JP2009098010A - 近接場光学顕微鏡用カンチレバー、それを用いたプラズモン増強蛍光顕微鏡及び蛍光検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】金属プローブを有する近接場光学顕微鏡用カンチレバーを用いた蛍光検出において、蛍光の金属消光を抑えることにより、蛍光信号の定量性を確保する。
【解決手段】自由端近傍に錐形状のプローブ２４を備えた近接場光学顕微鏡用カンチレバー２１において、プローブ２４は、プローブ２４の表面を成す１層以上の薄膜からなる薄膜部２７と 薄膜部２７に覆われた内部のバルク部２８とから構成される。薄膜部２７の最表層に誘電体薄膜２５を有し、誘電体薄膜２５よりも内側に金属部２９を有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、近接場光学顕微鏡用カンチレバーに関するものであり、さらにそれを用いた蛍光顕微鏡及び蛍光検出方法、特に詳細にはプラズモン増強を利用したプラズモン増強蛍光顕微鏡及び蛍光検出方法に関するものである。

近接場光学顕微鏡は、フォトンを回折限界以下の領域に閉じ込めたプローブを用いて試料を観察し、分析・加工する光学顕微鏡である。照明光を近接場プローブにより数１０ｎｍ以下の領域に絞り込み、その領域にある物質からの散乱光、透過光、蛍光等を分光器に通して検出することで、その物質のスペクトルをナノスケールで測定することができる。走査トンネル顕微鏡や原子間力顕微鏡などの走査プローブ顕微鏡に分光学的分析機能を持たせた評価装置として位置づけることができ、ナノテクノロジーにより生み出される新素材、ナノデバイスの評価・分析装置として期待されている。

このような近接場光学顕微鏡を用いた例として、非特許文献１及び２等に示されているように、一分子レベルでの検出が可能である金属プローブを用いたラマン分光法が挙げられる。これは、金属プローブ先端に光を入射して、この先端に局在プラズモンを生じさせ、これにより基板とプローブの間に生じる局所的な強電場を利用するものである。これにより、プローブ直下にある分子によるラマン過程の散乱断面積を実効的に増大し、理論的には入射光強度の数１０倍から１０^６倍の増強度が得られると考えられている（非特許文献２ ｐｐ．２７７ ２．２．１節）。しかしながら、ラマン信号は、溶媒などの被検出物質が置かれている状態及び環境に大きく左右され、また夾雑物の振動もスペクトルに現れるため、定性分析としては有用であるが定量性は期待できない。また、一般的にラマン分光装置は、大型かつ高価であり操作性も良くない。

一方、金属プローブを用いた手法で、同様に一分子レベルでの検出が実現されているものとして蛍光法を用いた蛍光顕微鏡がある。蛍光法とは、特定波長の光に励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出することによって被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質自身が蛍光体ではない場合、この被検出物質を有機蛍光色素等の蛍光標識で標識し、その後同様にして蛍光を検出することにより、その特異的な結合すなわち被検出物質の存在を確認する方法である。

とりわけここ数年、蛍光法は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光 ５２５ｎｍ、蛍光量子収率 ０．６）やＣｙ５（蛍光 ６８０ｎｍ、蛍光量子収率 ０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている。

蛍光法は、その吸収断面積が１０^−１６ｃｍ^２／ｍｏｌｅｃであり、ラマン散乱の散乱断面積１０^−３０ｃｍ^２／ｍｏｌｅｃに対して非常に大きいため、定量性がより高く容易に実施可能なバイオ測定として広く用いられている。さらに、蛍光法は、ラマン分光法に比べ、被検出物質が置かれている状態及び環境、または夾雑物等による影響を受けにくい分析法としても知られている。最近では、非特許文献３に示されているように、基板に起こした表面プラズモンによる電場増強効果を利用することにより、蛍光強度を増幅する手法も多く用いられている。
井上康志、河田聡，分光研究，第５１巻，第６号，ｐ．２７６−２８５（２００２） 井上康志、外３名，表面科学，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．１１，ｐ．６６７−６７４（２００５） Margarida M. L. M. Vareiro, et al., Analytical Chemistry, Vol. 77, No. 8, p.2426-2431 (2005)

しかしながら、実際には、金属プローブに起因する金属消光が大きな問題となっている。金属消光とは、エネルギーを吸収し励起した蛍光体の近傍に金属が存在する場合、蛍光体から金属へエネルギー移動が起こり金属内でエネルギーが消失される、無放射的なエネルギー失活である。これにより、本来蛍光を発することに使用されるエネルギーが減少し、蛍光体の蛍光量子収率が上がらず、蛍光信号の定量性が確保できていないのが現状である。

本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、金属消光を抑えることにより、プラズモンによる電場増強効果を有効に利用すると同時に、蛍光信号の定量性を確保することが可能な近接場光学顕微鏡用カンチレバー、それを用いたプラズモン増強蛍光顕微鏡及び蛍光検出方法の提供を目的とするものである。

