JP2008536479A

JP2008536479A - ジスルフィド架橋を有するタンパク質の発現法

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Publication number: JP2008536479A
Application number: JP2007556197A
Authority: JP
Inventors: ミネア，ラドゥ; マークランド，フランセス
Original assignee: ユニバーシティオブサザンカリフォルニア
Priority date: 2005-02-11
Filing date: 2006-02-09
Publication date: 2008-09-11
Also published as: US20130345399A1; EP2634252B1; US7754850B2; US8110542B2; US20110097388A1; US20120301453A1; EP1856255A4; CN101535492A; EP2634252A2; US8685668B2; AU2006336468A2; AU2006336468B2; US20060246541A1; AU2006336468A1; US8338365B2; CA2597647A1; EP2634252A3; WO2007086879A2; WO2007086879A3; EP1856255A2

Abstract

本発明は原核生物ホストにおいて真核生物タンパク質、特に生体活性のためにジスルフィド架橋の形成を必要とする真核生物タンパク質を発現する方法に関する。種々の方法、例えばチオレドキシンへの融合、ジスルフィド異性化酵素の細胞質発現、チオレドキシンおよび／またはグルタチオン還元酵素の欠損、プロテアーゼの欠損などが用いられる。方法は、生体活性を有する単量体および二量体型真核生物タンパク質、例えば単量体および二量体型のディスインテグリンまたはディスインテグリンドメインの発現に適用できる。ベクター、タンパク質を発現するホスト細胞、発現されたタンパク質、およびタンパク質の使用法を含む。

Description

本発明は、その全部または一部が米国陸軍および国立衛生研究所からの助成金によってサポートされている。米国政府は本発明の一定の権利を有しうる。

本発明は組換えホストにおいてタンパク質を発現させる方法、更に特定すれば微生物ホストにおいて、生体活性のためにジスルフィド架橋の形成を必要とする異種真核生物タンパク質を発現させる方法に関する。

業務用および医療用に使用され、ジスルフィド架橋によって安定化された複雑な分子構造を有することを特徴とする種々のタンパク質が知られている。それらの種類のタンパク質の一つであるディスインテグリンは、インテグリンの可溶性リガンドとして最も有力視されている、一群のシステインリッチなタンパク質を含む（Gould, Polokoffら, 1990；Niewiarowski, McLaneら, 1994）。トリペプチドモチーフ、RGD（Arg-Gly-Asp）は、ほとんどの単量体ディスインテグリンで保存されている（Niewiarowski, McLaneら, 1994）。RGD配列はフレキシブルなループ（インテグリン結合性ループ）の先端にあり、ジスルフィド結合によって安定化され、ペプチド鎖本体から突出している。ディスインテグリンはフィブリノーゲン受容体、αIIb/33に結合し、それによってフィブリノーゲン依存性血小板凝集の阻害を引き起こす（Savage, Marzecraら, 1990）。バーボリン（barbourin）はKGD含有ディスインテグリンであり、αIIbβ3インテグリンに比較的特異的なリガンドであるが（Scarborough, Roseら, 1991）、これを除く他のディスインテグリンはより非特異的であり、他のβ3インテグリン並びにβ１インテグリンの機能に関係するシグナル伝達経路を遮断または阻害することができる（McLane, Marcinkiewiczら, 1998）。

コントートロスタチン（contortrostatin；CN）はアメリカマムシ（Agkistrodon contortrix contortrix （サザンカパーヘッド：southern copperhead））毒液から単離されたディスインテグリンである（Trikha, Roteら, 1994）。CNはそのインテグリン結合性ループに古典的なRGDモチーフを示す。他の単量体ディスインテグリンと異なり、CNはホモ二量体であり、質量分析による質量（Mr）は、無傷の分子で13,505、還元型鎖で6,750である（Trikha, Roteら, 1994）。

これまでに同定されているCNの受容体には、インテグリンαIIbβ3、αvβ3、αvβ5、およびα5β1がある（Trikha, De Clerckら, 1994；Trikha, Roteら, 1994； Zhou, Nakadaら, 1999；Zhou, Nakadaら, 2000）。CNとインテグリンとの間の相互作用は全てRGD依存的である。抗ガン剤として、CNは強力な抗血管新生および抗転移分子であることが、インビトロの細胞に基づく機能性アッセイおよびインビボの動物モデルにおいて明らかになっている（Trikha, De Clerckら, 1994；Trikha, Roteら, 1994；Schmitmeier, Marklandら, 2000；Zhou, Huら, 2000；Markland, Shiehら, 2001；Swenson, Costaら, 2004）。また、CNはガン細胞に直接はまり込み、その増殖を細胞分裂阻害的に抑制する能力も有する。CNの抗腫瘍活性は、ガン細胞および新たに成長しつつある血管内皮細胞のいずれにおいても、インテグリンα5β1、αvβ3、およびαvβ5との高親和性相互作用に基づく（Trikha, De Clerckら, 1994；Zhou, Nakadaら, 1999；Zhou, Nakadaら, 2000；Zhou, Sherwinら, 2000）。CNは、この多様な作用機構により、一つの血管新生経路を阻害するのみであるか、および／または腫瘍細胞を直接標的としない多くの抗血管新生物質に優る明らかな利点を有する。

CNの完全長DNA前駆体はクローニングおよび配列決定がなされている（Zhou, Huら, 2000）。CNはヘビの毒腺において、1449bpのオープンリーディングフレーム（プロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインをコードする）を有する2027bpのマルチドメイン前駆体として生成され、これがタンパク分解的にプロセシングされて（おそらくは自己触媒的に）成熟CNを生じる。CNのディスインテグリンドメインは65アミノ酸をコードし、CNサブユニットと同じ分子量を有する。CN完全長前駆体のmRNA配列はGeneBankデータベースで得られる（アクセッション番号：AF212305）。65アミノ酸のCNディスインテグリンドメインをコードするヌクレオチド配列はｍRNAの1339から1533のセグメントに相当する。CN完全長遺伝子をコードするプラスミドについての報告がなされており（Zhou, Huら, 2000）、南カリフォルニア大学のFrancis S. Marklandの研究室から入手できる。

構造的に、CNはシステインリッチなタンパク質であり（単量体あたり10システイン）、二次構造を示さず、他のディスインテグリンのように複数のジスルフィド結合（4つの鎖内ジスルフィド結合および２つの鎖間ジスルフィド結合）による複雑なフォールディング・パターンによってその3次構造が安定化されている（Zhou, Huら, 2000）。複数のジスルフィド結合によって固定されたコンパクトな構造にフォールディングされることによって、CNは多くの他の毒液タンパク質と同様、生存に関する利点を有し、タンパク分解攻撃に対する感受性がより低く、厳しい細胞外微小環境で生き残るためのより優れた能力を備えている。その高度に架橋結合した構造と独自の生体活性は、組換え発現系を用いた生物学的に機能的なCN（または他のディスインテグリンドメインタンパク質）の生成の妨げとなる。更なる困難は、マルチドメイン前駆体（これから二量体CNが誘導される）のCNディスインテグリンドメインが二次構造を示さないことである（この特徴により、ほとんどの新生タンパク質で独自のフォールディングが促進されることが知られている）（Moiseeva, Swensonら, 2002）。野生型CNの結晶構造は解明されていない。CNのフォールディング・パターンは、研究が為されてきた他のクサリヘビ科動物（viperid）の二量体ディスインテグリンと同様に複雑であると推測される（Calvete, Jurgensら, 2000；Bilgrami, Tomarら, 2004）。CNのようなヘビ毒腺ディスインテグリンを、真核および原核生物系において機能的野生型コンフォーマーとして、大量生成に好適な高発現レベルで発現させようとする試みは、これまでのところ満足できるものではない（例えばMoura-da-Silva, Linicaら, 1999参照）。

発明の概要
原核生物ホストにおいて真核生物タンパク質、特に複数のジスルフィド架橋を有する真核生物タンパク質を発現させる方法を提供する。この方法は、生体活性が1つ以上のジスルフィド架橋（鎖内および鎖間）の形成に依存する真核生物タンパク質の発現に特に好適である。ある場合には、この方法は複数のジスルフィド架橋（鎖内および鎖間）の形成を必要とし、2次構造をほとんど、または全く形成しない活性真核生物タンパク質の発現に適用できる。

