JP2009007339A

JP2009007339A - 歯科用インプラント用接着剤

Info

Publication number: JP2009007339A
Application number: JP2008136456A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Takahashi; 一裕高橋
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2007-05-30
Filing date: 2008-05-26
Publication date: 2009-01-15

Abstract

【課題】歯科用インプラントと生体組織、特に歯肉上皮等の軟組織との結合性を強化する歯科用インプラント用接着剤を提供する。
【解決手段】細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を含有する歯科用インプラント用接着剤。該ペプチド（Ｐ）としては、細胞接着シグナルを表す最小アミノ酸配列を有し、特に、ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列、ＴｙｒＩｌｅＧｌｙＳｅｒＡｒｇ配列、及びＩｌｅＬｙｓＶａｌＡｌａＶａｌ配列より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。さらに、該接着剤には、シランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤を含有させることが好ましい。
【選択図】なし

Description

本発明は、歯科用インプラント（人工歯根）用接着剤に関する。

現在、医科及び歯科領域において、人工関節、人工歯根など多くの金属製インプラントが臨床に用いられている。金属材料としては、その生体内安定性や生体適合性から、チタン及びチタン合金が、主に使用されている。チタン及びチタン合金は、元来、骨組織との結合性が良好であることが知られている。また、さらにその結合性を向上するために、サンドブラストや酸エッチングといった表面の粗化処理（特許文献１、２参照）や、ハイドロキシアパタイト等による被覆を施したインプラント（特許文献３）が開発されている。
特開２００４−３３７６１６号公報特表２００６−５０１８６７号公報特開２００５−０３４３３３号公報

しかしながら、これまでのインプラントは、骨組織への結合強化を目的としたものがほとんどであり、軟組織への親和性を考慮したものではない。特に、歯科用インプラントでは、その一部が口腔内に露出していることから、その歯肉上皮組織との結合の脆弱性が、歯周病の原因となり、結果としてインプラントの長期維持が困難となる問題が多く、未だその問題を解決する有効な手段がないのが実状である。すなわち、本発明の目的は、歯科用インプラントと生体組織、特に歯肉上皮等の軟組織との結合性を強化する歯科用インプラント用接着剤を提供することである。

本発明者は、鋭意研究を重ねてきた結果、特定の組成からなる接着剤を使用することにより上記目的を達成することを見いだし本発明に到達した。すなわち、本発明の歯科用インプラント用接着剤は、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を含有することを要旨とする。

本発明の歯科用インプラント用接着剤は、歯科用インプラントと生体組織、特に歯肉上皮等の軟組織との結合性に優れる。したがって、本発明の歯科用インプラント用接着剤は、歯周組織と強固に結合できるため、歯周病の原因となることがなく、埋入したインプラントの長期間の維持が可能となる。

細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）は、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列を含んでいる。なお、「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。

細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列（Ｘ）としては、例えば、「病態生理、第９巻第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。

これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の中で、ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列、ＬｅｕＡｓｐＶａｌ配列、ＬｅｕＡｒｇＧｌｕ配列、ＨｉｓＡｌａＶａｌ配列、ＡｒｇＧｌｕＡｓｐＶａｌ配列（１）、ＴｙｒＩｌｅＧｌｙＳｅｒＡｒｇ配列（２）、ＰｒｏＡｓｐＳｅｒＧｌｙＡｒｇ配列（３）、ＡｒｇＴｙｒＶａｌＶａｌＬｅｕＰｒｏＡｒｇ配列（４）、ＬｅｕＧｌｙＴｈｒＩｌｅＰｒｏＧｌｙ配列（５）、ＡｒｇＡｓｎＩｌｅＡｌａＧｌｕＩｌｅＩｌｅＬｙｓＡｓｐＩｌｅ配列（６）、ＩｌｅＬｙｓＶａｌＡｌａＶａｌ配列（７）、ＬｅｕＡｒｇＧｌｕ配列、ＡｓｐＧｌｙＧｌｕＡｌａ配列（８）、ＧｌｙＶａｌＬｙｓＧｌｙＡｓｐＬｙｓＧｌｙＡｓｎＰｒｏＧｌｙＴｒｐＰｒｏＧｌｙＡｌａＰｒｏ配列（９）、ＧｌｙＧｌｕＰｈｅＴｙｒＰｈｅＡｓｐＬｅｕＡｒｇＬｅｕＬｙｓＧｌｙＡｓｐＬｙｓ配列（１０）、及びＴｙｒＬｙｓＬｅｕＡｓｎＶａｌＡｓｎＡｓｐＳｅｒ配列（１１）、ＡｌａＬｙｓＰｒｏＳｅｒＴｙｒＰｒｏＰｒｏＴｈｒＴｙｒＬｙｓ配列（１２）、ＡｓｎＡｒｇＴｒｐＨｉｓＳｅｒＩｌｅＴｙｒＩｌｅＴｈｒＡｒｇＰｈｅＧｌｙ配列（１３）、ＴｈｒＴｒｐＴｙｒＬｙｓＩｌｅＡｌａＰｈｅＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｒｇＬｙｓ配列（１４）、ＡｒｇＬｙｓＡｒｇＬｅｕＧｌｎＶａｌＧｌｎＬｅｕＳｅｒＩｌｅＡｒｇＴｈｒ配列（１５）及びＰｒｏＨｉｓＳｅｒＡｒｇＡｓｎ配列（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、細胞接着性の観点等から、さらに好ましくはＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列、ＴｙｒＩｌｅＧｌｙＳｅｒＡｒｇ配列（２）、ＩｌｅＬｙｓＶａｌＡｌａＶａｌ配列（７）、ＡｒｇＬｙｓＡｒｇＬｅｕＧｌｎＶａｌＧｌｎＬｅｕＳｅｒＩｌｅＡｒｇＴｈｒ（１５）及びＰｒｏＨｉｓＳｅｒＡｒｇＡｓｎ配列（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列、ＴｙｒＩｌｅＧｌｙＳｅｒＡｒｇ配列（２）及びＩｌｅＬｙｓＶａｌＡｌａＶａｌ配列（７）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。

細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）は、細胞接着性の観点から、前記最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有することが好ましく、さらに好ましくは１分子中に２〜５０個、つぎにさらに好ましくは１分子中に３〜３０個、特に好ましくは１分子中に５〜２０個、最も好ましくは１分子中に１３個である。

（Ｐ）は、（Ｐ）の熱に対する安定性の観点から、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列以外に、アミノ酸配列として、ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ配列（Ｙ）をさらに含んでなることが好ましい。（Ｙ）を含んでなる場合、アミノ酸配列（Ｙ）の含有量は、熱に対する安定性の観点から、（Ｐ）の１分子中に、２〜１０，０００個有するものが好ましく、さらに好ましくは１分子中に１０〜３，０００個、特に好ましくは１分子中に３０〜１，０００個である。また、熱的安定性の観点から、アミノ酸配列ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ（Ｙ）は、（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）_a（ａは任意の整数）のような連続した繰り返しの形で含まれることが好ましく、ａの好ましい範囲は２〜３３であり、さらに好ましくは３〜２３、特に好ましくは４〜１３である。

（Ｐ）が（Ｘ）及び（Ｙ）を含有する場合、（Ｐ）中の（Ｘ）と（Ｙ）との個数の比率［（Ｘ）／（Ｙ）］は、細胞接着性と熱に対する安定性の観点から、０．００２〜１０が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜２、特に好ましくは０．０５〜０．５である。また、細胞接着性人工ペプチドがβターン構造を取りやすい観点から、アミノ酸配列ＡｒｇＧｌｙＡｓｐとアミノ酸配列（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）_aとが交互に位置することが好ましい。

細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）は、人工的に製造されるものであり、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）、及び遺伝子組み換え法等によって容易に製造できる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法とも、（Ｐ）を作製できるが、（Ｐ）のアミノ酸配列を容易に設計・変更でき、（Ｐ）を安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。

（Ｐ）は、（Ｐ）のインプラント基材に対する結合性の観点から、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列以外に、アミノ酸配列として、ＡｒｇＬｙｓＬｅｕＰｒｏＡｓｐＡｌａ配列（１７）（Ｚ）をさらに含んでなることが好ましい。（Ｐ）がアミノ酸配列ＡｒｇＬｙｓＬｅｕＰｒｏＡｓｐＡｌａ（Ｚ）を有してなる場合、（Ｐ）の１分子中に少なくとも１個有すればよいが、インプラント基材に対する結合性の観点から、１分子中に２〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは１分子中に３〜３０個、特に好ましくは１分子中に５〜２０個有するものである。

