JP2009085619A - バイオセンサ - Google Patents
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Abstract
【課題】保存状態や測定試料によって標的とする菌（標的菌）を検出する感度が損なわれない安定したバイオセンサを提供するとともに、バイオセンサの基質認識部を生体内に挿入し、体液中に存在する標的菌を直接的に測定すること。
【解決手段】本発明は、菌に結合するアプタマーを基質認識部に備えるバイオセンサを提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、菌に結合するアプタマーを基質認識部に備えるバイオセンサを提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は、バイオセンサに関する。
バイオセンサとは、生体起源の分子認識機構を利用した化学センサの総称であり、酵素センサ、免疫センサ、微生物センサ、イオンチャネルセンサ等が知られている。
バイオセンサは、基質認識部に固定された酵素、抗体、微生物又はイオンチャネル等がそれぞれの基質となる被検物質と相互作用することにより生じる変化（例えば、物質変化、色変化、吸発熱、質量変化など）を、信号変換部（電極、受光素子、感熱素子、圧電素子、蛍光異方性など）で検出可能な信号に変換して被検物質を検出するセンサである。
例えば、基質認識部にモノクローナル抗体を固定し、被検物質である抗原が抗原抗体反応によりモノクローナル抗体に特異的に結合できるような構造にしておけば、そのセンサは、試料中に挟雑物が多く存在していても、被検物質の濃度に比例した信号が得られることとなる。
一方、口腔内では、ミュータンスレンサ球菌と呼ばれる乳酸発酵性細菌がう蝕の発症に深く関与している。このため、ヒトの口腔内で主に検出されるミュータンスレンサ球菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓを、抗体を用いた免疫学的測定法によって検出し、う蝕の発症を予防することが提案されている（特許文献１）。
また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓは、グルコシルトランスフェラーゼを口腔内に分泌することが知られているため、この酵素に特異的に結合する抗体を用いて、この菌を免疫学的測定法によって検出することも提案されている（特許文献２）
しかしながら、目に見えない菌を検出するには、被検試料を採取し、選択培地を用いた培養による同定、若しくは抗体を用いたＥＬＩＳＡ法又はウェスタンブロッティング法で菌の有無を解析するのが一般的であり、解析結果が出るまでに手間と時間を要するのが現状である。
また、基質認識部にモノクローナル抗体を固定したバイオセンサは、ＥＬＩＳＡ法やウェスタンブロッティング法と比較して、原理的には被検物質を短時間で検出できるものではあるが、基質認識部に固定された抗体は、バイオセンサの保存時や使用時に乾燥やタンパク質分解酵素等の影響を受けやすく、検出感度を著しく低下させることがある。このため、バイオセンサとしての安定性に問題があることが指摘されている。
さらに、基質認識部にモノクローナル抗体を固定したバイオセンサは、抗体の安定性保持のために人体に対して有害な物質が使用される場合があるため、口腔内細菌を検出する際、バイオセンサの基質認識部を直接口腔内に入れて測定することはできず、唾液等のサンプルを別容器に採取してから間接的に測定する必要があった。
そこで本発明の目的は、保存状態や測定試料によって標的とする菌（標的菌）を検出する感度が損なわれない安定したバイオセンサを提供するとともに、バイオセンサの基質認識部を生体内に挿入し、体液中に存在する標的菌を直接的に測定することにある。
本発明は、菌に結合するアプタマーを基質認識部に備えるバイオセンサを提供する。
アプタマーは、抗体等のタンパク質と比べて、酵素的分解や乾燥に強いため、上記のバイオセンサは、バイオセンサ自身の保存状態や測定試料によって標的菌を検出する感度が損なわれない特性を有している。このため、貴重なサンプルに含まれている菌を検出する上でも、基質認識部の状態を考慮することなく、単回測定で菌の有無を判定することができる。
上記の菌は、口腔内細菌であることが好ましく、う蝕菌又は歯周病菌であることがさらに好ましい。
上記のバイオセンサは、基質認識部にアプタマーが固定されたセンサであるため、抗体の安定性保持のために使用される人体に対して有害な薬剤（例えば、ＮａＮ３）が基質認識部に含有されておらず、口腔内に基質認識部を直接挿入して、唾液中の口腔内細菌、特に、う蝕菌又は歯周病菌を直接測定できる。
また、上記のう蝕菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであることが好ましい。
う蝕の発症を引き起こす菌は多数報告されているが、この中でも、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの３種がヒトのう蝕に深く関与しているとされている。したがって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ及び／又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを検出するバイオセンサは、ヒトのう蝕の発症リスクを正確かつ簡易に判定でき、う蝕発症の予防に貢献できる。なお、ヒトの口腔内に存在するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓをアプタマーによって検出する場合は、その検出感度は抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ菌抗体を用いて検出するよりも高い。
上記アプタマーは、菌体表層物質に結合することが好ましい。
菌体表層物質とは、菌体の表層に存在する菌由来のタンパク質であるため、これらの菌体表層物質に結合するアプタマーが基質認識部位に固定されていれば、標的菌を感度よく識別して検出できる。
上記アプタマーは、配列表の配列番号１〜１５記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質に結合することが好ましい。
配列表の配列番号１〜１５記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの菌体の表層に特異的に存在するため、これらのタンパク質に結合するアプタマーが基質認識部位に固定されていれば、他の口腔内細菌が存在する状況下においても、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓを特異的に検出できる。
