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JP2010042000A - 発現ベクターおよびその使用方法 - Google Patents

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JP2010042000A JP2009191744A JP2009191744A JP2010042000A JP 2010042000 A JP2010042000 A JP 2010042000A JP 2009191744 A JP2009191744 A JP 2009191744A JP 2009191744 A JP2009191744 A JP 2009191744A JP 2010042000 A JP2010042000 A JP 2010042000A
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Abstract

【課題】新規のベクター、前記ベクターを含むDNAワクチンおよび遺伝子治療物質、前記ベクターおよび前記ベクターを含むDNAワクチンおよび前記遺伝子治療物質の製造方法、並びに前記ベクターの治療的な使用方法の提供。
【解決手段】（a）（i）特定のDNA配列に結合できるDNA結合ドメイン（ii）核構成要素に結合できる機能ドメインを含む、核アンカータンパク質の遺伝子発現カセットと、（b）核アンカータンパク質のための結合部位を形成する多量体化されたDNAと、（c）対象となるDNA配列の1つまたは複数の発現カセットとを含むベクター。パピローマウイルス複製開始点を欠損し、哺乳類細胞における機能的な複製開始点を欠損する。核アンカータンパク質は、ウシの1型パピローマウイルスまたはエプスタイン・バーウイルス核抗原1のE2タンパク質を含む。さらに、被験者において対象となるDNA配列を発現させるための方法。
【選択図】なし

Description

1.本発明の技術分野
本発明は、新規ベクター、ベクターを含むDNAワクチンおよび遺伝子治療物質、ベクターおよびベクターを含むDNAワクチンおよび遺伝子治療物質を製造するための方法、並びにベクターの治療的な使用に関する。より詳細には、本発明は、新規ベクターであって、（a）（i）特定のDNA配列に結合することができるDNA結合ドメイン、および（ii）核構成要素に結合することができる機能ドメインを含む、核アンカータンパク質の遺伝子発現カセットと、（b）核アンカータンパク質のアンカータンパク質のための結合部位を形成する多量体化されたDNAと、選択的に（c）対象となるDNA配列の1つまたは複数の発現カセットとを含むベクターに関する。特に、本発明は、パピローマウイルス複製開始点を欠損するベクターに関する。また、本発明は、哺乳類細胞における機能的な複製開始点を欠損するベクターに関する。本発明は、さらに、被験者において対象となるDNA配列を発現させる方法に関する。
2.本発明の背景
適切なベクターによる動物もしくはヒトへの自己または異種遺伝子の導入は、遺伝的背景を有する疾患を治療するため、または感染症を予防もしくは治療するための測り知れない可能性を有する技術として明らかである。変異による欠損があり、したがって機能しない遺伝子/遺伝子群を送達するために、ウイルス性および非ウイルス性のベクターのいくつかの型が、動物において、およびヒト被験者において開発され、および試験されている。このようなベクターの例には、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびアデノ随伴ベクターが含まれる。
ワクチン接種は、感染性物質によって引き起こされる疾患を予防するために非常に有効かつ経済的な方法であることが証明されている。天然痘ウイルス（痘瘡）に対する弱毒ワクチンとしてのワクシニアウイルスの導入から、多数のヒト病原体に対するワクチンが開発され、ルーチンに使用されている。今日、小痘は、ワクチン接種によって根絶され、同じことが、ポリオウイルスについてもまもなくであると予想されている。百日咳、ジフテリア、および強縮などのいくつかの幼児疾患は、ワクチン接種によって効果的に予防することができる。
一般に、最も成功したウイルス性ワクチンは、疾患を引き起こすウイルスの生の非病原性突然変異株である。このアプローチの成功の鍵は、生きているウイルスは同じ器官、同じ型および同じ数の細胞を標的とし、したがってレシピエントにおいて増殖することにより、疾患を引き起こすことなく、または軽症疾患を引き起こすだけで、長期持続免疫応答を誘発するという事実である。効力では、生の弱毒ワクチンは、免疫化のによる自身の性質である無症状感染を生じる。その結果、液性、細胞性、および生得的な免疫応答を含む完全な免疫応答が誘導され、病原体に対して持続性の、および時に生きている間中続く免疫の保護を提供する。
生の弱毒ワクチンが最も強力であるが、これらにより、有害な副作用が生じ得る。したがって、弱毒ウイルスワクチンは、毒性株に戻り得るし、または弱毒ウイルスが成体において病原性である場合は、これにより、なお乳児もしくは障害者に疾患が生じ得る。これは、1型および2型ヒト免疫不全ウイルスなどのウイルスが慢性感染を引き起こす場合に真性である。ウイルスおよび細菌のタンパク質から構成されるワクチンまたは免疫原性ペプチドは、不必要な副作用を生じる可能性は低いが、生ワクチンほど強力ではないと思われる。これは、特に、あるウイルスおよび細胞内細菌などの慢性感染を引き起こす微生物に対するワクチンの場合にある。
しかし、免疫応答の強さおよび型は、どのようにしてウイルスタンパク質がプロセシングされるか、並びにこれらがマクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞（APC）によってどのように免疫系に提示されるかについても依存する。タンパク質およびペプチド抗原は、エンドサイトーシスを経てAPCによって取り込まれ、エンドソーム経路を介して小さな免疫原性ペプチドにプロセシングされて、MHC（主組織適合性複合系）クラスII抗原［ヒトでは、HLA（ヒト白血球抗原）クラスII］によって、Tリンパ球（T細胞）に提示される。対照的に、APCにおいて、または免疫応答の標的の可能性のある細胞において新規に合成されたタンパク質は、細胞質経路を介してプロセシングされ、T細胞にMHCクラスI抗原（ヒトでは、HLAクラスI）によって提示されるであろう。一般に、クラスII経路を介した免疫原性ペプチドの提示は、ヘルパー/誘導因子T細胞の活性化を引き起こし、これは、B細胞の活性化および抗体反応を次々と引き起こすであろう。対照的に、クラスI MHCを介した提示は、細胞障害性Tリンパ球（CTL）の誘導に有利であり、これにより、ウイルス性感染細胞の認識および破壊が可能である。
1990年代の初めに、生の弱毒ワクチンによって通常達成される抗原プロセシングおよび提示を模倣する方法が導入された［Ul- mer, J. B. et al Science 259（1993）1745-1749］。環状DNA形態の真核生物発現ベクターの筋肉への注射が、筋細胞（おそらくその他のものも）によるこのDNAの取り込みを誘導し、対象となる遺伝子の発現を誘導することが可能であり、挿入された遺伝子によってコードされるタンパク質に対する免疫応答、特にCTLの形態の細胞免疫応答を上昇させることが示された。この観測から、DNA免疫化は、実験動物において外来タンパク質に免疫応答を誘導するための標準的な方法になり、およびいくつかのDNAワクチンによるヒトでの研究が、進行中である。
通常、これらのワクチン研究に使用されるDNAベクターは、対象となる遺伝子のためのクローニング部位、対象となる遺伝子の発現を推進するための、CMVウイルスの前初期プロモーターなどの強力なウイルスのプロモーター、ポリアデニル化領域、並びに抗生物質抵抗性遺伝子および細菌細胞におけるDNAベクター（プラスミド）の増幅のための細菌の複製開始点を含む。
上記したベクターにより、筋肉もしくは皮膚に粒子衝撃技術で直接注射することによって、または直接粘膜にベクター溶液を適用することによってのいずれかで、ベクターを実験動物にもしくはヒトに投与した後に、対象となる遺伝子を検出可能な発現レベルで得ることができる。しかし、これらのベクターによって得られる発現は、短命である。ベクターは、トランスフェクション細胞から少しずつ消滅する傾向があり、分裂細胞集団において娘細胞へ移動されない。対象となる遺伝子の発現が短期で標的細胞の数が限られていることが、上記したDNAベクターで免疫化された被験者において一時的な免疫応答だけが観察されることのおそらく主な理由である。したがって、たとえばBoyerらは、上記したものに類似するベクターを数回免疫化したヒト被験者において、HIV-1 EnvおよびRevタンパク質に対する一時的な免疫応答のみを観察した［Boyer, J. D., J Infect Dis 181 （2000）476-483］。
遺伝子治療およびDNAワクチン接種において有用な新規産物の開発に対する関心は増大している。たとえば、対象となる遺伝子のための発現カセットを有するパピローマウイルスベクターは、有用な候補物質であることが示唆された。
今日までに、ヒトパピローマウイルス（HPV）および多くの様々な動物パピローマウイルスの70を超えるサブタイプが同定されている［zur Hausen, H.およびde Villiers E., Annu Rev Microbiol 48（1994）427-447; Bernard, H.ら、Curr Top Microbiol Immunol 186（1994）33-54］。全てのパピローマウイルスは、同様のゲノム組織を共有し、また、全ての翻訳のオープンリーディングフレーム（ORF）の位置は、非常に保存されている。
パピローマウイルスは、体の様々な部位の皮膚または粘膜の扁平上皮細胞に感染して、良性腫瘍の形成を誘導し、これは、場合によっては悪性に進行し得る。パピローマウイルスゲノムは、感染細胞において、多コピー核プラスミドとして複製されて維持される。複製、エピソームの維持、後期遺伝子の発現、およびウイルス形成は、上皮組織の分化と密に関連しており、パピローマウイルスDNAエピソームの複製は、分化している上皮において、最初の増幅性の複製、および第二の（すなわち潜伏性）、および第三の（すなわち増殖型）複製の間に生じる［Howley, P. M.; Papillomavirinae: the viruses and their replication. Virology, Fields, B. C., Knipe, D. M., Howley, P. M.編, Lippincott Raven Publishers, Philadelphia, USA, 1996, 2. Edition, p. 2045-2076］。
E1およびE2オープンリーディングフレームによってコードされる2つのウイルス因子は、細胞においてパピローマウイルス起点からDNA複製の開始のために必要かつ十分であることが示された［Ustav, M.およびStenlund, A., EMBO J 10（1991）449-57; Ustav, M.ら、EMBO J 10（1991）4321-4329; Ustav, E.ら、Proc Natl Acad Sci USA 90（1993）898-902］。
DNA複製の開始のための機能的な起点は、BPV1 ［Ustav, M.ら、EMBO J 10（1991）4321-4329］, HPV1a ［Gopalakrishnan, V.およびKhan, S., 前記］, HPV11 ［Russell, J., Botchan, M., J Virol 69（1995）651-660］, HPV18 ［Sverdrup, F.およびKhan, S., J Virol 69（1995）1319-1323: Sverdrup, F.およびKhan, S., J Virol 68（1994）505-509］などにおいて定義されている。特徴的に、これら全ての起点断片は、高A/T含量であり、これらは、いくつかの重なり合う個々のE1タンパク質認識配列を含み、これらは、ともにE1結合部位を構成する ［Ustav, M.ら、EMBO J 10（1991）4321-4329; Holt, S.ら、J Virol 68（1994）1094-1102; Holt, S.およびWilson, V., J Virol 69（1995）6525-3652; Sedman, T.ら、J Virol 71（1997）2887-2996］。さらに、これらの機能的な起点断片はE2結合部位を含み、これは、ほとんどの場合インビボにおけるDNA複製の開始のために必須である（上記Ustav、E.ら）。E2タンパク質は、E1による起点認識の最初の工程を容易にする。起点に対して単量体E1が最初に結合した後、E1の多量体化が開始される。これは、ori融解活性を伴う複合体の形成を引き起こす。E2は、DNA合成開始の以下の段階に影響を有さないことが示唆されている ［Lusky, M.ら、Proc Natl Acad Sci USA 91（1994）8895-8899］。
BPV1 E2 ORFは、選択的プロモーター利用能および選択的mRNAスプライシング［Lambert, P.ら、Annu Rev Genet 22（1988）235-258］から生じる3つのタンパク質をコードする。これらのタンパク質の全ては、互いに、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成することができ、断続的な12bpのパリンドローム配列5'-ACCNNNNNNGGT-3'に特異的に結合することができる［Androphy, E.ら、Nature 325（1987）70-739］。
BPV1ゲノムには17個のE2結合部位があり、およびHPVゲノムには4個までの部位があり、これはウイルスDNA複製の開始において（Ustav, E.ら、前記）、およびウイルス遺伝子発現の調節において重大な役割を果たす（Howley, P. M., Papillomavirinae: the viruses and their replication, Virology, Fields, B. C., Knipe, D. M., Howley, P. M.編, Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1996. 2. edition, p. 2045-2076）。構造解析および変異解析により、全長サイズのE2タンパク質に3つの異なった機能ドメインが明らかとなった。N末端部分（残基1〜210）は、転写および複製のための活性化ドメインである。構造のないヒンジ領域（残基211〜324）、およびカルボキシ末端DNA結合二量体化ドメイン（残基325〜410）が続く［Dostatni, N.ら、EMBO J 7（1988）3807-3816; Haugen, T.ら、EMBO J 7（1988）4245-4253; McBride, A.ら、EMBO J 7（1988）533-539; McBride, A.ら、Proc Natl Acad Sci USA 86（1989）510-514］。X線結晶学的なデータに基づいて、E2のDNA結合二量体化ドメインは、二分子対称な8鎖の逆行性のβバレルの構造を有し、二つの同一の「半バレル」サブユニットを構成する「Hegde, R.ら、Nature 359（1992）505-512; Hegde, R., J Nucl Med 36 （6 Suppl）（1995）25S-27S］。変異解析［Abroi, A.ら、J Virol 70（1996）6169-6179; Brokaw, J.ら、J Virol 71（1996）23-29; Grossel, M.ら、J Virol 70（1996）7264-7269; Ferguson, M.およびBotchan, M., J Virol 70（1996）4193-4199］、およびX線結晶学［Harris, S.およびBotchan, M. R., Science 284（1999）1673-1677；Antson, A.ら、Nature 403 （2000）805-809］によって確認されたように、E2のトランスアクチベーションドメインの機能エレメントは、非常に高い構造的完全性を有する。さらに、X線結晶学では、E2タンパク質のN末端ドメインは、二量体構造を形成し、このうちのArg37が二量体形成に重要な機能を有することを示す（Antson, A.ら、前記）。
以前に記載したように、トランスのウシの1型パピローマウイルス E2タンパク質およびシスのその多数の結合部位は、エピソームの遺伝的エレメントのクロマチン付着のために必要かつ十分である。この現象は、分裂細胞におけるウイルス感染の間に、ウイルスゲノムを分割するための機構を提供することを示唆する［lives, l.ら、J Virol. 73（1999）4404-4412］。
これまでに開示されたパピローマベクターまたはその他のベクターのいずれも、最適なワクチンについて記載した判定基準および要求を満たさず、これはDNAワクチンについても、従来のワクチンについても同じである。（これらの要求は、ワクチンとしての用途に好ましいが、必然的ではない点に留意する必要がある。）まず、最適なワクチンは、防御免疫を最小の副作用で生じなければならない。したがって、ワクチンは、有毒であり、および／またはレシピエントに対して疾患症状を引き起こす成分が取り除かれているべきである。第二に、最適なワクチンは、病原体特異的な免疫応答を誘導しなければならない、すなわち、ワクチンのその他の成分に免疫応答が生じることなく、所望の病原体に強力でかつ測定可能な免疫応答を誘発しなければならない。これらの2つの要求は、DNAワクチンとして使用するためのベクターが、最適には所望の遺伝子のみを発現すべきであり、ベクターと宿主のゲノム間で相同的であるヌクレオチド配列は、宿主ゲノムへのベクターの組込みを生じる可能性があるので、最適には宿主において複製されず、またはレシピエントのものと相同的ないずれかの配列を含むべきではない。第三に、最適なワクチンは、免疫応答の正しい型を誘導しなければならない；すなわち、細胞内および細胞外の病原体に対して作用するために、液性のおよび細胞性の免疫応答を上昇させなければならない。最後に、最適のワクチンは、安定でなければならず、すなわち体内で十分に長い時間その効力を保持し、貯蔵および調製の間に種々の損害を与える環境で使用するためのワクチン製剤において免疫応答を上昇させなければならない。その上、ワクチンは適切な価格であるべきである。さらに、接種の経路および方法は、DNA免疫化を最適化するための重要な考慮点である。
DNAワクチンを開発するときに、所望の遺伝子の発現の安定性は、時に重大な課題である。したがって、レシピエント細胞におけるベクターの維持機能または持続性は、従来技術において、しばしば安全性を犠牲にして注目された。たとえば、Ohe, Yら［Hum Gene Ther 6（3）（1995）325-333］は、安定で、高レベルの遺伝子発現が可能なパピローマウイルスベクターを開示し、遺伝子治療における使用を示唆する。初期遺伝子E5、E6、およびE7を形質転換することは前記ベクターから除かれているが、これには、なおウイルスの複製に関与するE1およびE2遺伝子などのその他のパピローマウイルス遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。したがって、このベクターは、望まれない免疫応答を誘発する可能性があり、かつレシピエントへのベクターの組み込みのリスクを誘導するその他のいくつかのパピローマタンパク質を産生する。また、このベクターは、E1遺伝子を含むので複製可能である。その上、これはサイズが大きく、したがって、調製の際に細菌性の修飾に供される。
国際特許出願PCT/EE96/00004（国際公開公報第97/24451号）では、宿主細胞における長期維持が可能なベクター、並びにE1およびE2を発現する哺乳類宿主細胞において対象となる遺伝子産物の長期の産生を得るためにこのようなベクターを使用する方法を開示する。これらのベクターは、パピローマウイルスの最小の複製開始点（MO）、パピローマウイルスのミニ染色体維持エレメント（MME）、および前記遺伝子産物をコードする遺伝子と、天然のパピローマウイルス配列とは異なるDNA配列からなるMOおよびMMEと、並びに一部の態様ではE1遺伝子とを含む。その上、10個のE2結合部位から本質的になるMMEを含むベクターが、一部の実施例に開示される。これらのベクターは、発現のために宿主においてまたはベクターにおいて、E1タンパク質が存在することを必要とする。これが、ベクターに複製機能を与える。また、これらのベクターは、対象となる遺伝子、およびE2タンパク質の遺伝子に加えてE1タンパク質を発現し、かつウサギβ-グロビン配列などのヒト配列に対して部分的に相同的であり、ヒトゲノムへの組込みに重大な危険を生じ、DNAワクチンとしてこれらのベクターの能力を減少する、配列を含む。その上、このベクターは、これらの大きさ（約15kb）のために不安定である：細菌細胞において調製する段階で、細菌の複製機構が、ベクターのランダムスライシングによってベクターを修飾する傾向があり、これは、対象となる遺伝子を全く欠いた産物を含む不満足な発現産物を引き起こす。
国際特許出願PCT/EE96/00004（国際公開公報第97/24451号）では、E1およびE2は、ベクターにおけるエピソームの長期複製に必要な唯一のウイルスタンパク質であることをさらに開示する。その上、BPV1ゲノムの維持機能は、最小ori（MO）の存在と関連し、これは、細胞でのベクターの長期残存または安定維持のために必要であるが、十分でないことが述べられている。加えて、シスエレメント、すなわちBPV1のミニ染色体維持エレメントは、BPV1の安定な複製に必要であることが述べられている。特に、多量体のE2結合部位（E2BS）は、ベクターの安定な維持のために必要であることが述べられている。
DNAワクチンとして有用であるような改良された新規のベクターが明らかに必要である。
本発明の目的は、したがって、大量および多数の種々の宿主体の細胞において、長期の維持が可能な新規ベクターを提供することであり、これにより所望の抗原の安定な発現を提供することができる。
本発明のもう一つの目的は、元々のベクターを受け入れた細胞において長期間維持され、かつ有糸分裂細胞分裂後に、これを娘細胞へ移動する新規ベクターを提供することである。
さらに、本発明のもう一つの目的は、対象となる1つもしくは複数の遺伝子に加えて、好ましくはレシピエント細胞における長期維持に必要な遺伝子を発現し、したがって、有毒であり、またはレシピエントに疾患症状を引き起こす成分が取り除かれる新規ベクターを提供することである。
本発明のさらなる目的は、減弱された生のウイルスワクチンを、特にそれらの体内における増殖機能を模倣し、どのような考慮すべき疾患の徴候も誘導することなく、かつDNAワクチンとともに注射された宿主において副作用を誘導する可能性のある望まれないタンパク質を発現することのない新規ベクターを提供することである。
本発明のさらなる目的は、レシピエントにおいて複製されない新規ベクターを提供することである。
本発明のもう1つの目的は、DNAワクチンとして使用されるときに、液性のおよび細胞性の免疫応答を誘導する新規ベクターを提供することである。
さらに、本発明のもう一つの目的は、細菌細胞における大量産生に適している新規ベクターを提供することである。
さらに、本発明のもう一つの目的は、宿主特異的ではなく、したがって、種々の細菌細胞における産生を可能にする新規ベクターを提供することである。
本発明のさらなる目的は、対象となる1つまたは複数の遺伝子のためのキャリアベクターとして有用である新規ベクターを提供することである。
本発明のさらなる目的は、遺伝子治療において、および遺伝子治療物質として、およびインビボにおける高分子薬物の産生のために有用な、新規ベクターを提供することである。
3.本発明の概要
本発明は、対象となる1つもしくは複数の遺伝子のキャリアベクター、または最適なDNAワクチン接種ベクターの要求を満たし、好ましくは従来技術ベクターの欠点および副作用が取り除かれた新規ベクターを開示する。
本発明は、（i）核アンカータンパク質をコードするDNA配列の発現カセット、および（ii）多コピー数の前記核アンカータンパク質のための高親和性結合部位を有するベクター（プラスミド）が、増殖細胞において伝播するという驚くべき所見に基づく。その結果、ベクター保有細胞の数は、ベクターが複製されない場合でさえ増加する。ベクターが、付加的な対象となる1つまたは複数の遺伝子を有する場合に、対象となる1つもしくは複数の遺伝子を発現するこのような細胞の数は、ベクターの複製がない場合にも同様に増加する。したがって、本発明のベクターは、パピローマウイルス複製開始点を欠損している。好ましい態様において、本発明のベクターは、哺乳類細胞において機能する複製開始点を欠損している。
したがって、本発明は、DNAワクチン接種および遺伝子治療において、対象となる1つもしくは複数の遺伝子のキャリアベクターとして、および遺伝子治療物質として有用な新規ベクターを開示する。特定の態様において、前記ベクターは、伝播ができ、必要に応じて、長期間数が増えつつある細胞において対象となる1つもしくは複数の遺伝子を発現することができる。本発明のベクターは、好ましくは核アンカータンパク質のみ、および必要に応じて、対象となる1つもしくは複数の遺伝子、および任意で選択マーカーを発現する。しかし、これらは、好ましくは余分な、発癌性の形質転換するか、または潜在的に有毒な、どのような配列も欠いており、これにより、DNAワクチンとして使用するために以前に開示され、または示唆されたベクターの重大な欠点を、すなわちその他のウイルス成分に対する過敏性反応を回避する。本発明のある態様において、これは、細胞に低レベルで発現された核アンカータンパク質によって達成される。同時に、本発明のベクターは、液性のおよび細胞性の免疫応答を誘導し、ベクターには、対象となる1つまたは複数の遺伝子が含まれる。
本発明のベクターは、インビトロにおいて（たとえば、産生レベルにおいて）およびインビボにおいて（たとえば、ワクチン接種）の両方で使用するために有利である。
本発明は、添付の特許請求の範囲にて説明したように本発明の主題に関する。
本発明は：（a）異種プロモーターに機能的に連結された核アンカータンパク質またはその機能的相当物をコードするDNA配列であって、前記核アンカータンパク質が（i）特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメイン、および（ii）核構成要素に結合する機能的ドメインを含むDNA配列；ならびに（b）核アンカータンパク質のための結合部位を形成する多量体化DNA配列を含む発現ベクターであって、パピローマウイルス複製開始点を欠損する発現ベクターに関する。好ましい態様において、本発明のベクターは、哺乳類細胞において機能的な複製開始点を欠損する。
ある態様において、核構成要素は、有糸分裂のクロマチン、核マトリックス、核ドメイン10（ND10）、または核のドメインPODである。
ある特定の態様において、核アンカータンパク質は、クロマチンアンカータンパク質であり、前記機能的ドメインは、有糸分裂クロマチンと結合する。
ある態様において、核アンカータンパク質は、ヒンジ領域またはリンカー領域を含む。
ある態様において、核アンカータンパク質は、真核生物起源、原核生物起源、またはウイルス起源の天然のタンパク質である。ある特定の態様において、天然のタンパク質は、ウイルス起源のものである。
ある態様において、核アンカータンパク質は、真核生物起源の天然のタンパク質である。
ある態様において、核アンカータンパク質は、パピローマウイルスまたはエプスタイン・バーウイルスのものである。