細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）にアミノ酸配列ＡｒｇＬｙｓＬｅｕＰｒｏＡｓｐＡｌａ（Ｚ）を含有させる手段としては、遺伝子組み換えによる方法、及び反応性基｛水酸基、カルボキシル基、メルカプト基、並びに１級又は２級アミノ基等｝を有するアミノ酸残基に対して化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝させる方法がある。化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、特開２００７−５１１２７号公報等に記載の方法が挙げられる。化学結合のうち、結合の強さの観点等から、共有結合が好ましい。これらの反応性基のうち、結合形成の容易さの観点から、水酸基、カルボキシル基及び１級アミノ基が好ましく、さらに好ましくは水酸基及びカルボキシル基、特に好ましくは水酸基である。化学結合形成反応には反応溶媒を使用してもよく、反応溶媒としては公知のものが使用でき、例えば、水、臭化リチウム水溶液、過塩素酸リチウム水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルフォキシド、ジメチルアセトアミド及びテトラヒドロフランが挙げられる。

細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の好適な例を以下に示す。
ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列の１３個と（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）₉配列（１８）の１２個とを有し、これらが交互に位置する構造を有するＭｎ約１１万のペプチド｛「プロネクチンＦ」、プロネクチンは三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；
ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列の５個と（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）₃配列（１９）の５個とを有しこれらが交互に位置する構造を有するＭｎ約２万のペプチド（「プロネクチンＦ２」）；
ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列の３個と（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）₃配列の３個とを有しこれらが交互に位置する構造を有するＭｎ約１万のペプチド（「プロネクチンＦ３」）；
ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列の６個とＡｒｇＬｙｓＬｅｕＰｒｏＡｓｐＡｌａ配列（１７）の６個と（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）₉配列（１８）の１２個とを有し、これらがＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列、（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）₉配列、ＡｒｇＬｙｓＬｅｕＰｒｏＡｓｐＡｌａ配列、（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）₉配列の順に交互に位置する構造を有するＭｎ約１１万のペプチド（「プロネクチンＦＴ」）；
「プロネクチンＦ」のＳｅｒ残基に対してアミノ酸配列ＡｒｇＬｙｓＬｅｕＰｒｏＡｓｐＡｌａを化学結合したＭｎ約１２万のペプチド（「プロネクチンＦＴ２」）等。

（Ｐ）の数平均分子量は、細胞接着性、インプラント基材に対する結合性、熱に対する安定性の観点から、３００〜３，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは１，０００〜１，０００，０００、特に好ましくは３，０００〜３００，０００である。なお、（Ｐ）の数平均分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法で、（Ｐ）を分離し、泳動距離を標準物質と比較することによって求めるものである（以下、同じである）。

本発明の歯科用インプラント用接着剤は、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を含有する。（Ｐ）以外に、シランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤を含有することは、（Ｐ）のインプラント基材に対する結合性を強固にするために好ましい。

シランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤としては、特開２００６−２８２９１５号公報に記載の物質等が利用できる。細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）との化学結合形成の観点から、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、チタンラクテート等を用いることが好ましい。

シランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤を含有する場合、（１）（Ｐ）とシランカップリング剤とを単純に混合する、（２）（Ｐ）とシランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤との間の結合反応を行い側鎖にアルコキシシリル基を導入した細胞接着性人工ペプチドとする等のいずれでもよい。なお、（２）の場合、化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、例えば、特開２００７−５１１２７号公報等に記載の方法が挙げられる。縮合反応には反応溶媒を使用してもよく、反応溶媒としては公知のものが使用でき、例えば、水、臭化リチウム水溶液、過塩素酸リチウム水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルフォキシド、ジメチルアセトアミド及びテトラヒドロフランが挙げられる。

また、（２）の場合、使用した（Ｐ）とシランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤との間に化学結合が形成されることが好ましいが、使用したすべての（Ｐ）がシランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤と化学結合する必要はなく、その一部分がシランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤と化学結合していてもよい。（Ｐ）をシランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤と化学的に結合させる場合、化学反応に関与する（Ｐ）の官能基としては、カルボキシル基、アミノ基及び水酸基等が挙げられる。

また、本発明の接着剤は、シランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤を使用する場合、（Ｐ）とシランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤との化学結合形成を促進する観点から、公知の縮合剤（カルボニルジイミダゾール化合物、カルボジイミド化合物等）等を含んでいても良い。

シランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤を含有する場合、その含有量は、インプラント基材に対する結合性の観点から、（Ｐ）の重量に基づいて、０．００１μｇ／ｇ〜１０００ｇ／ｇが好ましく、さらに好ましくは０．０１μｇ／ｇ〜１００ｇ／ｇ、特に好ましくは０．１μｇ／ｇ〜１０ｇ／ｇ、最も好ましくは１μｇ／ｇ〜１ｇ／ｇである。