自由端近傍にプローブを備えてなる近接場光学顕微鏡用カンチレバーにおいて、
プローブが、
プローブの表面を成す１層以上の薄膜からなる薄膜部と、
薄膜部に覆われた内部のバルク部とから構成され、
薄膜部の最表層に誘電体薄膜を有し、誘電体薄膜よりも内側に金属部を有するものであることを特徴とするものである。

本発明において、上記「近接場光学顕微鏡」とは、フォトンを回折限界以下の領域に閉じ込めたプローブを用いて試料を観察し、分析・加工等を行う光学顕微鏡を意味するものである。すなわち、走査トンネル顕微鏡や原子間力顕微鏡などの走査プローブ顕微鏡に分光学的分析機能を持たせた評価装置として位置づけられ、測定領域から得られた光学的な情報の二次元解析機能及びスペクトル解析機能等を有するものである。

また、上記「薄膜部」とは、錐形を成す上記プローブにおいて、その表面を作製工程及び構成材料等の観点から分離し定義した各々の薄膜層の総称を意味するものとする。

そして、上記「バルク部」とは、錐形を成す上記プローブにおいて、薄膜部以外の部分を意味するものとする。

なお、錐形の底面に当たる部分は、上記カンチレバーの本体部分との結合部であるため、表面はないものとして考えることとする。

上記本発明による近接場光学顕微鏡用カンチレバーにおいて、金属部は、薄膜部の一部を構成する金属薄膜であることが望ましい。

そして、プローブは、非金属バルクからなるバルク部と、最表層の誘電体薄膜と誘電体薄膜に隣接する第１の金属薄膜とからなる薄膜部を有するもの、すなわち、非金属プローブの表面を金属薄膜、誘電体薄膜の順にコーティングした場合のようなものであることが望ましい。

或いは、金属部が、バルク部を構成する金属バルクであることが望ましい。

そして、プローブは、金属バルクからなるバルク部と、誘電体薄膜のみからなる薄膜部を有するもの、すなわち、金属プローブの表面を誘電体薄膜でコーティングした場合のようなものであることが望ましい。

また、誘電体薄膜は、シリコン酸化膜、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネイトおよびシクロオレフィンからなる群より選ばれるものであることが望ましい。

さらに、本発明によるプラズモン増強蛍光顕微鏡は、
上記近接場光学顕微鏡用カンチレバーと、
被検出物質を含む試料と、被検出物質に特異的に結合するよう施された蛍光標識とが供給される一面を含む検出部を有する基板と、
蛍光標識を励起発光しうる波長の励起光を発する光源と、
励起光を利用して、上記カンチレバーのプローブの先端に近接場光を発生させると共に、上記プローブ内の金属部に局在プラズモンを発生させる近接場光発生手段と、
近接場光により励起した蛍光標識から発せられる蛍光を検出するように配置された光検出器とを備えるものであり、
検出部は、その表面に、被検出物質と特異的に結合する特異的結合物質が固定されており、
近接場光は、局在プラズモンによる電場増強効果により電場増強されることを特徴とするものである。

本発明において、「検出部」とは、試料および蛍光標識を接するように供給する場所であって、上記表面修飾を用いて蛍光標識を検出部に固定し、この固定された蛍光標識を上記近接場光によって励起発光させるために配されたものである。

また、「特異的結合物質」とは、例えばタンパク質に対するリガンドあるいは抗原に対する抗体といった、ある特定の物質に対して特異的に結合する性質を有する物質を意味する。

被検出物質と特異的に結合する特異的結合物質とは、次のような蛍光法に対応するためのものである。すなわち、例えば被検出物質が抗原で、特異的結合物質が上記抗原に対する一次抗体であって、基板に固定された一次抗体に抗原を結合させ、その後この抗原を二次抗体（蛍光標識に施されたリンカー）を介して蛍光標識にて標識し、結果的に基板に固定されたこの蛍光標識からの蛍光を検出する、すなわち抗原の存在する箇所からの蛍光を検出する、いわゆる「サンドイッチ方式」による蛍光法である。本蛍光法は、抗原抗体反応に限らず検出条件に応じて適宜蛍光標識に施すリンカーおよび特異的結合物質を選択することで実施することができる。

上記本発明によるプラズモン増強蛍光顕微鏡において、近接場光発生手段は、第１の入射光学系を用いて、励起光を、カンチレバーのプローブに照射することにより、上記近接場光を発生させると共に、上記局在プラズモンを発生させるものであることが望ましい。ここで「第１の入射光学系」とは、カンチレバーと試料との間を調節する上下微動手段、及びカンチレバーを試料上で二次元走査させる走査手段に連動して、励起光をプローブに照射するよう導光する光学系である。

或いは、基板は、誘電体プリズム基板であり、近接場光発生手段は、第２の入射光学系を用いて、励起光を、誘電体プリズム基板における検出部の一面で全反射条件を満たすように、この一面に対して誘電体プリズム基板を通し照射することにより、この一面の表面にエバネッセント光を発生させて、このエバネッセント光と共鳴させることにより、上記近接場光を発生させると共に、上記局在プラズモンを発生させるものであることが望ましい。ここで「第２の入射光学系」とは、誘電体プリズム基板における検出部の一面で全反射条件を満たすように、この一面に対して誘電体プリズム基板を通して、励起光を照射するよう導光する光学系である。この場合、検出部は、誘電体プリズム基板上に第２の金属薄膜を有するものであることがより望ましい。