ある方法では、タンパク質を融合パートナーとの遺伝子融合体として発現させることによって、ホスト細胞における真核生物タンパク質の発現を行う。融合パートナーは細菌チオレドキシン、例えばチオレドキシンA（Trx A）であってもよい。これは、チオレドキシンをコードする配列の下流（すなわち３’側）に真核生物タンパク質をコードするDNA配列をクローニングすることによって行う。融合タンパク質をコードする配列は、好適な調整制御配列、例えばプロモーター、必要により転写促進因子、転写抑制因子などの制御下で、好適な発現ベクターに含有されてもよい。ある態様では、ベクターはpET32aである。別の態様では、ベクターはpET32a/pCDFDuet-1を組み合わせたものである。チオレドキシン／真核生物タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換したホスト細胞を培養し、真核生物タンパク質を含有する融合タンパク質を生成する。

更に別の態様では、原核ホスト細胞を遺伝子操作し、通常は細菌のペリプラズム空間に局在するジスルフィド異性化酵素を細胞質内で発現させる。ある態様では、ジスルフィド異性化酵素はDsbCである。別の態様では、細胞を遺伝子操作して、レドックス系触媒、例えば細菌チオール／ジスルフィド交換タンパク質DscDのα-ドメインを細胞質内で発現させる。DsbCまたはDsbDのα-ドメインの細胞質への局在化は、シグナル配列のない成熟タンパク質を発現させることによって行うことができる。ホスト細胞を改変してDsbCおよびDscDのα-ドメインの両方を細胞質内で発現させてもよい。

更なる態様では、野生型異性化酵素の代わりに、異性化酵素活性が亢進されたジスルフィド異性化酵素の活性部位変異体を、ホスト細胞によって細胞質内で発現させることができる。例えば、E. coliの野生型DsbCの活性部位の配列CGYCをCGFCまたはCTFCで置換することによって、異性化酵素活性が亢進された変異酵素が生じる。

別の態様では、ホスト細胞は変異型trxB遺伝子および／または変異型gor遺伝子を有し、それによって細胞はチオレドキシン還元酵素活性および／またはグルタチオン還元酵素活性を欠損する。これらの変異体を個別に、または本明細書に記載する他のホスト細胞変異体と組み合わせて使用してもよい。

更に別の態様では、ホスト細胞は1つ以上のプロテアーゼを欠失するよう調製される。それらのプロテアーゼの例には、ompTおよびlon遺伝子にコードされるものがある。例えばE. coliホスト細胞AD494(DE3)pLysSは、trxB遺伝子、並びにompTおよびlonを欠損している。E. coli株Origami B(DE3)pLysSおよびRosetta-gami B(DE3)pLysSは、trxB、gor、ompT、およびlon遺伝子産物を欠損している。これらの変異体を本明細書に記載する他のホスト細胞変異体と組み合わせて使用してもよい。従ってompTおよびlon遺伝子変異体を、trxBおよび／またはgor遺伝子を欠失するホスト細胞、並びにDscC（野生型タンパク質または活性部位変異体）および／またはDsbD α-ドメインを細胞質内で発現するように改変したホスト細胞と組み合わせて使用してもよい。

本明細書に開示する方法で発現させる真核生物タンパク質としては、生体活性が少なくとも1つのジスルフィド架橋の形成に依存するものが挙げられる。別の態様では、真核生物タンパク質の生体活性は少なくとも2つのジスルフィド架橋の形成に依存する。更に別の態様では、真核生物タンパク質の生体活性は少なくとも3つのジスルフィド架橋の形成に依存する。更なる態様では、真核生物タンパク質の生体活性は少なくとも4つのジスルフィド架橋の形成に依存する。また別の態様では、真核生物タンパク質の生体活性は少なくとも5つのジスルフィド架橋の形成に依存する。更に別の態様では、真核生物タンパク質の生体活性は少なくとも10または少なくとも15のジスルフィド架橋の形成に依存する。

本明細書で使用する“真核生物タンパク質”という用語は、真核細胞で天然に発現されるタンパク質をいう。真核生物タンパク質という用語は、天然に発現される真核生物タンパク質のアミノ酸配列における変異体も含む。ただしその場合、タンパク質は天然に発現される真核生物タンパク質に伴う活性を少なくとも１つ保持し、真核生物タンパク質の配列は原核生物タンパク質のいずれとも異なる。好ましい態様では、野生型タンパク質に特徴的な活性または機能を少なくとも1つ保持させるようにして、真核生物タンパク質を本明細書に記載するように発現させる。好ましくは、発現されたタンパク質は野生型タンパク質の活性または機能の全て、または実質的に全てを保持する。他の好ましい態様では、発現されたタンパク質は野生型タンパク質の活性または機能特性の少なくとも1つを保持し、その活性または機能は少なくとも1つ以上のジスルフィド架橋の形成に依存するものである。本明細書で使用する“実質的に”という用語は、特に記載しない限り+/- 10%を意味する。

タンパク質の活性または機能（すなわちその生体活性）は、その1次アミノ酸配列、および／または、2次および／もしくは3次構造に起因するタンパク質の特徴を反映する。例えば真核生物酵素の生体活性には、特定の酵素反応を触媒する能力が含まれる。真核生物の構造タンパク質の生体活性には、細胞内で好適な細胞下構造を形成するタンパク質の能力も含まれうる。生体活性の評価法は当該分野で周知である。

本明細書に記載するように発現させることができる真核生物タンパク質には、単量体または多量体（例えば二量体）タンパク質、および以下のような異なるクラスからのタンパク質が含まれる：ADAMタンパク質、ディスインテグリン、毒素、ワクチン成分（例えば細菌またはウィルスタンパク質）、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、免疫グロブリン（抗体およびT細胞受容体細胞外ドメインを含む）、細胞接着分子（IgCAM）の免疫グロブリンスーパーファミリーに属する接着タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、増殖因子、およびプラスミノーゲン活性化因子。代表的なタンパク質には以下がある：コントートロスタチン、ハララギン（jararhagin）、ディスインテグリン・チスタチン（schistatin）、ヘビメタロプロテイナーゼフィブロラーゼ、ヒトインターロイキン-2前駆体、ヒトインターフェロン-γ、ヒトトランスフォーミング増殖因子ベータ2、ヒト肝臓発現ケモカイン（LEC、CCL16）、オメガ-コノトキシンCVID前駆体、サソリクロロトキシン、ヒトADAM 9前駆体、ヒト血管内皮増殖因子A（VEGF-A）、およびヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子前駆体（t-PA）。

本発明の方法を用いて真核生物タンパク質の活性フラグメントを発現させてもよい。例えばヘビ毒液ディスインテグリン前駆体（例えばクラスPIIおよびPIII）の場合、これはいくつかの生体活性ドメイン（メタロプロテアーゼ、ディスインテグリン、ディスインテグリン様、および／またはシステインリッチ）を含むマルチドメインタンパク質であるが、発現される産物は完全長のプレタンパク質（完全長の前駆体）、または以下の候補で表される生体活性フラグメントであってもよい：メタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリンドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、およびシステインリッチドメイン。これらは単独でも、または他のドメインと組み合わされたものであってもよい（例えば共発現されたディスインテグリンおよびシステインリッチドメイン）。ディスインテグリンの他のフラグメントも可能である。他のフラグメントも可能である。抗体の場合、代表的なフラグメントにはF(ab’)2フラグメント、Fabフラグメント、Fvまたは1本鎖Fvフラグメント、およびFcフラグメントがある。他の抗体フラグメントも可能である。

ある態様では、遺伝子操作により切断部位をチオレドキシンおよび真核生物タンパク質の間に配し、発現後の融合タンパク質からの真核生物タンパク質の単離を可能とする。別の態様では、切断部位はタンパク質分解性切断部位である。別の態様では、切断部位は化学切断部位である。好ましくは切断部位をチオレドキシンおよび真核生物タンパク質の間（例えばチオレドキシン配列の下流でジスルフィド含有真核生物タンパク質のN-末端の上流）に配し、チオレドキシンを含有しない真核生物タンパク質を得る。

ある態様では、内部切断部位を有する発現された融合タンパク質を他の混入分子から実質的に精製してもよい。精製を容易にするために、融合タンパク質はリガンドもしくは受容体をコードする配列、または金属イオンを配位する能力を有するアミノ酸の配列、すなわちタグを含んでもよい。タグ配列は、天然に存在するペプチドであるリガンド／受容体対のいずれかのメンバーであってもよい。他の態様では、タグ配列はHisタグ（ポリHis）配列を含む。好ましくは、タグ配列はジスルフィド含有真核生物タンパク質のN-末端またはC-末端、より好ましくはN-末端で、任意の切断部位の上流に位置する。