本発明の歯科用インプラント用接着剤に含有される細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の含有量は、接着剤の全重量に基づいて、０．００１μｇ／ｇ〜１，０００ｍｇ／ｇが好ましく、さらに好ましくは０．０１μｇ／ｇ〜１００ｍｇ／ｇ、特に好ましくは０．１μｇ／ｇ〜１０ｍｇ／ｇ、最も好ましくは１μｇ／ｇ〜１ｍｇ／ｇである。

本発明の歯科用インプラント用接着剤は、（Ｐ）以外に、天然高分子材料（コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、キチン、キトサン等）及び合成高分子材料（ポリエチレングリコール等）等を含有していても良い。

また、性状としては、特に制限はなく、例えば、溶液（溶剤として例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、エタノール等）、分散液（分散媒として例えば、水、ＰＢＳ、エタノール等）、軟膏、ゲル、フィルム及びスポンジ等が挙げられる。

本発明の歯科用インプラント用接着剤は、（Ｐ）以外にシランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤等を含有する場合、（Ｐ）とシランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤とを混合することにより製造できる。混合装置としては、マグネチックスタラー、ボルテックスミキサー、撹拌翼を備えた混合槽等の従来公知の装置が適用できる。混合する温度としては、１０〜６０℃が好ましい。
本発明の接着剤をゲル状にする場合、（Ｐ）単独の溶液、または（Ｐ）とその他の高分子材料（例えば、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸等）の混合溶液を、架橋処理することにより製造できる。架橋方法としては従来公知の方法が適用でき、熱脱水架橋、電子線架橋、縮合剤による化学架橋等が適用できる。
本発明の接着剤をフィルム状にする場合、（Ｐ）単独の溶液、または（Ｐ）とその他の高分子材料（例えば、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸等）の混合溶液を、キャストし、乾燥させることで製造できる。キャストする方法としては、従来公知のアプリケーター等が使用できる。乾燥温度としては、２５℃〜１００℃が好ましい。
本発明の接着剤をスポンジ状にする場合、（Ｐ）単独の溶液、または（Ｐ）とその他の高分子材料（例えば、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸等）の混合溶液を、凍結乾燥することにより製造できる。凍結乾燥する方法としては、従来公知の方法が適用でき、超低温槽中または液体窒素中で凍結させた試料を、真空ポンプによる減圧下で溶媒を昇華させる等の方法である。

本発明の歯科用インプラント用接着剤は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法としては、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、プラズマ滅菌、γ線滅菌、アルコール滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。

本発明の歯科用インプラント用接着剤の使用方法としては、特に制限はなく、例えば、噴霧、浸漬、塗布等の方法によりインプラント基材の表面に被覆し使用する。
また、インプラント基材は、本発明の接着剤を被覆する前に、シランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤をインプラント基材に塗布してから使用しても良い。

本発明の歯科用インプラント用接着剤を適用できる被接着細胞としては、哺乳動物細胞が特に適している。哺乳動物としては、有袋目（カンガルー等）、霊長目（サル、チンパンジー及びヒト等）、齧歯目（リス、ネズミ及びヤマアラシ等）、鯨目（イルカ、シャチ及びクジラ等）、食肉目（イヌ、キツネ、クマ、ネコ、ライオン及びトラ等）、奇蹄目（ウマ、ロバ及びサイ等）及び偶蹄目（イノシシ、ブタ、ラクダ、シカ、ウシ、ヤギ及びヒツジ等）等の「生物学辞典（岩波書店発行、１９６９年）」に記載されている哺乳動物が挙げられる。哺乳動物のうち、細胞との結合性の観点から、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ラット及びマウスが好ましく、さらに好ましくはヒトである。哺乳動物細胞としては、例えば、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝実質細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯肉上皮細胞、歯肉線維芽細胞、歯根膜細胞及び骨芽細胞）、及びこれらの幹細胞が挙げられる。これらの細胞のうち、細胞との結合性の観点から、特に好ましくは、歯肉上皮細胞、歯肉線維芽細胞、歯根膜細胞、骨芽細胞、骨細胞及びこれらの幹細胞である。