さらに、本発明による蛍光検出方法は、
被検出物質を含む試料と、被検出物質に特異的に結合するよう施された蛍光標識とを検出部に供給して、検出部上の、被検出物質と特異的に結合する特異的結合物質を用いて、蛍光標識を検出部に固定する工程（Ａ）と、
上記近接場光学顕微鏡用カンチレバーのプローブ先端を、検出部に接近させ、その後プローブ先端に増強された近接場光を発生させる近接場光発生工程を含む工程（Ｂ）と、
上記工程（Ａ）及び工程（Ｂ）の後の
プローブ先端を検出部に接近させた状態と、上記近接場光を発生させた状態とを保ちながら、プローブを検出部上で二次元走査させる工程（Ｃ）と、
近接場光によって、検出部に固定された蛍光標識を励起させて、この蛍光標識から発せられる蛍光を検出する工程（Ｄ）と、
工程（Ｃ）及び工程（Ｄ）を、交互に複数回実施又は同時に連続して実施することにより、蛍光標識から発せられる蛍光の光学特性を解析する工程（Ｅ）と
を有することを特徴とするものである。

上記本発明によるプラズモン増強蛍光検出方法において、蛍光標識は、多光子蛍光材料を含むものであることが望ましい。この場合特に、ローダミンＢ、ベンゾチアジアゾール蛍光色素、クマリン色素、スチルベン系化合物、ジヒドロフェナントレン系化合物およびフルオレン系化合物からなる群より選ばれるものであることがより望ましい。

或いは、蛍光標識は、非線形蛍光材料を含むものであることが望ましい。この場合特に、ｐ−ニトロアニリン（ＰＮＡ）を含むニトロベンゼン系化合物、複素芳香族アルデヒドを含む複素環化合物、スチリル系化合物およびジチオール系化合物からなる群より選ばれるものであることがより望ましい。

ここで、上記「多光子蛍光材料」とは、所定波長の蛍光を発生させる場合において、通常の蛍光材料に対する励起光の２倍以上の整数倍の波長を有する励起光により、励起され蛍光を発する材料を意味するものとし、例えば、二光子蛍光材料ならば、通常の蛍光材料に対する励起光の２倍の波長を有する励起光により、励起され蛍光を発する材料を意味するものとする。

また、上記「非線形蛍光材料」とは、強い入射光に対して、光高調波発生、光混合、光パラメトリック効果等の非線形光学効果を有する材料を意味するものとする。

本発明による近接場光学顕微鏡用カンチレバー、それを用いたプラズモン増強蛍光顕微鏡及び蛍光検出方法によれば、プローブの金属部を誘電体薄膜によってコーティングすることにより金属部と蛍光標識（つまり蛍光体）との距離を制御することができ、蛍光標識から発せられる蛍光の金属消光を抑えることができる。これによりプラズモンによる電場増強効果を有効に利用すると同時に、蛍光信号の定量性を確保することが可能となる。

また、フォトンを回折限界以下の領域に閉じ込めたプローブの持つ、数１０ｎｍという高い空間分解能を利用することにより、意図的に選択した局所的な領域からのみ蛍光信号が得られるため、アレイ化と多項目検出が可能になる。これにより、ＤＮＡや抗体等の検出においてチップ化のような簡易小型化も可能になる。

さらに、一般的に高価なことで知られるバイオサンプルや試料も極少量で測定できるようになり、コスト面でも大幅な低減を可能とする。

以下、本発明における最良の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。

「近接場光学顕微鏡用カンチレバー」
＜第１の実施形態＞
図１（ａ）は、本実施形態による近接場光学顕微鏡用カンチレバーの概略断面図である。これは、走査型プローブ顕微鏡用に一般に市販されているカンチレバーのレバー部における長手方向の中心軸に沿って切断している。図に示すようにこのカンチレバー２１は、支持部２２と、支持部２２から伸びるレバー部２３と、レバー部２３の自由端近傍に形成される錘形状のプローブ２４とを備えてなるものである。そして、このプローブ２４のバルク部２８は非金属材料から、同じく薄膜部２７は最表層の誘電体薄膜２５、金属薄膜２６から構成されるものである。

市販されているカンチレバー２１は、特に制限はなく、測定条件に応じて適宜選択することができる。

誘電体薄膜２５は、無機酸化物やポリマー膜等を用いることができ、例えば、シリコン酸化膜、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネイトおよびシクロオレフィンからなる群より選ばれることが望ましい。特に金属消光の抑制条件等の観点から、ＳｉＯ_２（シリコン酸化膜）から構成されることがより望ましい。また、その膜厚は、同様の観点から、１０ｎｍ〜１００ｎｍが望ましい。そして、薄膜作製方法は、例えば、スパッタリング法、蒸着法等、特に制限はなく、薄膜材料に応じて適宜選択することができる。