本明細書の方法で発現させたジスルフィド含有真核生物タンパク質は、同じクラスの構造を有する他のタンパク質から得た、またはそれをモデルとした機能的に有用な配列を含んでもよい。真核生物タンパク質にとっては外来種であるこれらの機能性配列は、付加によって与えられる真核生物タンパク質の生体活性への影響に応じて、真核生物タンパク質のいずれかの末端か、または真核生物タンパク質内に配置させてもよい。それらの機能性配列には単量体または二量体ディスインテグリン１次配列中のC-最末端Cys残基から下流に位置するアミノ酸残基が含まれる。例えば生物学的に活性なディスインテグリンドメインは、特定型のインテグリンへの結合のための配列をそのC-末端に含有してもよい。例えば、CN完全長ディスインテグリン前駆体またはそのディスインテグリンドメインを、C-末端伸長鎖HKGPAT（３文字コード：His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr）と共に発現させてもよく、この伸長鎖はエキスタチン（echistatin；天然状態では単量体であるディスインテグリン）のC-末端アミノ酸配列である。CNのC-末端へHKGPATを付加させることによって、発現された組換えCNディスインテグリンドメインのα5β1インテグリンに対する親和性を増加させることができる。このC-末端融合体により、分子のC-末端側半分（インテグリン結合性ループの鍵となる構造要素が存在する）における新生組換えCNディスインテグリンドメインの正確なフォールディングを促進することもできる。

更に別の態様では、ジスルフィドを含む真核生物タンパク質はディスインテグリンであり、これをC-末端に配列HKGPATを有するキメラ融合タンパク質として発現させてもよい。配列HKGPATのN-末端にコントートロスタチンドメインを含む融合タンパク質をビクロスタチン（vicrostatin）（VN）と称する。

更なる態様では、真核生物タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのコドン使用を特定のホストにおける発現用に最適化してもよい。例えばE. coliのコドン使用を操作し、発現ホストの形質転換に用いられる組換えプラスミドにコードされるtRNA種で発現ホストのtRNA生成を補足することによって、ディスインテグリンの発現を最適化することができる。また、よりホスト細胞に好適となるようにコドンを選択することによって、ホスト細胞にとっては外来種であるチオレドキシンまたはジスルフィド異性化酵素コード配列用にコドン使用を最適化してもよい。

更なる方法では、真核生物タンパク質を上流チオレドキシン配列無しで直接発現させてもよい。真核生物タンパク質は上記のような更なる配列を含んでもよい。チオレドキシンに融合していない真核生物タンパク質をコードするベクターで形質転換したホスト細胞は、上記の改変を任意の組み合わせで有してもよい。

上記の方法によれば、真核生物タンパク質を含有する融合タンパク質の発現レベルは少なくとも1-3mg/L、より好ましくは4-6mg/L、更に好ましくは7-9mg/L、更により好ましくは8-10mg/L以上、11-14 mg/L以上、15-19 mg/L以上、または20 mg/L以上である。

本発明はまた、上記の方法のいずれかで生成された、実質的に精製された真核生物タンパク質（チオレドキシンに融合させたもの、またはチオレドキシンから分離されたもの）も提供する。

更に、チオレドキシンをコードするN-末端セグメントと、生体活性のために少なくとも２つの鎖内または鎖間ジスルフィド架橋の形成を必要とする真核生物タンパク質をコードするC-末端セグメントとを含む融合タンパク質を提供する。好ましくは、真核生物タンパク質はディスインテグリンを含む。融合タンパク質を切断して、実質的にチオレドキシンを含有しない真核生物タンパク質を得てもよい。融合タンパク質を実質的に精製してもよい。

更にまた、生成された真核生物タンパク質（または融合タンパク質）および原核生物物質を含有する組成物を提供する。組成物中の原核生物物質は、発現ホストとして使用する原核細胞に由来してもよい。本明細書で使用する原核生物物質は、原核細胞中には存在するが真核細胞中には存在しない、または真核細胞中に存在するものと異なる、タンパク質、リポタンパク質、脂質、核酸、炭水化物、または他の分子をいう。

更に、本明細書に記載する方法のいずれかによって得られる発現ベクターおよびそれらの発現ベクターを含む原核ホスト細胞を提供する。例えば、ディスインテグリンまたはディスインテグリンドメインに融合したチオレドキシンをコードする発現カセットを含む発現ベクター、およびそれらの発現ベクターで形質転換したホスト細胞を提供する。

また、ディスインテグリンまたはディスインテグリンドメインにとっては外来であるC-末端配列であって、機能性インテグリン結合性ループをコードするC-末端配列を含む単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメインを提供する。ある態様では、インテグリン結合性ループは、インテグリンαIIbβ3、αvβ3、αvβ5、またはα5β1から選択される。別の態様では、インテグリン結合性ループC-末端配列はHKGPATを含む。更なる態様では、インテグリン結合性ループは少なくとも１つの分子内ジスルフィド架橋で安定化される。更に別の態様では、単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメインはコントートロスタチン由来である。単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメインは、上記のようにホスト細胞での発現によって得てもよい。発現後、単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメインを実質的に精製された形態で得てもよい。

更に、αIIbβ3、αvβ3、αvβ5、またはα5β1から成る群から選択される1つ以上のインテグリンに特異的なインテグリン受容体を発現する細胞と、αIIbβ3、αvβ3、αvβ5、またはα5β1から成る群から選択される1つ以上のインテグリンとの間の結合を阻害する方法を提供する。この方法は、ディスインテグリンまたはディスインテグリンドメインにとって外来であるC-末端配列を含む単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメインと細胞を接触させることを含み、該C-末端配列は機能性インテグリン結合性ループをコードする。好ましい態様では、インテグリン受容体はビトロネクチン受容体である。

更に、インビボにおいて血小板凝集、細胞増殖、細胞接着、転移、または血管新生を阻害する方法も提供する。この方法は、それらの治療を必要とする個体に、ディスインテグリンまたはディスインテグリンドメインにとって外来であるC-末端配列を含む単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメインを有効量投与することを含み、該C-末端配列は機能性インテグリン結合性ループをコードする。

図面の簡単な説明
図１は、E. coliペリプラズムにおける酸化経路を示す（ColletおよびBarwell 2002より）。

図２は、E. coliペリプラズムにおける異性化経路を示す（ColletおよびBarwell 2002より）。

図３は、DsbCの裂隙内へのDsbDαのドッキング後の、明らかにされているDsbCおよびDsbC-DsbDα相互作用の結晶構造を示す（Haebel, Goldstoneら 2002より）。

図４は、E. coliペリプラズムにおける種々のDsbフォールダーゼによって触媒されるジスルフィド結合形成のモデルを示す。

図５は、E. coli細胞質におけるチオレドキシンおよびグルタレドキシン経路を示す（RainaおよびMissiakas 1977より）。TrxA：チオレドキシン；TrxB：チオレドキシン還元酵素；Grx：グルタレドキシン；Gor：グルタチオン還元酵素。

図６は、pET32aベクター（Novagen）のマップを示す。

図７は、インテグリンαvβ3結合ポケット内へのトリメスタチン（trimestatin）単量体ディスインテグリンのドッキング後の、推定されるトリメスタチン-受容体相互作用を示す（Fujii, Okudaら 2003より）。

図８は、種々のTrx融合コンストラクトで形質転換したOrigami B (DE3) pLysS E. coliホストから回収した総可溶性タンパク質画分（TPF）のSDS-PAGEクマシー染色したゲルを示す。1Lの培地中の形質転換および未形質転換Origami B E. coliを1mM IPTGで誘導し、撹拌フラスコ中、37℃または25℃、250rpmで3時間増殖させた。総可溶性タンパク質画分（TPF）を4mlの20mM Tris-HCl（pH7.5）中に回収し、その10μlを負荷し、非還元条件下で分析した。左レーンから右へ： Trx-VN発現細胞由来のTPF（37℃で増殖および誘導）、非形質転換細胞由来のTPF（37℃で増殖および誘導）、Trx-rCN-発現細胞由来のTPF（37℃で増殖および誘導）、非形質転換細胞由来のTPF（25℃で増殖および誘導）、プレステインド広域タンパク質スタンダード（Bio-Rad）、Trx-VN発現細胞由来のTPF（25℃で増殖および誘導）、およびTrx-rCN-発現細胞由来のTPF（25℃で増殖および誘導）。