インプラント材料としては、例えば、金属材料、セラミックス材料、有機高分子材料及びこれらの二種以上を含む複合材料等が使用できる。
金属材料としては、例えば、チタン、アルミニウム、コバルト、クロム、モリブデン、鉄、ニッケル、ジルコニウム、ニオブ、タンタル及びこれらの二種以上を含む複合材料（「移植と人工臓器（株式会社岩波書店、発行岩波講座現代医学の基礎１４）」及び特開平７−８８１７４号公報等に記載のもの）等が挙げられる。複合材料としては、チタン合金（Ｔｉ−６Ａｌ−４Ｖ及びＴｉ−６Ａｌ−２Ｎｂ−１Ｔａ等）及びコバルトクロム合金等が挙げられる。これらのうち、生体親和性、骨結合性の観点から、チタン及びチタン合金が好ましい。

セラミックス材料としては、例えば、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム｛リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）［s−リン酸三カルシウム（s−ＴＣＰ）等］等｝、バイオガラス（ＳｉＯ₂−ＣａＯ−Ｎａ₂Ｏ−Ｐ₂Ｏ₅）［セラビタール（ＳｉＯ₂−ＣａＯ−Ｎａ₂Ｏ−Ｐ₂Ｏ₅−Ｋ₂Ｏ−ＭｇＯ）等］、ＣＰＳＡ［ＣａＯ−Ｐ₂Ｏ₅−ＳｉＯ₂−Ａｌ₂Ｏ₃］ガラス線維複合材、アパタイト−ウォラストナイト（Ａ−Ｗ）ガラスセラミックス［ＳｉＯ₂−ＣａＯ−ＭｇＯ−Ｐ₂Ｏ₅］、アルミナ、ジルコニア、カーボン、チタニア、サファイア、炭化珪素、窒化珪素及びこれらの二種以上を含む複合材料（「移植と人工臓器（株式会社岩波書店、発行岩波講座現代医学の基礎１４）」及び特開平７−８８１７４号公報等に記載のもの）等が挙げられる。これらのうち、生体親和性、骨結合性の観点から、ヒドロキシアパタイト、ＴＣＰ、s−ＴＣＰ、バイオガラス、セラビタール、ＣＰＳＡガラス線維複合材、Ａ−Ｗガラスセラミックス、アルミナ、及びジルコニアが好ましく、さらに好ましくはヒドロキシアパタイトである。

有機高分子材料としては、例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエチレン及びこれらの二種以上を含む複合材料（「移植と人工臓器（株式会社岩波書店、発行岩波講座現代医学の基礎１４）」及び特開平７−８８１７４号公報等に記載のもの）等が挙げられる。これらのうち、生体内での安定性の観点から、ポリメチルメタクリレート及びポリエチレンが好ましい。有機高分子材料の重量平均分子量（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー法）は、生体内での安定性の観点から、０．５万〜２億５，０００万が好ましく、さらに好ましくは２万〜５，０００万、特に好ましくは１０万〜１，０００万である。

これらの二種以上を含む複合材料としては、例えば、セラミック材料と金属材料との複合材料（例えば、ヒドロキシアパタイトとチタンとの複合材料、s−ＴＣＰとチタンとの複合材料及びＡ−Ｗガラスセラミックスとチタンとの複合材料等）、金属材料と有機高分子材料との複合材料（例えば、チタンとポリメチルメタクリレートとの複合材料、及びチタンとポリエチレンとの複合材料等）及びセラミック材料と金属材料と有機高分子材料との複合材料（例えば、ヒドロキシアパタイトとチタンとポリエチレンとの複合材料等）（「移植と人工臓器（株式会社岩波書店、発行岩波講座現代医学の基礎１４」及び特開平７−８８１７４号公報等に記載のもの）等が挙げられる。

これらのうち、生体親和性、骨結合性の観点から、金属材料、セラミックス材料及びセラミックス材料と金属材料との複合材料が好ましく、さらに好ましくは金属材料及びセラミックス材料と金属材料との複合材料、特に好ましくはチタン、チタン合金、ヒドロキシアパタイトとチタンとの複合材料、s−ＴＣＰとチタンとの複合材料及びＡ−Ｗガラスセラミックスとチタンとの複合材料である。

