JP2010011747A - 細胞培養容器および細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、継代操作時の細胞機能の劣化、操作の煩雑さといった従来の細胞培養に纏わる課題を解決できる新規の細胞培養容器の提案を目的とする。
【解決手段】少なくとも、液体を流す流路と、該流路の壁面に、付着性細胞が接着可能である培養面と、前記流路に前記液体を導入するための流入口と、前記流路から前記液体を排出するための流出口と、を有する、付着性細胞の培養のために用いられる細胞培養容器であって、該細胞培養容器（第１の細胞培養容器）は、他の該細胞培養容器（第２の細胞培養容器）とお互いを連結するための連結部及び被連結部を前記流路と空間的に繋がって有しており、前記第１の細胞培養容器の連結部と前記第２の細胞培養容器の被連結部とを連結することによって、前記第１の細胞培養容器の培養面と前記第２の細胞培養容器の培養面が連続した培養面を形成することを特徴とする細胞培養容器。
【選択図】図５

Description

本発明は、付着性細胞の継代培養に使用する細胞培養容器に関する。また、付着性細胞の継代的な培養方法に関する。

従来、細胞培養に利用されている細胞種として付着性細胞が多く用いられている。付着性細胞とは、足場に接着することで生存、増殖、物質の生産を行なうことができる足場依存性の細胞群の総称である。付着性細胞には初代培養細胞をはじめとした細胞群の多くや、さらには無限に増殖可能な株化細胞の中にも数多く知られている。

付着性細胞種の重要な性質として、ディッシュやフラスコ等の培養容器の培養面において細胞が培養面を覆いつくしてしまうと細胞増殖が停止してしまう接触阻害が知られている。また、播種される細胞濃度が低すぎると栄養分や酸素等が細胞に十分供給されている環境であっても細胞の接着や増殖に影響が生じるという密度効果も知られている。したがって、分裂を繰り返す付着性細胞を培養するためには、培養容器で細胞を適当な時間培養して目的の細胞濃度まで増殖する度に、細胞を培養面から剥離し、その一部を新たな培養容器に移し替える操作（以下、継代操作と略す）を継続的に行なう必要がある。この継代操作は頻繁な液交換などの非常に煩雑な作業を伴うものであり、従来から継代操作を簡便に行なうことを目的として各種提案がなされている。

例えば、特許文献１には、ガス透過性の樹脂で作製された細胞バッグ同士を接続し、バッグ内の培養液を混合させることで、細胞濃度を調整するスプリット操作に関する発明が記載されている。

また、特許文献２には、面積が異なる複数の培養面を有する培養容器を用い、最小面積を有する培養面から細胞培養を開始し、増殖が進行するにつれて細胞をスクレーパーで剥離して徐々に面積の大きな培養面へと細胞を移動しながら培養を閉鎖系で行なう方法が提案されている。

特開平７−０４７１０５号公報 特開２００４−１２９５５８号公報

継代操作は付着性細胞の継続的な培養を行なうためには必須の操作であるが、細胞の剥離、懸濁、希釈、播種という煩雑な作業を繰り返すために非常に手間のかかる作業であった。従来から作業者の負担を軽減し煩雑な継代操作を簡便にすることを目的に、上述のように様々な提案が成されているが、従来の提案においても細胞を培養面から剥離する際の細胞に対する影響が避け難いという課題が残されたままであった。

細胞を培養面から剥離するためには、通常、トリプシン等のタンパク質分解酵素による処理が行われ、タンパク質分解酵素は細胞と培養担体との結合および細胞同士の結合を司る接着因子を消化・分解するために用いられる。しかし、トリプシン等を用いた剥離操作が細胞に対して影響を与えることが従来から指摘されており（特許文献３）、細胞にとってダメージの少ない、すなわち剥離操作を含まない培養方法が求められていた。

特開平２−２１１８６５

また、細胞の継代操作全般においてもピペットを用いた液交換等、煩雑な操作を行なう必要がある。例えば細胞を大量に培養するために用いられる９６穴の細胞培養プレートでの培養に関しては、非常に煩雑な液交換が作業者にとって大きな負担となる。さらには、開放系での操作となるため、感染性の物質を対象とする場合には作業者への感染の恐れや無菌環境の維持という課題が残されていた。