特定の態様において、核アンカータンパク質は、ウシの1型パピローマウイルスのE2タンパク質またはエプスタイン・バーウイルス核抗原1である。
特定の態様において、核アンカータンパク質は、ウシの1型パピローマウイルスのE2タンパク質である。
特定の態様において、核アンカータンパク質は、高移動度タンパク質（High Mobility Group protein）である。
ある態様において、核アンカータンパク質は、非天然のタンパク質である。
ある態様において、核アンカータンパク質は、組換えタンパク質、融合タンパク質、または分子モデリング技術によって得られたタンパク質である。
特定の態様において、組換えタンパク質、融合タンパク質、または分子モデリング技術によって得られたタンパク質は、前記特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメインおよび核構成要素に結合する機能的ドメインの任意の組み合わせを含み、核構成要素に結合する前記機能的ドメインは、パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、または高移動度タンパク質のものである。
ある特定の態様において、組換えタンパク質、融合タンパク質、または分子モデリング技術によって得られたタンパク質は、前記特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメインおよび核構成要素に結合する機能的ドメインの任意の組み合わせを含み、核構成要素に結合する前記機能的ドメインは、ウシの1型パピローマウイルスのE2タンパク質、エプスタイン・バーウイルス核抗原1、または高移動度タンパク質のものである。
ある態様において、ベクターは、対象となるDNA配列の1つまたは複数の発現カセットをさらに含む。
ある態様において、対象となるDNA配列は、感染性病原体のものである。ある態様において、感染性病原体はウイルスである。ある特定の態様において、ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、C型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、およびエンテロウイルスからなる群より選択される。
ある態様において、対象となるDNA配列は細菌のものである。ある態様において、細菌は、クラミジア-トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、マイコバクテリウム-ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、およびマイコプラズマ-ニューモニエ（Mycoplasma pneumonia）からなる群より選択される。特定の態様において、細菌は、サルモネラ属（Salmonella）である。
ある態様において、対象となるDNA配列は、真菌病原体のものである。ある態様において、真菌病原体は、カンジダ・アルビカンス（Candida albigans）である。
ある態様において、対象となるDNA配列は、HIV起源のものである。
特定の態様において、対象となるDNA配列は、HIVの非構造調節タンパク質をコードする。さらに特定の態様において、HIVの非構造調節タンパク質は、Nef、Tat、および／またはRevである。特定の態様において、HIVの非構造調節タンパク質は、Nefである。
ある態様において、対象となるDNA配列は、HIVの構造タンパク質をコードする。特定の態様において、対象となるDNA配列は、HIVb gp 120/gp 160をコードする遺伝子である。
ある態様において、本発明のベクターは、Nef、Tat、および／またはRevをコードする対象となるDNA配列を含む第一の発現カセットと、Nef、Tat、および／またはRevをコードする対象となるDNA配列を含む第二の発現カセットとを含む。
ある態様において、本発明のベクターは、Nef、Tat、および／またはRevをコードする対象となるDNA配列を含む第一の発現カセットと、HIVの構造タンパク質をコードする対象となるDNA配列を含む第二の発現カセットとを含む。
ある態様において、対象となるDNA配列は、癌と関連したタンパク質をコードする。
ある態様において、対象となるDNA配列は、免疫成熟、免疫応答の調節、または自己免疫反応の調節と関連したタンパク質をコードする。特定の態様において、タンパク質は、APECEDである。
特定の態様において、対象となるDNA配列はAire遺伝子である。
ある態様において、対象となるDNA配列は、任意の遺伝性の単一遺伝子疾患において欠損があるタンパク質をコードする。
ある態様において、対象となるDNA配列は高分子薬物をコードする。
ある態様において、対象となるDNA配列はサイトカインをコードする。ある特定の態様において、サイトカインは、IL1、IL2、IL4、IL6、およびIL12からなる群より選択されるインターロイキンである。その他の特定の態様において、対象となるDNA配列は、インターフェロンをコードする。
ある態様において、対象となるDNA配列は、生物学的に活性なRNA分子をコードする。ある特定の態様において、生物学的に活性なRNA分子は、抑制性のアンチセンスおよびリボザイム分子からなる群より選択される。ある特定の態様において、抑制性のアンチセンスまたはリボザイム分子は、発癌遺伝子の機能に拮抗する。
本発明のベクターは、インビボにおいて治療的な高分子物質を産生するための使用に適している。
ある態様において、本発明は、薬物として使用するためのベクターを提供する。
ある態様において、本発明は、タンパク質もしくはペプチドの感染性物質、治療物質、高分子薬物、またはそれらの任意の組み合わせをコードする1つもしくは複数の遺伝子または1つもしくは複数のDNA配列のような、対象となる1つもしくは複数の遺伝子または1つもしくは複数のDNA配列のためのキャリアベクターとして使用するためのベクターを提供する。
ある特定の態様において、本発明は、遺伝性または後天性の遺伝子欠損を治療するための薬物として使用するためのベクターを提供する。
ある態様において、本発明は、感染性物質に対して治療的なDNAワクチンとして使用するためのベクターを提供する。
ある態様において、本発明は、治療物質として使用するためのベクターを提供する。
本発明は、さらに、被験者にタンパク質を提供する方法であって、被験者に本発明のベクターを投与する段階を含み、前記ベクターが（i）被験者に提供されるタンパク質をコードする第二のDNA配列をさらに含み、この第二のDNA配列は、機能的に第二のプロモーターに連結されており、（ii）ウシパピローマウイルスタンパク質E1をコードせず、ならびに前記被験者が、ウシパピローマウイルスタンパク質E1を発現しない方法に関する。
本発明は、さらに、被験者にタンパク質に対する免疫応答を誘導する方法であって、被験者に本発明のベクターを投与する段階を含み、前記ベクターが（i）前記タンパク質をコードする第二のDNA配列をさらに含み、この第二のDNA配列は、機能的に第二のプロモーターに連結されており、（ii）ウシパピローマウイルスタンパク質E1をコードせず、ならびに該前記被験者が、ウシパピローマウイルスタンパク質E1を発現しない方法に関する。
本発明は、さらに、感染症の治療を、治療を必要とする被験者に実施する方法であって、治療的に有効な量の本発明のベクターを前記被験者に投与する段階を含み、対象となるDNA配列は、感染性物質の免疫原性エピトープを含むタンパク質をコードする方法に関する。
本発明は、さらに、遺伝性または後天性の遺伝子欠損を、治療を必要とする被験者において治療する方法であって、治療的に有効な量の本発明のベクターを前記被験者に投与する段階を含み、対象となるDNA配列は、遺伝性または後天性の遺伝子欠損によって影響を受けるタンパク質をコードする方法に関する。
本発明は、さらに、被験者においてDNA配列を発現させる方法であって、前記被験者に本発明のベクターを投与する段階を含む方法に関する。
本発明は、さらに、被験者においてDNA配列を発現させるため、遺伝性または後天性の遺伝子欠損を治療するため、感染症を治療するため、タンパク質に対する免疫応答を誘導するため、および被験者にタンパク質を提供するための方法に関し、本発明のベクターはウシパピローマウイルスタンパク質E1をコードせず、および前記被験者はウシパピローマウイルスタンパク質E1を発現しない。
ある態様において、本発明のベクターは、細胞または生物における対象となるDNA配列によってコードされるタンパク質の産生のために使用される。
本発明は、さらに請求項1、2、または17記載のベクターの調製のための方法であって：（a）前記ベクターを含む宿主細胞を培養する段階、および（b）ベクターを回収する段階を含む方法を提供する。特定の態様において、本発明のベクターを調製するための方法は、段階（a）の前に、前記宿主細胞を前記ベクターで形質転換する段階をさらに含む。ある特定の態様において、宿主細胞は、原核細胞である。特定の態様において、宿主細胞は大腸菌である。
本発明は、さらに、本発明のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞に関する。ある態様において、宿主細胞は、細菌細胞である。その他の態様において、宿主細胞は哺乳類細胞である。
本発明は、さらに、本発明のベクターを含むキャリアベクターに関する。
本発明は、さらに、本発明のベクターおよび適切な薬学的媒体を含む薬学的組成物に関する。
本発明は、さらに、本発明のベクターを含むDNAワクチンに関する。
本発明は、さらに、本発明のベクターを含む遺伝子治療物質に関する。
本発明は、さらにDNAワクチンの調製のための方法であって、前記方法は、適切な薬学的媒体と本発明のベクターを組み合わせることを含む方法に関する。
本発明は、遺伝子治療に使用するための薬剤を調製する方法であって、前記方法は、適切な薬学的媒体と本発明のベクターを組み合わせることを含む方法に関する。
5.発明の詳細な説明
5.1本発明のベクター
本発明は、（A）（i）特定のDNA配列および（ii）適切な核構成要素の両者に結合する核アンカータンパク質遺伝子の発現カセットと、（B）前記核アンカータンパク質のための多量体化されたDNA結合配列を有する発現ベクターが、増殖している細胞群において伝播することができるという予想外の所見に基づく。このような核アンカータンパク質は、ウシの1型パピローマウイルスのE2タンパク質（BPV1E2；配列番号：50）などのクロマチンアンカータンパク質を含むが、これらに限定されない。DNA結合配列は、多量体化されたE2結合部位であり得るが、これらに限定されない。従来技術に基づいて、たとえばパピローマウイルスの分離／分割する機能が別々に発現され得ること、およびこのような分離／分割する機能をワクチンベクターに付加することが増殖している細胞群におけるベクターの分配を保証するであろうことは、予想することができない。その上、従来技術似基づいて、複製開始点が独立して作用する機能的ベクターを構築できることは、予想することができなかった。
本発明において使用される「核アンカータンパク質」という用語は、特定のDNA配列に結合して、ベクターに核区画化機能を提供することができるタンパク質、すなわち、特定の核区画にベクターを固着または付着することができるタンパクをいう。本発明のある態様において、核アンカータンパク質は、天然のタンパク質である。このような核区画の例は、有糸分裂クロマチンまたは有糸分裂染色体、核マトリックス、ND10様核ドメイン、およびPODなどである。核アンカータンパク質の例は、ウシの1型パピローマウイルス（BPV1）E2タンパク質、EBNA1（エプスタイン・バーウイルス核抗原1；配列番号：52）、および高移動度（HMG）タンパク質などである。本発明において使用される「核アンカータンパク質の機能的な相当物」という用語は、核アンカータンパク質の性質を有する天然のまたは非天然の起源のタンパク質またはポリペプチドをいう。
本発明のその他の態様において、本発明の核アンカータンパク質は、組換えタンパク質である。本発明のある特定の態様において、核アンカータンパク質は、融合タンパク質、キメラタンパク質、または分子的モデリングによって得られるタンパク質である。融合タンパク質または本発明と関連した分子的モデリングによって得られるタンパク質は、これが核構成要素に結合する機能により、およびこれがDNAに配列特異的に結合する機能により、特徴づけられる。本発明の好ましい態様おいて、このような融合タンパク質は、本発明のベクターによってコードされ、これは、融合/キメラタンパク質が結合する配列に特異的なDNA配列も含む。核構成要素は、クロマチン、核マトリックス、ND10ドメイン、およびPODを含むが、これらに限定されない。宿主細胞に内因性の遺伝子の発現と干渉するリスクを減少させるために、DNA結合ドメインおよび対応するDNA配列は、好ましくは宿主細胞/宿主生物に対して非内在性である。このようなドメインは、ウシの1型パピローマウイルス（BPV1）E2タンパク質のDNA結合ドメイン（配列番号：50）、エプスタイン・バーウイルス核抗原1（EBNA1；配列番号：52）、および高移動度（HMG）タンパク質（HMGボックス）を含むが、これらに限定されない。
本発明のベクターは、タンパク質（ペプチドまたはポリペプチドを含む）、たとえば免疫原または治療薬をコードする「対象となるDNA配列」をさらに含み得る。本発明のある態様において、対象となるDNA配列は、生物学的に活性なRNA分子（たとえばアンチセンスRNA分子またはリボザイム）をコードする。
核アンカータンパク質の遺伝子および前記核アンカータンパク質のための多量体化された結合部位の発現カセットを有する本発明の発現ベクターは、増殖する宿主細胞群において伝播する。これは、高コピー数のベクターまたはプラスミドが標的細胞に送達され、核アンカータンパク質およびその多量体化された結合部位の分離/分割機能の使用により、細胞分裂の際の娘細胞へのベクターの分配を保証することを意味する。
本発明のベクターは、パピローマウイルスの複製開始点を欠損する。さらに、好ましい態様において、本発明のベクターは、哺乳類細胞において機能的な複製開始点を欠損する。パピローマウイルス複製開始点または哺乳類複製開始点の欠損は、いくつかの理由において従来技術のベクターを超える改善を構成する。（1）複製開始点の欠損は、従来技術ベクターと比較して本発明のベクターの大きさを減少させる。このような大きさの減少は、ベクターの安定性を増大させ、宿主細胞による取込みを容易にする。（2）複製開始点の欠損は、宿主細胞ゲノムとの組換えの危険性を減少させ、これにより不要な副作用の危険性が減少する。（3）複製開始点の欠損により、単にベクターの投与量を調整することによって用量を制御することができる。対照的に、機能的な複製開始点があると、必要な用量を決定するときに、ベクターの複製を考慮にいれなければならない。（4）ベクターが宿主生物に継続して投与されない場合、複製開始点の欠損により、宿主生物は、ベクター自体を除くことができ、したがって、宿主生物に発現されるDNA配列のレベルにわたってより高い制御が提供される。さらに、治療の間にのみベクターの存在が必要であるが、健康な個体には望ましくない場合、生物がベクター自体を除去する能力は有利である。
本発明のベクターにおいて有用な核アンカータンパク質の遺伝子は、組換えタンパク質、融合タンパク質、または分子のモデリング技術によって得られたタンパク質などの、必要な特性を有する天然のまたは人工のタンパク質をコードする任意の適切なDNA配列であることができる。したがって、特定のDNA配列に結合することができるDNA結合ドメインおよび核構成要素に結合することができる機能的ドメインを含む天然の核アンカータンパク質の遺伝子は、ウシパピローマウイルスのE2タンパク質またはエプスタイン・バーウイルスのEBNA1（エプスタイン・バーウイルス核抗原1）などのウイルスタンパク質、高移動度（HMG）タンパク質もしくは同種のタンパク質のうちの1つなどの真核タンパク質、または原核タンパク質のものであり得る。または、特定のDNA配列に結合することができるDNA結合ドメインおよび核構成要素に結合することができる機能的ドメインを含む核アンカータンパク質の遺伝子は、有糸分裂染色体、核マトリックス、またはND10もしくはPODに似た核ドメインなどの適切な核構造に結合する能力を有する細胞タンパク質由来のドメインをコードするDNA配列も含まれ得る。
または、組換えタンパク質もしくは融合タンパク質もしくは分子的モデリングによって得られるタンパク質などの非天然のまたは人工のタンパク質をコードするDNA配列は、たとえばBPV1のE2タンパク質のDNA結合ドメインなどのパピローマウイルス特定のDNA配列に結合することができるDNA結合ドメインを含むが、核アンカータンパク質の、たとえばE2タンパク質のもののN末端が、同様の能力の任意の適切なタンパク質ドメインで、たとえばエプスタイン・バーウイルス核抗原1配列のN末端ドメインで置換されたDNA配列を使用することができる。同様に、組換えタンパク質または融合タンパク質をコードするDNA配列は、核構成要素に結合することができる機能的ドメイン、たとえばBPV1のE2タンパク質などのパピローマウイルスのN末端の機能的ドメインを含むが、核アンカータンパク質の、たとえばE2タンパク質のもののC末端のDNA結合二量体化ドメインが、十分なDNA結合強度の任意のタンパク質のドメイン、たとえばBPV-1 E2タンパク質およびEBNA-1のDNA結合ドメインで置換されたDNA配列を使用することもできる。
本発明の好ましい態様において、核アンカータンパク質は、DNA結合ドメインを含むクロマチンアンカータンパク質であり、これは、特定のDNA配列、および有糸分裂クロマチンに結合することができる機能的ドメインに結合する。このようなクロマチンアンカータンパク質および本発明において有用なその多量体化された結合部位の好ましい例は、ウシの1型パピローマウイルスのE2タンパク質および結合部位が多量体化されたE2タンパク質である。E2の場合、伝播機能の機構は、E2タンパク質の二つの機能：タンパク質のN末端ドメインを介した、有糸分裂染色体に結合するE2タンパク質の能力、および有糸分裂染色体に対する多量体化されたE2結合部位を含むベクターを鎖でつなぐことを保証するE2タンパク質のC末端ドメインの配列特異的結合能による。したがって、分離/分割機能は、ベクターに提供される。
もう一つの本発明の好ましい態様において、クロマチンアンカータンパク質の遺伝子の発現カセットは、BPV1のE2に類似した性質、すなわち、1つのドメインを介して有糸分裂クロマチンに結合し、およびもう一つのドメインを介してこのDNA結合ドメインに特異的な多量体化された結合部位に協同的に結合するDNA能力を有する細胞の、ウイルスの、または組換え起源の、いずれの適切なタンパク質の遺伝子をも含む。
特定の態様において、BPV1から得られた配列は、本発明のベクターに使用され、これにより、BPV1からのちょうど2つのエレメントを含むためのサイズを大幅に短くする。第一に、これらは、異種の真核生物プロモーターから転写され、異種のポリアデニル化部位でポリアデニル化されるE2タンパク質コード配列を含む。第二に、これらは、クラスターとしてベクターに組み込まれたE2タンパク質の多数の結合部位を含み、この部位は、頭-尾部構造とすることもでき、または間隔を置いた位置でベクターに含まれることもできる。これらの両エレメントは、ベクターが増殖する細胞において伝播するための機能に必要であり、驚くべきことに十分である。同様に、その他の適切な供与源に基づいたDNA配列を本発明のベクターに使用するときに、同じ成分が適用される。
本発明によれば、BPV1 E2様のクロマチンアンカータンパク質の遺伝子の発現カセットなどの、特定のDNA配列に結合することができるDNA結合ドメインおよび核構成要素に結合することができる機能的ドメインを含む核アンカータンパク質の遺伝子の発現カセットは、異種の真核生物プロモーター、クロマチンアンカータンパク質をコードする配列、たとえばBPV1 E2タンパク質コード配列などの核アンカータンパク質をコードする配列、およびポリA部位を含む。核アンカータンパク質の発現を制御する種々の異種の真核生物プロモーターを使用することができる。このような異種の真核生物プロモーターのヌクレオチド配列は、公知技術であり、容易に利用できる。このような異種の真核生物プロモーターは、異なる強さおよび組織特異性がある。好ましい態様において、核アンカータンパク質は、低レベルで発現される。
多量体化されたDNA配列、すなわち本発明の環境において定義された多量体結合部位を含むDNA配列は、二量体化DNA結合ドメインが結合する領域である。本発明のベクターの多量体化されたDNA結合配列は、上記の要求を果たすと仮定するならば、いずれの適切なDNA結合部位を含むこともできる。
好ましい態様において、本発明のベクターの結合配列多量体化されたDNAは、六量体またはより多いオリゴマーとして、八量体またはより多いオリゴマーとして、十量体またはより多いオリゴマーとして、既知の17の異なる親和性E2結合部位のいずれか1つを含み得る。また、異なったE2結合部位を含むオリゴマーも適用できる。本発明のベクターにおいて有用な特に好ましいE2結合部位は、BPV1高親和性部位9および10であり、親和性部位9が最も好ましい。より多いオリゴマーを考慮する場合、その大きさは、構築環境によってのみ限定され、6〜30の同一の結合部位を含んでいてもよい。本発明の好ましいベクターは、10のBPV-1 E2結合部位9を直列に含む。多量体化されたDNA結合配列が、異なったE2結合部位を含む場合、これらのサイズおよび成分は、構築を行う方法によってのみ制限される。したがって、これらは、一連の6〜30、最も好ましくは10のE2結合部位に結合された2つまたはそれ以上の異なるE2結合部位を含んでもよい。ウシの1型パピローマウイルスゲノム（配列番号：49）は、17のE2タンパク質結合部位を含み、これは、その親和性においてE2と異なる。E2結合部位は、Liら［Genes Dev 3（4）（1989）510-526］に記載されており、これは、参照として全体が本明細書に組み入れられる。
または、多量体化されたDNA結合配列は、EBNA1または適切なHMGタンパク質のものなどの、タンパク質の協同的結合をプラスミドに誘導することことができるどのような適切な多量体特異的配列から構成されてもよい。EBNA-1の結合部位における21×30bp繰り返しは、エプスタイン・バーウイルスゲノム（配列番号：51）のヌクレオチド位置7421〜ヌクレオチド位置8042にわたる領域に局在する。これらのEBNA-1結合部位は、以下の文献において記載されている：Rawlinsら、Cell 42 （3）（1985）859-868; Reismanら、Mol Cell Biol 5（8）（1985）1822-1832；ならびにLuptonおよびLevine, Mol Cell Biol 5（10）（1985）2533-2542。これらの3文献は全て、参照として全体が本明細書に組み入れられる。
DNA結合二量体化ドメインのための発現カセットに関して、多量体化されたDNA結合配列の位置は、重要ではなく、プラスミドのどの位置でもあり得る。したがって、多量体化されたDNA結合配列は、対象となる遺伝子のための発現カセットに関して下流にまたは上流のいずれに位置することもでき、対象となる遺伝子のプロモーターに近接した位置に配置されることが好ましい。
また、本発明のベクターは、必要に応じて、対象となる1つもしくは複数の遺伝子またはDNA配列の転写のための適切なプロモーター、さらなる調節配列、ポリアデニル化配列、およびイントロンを含む。好ましくは、ベクターは、選択マーカーのための細菌のプラスミド複製開始点、および細菌宿主におけるベクターの調製を容易にするための選択マーカーの1つまたは複数の遺伝子、および抗生物質選択のための遺伝子を発現するのに適したプロモーターを含んでいてもよい。
選択マーカーは、カナマイシンまたはネオマイシンなどの、DNAワクチンにおいて許容される任意の適切なマーカーでありうる。さらに、必要に応じて、その他の正および負の選択マーカーが本発明のベクターに含まれてもよい。
本発明のベクターは、長期維持のために必要かつ十分なDNA配列、たとえばBPV1 DNA配列を含むのみである。発癌性の配列などの副作用を誘導する可能性のある余分な配列の全てを除去した。したがって、本発明の好ましいベクターにおいて、E2コード配列は、変異解析によって修飾されており、その結果E2タンパク質のみを発現し、オーバーラップするE3、E4、およびE5配列は、E3、E4、およびE5のオープンリーディングフレームからの翻訳を不活性化する変異の導入により、不活性化されている。本発明のベクターは、パピローマウイルス複製開始点を含まない。好ましくは、本発明のベクターは、さらに哺乳類細胞または哺乳類において機能する複製開始点を含まない。
さらに、E2タンパク質などの核アンカータンパク質の発現は、非天然のまたは異種のプロモーターによって制御されるので、本発明のベクターは、宿主特異的ではない。選択した特定のプロモーターに依存して、これらのプロモーターは、広範な哺乳類細胞において機能してもよく、またはこれらは、細胞もしくは組織特異的であることもできる。E2タンパク質のためなどの、本発明のベクターにおいて有用である核アンカータンパク質のためのプロモーターの例は、チミジンキナーゼプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスLTRなどである。対象となる遺伝子の発現のために好ましいプロモーターは、対象となる遺伝子の高レベルの発現を保証する強力なプロモーターであり、このようなプロモーターの例は、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターである。
5.2対象となるDNA配列の発現のための媒体としての本発明のベクター
本発明のベクターを経て発現される1つもしくは複数の遺伝子または1つもしくは複数のDNA配列は、その発現が望まれるどのような対象となるDNA配列であることもできる。したがって、ベクターは、生の弱毒ワクチンもしくは不活化ワクチンを調製することができないかまたは使用することができないものに対し、ウイルスなどの感染性の微生物の病原体の1つもしくは複数の遺伝子または1つもしくは複数のDNA配列を含んでいてもよい。対象となるこのようなDNA配列は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、C型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、エンテロウイルスなどのウイルス；クラミジア-トラコマチス、マイコバクテリウム-ツベルクローシス、およびマイコプラズマ-ニューモニエなどの細胞内細菌のもの；サルモネラ属などの細胞外細菌；またはカンジダ・アルビカンスなどの真菌に由来する遺伝子またはDNA配列を含む。
本発明の好ましい態様において、ベクターは、HIVの初期調節タンパク質をコードする遺伝子、すなわち、非構造調節タンパク質Nef、Tat、またはRev、好ましくはNefを含む。一つの本発明の好ましい態様において、本発明のベクターは、HIVの構造タンパク質をコードする遺伝子を含む。もう一つの好ましい態様において、本発明のベクターは、初期調節タンパク質および／またはHIVの構造タンパク質の任意の組み合わせをコードする2つ以上の遺伝子を含む。このような組み合わせの例は、Nefタンパク質をコードする遺伝子とTatタンパク質をコードするDNA配列の組み合わせであり、おそらくHIVのgp120/gp160外層膜糖タンパク質をコードするDNA配列と共に、または人工の組換えタンパク質に組み込まれた病原体のタンパク質の免疫原性エピトープのいずれかの組み合わせである。