本発明の歯科用インプラント用接着剤を用いて歯科用インプラント表面を被覆した時のインプラントにおける細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の含有量は、細胞接着性の観点から、インプラント材料の単位表面積あたり、０．１ｎｇ／ｃｍ²〜１００ｍｇ／ｃｍ²が好ましく、さらに好ましくは１ｎｇ／ｃｍ²〜１０ｍｇ／ｃｍ²、特に好ましくは１０ｎｇ／ｃｍ²〜１ｍｇ／ｃｍ²、最も好ましくは１００ｎｇ／ｃｍ²〜１００μｇ／ｃｍ²である。単位表面積あたりの細胞接着性ペプチドの含有量の測定方法は特に限定されないが、例えば、免疫学的測定、ラジオアイソトープラベル化による測定等が利用できる。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

＜実施例１＞
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列の１３個と（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）₉配列（１８）の１２個とを有し、これらが交互に位置する構造を有するＭｎ約１１万のペプチドを遺伝子組換え大腸菌により製造し、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−０）を得た。

細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−０）５０ｍｇと塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド（特級試薬）１５０ｍｇとを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．５ｍＬに２０〜４０℃で溶解した後、その溶液を２０〜４０℃で攪拌しながら、水酸化ナトリウム（特級試薬）１００ｍｇを溶解した４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．３２５ｍＬを４５〜５０秒間かけて一定速度で滴下し仕込んだ。室温（２５℃）で１時間攪拌したのち、反応液を分画分子量１２，０００〜１４，０００の透析膜を用いて、脱イオン水１０Ｌに対して４８時間透析した。なお、最初の１２時間は、4時間経過毎に脱イオン水を交換した。得られた水溶液を、−２０℃、０．１ｋＰａ以下の条件で、２４時間凍結乾燥して、水溶性の細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−１）を得た。

細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−１）３ｍｇをガラス試験管中で乾燥（１００℃、３０分）した後、モレキュラーシーブス（４Ａ１／８）にて２４時間脱水処理したＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）２ｍＬに２０〜４０℃で溶解した。さらに、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（特級試薬）２ｍｇを加え、２０〜４０℃で溶解した。ＬｙｓＡｒｇＬｙｓＬｅｕＰｒｏＡｓｐＡｌａ配列（Ｚ）からなるペプチド（「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法に準じて、有機合成法により合成した）７ｍｇを加え、２０〜４０℃で２０時間攪拌した。得られた反応溶液を分画分子量１２，０００〜１４，０００の透析膜を用いて、脱イオン水１０Ｌに対して４８時間透析した。なお、最初の１２時間は、4時間経過毎に脱イオン水を交換した。次いで、得られた水溶液を、−２０℃、０．１ｋＰａ以下の条件で、２４時間凍結乾燥して細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−２）を得た。導入されたアミノ酸配列（Ｚ）の平均個数は１６個であった｛アミノ酸配列（Ｚ）中のＬｙｓ及びＡｒｇ残基に由来する１級アミノ基量の増分を公知のトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）法[「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）等]により定量し、算出した｝。

細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−２）を、脱イオン水に対して、１００μｇ／ｇの濃度で溶解し、本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ１）を得た。

＜実施例２＞
「細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−０）」を「ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列の３個と（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）₃配列（１９）の３個とを有しこれらが交互に位置する構造を有するＭｎ約１万のペプチド（Ｐ２−０）｛特表平３−５０２９３５号公報に記載の方法に準じて調製した｝」に変更したこと以外、実施例１と同様にして（Ｐ２−１）、（Ｐ２−２）を得、さらに実施例１と同様にして本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ２）を得た。
（Ｐ２−２）において、導入されたアミノ酸配列（Ｚ）の平均個数は１個であった｛実施例１と同様にして算出した｝。

＜実施例３＞
「細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−０）」を「ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列の４８個と（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）₉配列の４８個とを有しこれらが交互に位置する構造を有するＭｎ約４４万のペプチド（Ｐ３−０）｛特表平３−５０２９３５号公報に記載の方法に準じて調製した実施例１と同様にして調製した｝」に変更したこと以外、実施例１と同様にして（Ｐ３−１）、（Ｐ３−２）を得、さらに実施例１と同様にして本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ３）を得た。（Ｐ３−２）において、導入されたアミノ酸配列（Ｚ）の平均個数は４８個であった｛実施例１と同様にして算出した｝。

＜実施例４＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−２）及び３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランを、各々２００μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液を作成し、これらを等量混合することにより本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ４）を得た。

＜実施例５＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−２）及びチタンラクテートを、各々２００μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液を作成し、これらを等量混合することにより本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ５）を得た。

＜実施例６＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−０）を、脱イオン水に対して、１００μｇ／ｇの濃度で溶解し、本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ６）を得た。