そこで、本発明は、継代操作時の細胞機能の劣化、操作の煩雑さといった従来の細胞培養に纏わる課題を解決できる新規の細胞培養容器の提案を目的とする。

前記の課題を解決するための本発明は以下の通りである。
（１）少なくとも、
液体を流す流路と、
該流路の壁面に、付着性細胞が接着可能である培養面と、
前記流路に前記液体を導入するための流入口と、
前記流路から前記液体を排出するための流出口と、
を有する、付着性細胞の培養のために用いられる細胞培養容器であって、
該細胞培養容器（第１の細胞培養容器）は、他の該細胞培養容器（第２の細胞培養容器）とお互いを連結するための連結部及び被連結部を前記流路と空間的に繋がって有しており、
前記第１の細胞培養容器の連結部と前記第２の細胞培養容器の被連結部とを連結することによって、前記第１の細胞培養容器の培養面と前記第２の細胞培養容器の培養面が連続した培養面を形成することを特徴とする細胞培養容器。
（２）前記連結部及び前記被連結部への前記液体の流れを制御する液体制御部を有することを特徴とする（１）に記載の細胞培養容器。
（３）前記液体制御部は、
前記連結部への前記液体の流れを制御する第１の液体制御部と、
前記被連結部への前記液体の流れを制御する第２の液体制御部と、
を有することを特徴とする（２）に記載の細胞培養容器。
（４）前記液体制御部はダイアフラムを用いることを特徴とする（３）に記載の細胞培養容器。
（５）前記流入口と前記流出口はそれぞれ開閉可能に構成されている（１）乃至（４）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（６）少なくとも、
液体を流す流路と、
該流路の壁面に、付着性細胞が接着可能である培養面と、
を有する、付着性細胞の培養のために用いられる細胞培養容器であって、
該細胞培養容器（第１の細胞培養容器）は、他の該細胞培養容器（第２の細胞培養容器）とお互いを連結するための連結部及び被連結部を前記流路の両端に有し、
前記第１の細胞培養容器の連結部と前記第２の細胞培養容器の被連結部とを連結することによって、前記第１の細胞培養容器の培養面と前記第２の細胞培養容器の培養面が連続した培養面を形成することを特徴とする細胞培養容器。
（７）前記細胞培養容器は複数連結することができ、連結した前記細胞培養容器の培養面は連続した培養面を形成することを特徴とする（１）乃至（６）のいずれかに記載の細胞培養用容器。
（８）前記連結時に、前記第１の細胞培養容器の流路と前記第２の細胞培養容器の流路とが空間的に繋がることを特徴とする（１）乃至（７）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（９）前記連結は、前記連結部及び前記被連結部を繋ぐアダプターを用いて行われることを特徴とする（１）乃至（８）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（１０）前記アダプターは内部に前記培養面を有する流路を有し、該アダプターの流路内の培養面を介して、前記第１の細胞培養容器の培養面と前記第２の細胞培養容器の培養面が連続した培養面を形成することを特徴とする（９）に記載の細胞培養容器。
（１１）前記連結部及び前記被連結部は直接的に連結できることを特徴とする（１）乃至（８）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（１２）前記連結部及び前記被連結部は、外部空間と前記流路内の空間とを遮断可能でかつ取り外し可能な密閉部材を有することを特徴とする（１）乃至（１１）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（１３）前記培養面は光学的に透明であることを特徴とする（１）乃至（１２）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（１４）（１）乃至（１３）のいずれかに記載の細胞培養容器を用いて、剥離操作を行なわずに付着性細胞の継代培養を行うことを特徴とする細胞培養方法。

本発明に係る細胞培養容器により、剥離操作を行わずに付着性細胞の継代培養を行うことができる。

本発明の細胞培養容器は、
少なくとも、
液体を流す流路と、
該流路の壁面に、付着性細胞が接着可能である培養面と、
前記流路に前記液体を導入するための流入口と、
前記流路から前記液体を排出するための流出口と、
を有する、付着性細胞の培養のために用いられる細胞培養容器であって、
該細胞培養容器（第１の細胞培養容器）は、他の該細胞培養容器（第２の細胞培養容器）とお互いを連結するための連結部及び被連結部を前記流路と空間的に繋がって有しており、
前記第１の細胞培養容器の連結部と前記第２の細胞培養容器の被連結部とを連結することによって、前記第１の細胞培養容器の培養面と前記第２の細胞培養容器の培養面が連続した培養面を形成することを特徴とする細胞培養容器。

本発明に係る細胞培養容器により、剥離操作を行わずに付着性細胞の継代培養を行うことができる。より具体的には、本発明の細胞培養容器同士を連結することで培養面を広げることができるため、適宜該細胞培養容器を連結していくことで、剥離操作を行わずに付着性細胞の継代培養を行うことができる。したがって、従来の細胞培養方法では必要であった細胞活性に対する影響が指摘されている剥離操作を行なわずに、継続的な細胞培養を行うことができる。

また、本発明に係る細胞培養容器は、シリンジポンプ等の送液装置を取り付けることにより、前記流入口から前記流出口へと液体を流すことが可能である。したがって、培養液の交換、細胞間コミュニケーションのための液性因子の供給や老廃物の除去などを極めて容易に行なうことが出来る。

以下、本発明の細胞培養容器の実施形態について図面を用いて説明しつつ、本発明について詳細に説明するなお、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