上記アプタマーは、配列表の配列番号１６〜２１記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質に結合することが好ましい。
配列表の配列番号１６〜２１記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓの菌体の表層に特異的に存在するため、これらのタンパク質に結合するアプタマーが基質認識部位に固定されていれば、他の口腔内細菌が存在する状況下においても、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓを特異的に検出できる。
上記アプタマーは、配列表の配列番号２２〜２５記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質に結合することが好ましい。
配列表の配列番号２２〜２５記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの菌体の表層に特異的に存在するため、これらのタンパク質に結合するアプタマーが基質認識部位に固定されていれば、他の口腔内細菌が存在する状況下においても、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを特異的に検出できる。
本発明のバイオセンサは、基質認識部が酵素的分解や乾燥に強いため、バイオセンサの保存状態や測定試料によって標的菌を検出する感度が損なわれない特性を有している。また、本発明のバイオセンサは、人体に対して有害な薬剤が基質認識部に含有されておらず、口腔内に基質認識部を直接挿入し、唾液中の口腔内細菌を直接的に測定できる。
さらに、本発明のバイオセンサは、配列表の配列番号１〜２５記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質に結合するアプタマーを基質認識部に備えているため、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを特異的に検出できる。
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明のバイオセンサは、菌に結合するアプタマーを基質認識部に備えることを特徴としている。
「菌」とは、細菌又は糸状菌を意味し、「口腔内細菌」とは、口腔内で生存している常在細菌のことを意味している。
「アプタマー」とは、タンパク質や糖など様々な化合物に結合する能力を持つ核酸分子のことである。アプタマーは、抗体と同様に高い特異性と親和力を有するため、上記バイオセンサは、標的菌を高感度に検出することを可能としている。
上記バイオセンサは、菌の中でも口腔内細菌に結合するアプタマーを基質認識部に備えることが好ましく、口腔内細菌の中では、特に、う蝕菌又は歯周病菌に結合するアプタマーを基質認識部に備えることがより好ましい。
う蝕菌としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ等が挙げられ、歯周病菌としては、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｃｔｕｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ等が挙げられる。
上記バイオセンサは、上記のう蝕菌の中では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに結合するアプタマーを基質認識部に備えることがより好ましい。
上記バイオセンサは、アプタマーが、菌体表層物質に結合することを特徴としており、う蝕菌の菌体表面に特異的に存在する菌体表層物質としては、高分子タンパク質抗原、ＰＡｃ様タンパク質、抗原Ａ（ＩＩＩ）、グルカン結合タンパク質、リポタイコ酸及びグルコシルトランスフェラーゼ等を例示できる。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの菌体表面に特異的に存在する菌体表層物質としては、ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＳｐａＰ（配列番号１及び２６）、Ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ＷａｐＡ（配列番号２及び２７）、Ｇｌｕｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ， ＧｂｐＡ（配列番号３及び２８）、Ｇｌｕｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ， ＧｂｐＣ（配列番号４及び２９）、Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ（配列番号５及び３０）、Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｓ（配列番号６及び３１）、Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ＳＩ（配列番号７及び３２）、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ｇｌｕｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｇｂｐ）（配列番号８及び３３）、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＧＳ−５ ｓｃｒＢ（配列番号９及び３４）、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ｓｒ（配列番号１０及び３５）、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ｗａｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｗａｐＡ）（配列番号１１及び３６）、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ｓｐａＰ（配列番号１２及び３７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｐａｃ（配列番号１３及び３８）、Ｍｕｔａｃｉｎ ＩＶ ＮｌｍＡ（配列番号１４及び３９）、Ｍｕｔａｃｉｎ ＩＶ ＮｌｍＢ（配列番号１５及び４０）が好ましい。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓの菌体表面に特異的に存在する菌体表層物質としては、Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ（配列番号１６及び４１）、Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｓ１（配列番号１７及び４２）、Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｓ２（配列番号１８及び４３）、Ｄｅｉ（配列番号１９及び４４）、Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ＰＡｇ（配列番号２０及び４５）、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ ｓｐａＡ（配列番号２１及び４６）が好ましい。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの菌体表面に特異的に存在する菌体表層物質としては、Ａｃｉｄｏｃｉｎ．Ａ（配列番号２２及び４７）、Ａｃｉｄｏｃｉｎ．Ｂ（配列番号２３及び４８）、Ａｃｉｄｏｃｉｎ．Ｍ（配列番号２４及び４９）、Ａｃｉｄｏｃｉｎ８９１２（配列番号２５及び５０）が好ましい。