＜実施例７＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−０）及び３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランを、各々２００μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液を作成し、これらを等量混合することにより本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ７）を得た。

＜実施例８＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−０）及びチタンラクテートを、各々２００μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液を作成し、これらを等量混合することにより本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ８）を得た。

＜実施例９＞
「細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−０）」を「ＴｙｒＩｌｅＧｌｙＳｅｒＡｒｇ配列（２）の１３個と（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）₉配列（１８）の１２個とを有しこれらが交互に位置する構造を有するＭｎ約１１万のペプチド（Ｐ４−０）｛特表平３−５０２９３５号公報に記載の方法に準じて調製した実施例１と同様にして調製した｝」に変更したこと以外、実施例１と同様にして細胞接着性ペプチド（Ｐ４−１）、（Ｐ４−２）及び、本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ９）を得た。（Ｐ４−２）において、導入されたアミノ酸配列（Ｚ）の平均個数は１７個であった｛実施例１と同様にして算出した｝。

＜実施例１０＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ４−２）及び３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランを、各々２００μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液を作成し、これらを等量混合することにより本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ１０）を得た。

＜実施例１１＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ４−２）及びチタンラクテートを、各々２００μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液を作成し、これらを等量混合することにより本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ１１）を得た。

＜実施例１２＞
「細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−０）」を「ＩｌｅＬｙｓＶａｌＡｌａＶａｌ配列（７）の１３個と（ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ）₉配列（１８）の１２個とを有しこれらが交互に位置する構造を有するＭｎ約１１万のペプチド（Ｐ５−０）｛特表平３−５０２９３５号公報に記載の方法に準じて調製した実施例１と同様にして調製した｝」に変更したこと以外、実施例１と同様にして細胞接着性ペプチド（Ｐ５−１）、（Ｐ５−２）及び、本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ１２）を得た。（Ｐ５−２）において、導入されたアミノ酸配列（Ｚ）の平均個数は１５個であった｛実施例１と同様にして算出した｝。

＜実施例１３＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ５−２）及び３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランを、各々２００μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液を作成し、これらを等量混合することにより本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ１３）を得た。

＜実施例１４＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ５−２）及びチタンラクテートを、各々２００μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液を作成し、これらを等量混合することにより本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ１４）を得た。

＜実施例１５＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−２）を、脱イオン水に対して、１，０００，０００μｇ／ｇの濃度で溶解し、本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ１５）を得た。

＜実施例１６＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−２）を、脱イオン水に対して、０．００１μｇ／ｇの濃度で溶解し、本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ１６）を得た。

＜実施例１７＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−２）を２００μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液と、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランを２００，０００μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液を作成し、これらを等量混合することにより本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ１７）を得た。

＜実施例１８＞
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ１−２）を２００μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液と、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランを０．００００００２μｇ／ｇの濃度で脱イオン水に溶解した溶液を作成し、これらを等量混合することにより本発明の歯科用インプラント用接着剤（Ａ１８）を得た。

＜比較例１＞
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、脱イオン水に対して、１００μｇ／ｇの濃度で溶解し、比較用の歯科用インプラント用接着剤（Ａ１９）を得た。

＜評価１＞
（ポリスチレン製マルチウェルプレートでの歯肉上皮細胞接着性評価）
評価する接着剤をポリスチレン製９６ウェルプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．３５−１１７２）の６穴に、１００μＬ／穴で投入後、２０〜３０℃で２時間放置して表面被覆を行った。アスピレーターを用いて接着剤を除去した後、生理食塩水を１００μＬ／穴で投入し直ぐに除去する操作を２度、さらに脱イオン水で同様の操作を１度行って洗浄を行った。マウス由来歯肉上皮細胞を５万個／穴で投入し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて１時間放置して接着させた。細胞懸濁液調製および細胞培養に使用する培地としては、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）１％及び上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）１ｎｇ／ｍＬを添加したＳＦＭ−１０１培地（日水製薬株式会社製）を用いた。１時間経過後、アスピレーターを用いて培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で投入し直ぐに除去する操作を２度繰り返した。次に培地を１００μＬ／穴で添加し、さらに生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に３時間放置した。３時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定した。各々の接着剤について６穴の吸光度の測定を行い、この測定値の平均値を細胞接着活性とした。これらの結果を表１に示す。