（実施形態１）
図１は、本発明に係る細胞培養容器の実施形態の一例を示す概略図である。図２は、図１に示した細胞培養容器を上面方向から見た概略図である。また、図３は、図１に示した細胞培養容器の本体部の斜視図である。１は液体を導入するための流入口、２は液体を排出するための流出口であり、流入口１及び流出口２は流路３と繋がって構成される。図４に示すように、送液装置を用いて流入口１から流出口２に向かって流路３中に液体を送液することができる。流路３は基材７中に形成されている。また、流路３の少なくとも一部の壁面には培養面４が設けられており、この培養面４を足場として付着性細胞が増殖する。また、５は連結部、６は被連結部であり、この連結部５が別の細胞培養容器の被連結部６’に連結される。細胞培養容器が連結された際、培養面４は別の細胞培養容器の培養面４’（図５参照）と繋がり、連続した培養面を形成する。図５に、図１に示した細胞培養容器を２つ連結した構成を示す概略図を示す。図５の例では、第１の細胞培養容器１０１の連結部と第２の細胞培養容器１０２の被連結部とをアダプター１２を用いて連結している。なお、本発明の細胞培養容器は、アダプターを用いて間接的に連結するように構成されてもよく、アダプターを用いずに直接的に連結するように構成されてもよい。

以下、本発明の構成について詳細に説明する。なお、必要に応じて、連結する側の細胞培養容器を第１の細胞培養容器と称し、連結される側の細胞培養容器（継ぎ足される細胞培養容器）を第２の細胞培養容器と称す。

（流路）

流路は、液体が流れる部分であり、該液体としては、例えば、付着性細胞の増殖のための培養液や、細胞間コミュニケーションのための液性因子、洗浄用の液体等が挙げられる。流路は、液体を導入する流入口と、液体を排出する流出口と繋がっている。

流路の形状は、図１乃至３の細胞培養容器に例示されたように直線状に限定されることは無く、任意の形状から選択することができる。

また、流路の構造は、基材に微小溝として加工されていても良いし、キャピラリ構造をとっていても良い。流路の形成方法としては、特に限定されるものではないが、例えばフォトリソグラフィー法を利用することができる。例えば、ガラス・石英ガラス・シリコン等の無機材料や、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリエート）、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等のプラスチック樹脂等の基材を、フォトリソグラフィー法や成型等によって加工し、流路を形成することができる。また、必要に応じて接合したもの等を用いることもできる。

また、上述のように流路の形状は任意の形状を選択することができるが、例えば、流路の断面形状は正方形、長方形、円、楕円等の形状とすることができる。例えば、流路の断面形状が四角形で流路が平面基板上に形成される場合、該流路の幅は、２０〜１０００００μｍが好ましく、５０μｍ〜１０００μｍがより好ましい。また、該流路の高さは、５０〜１０００μｍが好ましく、１００μｍ〜５００μｍがより好ましい。また、流路の断面形状は一定であることが好ましい。

本発明の細胞培養容器の基材としては、特に限定されずに用いることができ、例えばガラス、石英ガラス、シリコン、プラスチック等の材料を用いることができる。プラスチック基材としては、例えば、フッ素樹脂やポリカーボネート、アセタール、ポリスチレン等の所定の強度と耐食性を有する透明な合成樹脂等が挙げられる。

基材の大きさは特に制限されないが、３００〜１０００μｍの厚さのものが好ましく用いられる。

さらに、基材としては、光学顕微鏡による観察を可能にするような光学的に透明であることが好ましく、酸素等のガス供給を容易に行なえるようなガス透過性の基材であることがさらに好ましい。

なお、本発明における基材は、必要に応じて表面改質して使用することができる。例えば、スライドガラスおよび石英基板等を基材として用いる場合は、あらかじめ酸、プラズマ、オゾン、有機系溶剤、水系溶剤、界面活性剤等で表面を処理することができる。また、シランカップリング等の処理により所望の置換基を表面に導入することもできる。また、表面自由エネルギーを制御する処理も施すことができる。

（流入口、流出口）
流入口は、前記流路に液体を導入するためのものであり、流出口は流路から液体を排出するためのものである。該流入口と流出口に、例えばシリンジポンプ等の送液装置を取り付けることにより、流路に液体を送液することができる。

また、この流入口及び流出口は必要時に閉じることができる。例えば、図４に示すように、１つの細胞培養容器で付着性細胞の培養を行う際には、該細胞培養容器の流出口及び流入口に送液チューブ及び排液チューブが取り付けられる。一方、図５に示すように、２つの細胞培養容器を連結して付着性細胞の培養を行う際には、第１の細胞培養容器１０１の流入口と第２の細胞培養容器１０２の流出口に送液チューブ１０及び排液チューブ１１が取り付けられることになる。つまり、第１の細胞培養容器の流出口と第２の細胞培養容器の流入口を、例えば閉塞具１３、１３’で閉じる必要がある。さらに、３つ以上の細胞培養容器を連結する場合は、流入口及び流出口の両方を閉じることとなる細胞培養容器もでてくる。閉じる方法としては、特に限定されるものではない。

