JP2009153467A - 核酸の簡易抽出法 - Google Patents

Abstract

【課題】僅かな試料から核酸を、とくにＲＮＡ又はＤＮＡを高精度で安全に、かつ高収量で抽出する。
【解決手段】生体由来の抽出試料に対し、蛋白質変性剤もしくはこれにアルコール類を含有させたものを添加する第１の工程と、アルコール類を添加して遊離核酸をキャリアーなしで凝集させる第２の工程、さらに核酸含有抽出物をフィルターを通過させて抽出する第３の工程、および抽出物に精製水あるいは低濃度緩衝液を加えて可溶化させる第４の工程を経ることにより、共沈剤無しで核酸を損傷することがなく、しかもキャリアーを必要とせずに安全に不溶化することができ、またフィルターを用いて核酸抽出を行うために、特殊な技術、複雑な操作、および特殊な装置を必要とせず、簡便・迅速・効率的・高収量に核酸の分離精製抽出作業をおこなうことができ、また増幅阻害物質の影響の低減化も果たすことができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、生体から採取した試料から核酸を簡単に抽出する方法に関し、僅かな試料から高濃度の核酸を、とくにＲＮＡ又はＤＮＡの一方だけでも精度よく、しかも安全に収量を増すことができるようにすることを目的とするものである。

ヒトゲノム塩基配列の読み取り完了に伴い、今後はゲノム上に存在する遺伝子の機能や個人差などを明らかにする遺伝子解析研究をはじめとし、バイオテクノロジーおよび臨床診断等の分野での遺伝子検査が次第に重要となっていくと予想される。遺伝子を対象とした研究・検査を行うためには血液などの試料から核酸抽出を簡易にかつ高効率で行うことが必要不可欠となる。

特に遺伝子検査においては細胞中あるいはウイルス中の核酸を分離し、その後の核酸増幅あるいはウイルス検出工程に使用するために、核酸抽出操作の抽出効率、操作法を改善する方法が数多く提案されている。

例えばプロテアーゼＫ等の蛋白質分解酵素や界面活性剤を加えて細胞壁を破壊し、フェノール／クロロホルムにより蛋白質を変性させて水相と有機相とに分離させ、核酸のみの水相にエタノールやイソプロパノール等を添加して核酸を不溶化させて抽出するプロテアーゼＫ／フェノール法（非特許文献１）や、あるいはグアニジンチオシアネートを加えて細胞を溶解させた後、酸性条件下でフェノールを用いて共存するＤＮＡを除去してＲＮＡを抽出するＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ Ｐｈｅｎｏｌ Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法（非特許文献２）等が使われてきた。

しかし上記のプロテアーゼＫ／フェノール法およびＡＧＰＣ法による場合には、いずれも劇物であるフェノールおよびクロロホルムを使用することから、操作の際の安全性および使用済試薬の廃棄に大きな課題がある。

そこで上記の方法を改善したのが、核酸と親和性を有する共沈剤を混合し、蛋白質変性剤と変性蛋白を可溶化する可溶化剤を含んだ液により核酸以外の不純物を除去すると同時に核酸を共沈剤と共に不溶化させて抽出する方法である〔例えば特許第３１０８４６３号公報（特許文献１）を参照〕。またその他にも有害な有機化合物を使用しないで、核酸に親和性の高い共沈剤を使うことで核酸の抽出効率を上げる方法も提案されている〔例えば特開平０９−０８４６００号公報（特許文献２）、特開２００１−０１７１７３号公報（特許文献３）を参照〕。

また溶液状態で核酸抽出をおこなう場合にあっては、核酸以外の夾雑物と不溶化核酸を分離する際に高濃度な抽出物としたいためにろ過ではなく遠心分離が多用される。そのため、抽出効率を上げるべく核酸と親和性の高い共沈剤を使用し凝集させることで大きな不溶化物を生成させているが、共沈剤と核酸の複合体を解消する際に核酸が損傷する危険性がある。また遠心分離は遠心分離機等の特殊な装置が必要となり、また大量処理が難しくしかも自動化の妨げとなる。

これら溶液状態で核酸抽出をおこなう方法に対抗し、最近では操作が煩雑でなく、また時間がかかる遠心分離機を使用することなく自動化が可能な核酸抽出方法が提案されている。それらは核酸を含む溶液と固体材料とを接触させ核酸を吸着後、洗浄し、脱着することでおこなう固体材料を介した方法である。

具体的には、シリカ担体を接液可能な状態で固定化し、シリカ粒子に核酸を吸着させ、試料の夾雑物を除去し、溶出液にて核酸を回収する方法〔例えば、特許第２６８０４６２号公報（特許文献４）〕、また塩及びアルコールを加えて急冷すると核酸が磁気ビーズの周囲に凝集することを利用した方法〔例えば、特表２００２−５０７１１６号公報（特許文献５）を参照〕、さらに多孔質膜を使った方法〔例えば、特許第３８９０３６０号公報（特許文献６）を参照〕等が提案されている。