または、本発明のベクターは、チロシナーゼAコード配列またはβ-カテニンのコード配列のようなメラノーマのための分化抗原配列などの、遺伝性または後天性の遺伝子欠損についての遺伝子またはDNA配列を含んでいてもよい。
本発明の好ましい態様において、ベクターは、癌またはその他の変異疾患、好ましくはAPECED遺伝子などの、免疫の成熟並びに自己および非自己に対する免疫応答の調節に関連した疾患に関するタンパク質をコードする遺伝子を含む。
もう一つの本発明の好ましい態様において、ベクターは、任意の遺伝性の単一遺伝子遺伝子疾患に欠損があるタンパク質をコードする任意のDNA配列を含む。
もう一つの本発明の好ましい態様において、ベクターは、インビボにおいて送達されかつ産生されるような高分子薬物をコードする任意のDNA配列コーディングを含む。
本発明のベクターを調製するための本発明の方法は、（A）本発明のベクターを含む宿主細胞を培養する段階、および（B）ベクターを回収する段階を含む。ある特定の態様において、段階（A）は、宿主細胞を本発明のベクターで形質転換した後に行われる。
本発明のベクターは、大腸菌などの適切な細菌性の宿主細胞において好ましくは増幅される。本発明のベクターは、細菌細胞において安定して高コピー数で複製される。本発明のベクターが細菌の宿主細胞において増幅される場合、本発明のベクターは、細菌の複製開始点を含む。細菌の複製開始点のヌクレオチド配列は、当業者に周知であり、容易に得ることができる。
高コピー数で哺乳類宿主にトランスフェクションする際に、ベクターは、細胞分裂と共に伝播され、ベクターを有する細胞数は、ベクターの複製を伴わずに増加し、それぞれの細胞は、対象となるタンパク質を発現することができる。
本発明のベクターは、所望のタンパク質の高発現を生じる。たとえば、実施例4、7〜10において示したとおり、HIVのNefタンパク質、緑色蛍光タンパク質（EGFP）、およびAIREタンパク質の高発現が、多くの異なった細胞株において示されるであろうし、陽性細胞の数だけでなく対象となる遺伝子によってコードされるタンパク質の量をも次第に増加することがデータにより示される。
また、実施例9および実施例10において示したとおり、本発明のベクターは、液性および細胞性の応答を誘導する。結果は、本発明のベクターがDNAワクチンとして効果的に使用することができることを示す。
本発明のワクチンは、適切な薬学的キャリア中に、本発明のベクターまたは前記ベクターの混合液を含む。ワクチンは、たとえばHIVの3つの異なる調節タンパク質および／またはHIVの構造タンパク質の遺伝子を含むベクターの混合物を含んでいてもよい。
本発明のワクチンは、投与の従来の任意の経路、すなわち筋肉内、皮内などに投与するためのワクチンを製造するためのワクチン製剤の標準的な方法を使用して、製剤化される。
本発明のベクターは、体内で免疫応答を活性化するために、ISS刺激配列を含んでもよい。
本発明のワクチンは、従来の予防的な方法を使用して個体を感染から保護することができ、または本発明のワクチンは、治療的ワクチンとして、特にウイルス感染の場合に、従来の薬物投与と共に使用することができる。
上記したように、宿主細胞における伝播の機構を有する本発明のベクターは、ワクチンとして、遺伝子治療において、遺伝子導入において、および治療的な免疫原として多数の適用が見いだされた。本発明のベクターは、正常遺伝子を遺伝子欠損を有する宿主に送達するために使用することができ、したがって遺伝病が治癒または治療される。さらに、ベクターは、微生物または癌に対するワクチンの開発に使用するために、微生物に由来するものなどの外来起源または自己の腫瘍抗原の免疫原性タンパク質の遺伝子を送達することができる。さらに、本発明のベクターは、細胞の機能の研究において、または診断において使用するために、マーカー物質の適切な遺伝子を核に送達することができる。最後に、本発明のベクターは、高分子薬物の遺伝子を核に特異的に送達するために使用することができ、したがって、作用部位である細胞核に薬剤を発現することが重要な疾患を治療および治癒するための、新たな治療原理を開発することができる。これらの薬剤は、治療的なもしくは治癒的な効果を有する任意のタンパク質またはポリペチドなどの化学的な巨大分子であることができ、これは、複製もしくは転写、または細胞核への、および核からの物質の運搬などの核の機構のいずれかに干渉する。
特に、本発明のベクターは、外来の抗原に対して生物の特定の免疫応答（免疫療法）を調整すること、または変異した自己抗原に対する免疫系の活性のブーストを目的として、特定のサイトカイン、インターロイキン類（IL1、IL2、IL4、IL6、IL12など）またはインターフェロンなどを発現させるために使用することができる。また、本発明のベクターは、チロシン水酸化酵素のようなドーパミンの合成に関与する遺伝子を発現すること、並びに同様の効果を有するその他の遺伝子を欠失することにより、パーキンソン病の原因である神経変性を引き起こす特定のドーパミン作動性のニューロンの損失による脳の機能不全を補完するために有用である。また、本発明のベクターは、脳活性を調節するタンパク質およびペプチド、ドーパミン受容体様のCCK-AおよびCCK-B受容体、並びに神経栄養因子様のGDNF、BDNFなどの脳活性を調節するタンパク質の発現のために有用である。さらに、本発明のベクターは、生物におけるそれぞれの欠失を補完する目的で、肝細胞におけるファクターIXおよび筋細胞におけるα1-抗トリプシンの長期発現のために有用である。
5.3標的疾患および疾患
ある態様において、本発明のベクターは、ワクチンとして使用される。ある態様において、本発明のベクターは、タンパク質またはペプチドをコードする対象となるDNA配列を含む。このようなベクターを被験者に投与する際に、対象となるDNA配列によってコードされるタンパク質またはペプチドは、発現され、対象となるDNA配列によってコードされるタンパク質またはペプチドに特異的な免疫応答特性を刺激する。
特定の態様において、本発明のベクターは、感染症および／または感染性物質によって引き起こされる状態を治療および／または予防するために使用される。このような疾患および状態は、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、蠕虫などによって引き起こされる感染症を含むが、これらに限定されない。本発明のより特定の態様において、感染症は、後天性免疫不全症候群である。
好ましくは、ウイルス疾患を治療または予防することが望まれる場合、既知のウイルスのエピトープを含む分子をコードするDNA配列が使用される。たとえば、抗原エピトープをコードするこのようなDNA配列は、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、I型単純ヘルペス（HSV-I）、II型単純ヘルペス（HSV-II）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（echinovirus）、アルボウイルス、ハンタウイルス（huntavirus）、コクサッキーウイルス、おたふくかぜウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルス型I（HIV-I）、およびヒトII型免疫不全ウイルス（HIV-II）を含むウイルスから調製されてもよいが、これらに限定されない。
好ましくは、原生動物感染症を治療または予防することが望まれる場合、既知の原生動物エピトープを含む分子をコードするDNA配列が使用される。たとえば、抗原エピトープをコードするこのようなDNA配列は、マイコバクテリアリケッチア（mycobacteria rickettsia）、マイコプラズマ（mycoplasma）、ナイセリア（neisseria）、およびレジオネラ（legionella）を含む細菌から調製されてもよいが、これらに限定されない。
好ましくは、原虫感染を治療または予防することが望まれる場合、既知の原生動物のエピトープを含む分子をコードするDNA配列が使用される。たとえば、抗原エピトープをコードするこのようなDNA配列は、ライシェマニア（leishmania）、コクジディオ（kokzidioa）、およびトリパノソーマ（trypanosoma）を含む原生動物から調製されてもよいが、これらに限定されない。
好ましくは、寄生虫感染症を治療または予防することが望まれる場合、既知の寄生生物のエピトープを含む分子をコードするDNA配列が使用される。たとえば、抗原エピトープをコードするこのようなDNA配列は、クラミジアおよびリケッチアを含む寄生生物から調製されてもよいが、これらに限定されない。
その他の特定の態様において、本発明のベクターは、被験者における腫瘍疾患を治療および／または予防するために使用される。これらの態様において、対象となるDNA配列は、腫瘍疾患に特異的または主要疾患に関連したタンパク質またはペプチドをコードする。非限定的な例として、腫瘍疾患は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌腫、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆道癌、絨毛膜癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、睾丸腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、たとえば急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単核球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）；ならびに真性多血症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖病などであり得る。
本発明のその他の態様において、対象となるDNA配列は、タンパク質をコードする遺伝子における遺伝性疾患もしくは後天性の変異のために機能しないか、または機能不全のタンパク質をコードする。このような遺伝病は、代謝病、たとえばアテローム性動脈硬化（影響を受ける遺伝子：APOE）；癌、たとえば家族性腺腫様のポリポーシス大腸菌（影響を受ける遺伝子：APC遺伝子）；自己免疫疾患、たとえば自己免疫性の多腺性内分泌障害-カンジダ症外胚葉性異形成症（影響を受ける遺伝子：APECED）；筋肉の疾患、たとえばデュシェンヌ筋ジストロフィーワクチン（影響を受ける遺伝子：DMD）；神経系の疾患、たとえばアルツハイマー病（影響を受ける遺伝子：PS1およびPS2）を含むが、これらに限定されない。
その他の態様においても、本発明のベクターは、タンパク質の病理学的な高活性によって引き起こされる病気および疾患を治療および／または予防するために使用される。本発明のこれらの態様において、対象となるDNA配列は、過敏性のタンパク質のアンタゴニストをコードする。このようなアンタゴニストは、アンチセンスRNA分子、リボザイム、抗体、およびドミナントネガティブなタンパク質を含むが、これらに限定されない。本発明の特定の態様において、対象となるDNA配列は、癌遺伝子の阻害剤をコードする。
ある態様において、対象となるDNA配列は、腫瘍発育増殖に拮抗する分子をコードする。本発明の特定の態様において、対象となるDNA配列は、たとえば腫瘍抑制因子p53をコードするが、限定されない。その他の特定の態様において、対象となるDNA配列は、アポトーシスの活性化因子カスパーゼをコードするが、限定されない。
本発明は、対象となるDNA配列が被験者において発現される方法を提供する。ある態様において、対象となるDNA配列の1つまたは複数の発現カセットを含むベクターが、被験者に投与されるが、被験者には、ウシパピローマウイルスE1タンパク質が発現しない。
5.4本発明と共に使用するための治療的な方法
5.4.1組換えDNA
本発明の種々の態様において、本発明のベクターは、対象となるDNA配列を含む1つまたは複数の発現カセットを含む。対象となるDNA配列は、タンパク質および／または生物学的に活性なRNA分子をコードし得る。いずれにせよ、DNA配列は、組換え細胞にまたは遺伝子治療の場合には宿主細胞に発現するために、本発明のベクターに挿入される。
本明細書において使用されるものとして、発現カセットとは、適切な宿主細胞において本発明のタンパク質の発現を可能にする1つまたは複数の調節領域またはエンハンサー/プロモーター配列に機能的に連結された対象となるDNA配列をいう。「機能的に連結された」とは、発現される調節領域およびDNA配列が、転写、およびタンパク質の場合は翻訳可能な方法で連結されて配置されている結合をいう。
対象となるDNA配列の転写に必要な調節領域は、本発明のベクターによって提供することができる。適合した宿主構築物系において、RNAポリメラーゼなどの細胞の転写因子は、ベクターの調節領域に結合して、宿主生物における対象となるDNA配列の転写に影響を及ぼすと思われる。遺伝子の発現に必要とされる調節領域の正確な性質は、宿主細胞間で異なると考えられる。一般に、プロモーターは、RNAポリメラーゼを結合して機能的に結合されたDNA配列の転写を促進できることが必要である。このような調節領域は、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列などの、転写および翻訳の開始に関する5'-非コード配列のものを含んでいてもよい。コード配列に対して、3'の非コード領域は、ターミネーターおよびポリアデニル化部位などの転写終結調節配列を含んでいてもよい。
構成的および誘導性の調節領域は、対象となるDNA配列の発現のために使用してもよい。宿主細胞の増殖に最適な条件および対象となるDNA配列の高レベルの発現のための条件が異なる場合、誘導性のプロモーターを使用することが望ましいであろう。有用な調節領域の例は、以下で提供される（節5.4.4）。
プロモーターなどの調節機能を有するDNA配列を対象のDNA配列に結合するために、またはベクターのクローニング部位に対象となるDNA配列を挿入するために、適切な適合性を持つ制限部位を提供するリンカーまたはアダプターを、当業者に周知の技術によってcDNAの末端にライゲーションしてもよい［Wuら、Methods in Enzymol 152（1987）343349］。制限酵素で切断した後、ライゲーションの前に一本鎖DNA末端を消化して戻すか、埋めることによってブラントエンドを作製するような改変を行うこともできる。または、所望の制限酵素部位を含むプライマでのPCRを使用してDNAを増幅することにより、所望の制限酵素部位をDNA断片に導入することができる。
調節領域（エンハンサー/プロモーター配列）に、機能的に連結された対象となるDNA配列を含むベクターは、さらにクローニングすることなく、対象となるDNA配列の発現のための適切な宿主細胞に直接導入することができる。
哺乳類宿主細胞において対象となるDNA配列を発現するために、様々な調節領域、SV40早期および後期型プロモーター、サイトメガロウイルス前初期（CMV）プロモーター、並びにラウス肉腫ウイルス末端反復配列（RSV-LTR）プロモーターを使用することができる。哺乳類細胞において有用でありうる誘導性のプロモーターは、メタロチオネインII遺伝子、マウス乳癌ウイルスグルココルチコイド応答性末端反復配列（MMTV-LTR）、β-インターフェロン遺伝子、およびhsp70遺伝子に関するものでもよいが、これらに限定されない［Williamsら、Cancer Res. 49（1989）2735-42; Taylorら、Mol. Cell Biol., 10（1990）165-75］。組換え宿主細胞において対象となるDNA配列を発現させるために、熱ショックプロモーターまたはストレスプロモーターを使用することは、有利であると考えられる。
さらに、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を初めに単離、同定、またはトラッキングするための選択可能な、またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含んでいてもよい。多くの選択系を哺乳類細胞のために使用してもよく、以下のものを含むがこれらに限定されない。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ ［Wiglerら、Cell II（1977）223］、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ［SzybalskiおよびSzybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48（1962）2026］、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ［Lowyら、Cell 22（1980）817］の遺伝子は、tk-、hgprt-、またはaprt-細胞においてそれぞれ使用することができる。また、代謝拮抗剤耐性は、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）のための選択の基礎として使用することができ、これはメトトレキセートに耐性を与え［Wiglerら、Natl. Acad. Sci. USA 77（1980）3567; O'Hareら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78（1981）1527］；gptはミコフェノール酸に耐性を与え［Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78（1981）2072］；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）、これはアミノグリコシドG-418に耐性を与え［Colberre-Garapinら、J. Mol. Biol. 150（1981）1］；およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hyg）、これはハイグロマイシンに耐性を与える［Santerreら、1984, Gene 30（1984）147］。ヒスチジノールおよびゼオシン（Zeocin（登録商標））などのその他の選択マーカーも使用することができるが、これらに限定されない。
5.4.2発現系および宿主細胞
本発明の方法を使用するために、宿主細胞および／または宿主生物は、好ましくはウシパピローマウイルスE1タンパク質を発現しない。さらに、好ましくは、本発明のベクターは、ウシパピローマウイルスE1タンパク質をコードしない。
好ましい哺乳類宿主細胞は、SV40によって形質転換されたサル腎臓細胞株（COS-7, ATCC CRL 1651）；ヒト胎生期腎臓株（293,293-EBNAまたは293細胞、懸濁培養における増殖についてサブクローニングされた；Grahamら、J. Gen. Virol., 36（1977）59）；ベビーハムスター腎臓細胞（BHK, ATCC CCL10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞DHFR［CHO, UrlaubおよびChasin., Proc. Natl. Acad. Sci. 77（1980）4216］；マウスセルトリ細胞［Mather, Biol. Reprod. 23（1980）243-251］；マウス繊維芽細胞細胞（NIH-3T3）（サル腎臓細胞, CVI ATCC CCL70）； アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76, ATCC CRL 1587）；ヒト子宮頚癌細胞（HELA ATCC CCL2）；犬歯腎臓細胞（MDCK, ATCC CCL34）；バッファローラット肝細胞（BRL 3A, ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138, ATCC CCL75）；ヒト肝細胞（Hep G2, HB8065）；およびマウス乳腺腫瘍細胞（MMT060562, ATCC CCL51）などの、ヒト、サル、および齧歯類から誘導されたものを含むが、これらに限定されない（たとえばKriegler M.,「Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual」, New York, Freeman & Co. 1990を参照されたい）。
本発明のベクターは、当業者に周知の種々の技術により、既知のDNA配列から合成され、および構築されてもよい。調節領域およびエンハンサーエレメントは、天然および合成の両方の、様々な起源であることができる。一部の宿主細胞は、商業的に得られるかもしれない。
対象となるDNA配列を含む本発明のベクターは、原核細胞については細菌の形質転換（Hanahan, 1985, DNA Cloning, A Practical Approach, 1: 109-136）、並びに真核生物細胞についてはリン酸カルシウムを媒介したトランスフェクション［Wiglerら、Cell 11（1977）223-232］、リポソームを媒介したトランスフェクション［Schaefer-Ridderら、Science 215（1982）166168］、エレクトロポレーション［Wolffら、Proc Natl Acad Sci 84（1987）3344］、およびマイクロインジェクション［Cappechi, Cell 22（1980）479-4889］を含む当業者に既知の様々な技術により、宿主細胞に導入することができるが、これらに限定されない。
特定の態様において、本発明のDNA配列を発現する細胞株は、選択マーカーを含むベクターを使用することによって設計されてもよい。実施例の方法により、ベクターの導入に続いて、作製した細胞を濃縮された培地で1〜2日間培養し、次いで選択培地に切り替えることもできる。ベクターの選択マーカーは、選択に対する耐性を与えて最適に選択マーカーを有するベクターを含む細胞のみを培養において増殖することができる。
5.4.3ワクチンアプローチ
ある態様において、対象となるDNA配列の発現カセットを含む本発明のベクターは、免疫応答を誘導するように被験者に投与される。特に、対象となるDNA配列は、タンパク質（たとえばペプチドまたはポリペチド）をコードし、これによりその発現の際に、特定の免疫応答を誘導する。このようなタンパク質の例は、節5.3に記載される。
ワクチンとして使用するための本発明のベクターの送達のための方法は、当業者に既知のものおよび／または節5.4.6において記載されたものの中から選択されてもよい。
5.4.4遺伝子治療アプローチ
特定の態様において、対象となるDNA配列を含む発現カセットを含む本発明のベクターは、種々の疾患を治療または予防するために投与される。対象となるDNA配列は、タンパク質および／または生物学的に活性なRNA分子をコードしてもよい。遺伝子治療は、発現される、または発現できるDNA配列を被験者に投与することよって行われる治療法をいう。本発明の本態様において、DNA配列は、治療的な効果を媒介するこれらがコードするタンパク質またはRNA分子を産生する。
当業者に利用できる遺伝子治療のためのいずれの方法も、本発明に従って使用することができる。例示的な方法が後述される。
遺伝子治療の方法の一般的な総説については、Goldspielら、Clinical Pharmacy 12（1993）488-505; WuおよびWu, Biotherapy 3（1991）87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32（1993）573-596; Mulligan, Science 260（1993）926-932; MorganおよびAnderson, Ann. Rev. Biochem. 62（1993）191-217; May, TIBTECH 1,1 （5）（1993）155-215を参照されたい。使用することができる組換えDNA技術の当業者に一般に既知の方法は、Ausubelら（編）, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY（1993）;およびKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY（1990）に記載されている。
組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されている以下の動物の調節領域は、特定の組織型に対象となるDNA配列を発現するために使用することができる：膵臓の腺房細胞において活性なエラスターゼI遺伝子調節領域［Swiftら、Cell 38（1984）639-646; Ornitzら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50（1986）399-409 ; MacDonald, Hepatology 7（1987）425-515］；膵臓のβ細胞において活性なインシュリン遺伝子調節領域［Hanahan, Nature 315（1985）115-122］、およびリンパ系細胞において活性な領域免疫グロブリン遺伝子調節領域［Grosschedlら、Cell 38（1984）647-658; Adamesら、Nature 318（1985）533-538; Alexanderら、Mol. Cell. Biol. 7（1987）1436-1444］、精巣細胞、乳細胞、リンパ球、およびマストセルで活性なマウス乳癌ウイルス制御領域［Lederら、Cell 45（1986）485-495］、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域［Pinkertら、 Genes and Devel. 1（1987）268-276］、肝臓において活性なアルファフェトプロテイン遺伝子制御領域［Krumlaufら、Mol. Cell. Biol. 5（1985）1639-1648; Hammerら、Science 235（1987）53-58］；肝臓において活性なα1-抗トリプシン遺伝子制御領域 ［Kelseyら、Genes and Devel. 1（1987）161-171］、骨髄性細胞において活性なβ-グロビン遺伝子制御領域［Mogramら、Nature 315（1985）338-340; Kolliasら、Cell 46（1986）89-94］；脳における乏突起膠細胞細胞において活性なミエリン塩基性タンパク遺伝子制御領域［Readheadら、Cell 48（1987）703-712］；骨格筋において活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域［Sani, Nature 314（1985）283-286］；並びに視床下部において活性である生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域［Masonら、Science 234（1986）1372-1378］。
遺伝子治療アプローチのための送達方法は、当業者に周知であるかおよび／または節5.4.6.において記載してある。
5.4.5抑制性のアンチセンスおよびリボザイム
本発明のある態様において、本発明のベクターは、アンチセンスまたはリボザイムRNA分子をコードする対象となるDNA配列を含む。このような分子の産生および使用のための技術は、当業者に周知である。