なお、流入口と流出口は同じ形状であってもよい。流入口と流出口と厳密に区別される必要はなく、本発明を説明するための呼称に過ぎない。また、流入口及び流出口は開閉可能に構成されることが好ましい。

（連結部、被連結部）
上述のように、本発明の細胞培養容器は他の本発明の細胞培養容器と連結可能となるように構成される。連結部とは、細胞培養容器が連結する部分において第１の細胞培養容器の連結部分をいう。また、被連結部とは、細胞培養容器が連結する部分において第２の細胞培養容器の連結部分をいう。

また、連結部と被連結部は、直接的に又は間接的に（アダプターを用いて）連結することができる。また、細胞培養容器の連結時は、連続した培養面が形成されるように構成されている。この「連続した培養面」とは、細胞の接着・増殖等の細胞機能および活性が継続的に維持される培養面であれば良い。つまり、この条件を満たせば、各細胞培養容器の培養面の接続部の間にギャップや段差が生じていても連続した培養面であるとみなすことができる。例えば、連続した培養面の一例としては、細胞体の直径を考慮して十分小さな１０μｍ以下程度のギャップや段差等は十分に許容され得る。

アダプターを用いて連結部と被連結部を連結する際、該アダプターの内部に形成した流路上に培養面を形成しておき、この培養面を介して、第１の細胞培養容器の培養面と第２の細胞培養容器の培養面とが前記連続した培養面を形成する構成としてもよい。アダプター内の培養面の配置方法は、連結時に連続した培養面が形成されるように特に考慮して設計することが好ましい。例えば、図６に示したアダプターは、図１に示した細胞培養容器を連結するのに用いられるアダプターであるが、そのアダプター内には流路３’’が形成されており、その流路内に培養面４’’が配置され、連結時に連続した培養面を形成できるように構成されている。なお、図７は該アダプターを用いて細胞培養容器を連結したときの概略を示す斜視図である。

また、後述の実施形態で詳述するが、前記流入口と前記被連結部、及び前記流出口と前記連結部は、それぞれ同じ部分に相当する構成としてもよい。また、同様に、前記流入口と前記連結部、及び前記流出口と前記被連結部がそれぞれ同じ部分に相当する構成としてもよい。つまり、この場合、本発明は以下のように記載することができる。

少なくとも、
液体を流す流路と、
該流路の壁面に、付着性細胞が接着可能である培養面と、
を有する、付着性細胞の培養のために用いられる細胞培養容器であって、
該細胞培養容器（第１の細胞培養容器）は、他の該細胞培養容器（第２の細胞培養容器）とお互いを連結するため連結部及び被連結部を前記流路の両端に有し、
前記第１の細胞培養容器の連結部と前記第２の細胞培養容器の被連結部とを連結することによって、前記第１の細胞培養容器の培養面と前記第２の細胞培養容器の培養面が連続した培養面を形成することを特徴とする細胞培養容器。

また、連結部及び被連結部は、密閉部材により閉じられることが好ましい。連結部又は被連結部はそれ自体に開閉機構を付与してもよいが、取り外し可能な密閉部材を用いることで、培養中は内部を厳密に外部空間から遮断可能であり、連結時には容易に脱着可能であるため好ましい。

また、連結部、被連結部、密閉部材、アダプター等には、圧着をより確実なものにするためにシリコンゴムなどのシーリング材やパッキンを適宜使用することがよい。

（培養面）
前記培養面は、前記流路中に形成され、また、複数の細胞培養容器を連結したときに、各細胞培養容器の培養面が繋がり、連続した培養面となるように構成されている。

また、培養面の材料は、細胞が接着・固定化でき、目的の細胞観察に支障が無ければ特に限定されない。培養面の形成方法としては、例えば、前記流路内を親水化処理することで適宜形成することができる。例えば、有機膜または無機膜を形成し、親水化を図ることができ、細胞の接着度合いを制御することができる。他の形成方法としては、例えば、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射等を用いる方法、細胞の接着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法等がある。また、一部分をマスクすることにより、他の部分のみを有機膜または無機膜により被覆することもできる。

また、培養面の形状は、細胞が接着・固定化することが出来れば任意の形状から選択される。特に平坦な面であることが好ましい。

培養面は、前記流路の壁面のうち一つの面に渡って形成されることが好ましく、培養面の幅や厚さは任意に選択することができる。培養面の幅や厚さを適宜規定することによって、隣接した細胞間での液性因子の拡散距離を制御することが可能となり、非常に広い培養面積を持つ培養フラスコ等の培養機器と比べても液性因子の効率的な受け渡しにより細胞活性を良好に維持することが可能となる。