これらの方法は固相に核酸を吸着させるため、核酸を固相から溶出させる際に核酸の回収率が問題となる。この場合に回収率を上げるためには核酸を固相から脱離させるための溶出液量を多くしなければならず高濃度の抽出物を得るのが難しくなるという問題もある。そこで予め不溶化した核酸を担体に付着させ、担体からの分離操作無しに付着した核酸を核酸増幅に供する方法が提案されている〔例えば特開２００５−２５３４６４号公報（特許文献７）を参照〕。

この方法では目的核酸を担体表面に付着させる際に、核酸共沈剤により大きな核酸不溶化物を生成させることで一般的に汎用されているろ紙のような目の粗い担体でも核酸抽出操作に使用でき、また目的核酸が付着した状態で、つぎの核酸増幅試薬と接触させることで核酸の抽出によるロスを少なくしているため利便性が高い。また実際にこの方法を具現化した装置も提案されており、核酸が付着した担体を容器内に収容し、容器内で抽出・精製・核酸増幅の全ての工程をおこなうことができるものである〔特開２００５−２９５９１０号公報（特許文献８）を参照〕。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ， ｅｔ．ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）７−１２〜７−１５ Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ． ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８７） １６２， １５６−１５９ 特許第３１０８４６３号公報 特開平０９−０８４６００号公報 特開２００１−０１７１７３号公報 特許第２６８０４６２号公報 特表２００２−５０７１１６号公報 特許第３８９０３６０号公報 特開２００５−２５３４６４号公報 特開２００５−２９５９１０号公報

しかしながら、上記した核酸共沈剤を用いる方法では、核酸共沈剤により核酸が損傷する可能性があり、また目的核酸以外の核酸も凝集してしまうため、例えばＲＮＡのみ、またはＤＮＡのみの単離・抽出には不向きである。またＲＮＡを検査対象とした場合に、ゲノムＤＮＡからＲＮＡを分離できないと、ゲノムＤＮＡは増幅阻害因子と成り、増幅反応の効率を下げる結果となる。また担体から核酸を分離しない場合、抽出した核酸全量を検査に供することになり、再検査等の必要が迫られた時には再度核酸の抽出操作が必要となる。

そこで、このような核酸共沈剤を用いることによる核酸の損傷がなく、また増幅阻害因子の少ない、しかも安全で使用済試薬の廃棄上の問題も無く、さらに遠心分離機等の特殊な装置も不要とするばかりでなく、高精度の核酸を高収量で回収することができるようにすることが課題となっている。

そこで本発明にあっては上記した従来の核酸抽出法の抱える課題を解決し、とくに遠心分離機等の特殊な装置を必要とせずに、しかも簡単な工程により、安全に、かつＲＮＡまたはＤＮＡ単体であっても、これをゲノムＤＮＡから分離するとともに増幅阻害物質を除去して高精度の核酸を迅速・高収量で回収することができるようにしたものであって、具体的には、生体由来の抽出試料に対し、蛋白質変性剤を添加して細胞膜や細胞壁を破壊し、蛋白質を変性させる第１の工程と、アルコール類を添加して遊離核酸をキャリアーなしで凝集させる第２の工程と、核酸含有抽出物をフィルターを通過させてＲＮＡまたはＤＮＡの少なくとも一方または両方を分離抽出する第３の工程と、抽出された抽出物に精製水あるいは低濃度の緩衝液を加えて可溶化させる第４の工程とからなる核酸の簡易抽出法に関する。

本発明は、上記したように、生体由来の抽出試料に対し、蛋白質変性剤もしくはこれにアルコール類を含有させたものを添加する第１の工程と、アルコール類を添加して遊離核酸をキャリアーなしで凝集させる第２の工程、さらに核酸含有抽出物をフィルターを通過させて抽出する第３の工程、および抽出物に精製水もしくは緩衝液を加えて可溶化させる第４の工程を経ることにより、共沈剤無しで核酸を損傷することがなく、しかもキャリアーを必要とせずに安全に不溶化することができ、またフィルターを用いて核酸抽出を行うために、特殊な技術、複雑な操作、および特殊な装置を必要とせず、簡便・迅速・効率的・高収量に核酸の分離精製抽出作業をおこなうことができ、また増幅阻害物質の影響の低減化も果たすことができる。