図９は、ビクロスタチン（VN）、rCNコンストラクト、および野生型CNによるADP-誘導型血小板凝集の阻害を示す。種々の濃度の野生型CN、ビクロスタチン（VN）、またはrCNコンフォーマーを多血小板血漿と共にインキュベートした。ADPの添加によって血小板凝集を誘導する；VN、rCNコンフォーマー、または野生型CNをADPの1分前に添加した。野生型CNおよびVNはいずれもIC₅₀ 約60nMで凝集を阻害し、これはVNが野生型CNと同様に血小板と相互作用することを示している。rCNコンストラクトはマイクロモルの範囲では血小板阻害活性を示すが、ナノモルの範囲では示さない。

図１０は、固定化したフィブロネクチン（Fn）またはビトロネクチン（Vn）へのMDA-MB-435乳ガン細胞接着の阻害を示す。種々の濃度（0-1000nM）の野生型CNまたはVNのいずれかで30分間MDA-MB-435細胞を前処理すると、固定化したフィブロネクチン（Fn）へのMDA-MB-435細胞（100μlの細胞、10⁵細胞/ml）の接着が阻害された（パネルA）。種々の濃度（0-1000nM）のCNまたはVNのいずれかで30分間MDA-MB-435細胞を前処理すると、固定化したビトロネクチン（Vn）へのMDA-MB-435細胞（100μlの細胞、10⁵細胞/ml）の接着が阻害された（パネルB）。前処理した細胞を25℃で1時間接着させ、未接着細胞を洗浄除去し、MTS細胞生存能アッセイを用いて各条件での接着細胞数を測定した。ビクロスタチン（VN）および野生型CNは同様の阻害プロフィールを示している。

図１１は、人工基底膜を通したMDA-MB-435乳ガン細胞の浸潤の阻害を示す。細胞を種々の濃度（10、100、1000nM）の野生型CNまたはビクロスタチンの存在下、25℃で30分間インキュベートした後、ボイデン・チャンバーで8時間移動させた。ビクロスタチンおよび野生型CNは同様の阻害プロフィールを示している。

図１２は、野生型CNおよびビクロスタチン（VN）含有リポソーム（それぞれLCNまたはLVN）投与後のマウス異種移植片モデルにおけるMDA-MB-435腫瘍の増殖を示す。動物をLCNおよびLVN（105μg、週2回、i.v.投与）で処理した。PBS処理したコントロール動物も含めた。T/C値はいずれも約0.27であった；400mg（T-C）での腫瘍増殖の遅延は各処理群で31日であった。

図１３は、CNおよびVN含有リポソームで処理した異種移植マウスからから採取したMDA-MB-435腫瘍からの組織切片のCD31免疫染色で示されるCNおよびVNの抗新生効果を示す。図１３AはCD34（茶色）で染色した各処理群の代表的な切片を示す。１３Bは染色された微小血管の定量を示し、腫瘍によって誘導された血管新生をLCNは90%、LVNは92%阻害した（いずれもPBS処理したコントロール動物と比較）。

図１４Aおよび１４Bはそれぞれ、野生型CNおよびVNのMALDI-TOF質量分析を示す。VNの分子量7143.41のシングルピークは、それが単量体であることを示している。

図１５Aおよび１５Bはそれぞれ、野生型CNおよびVNの電子スプレーイオン化（ESI）質量分析を示す。13CでのCNの13507.0の大きなピークは2量体を示し、VNの7146.0のシングルピークは単量体を示す。

図１６は、E. coliにおけるコドン使用の概要を表に示す（Guerdoux-Jamet, Henautら, 1977）。

図１７は、種々の生物における最も使用頻度の低いコドン８つを示す（Guerdoux-Jamet, Henautら, 1977）。

図１８Aは野生型CN配列を示す（細菌において稀にしか使用されないコドンを太字で示す）。１８Bは稀にしか使用されないCGGの全ておよびACAのほとんどを置換した後の野生型CN遺伝子配列を示す。未置換のままのACAコドンを太字で示す。

図１９は、pCDFDuet-1ベクター（Novagen）のマップを示す。

発明の詳細な説明
微生物ホストにおいて生体活性のためにジスルフィド架橋の形成を必要とする外来真核生物タンパク質を発現させる方法を提供する。この方法は、複数のジスルフィド架橋（鎖内および鎖間）の形成を必要とする生物学的に活性な真核生物タンパク質を発現するのに特に好適であり、それらのタンパク質には2次構造をほとんどまたは全く形成しないものも含まれる。

ある方法では、真核生物タンパク質をチオレドキシンへの融合体として発現させる。本明細書で使用する“チオレドキシン”とはジチオール／ジスルフィド活性部位（CGPC）を有する小型（約13kD）の電子キャリアータンパク質のファミリーをいうが、このタンパク質は主要な細胞タンパク質ジスルフィド還元酵素であり、リボヌクレオチド還元酵素、チオレドキシンペルオキシダーゼ（ペルオキシレドキシン）、およびメチオニンスルホキシド還元酵素のような酵素の電子ドナーとして作用する。細菌において、チオレドキシンの酸化還元電位はチオレドキシン還元酵素（チオレドキシンB、TrxB）によって保持されている。

本明細書で使用するチオレドキシンとは、Cys-X1-X2-Cys配列（活性部位）を含む短い配列モチーフを含有する小型タンパク質（約10-12kDa）のクラス、およびこのモチーフを含有する構造全体（チオレドキシン様フォールドと呼ばれるものに相当する）をいう（Martin, 1995）。このモチーフの末端のシステイン対は酸化されてジスルフィド結合を形成し、これはNADPH依存性酵素、チオレドキシン還元酵素で還元される。代表的なチオレドキシンはE. coli由来のチオレドキシンA（TrxA）であり、これは約109アミノ酸長であり、trxA遺伝子にコードされる。E. coli野生型チオレドキシンAのアミノ酸配列を以下に示す（活性部位CXXCを太字および下線で示す）。
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIAD
EYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALS
KGQLKEFLDANLA (SEQ ID NO: 1)

チオレドキシンの活性部位変異体を融合タンパク質中の野生型チオレドキシンの代わりに用いてもよい。従って、チオレドキシン活性部位モチーフCXXCを別の酸化還元酵素からの活性部位モチーフで置換することができる。例えば野生型チオレドキシンの代わりに野生型チオレドキシンAの活性部位変異体を、真核生物タンパク質を有する融合体コンストラクトに用いてもよい。これに関連して、チオレドキシンAの活性部位モチーフCGPCを、別の細菌酸化還元酵素、グルタレドキシンA（別名グルタレドキシン1）から取った活性部位モチーフCPYCで置換してもよい。この変異体をグルタレドキシン様チオレドキシンと称してもよい。別のチオレドキシン活性部位変異体はPDI様チオレドキシンであり、これは活性部位野生型モチーフCGPCを真核生物タンパク質ジスルフィド異性化酵素（PDI）から取った活性部位モチーフCGHCで置換して得られる。

完全長チオレドキシンAに加え、より短いセグメントを真核生物タンパク質との融合体として使用してもよい。

融合タンパク質に用いるチオレドキシンは、好ましくは発現に使用するのと同じ型のホスト由来である。例えば特定の細菌タンパク質を発現ホストとして使用する場合、好ましくは融合タンパク質にコードされるチオレドキシン部分は、その特定の細菌ホスト由来である。

本明細書の方法で発現することができる真核生物タンパク質には広範なジスルフィド架橋含有タンパク質が含まれ、それらには以下がある:単量体および多量体ディスインテグリン、ヘビ毒液毒素（PI、PII、またはPIIIクラス）、抗体フラグメント（scFv、Fab、またはF(ab’)2の形態）、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、腫瘍増殖因子、サソリ毒素、コノトキシン、ADAM（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）タンパク質の種々のドメイン、ワクチン、増殖因子、プラスミノーゲン活性化因子、および異なるクラスに属する上記タンパク質を組み合わせて融合タンパク質として発現したもの（例えばディスインテグリンに融合したケモカインなど）、並びに他の生物学的に活性な真核生物システインリッチタンパク質（例えばハララギン-C、GeneBankアクセッション番号 AAB30855；ディスインテグリン・チスタチン- GeneBankアクセッション番号 P83658；ヘビメタロプロテイナーゼフィブロラーゼ- GeneBankアクセッション番号 P83255；ヒトインターロイキン-2前駆体- GeneBankアクセッション番号 NP000577；ヒトインターフェロン-γ- GeneBankアクセッション番号 NP000610；ヒトトランスフォーミング成長因子、ベータ2- GeneBankアクセッション番号 NP003229；ヒト肝臓発現ケモカイン、CCL16- GeneBankアクセッション番号O15467；オメガ-コノトキシンCVID前駆体- GeneBankアクセッション番号 P58920；サソリクロロトキシン- GeneBankアクセッション番号 P45639;ヒトADAM 9前駆体- GeneBankアクセッション番号 Q 13443；ヒト血管内皮増殖因子A、VEGF-A - GeneBankアクセッション番号 P15692；ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子前駆体、t-PA - GeneBankアクセッション番号 P00750）など。