上記アプタマーは、当業者が行う一般的な方法によって目的とする塩基配列の核酸を化学合成し、標的菌の菌体表面に特異的に存在する菌体表層物質に特異的に結合する作用を指標にスクリーニングすることにより取得できる。具体的には、以下の方法を例示できる。
まず、標的菌の菌体表面に特異的に存在する菌体表層物質を選択し、その菌体表層物質のアミノ酸配列をコードする塩基配列をコンピューター内進化プログラムで処理して１０世代の塩基配列をコンピューター上に発生させ、これらの塩基配列を標的菌に結合するアプタマーの候補とする。なお、コンピューター内進化プログラムは、Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏらの文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００５年、３３巻、ｅ１０８）を参照し、通常利用されている遺伝的アルゴリズムを用いて、ｖｉｓｕａｌ ｂａｓｉｃで作成できる。
その後、上記の処理によって候補として挙げられた複数の塩基配列からなるオリゴＤＮＡを化学合成し、実際に標的菌と反応させて結合性の高いものをアプタマーとして回収し、これを鋳型にＰＣＲで増幅することによって、標的菌と結合するアプタマーを大量に取得できる。
上記のアプタマーは、製造の容易さと安定性の面からは、ＤＮＡアプタマーであることが好ましく、塩基長は、１０〜２００塩基が好ましく、２０〜１００塩基がより好ましい。
以下に、本発明のバイオセンサの実施形態について説明する。
本発明のバイオセンサの第一の実施形態としては、標的菌に特異的に結合する上記のアプタマーを酵素又は蛍光色素で標識し、これらを基板上に基質認識部として固定化したセンサを例示できる。
図１は、本発明のバイオセンサの第一の実施形態を示す斜視図である。
図１に示すバイオセンサ１０は、基板１と、基板１上に設けられた基質認識部３とを備え、基質認識部３には、酵素７又は蛍光色素７で標識されたアプタマー５が結合している。
第一の実施形態に係るバイオセンサ１０では、基質認識部３に被検試料（例えば、唾液、体液）を滴下したり、基質認識部３を口に含んで唾液と接触させたりして、アプタマー５に標的菌を結合させると、アプタマー５に結合した酵素７の酵素反応により反応基質の吸光度が変化したり、又は蛍光色素７の蛍光異方性が変化するため、この変化を検出し、これにより標的菌を検出できる。
アプタマー５の基板１表面への結合方法は特に制限はなく、当該技術分野で通常に使用されている方法を使用できる。例えば、基板１表面をポリ−Ｌ−リジンで処理し、そこに目的量のアプタマー５を含む溶液をスポッティングして、ポリ−Ｌ−リジンとアプタマー５を共有結合させることによって行うことができる。また、アプタマー５の末端に官能基等を予め導入しておき、その官能基等を通じて基板１表面上の官能基等と共有結合させることもできる。
アプタマー５を標識する酵素７としては、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）、β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ、Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅを例示きる。
Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）の基質としては、例えば、３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＡＢ）、３−Ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｚｏｌｅ（ＡＥＣ）、５−Ａｍｉｎｏｓａｌｉｔｙｌｉｃ ａｃｉｄ、２，２’−Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＡＢＴＳ）、ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ｏ−ＰＤＡ）、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、Ｔｙｒａｍｉｎｅ、３−（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ)−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＰＰＡ）が挙げられる。β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの基質としては、例えば、ｏ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅが挙げられる。Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの基質としては、例えば、Ｂｒｏｍｏ ｃｈｏｒｏ ｉｎｄｏｌｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ、ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐａｔｅ、４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅが挙げられる。Ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅの基質としては、例えば、β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅが挙げられ、この酵素の場合は、さらに上記のＨＲＰとその基質とを共存させることで発色又は発光が得られる。Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの基質としては、例えば、Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅが挙げられ、この酵素の場合は、さらにＮＡＤＰを共存させることで、ＮＡＤＰが還元されて生じるＮＡＤＰＨの吸光度を測定することが可能となる。