さらにフィルターを用いる場合においては作業をインビトロでおこなうことができるためにフィルターが外部に露出せず、大気中の不純物が付着することが無い。さらにフィルターを交換することでＲＮＡ・ＤＮＡと染色体ＤＮＡの分離・抽出を簡便におこなうことができ、また、核酸を含有する試料と蛋白質変性剤、およびアルコール類を混合し、フィルターにより不溶化核酸以外の不純物を除去する工程を何回も繰り返すことで簡便に目的とする核酸を濃縮することも可能となる。

以下において本発明の具体的な内容を説明する。生体由来の抽出試料としては、例えば全血、血清、血漿、尿、糞便等のほかに喀痰、唾液、胃液、胸水、髄液、膿や気管支洗浄液、肺胞洗浄液、培養液など、生体より採取可能な全ゆる物質が含まれる。抽出試料はそのまま直接に使用することも可能だが、あらかじめ前処理として乳化処理または還元処理を施す。

〔第１の工程〕
抽出試料から核酸を抽出するためには、まず試料に含まれる核酸だけを遊離させる必要があるが、そのためには細胞膜や細胞壁等を破壊し、蛋白質を変性させる必要がある。この場合に有効なのが蛋白質変性剤の添加である。蛋白質変性剤としてはチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、尿素などの添加が有効である。これらの蛋白質変性剤のうち、少なくとも１種または２種以上の混合であってもよい。

蛋白質変性剤の添加量については、生体から採取した試料、たとえば１〜１０ｍｌ程度の血液に対し、０．０５ｍｌ程度ではあまり顕著な効果がなく、また１２０ｍｌを超えても変性効果においてあまり差はない。したがってこの場合の好ましい添加量については２ｍｌ〜６０ｍｌの範囲である必要がある。また試料に蛋白質変性剤を添加する具体的な手法としては、密閉可能な容器内での攪拌により実施される。蛋白質変性剤の添加により試料に含まれている細胞膜や細胞壁等が破壊され、蛋白質が変性される。

〔第２の工程〕
つぎに遊離した核酸を凝集させて不溶化する必要があるが、この場合に有効なのがアルコール類の添加である。用いられるアルコール類としては、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコールなどが挙げられる。使用に際してはこれらのうち、少なくとも１種または２種以上の混合として用いられる。

アルコール類の添加量については、０．０５ｍｌではあまり顕著な効果がなく、また１２０ｍｌを超えても変性効果においてあまり差がない。したがってこの場合の好ましい添加量については２ｍｌ〜６０ｍｌの範囲である必要がある。またアルコール類を添加する具体的な手法としては密閉可能な容器内への添加によりおこなわれる。アルコール類の添加により遊離核酸を凝集させる。上記のアルコール類の添加により例えば共沈剤等のキャリアー無しで遊離核酸を凝集・不溶化させることができる。

なお前記した第１の工程で使用される蛋白質変性剤についても、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコールなどのうち、少なくとも１種または２種以上の混合物を含有させたものであってもよい。アルコール類を含有させた場合には蛋白質の変性と核酸の凝集とを同時におこなうことができ、簡便性の向上により汚染の危険性が低下するのでさらに有利である。

〔第３の工程〕
不溶化した核酸の抽出は、上記により得られた核酸含有抽出物をフィルターを通過させて核酸をフィルターに捕集させることによりおこなわれる。ここで用いられるフィルターは、不溶化した核酸を通過させずに、しかもフィルター自体に粘着など付着することなく、単に担持されるだけで捕集することができる機能を有するものであればよく、これらの目的を達成できる材質としては核酸との静電的および疎水的などの分子間相互作用を起こしにくいものとしてポリプロピレン、ＰＶＤＦ、ナイロン、ＲＴＦＥからなるフィルターの使用が望ましい。

この場合にフィルターの平均ポアサイズを３．０μｍ以上とした場合には不溶化核酸の捕集が十分ではなく、また反対に０．１μｍ未満とした場合においては、不溶化核酸のみならず分離した蛋白質や不純物も捕集されてしまい、高精度の純粋な核酸のみを抽出することが困難である。したがってこの場合の不溶化核酸の捕集のためには平均ポアサイズが０．２μｍ〜１．０μｍの範囲内、さらに好ましくは０．２μｍ〜０．８μｍの範囲内のものがよい。

〔第４の工程〕
第３の工程で分離・抽出された抽出物に精製水を加えて可溶化させることによりＲＮＡまたはＤＮＡを抽出して高純度の核酸を得る。具体的には不溶化が解かれて可溶化されることによりフィルターを通過して回収される。なお上記した精製水に代えて低濃度の緩衝液を用いてもよい。