なお、本発明の細胞培養容器の培養対象は付着性の動物細胞が好ましいが、培養面に補足・固定化出来る手段を用いることで浮遊系の細胞も対象と成り得る。培養面上に浮遊系細胞を固定化するための手段の一例としては、浮遊系細胞の表面抗原を認識する抗体を固定化することで培養面に浮遊系細胞を不動化する方法や公知の細胞アンカリング物質を流路上に固定化する方法が挙げられる。公知の細胞アンカリング物質の一例としてＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＯＥ−０２０ＣＳ（化学名 αサクシンイミジルオキシサクシニル，ω−オレイルオキシ，ポリオキシエチレン）（日本油脂製）等を挙げることができる。

（培養方法）
次に、本発明の細胞培養容器を用いた付着性細胞の培養方法について、図８及び図９を用いて説明する。なお、図中では培養装置と細胞のサイズは現実の大きさと対応していない。また、矢印は液体の流れる方向を示し、流入口１から流出口２に向かって培地等の液体が流路内を送液される。

図８は、図１に示した細胞培養容器に送液装置を取り付け、付着性細胞１４を培養している状態を示す概略図である。そして、付着性細胞が増殖し、足場となる培養面がなくなった又は少なくなった場合、図９に示すように新たな細胞培養容器を連結し、培養を行う。より具体的には、第１の細胞培養容器の連結部５に、第２の細胞培養容器の被連結部６’を連結する。

まず、第１の細胞培養容器へ目的の細胞と培養液とを含む懸濁液を流通させて、付着性細胞の培養を行なう（図８）。その際、細胞培養容器の密閉部材は液体のシーリング能に優れたもので、かつ、細胞に対して毒性が報告されていないものの中から選択されるシリコーン樹脂やＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等のシーリング部材を用いることができる。培養面４上で所望の細胞濃度が達成されたら、流路内の培養液を取り除き、第２の細胞培養容器を連結するためにアダプター１２を連結部５に接続する。このアダプターは第１と第２の細胞培養容器の流路３及び３’を空間的に接続し、第１および第２の培養容器内において連続的な培養面を形成するものである。つまり、図９の例ではアダプターを用いて連結されており、該アダプター内の流路には培養面が設けられているため、第１の細胞培養容器の培養面４と第２の細胞培養容器の培養面４’はアダプターの培養面４’’とともに連続した培養面を形成する。アダプター１２の接続後、第２の細胞培養容器の被連結部６’を接続して連続した培養面を付加し、容器を連結した状態で培養を行なう（図９）。上記の手順によって連続した培養面を所望のタイミングで追加することができる。さらに、新たに連結した第の細胞培養容器にも同様の接続手段を備えることでさらに新しい細胞培養容器を接続することもできる。したがって、本発明の細胞培養容器を用いることにより、細胞に影響を与える剥離操作を行わずに、容易に継代培養を行うことができる。

図９において、さらなる継代培養を行う場合、第２の細胞培養容器に新たな細胞培養容器を（第３の細胞培養容器）を連結すればよい。送液装置の設置や流入口及び流出口の開閉は適宜選択することができる。このとき、第１の細胞培養容器は外しても良く、特に制限はない。細胞培養容器の連結操作時には無菌状態を確保することが好ましい。

（実施形態２）
上述のように、細胞培養容器の連結部や非連結部の形状や密閉部材の形状は、上述の要件を満たす限り特に限定されるものではなく、適宜選択することができる。

例えば図１に示した一実施形態において、密閉部材の形状としては、図１０や図１１に示した形状のものを使用できる。

また、図１２に示すように、密閉部材や、連結部、被連結部にねじ機構を用いた構成とすることで、より効果的な密閉性を担保することができる。図１２に示した細胞培養容器の一実施形態では、図１３に示したようなアダプター１２を用いることができる。また、ねじ機構の場合は、アダプター内の培養面の配置は、連結時に連続した培養面が形成されるように特に考慮して設計することが好ましい。

（実施形態３）
また、本発明の細胞培養容器は、上述のように、連結にアダプターを使用しない構成とすることができる。つまり、連結部と被連結部が直接的に連結可能なように構成とすることができる。

例えば図１４に示す細胞培養容器のように、連結部が被連結部に勘合するような構造とすることができる。引っ掛け部を設けておき、適宜取り外せるように構成することが好ましい。
（実施形態４）
本発明では、上述のように、前記流入口と前記連結部、及び前記流出口と前記被連結部は、それぞれ同じ部分に相当する構成としてもよい。また、同様に、前記流入口と前記連結部、及び前記流出口と前記被連結部がそれぞれ同じ部分に相当する構成としてもよい。