本明細書で使用する“ADAM”（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）とは、ディスインテグリンドメインおよびメタロプロテアーゼドメインを含むいくつかの異なるドメインを含有する膜貫通真核生物タンパク質のファミリーである。

本明細書で使用する“ディスインテグリン”とは、インテグリンの有効な可溶性リガンドであって、以下のような多くの過程の制御に関与するシステインリッチタンパク質のクラスをいう:多くの後生生物の発生の際の細胞-細胞および細胞-細胞外マトリクス接着、遊走および浸潤、細胞周期進行、分化、および細胞型特定化、並びに細胞死とアポトーシス。トリペプチドモチーフRGD（Arg-Gly-Asp）はほとんどの単量体ディスインテグリンで保存されており、フレキシブルループであるインテグリン結合性ループ（ジスルフィド結合によって安定化され、ペプチド鎖の本体から突出している）の先端に位置する。ヘビ毒液から精製されたディスインテグリンは全てフィブリノーゲン受容体、インテグリンαIIbβ3に結合し、その結合によってフィブリノーゲン依存性血小板凝集の阻害が起こる。ほとんどのディスインテグリンはインテグリンαvβ3（ビトロネクチン受容体）およびα5β1（フィブロネクチン受容体）にもRGD依存的に結合する。

ディスインテグリンタンパク質のほとんどのディスインテグリンドメインは、構造的に、インテグリン結合性ポケット（pocked）との深くて広域な接触が可能となるように設計されている。このポケットはα-サブユニットβ-プロペラおよびきわめて重要なMIDAS（金属イオン依存性接着部位）を提示するβ-サブユニットI様ドメインの間に創生され、MIDASはRGDモチーフ中の負の電荷を有するAspと協調して作用する。フレキシブルなインテグリン結合性ループの他に、ディスインテグリンは、インテグリン受容体中のMIDASに隣接する結合ポケットにはまり込むことが明らかにされている、他の独自の構造要素を示す。これらの更なる構造要素はディスインテグリンおよびその受容体間の相互作用の強度に関与している。そのような構造要素の一つはディスインテグリンのC-末端に位置する。

ディスインテグリンのC-末端テールによってディスインテグリンのインテグリン結合性ループが安定化され、それによってその真核生物インテグリンの結合ポケット（pocked）との相互作用が可能となる。このため、ディスインテグリンは環状RGDペプチドより優れたリガンドを生成し、治療薬として後者をしのぐはずである。新たな構造研究によって示唆されているところによれば、ディスインテグリンのインテグリン結合性ループはそのC-末端テールに近づいて接触し、機能性ユニットとして共にフォールディングされ、後者は更に接触することによって結合ポケット中のインテグリン結合性ループをサポートする（Fujii, Okudaら 2003）。インテグリンαvβ3結合ポケットへトリメスタチンがドッキングした後の推定されるトリメスタチン-受容体相互作用を図８に示す（Fujii, Okudaら 2003）。いくつかのディスインテグリンのC-末端テールは、β-インテグリンサブユニットの表面上に見られる更なる結合ポケット、AMIDAS（更なる金属イオン依存性接着部位；additional metal ion-dependent adhesion site）に配位しうる、1つ以上の重要な鍵となる負に帯電した残基を提示する。

本明細書で使用する“コントートロスタチン”（CN）とは、アメリカマムシ（Agkistrodon contortrix contortrix （サザンカパーヘッド：southern copperhead））毒液から単離されたディスインテグリンをいう（Trikha, Roteら, 1994）。CNは、プロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインをコードする1449bpのオープンリーディングフレームを含有する2027bpのマルチドメイン前駆体としてヘビ毒腺で生成される。前駆体は（おそらく自己触媒的に）タンパク分解的プロセシングを受けて成熟CNを生ずる。完全長のCNプレタンパク質は完全長mRNA（GenBank AF212305）のヌクレオチド配列85-1536にコードされ、CNのディスインテグリンドメインはmRNAの1339-1533に相当する。65アミノ酸を含むCNディスインテグリンドメインを以下に示す（RGD配列に下線を付す）。
DAPANPCCDAATCKLTTGSOCADGLCCDQCKFMKEGTVCRRARGDD
LDDYCNGISAGCPRNPFH (SEQ ID NO: 2)

成熟CNには、2つのジスルフィド架橋で結合された２つの65aaディスインテグリンドメインが含まれる。他のホモ二量体からの構造データ（Bilgrami, Tomarら 2004）に基づき、両65aaサブユニットの第1および第3のCys残基が対となり、逆平行で２つの鎖間ジスルフィド架橋を形成すると考えられる（一方のサブユニットの第1のCys残基が他方のサブユニットの第3のCys残基と対になる。逆も同様）。

CNはそのインテグリン結合性ループに古典的なトリペプチドRGDモチーフを示す。マムシ亜科動物（Crotalid）毒液由来の他の単量体ディスインテグリンと異なり、CNは無傷の分子では分子量（Mr）13,505、還元鎖では6,750のホモ二量体であることが質量分析で明らかになっている（Trikha, Roteら, 1994）。

チオレドキシン／真核生物タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換したホスト細胞を培養して、生物学的に活性な型の真核生物タンパク質を含む融合タンパク質を生成する。発現されたタンパク質は、慣例的な細胞溶解法によって可溶性の形態で細胞から直接回収してもよく、これから慣例的な精製法によって実質的に精製された型で単離することができる。

本明細書における使用では、ポリペプチド（またはタンパク質）に関する “精製した”という用語は、完全に純粋である必要はない。そうではなく、目的のポリペプチド（単数または複数）が、タンパク質が初めに生成された環境よりタンパク質が多い（質量ベースで）環境にあることをいう。精製されたポリペプチドは多くの方法によって得てもよいが、それらには例えばクロマトグラフィー、分離用電気泳動、遠心、沈殿、アフィニティー精製などがある。純度は好ましくは少なくとも10%である。1つ以上の“実質的に精製された”ポリペプチドは、環境中のタンパク質含量の少なくとも50%、より好ましくは環境中のタンパク質含量の少なくとも75%、そして最も好ましくは環境中のタンパク質含量の少なくとも95%である。タンパク質含量の測定は、Lowryらの方法（Lowry, Rosebroughら, 1951）に変更を加えたHartreeの報告（Hartree, 1972）のものを使用し、ウシ血清アルブミンをタンパク質標準物質として用いて行うことができる。

本明細書に記載する方法にしたがって、チオレドキシンを含有しない真核生物タンパク質を得るために、N-末端チオレドキシン配列および真核生物タンパク質配列を含有するC-末端配列の間に切断部位を配して設計してもよい。切断段階の前に融合タンパク質を精製してもよい。任意の数の周知の切断部位をこの目的で使用することができる。好適なプロテアーゼ切断部位は、アミノ酸配列ENLYFQG/S（３文字コード：
Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser）を含むTEVプロテアーゼ切断部位である。TEV部位がジスルフィド含有真核生物タンパク質のN-末端のすぐ上流に位置するように遺伝子操作してもよい。化学的切断部位をこの目的で用いてもよい。例えばDP（Asp-Pro）ジペプチド配列を融合タンパク質のTEV部位と同様の位置となるように遺伝子操作することができる。その後、ギ酸加水分解によってタンパク質のDP部位を切断することができる。

ある態様では、コンストラクトは真核生物タンパク質に融合したチオレドキシン、および“タグ”配列から成る。この配列は発現後の融合タンパク質の検出、融合タンパク質の精製、または真核生物タンパク質の精製を容易にする。タグ配列はHis-タグもしくはポリHis配列、または金属イオンを配位することができる任意のアミノ酸配列であってもよい。タグ配列はリガンド／受容体結合関係（例えば抗体およびペプチド抗原）の部分であってもよい。タグ配列は遺伝子操作により、融合タンパク質のN-末端、C-末端、または発現系および真核生物タンパク質の機能に関する制約によってその間の任意の位置に挿入してもよい。好ましくは、タグ配列は融合タンパク質中の任意の切断部位の上流にある。

