JP2009201369A - 新規アスタキサンチンジラムノシドとその製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】抗酸化活性と水溶性を兼ね備えたアスタキサンチン様の色素であるアスタキサンチンジラムノシド及びその製造法を提供する。
【解決手段】スフィンゴモナス属に属するアスタキサンチンジラムノシド生産菌を培養し、その培養物より採取されるアスタキサンチンジラムノシド、及び、その製造法。

【選択図】なし

Description

本発明は新規アスタキサンチンジラムノシドとその製造法に関するものである。

カロテノイドは、天然に存在する色素であり、その高い抗酸化活性と明彩な黄橙色の色合いから、種々の用途に応用されている。中でも、抗酸化活性の高い分子種である赤色色素であるアスタキサンチンは、健康食品（特許文献１）や食品添加物（特許文献２）としての利用が進み、また、畜肉などの着色（特許文献３）への用途が拡大している。

アスタキサンチンは脂溶性が高いことから、服用しても利用率が低い。そのため、溶解度を向上させる目的で、２個のグルコース分子が結合したアスタキサンチン類が報告されている（特許文献４、５）。
特開２００５−３４１３５号公報 特開２００２−２６２８２４号公報 特開平７−９９９２５号公報 特開平１０−３２７８６５号公報 特開２００７−３３０１０５号公報

しかし、アスタキサンチンはその脂溶性の高さから、生体内への取り込みの効率や分布にある程度の偏りがあることが予想されている。そのため、より有用なアスタキサンチンの開発が求められている。
すなわち、アスタキサンチン並びにその類縁物質の応用用途のさらなる拡大のために、さらに高い抗酸化活性を示し、かつ異なる物性を有するような分子種の開発が望まれている。

そこで、本発明者らは、アスタキサンチンとは異なる物性を示す類縁化合物を開発するため、新たな微生物を探索した結果、鳥取県三朝温泉から新たなアスタキサンチン様物質を産生する微生物を分離した。
この新たな微生物はスフィンゴモナス属に分類するスフィンゴモナス・アスタキサンチニファシエンスであることが確認された。
そして、この新たな微生物を培養し、その培養物を分析した結果、アスタキサンチン様の色素をもつ新たなアスタキサンチンジラムノシドであることが見出し、本発明を完成させた。

すなわち、以下の通りの本発明を提供するものである。
（１）下記の式（１）

[式（１）中、Ｒは、α−ラムノピラノシル基を表す。]で表されるアスタキサンチンジラムノシドを提供するものである。[(3S,3'S)-3,3'-bis(a-D-rhamnopyranosyloxy)-b,b-carotene-4,4'-dione]。
（２）スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）に属するアスタキサンチンジラムノシド物質生産菌を培養し、その培養物よりアスタキサンチンジラムノシドを採取することを特徴とするアスタキサンチンジラムノシドの製造法を提供するものである。
（３）スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）に属する微生物がスフィンゴモナス・アスタキサンチニファシエンス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）である上記（２）記載のアスタキサンチンジラムノシドの製造法を提供するものである。
（４）スフィンゴモナス・アスタキサンチニファシエンス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）がスフィンゴモナス・アスタキサンチニファシエンスＴＤＭＡ−１７（ＮＢＲＣ番号：１０２１４６）である上記（３）記載のアスタキサンチンジラムノシドの製造法を提供するものである。
（５）上記（１）記載のアスタキサンチンジラムノシドを含有する組成物を提供するものである。

本発明の新規アスタキサンチンジラムノシドは、赤色色素のアスタキサンチンと同様に、色調改善剤、抗酸化剤、食材用色素、飼料用添加剤などの用途として広く利用することができる。

本発明に使用される新規アスタキサンチンジラムノシド生産菌の一例としては、鳥取県・三朝温泉で新たに分離され、平成１８年９月７日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センターにＮＢＲＣ １０２１４６（受託証発行日：２００６年１２月１５日）として寄託されているスフィンゴモナス・アスタキサンチニファシエンスＴＤＭＡ−１７株（以下、「本菌株」と略記することもある）が挙げられる。

本菌株の菌学的性状は以下のとおりである。
（１）コロニーの性状
ニュートリエントブロス寒天培地上で、２０〜４５℃ （至適温度：４０℃）、ｐＨ５．５〜１１．０（至適ｐＨ：７．０〜８．０）、約４８時間の培養条件により、良好な生育を示し、直径０．５〜１．０ｍｍの赤色で平滑なコロニーを形成する。しかし、０．２５％以上の塩化ナトリウムが存在すると発育が阻害される。