このような構成の細胞培養容器としては、例えば、図１５から図１７に示すような細胞培養容器が例として挙げられる。図１５は、該細胞培養容器の概略断面図（密閉部材は不図示）である。この細胞培養容器は、上述の本発明の説明において、連結部と流出部が同じ部分に相当し、被連結部と流入部が同じ部分に相当する構成である。図１６は、図１５における細胞培養容器の連結部及び被連結部の斜視図である。図１７は、図１５における細胞培養容器の断面概略図である。図１８は、該細胞培養容器に送液装置を取り付けた状況を表す概略図である。図１９は、該細胞培養容器を連結し、送液装置を取り付けた状態を表す概略図である。

また、図１６では、細胞培養容器の右端部を連結部と、左端部を被連結部と把握し指示線を付しているが、逆に、右端部を被連結部と、左端部を連結部と把握することもできる。

また、同様に、図１６では、細胞培養容器の左端部を流入部と、右端部を流出部と把握しているが、逆に、左端部を流出部と、右端部を流入部と把握することもできる。送液装置の取り付け状況によって捉え方が異なる。

連結機構としてねじ機構を採用することに特に制限されるわけではないが、細胞培養容器の取り外しを容易に行えるという点、及び厳密な密閉性を確保できるという点で好ましい。

（実施形態５）
また、本発明の細胞培養容器は、培養面を有しないアダプターを用いて連結する構成とすることもできる。つまり、アダプターを使用して連結するが、第１の細胞培養容器の培養面と第２の細胞培養容器の培養面とが直接接して連続した培養面を形成する構成とすることができる。

例えばこのような実施形態の一例として、図２０から２２に示したような細胞培養容器を挙げることができる。図２０は本実施形態の概略断面図である。図２１は本実施形態の本体部の斜視図である。図２２は本実施形態の上面図である。本実施形態の細胞培養容器では、培養面が本体部より飛び出す形で設置されている。図２３及び図２４は、この細胞培養容器の連結に使用するアダプターの例である。このアダプターを用い、図２５に示すように本実施形態の細胞培養容器を連結することで、連続した培養面を形成することができる。

本実施形態の他の例として、図２６から図２８に記載したような細胞培養容器も挙げられる。図２６は該細胞培養容器の概略断面図である。図２７は本体部の斜視図である。図２２は該細胞培養容器を連結し、送液装置を取り付けた状況を表す概略図である。

（実施形態６）
本発明の細胞培養容器は、ダイアフラムを利用することで、細胞培養時と培養容器接続時とで液体の流れを制御することが可能となる液体制御部を設けることができる。ダイアフラムを用いた細胞培養容器の例を、図２９及び図３０に示す。矢印は液体の流れを示している。細胞培養容器の流路内にダイアフラム１５を備えて空気圧等により駆動させることができる。ダイアフラムの材質はシーリング性に優れる材質や加工の容易さを考慮してＰＤＭＳ等の樹脂材料が好適である。

まず、第１の細胞培養容器内でダイアフラムを押し下げた状態で付着性細胞を培養する（図２９）。容器には第１の液体制御部と第２の液体制御部を備えておく。この時、液体は図の矢印のように導入・排出させることが可能である。続いて第１の細胞培養容器と第２の細胞培養容器とを連結するためのアダプターを取り付ける。細胞培養容器同士を連結するためのアダプターの材質としてはＰＤＭＳ等のシリコーン樹脂等が好ましい。そして、第２の細胞培養容器の被連結部とアダプターとを連結して、流路出入口を閉じると共に空気圧を開放して第１の細胞培養容器のダイアフラムを押し上げることで第１の細胞培養容器と第２の細胞培養容器との間に連続した培養面を形成することができる。ダイアフラム等の可逆的な液体制御機構を備える培養容器を用いることで培養液を取り除かないで細胞培養容器同士を連結することが可能となる。また、このような手段を利用することで、新しい細胞培養容器を取り付けることだけでなく、連結されている細胞培養容器を容易に外すことも可能となる。

次に、本発明の実施例について図面を用いて説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

（実施例１）
本実施例の細胞培養容器は図２０から図２２に示したものを用いた。

本実施例の細胞培養容器の作製方法について簡単に説明する。まず、シリコン基板にネガレジスト（ＳＵ−８； ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）を設け、そのレジストに図２１に示した容器の鋳型となるレジストパターンをフォトリソグラフィーにより形成する。形成した前記レジストパターンを鋳型としてＰＤＭＳプレポリマー（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４；Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）を流し込み、９０℃で１時間加熱しポリマーを形成させて、室温に放冷させることで固化させる。以下、上記工程をソフト（マテリアル）リソグラフィーと呼ぶ。放冷後、鋳型から固化したＰＤＭＳを剥離する。底面を構成する基板となるスライドガラスと固化したＰＤＭＳとを酸素プラズマ（８０Ｗ，３０秒）で接合する。連結部及び被連結部にはシーリングのために図示したように密閉部材を取り付けて液体の漏出を防止する。