本発明の方法によれば、融合タンパク質をコードする配列は、好適な調節配列（例えばプロモーター、必要によりエンハンサー、リプレッサーなど）の制御下で好適な発現ベクター内に含有される。微生物ホストにおける外来タンパク質の発現に好適な発現ベクターは当該分野で周知である。ある態様では、ベクターはpET32aである。別の態様では、ベクターはpET32a/pCDFDuet-1である。

別の態様では、細菌ホスト細胞を遺伝子操作し、通常はホストのペリプラズム空間に局在するジスルフィド異性化酵素を細胞質内で発現させてもよい。ある態様では、ジスルフィド異性化酵素はDsbCである。本明細書で使用する“ジスルフィド異性化酵素”とは、酸化によるタンパク質のフォールディングの際に不正確なジスルフィド結合を再配置させる原核生物タンパク質をいう。DsbCは膜貫通電子伝達体DsbDのペリプラズムN-末端ドメイン（DscD α-ドメイン）で特異的に活性化される。細菌ペリプラズムにおいて、タンパク質ジスルフィド結合の形成はDsbAおよびDsbCによって触媒される。DsbAは膜酵素DsbBによって完全に酸化された状態に保持される単量体であり、一方DsbCは異なる膜タンパク質、DsbDで還元された状態に保持される二量体である。DsbAおよびDsbCの触媒領域は構造的に相同なチオレドキシンモチーフドメインから成るが、DsbAはインビボにおいて酸化酵素としてのみ作用するのに対し、DsbCはジスルフィド還元反応および異性化を触媒し、また有意なシャペロン活性も示す。

DsbCの細胞質局在化は、シグナル配列を持たない成熟タンパク質を発現させることによって行うことができる。E. coli DsbCの配列を以下に示す（シグナル配列無し。下線および太字は活性部位CGYC）。
DDAAIQQTLAKMGπCSSDIQPAPVAGMKTVLTNSGVLYITDDGKHIIQ
GPMYDVSGTAPVNVTNKMLLKQLNALEKEMIVYKAPQEKHVITVFTD
ITCGYCHKLHEOMADYNALGITVRYLAFPROGLDSDAEKEMKAIWC
AKDKNKAFDDVMAGKSVAPASCDVDIADHYALGVQLGVSGTPAVVL SNGTLVPGYQPPKEMKEFXDEHQKMTSGK
(SEQ ID NO: 3)

更なる態様では、高い異性化酵素活性を有するジスルフィド異性化酵素の活性部位変異体を野生型配列の代わりに使用できる。例えば、異性化酵素活性をより高くするために、DsbC活性部位CGYCをCGFCまたはCTFCで置換することができる。シグナル配列の無いDsbC（または活性部位変異体）の発現を、trxBおよび／またはgorが欠失したホスト細胞に使用してもよい。trxBおよびgor変異の両方を有する二重変異体株FA113およびその誘導体をこの目的に使用できる。

別の態様では、ホスト細胞を遺伝子操作して、細菌チオール-ジスルフィド交換タンパク質DsbDのα-ドメイン（DsbD α-ドメイン）を細胞質で発現させることができる。本明細書で使用する“DsbD”とは、通常はペリプラズム膜内部に局在する膜貫通E. coli酵素である。α-ドメインはペリプラズム空間に面しており、そこでジスルフィド交換触媒（酸化還元触媒）として作用する。DscDの細胞質局在化は、シグナル配列を持たないドメインを発現させることによって行うことができる。細胞質でのDbsD α-ドメイン発現を、trxBおよび／またはgorが欠失し、DsbC（シグナル配列のない野生型酵素または活性部位変異体）を発現しうるホスト細胞と組み合わせてもよい。DsbD α-ドメインは成熟DsbDの最初の132アミノ酸に相当する、19aaの切断可能なシグナル配列が除去されてできる。リーダー配列なしで、触媒部位に下線を施したDsbD α-ドメインの配列を以下に示す。
GLFDAPGRSQFVPADQAFAFDFQQNQHDLNLTWQIKDGYYLYRKQIR
ITPEHAKIADVQLPQGVWHEDEFYGKSEIYRDRLTLPVTINQASAGATL
TVTYOGCADAGFCYPPETKTVPLSEVVANNEASOPV (SEQ ID NO: 4)

リーダー配列を持たないDsbD α-ドメインをΔssDsbD α-ドメインと記載する。ホスト細胞を改変して、DsbCおよびDsbD α-ドメインを細胞質で発現させてもよい。

別の態様では、ホスト細胞を改変してチオレドキシン還元酵素および／またはグルタチオン還元酵素活性を欠失させる。チオレドキシン還元酵素（チオレドキシンB、TrxB）はサイトゾルにおける2つの主要な還元経路のうちの第1のものを制御する重要なE. coli酵素である。チオレドキシン還元酵素の欠失は、ホストの細胞質において別のプラスミドからtrxB遺伝子のトランスドミナント・ネガティブ変異体産物を発現させることによって行うことができる。グルタチオン還元酵素（Gor）は別の重要な酵素であり、サイトゾルにおける第2の主要な還元経路を制御する。グルタチオン還元酵素の欠失は、ホストの細胞質において同じ、または別のプラスミドから、gor遺伝子のトランスドミナント・ネガティブ変異体産物を発現させることによって行うことができる。これらの変異を併せて、または単独で使用してもよく、また本明細書に記載する他のホスト細胞変異体と組み合わせてもよい。

更なる態様では、ホスト細胞は1つ以上のプロテアーゼを欠失している。それらのプロテアーゼの代表的なものにはompTおよびlon遺伝子にコードされるものがある。例えば、E. coliホスト細胞AD494(DE3)pLysSはtrxB遺伝子並びにompTおよびlon遺伝子産物を欠失する。E. coli株Origami B(DE3)pLysSおよびRosetta-gami B(DE3)pLysSはtrxB、gor、ompT、およびlon遺伝子産物を欠失する。これらの変異を本明細書に記載する任意の他のホスト細胞変異体と組み合わせて使用してもよい。従って、trxBおよび／またはgorを欠失するホスト細胞、並びにDsbC(野生型タンパク質または活性部位変異体)および／またはDscD α-ドメインを細胞質で発現するように改変したホスト細胞を、ompTおよびlon変異体と組み合わせて使用してもよい。

以下に本発明の方法を更に説明する。

Ａ．細菌における酸化によるタンパク質のフォールディング
合成の際、新生ポリペプチド鎖が生体活性をもつためには、独自の安定化された３次元構造にフォールディングされなければならない。活性なコンフォーマーを生成する過程では、タンパク質は分子シャペロンの助けによって成熟前の会合および不溶性凝集体の形成から保護されている。更に、フォールディング触媒（フォールダーゼ；foldase）はフォールディング経路の律速段階の速度を増加する作用をする。新生タンパク質におけるシステイン残基間の正確なジスルフィド結合の形成は律速段階である。ジスルフィド結合の形成を速くするために必要な最低限の酵素装置（enzymatic equipment）には酸化酵素および異性化酵素活性がある（ColletおよびBardwell, 2002）。（原核生物から真核生物まで）全ての細胞系において、細胞外領域へ移出することになっているタンパク質は、多くの場合、複雑なフォールディング・パターンを有する複数のジスルフィド結合を示す。複数のジスルフィド架橋を有することによってこれらの分泌タンパク質の２次および３次構造が安定化され、細胞内コンパートメントの外のより過酷な微小環境での生存率が高くなる。

細胞は、複数のジスルフィド結合タンパク質の正確なフォールディングが保証されるよう、独自の酵素装置を発達させてきたが、これは不正確なジスルフィド結合の形成によって不活性および不溶性産物が生成される可能性があるためである（WalkerおよびGilbert, 1994）。真核生物では、ジスルフィド結合の形成および異性化はタンパク質ジスルフィド異性化酵素（PDI）および関連タンパク質によって触媒され、これは小胞体内で起こる。10年以上前に、原核生物のペリプラズム空間におけるジスルフィド結合の形成も触媒されたプロセスであることが発見された（Bardwell, McGovernら, 1991）。細菌のような他の生物の場合と同様に、システインリッチであってそのフォールディングが正確なジスルフィド架橋の形成に依存しているタンパク質は、主として細胞外に分泌されることになるタンパク質である。これらのタンパク質は通常、細胞の生存に重要であり、運動器官、呼吸鎖、または外毒素もしくは抗生物質抵抗性酵素のような毒素因子の主要成分に関与している。正確にフォールディングされ、生体活性を得るために、これらのタンパク質はペリプラズム空間を通過し、ペリプラズム酸化還元酵素によってそのフォールディングを補助される必要がある。ペリプラズム空間における酸化還元酵素の酵素装置は、機能性ユニットとして作用する２つの経路、すなわち酸化および異性化経路から成る。両経路について以下に簡潔に記載する。