金属薄膜２６は、その薄膜材料として特に制限はなく、測定条件に応じて適宜選択することができるが、局在プラズモンの発生条件等の観点から、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ等を用いることが望ましい。また、その膜厚は、同様の観点から、２０ｎｍ〜６０ｎｍが望ましい。そして、薄膜作製方法は、特に制限はなく、例えば、スパッタリング法、蒸着法等を用いることができ、薄膜材料に応じて適宜選択することができる。

上記のようなカンチレバー２１を用いて蛍光検出を行うことにより、プローブ２４の金属部２９（本実施形態では、金属薄膜２６）を誘電体薄膜２５によってコーティングすることで、金属部２９と蛍光標識５との距離を制御し、蛍光標識５から発せられる蛍光の金属消光を抑えることができる。よって、プラズモンによる電場増強効果を有効に利用すると同時に、蛍光信号の定量性を確保することが可能となる。

＜第２の実施形態＞
図１ｂは、第二実施形態による近接場光学顕微鏡用カンチレバーの図１ａ同様の概略断面図である。図に示すようにこのカンチレバー２１’は、支持部２２と、支持部２２から伸びるレバー部２３と、レバー部２３の自由端近傍に形成される錘形状のプローブ２４’とを備えてなるものである。そして、このプローブ２４’のバルク部２８’は金属材料から、同じく薄膜部２７’は最表層の誘電体薄膜２５から構成されるものである。

本実施形態においては、市販されている状態のプローブが、局在プラズモンを発生させるための金属部２９になる。そのため、カンチレバーを選択する際、そのプローブが、局在プラズモンの発生条件等の観点から、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ等によって構成されているものを選ぶことが望ましい。

誘電体薄膜２５に関しては、第一実施形態と同様である。

以上により、本実施形態においても、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。

＜実施例＞
本実施例による近接場光学顕微鏡用カンチレバー２１は、市販のＡＦＭカンチレバーを用いて、このプローブを覆うようにＡｕ、ＳｉＯ_２の順に、それぞれ４０ｎｍ、２０ｎｍ真空蒸着を行ったものを用いた。

「プラズモン増強蛍光顕微鏡及び蛍光検出方法」
＜第１の実施形態＞
まず、第１の実施形態について説明する。

図２ａは、本実施形態による、プラズモン増強蛍光顕微鏡の概略図である。また、図２ｂは、図２ａにおける検出部７近傍を示す概略断面図である。

この装置を用いて、試料１に含まれる被検出物質としてのアビジン２を検出する場合を考える。このプラズモン増強蛍光顕微鏡は、検出部７を有する誘電体プリズム基板６と、検出部７上に施された表面修飾（図省略）と、アビジン２と特異的に結合し表面修飾に固定された一次抗体３と、上記実施例による近接場光学顕微鏡用カンチレバー２１と、カンチレバー２１を制御するための微動スキャナ１２と、蛍光体５を励起発光しうる波長の励起光９を発する光源８と、第２の入射光学系１３と、蛍光を検出するように配置された光検出器１０と、反射光を検出するように配置された第２の光検出器１５と、微動スキャナ１２、光源８、光検出器１０、第２の入射光学系１３及び第２の光検出器１５を制御するコンピュータ（ＰＣ）１１とを備えてなるものである。そして図中には、蛍光標識５と、この蛍光標識５に施されアビジン２に対する特異的結合性を付与する二次抗体４も同時に示している。

誘電体プリズム基板６は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プリズム基板６は樹脂から形成されたものが望ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネイト（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより望ましい。

表面修飾及び一次抗体３は、特に制限なく、蛍光標識５を被検出物質２と二次抗体４を介して検出部７に固定することができるものであれば、検出条件（特に被検出物質）に応じて適宜選択することができる。例えば本実施形態の場合、下記（１）〜（３）のステップからなる方法により、誘電体プリズム基板６上にシランカップリング処理を施し、蛍光標識（Ｃｙ５色素）５により標識したアビジン２を検出部に固定することができる。

（１） シランカップリング剤（ＡＰＳ）によるアミノ基の導入
１８ｍｌのＥｔＯＨ、１．９８ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水、２０ｕｌの１Ｎ ＨＣｌをねじ口付試験瓶に入れ、混合後、６０℃にてインキュベータで温める。その後、この試験瓶に２４．３ｍｇのＡＰＳを添加しよく撹拌する。そして、プリズム上に液体を保持するためのキュベットを設け、その中に、上記のＡＰＳ混合溶液を１０ｍｌ分注する。キュベットに液体を入れた状態で、プリズムごと６０℃のインキュベータに入れ、１２分反応させる。その後、ＥｔＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（体積比９：１）でキュベット内の撹拌洗浄を５回行う。そして、キュベット内の液体を全て抜取り、９０℃のインキュベータに入れ、１８０分加熱処理を行う。

APS:3-aminopropyltrimethoxysilane
（２）ジビニルスルホンによる修飾
ねじ口付き試験管に、１０ｍｌの４ｗｔ％ジビニルスルホン溶液と３０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水を加え、よく混合し１％ジビニルスルホン水溶液を作成する。そして、プリズム上のキュベットに上記水溶液を分注し、室温で６０分反応させる。その後、ＭｉｌｌｉＱ水にてキュベット内の撹拌洗浄を５回行う。