さらに前記のフォトリソグラフィーにより形成されるＰＤＭＳ構造体の流入口及び流出口に送液のためのチューブを接着剤（信越シリコーン）を用いて固定化する。

流路を通じてフィブロネクチン／リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ｉｎｃ．）水溶液を導入し、この水溶液を培養空間内で１時間留めておくことで、流路に細胞接着のための前処理を行なう（培養面を形成する）。その後、ＰＢＳを培養空間内に流通させて余剰なフィブロネクチンを洗浄する。ヒト子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ細胞を１０％のウシ血清（ＦＢＳ；ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ｉｎｃ．）を含む細胞培養液（ＲＰＭＩ１６４０；ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ｉｎｃ．）で細胞濃度１×１０⁵細胞／ｍｌに調整したものを培養空間内に導入して３７℃、５％ＣＯ₂の環境下で細胞培養を行なう。この際、ウシ血清を含む培養液を６時間毎に流通させる以外は静置した状態で培養する。

細胞が培養容器内底面に接着した後に所望の速度で増殖を示したことを光学顕微鏡等により観察する。その後培養液を流路から除去し、密閉部材を取り除く。密閉部材を取り除いた連結部にソフトリソグラフィーで作製したＰＤＭＳ構造体（アダプター１２）を取り付け、アダプターを介して新たな培養容器を取り付ける（図２５）。後から取り付ける培養容器内には予めフィブロネクチンによる細胞接着処理を施しておく。新たに接続した培養容器に、ウシ血清を含む培養液を導入してＨｅＬａ細胞の培養を行なう。Hela細胞は接続した培養容器によって生じた新たな細胞接着面（培養面）上に接着して増殖する。さらに、培養容器を付加するだけでなく、接続した培養容器を取り除いたり、所望の培養容器のみを取り外すことも可能である。目的に応じて上記の操作を繰り返して行なうことにより剥離操作を行なうことなく継続的な細胞培養が可能となる。

（実施例２）
本実施例では送液を制御するためのバルブ機構としてダイアフラムを培養容器内に備える構成となっている。本実施例におけるダイアフラムはシリコーンポリマーやＰＤＭＳ等の弾性を有する有機膜のフィルムを空気圧により歪ませることにより流路部分を塞ぐ機能を有する。流路の天井部分に前記の通りに作製したＰＤＭＳシートを貼り付けてダイアフラムシートとする。前記のバルブ機構以外のその他の構造は実施例１の構成と同様である。ダイアフラムを設けることで培養空間内の培養液を取り除くことなく培養容器の取り外しを行なうことができる。ダイアフラムを図３に示した通りの動作を行なうことで培養容器の追加および取り外しを行なう。弾性シートを用いたダイアフラムの一例としては非特許文献１が挙げられる。

Ｘ．Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｇｒｏｓｊｅａｎ，Ｙ．−Ｃ．Ｔａｉ，Ｃ．−Ｍ．Ｈｏ，Ｐｒｏｃ．ＩＥＥＥ ＭＥＭＳ ’９７，１１４（１９９７）

本発明に係る細胞培養容器の実施形態の一例を示す概略図である。 図１に示した細胞培養容器を上面方向から見た概略図である。 図１に示した細胞培養容器の本体部の斜視図である。 図１に示した細胞培養容器に送液装置を取り付けた状態を表す概略図である。 図１に示した細胞培養容器を２つ連結した構成を示す概略図である。 図５における細胞培養容器の連結に用いたアダプターを表す説明図である。 図５における細胞培養容器の連結状態を表す斜視図である。 図１に示した細胞培養容器に送液装置を取り付け、付着性細胞を培養している状態を示す概略図である。 図８の細胞培養容器にさらに新たな細胞培養容器（第２の細胞培養容器）を連結し培養している状態を示す概略図である。 密閉部材の形状の一例を表す概略図である。 密閉部材の形状の一例を表す概略図である。 密閉部材（ねじ機構）の形状の一例を表す概略図である。 図１２の細胞培養容器をアダプターを用いて連結した状態を表す概略図である。 アダプターを用いずに直接的に連結可能な細胞培養容器の一実施形態を表す概略図である。 本発明に係る細胞培養容器の実施形態の一例を示す概略図である（連結部と流出部が同じ部分に相当し、被連結部と流入部が同じ部分に相当する構成、密閉部材は不図示）。 図１５の細胞培養容器の連結部及び被連結部を説明するための概略図である。 図１５の細胞培養容器の断面概略図である。 図１５の細胞培養容器に送液装置を取り付けた状態を表す概略図である。 図１５の細胞培養容器を２つ連結し、送液装置を取り付けた状態を表す概略図である。 本発明に係る細胞培養容器の実施形態の一例を示す概略図である（アダプターを用いて連結し、第１の細胞培養容器の培養面と第２の細胞培養容器の培養面とが直接的に接する構成）。 図２０の細胞培養容器の本体部の斜視図である。 図２０の細胞培養容器の上面図である。 図２０の細胞培養容器の連結に用いるアダプターを表す斜視図である。 図２３のアダプターを詳細に説明するための概略図である。 図２０の細胞培養容器を図２３のアダプターを用いて連結する際の概要を説明するための概略図である。 本発明に係る細胞培養容器の実施形態の一例を示す概略図である（アダプターを用いて連結し、第１の細胞培養容器の培養面と第２の細胞培養容器の培養面とが直接的に接する構成）。 図２６の細胞培養容器の本体部の斜視図である（流入口及び流出口は不図示）。 図２６の細胞培養容器をアダプターを用いて２つ連結し、送液装置を取り付けた状態を表す概略図である。 本発明に係る細胞培養容器の実施形態の一例を示す概略図である（ダイアフラムを用いて連結部又は被連結部への液体の流れを制御する構成）。 図２９の細胞培養容器を２つ連結し、送液装置を取り付けた状態を表す概略図である。