アンチセンスRNA分子は、標的mRNAにハイブリダイズして直接mRNAの翻訳を遮断するように作用して、タンパク質翻訳を妨げる。アンチセンスアプローチは、標的遺伝子mRNAに相補的であるオリゴヌクレオチドの設計を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な標的遺伝子mRNA転写産物に結合して翻訳を妨げるであろう。好ましいことではあるが、絶対的な相補性は必要でない。
本明細書において意味するものとして、一部のRNAに「相補的な」配列は、RNAの少なくとも非ポリA部分とハイブリダイズして、安定な二量体を形成することができるように十分な相補性を有する配列を意味し；したがって、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二量体DNAの一本鎖を試験してもよく、または三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さに依存するであろう。通常、ハイブリダイズする核酸が長くなるにつれ、より多くのRNAと塩基のミスマッチを含み、安定な二重鎖（または、場合により三重鎖）を形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的な手順を使用して、ミスマッチの許容できる程度を確認することができる。
アンチセンス核酸は、長さが少なくとも6ヌクレオチドであるべきであり、好ましくは長さが6〜約50ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の側面において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、または少なくとも50ヌクレオチドである。本発明のその他の態様において、アンチセンス核酸は、長さが少なくとも100、少なくとも250、少なくとも500、および少なくとも1000のヌクレオチドである。
標的配列の選択に関係なく、インビトロにおける研究を最初に行って、アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子形質発現を阻害する能力を定量することが好ましい。これらの研究では、アンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異な生物学的影響とを区別する対照を利用することが好ましい。また、これらの研究では、標的RNAまたはタンパク質のレベルを内因的な対照RNAまたはタンパク質のものと比較することが好ましい。その上、アンチセンスDNA配列を使用して得られた結果を対照DNA配列を使用して得られたものと比較することが想像される。対照DNA配列は、試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、オリゴヌクレオチドのDNA配列は、アンチセンス配列とは異なることが好ましく、標的配列に対する特異的なハイブリダイゼーションを防止するために必要なだけである。
標的遺伝子のコード領域配列に相補的なアンチセンスDNA配列を使用することができるが、転写され、翻訳されていない領域に相補的なものが最も好ましい。
本発明のベクターに由来する生物学的に活性なRNA、たとえばアンチセンスRNA分子の発現のためには、生物学的に活性なRNA分子をコードするDNA配列が、強力なpolIIIまたはpolIIプロモーターに機能的に連結される。被験者の標的細胞にトランスフェクトするためのこのような構築物の使用により、内因性の標的遺伝子転写物と相補的な塩基対を形成し、これにより標的遺伝子mRNAの翻訳を妨げると考えられる。たとえば、本発明のベクターは、たとえば細胞によって取り込まれ、アンチセンスRNAの転写をさせるように導入することができる。このようなベクターは、当業者に標準的な組換えDNA技術方法によって構築することができる。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、当業者に既知のどのようなプロモーターにでもよく、哺乳類、好ましくはヒト細胞において作用することができる。このようなプロモーターは、誘導性または構成的であることができる。このようなプロモーターは：SV40初期プロモーター領域［BernoistおよびChambon, Nature 290（1981）304-310］、ラウス肉腫ウイルスの3つの末端反復配列に含まれるプロモーター［Yamamotoら、 Cell 22（1980）787-797］、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター［Wagnerら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78（1981）1441-1445］、メタロチオネイン遺伝子の調節配列［Brinsterら、1982, Nature 296（1982）39-42］などを含むが、これらに限定されない。
本発明のある態様において、本発明のベクターは、DNA配列を含み、これはリボザイムをコードする。標的mRNA転写産物を触媒的に切断するために設計したリボザイム分子は、標的遺伝子mRNAの翻訳、従って、遺伝子産物の発現を妨げるために使用することができる［たとえば、国際公開公報第90/11364号, 1990年10月4日公開; Sarverら、Science 247（1990）1222-1225を参照されたい］。
リボザイムは、RNAの特異的な切断を触媒すことでことができる酵素のRNA分子である。［総説については、Rossi, Current Biology 4（1994）469471を参照されたい］。リボザイムの作用機構は、相補的な標的RNAに対するリボザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーション、続いてヌクレオチド鎖切断の切断イベントが関与する。リボザイム分子の組成は、標的遺伝子mRNAに相補的な1つまたは複数の配列を含まなければならず、mRNA切断に応答性の周知の触媒配列を含まなければならない。この配列については、たとえば米国特許第5,093,246号を参照されたく、これは参照として全体が本明細書に組み入れられる。
部位特異的な認識配列でmRNAを切断するリボザイムは、標的遺伝子mRNAを破壊するために使用することができるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的mRNAと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって指示された位置で、mRNAを切断する。唯一の要求は、標的mRNAが以下の2塩基の配列を有するということである：5'-UG-3’。ハンマーヘッドリボザイムの構築および産生は、当業者に周知であり、Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology ： A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, （特に図4、833頁を参照のこと）およびHaseloff & Gerlach, Nature, 334 (1988）585-591により完全に記載されており、これは参照として全体が本明細書に組み入れられる。
好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的遺伝子mRNAの5'末端の近くに位置するように、すなわち効率を増大させて機能しないmRNA転写産物の細胞内蓄積を最小にするように設計される。
また、本発明のリボザイムは、天然に存在するテトラヒメナサーモフィラ（Thtrahymena thermophila）（IVSまたはL-19 IVS RNAとして既知）で、Thomas Cechおよび共同研究者［Zaugら、Science, 224（1984）574-578; ZaugおよびCech, Science, 231（1986）470-475; Zaugら、Nature, 324（1986）429-433; University Patents Inc.による国際公開公報第88/04300号; Been & Cech, Cell, 47（1986）207-216］によって詳細にわたって記載されたものなどのRNAエンドリボヌクレアーゼ（以下「キャッシュ型リボザイム」とする）を含む。キャッシュ型リボザイムは、8塩基対の活性部位を有し、これは標的RNA配列にハイブリダイズした後、標的RNAの切断が起こる。本発明は、それらのキャッシュ型リボザイムを包含し、これは標的遺伝子に存在する8塩基対の活性部位配列を標的とする。
リボザイムの発現は、強力な構成的polIIIまたはpolIIプロモーターの制御下にあってもよく、その結果トランスフェクション細胞は、リボザイムの十分な量を産生して内因性の標的遺伝子メッセージを破壊し、翻訳を阻害すると考えられる。アンチセンス分子と異なったリボザイムは触媒作用的があるので、効率のためにより低い細胞内濃度であることが必要である。
本明細書に記載されたアンチセンスおよび／またはリボザイム分子が、変異遺伝子の発現を阻害するために利用される例では、この技術が正常な標的遺伝子対立遺伝子によって産生されるmRNAの翻訳を非常に効率的に減少し、または阻害して、正常な標的遺伝子産物の存在する濃度は、正常な表現型のために必要なものよりも低くさせる可能性も生じ得る。このような場合、実質的に正常なレベルが維持されることを保証するために、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペチドをコードして発現する核酸分子が、以下に、節5.4.4において記載したものなどの遺伝子治療方法を経て、細胞に導入されても良く、これは、治療に利用されるどのようなアンチセンス、リボザイム、または三重螺旋治療に感受性の配列も含まない。または、標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合の例において、要求レベルの標的遺伝子活性を維持するために、正常な標的遺伝子タンパク質を同時投与することが好ましいと思われる。
リボザイムおよびアンチセンスRNA分子を投与する方法は、当業者および／または節5.4.6に記載する。
5.4.6薬学的製剤および投与の方法
好ましい側面において、本発明の医薬品は、実質的に精製された本発明のベクター（たとえば、その効果を制限するか、または望まれていない副作用を生じる物質が実質的にない）を含む。医薬品が本発明の方法で投与される被験者は、好ましくは動物であり、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物を含むがこれらに限定されず、好ましくは哺乳類、および最も好ましくはヒトである。ある態様において、本発明のベクターは、生体内に直接投与され、対象となるDNA配列は、コードされた産物を発現して産生する。これは、当業者に既知の多数のいずれの方法でも達成することができる。本発明のベクターは、核酸配列が細胞内に来るように投与することができる。本発明のベクターは、無傷のDNAの直接の注射；微小粒子照射の使用（たとえば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）；脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクション剤による被覆；微小粒子またはマイクロカプセルにおけるカプセル化法；核に入ることが知られているペプチドとの結合による投与；受容体依存性エンドサイトーシスに供するリガンドとの結合による投与［たとえばWuおよびWu, J. Biol. Chem. 262（1987）4429-4432を参照されたい］（これは、受容体を特異的に発現する標的細胞型に使用することができる）；等によって投与することができる。特定の態様において、化合物または組成物は、ベシクルで、特にリポソームで送達することができる［Langer, Science 249（1990）1527-1533; Treatら、1989, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-BeresteinおよびFidler（編）, Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327を参照されたい］。
ある態様において、本発明のベクターは、脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤で被覆され、または細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと結合されている［たとえば、Joliotら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88（1991）1864-1868を参照されたい］。
その他の態様において、核酸リガンド複合体は、膜融合（fusogenic）ウイルスのペプチドを含むリガンド内に形成されてエンドソームを分裂させることができ、核酸がリソソーム分解することを回避させる。
さらにその他の態様において、本発明のベクターは、特定の受容体を標的化することによって、インビボにおいて細胞特異的に取込みおよび発現させるために標的化することもできること（たとえば国際公開公報第92/06180号；国際公開公報第92/22635号；国際公開公報第92/20316号；国際公開公報第93/14188号；および国際公開公報第93/20221号を参照されたい）。
本発明を使用するための方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口の経路を含むが、これらに限定されない。本発明を使用するための方法は、あらゆる簡便な経路により、たとえば、注入液または大量瞬時投与により、上皮のまたは粘膜皮膚のライニング（たとえば、口腔粘膜、直腸、および腸の粘膜など）を介した吸収により、投与をすることをさらに含む。特定の態様において、本発明のベクターを注射により、カテーテルにより、坐薬により、またはインプラントにより投与することが望ましく、前記インプラントは、サイラスティック膜などの膜または繊維を含む多孔質、非多孔性またはゼラチン質物質である。ベクターが吸収しない物質を使用するためには、注意をしなければならない。投与は、全身的または局所的であることができる。
ある態様において、本発明のベクターは、化学療法剤などのその他の生物活性物質または免疫系を増強する物質と共に投与される。
もう一つの態様において、さらに、本発明を使用するための方法は、徐放性系による送達を含む。一つの態様において、ポンプを使用してもよい［Langer, 前記; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14（1989）201; Buchwaldら、Surgery 88（1980）507; Saudekら, N. Engl. J. Med. 321（1989）574を参照されたい］。もう一つの態様において、重合材料を使用することができる［Medical Applications of Controlled Release, 1974, LangerおよびWise（編）, CRC Pres., Boca Raton, Florida; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, 1984, SmolenおよびBall（編）, Wiley, New York ; RangerおよびPeppas, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23（1983）61; さらにLevyら、Science 228（1985）190; Duringら, Ann. Neurol. 25（1989）351; Howardら、J. Neurosurg. 71（1989）105を参照されたい］。
その他の徐放性系は、Langer, Science 249（1990）1527-1533による総説において議論されている。
本発明の医薬組成物は、本発明のベクターの治療的に有効な量および適切な薬学的媒体を含む。特定の態様において、「適切な薬学的媒体」という用語は、連邦または州政府の調節機関によって承認され、または米国薬局方または動物に、特にヒトに使用するためにその他の一般に認識された薬局方に一覧を示されたものを意味する。「媒体」という用語は、希釈液、アジュバント、賦形剤、または治療薬と共に投与される媒体をいう。このような適切な薬学的媒体は、水およびラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油、その他同種のものなどの、石油、動物、野菜、または合成起源のものを含むオイルなどの無菌の液体であることができる。薬学的組成物が静脈内に投与される場合、水は、好ましいキャリアである。また、塩類溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、液体キャリアとして、特に注射可能な溶液に使用することができる。適切な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、シュークロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥した脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、必要に応じてまた、湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝作用剤の軽微な量を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、タブレット、ピル、カプセル、粉末、持続性製剤などの形態をとることができる。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤およびキャリアと共に坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなど、標準的なキャリアを含むことができる。適切な薬学的キャリアの例は、E. W. Martinにより、「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、本発明の核酸またはタンパク質の治療的に有効な量を、好ましくは精製された形態で、被験者に適した投与形態を提供するように適切な量のキャリアと共に含むであろう。製剤は、投与の型式に適しているべきである。
特定の態様において、本発明の医薬品は、ヒトへの静脈内投与に適した薬学的組成物としてルーチン手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌の等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、本発明の医薬品は、また、注射の部位の痛みを和らげるために、溶解剤およびリグノカインなどの容局所麻酔剤を含んでいてもよい。通常、成分は、ユニット剤形で別々にまたは混合されてのいずれかで、たとえば活性剤の量を示すアンプルまたはサッシェなどの密封された密封コンテナの、凍結乾燥された粉末または水フリーの濃縮物として供給される。本発明の医薬品が注入液によって投与される場合、無菌の薬学的等級の水または塩類溶液を含む注入液瓶で調剤することができる。本発明の医薬品が注射によって投与される場合、注射のための滅菌水または塩類溶液のアンプルは、成分を投与前に混合してもよいように提供することができる。
口腔投与については、組成物は、従来の方法で製剤化されたタブレットまたはロゼンジの形態をとってもよい。
吸入による投与については、本発明に従って使用するための化合物は、適切な噴射剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切な気体を使用して、加圧されたパックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、用量ユニットは、バルブを提供することによりメーターで測った量を送達することによって決定されてもよい。吸入器または通気器に使用するためのたとえばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含んで製剤化してもよい。
示した疾患の治療または予防に有効であろう本発明のベクターの量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、インビトロでのアッセイ法は、最適な用量範囲の同定を補助するために任意に使用されてもよい。また、製剤に使用される正確な用量は、投与の経路および示された疾患の段階に依存し、開業医の判断およびそれぞれの被験者の状況に従って決定されるべきである。有効な量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から推論してもよい。
本発明は、本発明の例示として提供される以下の限定されない実施例を参照することで、より理解されると思われる。以下の実施例は、本発明の好ましい態様をより完全に例示するために提示する。しかし、これらは、本発明の幅広い範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
6.1.実施例1
super6およびsuper6wtの発現性質のクローニングおよび解析
ベクタープラスミドsuper6（図1）およびsuper6wtは、それぞれ以前に作製した遺伝子ワクチン接種ベクターVI（図2）およびVIwtから調製した。ベクターVIおよびVIwtは、主に、カナマイシン耐性マーカー遺伝子由来のトランスポゾンTn903［Oka, A.ら、J Mol Biol 147（1981）217-226］、および大腸菌細胞の増殖のために必要とされるpMB1レプリコン［Yanisch-Perron, C.ら、Gene 33（1985）103-119］の修飾された形態を含む合成細菌性プラスミドである。また、ベクターVIおよびVIwtは、HSV1 TKリーダー配列およびウサギβ-グロビン遺伝子配列（両方ともプラスミドpCGに由来する）と組み合わせたサイトメガロウイルス前初期プロモーターを含む［Tanaka, M.ら、60（1990）Cell 375-386］。後者のエレメントは、HIV-1株のHAN2分離株に由来するnefコード配列から発現するために必要である［Sauermann, U.ら、AIDS Research. Hum. Retrov. 6（1990）813-823］。Nefのための発現ベクターは、CMVプロモーターのすぐ上流に、クラスター形成した10個の高親和性E2結合部位（未公開、プラスミドpUC1910BSに由来）を有する。
親ベクターVlは、修飾されたE2コード配列を含み：E2（アミノ酸192-311）のヒンジ領域は、エプスタイン・バーウイルスのEBNA1タンパク質由来の4つのグリシン-アラニンリピートで置換される［Baer, R. J.ら、Nature 310（1984）207-211］。この配列によってコードされるタンパク質は、E2d192-311+4Gと名づけられた。親ベクターVIwtは、E3およびE4のオープンリーディングフレーム（ORF）コード能を除去するために導入された、両方のORF内の2つの停止コドンによる点変異を有するウシの1型パピローマウイルスの野生型E2タンパク質のための発現カセットを含む。ベクターにおいて、E2コード配列は、ラウス肉腫ウイルスのプロウイルスの5'LTR［Long, E. O.ら、Hum. Immunol. 31（1991）229-235］と、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域［Chesnut, J. D.ら、J Immunol Methods 193（1996）17-27］との間でクローニングする。
プラスミドベクターsuper6およびsuper6wtは、それぞれの親ベクターVIおよびVIwtから、ウサギβ-グロビン遺伝子の第二イントロンを除くnef遺伝子の下流の全てのβ-グロビン配列削除することによって構築した。β-グロビン配列（特にエキソンの断片）は、ヒトβ-グロビン遺伝子の配列と一部相同性を示すが、イントロンは、ヒトゲノム配列に対して有意な相同性を全く欠損している。イントロンは、イントロンのスプライシングドナーおよびアクセプターの配列を修飾するための一部のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを、コンセンサスモチーフに対する完全なマッチに使用して、PCRによってプラスミドpCG［Tanaka, M.ら、Cell 60（1990）375-386］から増幅した。次いで、親プラスミドにおいて、ウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナルを使用したので、pHook［Chesnut, J. D.ら、J Immunol Methods 193（1996）17-27］からの1型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子ポリアデニル化領域を、イントロンの3'末端のすぐ隣りにクローニングした。
プラスミドベクターsuper6およびsuper6wtによって発現されるNefおよびE2タンパク質の発現特性を解析し、NefおよびE2に対するモノクローナル抗体でのウェスタンブロッティング［Towbinら、Proc Natl Acad Sci USA 76（1979）4350-4354］により、VIおよびVIwtによって発現されるNefおよびE2タンパク質の発現特性と比較した。最初に、ジャーカット(Jurkat)細胞（ヒトT細胞リンパ芽細胞系）には、エレクトロポレーション［Ustavら、EMBO J2（1991）449-457］によって1μgのsuper6、super6WTまたは等モル量のプラスミドVI、VIwtをトランスフェクションした。対照として、同一のNefカセットを含むが、E2コード配列を含まない、等モル量のベクターII（図3）を使用した。キャリアDNAは、陰性対照として使用した。簡単には、プラスミドおよびキャリアDNAを、0.4cmのエレクトロポレーションキュベット（BioRad Laboratories, Hercules, USA）において細胞懸濁液と混合し、キャパシタンス増量剤（BioRad Laboratories, Hercules, USA）と共に遺伝子パルサーII（Gene Pulser）（商標）を使用して、電気パルス（200V；1mF）した。
トランスフェクションの49時間後、50mMのトリス-HCl、pH6.8；2％のSDS、0.1％のブロムフェノールブルー、100mMのジチオトレイトール、および10％の（v/v）グリセロールを含む試料緩衝液で処理して細胞を溶解した。可溶化液を、10％または12.5％のSDS-ポリアクリルアミドゲルで泳動し、その後、0.45μmのPVDFニトロセルロース膜（Millipore）に転写した。まず、5％の粉ミルク（脂肪なし）、0.1％のツイーン20の50mMトリス-HCl、pH7.5溶液；150mMのNaClを含むブロッキング溶液で、膜を一晩ブロッキングし、その後、希釈したモノクローナル抗Nef抗血清（1：100）、または抗E2-抗血清（1：1000）のブロッキング溶液中で1時間インキュベートした。それぞれのインキュベーション工程の後、TBS-0.1％のツイーン20で細片を3回洗浄することにより、未結合のタンパク質を除去した。一次免疫グロブリンの結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG（Labas, Estonia）と細片をインキュベートし、続いて化学発光検出系（Amersham Pharmacia Biotech, United Kingdom）を使用して可視化することによって検出した。