（３）色素標識アビジンの固定
ＰＢＳをキュベットに分注し撹拌洗浄を５回行う。そして、標識アビジン溶液（１ｍｇ／ｍｌ；ＰＢＳにて希釈）を加え、適宜撹拌しながら室温にて１時間放置する。その後、ＰＢＳをキュベットに分注し撹拌洗浄を５回行う。

カンチレバー２１は、例として、上記実施例における近接場光学顕微鏡用カンチレバー２１であり、すなわち、市販のＡＦＭカンチレバーを用いて、このプローブを覆うようにＡｕ、ＳｉＯ_２の順に、それぞれ４０ｎｍ、２０ｎｍ真空蒸着を行ったものである。なお、カンチレバーは、本発明による近接場光学顕微鏡用カンチレバーであれば、これに限られるものではない。

微動スキャナ１２は、特に制限はなく、検出条件に応じて適宜選択することができる。なお、ここで「微動スキャナ」とは、プローブ２４先端を検出部７へアプローチさせる上下微動手段と、プローブ２４を検出部７上で走査させる走査手段とを併せ持つものを意味するものとする。

励起光９は、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。

光源８は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。

光検出器１０は、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができるが、これに限らず検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、冷却ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また、必要に応じて、検出部７上に固定された蛍光標識５からの蛍光を効率的に検出するため、適切な位置へ移動する移動機構を組み合わせて用いてもよい。

第２の入射光学系１３は、誘電体プリズム基板６における検出部７の一面６ａで全反射条件を満たすように、上記一面６ａに対して誘電体プリズム基板６を通して、励起光９を照射するよう導光する光学系である。

第２の光検出器１５は、光検出器１０と同様に、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができるが、これに限らず検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、冷却ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。これは、必要に応じて誘電体プリズム基板６で全反射した反射光を受光する時に使用することができる。これにより、反射光のスペクトル分布等を解析することによって、被検出物質に関するより詳細なデータを得ることができる。

蛍光標識５は、特に制限なく、検出条件（特に検出対象物質）に応じて適宜選択することができる。例えば、励起光９の波長が６５０ｎｍの場合、Ｃｙ５色素等を用いることができる。また、蛍光標識５をモノクロナール抗体等に修飾することにより、蛍光標識５を抗原２と特異的に結合可能にすることができる。

一方、本実施形態によるプラズモン増強蛍光検出方法は、上記プラズモン増強蛍光顕微鏡を用いて、
蛍光標識５により標識された二次抗体４とアビジン２を含む試料１とを検出部７に供給し、検出部７上のアビジン２と特異的に結合する一次抗体３を用いて、上記蛍光標識５をアビジン２と二次抗体４を介して検出部７に固定する工程（Ａ）と、
上記カンチレバー２１のプローブ２４先端を検出部７に接近させ配置し、その後第２の入射光学系１３を用いて、励起光９を、検出部７の一面６ａで全反射条件を満たすように、この一面６ａに対して誘電体プリズム基板６を通し照射することにより、この一面６ａの表面にエバネッセント光３０を発生させて、このエバネッセント光３０と共鳴させることにより、プローブ２４先端に近接場光３１を発生させると共に、プローブ２４中のＡｕ薄膜２６中に局在プラズモンを発生させて、この局在プラズモンよる電場増強効果により近接場光３１を増強する近接場光発生工程を経る工程（Ｂ）と、
上記工程（Ａ）及び工程（Ｂ）の後の、
プローブ２４先端を検出部７に接近させた状態と上記近接場光３１を発生させた状態とを保ちながら、プローブ２４を検出部７上で二次元走査させる工程（Ｃ）と、
近接場光３１によって、検出部７に固定された蛍光標識５を励起させて、この蛍光標識５から発せられる蛍光を検出する工程（Ｄ）と、
工程（Ｃ）及び工程（Ｄ）を、交互に複数回実施又は同時に連続して実施することにより、上記蛍光標識５から発せられる蛍光の光学特性を解析する工程（Ｅ）と
を有することを特徴とするものである。

ここで、試料１の供給は、上記に限られるものではない。例えば、上記検出部７上にアビジン２を含む試料１を流すように供給し、アビジン２を検出部７に固定する。その後同様に、アビジン２に特異的に結合する二次抗体４に修飾した蛍光標識５を流し、アビジン２と二次抗体４を介して上記蛍光標識５を検出部７に固定してもよい。

また、工程（Ｂ）の近接場光発生工程は、上記に限られるものではない。例えば、エバネッセント光３０を発生させる他の方法を用いてもよいし、励起光９を直接プローブ２４に照射する方法でもよい。

以下、本実施形態における作用を示す。

図２ｂにおいて、エバネッセント光３０による照明により、プローブ２４先端に近接場光３１が発生すると共に、プローブ２４中のＡｕ薄膜２６中に局在プラズモンが発生する。そして、この局在プラズモンによる電場増強効果により近接場光３１が電場増強されることになる。この電場増強された近接場光３１の幅Ｌは、数十ｎｍである。また、カンチレバー２１を用いているが、実質的にプローブの役割をするのは上記電場増強された近接場光３１である。そのため、本発明におけるカンチレバー２１と試料１等の間隔は、プローブ２４直下の蛍光標識５が近接場光３１に照射される範囲で、通常の走査型プローブ顕微鏡等よりも広くなっている。