Ｂ． E. coliペリプラズムにおける酸化経路
酸化経路は強力な酸化酵素DsbA（既知の最も酸化力の強いタンパク質）およびそのモジュレーター、DsbB（DsbAを好気条件下で呼吸鎖、または嫌気条件下で嫌気性電子受容体と連関させる）から成る。DsbAはチオレドキシン・フォールディング部分を有する小型のペリプラズムタンパク質（21kDa）であり、その活性部位にCXXCモチーフを示すが（DsbAではCPHC）、これはいくつかの他の酸化還元酵素、例えば全ての細胞質チオレドキシン、DsbC、DsbDのγ-ドメイン、および真核生物タンパク質ジスルフィド異性化酵素（PDI）にも共通している（RainaおよびMissiakas, 1997）。DsbAの高い酸化還元電位（oxidizing redox potential）（-120mV）はこのタンパク質の酸化剤としての役割と一致する。酸化されたDsbAは非常に不安定で、フォールディングされていないタンパク質と速やかに反応してペリプラズム空間に入る（Zapun, Bardwellら, 1993）。

DsbAはその活性部位ジスルフィド架橋を真核生物タンパク質に運搬した後、還元される。触媒作用をするために、DsbAは再荷電される必要がある。DsbAの酸化還元に関与するタンパク質はDsbBと呼ばれる膜内に埋め込まれたタンパク質であり、チオレドキシン様ドメインを有さないと考えられる唯一のDsbタンパク質である（ColletおよびBardwell, 2002）。DsbBは21ｋDaの内膜タンパク質であり、膜を４回貫通している。DsbBは２対の本質的なシステイン残基を有し、１対はその２つのペリプラズムドメインのそれぞれに位置している。第１の対だけがCXXCモチーフを有する。DsbBの３次元構造はまだ解明されていないが、DsbBはチオレドキシン様フォールディングを有するドメインを含有しないと考えられる。酸素分子および電子伝達系がDsbBの再酸化に関与しうるという可能性は、DsbBが最初に単離された時に立てられた仮定であった（Bardwell, Leeら, 1993）。証拠の蓄積と精製された成分を用いたインビトロでの細菌ジスルフィド結合触媒系の再構築によって、電子伝達系およびジスルフィド結合形成間の関係が実証された（Bader, Museら, 1999）。DsbBが内膜のキノン系と結合し、好気条件下でDsbBがその電子を酸化型ユビキノンに運搬し、その後ユビキノンがシトクローム酸化酵素に電子を供与し、これが酸素を還元することが証明されている。嫌気条件下ではDsbBはその電子をメナキノン、その後嫌気性電子受容体へ運搬する。ペリプラズム空間およびDsbAからキノン電子伝達系への還元力の連続的な流れがあり、これはDsbAを再生する機能を果たす、膜に埋め込まれたDsbBによって可能となる。E. coliペリプラズムにおける酸化経路を図２に示す（ColletおよびBardwell, 2002より）。

Ｃ． E. coliペリプラズムにおける異性化経路
２個以上のシステイン残基を含有するタンパク質では、組換え発現の際に不正確なジスルフィド結合が起こる可能性がある。これはDsbA（天然のコンフォメーションにはほとんど関係なく、ペリプラズム空間において非常に速く（数十秒）システインにマッチする傾向がある）に特に当てはまる。DsbAがタンパク質中に非野生型ジスルフィドを形成することができることが、インビトロにおけるRNase A再フォールディング実験で証明された。DsbAはDsbBおよびキノンの存在下でRNase Aを完全に酸化するが、４つのジスルフィド結合を有する酸化型RNase Aは酸化せず、グルタチオン酸化還元バッファーを添加しない限り活性を示さない（Bader, Xieら, 2000）。

従って、ペリプラズム空間における効率の高い酸化のための装置は、更なる２つのDsbタンパク質、すなわちDsbCおよびそのモジュレーター、DsbDから成る強力な異性化系と一致する。当初、DsbCは酸化酵素として作用することによってジスルフィド結合の形成を触媒する能力を有すると思われたが（Missiakas, Georgopoulosら, 1994）、現在はDsbCはインビボにおいて主にジスルフィド異性化酵素およびシャペロンとして作用すると考えられている。DsbC変異体はDsbAおよびDsbB変異体と同様、ジスルフィド結合の形成能力が欠如している。DsbC変異は特に複数のジスルフィド結合を示すタンパク質のフォールディングに影響を与える：ウロキナーゼ（12のジスルフィド結合）は非常に誤ったフォールディングをされるのに対し、アルカリホスファターゼ（２つのジスルフィド結合）の生成はわずかしか影響を受けない（Rietsch, Belinら, 1996）。可能性のある不正確なジスルフィドの数はタンパク質中のシステイン残基の数と共に指数関数的に増加するので、有効な異性化酵素の存在は複数のジスルフィド結合を有するタンパク質の正確なフォールディングに不可欠である。

DsbCは２つの同一の23kDaサブユニットから成るV字型ホモ二量体である。各サブユニットは４つのシステイン残基を有する。活性部位はCys-98-Cys-101対を含有し（DsbCにおけるCXXCモチーフはCGYC）、これがDsbCの酸化還元活性に直接関与する（Zapun, Missiakasら, 1995）。DsbCの結晶構造は解明されており(McCarthy, Haebelら, 2000)、V字型ホモ二量体のそれぞれのアームはDsbC単量体であり、これはヒンジを有する3回転リンカーαへリックスで連結された2つの別個のドメインから成ることが明らかになっている。各単量体からのN-末端ドメイン（残基1-61）が結合してV字型ホモ二量体の基部に二量体接合部分を形成する。C-末端触媒ドメイン(残基78-216)は予想されるようにチオレドキシンのフォールディングを有する。2つの活性部位、CXXCモチーフはV字型ホモ二量体の内部で互いに向き合っている。このV字型裂隙の表面は主に疎水性の非荷電残基から成り、これが真核生物タンパク質の非共有結合に関与してDsbCシャペロン活性を与えていることを示唆している。DsbCは、酸化条件下で形成された、埋め込まれた非野生型ジスルフィド結合の再配列に特に有効である（Maskos, Huber-Wunderlichraら, 2003）。DsbCは以下のように作用すると考えられている：Cys-98が基質タンパク質中の誤ったジスルフィド架橋を攻撃し、DsbCとミスフォールドされたタンパク質の間で混合ジスルフィドが形成される。その後、この混合ジスルフィドは、ミスフォールドされたタンパク質の別のシステインの攻撃によって（または多くの場合はDsbCのCys-101による攻撃によって）、基質および還元型DsbCで、より安定なジスルフィドを形成する。この場合、DsbCは酸化され、再利用されるためには還元される必要がある（ColletおよびBardwell, 2002）。異性化酵素として機能するためには、DsbCはペリプラズムの非常に酸化的な環境内で還元状態を保持しなければならない。DsbCは、その触媒サイクルの終末で再還元されなければ酸化酵素として機能し、その異性化酵素活性を失う傾向がある。DsbCを還元状態に保つ酵素はDsbDと呼ばれる内膜に埋め込まれたタンパク質である。