結果を図4に示す。Nefタンパク質の発現は、パネルAに示し、E2タンパク質をパネルBに示した。矢印は、NefおよびE2タンパク質の正しい分子サイズを示す。E2d192-311+4GAの発現レベルは、非常に低く、この理由のために図4においてブロットの存在を見出すことができない。
プラスミドsuper6、super6wt、VI、およびVIwt（図4Aにおけるレーン1〜4）から発現されるNefの量は、非常に似ている（図4、パネルA、レーン1〜4）。プラスミドII（レーン5）からは、非常により少ないタンパク質が産生される。Nefタンパク質の発現レベルは、wtE2を含むベクターからのものよりも高い（参照、レーン2と比較してレーン1、およびレーン4と比較してレーン3）。これは、これらのプラスミド（図4、パネルB）からのE2およびE2d192-311+4GAタンパク質の発現レベルに従ったものである。
6.2.実施例2
一連のプロダクト1(product1)およびNNVのプラスミドのクローニング並びに発現特性の解析
大腸菌において、ベクターsuper6およびsuper6wtのコピー数を増大させるために、これらのベクターにさらなる改変を行った。Tn903カナマイシン耐性遺伝子、pMB1レプリコン、および10個のE2結合部位をHindIII/NheI消化によって除去し、続いてレトロウイルスベクターpBabe NeoからHindIII/NheI断片と置換した［Morgenstern, J. P.およびLand, H., Nucleic Acids Research 18（1990）3587-3596］。この断片は、細菌における弛緩したプラスミドの高コピー数での複製を可能にする修飾されたpMB1レプリコンおよびTn5カナマイシン耐性遺伝子を含む。新規プラスミドを、それぞれプロダクト1(product1)（図5）、およびプロダクト1wt(product1wt)と名付けた。10個のE2結合部位を、product1のCMVプロモーターのNheI部位上流へと戻して、元通りに挿入する試みは不成功であり、それぞれベクターに2つの結合部位だけを有する新規ベクターNNVを生じた。
さらなる10個のE2結合部位を、プラスミドpUC191OBから、新規ベクターのE2発現カセットのすぐ下流に挿入した。これらの新規ベクターは、NNV-1およびNNV-2（図6A）と名付けた。E2d192-311+4GAをwtE2（削除されたE3およびE4 ORFと）と置換するために、Bsp120I断片を含むE2d192-311+4GAコード配列を、super6wtからの類似のBsp120I断片を含むwtE2と置換した。作製したプラスミドは、それぞれNNV-1wtおよびNNV-2wt（図6B）と名付けた。NNVシリーズのベクターの1番または2番は、E2発現カセットと関連する10個のE2結合部位領域の配向を特徴付ける。
NNVプラスミド、すなわちNNV-1、NNV-2、NNVwt、およびNNV-2wtからのNefタンパク質の発現特性は、1μgの濃度のプラスミドをエレクトロポレーションによってジャーカット細胞にトランスフェクションした後に解析し、super6およびsuper6wtからのNefタンパク質の発現特性と、本質的に実施例1にて説明したようにウェスタンブロッティングによって比較した。トランスフェクションに使用したsuper6およびsuper6wtの量はそれぞれ、0.95μgおよび1μgであった。結果を図7に示す。
NNV-1およびNNV-2ベクターは、図8におけるレーン5とレーン1および2との比較から明らかなように、プラスミドsuper6と同様の発現能力を有する。同じことは、ベクターNNV-1wt、NNV-2wt、およびsuper6wtにも適用される（図7におけるレーン6とレーン3および4とを比較）。以前の結果に従って、wtE2を発現するプラスミドは、E2d192-311+4GAベクターが発現するよりも多くのNefタンパク質を産生する（図7におけるレーン3とレーン1とを比較、およびレーン4とレーン2とを比較）。これを考慮して、NNV-2wtからのNefの発現は、NNV-1wtからのものよりもわずかに高かったので、さらなる試験のためにベクターNNV-2wtを選択した。
6.3実施例3
NNV-2wtの発現特性の解析
NNV-2wtの発現性質を解析するため、4つの異なる細胞系、すなわちジャーカット（ヒトT細胞リンパ芽球）、P815（マウス肥満細胞腫細胞）、CHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣）株、およびRD（ヒト胎児横紋筋肉腫細胞）をエレクトロポレーションによってトランスフェクションし、これらによるNefおよびE2の発現について解析した。E2タンパク質およびE2のオリゴマー形成された結合部位によって媒介される転写活性化並びに維持特性を示すために、E2結合部位（図5）を欠損しているproduct1wtを対照として使用した。さらなる対照プラスミドは、プラスミドNNV-2wtFSであり、これはE2コード配列に導入されたフレームシフトを含むことによってNNV-2wtとは異なり、これにより、機能的E2タンパク質を発現しない。
それぞれの細胞株には、本質的に実施例1にて説明したように、種々の量のベクターDNAをエレクトロポレーションによってトランスフェクションした。トランスフェクションの約2日および約5日後に時間点を取った。解析の結果を図8〜10に示す。
ジャーカット細胞には、0.5μgまたは2μgのNNV-2wt（図8におけるレーン1、2、8、および9）、および等量のプラスミドNNV-2wtFS（図8におけるレーン3、4、10、および11）、およびproduct1wt（図8におけるレーン5、6、12、および13）またはキャリアのみ（図8におけるレーン7および14）をトランスフェクトした。トランスフェクションの44時間後（レーン1〜7）および114時間後（レーン8〜14）に時間点を取った：NefおよびE2タンパク質の発現は、本質的に実施例1にて説明したように、ウェスタンブロッティングによって解析した。
P815細胞には、0.5μgまたは2μgのNNV-2wt（図9におけるレーン1、2、8、および9）、および等量のプラスミドNNV-2wtFS（図9におけるレーン3、4、10、および11）、およびproduct1wt（図9におけるレーン5、6、12、および13）、またはキャリアのみ（図9におけるレーン7および14）をトランスフェクトした。トランスフェクションの45時間後（レーン1〜7）および119時間後（レーン8〜14）に時間点を取った：Nefタンパク質の発現は、本質的に実施例1にて説明したように、ウェスタンブロッティングによって解析した。転写後119時間の抗E2抗体によるブロットは、特別なシグナルを検出されることができないので示されていない。通常、Nefタンパク質の発現量は、これらの細胞におけるE2タンパク質の発現量と互いに関連しており、これにより、E2タンパク質の機能が転写を活性化し、プラスミドが増殖細胞においてより長時間維持されるのを補助するという事実を確証する。
CHO細胞には、0.5μgまたは2μgのNNV-2wt（図10におけるレーン1、2、8、および9）、および等量のプラスミドNNV-2wtFS（図10におけるレーン3、4、10、および11）およびproduct1wt（図10におけるレーン5、6、12、および13）またはキャリアのみ（図10におけるレーン7および14）をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後（レーン1〜7）および114時間後（レーン8〜14）に時間点を取った。NefおよびE2タンパク質の発現は、本質的に実施例1にて説明したように、ウェスタンブロッティングによって解析した。
RD細胞には、0.5μgまたは2μgのNNV-2wt（図11におけるレーン1、2、8、および9）、および等量のプラスミドNNV-2wtFS（図11におけるレーン3、4、10、および11）、およびproduct1wt（図11におけるレーン5、6、12、および13）またはキャリアのみ（図11におけるレーン7および14）をトランスフェクトした。トランスフェクションの39時間後（レーン1〜7）および110時間後（レーン8〜14）に時間点を取った。Nefタンパク質の発現は、本質的に実施例1にて説明したように、ウェスタンブロッティングによって解析した。
4つの全ての細胞系において、初期の時間点（図8〜11におけるレーン1〜7）および後の時間点（図8〜11におけるレーン8〜14）の時間でとったNNV-2wtからのNefタンパク質の発現レベルは、対照ベクターからのものよりも高かった。NNV-2wtの優位性は、図8におけるレーン10および12とレーン8の比較から、さらに、図8、9、および10におけるレーン11および13とレーン9の比較から明らかなように、後の時間点でより明らかであった。
また、これらのプラスミドからのRNAの発現パターンを、ノーザン解析［Alwine, J. Cら、Proc Natl Acad Sci USA 74（1977）5350-5354］を使用してNNV-2wtベクターについて解析した。この目的のために、ジャーカット細胞およびCHO細胞には、2μgのNNV-2wtをトランスフェクトした。P815細胞のトランスフェクションについては、10μgのNNV-2wtを使用した。トランスフェクションは、本質的に実施例1にて説明したように行った。トランスフェクションの48時間後、RNAeasyキット（Qiagen）を使用して総RNAを抽出し、21μg（P815）、15μg（CHO）、または10μg（ジャーカット）のRNAを含む試料を変性条件下（20mMのMOPS pH7.0；2mMのNaOAc；1mMのEDTA pH8.0；2.2Mのホルムアルデヒドを含む1.3％のアガロースゲル）で電気泳動によって解析した。ランニング緩衝液は、ホルムアルデヒドを除いて同じ成分が含まれた。試料をホルムアミドおよびホルムアルデヒドを含む緩衝液に充填した。電気泳動後、分離したRNAをHybondN+膜（Amersham Pharmacia Biotech, United Kingtom）にブロットし、放射標識したnefコード配列、E2コード配列、または総ベクタープローブによるハイブリダイゼーションを行った。キャリアをトランスフェクションした細胞からのRNAを対照として使用した。ノーザンブロット解析の結果を図12に示す。
結果は、nefおよびE2特異的なハイブリダイゼーション（図12におけるレーン13〜18とレーン1〜12を比較）と比較して総ベクタープローブによって、さらなるシグナルを検出することができないので、E2およびnefに相補的なmRNA以外のRNA種は、ベクターから発現されなかったことを示す。
6.4実施例4
有糸分裂染色体に対するNNV-2wtの付着の解析
CHO細胞の有糸分裂染色体に対するNNV-2wtの付着は、インサイチュー・ハイブリダイゼーション（FISH）におけるフルオレセンスによって解析した［Tucker J. D.ら、J. E. Celis（編）, Cell Biology: A Laboratory Handbook, vol 2, p. 450-458. Academic Press, Inc. New York, NY. 1994］。
1μgのNNV-2wtを、または等モル量の対照プラスミドNNV-2wtFSおよびproduct1wtをエレクトロポレーションによってCHO細胞にトランスフェクトした36時間後（本質的に実施例1にて説明したように行った）、有糸分裂の中期における細胞を停止させるために培養をコルヒチン（Gibco）で処理した。簡単には、コルヒチンを細胞に終濃度0.1μg/mlで培地に1〜4時間添加して、細胞周期を有糸分裂で遮断した。遮断された細胞をトリプシン処理によって回収して、0.075MのKCl溶液に懸濁し、15分間室温でインキュベートして氷冷メタノール-氷酢酸（3：1、vol/vol）で固定した。蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーション解析のために、中期の広がった染色体および間期の核を湿ったスライドに細胞懸濁液を垂下することによって調製した。1つの培養からいくつかのスライドを調製した。
ハイブリダイゼーションプローブは、標識としてビオチン-16-dUTPを、およびテンプレートとしてプラスミドproduct1wtを使用して、ニックトランスレーションによって作製した。典型的ニックトランスレーション反応混合液は、ニックトランスレーション緩衝液、標識のないdNTP、ビオチン-16-dUTP、および大腸菌DNAポリメラーゼを含んだ。
染色体の調製は、70％のホルムアミド（pH7.0〜7.3）に70℃で5分間変性させ、次いで直ちに一連の洗浄液（70％、80％、および96％の氷冷エタノール洗浄液をそれぞれ3分間）で脱水して空気乾燥させた。ハイブリダイゼーション混合液（スライドあたり18μl）は、50％のホルムアミドの2xSSC（1xSSCは、0.015Mのクエン酸ナトリウムおよび0.15MのNaClである）溶液、10％の硫酸デキストラン、150ngのビオチン化されたプラスミドプローブDNA、および10μgのニシン精液キャリアDNAから構成された。70℃で5分間の変性後、プローブDNAをそれぞれのスライド（カバーグラスの下で封止される）に加えて、湿室において37℃で一晩ハイブリダイズさせた。スライドを、45℃で0.1％のIGEPALCA-630（Sigma Chemical Co.）を含む2xSSC、nd2xSSCの3回交換によって洗浄した。免疫蛍光法検出の前に、スライドをPNM緩衝液［5％の脂肪を含まない粉乳および0.02％のアジ化ナトリウムと共に、PN緩衝液（1リットルH2O中、25.2gのNa2HPO4・7H2O、083g NaH2PO4 ・□H2Oおよび0.6mlのIGEPAL CA-630）］において5分間プレインキュベートした。
その後、プローブをフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合エクストラアビジンで検出した。シグナルをビオチン化された抗アビジン抗体および二回目のエクストラアビジン-FITC処理によって増幅した。それぞれの工程間で、スライドを、2×5分間、室温で0.05％のIGEPAL CA-630を含むPN緩衝液で洗浄した。染色体をヨウ化プロピジウムで対比染色し、p-フェニレンジアミン抗退色マウンティングメディウムにマウントした。
スライドは、適切なフィルターセットを備えたオリンパスVANOX-S蛍光顕微鏡で解析した。
結果を表1に示す。
（表１）NNV-2wtの染色体付着
Figure 2010042000
データは、NNV-2wtだけがこの機能を有し、その他の2つのベクターは有さないので、E2タンパク質およびその結合部位が染色体の付着のために必要なことを明確に示す。
6.5実施例5
細菌細胞における生殖の間のNNV-2wtの安定性
細菌細胞における生殖の間のNNV-2wtの安定性を試験した。プラスミドNNV-2wtを、コンピテント大腸菌細胞のDH5アルファ株と混合し［Inoue, H.ら、Gene 96（1990）23-28にて記載されたように調製した］、氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞懸濁液を37℃で3分間熱ショックに供し、続いて迅速に氷上で冷却した。1ミリリットルのLB培地を試料に添加し、混合液を37℃で45分間、激しく振盪しながらインキュベートした。最後に、一部の細胞を50μg/mlのカナマイシンを含むLB培地を含むディッシュ上へプレーティングした。その翌日、単一コロニーからの細胞を、同じ培地を含む新たなディッシュに移した。この手順を、4世代の細菌が培養されるまで繰り返し、それぞれの世代のコロニーからのプラスミドDNAを解析した。
それぞれの世代からの1つのコロニーを、50μg/mlのカナマイシンを含む2mlのLB培地の接種に使用し、続いて一晩37℃で激しく振盪しながらインキュベーションした。細胞を回収し、古典的な細胞溶解を使用してプラスミドDNAを煮沸によって細胞から抽出した［Sambrook, S.ら、Molecular Cloning A Laboratory Manual.、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York］。試料を制限エンドヌクレアーゼXbal（Fermentas, Lithuania）で消化して、アガロースゲル電気泳動により、形質転換のために使用したオリジナルのDNAと比較して解析した。結果を図13に示す。
図13で分かるように、ベクターは、大腸菌細胞の継代の間安定している：形質転換に使用したDNA（レーン9）と比較して、再編成を有するコロニーは観察されなかった。
6.6実施例6
真核生物細胞におけるNNV-2wtの安定性
また、非複製エピソームのエレメントとしてのプラスミドNNV-2wtの安定性を真核生物細胞において解析した。この目的のために、CHO細胞およびジャーカット細胞には、2μgのNNV-2wtをトランスフェクトした。細胞の総DNAを、トランスフェクションの24時間、72時間、または96時間後に抽出した。簡単には、細胞を20mMのトリス-HCl pH8.0；10mMのEDTA pH8.0；100mMのNaCl；0.2％のSDSに、200μg/mlのプロテイナーゼK（Fermentas, Lithuania）存在下において溶解した。次に、試料を順番にフェノールで、およびクロロホルムで抽出してエタノールで沈殿させた。核酸は、トリス-HCl 10mM pH8.0；1mMのEDTA pH8.0；20μg/mlのRnase A（Fermentas, Lithuania）に再懸濁して、37℃で1時間インキュベートした。最後に、DNAを酢酸アンモニウムおよびエタノールで再沈殿させて、70％のエタノールで洗浄して10mMのトリス-HCl pH8.0；1mMのEDTA pH8.0に再懸濁した。異なる限定エンドヌクレアーゼで：プラスミドに2つの認識部位を有するEco81I（Fermentas, Lithuania）で、NNV-2wt DNAを切断しないHindIII（Fermentas, Lithuania）で、および大腸菌細胞で合成されるDNAのみを消化するDpnI（New England Biolabs, USA）で、試料を消化した。切断されたDNAをTAEアガロース電気泳動で分離して、ベクター特異的な放射性標識されたプローブでサザンブロッティングによって解析した［Southern, E. M. J. Mol. Biol. 98（1975）503-517］。結果を図14に例示する。それぞれのマーカーレーンとEco81I消化（図14におけるレーン1、2、および7）の断片大きさの比較から明らかなように、ベクターの配置は、アッセイ法において検出されなかった。HindIII（図14におけるレーン3、4、および8）またはHindIII/DpnI（図14におけるレーン5、6、および9）消化の場合には、いずれもマーカーレーンとは異なる位置で観察されるシグナルがなかったことから、組込みおよび／または複製イベントが観察されないことを示す。
6.7実施例7
ヒトパピローマウイルスの複製因子の存在下におけるNNV-2wtの複製の解析
パピローマウイルスタンパク質は、多くのその他のヒトおよび動物パピローマウイルス由来の異種のoriを含むプラスミドからの複製を開始することができることが、以前に示されている［Chiang, C. M.ら、Proc Natl Acad Sci U S A 89（1992）5799-5803］。NNV-2wtは、完全なウイルスの複製開始点を含まないが、ヒトの1型パピローマウイルスのE1およびE2タンパク質の存在下においてどのように複製が開始されるか試験した。図15の上段に示したとおり、CHO細胞を、1マイクログラムのプラスミドNNV-2wt、NNV-2wtFS、もしくはproduct1のいずれかを単独で、または4.5μgのHPV-11のE1発現ベクターpMT/E1 HPV11で、または同量のpMT/E1 HPV11と4.5μgのHPV-11 E2タンパク質発現ベクターpMT/E2 HPV11でトランスフェクトした。トランスフェクションは、本質的に実施例1にて説明したように行った。E1およびE2発現ベクターは、以前に記載されている（Chiang, C. M.ら、前記）。HPV-11の複製開始点を含むプラスミドHPV11ORIの等モル量を、陽性対照として同じ発現ベクターでトランスフェクトした。
低分子量DNAを、修飾Hirt溶解［Ustavら、EMBO J 2（1991）449-457］によって、トランスフェクションの67時間後に抽出した。簡単には、PBSで洗浄した細胞を、アルカリ細胞溶解溶液I（50mMのグルコース；25mMのトリス-HCl、pH8.0；10mMのEDTA、pH8.0）、およびII（0.2MのNaOH；1％のSDS）を1：2の比でディッシュ上に添加することにより、氷上で5分間溶解した。可溶化液を0.5vol溶液III（酢酸カリウムおよび酢酸の混合液；カリウムに関して３Mおよび酢酸塩に関して5M）によって中和した。遠心後、上清をイソプロパノールで沈殿し、再懸濁して、55℃において200μg/mlのプロテイナーゼK（Fermentas, Lithuania）の存在下で、20mMのトリス-HCl pH8.0；10mMのEDTA pH8.0；100mMのNaCl；0.2％のSDS中でインキュベートした。次に、試料をフェノールで、クロロホルムで順番に抽出して、続いてエタノールで沈降させた。核酸を10mMのトリス-HCl pH8.0；1mMのEDTA pH8.0；20μg/mlのRnase A（Fermentas, Lithuania）に再懸濁して、65℃で30分間インキュベートした。試料は、ベクターの場合には直鎖化エンドヌクレアーゼ（Ndel；Fermentas, Lithuania）で、またはHPV11ORIの場合にはHindIII（Fermentas, Lithuania）、およびDpnl（New England Biolabs, USA）（複製されないDNAを破壊）で消化し、続いて、本質的に以前に行ったように、ベクター特異的な放射性標識されたプローブを使用してサザンブロッティングを行った。ハイブリダイゼーションの陽性対照のために、直鎖状ベクターおよびHPV11ORIの適切なマーカーを使用した（図15においてレーンMとしてマークした）。図15に記載した結果から見られるように、複製シグナルは、いずれのベクタープラスミドの場合にも検出されなかった。
6.8実施例8
分裂細胞におけるE2の解析およびその結合部位依存的なベクターの分離機能
以前に記載されたとおり、トランスのウシの1型パピローマウイルス E2タンパク質およびシスのその多数の結合部位は、エピソームの遺伝的エレメントのクロマチン付着のために必要かつ十分である。本現象は、分裂細胞におけるウイルス感染の間に、ウイルスゲノムを分割するための機構を提供することを示唆する［Lives, I.ら、J Virol. 73（1999）4404-4412］。また、両方の機能的エレメントが本発明者らのベクター系に含まれるので、この研究の目的は、分裂細胞集団における転写的に活性なベクターエレメントの維持のための、E2タンパク質およびオリゴマー形成された結合部位の重要性を解析することである。
この目的のために、ベクターNNV-2wtおよびsuper6wtのNefコード配列を、ベクターpd1EGFP-N1（Clontech Laboratories）に由来する緑色蛍光タンパク質（d1EGFP）の不安定化した形態のコード配列と置換した。このタンパク質の半減期は、1時間程度と短いので、これは細胞に蓄積せず、これらの細胞における転写的に活性なベクターの存在に関連して、d1EGFP発現をフローサイトメーターによって検出した。
NNV-2wtから、nefコード配列を除去し、pd1EGFP-N1からのSmal-NotI断片をその代わりに挿入した。新たなベクターは、2wtd1EGFPと名付けた（図16）。gf10bse2を作製するために、同様の置換をsuper6wtの場合にもそれぞれ行った（図17）。制限エンドヌクレアーゼSpeIの認識配列をsuper6wtの10個のE2BSのすぐ上流のEcoRI部位に導入した。ベクターgf1Obse2は、Ndel-Bst1107I断片を含むNefコード配列を同じ酵素で切断した2wtd1EGFPからの断片を含むd1EGFPコード配列と置換することにより、このプラスミドから誘導される。
また、機能的E2コード配列またはその結合部位のいずれかを欠損する陰性対照プラスミドを作製した：フレームシフトは、2wtd1EGFPに関して、Bsp120I-Bsp120Iを含むE2コード配列をプラスミドNNV-2wtFSからの同様の断片と置換することによってE2コード配列に導入した。得られたベクターを、2wtd1EGFPFSと名付けた（図18）。対照プラスミドNNVd1EGFP（図19）の構築のためには、2wtdEGFPからの総E2発現カートリッジ（加えて細菌性のレプリコン）をBst1107およびNheI消化によって除去した。レプリコンは、プラスミドproduct1からHindIII(埋め込み：filled in)-NheI断片として再構成した。
ジャーカット細胞には、1μgのベクター2wtd1EGFP、または等モル量のプラスミド2wtd1EGFPFS、NNVd1EGFP、gf10bse2もしくはキャリアDNAのみを、実施例1にて説明したようにエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクション後の種々の時間点で、同量の一定分量の細胞懸濁液を解析のために回収し、その後、試料を新しい培地で希釈した。すべての時間点における細胞の総数に加えて、d1EGFPを発現する細胞数をフローサイトメーター（Becton-Dickinson FACSCalibur System）によって計数した。これらのデータと共に、バックグランド蛍光のための陰性対照として、キャリアのみをトランスフェクトした細胞を使用して、試料におけるd1EGFPを発現する細胞の割合、細胞の総数の変化、およびd1EGFPを発現する細胞数を算出した。細胞数の計算は、希釈を考慮して行った。最後に、誤差値は、流速の揺らぎについてのサイトメーター技術的データに基づいて算出した。
2つの独立した実験を行った。第一に、プラスミド2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS、およびNNVd1EGFPから発現されるd1EGFPの維持を、トランスフェクションの8日間後に解析した。第二の実験において、プラスミド2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS、およびgf10bse2から発現したd1EGFPの維持を、トランスフェクションの13日間後に解析した。
図20および図21から明らかであるように、いずれのベクターまたはキャリアのみをトランスフェクトした細胞の増殖速度にも相違はなかった。これは、細胞分裂の際のd1EGFP発現維持における相違は、トランスフェクトしたベクター自体の影響によって引き起こされるのではないことを意味する。また、アッセイの間に、図20に表した実験における第二の時間点までを除き、細胞の対数増殖が検出された。第一の時間点は、すでにトランスフェクションの19時間後に取られているので、この増殖の遅滞期間は、おそらく細胞のエレクトロポレーションのショックによって引き起こされたものである。