また、蛍光色素７としては、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（テキサスレッド；励起波長５９０ｎｍ、蛍光波長６１５ｎｍ）、ＲＩＴＣ（ローダミン；励起波長５２０ｎｍ、蛍光波長５８０ｎｍ）、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）、ＰＥ（フィコエリスリン；励起波長４８８ｎｍと５４５ｎｍ、蛍光波長５８０ｎｍ）、Ｃｙ２（励起波長４８９ｎｍ、蛍光波長５０５ｎｍ）、Ｃｙ３（励起波長５５２ｎｍ、蛍光波長５６５ｎｍ）、Ｃｙ３．５（励起波長５８１ｎｍ、蛍光波長５９６ｎｍ）、Ｃｙ５（励起波長６５０ｎｍ、蛍光波長６６７ｎｍ）、Ｃｙ５．５（励起波長６７８ｎｍ、蛍光波長７０３ｎｍ）、ＡＭＣＡ（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸；励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン；励起波長６３３ｎｍと６３５ｎｍ、蛍光波長６７０ｎｍ）、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン；励起波長４９４ｎｍ、蛍光波長５１８ｎｍ）、ＨＥＸ（ヘキセクロロフルオレセイン；励起波長５３５ｎｍ、蛍光波長５５６ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（カルボテトラメチルローダミンン；励起波長５２１ｎｍ、蛍光波長５３６ｎｍ)、ＴＥＴ（カルボテトラクロロフルオレセイン；励起波長５５５ｎｍ、蛍光波長５８０ｎｍ）、ＧＦＰ（グリーンフルオレッセンスプロテイン；励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）を例示できる。なお、酵素７又は蛍光色素７によるアプタマー５の標識方法は特に制限はなく、当該技術分野で通常に使用されている標識方法が利用できる。
本発明のバイオセンサの第二の実施形態としては、標的菌に特異的に結合する上記のアプタマーを酵素７又は蛍光色素７で標識することなく、基板上に基質認識部として固定化したセンサを例示できる。
図２は、本発明のバイオセンサの第二の実施形態を示す斜視図である。
図２に示すバイオセンサ２０は、基板１と、基板１上に設けられた基質認識部３とを備え、基質認識部３には、アプタマー５が結合している。
第二の実施形態に係るバイオセンサ２０では、まず、基質認識部３に被検試料（例えば、唾液、体液）を滴下したり、基質認識部３を口に含んで唾液と接触させたりして、アプタマー５に標的菌を結合させ、その後、基質認識部３をバッファー中で十分に洗浄し、酵素又は蛍光色素で標識した標的菌を特異的に認識する抗体又はアプタマーを含む溶液に基質認識部３を接触させることにより、アプタマー５に結合した標的菌に上記の抗体又はアプタマーを結合させる。その後、基質認識部３を十分に洗浄することにより非特異的な結合を排除し、上記の抗体又はアプタマーに標識されている酵素の活性又は蛍光色素が発する蛍光を検出し、これにより標的菌を検出できる。
アプタマー５の基板１の表面への結合及び蛍光色素の例示は、本発明のバイオセンサの第一の実施形態のところで記載した通りである。
本発明のバイオセンサの第三の実施形態としては、標的菌に特異的に結合する上記のアプタマーと、アルカンチオールと、フェロセンとを電極上に固定した作用極と、参照極とを備える２電極式電気化学セルに電解液を入れたセンサが挙げられる。但し、このセンサは、作用極、対極及び参照極の３電極を備えた３電極系であってもよい。
図３は、本発明のバイオセンサの第三の実施形態を示す斜視図である。
図３に示すバイオセンサ３０は、絶縁性基板２と、絶縁性基板２上に形成された作用極１１及び参照極１３と、これらに接続されたリード線１５を備えている。作用極１１には、アルカンチオール２１が結合し、アルカンチオール２１にはフェロセン２３が結合し、フェロセン２３にはアプタマー５が結合している。バイオセンサ３０の絶縁性基板２上には、作用極１１、参照極１３、アルカンチオール２１及びフェロセン２３を取り囲むようにして、堰部６が形成されており、堰部６で取り囲まれた内部が、被検試料を保持するための反応部１７となる。また、作用極１１、参照極１３、アルカンチオール２１、フェロセン２３及び堰部６が全体として基質認識部３となる。
第三の実施形態に係るバイオセンサでは、作用極１１と参照極１３の間に一定の電圧をかけて、電流が定常になった後に、反応部１７に被検試料（例えば、唾液、体液）を加え、電流値の変化を測定することにより標的菌を検出できる。なお、標準濃度の標的菌を含有する溶液により作製した標準曲線に従えば、標的菌の濃度を計算することもできる。
電極材料としては、作用極１１に金電極を用い、参照極１３にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いる構成を例示できる。
標的菌に特異的に結合する上記のアプタマー５と、アルカンチオール２１と、フェロセン２３とを電極上に固定する方法としては、まず、ビオチン標識したアルカンチオール２１を作用極１１に結合し、ビオチン−アビジン反応を介して、アビジン標識したフェロセン２３をアルカンチオール２１に結合させ、さらに、ビオチン標識したアプタマー５をフェロセン２３に結合させる方法を例示できる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓに特異的に結合するアプタマーのスクリーニング
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓに特異的に存在する菌体表層物質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｐａｃ（配列番号１３）を選択し、このタンパク質に特異的に結合するアプタマーをスクリーニングした。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓに特異的に存在する菌体表層物質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｐａｃ（配列番号１３）を選択し、このタンパク質に特異的に結合するアプタマーをスクリーニングした。