〔核酸の高純度抽出用キット〕
また、上記した第１の工程で用いられる蛋白質変性剤、および第２の工程で用いられるアルコール類、さらに第３の工程で用いられるフィルター、および必要に応じて第４の工程で用いられる精製水あるいは低濃度の緩衝液を加え、これらを１個の核酸の簡易抽出用キットとして製品化し、販売等により取り扱いをするようにすると、例えば機器類を使用することができず、あるいは保持していない等の環境下にある作業現場において、いちいち個別に取り揃える必要が無く、簡易かつ迅速に核酸の抽出活動を実施することができる。

生体からの試料の採取については、末梢血あるいは、リンパ節、胸腺などから採取することができる。患者由来のリンパ球であれば、いずれの組織あるいは臓器由来のものであってもよい。特に静脈からの末梢血の採取は患者の負担が軽く、簡便である。末梢血は、凝集を防ぐ目的でヘパリン加採血あるいはクエン酸加採血などで行えるが、本方法に限定されない。

また、一回に採血する血液量としては、０．１〜２００ｍｌ、より好ましくは、０．５ｍｌ〜１００ｍｌで行なうことができる。 さらに好ましくは１〜５０ｍｌで行なうこともできる。 本方法においては、大量の血液でも、また小量の血液を材料としてでも実施できるが、特に小量の血液の場合、患者の負担を最小限におさえることができる。 そのため、一回の採血量は１ｍｌ〜５０ｍｌ程度が好ましい。

上記の試料を１０μｌ分取し、密閉可能な容器に入れ、塩酸グアニジンを０．２ｍｌ添加し、３０秒から９０秒程度インキュベート攪拌した。これにより試料に含まれている細胞膜や細胞壁が破壊され、蛋白質が変性遊離された。その後ｔｅｒｔ−ブチルアルコールを０．３ｍｌ添加し、同じく３０秒から９０秒程度インキュベート攪拌して蛋白質を分離させるとともに、遊離核酸を凝集させることができた。

上記により得られた核酸含有抽出物を平均ポアサイズ０．１０μｍのナイロン製フィルターにかけて濾過してみたところ、不溶化核酸のみならず分離した蛋白質や不純物も捕集されてしまい、高精度の純粋な核酸のみを抽出することができなかった。そこでフィルターを、平均ポアサイズ０．２μｍのものに交換してみたところ目的とするＲＮＡまたはＤＮＡを捕集することに成功した。

上記により、目的とするＲＮＡまたはＤＮＡを分離・抽出して捕集した抽出物をフィルターごと、フィルターを保持可能な装具に入れ、精製水を加えて可溶化させることにより高純度の核酸を得ることができた。因みにこの場合の平均抽出効率は９３％程度と推定される。抽出した核酸は、以後の遺伝子解析や遺伝子検査等に十分に利用可能であった。また凍結血液を試料として用いた場合においても抽出効率の低下はみられなかった。

第１の工程で用いる蛋白質変性剤について、これにｎ−プロピルアルコールを５００μｌ含有させたものであるほかは上記実施例１のものと同様の各工程を経る核酸の単離・抽出を試みたところ、蛋白質変性剤にアルコール類を含有させた場合には蛋白質の変性と核酸の凝集とを同時におこなうことができるとともに、簡便性の向上により汚染の危険性が低下し、さらに有利であることが解った。

Claims (7)

1. 生体由来の抽出試料に対し、蛋白質変性剤を添加して細胞膜や細胞壁等を破壊し、蛋白質を変性させる第１の工程と、アルコール類を添加して遊離核酸をキャリアーなしで凝集させる第２の工程と、核酸含有抽出物をフィルターを通過させてＲＮＡまたはＤＮＡの少なくとも一方または両方を分離抽出する第３の工程と、抽出された抽出物に精製水あるいは低濃度の緩衝液を加えて可溶化させる第４の工程とからなる核酸の簡易抽出法。
2. 第１の工程で使用される蛋白質変性剤が、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、尿素のうち、少なくとも１種または２種以上の混合であるところの請求項１に記載の核酸の簡易抽出法。
3. 第２の工程で使用されるアルコール類が、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコールのうち、少なくとも１種または２種以上の混合であるところの請求項１に記載の核酸の簡易抽出法。
4. 第３の工程で使用されるフィルターが、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ、ナイロン、ＲＴＦＥのいずれかであるところの請求項１に記載の核酸の簡易単離・抽出法。
5. 第３の工程で使用されるフィルターが、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ、ナイロン、ＲＴＦＥのいずれかであって、しかも平均ポアサイズが０．１μｍ〜１．０μｍであるところの請求項１に記載の核酸の簡易抽出法。
6. 第１の工程で使用される蛋白質変性剤が、アルコール類を含有するものであるところの請求項１に記載の核酸の簡易抽出法。
7. 第１の工程で使用される蛋白質変性剤に、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコールのうち、少なくとも１種または２種以上のアルコール類を含有するものであるところの請求項１〜５のいずれか１に記載の核酸の簡易抽出法。