図22および図23に図示したように、ベクターは、細胞において複製されないので、緑色蛍光タンパク質を発現する細胞の割合は、いずれかのプラスミドをトランスフェクトした全ての集団において減少する。しかし、図表において見られるように、陽性細胞の画分は、2wtd1EGFPまたはgf10bse2と比較すると、対照ベクターの場合により迅速に減退する。互いに比較した場合、gf10bse2は、2wtd1EGFP（図23）に対して明らかに利点を有する。対照プラスミド2wtFSd1EGFPとNNVd1EGFPとの間には、維持に顕著な相違がある（図22）。
ベクター間のこれらの相違は、データが、集団においてd1EGFPを発現する細胞の数の変化として表された場合（図24および図25）に、より明白である。対照プラスミドの場合の陽性細胞数は、アッセイの間に顕著に変化していない。対照的に、2wtd1EGFPの場合には、d1EGFPを発現する細胞数は、トランスフェクション後の第一週の間に増加し、対照試料のものよりも約5〜10倍多くなる（図24）。この時間点の後、数は減少し始める（図25）。維持の相違は、gf1Obse2ベクターの場合に最も大きかった。陽性細胞の数は、解析期間の間に連続的に増加する。2週以後、2wtd1EGFPをトランスフェクトした試料よりも6倍高く、フレームシフト変異体をトランスフェクトした集団よりも45倍高い（図25）。
データは、本発明のベクター系が、核アンカータンパク質、すなわちウシの1型パピローマウイルスE2タンパク質およびその結合部位に基づいた活性な分離機構を有し、転写的に活性なエレメントとして、増殖している細胞集団におけるその維持を促進することを明らかに示す。
6.9実施例9：AIRE遺伝子のsuper6wtへのクローニングおよび上皮細胞株における発現
AIREタンパク質（AIRE=自己免疫調節因子）をコードするAIRE遺伝子は、常染色体性の遺伝性症候群APECED（自己免疫多腺性内分泌障害カンジダ症外胚葉性ジストロフィー）において変異している。AIREは、胸腺の延髄における珍しい上皮細胞に、および末梢血における樹状細胞に、および末梢リンパ系器官に発現される。したがって、APECEDは、末梢血樹状細胞にエキソビボで非変異AIRE遺伝子を導入し、続いて修正された樹状細胞を被験者へ導入ことによって治療することができる。この可能性を試験するために、ヒトAIRE遺伝子および相同的なマウスAIRE遺伝子をCOS-1細胞へ導入した。
Super6wtへAIRE遺伝子をクローニングするために、ベクターの大量標品を調製した。まず、製造業者のプロトコルに従って、TOP10細胞（Invitrogenによる化学的にコンピテントとした大腸菌）にSuper6wtをトランスフェクトした。簡単には、細胞を氷上で30分間インキュベートし、その後、+42℃の水浴で30秒間熱ショックを行った。次いで、細胞を直接氷に移して2分間、250μlのSOC培地（2％のトリプトン、0.5％の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgS04、20mMのグルコース）において、+37℃で1時間振盪しながら培養した。
選択のためにカナマイシン（50μg/ml）を使用してLB-プレートにプレーティングを行った。マキシプレップのために、コロニーをカナマイシン（50μg/ml）を含む150mlのLB溶液に移して、+37℃で振盪しながら一晩培養した。製造業者のプロトコルに従ってQiagenプラスミドマキシキットを使用して、マキシプレップ調製を行った。
BamHIおよびSalI制限酵素による消化を、ベクターを確認するために使用した。反応混合液は、500ngのSuper6w、5UのBamHI、5UのSalI、2μlの2XTANGO緩衝液（両方ともFermentasからの制限酵素および緩衝液）、および滅菌水を10μlの総体積で含んだ。消化は+37℃で1時間行った。
消化したベクターを、1μg/ml臭化エチジウムを1×TAE緩衝溶液中に含む1％のアガロースゲルで確認した。
PCR増幅されたAIRE遺伝子およびAire断片のSuper6wtへクローニングするために、4μgのSuper6wtを10UのNotI制限酵素（MBI Fermentas）の2μl酵素緩衝液で消化し、20μlの最終体積に滅菌水を添加した。消化は、+37℃で1.5時間行い、その後1UのZIP酵素（アルカリホスファターゼ）を反応混合液に添加して、さらに30分間インキュベートした。ZIP酵素処理は、ベクターがセルフライゲーションして環状型式へ戻ることを予防することによりベクターにAIRE遺伝子の挿入を容易にするために行った。消化後、ベクターをGFXTM PCR DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia Biotech）を使用して精製し、0.2マイクログラム/マイクロリットルの濃度に溶解した。
また、ヒトおよびマウスAIRE遺伝子のPCR産物をNotI制限酵素で消化した。消化のために26μlのPCR産物、3μlの適切な酵素緩衝液、および10UのNotI制限酵素（MBI Fermentasからの緩衝液および酵素）を使用した。消化は、+37℃で2時間行い、その後PCR産物を精製して、10μlの体積の滅菌水に溶解した。
PCR増幅して消化したヒトおよびマウスAIRE遺伝子をT4DNAリガーゼ（MBI Fermentas）によってSuper6wtにライゲーションした。消化したインサートDNAを取り（10μlの総体積）、1.5μlのリガーゼ緩衝液（MBI Fermentas）、5UのT4DNAリガーゼ、および滅菌水を15μlの終濃度に添加した。ライゲーションは、+17℃で一晩行った。
ライゲーション後、10μlの反応混合液を製造業者のプロトコルに従ってTOP10細胞にトランスフェクトするために採取した。細胞を氷上で30分間インキュベートし、その後+42℃の水浴において熱ショックを30秒間行った。次いで、細胞を直接氷に移して2分間、250μlのSOC培地（2％のトリプトン、0.5％の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgS04、20mMのグルコース）において+37℃で1時間振盪しながら培養した。
トランスフェクトした細菌細胞をLB-カナマイシンプレートにまいて、後日コロニーをカナマイシンを含む2mlのLB培地（1％のトリプトン、0.5％の酵母抽出物、170mMのNaCl）に播種し、+37℃で一晩培養した。
選択したコロニーからのミニプレップDNA標品を、Qiagenプラスミドミディキットを使用して精製し、50μlの体積の滅菌水に溶解した。インサートの存在および大きさは、NotIおよびBamHI消化で確認した。10μlのミニプレップDNAを消化のために採取し、5UのNotIおよび5UのBamHI酵素、2mlのR+酵素緩衝液、および滅菌水を20μlの最終体積に添加した。消化は、+37℃で1時間行った。
インサートの向きをBamHI制限酵素で解析した。10μlのミニプレップDNAを取り、5UのBamHI、2μlのBamHl緩衝液（MBI Fermentas）、および滅菌水を20μlの最終体積に添加した。消化は+37℃で1時間行い、産物は1％アガロースゲルでEtBrの1×TAE溶液によって確認した。
これらの結果に基づいて、マウスAIRE遺伝子を含むプラスミドおよびヒトAIRE遺伝子を含むプラスミドを回収し、マキシプレップ調製した。簡単には、対象となるプラスミドを含む0.5mlの大腸菌細胞懸濁液またはミニプレップ培養物を、カナマイシン（50μg/ml）を含む150mlのLB培地に添加し、+37℃で一晩培養した。マキシプレップDNAは、Qiagenのプラスミドマキシキットを使用して調製した。
マウスAIRE遺伝子を含むプラスミドは、pS6wtmAIREとして設計され、ヒトAIRE遺伝子を含むプラスミドはpS6wthAIREとした。
生じたベクターを両末端から約500bpシーケンスして、インサートの向きおよび正確さを確認した。シーケンシングは、異なる蛍光標識でラベルされた4つの異なる終端ジデオキシヌクレオチド三リン酸を含むPE Biosystem’s Big Dye Terminator RR-mixでジデオキシ法を使用して行った。
AIRE遺伝子を含むプラスミドおよびAIRE遺伝子断片を、選択した細胞株に挿入して、トランスフェクション後にウエスタンブロットによってタンパク質の発現を確認した。
トリプシン-EDTA（Bio Whittaker Europe）溶液でCOS-1細胞を回収し、ダルベッコMEM培地（Life Technologies）に10×106細胞/mlで懸濁し、250μlの細胞懸濁液をトランスフェクションのために採取した。Cos-1細胞のトランスフェクションは、2.5×106、キャリアとしての50μgサケ精子DNA、および5μgの適切なベクターでのエレクトロポレーションを使用して行った。トランスフェクションは、pS6wthAIRE、pS6wtmAIRE、Super6wt、pCAIRE、psiAIRE、およびpCAIRE S1-4で行った。pCAIREおよびpsiAIREは、ヒトAIRE陽性対照であり、pCAIRE S1-4は、マウスAIREの陽性対照であり、Super6wtは陰性対照である。
エレクトロポレーションは、キャパシタンス960μFd、240V、および1パルスでBioradのジーンパルサーを使用して行った。パルス後、細胞を10分間室温で保持し、400μlの培地を添加した。細胞を5mlの培地へ移して、5分間、1000rpmで遠心分離した。細胞をプレーティングして、3日間、+37℃、5％のCO2で培養した。
細胞をトリプシンEDTAで回収して遠心分離した。次いで、細胞を500mlの1×PBS（0.14mMのNaCl、2.7mMのKCl、7.9μMのNa2HPO4、1.5μMのKH2PO4）で一度洗浄した。50μlのPBSおよび100μlのSDS添加液（5％のメルカプトエタノール、16μMのブロムフェノールブルー、20μMのキシレンシアノール、1.6mMのフィコール400）を添加し、細胞を10分間+95℃で加熱した。
ウエスタンブロット解析のために、SDS-PAGEを、SDS泳動緩衝液（25mMのトリス、250mMのグリシン、0.1％のSDS）中に、10％の分離ゲルおよび5％の濃縮用ゲルで調製した。細胞試料およびビオチン化された分子量マーカーをゲルに充填し、150Vで1時間50分電気泳動を行った。ニトロセルロース膜へのタンパク質の転写は、100Vで1.5時間、冷却装置を用いて室温で、転写緩衝液において行った。
膜を、5％ミルクのTBS（0.05Mのトリス-HCl、0.15MのNaCl、pH7.5）溶液で室温において30分間ブロッキングした。一次抗体混合液の抗AIRE6.1（ヒト）および抗AIRE8.1（マウス）抗体の1：100希釈の5％ミルクのTBS溶液を、膜に添加し、4℃において一晩インキュベートした。膜を0.1％のトゥイーンのTBS溶液で5分間を2回およびTBSで5分間を一回洗浄した。二次抗体のビオチン化された抗マウスIgGの1：500希釈の5％ミルクのTBS溶液を室温で1時間インキュベートした。膜を洗浄して、西洋ワサビペルオキシダーゼアビジンDの1：1000希釈の5％ミルクのTBS溶液を添加した。膜を室温で1時間のインキュベートして洗浄した。5mlのクロロナフトール、20mlのTBS、および10μlの過酸化水素のペルオキシダーゼの基質を調製して膜に添加した。発色後、膜をTBSで洗浄して乾燥させた。
ヒトAIREを検出する抗体（抗AIRE6.1）は、pS6wthAIRE、pCAIRE、およびpsiAIREをトランスフェクトしたプレパラートにおけるAIREタンパク質の発現を検出した。マウスAIREを検出する抗体は、同様にpS6wtmAIREおよびpCAIRE S1-4をトランスフェクトした細胞におけるマウスAIREも検出した。陰性対照（Super6wt）では、AIRE/aireタンパク質を示さなかった。
6.10実施例10：NNV-NEF構築物で免疫化したマウスにおける、HIV1 NEFに対する細胞性および液性免疫応答の検出
DNA免疫化
本発明のベクターによる液性免疫の誘導のさらなる研究のために、5〜8週齢の雄および雌のBALB/c（H-2d）マウスを使用した。DNA免疫化のために、マウスには、1.2mgのペントバルビタール（i.p）で麻酔をかけて、プラスミドDNA被覆金粒子を使用して、DNAを剪毛した腹腔の皮膚に接種した。接種は、300psiの圧力を使用するヘリオス遺伝子銃（Helios Gene Gun）（BioRad）で行った。金粒子は、直径1μmで、〜1μgDNA/カートリッジであった。マウスは、0.4μg/マウスまたは8μg/マウスのDNA総量で二回免疫化した（0日および7日において）。対照マウスは、8μgのnef-遺伝子のない単純なベクター、すなわちNNV-deltanefで免疫化した。
血液試料は、最後の免疫化の2週間後にマウスの尾部から採取した。最後の免疫化の4週後にマウスを屠殺し、血液試料（100μl）を、10μlの0.5Mブロッティング（++対+）を含むエッペンドルフチューブに回収し、ELISAにおいて行った（より高いODでは、より高用量の上記カットオフEDTAのマウス）。それぞれのマウスのこれらの試料から、血液の白血球/mlの絶対数を計数した。抗体アッセイ法を行うため、血清を回収して、-20℃で貯蔵した。脾臓を無菌的に除去して、重さを量り、次いでT、B、およびNK細胞アッセイ法並びに染色に使用するために、単一細胞懸濁液にホモジナイズした。
本発明のベクターの液性の免疫原性の検出
ウェスタンブロッティングによるNef特異的抗体の検出のために、本発明のベクター構築物で免疫化したマウスからの血清試料を5％ミルクのTBS溶液に対して1：100希釈し、組換えHIV-1Nefタンパク質で作製したニトロセルロース細片に適用した。ニトロセルロース細片を調製するためには、精製された組換えタンパク質を1％のSDSおよび1％の２-メルカプトエタノールを含む試料緩衝液中で沸騰させ、次いで10％または12.5％のポリアクリルアミドゲルで泳動して、その後0.45μmニトロセルロース紙に転写した。まず、細片を2％BSAの5％の脱脂乳-TBS溶液でブロッキングして、その後で、希釈した血清（1：100）と一晩インキュベートした。インキュベーション後、TBS-0.05％Tween-20で3回および水で2回細片を洗浄することによって未結合のタンパク質を除去した。洗浄後、1：500希釈のビオチン化された抗マウスIgG（Vector Laboratories, USA）を2時間、細片をプロービングした。さらなる洗浄後、1：1000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ-アビジン（Vector Laboratories, USA）を1時間添加し、細片を再び洗浄して、結合抗体を水素ペルオキシダーゼ基質の4-クロロ-1-ナフトール（Sigma, USA）で検出した。
また、血清をELISAで試験して、それぞれの構築物によって誘導される正確な抗体価を決定した。Nef抗体ELISAは、前述したように行った（Tahtinenら、2001）。簡単には、ヌンクマキシソーププレート（Nunc Maxi Sorp plate）を50ngのNef（分離株HAN）で被覆し、2％BSAのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液でブロッキングし、1：100〜1：25000希釈の血清を2つのウェルに添加し、一晩インキュベーションした。広範に洗浄した後、二次抗体のペルオキシダーゼ結合抗マウスIgGまたはIgM（DAKO）を添加して、プレートを2時間インキュベートし、次いで洗浄した。基質（2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸、ABTS、Sigma）のホスフェート-クエン酸塩緩衝液溶液から産生される色彩強度は、Labsystems Multiscan Plus ELISA-プレートリーダーを使用して、405nmで測定した。陽性の抗体反応の光学濃度カットオフ値は、次のように決定した：
カットオフ=OD（xl対称マウス血清）+3SD。
本発明のベクターの細胞性免疫原性の検出
本発明のベクターが、細胞性免疫を誘導する能力を解析するために、T細胞およびB細胞アッセイ法、並びに細胞表面染色を行った。
T細胞増殖アッセイ法
脾臓細胞を10％のFCS（GibcoBRL）、1％のペニシリン-ストレプトマイシン（GibcoBRL）、および50μMのβメルカプトエタノール（Sigma）を添加したRPMI-1640（GibcoBRL）に1×106/mlの終濃度に懸濁した。細胞を、培地のみまたは種々の刺激をして、マイクロタイタープレートにおいて200μl/ウェルでインキュベートした。刺激の終濃度は、以下の通りであった：5μg/mlのConA、1μg/mlおよび10μg/mlの濃度のHIV-Nef-タンパク質、並びに1μg/mlおよび10μg/mlの濃度の陰性対照抗原HlV-gag。全ての反応は4回行った。インキュベーションの第6日目において、それぞれのウェルからの100μlの上清を回収し、サイトカインアッセイ法のために-80℃で貯蔵した。回収の6時間前に、1μCiの3H-チミジン（Amersham Pharmacia Biotech）をそれぞれのウェルに添加した。細胞を回収して、取り込まれた放射活性（cpm）を、シンチレーションカウンターで測定した。刺激インデックス（SI）を以下のように算出した
SI=平均実験cpm/平均培地cpm
リンパ球活性化
TおよびB細胞活性化は、新鮮な脾細胞を抗CD3-FITCと抗CD69-PE（初期の活性化マーカー）、および抗CD19-FITCと抗CD69-PE抗体（全てPharmingenから）で二重表面染色することによって検出した。染色は、フローサイトメーター（FACScan, Becton Dickinson）で解析した。
CTLアッセイ法
マウス脾細胞を、固定した抗原提示細胞（MVA-HIV-nefまたは対照MVA-F6を感染させたP-815の細胞）と共に5日間培養し、MVA-HIV-nef感染細胞または対照標的細胞に対して標準的な4時間の51クロム放出アッセイ法で試験した［Hiserodt, J.ら、J Immunol 135（1995）53-59; Lagranderie, M.ら、J Virol 71（1997）2303-2309）］。CTLアッセイ法において、10％以上の特異的な細胞溶解は、陽性であると考えられた。
サイトカインアッセイ法
免疫化されたマウスがTh1型またはTh2反応を発症するかどうかを解析するために、抗原刺激した細胞培養上清からのIFN-γおよびIL-10を測定した。上記の通りに、抗原刺激した細胞から上清を回収した。免疫化したマウスの血清におけるプロ炎症性サイトカインTNF-αおよびIL-10を測定した。全てのサイトカインは、市販のELISAキット（Quantikine, R & D Systems）で測定した。
自発的増殖
自発的な脾臓細胞の増殖は、6日間だけ培地において培養した細胞の3H-チミジン取込みによって検出した。
抗二本鎖（ds）DNA抗体
免疫化したマウス、陽性対照マウス（mrl/lpr、Dr. Gene Shearer, NIH, USAからの寄贈）、および正常マウスの血清において、dsDNA抗体を測定した。ポリ-L-リジン結合ラムダファージdsDNAにおけるELISAにより抗体をアッセイした。結果を表2および表3に示す。
表2は、HIV-NefプラスミドDNAで免疫化したマウスの完全な免疫学的結果を示す。インビトロにおけるT細胞刺激のために使用したHIV-1Nef組換えタンパク質は、それぞれの免疫化した群の細胞の非HIV特異的な一部の増殖を誘導したが、0.4μgのプラスミドで免疫化したマウスの平均SI（平均SI=72,2）が、その他のものと比較して有意に増加した。さらに、陰性対照タンパク質HIV-gagは、T細胞応答を全く誘導しなかった。nef特異的な増殖を有する群のマウスのT細胞だけが、nef特異的にIFN-γを産生した。免疫化したマウスのいずれも、IL-10産生細胞を有しなかったことから、免疫化したマウスのT細胞応答は、Th1型であり、およびTh2型ではないことを示す。T細胞応答とは対照的に、より高い濃度のnefプラスミドDNA（8μg）で免疫化したマウスは、0.4μgで免疫化したマウスと比較して、より強いB細胞応答を有し：より高い用量で免疫化したマウスの液性応答は、最後の免疫化の3週後にすでに検出可能であり、検出された応答は、両方ともウエスタンおいてより強かった。検出された抗体はIgG-クラスに属し、IgM応答は検出されなかった。いずれのマウスも、E2特異的な抗体を発生しなかった。
0.4μgのHIV-nefプラスミドDNAと免疫化したマウスは、その他の免疫化したマウスおよび正常マウス（3.8×106/ml）（表3）の群と比較して、末梢血において多くの白血球数（6.38×106/ml）を有した。同じマウスは、その他のマウス（9％および10％）と比較して、2倍多くの活性化したT細胞を有した（21％、CD3+CD69+）。Nefに応答する陽性T細胞を有するマウスは、それらの脾臓に多数の活性化したT細胞を有したので、この所見は、HIV-Nefに応答する陽性のT細胞と相関変換がある（表2）。表3の結果は、免疫化したマウスでは陽性対照血清と比べて（OD=1,208）、抗dsDNA抗体を発生しないことから、免疫化には副作用がないことが示される。
（表２）
Figure 2010042000
*SI＝刺激インデックス
nt＝試験せず
-、陰性
+、陽性
++、強い陽性
（表３）
Figure 2010042000
正常マウスの平均WBC=3.8×106/ml
nt＝試験せず
dsDNA陽性対照血清のODは1.208である（1：10希釈）
6.11.実施例11：HIVに感染した患者における原型HIVワクチンGTU-NEFの安全性および免疫原性
NNV-2-Nefワクチンの産生（NNV-2またはNNVwt-2を使用したかどうかの検査）
治験ワクチンNNV-2-Nefは、製造ライセンス番号LLDnro756/30/2000（医薬品ためのフィンランド国家機関により2000年12月21日に発行）を用いて実施例2に従って調製した。
製造方法は、最新の優良医薬品製造基準（cGMP）の要求を満たし、第I相およびII相の臨床研究に適したプラスミドDNA標品を提供した。製造方法は、4つの工程からなる：
a）マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクの確立、
b）発酵、
c）精製、
d）ワクチンの無菌充填。
詳細には、NNV-2-Nefを大腸菌細菌で産生した。大腸菌DH5αT1ファージ耐性細胞株を含むマスターセルバンク（Master Cell Bank：MCB）およびワーキングセルバンク（Working Cell Bank：WCB）は、純粋に培養されおよび放出された研究セルバンクから特定の標準的な処理手順に従って確立した。
a）マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクの確立
セルバンク系を確立するための模式的な手順を以下に例示する：
研究セルバンクの1つのバイアルを解凍する［NNV-2-Nefプラスミドで形質転換された大腸菌DH5αT1ファージ耐性細胞株（Gibco RBL）］。
改変ルリアベルターニ（Luria Bertani）培地プレート（25μg/mlのカナマイシンを含む）に培養物を接種する。
37℃で一晩（14〜16時間）インキュベートする。
プレートから単一コロニーを選択し、50mlの改変ルリアベルターニ培地（25μg/mlのカナマイシンを含む）へ接種する。
37℃で一晩（14〜16時間）インキュベートする。
細菌培養物の光学濃度を測定する（OD600=2.0〜6.0）。
細菌培養物へグリセロールを添加する。
培養物-グリセロール混合液をアリコートに分割する。
ラベルし、マスターセルバンクを貯蔵する。
同じ流れ図に続き、開始材料としてマスターセルバンクの1バイアルを使用して、ワーキングセルバンクを確立した。MCBおよびWCBにおいて行ったルーチンテストは、以下の通りであった：微生物学的な特徴付け、汚染の不存在、レプリカ平板法によるプラスミド安定性、およびプラスミド同一性の評価（制限酵素消化およびシーケンシング）。
b）発酵
まず、発酵において、NNV-2-Nef（WCB）で形質転換したDH5αT1ファージ耐性大腸菌株（Gibco RBL, UK）をプレートにおいて培養した。発酵反応器で実際に発酵する前に、プレートから単一のコロニーを100mlの液状前培養物に接種した。発酵は、流加培養系に基づく51の発酵槽（B.Braun Medical）において行い、その後、細胞を回収した。1リットルの培養液の組成は、7gの酵母抽出物、8gの大豆ミール由来のペプトン、10gのNaCl、800mlの注射のための水（WFI）、1NのNaOH pH7.0、50mg/mlのカナマイシン（Sigma）、シリコン抗発泡剤（Merck）、1MのK2PO4（BioWhittaker）を含んだ。
発酵運転を開始する際に、1mlの試料を回収管を介して採取し、最初の菌体密度（OD600）を決定した。発酵培地に接種するために、前培養物を使用した。発酵の間、新しい培地および1Mのリン酸カリウム緩衝液（pH6.5〜7.3）を反応器にポンプで供給した。培地の添加により、必須栄養素が尽きる前にこれらを補充することができ、リン酸緩衝液により、pHが一定に維持される。発酵工程は、運転を約5時間続けて、発酵が終わったとき（約10時間の発酵後）に1mlの試料を上記のように採取し、菌体密度を測定した。発酵後、培地を遠心分離し（10,000rpm、30分間、+4℃）細菌ペレット（50g〜60g）を回収した。
c）精製
DNAの精製のために使用した方法は、QIAGENプロセススケール技術（Qiagen Plasmid Purification Hnadbook 11/98）に基づいた。NN2-Nefは、以下の工程を使用して精製した：
再懸濁緩衝液（100〜150ml、RT）に細菌ペレットを再懸濁する
溶解緩衝液（100〜150ml、5分、RT）で溶解する
中和緩衝液で中和する（100〜150ml、+4℃）
インキュベートする（30分、+4℃）
遠心分離する（10,000rpm／分、30分間、+4℃）
上清を濾過する（0.22μm）
エンドトキシン除去緩衝液（60〜90ml）によりエンドトキシンを除去する
平衡化緩衝液でUltrapureカラムを平衡化する（350ml、10ml/分の流速）
可溶化液をカラムに充填する（4〜6ml/分の流速）
洗浄緩衝液でカラムを洗浄する（3l、一晩、46ml/分の流速）
溶出緩衝液でプラスミドDNAを溶出する（400ml、3.1ml/分の流速）
溶出物を濾過する（0.22μm）
イソプロパノールでDNAを沈殿させる
遠心分離する（20000g、30分間、4℃）
プラスミドDNAを精製する
精製に使用した緩衝液は、以下の通りである。再懸濁緩衝液は、50mMのトリス-Cl、pH8.0さらにRNaceA（50mg）を含み；細胞溶解緩衝液は、200mMのNaOHであり；中和緩衝液は、３M酢酸カリウム、pH5.5であり；エンドトキシン除去緩衝液は、750mMのNaCl、10％のトライトンX100；50mMのMOPS、pH7.0を含み；平衡化緩衝液は、750mMのNaCl、50mMのMOPS、pH7.0を含み；洗浄液緩衝液は、1MのNaCl、50mMのMOPS、pH7.0、15％イソプロパノールを含み；および、溶出緩衝液は、1.6MのNaCl、50mMのMOPS、pH7.0、15％イソプロパノールを含んだ。
d）無菌充填
最終的なバルクを表す精製したDNAを、無菌の0.9％の生理食塩液に溶解して、1mg/mlの終濃度にし、同日のうちに濾過滅菌（0.22μm）した。精製したバルクを、蒸気殺菌したFinnpipette（登録商標）および無菌のエンドトキシンフリーチップを使用して、手動でショットタイプ(Schott Type)1・ガラスバイアル・プラスに充填した（充填体積0.5ml）。NN2-Nefワクチンを充填したバイアルは、特定の標準的な処理手順（SOP）に従って直ちに封止し、ラベルをつけて包装した。