まず、アプタマーの認識部位として、配列表の配列番号１３に示されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｐａｃの塩基配列をコンピューター内進化プログラムで処理して１０世代の塩基配列をコンピューター上に発生させ、これらの塩基配列をＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓに結合するアプタマーの候補とした。なお、コンピューター内進化プログラムは、Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏらの文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００５年、３３巻、ｅ１０８）を参照し、通常利用されている遺伝的アルゴリズムを用いて、ｖｉｓｕａｌ ｂａｓｉｃで作成した。
その後、候補として挙げられた複数の塩基配列からなるオリゴＤＮＡを化学合成し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓに対して特異的な結合が認められたものをアプタマーとして回収し、これを鋳型にＰＣＲを行うことによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓに特異的に結合するアプタマー（以下、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマー）を大量に調製した。
こうして得られたＳ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーは、末端をビオチンで標識して、以下の実験で使用した。
（実施例２）：アプタマーによるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの検出
Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーを抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ菌抗体の代わりに用いたＥＬＩＳＡ法で、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの検出を試みた。
Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーを抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ菌抗体の代わりに用いたＥＬＩＳＡ法で、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの検出を試みた。
まず、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓをＰＢＳに懸濁し、各濃度の菌懸濁液（１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８及び１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）を調製した。調製した菌懸濁液は、ポリ−Ｌ−リジンコートした９６穴プレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、一定時間静置することにより、ウェルの底に菌を固定した。
菌が固定された各ウェルには、実施例１で調製したビオチン標識Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーを５０μｇ加え、２５℃で１時間静置し、ＰＢＳで洗浄することにより菌に結合しなかったビオチン標識Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーを取り除いた。
引き続き、各ウェルにＨＲＰ標識ストレプトアビジンを加え、２５℃で１時間静置し、ＰＢＳで各ウェルを十分に洗浄した後に、発光基質であるｏ−ＰＤＡを各ウェルに加え、１５分間反応させた。その後、６Ｎ硫酸を加えることにより反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、ビオチン標識Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーは、１×１０４ＣＦＵ／ｍＬのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓを感度良く検出できることが明らかとなった（図４の実線のグラフ）。
（比較例１）：抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ菌抗体によるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの検出
抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ菌抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの検出を試み、実施例２におけるＳ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーを用いたＥＬＩＳＡ法での検出感度と比較した。
抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ菌抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの検出を試み、実施例２におけるＳ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーを用いたＥＬＩＳＡ法での検出感度と比較した。
実施例２と同様に、まず、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓをＰＢＳに懸濁し、各濃度の菌懸濁液（１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８及び１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）を調製した。調製した菌懸濁液は、ポリ−Ｌ−リジンコートした９６穴プレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、一定時間静置することにより、ウェルの底に菌を固定した。
菌が固定された各ウェルには、５０倍希釈液した抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ菌抗体（ウサギ抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＩｇＧ抗体）を１００μＬ加え、２５℃で１時間静置し、ＰＢＳで洗浄することにより菌に結合しなかったウサギ抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＩｇＧ抗体を取り除いた。