上記のような状態を保ちながら、プローブ２４を走査することにより、検出部７に固定されたプローブ２４直下の蛍光標識５を近接場光３１により励起させる。このとき、この蛍光標識５から蛍光が発せられるが、本実施形態ではプローブ２４の表面をＳｉＯ_２膜２５にてコーティングすることによりＡｕ薄膜２６と蛍光標識５との距離を制御し、蛍光の金属消光を起こすことなく、効率よく定量的に蛍光を検出することができる。すなわち、アビジン２の存在を定量的に確認することができる。なお、近接場光３１よりも広い領域に発生するエバネッセント光３０によっても、蛍光標識５は蛍光を発することになる。しかしながら、エバネッセント光３０は検出部７からの距離に対して指数関数的に減少するため、上記エバネッセント光３０と増強された近接場光３１の各々の電場増強度には、二桁以上の差がある。したがって、上記のようなエバネッセント光３０による蛍光の影響をほぼ無視する事ができる。

このように得られた蛍光信号は、光検出器１０で検出され、その結果が、記憶および解析のためにＰＣ１１に送られる。このＰＣ１１は、プローブ２４の位置に関する情報を受け取るように、微動スキャナ制御器を介して微動スキャナ１２にも接続されている。この結果、蛍光の波長、強度、発せられた位置等の情報をＰＣ１１で解析することによって、走査範囲内の蛍光強度分布等を得ることができ、アビジン２の存在位置を視覚的に確認することができる。アビジン２に限らず被検出物質２の大きさは、およそ１０ｎｍ程度であるため、検出部７に固定される密度を考えれば、本実施形態による手法を用いることにより分子１個レベルでの検出を可能とする。

以上により、本実施形態によれば、プローブ２４の金属部２９を誘電体薄膜２５でコーティングすることによって、金属部２９と蛍光標識５との距離を制御することができる。これにより、蛍光標識５から発せられる蛍光の金属消光を抑えることができ、プラズモンによる電場増強効果を有効に利用すると同時に、蛍光信号の定量性を確保することが可能となる。

そして、数１０ｎｍという高い空間分解能を利用することにより、意図的に選択した局所的な領域からのみ蛍光信号が得られるため、アレイ化と多項目検出が可能になる。これにより、ＤＮＡや抗体等の検出においてチップ化のような簡易小型化も可能になる。

また、一般的に高価なことで知られるバイオサンプルや試料も極少量で測定できるようになり、コスト面でも大幅な低減を可能とする。

さらに本発明においては、誘電体プリズム基板６上に表面修飾を施しているため、アビジン２や蛍光標識５の非特異的吸着を防ぐことができる。これにより、非特異的吸着によるノイズの影響を低減しＳ／Ｎ比を向上させ、高い定量性を有する蛍光検出が可能となる
＜第２の実施形態＞
次に、第２の実施形態について説明する。

図３は、第２の実施形態における、検出部７’付近の拡大図であり、第１の実施形態における図２ｂに対応している。本実施形態は、第１の実施形態において、検出部７に誘電体プリズム基板６上の第２の金属薄膜４０を追加し、アビジン２を標識する蛍光標識に多光子蛍光材料５’を用いたものである。その他の構成は、第１の実施形態と同様であり、図２に示す第１の実施形態と同等の要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。ただし、励起光９の波長は、多光子蛍光材料５’に合わせ適宜選択するものとする。

また、上記金属薄膜４０の追加に伴い工程（Ｂ）における近接場光発生工程は、第２の入射光学系１３を用いて、励起光９を、誘電体プリズム基板６と第２の金属薄膜４０との界面６ａで全反射条件を満たすように、この界面６ａに対して誘電体プリズム基板６を通し照射することにより、この界面６ａの表面にエバネッセント光３０’を発生させると共に、第２の金属薄膜４０中に表面プラズモンを発生させ、この表面プラズモンによる電場増強効果によりエバネッセント光３０’を増強し、この増強されたエバネッセント光３０’と共鳴させることにより、プローブ２４先端に近接場光３１を発生させると共に、プローブ２４中のＡｕ薄膜２６中に局在プラズモンを発生させて、この局在プラズモンよる電場増強効果により近接場光３１を増強する近接場光発生工程へと変更になる。

金属薄膜４０は、その薄膜材料として特に制限はなく、検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点から、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ等を用いることが望ましい。一方その膜厚も、特に制限はなく検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点から、２０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲にあることが望ましい。そして、薄膜作製方法は、例えば、スパッタリング法、蒸着法等、特に制限はなく、薄膜材料に応じて適宜選択することができる。

一方、多光子蛍光材料５’は、その材料として特に制限はなく、検出条件に応じて適宜選択することができるが、蛍光量子収率とプラズモンを発生させやすい波長の観点から、ローダミンＢ、ベンゾチアジアゾール蛍光色素、クマリン色素、スチルベン系化合物、ジヒドロフェナントレン系化合物およびフルオレン系化合物からなる群より選ばれるものであることが望ましい。

