−ＤＯＰＡの該リン酸バッファー溶液と、４０μＬの適量の試料（化合物１〜６）−該リン酸バッファー溶液（試料を溶かすために４％ＤＭＳＯ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む）と、の混合液を；Ｄには、１２０μＬの該リン酸バッファーと、４０μＬの適量の試料−該リン酸バッファー溶液（試料を溶かすために４％ＤＭＳＯ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む）と、の混合液を入れた。ポジティブコントロール試験として、コウジ酸（最終濃度＝０．０２ｍＭ）を参考試料として使用した。各ウェルの内容物を混合し、次いで、２３℃で１０分間インキュベートし、その後４０μＬのチロシナーゼ（５００ユニット／ｍｌ）の該リン酸バッファー溶液をＡ及びＣに添加するとともに、該リン酸バッファーをＢ及びＤに添加した。２３℃で２分間インキュベーションした後、各ウェルについて４９２ｎｍの吸光度を測定した。

チロシナーゼ活性の阻害パーセントを以下の式；
１００−｛［（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｄ）］／（Ａ−Ｂ）｝×１００
に従って計算した。

その結果を図３に示す。

図３の結果から、化合物１〜８の中で、化合物２が最も強力な阻害剤であり、化合物５が２番目に強力な阻害剤であり、化合物８が３番目に強い阻害剤であることがわかった。化合物２及び５のＩＣ_５０値は、それぞれ１２６μＭ及び２１０μＭであった。対照的に、化合物１、４及び７は、酵素をわずかに阻害したが、化合物３及び６は全くチロシナーゼ阻害活性を示さなかった。これらのチロシナーゼ阻害の違いは、活性な中央酵素中の銅をキレートするかどうかによって決まると考えられる。実際に、化合物１及び４のように酵素中の銅をキレートしない化合物は、わずかしか活性を示さず、３−ヒドロキシ基をラムノシドのような大きな基で保護すると（化合物４及び６）、阻害は観察されなかった。他方で、３−ヒドロキシ基が化合物２及び５のようにフリーである場合には、強力な阻害が観察された。

一般に、３’，４’−ジヒドロキシ置換基を有するクェルセチンは、４’−ヒドロキシル置換基を有するケンフェロールよりもさらに有力な阻害剤であることが報告されている（Kubo, I & Kinst-Hori, I. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47, 4121-4125 (1999)）。しかし、図１の結果では、４’−ヒドロキシル置換基を有する化合物２が、３’，４’−ジヒドロキシ置換基を有する化合物５よりもさらに有力な阻害剤であるという結果となった。これは、興味深い新しい結果である。
そこで、次に化合物２及び５の動態を分析した。

（４）動態解析
反応混合液は、１／１５Ｍリン酸バッファー中に３つの異なる濃度のＬ−ＤＯＰＡ基質（０．３ｍＭから２．５ｍＭ）及びマッシュルームチロシナーゼを含む。それぞれの反応混合液に、試料（化合物２又は５）を、最終濃度が０、１００、及び２５０ｍＭとなるように添加した。チロシナーゼのミカエリス定数（Ｋ_ｍ）及び最大速度（Ｖ_ｍａｘ）を、Lineweaver-Burkプロットによって決定した。競合阻害型の相反方程式は：
１／Ｖ＝Ｋ_ｍ／Ｖ_ｍａｘ（１＋［Ｉ］Ｋｉ）１／［Ｓ］＋１／Ｖ_ｍａｘ
であった。競合阻害剤の阻害定数（Ｋｉ）は、下式：
１／Ｖ_{ｍａｘａｐｐ}＝１／Ｖ_ｍａｘ
（式中、１／Ｖ_{ｍａｘａｐｐ}は任意の阻害剤濃度の存在下における見かけのＶ_ｍａｘである）
によって計算した。

化合物２の結果を図４（Ａ）に、化合物５の結果を図４（Ｂ）に示す。

図４（Ａ）及び（Ｂ）のLineweaver-Burkプロットから、化合物２及び５は、いずれもＬ−ＤＯＰＡ酸化の競合型阻害剤として作用することがわかった。また、化合物２の阻害定数は、Ｋｉ＝０．１２±０．０４ｍＭであり、化合物５の阻害定数は、Ｋｉ＝０．１９±０．０９ｍＭであった。

Claims

イエロー・バタイ（Peltophorum dasyrachis）のエステル及び／又はハロゲン化炭化水素抽出物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
前記抽出物が、式（Ｉ）：

で表されるアピゲニン、式（ＩＩ）:

（式中、Ｒ_１は水素原子又はラムノシド基を示す）
で表されるジヒドロケンフェロール、式（ＩＩＩ）:

（式中、Ｒ_２は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ_３は水素原子又はラムノシド基を示し、Ｒ_４は水素原子又はメチル基を示す）
で表されるジヒドロクェルセチン、式（ＩＶ）：

で表されるジヒドロ−ａｒ−ターメロン、及び式（Ｖ）:

で表されるａｒ−ターメロンからなる群から選択される少なくとも１種のフラボノイドを含む、請求項１に記載のチロシナーゼ阻害剤。
前記抽出物が、式（ＩＩａ）:

で表される(＋)−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロケンフェロール、式（ＩＩＩａ）:

で表される(＋)−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロクェルセチン、及び式（Ｖａ）:

で表される（＋）−（Ｓ）−ａｒ−ターメロンの少なくとも１種を含む、請求項１又は２に記載のチロシナーゼ阻害剤。
前記抽出物が、 (＋)−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロケンフェロール及び (＋)−（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロクェルセチンの少なくとも１種を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のチロシナーゼ阻害剤。
請求項１〜４のいずれかに記載のチロシナーゼ阻害剤からなる食品添加剤。
請求項１〜４のいずれかに記載のチロシナーゼ阻害剤からなる化粧品添加剤。