（２）形態的性状
幅０．３〜０．５μｍ、長さ０．５〜０．９μｍの長円形ないし桿状の細胞で、運動性を有する。胞子は認められない。コロニーを形成する細胞は繊維状の構造体を細胞外に形成することがある。

（３）生理学的性質
グラム染色 −
インドールの生成 −
硫化水素の生成 −
カタラーゼ活性 −
オキシダーゼ活性 −
β−ガラクトシダーゼ活性 −
ウレアーゼ活性 −
トリプトファンデアミナーゼ活性 −
ウレアーゼ活性 −
リジンデカルボキシラーゼ活性 −
オルニチンデカルボキシラーゼ活性 −
エスクリンの分解 ＋
Ｔｗｅｅｎ８０の分解 ＋
ゼラチンの分解 ＋
カゼインの分解 ＋
デンプンの分解 ＋
カンテン −
ＤＮＡ −
セルロース −
キチン −
スフィンゴ糖脂質 ＋
（資化性試験）
グルコース −
Ｌ−アラビノース −
Ｄ−マンノース −
Ｄ−マンニトール −
マルトース −
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン −
グルコン酸 −
カプリン酸 −
アジピン酸 −
リンゴ酸 −
クエン酸ナトリウム −
フェニル酢酸 −

（４）化学分類学的性状
ＤＮＡの塩基組成（ＧＣ含量：モル％） ６７．７％
ユビキノン（コエンザイムＱ）の型 Ｑ−１０

また、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の系統解析により、本菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（１３９６ｂｐ）を解読してデータベース検索を行った結果、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｅｒｏｌａｔａ ＮＷ１２（ＡＪ４２９２４０）と９４．５％の相同性があり、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に含まれることが確認された。
以上の結果から本菌株をグラム陰性の好気性細菌であり、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属と同定した。
なお、本菌株であるスフィンゴモナス・アスタキサンチニファシエンスＴＤＭＡ−１７について、菌学的性状等のより詳細については、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７３巻２号 ｐｐ．１４０ 〜 １４８に記載した。

（培養）
本発明のアスタキサンチンジラムノシド物質生産菌は、通常の微生物が利用し得る栄養物を含有する培地で培養することができる。よって、資化しうる炭素源、窒素源、無機物や発育を助けたり、促進させたりする物質を含有する培地であれば、合成培地や天然培地いずれでも使用することができる。
培地の組成物としては、通常細菌の培養に利用されているものを用いることができる。例えば、炭素源としては、グルコース、シュークロース、マルトース、グルセリン等を用いることができる。また、窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、モルトエキス等を用いることができる。その他必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等のイオンを生成することができる無機塩類を添加することができる。但し、塩化ナトリウムは本菌株の発育を阻害するため、用いることができない。
培養法は、前記、本菌株の菌学的性状の培養条件により、一般微生物の培養法に準じて行うことができ、静置、振盪または通気撹拌等いずれの方法も用いることができる。通常は液体培地による振盪培養が適している。

（抽出・精製）
本発明のアスタキサンチンジラムノシド物質は、実施例記載の理化学的性状を有することから、その性状に基づき、一般的な方法に準じて、培養物から抽出・精製することが可能である。
本発明の物質を培養物から得るためには、通常の分離手段を用いることができる。特に培養液中の菌体に蓄積されていることが多いことから、遠心分離や濾過等により分離させることが好ましい。また、その他の抽出・精製の方法としては、例えば、溶剤抽出、イオン交換樹脂、吸着または分配カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、透析法、沈殿法等を単独あるいはこれらの方法を適宜組み合わせて用いることができる。
また、培養物から得られた抽出液を工程中で濃縮することもできる。濃縮条件は特に制限されない。
例えば、アスタキサンチンジラムノシド物質を含む培養物を粉砕処理後、有機溶媒により抽出する。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ヘキサン、アセトン、クロロホルム、エーテル、酢酸エチル等を用いることができる。その抽出液を濃縮し、その抽出物を少量のクロロホルムに溶解させ、クロロホルムとメタノールで平衡化したシリカゲルカラムを用いて、クロロホルム／メタノールの溶媒でクロマトグラフィーを行う。その溶出液を濃縮して乾固させ、クロロホルム／メタノールの溶媒で薄層クロマトグラフィーを行うことによりアスタキサンチンジラムノシド物質を得ることができる。