本実施形態では、第２の入射光学系１３により、上記第２の金属薄膜４０に表面プラズモンが生じる。そして、表面プラズモンによる電場増強効果により電場増強されたエバネッセント光３０’が検出部７表面に生成されて、このエバネッセント光３０’により、プローブ２４先端に近接場光３１を発生させると共に、プローブ２４中のＡｕ薄膜２６中に局在プラズモンを発生させている。従って、この局在プラズモンによる電場増強効果により電場増強された近接場光３１により、多光子蛍光材料５’を励起発光させる。

本実施形態においては、第２の金属薄膜４０を追加することにより、その中に生じる表面プラズモンの電場増強効果も利用している。この結果、プローブ２４先端に生じる近接場光３１は、第１の実施形態時よりもさらに増強されるため、より高感度な蛍光検出が可能となる。

以上により、本実施形態においても、第１の実施形態と同様な効果を得ることができる。

また、本実施形態特有の効果として、以下のような効果も得られる。

多光子蛍光材料を用いた代表的な蛍光法として、例えば二光子励起蛍光法が知られている。二光子励起蛍光は、通常の蛍光の励起光の２倍の波長を有する励起光を用いる蛍光法であることから、励起光の波長と共存物質等（例えば、水，血清蛋白，及び酵素等）の吸収波長とをずらすことができ、ノイズの少ない蛍光測定を行うことができる。また、使用される励起光の波長が近赤外域であるために、被検出物質が生体組織等である場合も、測定中に破壊される恐れがない。

通常多光子蛍光材料を蛍光標識として用いる場合には、吸収断面積が一光子励起に比して数十桁程度小さいため、充分な蛍光を得るために非常に高価な尖頭値の高いパルスレーザが用いられている。

しかしながら、本発明においては、局在プラズモンによる電場増強効果により増強された近接場光３１を利用しているため、通常の励起光よりも１０倍から１０^６倍程度の増強度を有している。そのため、多光子蛍光材料を励起し得る充分な増強度を有し、すなわち、実質的に吸収断面積を大きくすることができるため、充分な蛍光量を得ることができる。これにより、高価な装置を用いる必要がなく、低コストでノイズの少ない多光子励起蛍光法等を行うことができる。

また、多光子蛍光材料の代わりに非線形蛍光材料を用いても同様な効果が得られる。この場合、その材料としては特に制限はなく、検出条件に応じて適宜選択することができるが、蛍光量子収率とプラズモンを発生させやすい波長の観点から、ｐ−ニトロアニリン（ＰＮＡ）を含むニトロベンゼン系化合物、複素芳香族アルデヒドを含む複素環化合物、スチリル系化合物およびジチオール系化合物からなる群より選ばれるものであることが望ましい。

なお、上記すべての実施形態において、抗原抗体反応を用いて説明してきたが、本発明はこれに限られるものではなく、他の特異的結合性を利用した反応を用いても本発明の課題を解決することができる。

以上により、本発明による近接場光学顕微鏡用カンチレバー、それを用いたプラズモン増強蛍光顕微鏡及び蛍光検出方法によれば、プローブの金属部を誘電体薄膜によってコーティングすることにより金属部と蛍光標識との距離を制御することができ、蛍光標識から発せられる蛍光の金属消光を抑えることができる。これによりプラズモンによる電場増強効果を有効に利用すると同時に、蛍光信号の定量性を確保することが可能となる。

本発明による近接場光学顕微鏡用カンチレバーの（ａ）第１の実施形態及び（ｂ）第２の実施形態を概略的に示す部分断面図 （ａ）本発明によるプラズモン増強蛍光顕微鏡における第１の実施形態を示す概略図、（ｂ）図２ａにおける検出部近傍を示す概略断面図 本発明によるプラズモン増強蛍光顕微鏡における第２の実施形態の検出部近傍を示す概略断面図

符号の説明

１ 試料
２ 被検出物質（抗原）
３ 特異的結合物質（一次抗体）
４ 蛍光体に施された３とは異なる特異的結合物質（二次抗体）
５、５’ 蛍光標識
６ 誘電体プリズム基板
６ａ 反射面
７、７’ 検出部
８ 光源
９ 励起光
１０ 光検出器
１１ コンピュータ（ＰＣ）
１２ 微動スキャナ
１３ 入射光学系
１５ 第２の光検出器
２１、２１’ カンチレバー
２２ 支持部
２３ 可撓性レバー部
２４、２４’ プローブ
２５ 誘電体薄膜
２６ 金属薄膜
２７、２７’ 薄膜部
２８、２８’ バルク部
２９ 金属部
３０、３０’ エバネッセント光（表面プラズモンによる増強電場）
３１ 局在プラズモンによる増強電場
４０ 第２の金属薄膜
Ｌ 局在プラズモンによる増強電場の横幅

Claims (15)