2.患者に対する試験ワクチンの投与
非常に積極的な抗レトロウイルス治療法（HAART）を受けている10人のHIV-1感染患者には、HIV-1Nef遺伝子（クレードB）を発現した実験的なDNAワクチンNN2-Nefで免疫化した。免疫化のために、殿筋に2回の筋肉内投与を2週間隔で投与した。用量は、1および20マイクログラム/注射であった。血液試料を-4、0、1、2、4、8、および12週に抜き取った。液性の免疫応答（ELISA、ウエスタンブロット）および細胞媒介性の免疫応答（T細胞サブセット、T細胞増殖、ELISPOT、サイトカイン発現、細胞内サイトカイン）について試料を解析した。
研究に参加したそれぞれの患者に臨床検査を行った。臨床検査は、患者との面接（既往歴）および体重測定を含んだ。心機能および肺機能を聴診法および打診法によって確認し、血圧および心拍数を記録した。リンパ節、肝臓、および甲状腺の肥大を触診法によって決定した。
ワクチンの安全性を評価するための実験室試験は、それぞれの来診により行われた。これらの試験は以下を含む。
組織学：赤血球数、ヘモグロビン、総WBCおよびWBC差、血小板数、ベースラインのプロトロンビン時間および活性化された部分トロンボプラスチン時間；平均の赤血球微粒子量、並びにヘモグロビン含量を算出した。
免疫学：核およびds-DNA抗体。
血清化学：総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、SGOT/SLT、またはSGPT/ALT、血清クレアチニン、タンパク質電気泳動、総血清コレステロール、トリグリセリド、グルコース（ベースラインで）、ナトリウム、カリウム、およびカルシウム。
尿解析：尿試験紙タンパク質、グルコース、ケトン、潜血、胆汁色素、pH、比重、および尿試験紙測定が1つまたは複数の異常な値を示した場合は、尿沈渣（RBC、WBC、上皮細胞、細菌、円柱）の検鏡。
ウイルス性負荷：1log10よりも多い増加では、2週後に確証的なウイルス性負荷の評価が行われるべきである。
いずれの患者も、ワクチン接種に自覚的なまたは客観的な副作用を受けなかった。ワクチン接種期間の間に繰り返し行った臨床化学試験（詳細は材料および方法を参照されたい）のパネルでは、有害な実験室異常は観察されなかった。
以下の免疫学的な研究を行った。
リンパ球増殖アッセイ法（LPA）
末梢血単核細胞（PBMC）をフィコール-ハイパック（Ficoll-Hypaque）密度勾配（Pharmacia）遠心によってヘパリン処理した静脈血から単離して、5％のプールされた熱不活性化したAB+血清（Sigma）、抗生物質（100μg/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン；Gibco）、およびL-グルタミン（完全培地、CM）を補ったRPMI1640培地（Gibco）に1×106細胞/mlで再懸濁した。次いで、それぞれ4つの培養物を平底マイクロタイタープレート（1×105PBMC/ウェル）に準備し、細胞を以下の刺激の有無において6日間インキュベートした：rNef（0.2、1、および5μg/ml）、GST（0.2、1、および5μg/ml）、ツベルクリンPPD（PPD 12.5μg/ml；Statens Seruminstitut）、カンジダ-アルビカンス抗原（20μg/ml；Greer Laboratories）、およびフィトヘムアグルチニン（PHA；5μg/ml；Life Technologies）。インキュベーション期間の最後の6時間に、3H-チミジン（1pCi/ウェル；Amersham）を培養に添加して、細胞をグラスファイバーフィルタの上へ回収し、取り込まれた放射活性をγカウンターで測定した。結果は、デルタcpm（抗原の存在下におけるcpm／抗原の存在しないcpm）、または刺激指数（抗原の存在下におけるcpm／抗原の非存在下におけるcpm）として表す。
結果を図26および図27に示す。ワクチン接種を受けたいずれの人も、試験抗原（ワクチン接種前のHIV1 Nef）に対して有意なT細胞増殖反応を示さなかった。対照的に、1マイクログラム用量の試験ワクチンを受けた群の5人のワクチン接種を受けた人のうち2人（患者1および3）（図26）、および20マイクログラムの試験ワクチンを受けた群の5人のワクチン接種を受けた人のうち2人（患者9および10）（図27）は、最初のワクチン接種後に、強力なT細胞増殖反応を示した。1マイクログラムの群では、2回目のワクチン接種の後、ワクチン接種を受けた人の1人（患者2）が応答した。
IFN-γアッセイ法
ワクチンによって誘導される免疫応答（Th1/Th2）の型は、PBMCを抗原（rNef、rGST、PPD）またはマイトジェン（PHA）で刺激した後に6日後の培養液上清に放出されるインターフェロンγ（IFN-γ）を測定することによって評価した。測定のためには、市販のELISAキット（R & D Quantikine）を使用した。アッセイ法には、IFN-γに特異的なモノクローナル抗体がマイクロプレート上にコートされた、定量的サンドイッチ酵素免疫アッセイ技術を使用する。標準および試料をウェルに注入し、存在する任意のIFN-γを固定した抗体で結合する。未結合の物質を洗い流した後、IFN-γに特異的な酵素結合ポリクローナル抗体をウェルに添加する。未結合のあらゆる抗体酵素試薬を除去するために洗浄した後、基質溶液をウェルに添加して、最初の工程で結合したサイトカインの量に比例して発色させる。発色現像を停止して、色の強度を測定する。
患者＃1に由来するIFN-γ反応データを図28に示す。参照することができるように、ワクチン接種を受けた人は、T細胞増殖と相関した著しいIFN-γ応答によりrNef抗原と反応したことから、ワクチン接種を受けた人において見られる応答は、実際にはTh1型であることが示された。
HIV-1感染は、全てのHIVタンパク質に対する細胞媒介性の免疫応答が、低いか、または全く欠如することを特徴とする。結果は、非常に低用量のDNAワクチンNN2-Nefでこのような患者に強力なCMIを誘導することができることを示す。使用した用量は、DNAワクチンに一般に必要とされるもので最小であった。したがって、たとえばMerchは、彼らの実験的なHIVワクチンでの良好な結果を最近発表したが、必要な用量は、1000〜5000マイクログラムであった（IAVI報告、2002）。
6.12実施例12：エプスタイン・バーウイルス（EBV）EBNA-1タンパク質を発現し、かつEBNA-1（FRエレメント）の20結合部位を含むプラスミドの構築
エプスタイン・バーウイルス（EBV）EBNA-1タンパク質を発現し、かつEBNA-1（FRエレメント）の20結合部位を含むプラスミドを作製するために、まず、BPV-1 E2結合部位をEBV EBNA-1結合部位（DSエレメントを有さないoriP）で置換した。プラスミドFRE2d1EGFP（図29）は、pEBO LPPプラスミド（図29A）（断片は、EBNA-1の20結合部位を含む）のXmiI（AccI）/Eco321（EcoRV）DNA断片（クレノウ酵素で平滑末端にした）を単離して、これを平滑末端ライゲーションによってs6E2d1EGFP（図29B）（クレノウ酵素で平滑末端にした）のSpeI/NheI部位に挿入することによって構築した。構築したプラスミドFRE2d1EGFP（図29）は、さらなる実験において陰性対照として使用した。これは、BPV1E2 10結合部位の代わりにEBNA-1タンパク質の結合部位を含み、E2を発現するが、EBNA-1は発現しない。
次に、FRE2d1EGFPプラスミドのBPV-1E2タンパク質をコードする配列を、以下のように、EBV EBNA-1タンパク質をコードする配列で置換した。pEBO LPPプラスミドのXmiI（AccI）/EcoRI断片を単離して、クレノウ酵素で平滑末端にして、FRE2d1EGFPプラスミド（クレノウ酵素で平滑末端にした）のXbaI/XbaI部位に挿入した。XbaI部位の1つがメチル化感受性であるので、ベクターFRE2d1EGFPは、Damメチル化を欠損する大腸菌株DH5aにおいて予め増殖した。構築したプラスミドFREBNAdlEGFP（図30）は、EBNA-1タンパク質を発現し、かつEBNA-1の20結合部位を含む。
発現のために、ジャーカット細胞、ヒト胎生期腎臓細胞株293（ATCC CRL1573）およびマウス繊維芽細胞系3T6細胞（ATCC CCL96）を、10％のウシ胎児血清（FCS）を添加したイスコフ修飾ダルベッコ培地（IMDM）中で維持した。4,000,000細胞（ジャーカット）、75％コンフルエントな状態のディッシュ（293）、または75％コンフルエントな状態のディッシュの1/4（3T6）を、それぞれトランスフェクションのために使用し、これを次のようにエレクトロポレーションを行った。細胞は、遠心（1000rpm、5分、20℃、Jouan CR422）によって回収し、5mMのNa-BES緩衝液（pH7.5）を含む完全培地に再懸濁した。250μlの細胞懸濁液の細胞を50μgのキャリアDNA（サケ精液DNA）および1μg（ジャーカットおよび3T6の場合）または5μg（293の場合）のプラスミドDNAと混合し、ジャーカット細胞については200Vおよび1000μFで、293細胞については170Vおよび950μFで、並びに3T6細胞については230Vおよび975μFでエレクトロポレーションをした。トランスフェクトしたジャーカット細胞を6cmのディッシュに5mlの培地でまき；トランスフェクトした293および3T6細胞の1/3を、6cmのディッシュに5mlの培地でまき、細胞の2/3を10cmのディッシュに10mlの培地でまいた。
d1EGFPタンパク質（修飾された増強緑色蛍光タンパク質）の発現について、トランスフェクトした細胞を解析した。構築した全てのプラスミドは、d1EGFPタンパク質を発現し、これはフローサイトメーターを使用して蛍光を測定することによって検出した。d1EGFPタンパク質の半減期は短いため、これは蓄積されず、このタンパク質の発現は、細胞における転写的に活性なプラスミドの存在を反映する。Becton Dickinson FACS Caliburシステムを使用した。ジャーカット細胞懸濁液の体積は、それぞれの時間点（約24時間後毎）前に測定し、体積が5ml未満の場合、なくなった培地の体積を添加した。細胞懸濁液密度に依存して、測定のための適切な体積（1mlまたは2ml）を採取し、同じ量の培地で置換した。これは、後で希釈を算出したときに考慮に入れた。
最初の時間点において、6cmのディッシュからの293細胞を5mlの培地において懸濁した。以後の時間点毎に、細胞の半分を10cmのディッシュから採取して5mlの培地に懸濁し、次いで計測した。細胞懸濁液の残りには、適切な体積を添加した。最初の時間点において、6cmのディッシュからの3T6細胞を1mlのトリプシンに懸濁し、次いで100μlのFCSで不活性化した。以後の時間点毎に、10cmのディッシュからの細胞を2mlのトリプシンに懸濁した。この懸濁液のうち1mlを上記したように処理した。9mlの培地を残りの懸濁液に添加した。解析する細胞は、インキュベータから測定の直前に取りだした。適切な流速（500〜1000細胞/秒）は、キャリアDNAのみをトランスフェクトした細胞を対照として使用し、それぞれの時間点の前に決定した。大きさ、表面構造、および細胞の蛍光を測定するために、3つの異なるパラメーターを使用した。
結果を図31にグラフとして示す。キャリアDNAのみをトランスフェクトした細胞を細胞株の自己蛍光を測定するために使用した。この自己蛍光の1％は、バックグランド蛍光であると考えられ、後でd1EGFP蛍光から差し引いた。受け取ったデータは、Microsoft Excelプログラムを使用して解析した。
d1EGFPを発現する細胞の割合は、キャリアのみをトランスフェクトした細胞をバックグランド蛍光の陰性対照として使用し、稀釈を考慮して算出した。図33に示すように、2つのベクターは、細胞において異なる速度を維持した。
d1EGFPを発現する細胞の数は、キャリアのみをトランスフェクトした細胞をバックグランド蛍光の陰性対照として使用し、希釈を考慮して算出した。図53に見られるように、EBNA-1を発現し、かつEBNA-1特異的な多量体結合部位を有するプラスミドは、トランスフェクトした細胞において非常に効率的に維持される。トランスフェクションの1日後、約8×104細胞が、EGFPを発現した。8日目に、維持ベクター（FREBNAd1EGFP）の場合、プラスミド陽性のd1EGFPを発現する細胞の数は、10倍の8×105に増加した。EBNA-1発現（FRE2d1EGFP）を欠損するか、またはEBNA-1結合部位を有していないプラスミドでは、プラスミド陽性細胞の数は、維持されるか、または多くの場合減少した。この事実は、エプスタイン・バーウイルスを分離／分割するための機構を反映する。EBNA-1が発現され、かつプラスミドがEBNA-1結合部位を有する場合に、EBNA1およびEBNA-1結合部位による維持および分離機能は、プラスミドに維持機能を提供する。同じ機構および同じ成分は、生活環の潜在期におけるエプスタイン・バーウイルスに対し、実際に分離機能を提供する。
また、同様の結果が、ヒト胎生期細胞株293およびマウス細胞株3T6においても得られた（図34）。293細胞および3T6細胞の維持のための対照として、s6HPV11および2wtFSをそれぞれ使用した。
6.13実施例13：GTU-1-MULTIGENEベクターの免疫原性
GTU-MULTIGENEベクターの免疫原性
実施例12で調製した6つの異なる多重遺伝子ワクチン構築物、すなわちGTU-1-RNT、GTU-1-TRN、GTU-1-RNT-CTL、GTU-1-TRN-CTL、GTU-1-TRN-optgag-CTL、およびGTU-1-TRN-CTL-optgagベクターの免疫原性をマウスにおいて試験した。ベクターをTOP10またはDH5α細胞に形質転換し、市販のQiagenカラムを使用してメガプレップを調製した。エンドトキシンは、Pierceエンドトキシン除去ゲルで除去した。
試験物品は、製造業者（Bio-Rad）によって提供された説明書に従って、少し改変して1μmの金粒子に被覆した。Balb/cマウスは、ヘリオス遺伝子銃により、400psiの圧力で0.5mgの金/カートリッジを使用して免疫化した。マウスは、0、1、および3週において3回免疫化した。最後の免疫の2週後にマウスを屠殺した。
マウスを6つの試験群に分け（5匹のマウス/群）、次のように3×1μgDNAを受けさせた：
群1.GTU-1-RNT
群2.GTU-1-TRN
群3.GTU-1-RNT-CTL
群4.GTU-1-TRN-CTL
群5.GTU-1-TRN-optgag-CTL
群6.GTU-1-TRN-CTL-optgag
群7.DNAがロードされていない空の金粒子を免疫化したマウス対照
液性応答は、それぞれのマウスの尾部-血液試料から行った。最初の予備免疫試料は、最初の免疫化が行われる前に麻酔をかけたマウスから採取した。2回目の試料は、三回目の免疫化の前に麻酔をかけたマウスから採取した。屠殺時には、総血液試料を白血球計数のために使用し、血清を液性免疫試験のために回収した。
標準的な手順を使用するELISAで、抗体について血液試料を試験した。ヌンクマキシソーププレートを100ngのNef、Rev、Tat、Gag、CTL、またはE2タンパク質でコートしてブロッキングし、1：100希釈で血清を2つのウェルに添加して一晩インキュベーションした。洗浄後、プレートを希釈した（1：500）二次抗体、ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG（DAKO）と2時間インキュベートした。基質（2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）（ABTS）のリン酸-クエン酸緩衝液）から産生される色の強度を、Labsystems ELISA プレートリーダーを使用して405nmで測定した。
全てのベクターが全てのマウスにおいてNef抗体を誘導したが、いずれのマウスもE2、CTL、またはRev抗体を示さなかった（図35、図36、および表4）。また、GTU-1-RNTまたはGTU-1-RNT-CTLで免疫化した数匹のマウスでは、Tat抗体を生じた（図36および表4）。さらに、optgag配列を含むベクターで免疫化したマウスも、Gag抗体を生じたが、構築物GTU-1-TRN-optgag-CTLは、構築物GTU-1-TRN-CTL-optgagよりも優れた抗体誘導因子であった（図37および表4）。誘導された抗体は、主に遺伝子銃による免疫で通常見られるTh2型の応答を示すIgG1クラスのものであった。以下に示した抗体アッセイ法は、マウスを屠殺するときに回収した血清から行った。
結果は、多重遺伝子構築物がいくつかのHIV遺伝子を融合タンパク質として発現し、大部分の遺伝子産物に免疫応答を誘導することができることを示す。しかし、融合タンパク質の多重遺伝子および対応するタンパク質の向き並びに順序は、結果に劇的に影響を及ぼした。したがって、Tatに対する応答は、Tat遺伝子が融合タンパク質の内側に置かれたとき（RNTモチーフを有するベクター）にのみ見られ、Tatがアミノ末端タンパク質に置かれた場合（TRNモチーフを有するベクター）は見られなかった。Gagタンパク質に対する応答は、GagがThおよびCTLエピトープの範囲を含むCTLの前に配置されたベクターにおいてのみ見られた。
（表４）免疫III AマウスELISAの結果（5匹のマウスの平均OD）
Figure 2010042000
6.14.実施例14：種々の組み合わせにおけるNef、Rev、およびTatを発現するハイブリッドタンパク質の発現（multireg）
HIV多重遺伝子ベクターの産生のために、マルチクローニング部位を有するGTU-1ベクター（図38A）をバックボーンとして使用した。無処理のNef、RevおよびTatをコードする配列をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅して、様々な順序で多重調節（多重調節；multireg）抗原をコードするリーディングフレームに互いに結合した（Nef-Tat-Rev、Tat-Rev-Nef、Rev-Tat-Nef、Tat-Nef-Rev、およびRev-Nef-Tat、；それぞれ配列番号：1〜5）。これらの配列をGTU-1ベクターのBsp119IおよびNotI部位にクローニングした。
同様に、Nefタンパク質を発現するGTU-2およびGTU-3ベクター（図38Bおよび図38C；NNV-2wtについては図6Bも参照されたい）も、HIV多重遺伝子ベクターを産生するためのバックボーンとして使用した。加えて、不安定化した増強緑色蛍光タンパク質またはd1EGFPを発現するベクターsuper6w（super6wtd1EGFP；図17および図38D）、並びにEBNA-1タンパク質およびその結合部位を利用するプラスミド（FREBNAdlEGFP；図38E）を、遺伝子導入単位（GTU）プラットフォームとして使用した。対照の「非GTU」ベクターのためには、Revを発現する規則的なサイトメガロウイルス（CMV）ベクターNNV-RevおよびプラスミドEBNA-1およびE2BS含有d1EGFPプラスミドをバックボーンとして使用した（NNV-RevおよびE2BSEBNAd1EGFP、それぞれ；図38Gおよび図38F）。
種々のGTU-2およびGTU-3ベクター（pNRT、pTRN、pRTN、pTNR、およびpRNT；並びにp2TRNおよびp2RNT；並びにp3RNT、それぞれ図39A〜E、図39F〜G、および図39H）を調製するために、ベクターGTU-2NefおよびGTU-3NefのNef遺伝子を、NdeIおよびPagI部位を使用して、それぞれの多重調節抗原によって置換した。配列の名前の文字N（ef）、R（ev）、およびT（at）は、多重遺伝子におけるタンパク質のそれぞれのコード配列の位置を示す。また、多重抗原またはE2コード配列のいずれかの後にSalI部位に配置されたIRESエレメントを含む2つのベクターを調製した（それぞれpTRN-iE2-GMCSFおよびpTRN-iMG-GMCSF；図39Iおよび図39J）。マウスの顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）をコードする配列の翻訳を制御する後者の配列を、IRESと共に導入された単一のBspTI部位にクローニングした。
加えて、ポリタンパク質を確立するために調節タンパク質の免疫主体部分のみを使用した一組のベクターを、GTU-1のBsp119IおよびNotI部位にクローニングした（pMV1NTR、pMV2NTR、pMV1N11TR、およびpMV2N11TR；図40A〜D）。pMV2構築物の場合には、多重抗原領域を切り離す細胞内プロテアーゼによって消化することができるリンカーは、異なる調節タンパク質に由来する。
さらに、gag遺伝子によってコードされる構造タンパク質または先に述べたCTLエピトープによって構成される人工のポリタンパク質を発現するGTU-1、GTU-2、およびGTU-3ベクターを調製した。コード配列をBsp119IおよびNotIで消化したPCR断片としてGTU-1ベクター（pCTL=BNmCTL、pdgag=pBNdgag、psynp17/24=pBNsynp17+24、poptp17/24=pBNoptp17/24；図41A〜D）にクローニングし、NdeI-PacI断片でGTU-2（p2mCTLおよびp2optp17/24；図41EおよびF）、およびGTU-3（p3mCTLおよびp3optp17/24；図41GおよびH）に移した。
CTLとして消化したコーディングセグメント（配列番号：10）は、以前に同定した多くのCTLエピトープを含むpolおよびenv領域からの断片を含む。コドンの選択性は、ヒト細胞において頻繁に使用されるコドンのみが含まれるように最適化する。また、このコード配列は、能力アッセイに使用されるよく特徴付けられたマウスCTLエピトープおよび抗マウスCD43抗体による認識のためのエピトープを含む。また、ドミナントSIVp27エピトープは、マカクにおける能力の研究の使用に含まれた。
dgagは、切断された、Han2単離体のgag領域のp17（13aaで開始）+p24+p2+p7（p1およびp6は除外）（配列番号：11）を含む。synp17/24（配列番号：12）は、Han2 HIV-1のp17+p24ポリペチドをコードする。コドンの使用は、ヒト細胞に最適であるように改変される。また、以前に同定したAUリッチのRNA不安定エレメントは、この方法によって除去された。optp17/24のコード（配列番号：13）領域はsynp17/24と非常に類似し、その中に作製された2つの同義変異は、タンパク質組成を変化させないが、潜在的なスプライシング供与部位を除去する。
さらに、単一のポリタンパク質として多重調節抗原および構造上の抗原を含む一組の多重HIVベクターを作製した：pTRN-CTL、pRNT-CTL、pTRN-dgag、pTRN-CTL-dgag、pRNT-CTL-dgag、pTRN-dgag-CTL、pRNT-dgag-CTL、pTRN-optp17/24-CTL、pTRN-CTL-optp17/24およびpRNT-CTL-optp17/24；p2TRN-optp17/24-CTL、p2RNT-optp17/2-4CTL、p2TRN-CTL-optp17/24、p2RNT-CTL-optp17/24、p2TRN-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF、およびp2RNT-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF；並びにp3TRN-CTL-optp17/24、p3RNT-CTL-optp17/24、p3TRN-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF、およびp3RNT-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF（図42A〜T）。
クローニングのために、第一の工程として、停止コドンを調節性多重抗原コード配列から除去した。次いで、構造抗原コード配列を、NotI部位が再構成されるようにフレームの末端のNotI部位にクローニングすることによって添加した。
CTLおよびgagの両方が添加される場合、第一の抗原コード配列は停止コドンなしとした。通常、クローニングはGTU-1の環境において行い、GTU-2（p2...）およびGTU-3（p3...）ベクターをそれぞれ作製するためには、プラスミドGTU-2NefおよびGTU-2NefのNef遺伝子をNdeIおよびPagIの部位を使用して置換した。しかし、RNT-optp17/24-CTL抗原は、直接GTU-2ベクターに構築した。
HIV多重抗原は、Eco105IおよびNotIのための部位を使用して、d1EGFPの代わりにベクターsuper6wtd1EGFPおよびFREBNAd1EGFPにクローニングした（super6wt-RNT-CTL-optp17/24およびFREBNA-RNT-CTL-optp17/24；それぞれ図43Vおよび図42U）。示した場合、IRESおよびマウスmGM-CSFは、GTU-2およびGTU-3ベクターに、E2コード配列の後のpTRN-iE2-mGMCSF（同じ制限部位を使用して切断）からの部位Mph1103IおよびEco91Iにクローニングした。
最後に、EBNA-1を利用する系（E2結合部位を有するEBNA-1発現カセットを含む）のための「非GTU」対照ベクターE2BSEBNA-RNT-CTL-optp17/24（図42W）は、FREBNA-RNT-CTL-optp17/24と同様の方法で作製した。多重HIV抗原（図42D）を発現する規則的CMVベクターpCMV-RNT-CTL-optp17/24は、NdeIおよびPagIのための部位を使用してそれぞれのGTU-1ベクターから多重HIVコーディング断片をクローニングすることによって作製した。
6.15.実施例15：調節タンパク質の免疫主体領域のみを有する多重調節抗原の発現特性
1.多重調節抗原の細胞内局在
本発明のベクターによって発現される多重調節抗原の細胞内局在は、本質的に実施例4にて説明したように、Nef、Rev、およびTatタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用するRD細胞におけるインサイチュー免疫蛍光法によって研究した。結果は、表5に要約し、図45に例示してある。無処理のNef、Rev、およびTatタンパク質を含む全ての抗原は、細胞質に独占的局在を示した。N（ef）T（at）R（ev）として、初めに設計された異所性のタンパク質はRev配列の前フレームシフトを有し、核のみに局在を示した。調節タンパク質の切断配列を有する多重調節抗原は、細胞質に局在性であった。この場合、「封入体」様の異なった構造がしばしば観察された。同じことが抗原についてもあてはまり、これはpMV2ベクターから発現されたプロテアーゼ部位を有した。しかし、これらの場合にも、細胞核においてタンパク質が検出された（図45）。
（表５）多重調節抗原における細胞内局在
Figure 2010042000
dgagおよびp17+p24タンパク質の細胞内局在は、また、RD細胞においてモノクローナル抗p24抗体での免疫蛍光法によって解析した。ジャーカット細胞におけるウエスタンブロットの結果によれば、dgagは検出することができない。しかし、p17/24のタンパク質は、形質膜における局在を示した（図45）。CTLタンパク質の局在は、適切な抗体が利用できなかったので解析しなかった。
6.2実施例15：組換えgag抗原およびPOLからの細胞毒性T細胞エピトープ（CTL）をコードするベクターの解析