また、本発明はアスタキサンチンジラムノシド物質を含有する組成物として用いることができる。ここでいう組成物とは、魚類の色調や卵黄の色などを改善する色調改善剤、抗酸化剤、食材用色素、飼料用添加剤などをいい、医薬品や食品に添加して用いることができる。この組成物には、更に、医薬品添加物や食品添加物などで使用されている賦形剤等を配合することもできる。

以下において、本発明の実施例を示すが、これらの実施例に本発明が限定されるものではない。
（実施例１）固体培養
ペプトン１．０％ 、酵母エキス０．５％ 、モルトエキス０．５％、カザミノ酸０．５％ 、魚エキス０．２％および硫酸マグネシウム０．１％を蒸留水に溶解後、ｐＨ７．２に調整したものに、粉末寒天１．５％を加え、オートクレーブ滅菌した。滅菌後、滅菌済みのシャーレに流し固めて固形培地を調製した。この培地に、スフィンゴモナス・アスタキサンチニファシエンスＴＤＭＡ−１７株を白金耳により植菌し、３７℃で５日間培養した。得られた菌体は、培地の表面から掻き取って下記の抽出に用いた。

（実施例２）液体培養
ペプトン０．４％ 、酵母エキス０．２％ 、塩化ナトリウム０．５％、魚エキス０．２ ％ 、硫酸マグネシウム０．２％およびマルトース１．０％を５００ｍｌ容の三角フラスコの中で蒸留水に溶解させ、ｐＨ７．２に調整後、１００ｍｌに調整した。それをオートクレーブ滅菌したものを液体培地として用いた。この液体培地にアスタキサンチンジラムノシドを生産するスフィンゴモナス・アスタキサンチニファシエンスＴＤＭＡ−１７株を白金耳により植菌し、３７℃で２日間振とう培養した。更にその培養液を上記と同じ組成の液体培地１００ｍｌに１％加え、３７℃で２日間振とう培養した。このようにして得られた培養液１００ｍｌを遠心分離により上清と分離させ、菌体を得た。

（実施例３）菌体抽出
実施例１または実施例２の菌体に５倍量のメタノールを加え、シェーカーを用いて１８０ｒｐｍ・３０分間処理して色素抽出する作業を３回行った。その抽出液をろ過して菌体を除去後、濃縮乾固し、メタノール抽出画分とした。

（実施例４）精製
実施例３のメタノール画分をクロロホルムに溶解させ、Ｐｕｒｉｆ−ｐａｃｋシリカゲル（ＭＯＲＩＴＥＸ社製）を充填した中圧分取液体クロマトグラフィーに供試した。カラムに吸着させ、クロロホルムで洗浄した後、クロロホルム：メタノール（９：１）で溶出した。得られた画分を、濃縮乾固し、適宜メタノールを加えたクロロホルムに溶解し、クロロホルム：メタノール（４：１）の展開液で逆相シリカゲルＴＬＣにより展開した。Ｒｆ＝０.３付近の赤色スポットを回収して精製標品とした。

（実施例５）アスタキサンチンジラムノシドの理化学的性質
実施例５で得られた精製標品を用いて、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定し、図１および図２の結果が得られた。また、ＦＡＢマススペクトルを測定した結果、測定された分子量（ｍ／ｚ ９１１．４８７８１[Ｍ＋Ｎａ]^＋ 分子式Ｃ_５２Ｈ_７２ＮａＯ_１２の分子量（計算値）９１１．４９２１４）より、このアスタキサンチンジラムノシドの分子式は、Ｃ_５２Ｈ_７２Ｏ_１２と推定された。

本発明のアスタキサンチンジラムノシドの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。

本発明のアスタキサンチンジラムノシドの重ジメチルスルホキシド中で測定した^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。

Claims (5)

1. 下記の式（１）
   

   

   [式（１）中、Ｒは、α−ラムノピラノシル基を表す。]で表されるアスタキサンチンジラムノシド。
2. スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）に属するアスタキサンチンジラムノシド物質生産菌を培養し、その培養物よりアスタキサンチンジラムノシドを採取することを特徴とするアスタキサンチンジラムノシドの製造法。
3. スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）に属する微生物がスフィンゴモナス・アスタキサンチニファシエンス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）である請求項２記載のアスタキサンチンジラムノシドの製造法。
4. スフィンゴモナス・アスタキサンチニファシエンス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）がスフィンゴモナス・アスタキサンチニファシエンスＴＤＭＡ−１７（ＮＢＲＣ番号：１０２１４６）である請求項３記載のアスタキサンチンジラムノシドの製造法。
5. 請求項１記載のアスタキサンチンジラムノシドを含有する組成物。

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