1. 自由端近傍にプローブを備えてなる近接場光学顕微鏡用カンチレバーにおいて、
   前記プローブが、
   該プローブの表面を成す１層以上の薄膜からなる薄膜部と、
   該薄膜部に覆われた内部のバルク部とから構成され、
   該薄膜部の最表層に誘電体薄膜を有し、該誘電体薄膜よりも内側に金属部を有するものであることを特徴とする近接場光学顕微鏡用カンチレバー。
2. 前記金属部が、前記薄膜部の一部を構成する金属薄膜であることを特徴とする請求項１に記載の近接場光学顕微鏡用カンチレバー。
3. 前記プローブが、非金属バルクからなる前記バルク部と、最表層の前記誘電体薄膜と該誘電体薄膜に隣接する前記金属薄膜とからなる前記薄膜部を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の近接場光学顕微鏡用カンチレバー。
4. 前記金属部が、前記バルク部を構成する金属バルクであることを特徴とする請求項１に記載の近接場光学顕微鏡用カンチレバー。
5. 前記プローブが、前記金属バルクからなる前記バルク部と、前記誘電体薄膜のみからなる前記薄膜部を有するものであることを特徴とする請求項４に記載の近接場光学顕微鏡用カンチレバー。
6. 前記誘電体薄膜が、シリコン酸化膜、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネイトおよびシクロオレフィンからなる群より選ばれるものであることを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の近接場光学顕微鏡用カンチレバー。
7. 請求項１から６いずれかに記載の近接場光学顕微鏡用カンチレバーと、
   被検出物質を含む試料と、該被検出物質に特異的に結合するよう施された蛍光標識とが供給される一面を含む検出部を有する基板と、
   前記蛍光標識を励起発光しうる波長の励起光を発する光源と、
   前記励起光を利用して、前記プローブの先端に近接場光を発生させると共に、前記プローブ内の前記金属部に局在プラズモンを発生させる近接場光発生手段と、
   前記近接場光により励起した前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出するように配置された光検出器とを備えるものであり、
   前記検出部は、該検出部表面に、前記被検出物質と特異的に結合する特異的結合物質が固定されており、
   前記近接場光は、前記局在プラズモンによる電場増強効果により電場増強されることを特徴とするプラズモン増強蛍光顕微鏡。
8. 前記近接場光発生手段が、
   第１の入射光学系を用いて、前記励起光を、前記カンチレバーの前記プローブに照射することにより、前記近接場光を発生させると共に、前記局在プラズモンを発生させるものであることを特徴とする請求項７に記載のプラズモン増強蛍光顕微鏡。
9. 前記基板が、誘電体プリズム基板であり、
   前記近接場光発生手段が、
   第２の入射光学系を用いて、前記励起光を、前記誘電体プリズム基板における前記検出部の前記一面で全反射条件を満たすように、該一面に対して前記誘電体プリズム基板を通し照射することにより、該一面の表面にエバネッセント光を発生させて、該エバネッセント光と共鳴させることにより、前記近接場光を発生させると共に、前記局在プラズモンを発生させるものであることを特徴とする請求項７に記載のプラズモン増強蛍光顕微鏡。
10. 前記検出部が、前記誘電体プリズム基板上に第２の金属薄膜を有するものであることを特徴とする請求項９に記載のプラズモン増強蛍光顕微鏡。
11. 被検出物質を含む試料と、該被検出物質に特異的に結合するよう施された蛍光標識とを検出部に供給して、前記検出部上の、前記被検出物質と特異的に結合する特異的結合物質を用いて、前記蛍光標識を前記検出部に固定する工程（Ａ）と、
    請求項１から６いずれかに記載の近接場光学顕微鏡用カンチレバーのプローブ先端を、前記検出部に接近させ、その後前記プローブ先端に増強された近接場光を発生させる近接場光発生工程を含む工程（Ｂ）と、
    上記工程（Ａ）及び工程（Ｂ）の後の
    前記プローブ先端を前記検出部に接近させた状態と、前記近接場光を発生させた状態とを保ちながら、前記プローブを前記検出部上で二次元走査させる工程（Ｃ）と、
    前記近接場光によって、前記検出部に固定された前記蛍光標識を励起させて、該蛍光標識から発せられる蛍光を検出する工程（Ｄ）と、
    前記工程（Ｃ）及び前記工程（Ｄ）を、交互に複数回実施又は同時に連続して実施することにより、前記蛍光標識から発せられる蛍光の光学特性を解析する工程（Ｅ）と
    を有することを特徴とするプラズモン増強蛍光検出方法。
12. 前記蛍光標識が、多光子蛍光材料であることを特徴とする請求項１１に記載のプラズモン増強蛍光検出方法。
13. 前記多光子蛍光材料が、ローダミンＢ、ベンゾチアジアゾール蛍光色素、クマリン色素、スチルベン系化合物、ジヒドロフェナントレン系化合物およびフルオレン系化合物からなる群より選ばれるものであることを特徴とする請求項１２に記載のプラズモン増強蛍光検出方法。
14. 前記蛍光標識が、非線形蛍光材料であることを特徴とする請求項１１に記載のプラズモン増強蛍光検出方法。
15. 前記非線形蛍光材料が、ニトロベンゼン系化合物、複素環化合物、スチリル系化合物およびジチオール系化合物からなる群より選ばれるものであることを特徴とする請求項１４に記載のプラズモン増強蛍光検出方法。

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