その後、各ウェルに１％スキムミルクを加えてブロッキング処理を行い、そこにビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を加えて、２５℃で１時間静置し、ＰＢＳで各ウェルを十分に洗浄した。
引き続き、各ウェルにＨＲＰ標識ストレプトアビジンを加え、２５℃で１時間静置し、ＰＢＳで各ウェルを十分に洗浄した後に、発光基質であるｏ−ＰＤＡを各ウェルに加え、１５分間反応させた。その後、６Ｎ硫酸を加えることにより反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、ウサギ抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＩｇＧ抗体は、１×１０5ＣＦＵ／ｍＬ以下の濃度のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓを検出することができず、１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ以上の濃度で検出可能となることが明らかとなった（図４の点線のグラフ）。
以上の結果より、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーは、ウサギ抗Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＩｇＧ抗体よりも、少なくとも１００倍検出感度が高いことが判明し、検出感度の観点から、アプタマーの方が抗体よりも菌を検出するのに適していることが示唆された。
（実施例３）：Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーを基質認識部に有するバイオセンサによるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの検出（電気化学的方法）
Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーと、アルカンチオールと、フェロセンとを電極上に固定した作用極と、対極と、参照極とを備える３電極式電気化学セルに電解液を入れたセンサを構築し、被検試料に含まれるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの検出を試みた。
Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーと、アルカンチオールと、フェロセンとを電極上に固定した作用極と、対極と、参照極とを備える３電極式電気化学セルに電解液を入れたセンサを構築し、被検試料に含まれるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの検出を試みた。
まず、金電極の表面にビオチン標識したアルカンチオールを結合させ、ＰＢＳで金電極を洗浄した後に、ビオチン−アビジン反応を介して、アビジン標識したフェロセンをアルカンチオールに結合させ、ＰＢＳで金電極を洗浄した後に、再び、ビオチン−アビジン反応を介して、実施例１で調製したビオチン標識Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーをフェロセンに結合させ作用極（基質認識部）を作製した。
その後、得られた作用極と、対極（Ａｕ）と、参照極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）とを備える３電極式電気化学セルを完成させ、セルにＰＢＳを入れたバイオセンサを構築した。
こうしてできたバイオセンサの作用極に一定の電圧をかけ、電流が定常になった後に、セルに各濃度のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの懸濁液（１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８及び１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）を加え、電流値の変化を測定した。
図５は、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーを基質認識部に有するバイオセンサで、電気化学的方法によって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの検出を行った結果である。
その結果、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ結合用アプタマーを基質認識部に有するバイオセンサによって、１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ以上の濃度のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓを検出できることが明らかとなった。
１・・・基板、２・・・絶縁性基板、３・・・基質認識部、５・・・アプタマー、６・・・堰部、７・・・酵素又は蛍光色素、１０，２０，３０・・・バイオセンサ、１１・・・作用極、１３・・・参照極、１５・・・リード線、１７・・・反応部、２１・・・アルカンチオール、２３・・・フェロセン。
Claims (10)
- 菌に結合するアプタマーを基質認識部に備える、バイオセンサ。
- 前記菌は、口腔内細菌である、請求項１記載のバイオセンサ。
- 前記口腔内細菌は、う蝕菌又は歯周病菌である、請求項２記載のバイオセンサ。
- 前記う蝕菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓである、請求項３記載のバイオセンサ。
- 前記う蝕菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓである、請求項３記載のバイオセンサ。
- 前記う蝕菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓである、請求項３記載のバイオセンサ。
- 前記アプタマーは、菌体表層物質に結合する、請求項１〜６のいずれか一項記載のバイオセンサ。
- 前記アプタマーは、配列表の配列番号１〜１５記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する、請求項４記載のバイオセンサ。
- 前記アプタマーは、配列表の配列番号１６〜２１記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する、請求項５記載のバイオセンサ。
- 前記アプタマーは、配列表の配列番号２２〜２５記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する、請求項６記載のバイオセンサ。
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