符号の説明

１ 流入口
２ 流出口
３ 流路（第１の細胞培養容器の流路）
３’ 第２の細胞培養容器の流路
３’’アダプターの流路
４ 培養面
４’ 第２の細胞培養容器の培養面
４’’アダプターの流路内の培養面
５ 連結部（第１の細胞培養容器の連結部）
５’ 第２の細胞培養容器の連結部
６ 被連結部（第１の細胞培養容器の被連結部）
６’ 第２の細胞培養容器の被連結部
７ 基材
８ 連結部の密閉部材
９ 被連結部の密閉部材
１０ 送液チューブ
１１ 排液チューブ
１２ アダプター
１３ アダプター内の流路
１４ 付着性細胞
１５ ダイアフラム（液体制御部）

Claims (14)

1. 少なくとも、
   液体を流す流路と、
   該流路の壁面に、付着性細胞が接着可能である培養面と、
   前記流路に前記液体を導入するための流入口と、
   前記流路から前記液体を排出するための流出口と、
   を有する、付着性細胞の培養のために用いられる細胞培養容器であって、
   該細胞培養容器（第１の細胞培養容器）は、他の該細胞培養容器（第２の細胞培養容器）とお互いを連結するための連結部及び被連結部を前記流路と空間的に繋がって有しており、
   前記第１の細胞培養容器の連結部と前記第２の細胞培養容器の被連結部とを連結することによって、前記第１の細胞培養容器の培養面と前記第２の細胞培養容器の培養面が連続した培養面を形成することを特徴とする細胞培養容器。
2. 前記連結部及び前記被連結部への前記液体の流れを制御する液体制御部を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
3. 前記液体制御部は、
   前記連結部への前記液体の流れを制御する第１の液体制御部と、
   前記被連結部への前記液体の流れを制御する第２の液体制御部と、
   を有することを特徴とする請求項２に記載の細胞培養容器。
4. 前記液体制御部はダイアフラムを用いることを特徴とする請求項３に記載の細胞培養容器。
5. 前記流入口と前記流出口はそれぞれ開閉可能に構成されている請求項１乃至４のいずれかに記載の細胞培養容器。
6. 少なくとも、
   液体を流す流路と、
   該流路の壁面に、付着性細胞が接着可能である培養面と、
   を有する、付着性細胞の培養のために用いられる細胞培養容器であって、
   該細胞培養容器（第１の細胞培養容器）は、他の該細胞培養容器（第２の細胞培養容器）とお互いを連結するための連結部及び被連結部を前記流路の両端に有し、
   前記第１の細胞培養容器の連結部と前記第２の細胞培養容器の被連結部とを連結することによって、前記第１の細胞培養容器の培養面と前記第２の細胞培養容器の培養面が連続した培養面を形成することを特徴とする細胞培養容器。
7. 前記細胞培養容器は複数を連結することができ、連結した前記細胞培養容器の培養面は連続した培養面を形成することを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の細胞培養容器。
8. 前記連結時に、前記第１の細胞培養容器の流路と前記第２の細胞培養容器の流路とが空間的に繋がることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の細胞培養容器。
9. 前記連結は、前記連結部及び前記被連結部を繋ぐアダプターを用いて行われることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の細胞培養容器。
10. 前記アダプターは内部に前記培養面を有する流路を有し、該アダプターの流路内の培養面を介して、前記第１の細胞培養容器の培養面と前記第２の細胞培養容器の培養面が連続した培養面を形成することを特徴とする請求項９に記載の細胞培養容器。
11. 前記連結部及び前記被連結部は直接的に連結できることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の細胞培養容器。
12. 前記連結部及び前記被連結部は、外部空間と前記流路内の空間とを遮断可能でかつ取り外し可能な密閉部材を有することを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の細胞培養容器。
13. 前記培養面は光学的に透明であることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれかに記載の細胞培養容器。
14. 請求項１乃至１３のいずれかに記載の細胞培養容器を用いて、剥離操作を行なわずに付着性細胞の継代培養を行うことを特徴とする細胞培養方法。

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