6.2.1. 発現
CTLcdsまたはgag領域からのタンパク質を発現するベクターの発現解析は、ウエスタンブロットによって行った。図46Aおよび図46Bにおいて見られるとおり、CTLおよびdgag発現は、Cos-7細胞において予想された大きさタンパク質して明らかに示された（それぞれ25kDおよび47kD）。Nef、Rev、およびTatのコトランスフェクションでは、dgagタンパク質の発現を非常に強化した。本発明者らは、GAG mRNA発現に対するRevタンパク質作用の結果であるとこれを解釈する。ジャーカット細胞においてGTU-1ベクターからのdgagタンパク質の発現も試したが、いずれのシグナルも検出することができなかった（図46C）。コドン選択性の解析によりwtGAG配列がヒト細胞のコドン選択性に適していしないことが示された。コドン選択性が最適化された場合（構築物psynp17/24およびpoptp17/24）、強力なp17+p24（40kD）タンパク質発現が、ジャーカット細胞において検出された（図46Cおよび図46D）。
6.2.2. 細胞内局在
dgagおよびp17+p24タンパク質については、細胞内局在も、RD細胞において抗p24Mabでの免疫蛍光法によって解析した。ジャーカット細胞におけるウエスタンブロットの結果と同様に、dgagは検出することができなかった。p17/24のタンパク質は、形質膜における局在を示した（図47）。CTLタンパク質の局在は、適切な抗体がないことにより解析しなかった。
6.16実施例16：多重HIV抗原発現としての多重調節+構造タンパク質
次の段階として、単一ポリペチドとしてgagコードタンパク質および／またはCTL多重エピトープと定型的多重遺伝子の両者を含む多重HIV抗原の発現を解析した。図48において、ウエスタンブロットは、Cos-7細胞にトランスフェクトしたベクターが発現するいくつかの多重HIV抗原の発現を示す。明らか全ての調節性+構造多重抗原の発現量は、RNTまたはTRNタンパク質のものよりも有意に低いことがわかる。試験した全ての多重HIV抗原は、ゲルにおいて予測される大きさの位置の近くの異なったバンドとして移動した（多重調節+CTLについて73kD；多重調節+dgagについて95kD、および多重調節+CTL+dgagについて120kD）。RNTおよびTRNと同様に、RNT-CTLは、TRN-CTLよりもゆっくりと移動する。また、TRNおよびRNT構築物の両者の場合には、多重REG-CTL-dgagの組み合わせは、多重REG-dgag-CTLよりも高発現レベルを示した。
多重HIV抗原のより詳細な解析をジャーカット細胞において行った。この理由について、多重REG+CTL+optp17/24（113kDの予想サイズを有する）を含む構築した多重HIV抗原（多重調節+構造）の大部分を、抗原の異なる部分に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングによって解析した。結果を図49に示し、主に前の節において報告したCos-7細胞のものと似ている。以前の実験において見られたように、多重抗原を含むdgagは、ジャーカット細胞において非常に低レベルのハイブリッドタンパク質を発現する。ベクターpTRNdgagからの発現は、全てのブロットにおいて検知されなかった。抗原発現ベクターを含むその他のdgagトランスフェクトした細胞から材料を充填したレーンでは、Nef Mabハイブリダイズしたブロットのみで非常にわずかな衰弱シグナルが、予測される大きさの部位で検出された。対照的に、dgag部分がコドン最適化したp17/24で置換された場合、発現量の増加が観察された。TRN-CTL-optp17/24およびRNT-optp17/24をさらなる解析のためにまず最初に選択したので、これらの発現カセットを含む全てのGTUベクターから、抗原の発現を解析した。また、これらのプラスミドからのE2タンパク質の発現を解析した。結果を図50に示す。多重抗原とE2タンパク質両者のベクター間には、発現レベルにおける大きな相違はない。E2の発現レベルは、プラスミドにおけるIRESエレメントに続くマウスGM-CSF遺伝子の存在によって有意に影響されず、E2と同じmRNAから翻訳される。
6.17.実施例17：抗原の発現の維持
分裂している細胞集団におけるプラスミドの維持を、マーカーとして緑色蛍光タンパク質およびNefタンパク質を使用して証明した。異なるGTUまたは非GTUベクターから産生されるRNT-CTL-optp17/24抗原の発現の維持も、解析した。特にGTU-1（pRNT-CTL-optp17/24）、GTU-2（p2RNT-CTL-optp17/24）、GTU-3（p3RNT-CTL-optp17/24）、super6wt（super6wt-RNT-CTL-optp17/24）ベクターは、それぞれプラスミド維持活性のためにE2タンパク質およびその結合部位を利用する。この実験には、GTUベクターFREBNA-RNT-CTL-optp17/24を利用するEBNA-1およびその結合部位も含まれた。陰性対照として、E2結合部位（E2BSEBNA-RNT-CTL-optp17/24）と共に、EBNA-1発現カセットの混合した対を含む「非GTU」プラスミドを使用した。また、規則的CMV発現ベクターpCMV-RNT-CTL-optp17/24を使用した。
ジャーカット細胞には、等モル量発のプラスミドをトランスフェクトし、トランスフェクションの2日および5日後に、モノクローナル抗Nef抗体を使用して抗原の発現を研究した。キャリアDNAのみのトランスフェクションを陰性対照として使用した。結果を図51に示す。
図51からわかるように、発現は、第二の時間点においてGTUベクターのみから検出可能である。FREBNA-RNT-CTL-optp17/24からの抗原の発現は、E2とは異なり、EBNA-1が転写活性化機能を有さないために、両方の時間点で低かった。
また、多重調節+構造タンパク質の細胞内局在は、本質的に実施例4にて説明したように、RD細胞におけるインサイチュー免疫蛍光法解析によって研究した。結果を図52に示す。
全ての場合において、モノクローナル抗Nef抗体または抗p24抗体を使用して細胞質のみに局在が認められた。ウエスタンブロットデータによれば、optp17/24を含むタンパク質の発現レベルは、抗原を含むdgag断片より非常に強かった。
引用した全ての参照文献は、その全体が、並びにそれぞれの個々の刊行物、または特許、または特許出願が特異的に、および個々に全ての目的のためにその完全を参照により組み入れるために示されたかのように全ての目的について同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の多くの改変および変種は、その趣旨および範囲から逸脱することなく、行うことができ、加えて当業者には明らかであろう。本明細書に記載される特定の態様は、例示としてのみ提供され、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語とこのような請求項に与えられる均等の範囲とによって限定される。
プラスミドsuper6の模式的なマップを示す。 プラスミドVIの模式的なマップを示す。 プラスミドIIの模式的なマップを示す。 ジャーカット細胞におけるベクターsuper6、super6wt、VI、VIwt、およびII由来のNefおよびE2タンパク質の発現を示す。 プラスミドproduct1の模式的なマップを示す。 図6Aは、プラスミドNNV-1およびNNV-2の模式的なマップを示し、および図6Bは、プラスミドおよびNNV-2wtの模式的なマップを示す。 ジャーカット細胞におけるプラスミドNNV1、NNV-2、NNV-1wt、NNV-2-wt、super6、およびsuper6wt由来のNefタンパク質の発現を示す。 ジャーカット細胞におけるプラスミドNNV-2-wt、NNV-2-wtFS、およびproduct1由来のNefおよびE2タンパク質の発現を示す。 P815細胞におけるプラスミドNNV-2-wt、NNV-2-wtFS、およびproduct1由来のNefおよびE2タンパク質の発現を示す。 CHO細胞におけるプラスミドNNV-2-wt、NNV-2-wtFS、およびproduct1由来のNefおよびE2タンパク質の発現を示す。 RD細胞におけるプラスミドNNV2-wt、NNV-2-wtFS、およびproduct1由来のNefタンパク質の発現を示す。 CHO細胞、ジャーカット細胞、およびP815細胞におけるRNA分子NNV-2wtの発現を示す。 細菌細胞におけるNNV-2wtの安定性を示す。 CHO細胞およびジャーカット細胞系における非複製エピソーム・エレメントとしてのNNV-2wtの安定性のサザンブロット解析を示す。 ベクターNNV2wt、NNV2wtFS、およびproduct1がHPV-11の複製因子依存的な複製をできないことを示す。 プラスミド2wtd1EGFPの模式的なマップを示す。 プラスミドgf10bse2の模式的なマップを示す。 プラスミド2wtd1EGFPFSの模式的なマップを示す。 プラスミドNNVd1EGFPの模式的なマップを示す。 プラスミド2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS、NNVd1EGFPを、またはキャリアDNAのみをトランスフェクトしたジャーカット細胞の増殖曲線を示す。 プラスミド2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS、gf10bse2を、またはキャリアDNAのみをトランスフェクトしたジャーカット細胞の増殖曲線を示す。 ベクター2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS、またはNNVd1EGFPをトランスフェクトしたジャーカット細胞集団におけるd1EGFP陽性細胞の割合における変化を示す。 ベクター2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS、またはgf10bse2をトランスフェクトしたジャーカット細胞の集団におけるd1EGFP陽性細胞の割合の変化を示す。 ベクター2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS、またはNNVd1EGFPとトランスフェクトしたジャーカット細胞の集団におけるd1EGFP発現細胞の数の変化を示す。 ベクター2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS、またはgf10bse2をトランスフェクトしたジャーカット細胞の集団におけるd1EGFP発現細胞の数の変化を示す。 1マイクログラムのGTU-Nefで免疫化した5人の患者におけるT細胞増殖によって測定した、組換えNefタンパク質（5マイクログラム/ウェル）に対するT細胞応答。 20マイクログラムのGTU-Nefで免疫化した5人の患者におけるT細胞増殖によって測定した、組換えNefタンパク質（5マイクログラム/ウェル）に対するT細胞応答。 1マイクログラムのGTU-Nefで免疫化した患者#1におけるT細胞増殖によって測定した、組換えNefタンパク質（5マイクログラム/ウェル）に対するT細胞応答。結果は、T細胞増殖アッセイ法（Nef SI）の刺激指数として、および上澄へのIFN-γの分泌として与えられる。 （A）プラスミドpEBOLPP；（B）プラスミドs6E2d1EGFP；（C）プラスミドFRE2d1EGFP プラスミドFREBNAd1EGFP ベクターは細胞増殖を妨げなかった。 ベクターは細胞において異なる速度で維持された。 トランスフェクトした細胞の総集団における詳細なd1EGFP発現細胞数の変化。 トランスフェクトした細胞の総集団における詳細なd1EGFP発現細胞数の変化。（A）ヒト胎生期細胞系293；（B）マウス細胞系3T6。 NefおよびE2抗体の反応。 RevおよびTat抗体の反応。 GagおよびCTL反応。 （A）GTU-1；（B）GTU-2Nef；（C）GTU-3Nef；（D）super6wtd1EGFP；（E）FREBNAd1EGFP；（F）E2BSEBNAd1EGFP；（G）NNV-Rev。 （A）pNRT；（B）pTRN；（C）pRTN；（D）pTNR；（E）pRNT；（F）p2TRN；（G）p2RNT；（H）p3RNT；（I）pTRN-iE2-GMCSF；（J）pTRN-iMG-GMCSF。 （A）pMV1NTR；（B）pMV2NTR；（C）pMV1N11TR；（D）pMV2N11TR。 （A）pCTL；（B）pdgag；（C）psynp17/24；（D）poptp17/24；（E）p2mCTL；（F）p2optp17/24；（G）p3mCTL；（H）p3optp17/24。 （A）pTRN-CTL；（B）pRNT-CTL；（C）pTRN-dgag；（D）pTRN-CTL-dgag；（E）pRNT-CTL-dgag；（F）pTRN-dgag-CTL；（G）pRNT-dgag-CTL；（H）pTRN-optp17/24-CTL；（I）pTRN-CTL-optp17/24；（J）pRNT-CTL-optp17/24；（K）p2TRN-optp17/24-CTL；（L）p2RNT-optp17/24-CTL；（M）p2TRN-CTL-optp17/24；（N）p2RNT-CTL-optp17/24；（O）p2TRN-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF；（P）p2RNT-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF；（Q）p3TRN-CTL-optp17/24；（R）p3RNT-CTL-optp17/24；（S）p3TRN-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF；（T）p3RNT-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF；（U）FREBNA-RNT-CTL-optp17/24；（V）super6wt-RNT-CTL-optp17/24；（W）E2BSEBNA-RNT-CTL-optp17/24；（X）pCMV-RNT-CTL-optp17/24。 多重調節抗原の発現の解析。 タンパク質の免疫主体部分を含んだ多重調節抗原の発現の解析。 免疫蛍光法による多重調節抗原の細胞内局在の解析。 Gagをコードする構造タンパク質およびCTL多重エピトープの発現の解析。 RD細胞の膜におけるp17/24タンパク質の局在。 Cos-7細胞におけるdgagおよび多重遺伝子を含むCTLの解析発現。 ジャーカット細胞に発現した多重HIV抗原のウエスタンブロット解析。 TRN-CTL-optp17/24およびRNT-CTL-optp17/24抗原、並びにGTU-1、GTU-2およびGTU-3ベクター由来のE2タンパク質の発現の解析。 種々のベクター由来の多重HIV抗原発現の維持。 RD細胞における多重HIV抗原の細胞内局在。

Claims (80)

  1. （a）異種プロモーターに機能的に連結された核アンカータンパク質またはその機能的相当物をコードするDNA配列であって、該核アンカータンパク質が（i）特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメイン、および（ii）核構成要素に結合する機能的ドメインを含むDNA配列；ならびに
    （b）核アンカータンパク質のための結合部位を形成する多量体化DNA配列
    を含む発現ベクターであって、パピローマウイルスの複製開始点を欠損するベクター。
  2. 哺乳類細胞において機能的な複製開始点を欠損する、請求項1記載のベクター。
  3. 核構成要素が、有糸分裂クロマチン、核マトリックス、核ドメイン10（ND10）、または核ドメインPODである、請求項1または2記載のベクター。
  4. 核アンカータンパク質がクロマチンアンカータンパク質であり、且つ機能的ドメインが有糸分裂クロマチンと結合する、請求項1または2記載のベクター。
  5. 核アンカータンパク質がヒンジ領域またはリンカー領域を含む、請求項1または2記載のベクター。
  6. 核アンカータンパク質が、真核生物、原核生物、またはウイルス起源の天然タンパク質である、請求項1または2記載のベクター。
  7. 天然タンパク質がウイルス起源のものである、請求項6記載のベクター。
  8. 核アンカータンパク質が真核生物起源の天然タンパク質である、請求項6記載のベクター。
  9. 核アンカータンパク質がパピローマウイルスまたはエプスタイン・バーウイルスのものである、請求項1または2記載のベクター。
  10. 核アンカータンパク質が、ウシの1型パピローマウイルスのE2タンパク質またはエプスタイン・バーウイルス核抗原1である、請求項9記載のベクター。
  11. 核アンカータンパク質がウシの1型パピローマウイルスのE2タンパク質である、請求項10記載のベクター。
  12. 核アンカータンパク質が高移動度タンパク質である、請求項1または2記載のベクター。
  13. 核アンカータンパク質が非天然タンパク質である、請求項1または2記載のベクター。
  14. 核アンカータンパク質が、組換えタンパク質、融合タンパク質、または分子モデリング技術によって得られたタンパク質である、請求項13記載のベクター。
  15. 組換えタンパク質、融合タンパク質、または分子モデリング技術によって得られたタンパク質が、特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメインおよび核構成要素に結合する機能的ドメインの任意の組み合わせを含み、核構成要素に結合する該機能的ドメインが、パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、または高移動度タンパク質のものである、請求項14記載のベクター。
  16. 組換えタンパク質、融合タンパク質、または分子モデリング技術によって得られたタンパク質が、特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメインおよび核構成要素に結合する機能的ドメインの任意の組み合わせを含み、核構成要素に結合する該機能的ドメインが、ウシの1型パピローマウイルスのE2タンパク質、エプスタイン・バーウイルス核抗原1、または高移動度タンパク質のものである、請求項15記載のベクター。
  17. ベクターが対象となるDNA配列の1つまたは複数の発現カセットをさらに含む、請求項1または2記載のベクター。
  18. 対象となるDNA配列が感染性の病原体のものである、請求項17記載のベクター。
  19. 感染性の病原体がウイルスである、請求項18記載のベクター。
  20. ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、C型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、およびエンテロウイルスからなる群より選択される、請求項19記載のベクター。
  21. 対象となるDNA配列が細菌のものである、請求項18記載のベクター。
  22. 細菌が、クラミジア-トラコマチス、マイコバクテリウム-ツベルクローシス、およびマイコプラズマ-ニューモニエからなる群より選択される、請求項21記載のベクター。
  23. 細菌がサルモネラ属である、請求項21記載のベクター。
  24. 対象となるDNA配列が真菌病原体のものである、請求項17記載のベクター。
  25. 真菌病原体がカンジダ・アルビカンスである、請求項24記載のベクター。
  26. 対象となるDNA配列がHIV起源のものである、請求項20記載のベクター。
  27. 対象となるDNA配列がHIVの非構造調節タンパク質をコードする、請求項26記載のベクター。
  28. HIVの非構造調節タンパク質がNef、Tat、またはRevである、請求項27記載のベクター。
  29. HIVの非構造的調節タンパク質がNefである、請求項28記載のベクター。
  30. 対象となるDNA配列がHIVの構造タンパク質をコードする、請求項17記載のベクター。
  31. 対象となるDNA配列がHIV gp120/gp160をコードする遺伝子である、請求項30記載のベクター。
  32. 第一の発現カセットがNef、Tat、またはRevをコードする対象となるDNA配列を含み、且つ第二の発現カセットがNef、Tat、またはRevをコードする対象となるDNA配列を含む、請求項17記載のベクター。
  33. 第一の発現カセットがNef、Tat、またはRevをコードする対象となるDNA配列を含み、且つ第二の発現カセットがHIVの構造タンパク質をコードする対象となるDNA配列を含む、請求項17記載のベクター。
  34. 対象となるDNA配列が癌に関連したタンパク質をコードする、請求項17記載のベクター。
  35. 対象となるDNA配列が、免疫成熟、免疫応答の調節、または自己免疫反応の調節と関連したタンパク質をコードする、請求項17記載のベクター。
  36. タンパク質がAPECEDである、請求項35記載のベクター。
  37. 対象となるDNA配列がAire遺伝子である、請求項17記載のベクター。
  38. 対象となるDNA配列が任意の遺伝性の単一遺伝子疾患において欠損があるタンパク質をコードする、請求項17記載のベクター。
  39. 対象となるDNA配列が高分子薬物をコードする、請求項17記載のベクター。
  40. 対象となるDNA配列がサイトカインをコードする、請求項39記載のベクター。
  41. サイトカインが、IL1、IL2、IL4、IL6、およびIL12からなる群より選択されるインターロイキンである、請求項40記載のベクター。
  42. 対象となるDNA配列がインターフェロンをコードする、請求項40記載のベクター。
  43. 対象となるDNA配列が生物学的に活性なRNA分子をコードする、請求項17記載のベクター。
  44. 生物学的に活性なRNA分子が抑制性のアンチセンスおよびリボザイム分子からなる群より選択される、請求項43記載のベクター。
  45. 抑制性のアンチセンスまたはリボザイム分子が発癌遺伝子の機能に拮抗する、請求項44記載のベクター。
  46. 薬物として使用するための、請求項17記載のベクター。
  47. タンパク質もしくはペプチドの感染性物質、治療物質、高分子薬物、またはそれらの組み合わせをコードする1つもしくは複数の遺伝子または1つもしくは複数のDNA配列のような、対象となる1つもしくは複数の遺伝子または1つもしくは複数のDNA配列のためのキャリアベクターとして使用するための、請求項17記載のベクター。
  48. 遺伝性または後天性の遺伝子欠損を治療するための薬物として使用するための、請求項17記載のベクター。
  49. 感染性物質に対して治療的なDNAワクチンとして使用するための、請求項17記載のベクター。
  50. 治療物質として使用するための、請求項17記載のベクター。
  51. 細胞または生物において対象となるDNA配列によってコードされるタンパク質の産生に使用するための、請求項17記載のベクター。
  52. インビボにおける治療的な高分子物質の産生に使用するための、請求項17記載のベクター。
  53. タンパク質を被験者に提供する方法であって、被験者に請求項1または2記載のベクターを投与する段階を含み、該ベクターが（i）被験者に提供されるタンパク質をコードする第二のDNA配列をさらに含み、該第二のDNA配列は機能的に第二のプロモーターに連結されており、（ii）ウシパピローマウイルスタンパク質E1をコードせず、ならびに該被験者が、ウシパピローマウイルスタンパク質E1を発現しない方法。
  54. 被験者にタンパク質に対する免疫応答を誘導する方法であって、被験者に請求項1または2記載のベクターを投与する段階を含み、該ベクターが（i）タンパク質をコードする第二のDNA配列をさらに含み、該第二のDNA配列は機能的に第二のプロモーターに連結されており、（ii）ウシパピローマウイルスタンパク質E1をコードせず、ならびに該被験者が、ウシパピローマウイルスタンパク質E1を発現しない方法。
  55. 感染症の治療を、治療を必要とする被験者に実施する方法であって、治療的に有効な量の請求項17記載のベクターを被験者に投与する段階を含み、対象となるDNA配列が、感染性物質の免疫原性エピトープを含むタンパク質をコードする方法。
  56. 遺伝性または後天性の遺伝子欠損の治療を、治療を必要とする被験者に実施する方法であって、治療的に有効な量の請求項17記載のベクターを被験者に投与する段階を含み、対象となるDNA配列が、遺伝性または後天性の遺伝子欠損によって影響を受けるタンパク質をコードする方法。
  57. 被験者に請求項17記載のベクターを投与する段階を含む、被験者においてDNA配列を発現させる方法。
  58. ベクターがウシパピローマウイルスタンパク質E1をコードせず、且つ被験者がウシパピローマウイルスタンパク質E1を発現しない、請求項55、56、または57記載の方法。
  59. （a）ベクターを含む宿主細胞を培養する段階、および
    （b）ベクターを回収する段階、
    を含む、請求項1または2記載のベクターを調製する方法。
  60. 段階（a）の前に、宿主細胞をベクターで形質転換する段階をさらに含む、請求項59記載の方法。
  61. 宿主細胞が原核細胞である、請求項59記載の方法。
  62. 宿主細胞が大腸菌である、請求項59記載の方法。
  63. 請求項1または2記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
  64. 請求項17記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
  65. 宿主細胞が細菌細胞である、請求項63記載の宿主細胞。
  66. 宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項63記載の宿主細胞。
  67. 請求項1または2記載のベクターを含む、キャリアベクター。
  68. 請求項17記載のベクターおよび適切な薬学的キャリアを含む薬学的組成物。
  69. 請求項17記載のベクターを含む、DNAワクチン。
  70. 請求項18記載のベクターを含む、DNAワクチン。
  71. 請求項19記載のベクターを含む、DNAワクチン。
  72. 請求項21記載のベクターを含む、DNAワクチン。
  73. 請求項24記載のベクターを含む、DNAワクチン。
  74. 請求項17記載のベクターを含む、遺伝子治療物質。
  75. 請求項17記載のベクターと適切な薬学的媒体とを組み合わせることを含む、請求項69記載のDNAワクチンを調製する方法。
  76. 請求項18記載のベクターと適切な薬学的媒体とを組み合わせることを含む、請求項69記載のDNAワクチンを調製する方法。
  77. 請求項19記載のベクターと適切な薬学的媒体とを組み合わせることを含む、請求項69記載のDNAワクチンを調製する方法。
  78. 請求項21記載のベクターと適切な薬学的媒体とを組み合わせることを含む、請求項69記載のDNAワクチンを調製する方法。
  79. 請求項24記載のベクターと適切な薬学的媒体とを組み合わせることを含む、請求項69記載のDNAワクチンを調製する方法。
  80. 請求項17記載のベクターと適切な薬学的媒体とを組み合わせることを含む、請求項74記載の物質を調製する方法。
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