＜評価２＞
（チタンプレート上での歯肉上皮細胞接着性評価）
チタンプレート（１０ｍｍ×１０ｍｍ）を、各接着剤の２ｍＬ中に浸漬し、２０〜３０℃で２時間放置した。その後、チタンプレートを取り出し、脱イオン水５ｍＬに浸漬し直ぐに取り出す洗浄操作を３回行い、次いで、６０℃の順風乾燥機の中で２時間乾燥を行った。各チタンプレートを、ポリスチレン製２４ウェルプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製、Ｃｏｄｅ．Ｎｏ．３５−１１４７）のウェル中に設置し、その上からマウス由来歯肉上皮細胞を３０万個／穴で投入し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて１時間放置して接着させた。細胞懸濁液調製および細胞培養に使用する培地としては、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）１％及び上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）１ｎｇ／ｍＬを添加したＳＦＭ−１０１培地（日水製薬株式会社製）を用いた。１時間経過後、チタンプレートを取り出し、ＰＢＳ中に静かに浸漬して、接着していない細胞を取り除いた後、新たなポリスチレン製２４ウェルプレート中に静置し、培地を５００μＬ／穴で添加し、さらに生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）を５０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に３時間放置した。３時間後に、上清１００μＬを９６ウェルプレートに移し、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定した。各々の接着剤について各６枚のチタンプレートを用いて同様の測定を行い、この測定値の平均値を細胞接着活性とした。これらの結果を表２に示す。

表１及び表２の結果から、本発明の歯科用インプラント用接着剤は、比較例に比べて細胞の接着活性が極めて高いことがわかる。特に、チタン表面への細胞接着活性を極めて高く保つことがわかる。

本発明の歯科用インプラント用接着剤は、チタン等のインプラント基材表面に対して、歯肉上皮細胞を極めて効率良く接着させることができる。従って、本発明の歯科用インプラント用接着剤は、歯科用インプラントと歯周組織との結合性を高めることができ、埋入された歯科用インプラントが長期間維持される等の効果を奏し、歯科用インプラント用接着剤として好適に使用できる。

Claims

細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）を含有することを特徴とする、歯科用インプラント用接着剤。
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が、細胞接着シグナルを表す最小アミノ酸配列（Ｘ）を含んでなる請求項１に記載の接着剤。
細胞接着シグナルを表す最小アミノ酸配列（Ｘ）がＡｒｇＧｌｙＡｓｐ配列、ＴｙｒＩｌｅＧｌｙＳｅｒＡｒｇ配列（２）及びＩｌｅＬｙｓＶａｌＡｌａＶａｌ配列（７）より選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載の接着剤。
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）１分子中の細胞接着シグナルを表す最小アミノ酸配列（Ｘ）が、１〜５０個である請求項２又は３に記載の接着剤。
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が、さらにＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ配列（Ｙ）を含有させてなる請求項１〜４のいずれかに記載の接着剤。
細胞接着シグナルを表す最小アミノ酸配列（Ｘ）とＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒ配列（Ｙ）との個数の比率［（Ｘ）／（Ｙ）］が０．００２〜１０である請求項５に記載の接着剤。
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が、さらに最小アミノ酸配列ＡｒｇＬｙｓＬｅｕＰｒｏＡｓｐＡｌａ（Ｚ）を含有させてなる請求項１〜６のいずれかに記載の接着剤。
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）が、１分子中に最小アミノ酸配列ＡｒｇＬｙｓＬｅｕＰｒｏＡｓｐＡｌａ（Ｚ）を１〜５０個有する請求項７に記載の接着剤。
さらに、シランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤を含有させてなる請求項１〜８のいずれかに記載の接着剤。
シランカップリング剤及び／又はチタンカップリング剤の含有量が、細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の重量に基づいて、０．００１μｇ／ｇ〜１，０００ｇ／ｇである請求項９に記載の接着剤。
細胞接着性人工ペプチド（Ｐ）の含有量が、接着剤の全重量に基づいて、０．００１μｇ／ｇ〜１，０００ｍｇ／ｇである請求項１〜１０のいずれかに記載の接着剤。
歯肉上皮細胞、歯肉線維芽細胞及び骨細胞及び骨芽細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞を接着させるための請求項１〜１１のいずれかに記載の接着剤。
請求項１〜１２のいずれかに記載の接着剤により表面を被覆された歯科用インプラント。
請求項１〜１２のいずれかに記載の接着剤を用いて、インプラント基材の表面を噴霧、浸漬及び塗布からなる群から選ばれる少なくとも１種の方法によりインプラント基材の表面に被覆することを特徴とする歯科用インプラントの製造方法。