チオール／ジスルフィド交換タンパク質、DsbDの分子量は59kDaであり、Dsbファミリーの中で最も大型のタンパク質である。トポロジカルな研究で明らかになったところによれば、DsbDは3つの異なるドメイン：特定の免疫グロブリン・フォールディングを有するN-末端ペリプラズムドメイン(α-ドメイン)（Haebel, Goldstoneら, 2002）、それに続く8つの膜貫通セグメントを有する疎水性コア(β-ドメイン)、および第2のペリプラズムドメイン(γ-ドメイン)を有し、チオレドキシン様フォールディングを有すると推測される（KatzenおよびBeckwith, 2000）。DbsDの各ドメインは2つの保存されたシステイン残基を有する。部位特異的変異導入実験で明らかになったところによると、1個のシステインからアラニンへの活性部位変異体によって酸化型DsbCの蓄積が起こり、DsbD null変異体と同様、活性ウロキナーゼを生成できなくなる（Gordon, Pageら, 2000）。DsbDの作用機能のモデルが最近提案されたが、これには細胞質チオレドキシンからDsbDのβ-ドメインへ、更に膜を通過してγ-およびα-ドメインへ、そして最終的にはDsbCへの電子の連続的な受け渡しが含まれている。この作用機構を図２に示す。このモデルはDsbCおよびDsbDのα-ドメイン間に観察されるジスルフィド架橋に基づいている（KatzenおよびBeckwith, 2000；KatzenおよびBeckwith, 2003）。更に、精製されたα-ドメインはインビトロにおいてDsbCと相互作用し、これを還元する能力があることが近年明らかになった（Goldstone, Haebelら, 2001）。DsbCの結晶構造、および解明されたDsbD αがDsbC裂隙にドッキングした後のDsbC-DscDα相互作用を図3に示す（Haebel, Goldstoneら, 2002）。

Ｄ．細菌のペリプラズム空間-考察
上記の記述によれば、ペリプラズム空間の酸化／異性化酵素装置は2つの主な特徴を持つ。第1に、これは2つのアームを持つ電気回路のように設計されており、回路が閉じるためには2つのアームがシステインリッチなフォールディングタンパク質と接触しなければならず、これはフォールダーゼによって補助される。回路を閉じることによってフォールディングタンパク質は、細胞質（NADPH）から両酵素アームを通じて膜内の電子伝達系（好気条件下では呼吸鎖、酸素が存在しない場合は嫌気性電子受容体）への還元力の一方向の連続的な流れ、および逆方向へのジスルフィド結合の持続的な運搬を確実にする。このことは各経路の主な酵素、DsbA酸化酵素およびDsbC異性化酵素がどのように持続的に再生され、絶え間なくタンパク質のフォールディングを補助しているかを説明するものである。第2に、両経路は同じ酸化的コンパートメントに共存するが、動態学的に分離を保っている。DsbAはジスルフィド・ドナーとして機能するために持続的に酸化される必要があり、DsbCは異性化酵素として作用するために還元され続ける必要がある。これは反対の目的を持つ２つの系が同じペリプラズム空間に共存できることを意味している。DsbBはDsbAを酸化するより少なくとも500倍遅い速度でDsbCを再酸化し、これはDsbBがこれら2つのタンパク質を識別できることを示唆している（Bader, Xieら, 2000）。この挙動の理由は、DsbBとの相互作用から二量体を保護し、その活性部位をDsbB酸化から保護し続けるDsbCの二量体形成面にある。突然変異させたDsbCの単量体変異体はDsbBと相互作用してdsbA^-表現型をレスキューし、DsbA酸化酵素の代わりに機能することが証明されている。上記のようなE. coliペリプラズムにおけるジスルフィド結合形成のモデルを図4に示す（RainaおよびMissiakas, 1997より）。

E. coliは真核生物の小胞体を思わせるような、ペリプラズム空間における複数のシステインリッチタンパク質の正確なフォールディングを触媒するための完全な酵素装置を有する。複数のジスルフィド結合を有する複雑な真核生物タンパク質を、ペリプラズム空間を通じて生物学的に活性なコンフォーマーとして発現できることが証明された。更に、DsbAおよび／またはDsbCが共過剰発現されると、収量が有意に向上する（BeckerおよびHsiung, 1986；Kurokawa, Yanagiら, 2000；Kurokawa, Yanagiら, 2001）。

ペリプラズム空間における組換えタンパク質の生成に関する２つの主要な問題がある。主な問題はペリプラズム空間が大量生成部位としての機能を果たすようには設計されていないことである。この経路に従う複数のジスルフィド結合を有する細菌タンパク質は、少量でも活性な外毒素またはβ-ラクタマーゼのような分泌タンパク質、または細胞外空間で構築される運動器官の主要成分である。第2の問題は、タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送が非常に複雑で完全に理解されていない過程であり、シグナルペプチドが存在することによって内膜を通過する効率的なタンパク質の転位が必ずしも保証されるわけではないという事実に起因する（Makrides, 1996）。例えば、Hsiungらがその研究（BeckerおよびHsiung, 1986）において観察したところによれば、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）誘導後、シグナル配列を含むヒト成長ホルモン前駆体の細胞内蓄積量は増加したが、転位したヒト成長ホルモンの量は増加しなかった。

Ｅ． E. coli細胞質におけるジスルフィド結合の形成とチオレドキシン
細菌細胞質タンパク質は一般にジスルフィド結合構造を含有しないが、ある種の細胞質酵素は触媒サイクルの一部としてそれらの結合を形成する。後者の酵素におけるジスルフィド結合は2つの系：チオレドキシン経路およびグルタチオン／グルタレドキシン経路によってE. coli細胞質中で還元される（Stewart, Aslundら, 1998）。生理学的条件下で、これら２つの還元経路は細胞質を、タンパク質における安定なジスルフィド結合の形成に非常に不利である還元型状態に保持する。主要酵素としてチオレドキシン還元酵素（TrxB遺伝子にコードされる）およびグルタチオン還元酵素（gor遺伝子にコードされる）を有するE. coliにおける主な還元経路を図5に示す。しかしながら、チオレドキシンおよびグルタチオンの一方または両方の還元に欠陥がある変異体（trxBまたはtrxB/gor変異体）では、細胞質中に酵素的に活性なヒト・アルカリホスファターゼのような酸化型ジスルフィド結合タンパク質が蓄積される（Stewart, Aslundら, 1998；Bessette, Aslundら, 1999）。これらの変異体におけるジスルフィド結合の形成は細胞質チオレドキシンの存在に依存しており、これは反転の役割に担い、ジスルフィド架橋の形成を能動的に補助し、それによってこの場合は酸化酵素として機能する。二重変異体は外因性還元剤（例えばDTT）が存在しなければほとんど増殖せず、高頻度で遺伝子外抑制因子を蓄積する：すなわちDTT依存性である急速増殖コロニー。この抑制因子変異はahpC遺伝子中にマッピングされ、これは野生型のペルオキシレドキシンをコードする。FA113（急速増殖抑制因子の一つ）に由来する変異によって、この酵素はジスルフィド還元酵素として作用するようになる（Jurado, Ritzら, 2002）。リッチな、または既定の培養液中で、E. coli FA113はE. coli DHB4とほとんど同様に増殖する（倍加時間約35分）。クロラムフェニコール、カナマイシン、またはテトラサイクリンのような抗生物質を選択に用いると、FA113の増殖速度が遅くなることが報告されている（倍加時間約60分）（Jurado, Ritzら, 2002）。

Ｆ．細胞質における外来タンパク質のジスルフィド結合形成を補助するための原核生物系
FA113二重変異体を更に操作して、細胞質におけるジスルフィドリッチなタンパク質の正確なフォールディングをサポートする能力をより効果的にするために、ペリプラズム酵素装置の活性を細胞質内に導入し、このコンパートメントでの外来組換えタンパク質のフォールディングを促進する。この方法に関する従前の報告は、抗体フラグメント（scFvまたはFabフォーマットで）のような外来タンパク質または他の真核生物システインリッチタンパク質に注目していた（Levy, Weissら, 2001；Jurado, Ritzら, 2002；Venturi, Seifertら, 2002；Maskos, Huber-Wunderlichら, 2003）。

既に報告されている改変型発現ホストは、シグナル配列のない酸化酵素（ΔssDsbAまたは活性部位変異体）またはシグナル配列のない異性化酵素（通常ΔssDsbC）のいずれかを含み、これは二重変異体trxB^-/gor^-株の細胞質において、ペリプラズム空間から取り込まれ、システインリッチ組換えタンパク質と同時に共過剰発現される（Levy, Weissら, 2001；Jurado, Ritzら, 2002）。この型の系はE. coliにおいてFab抗体フラグメントを生成するために使用されてきたものであり、野生型株に比較して正しくフォールディングされた抗体の収量が増加することが明らかになっている（ナノグラムから約1mg/Lの組換えタンパク質まで）。しかしながら、一歩前進とは見なされるものの、それらの系では期待される収量を生成することはできない。この方法の一つの問題は、同時に共過剰発現される酸化酵素／異性化酵素の組み合わせでは組換えタンパク質においてジスルフィド架橋形成が効率的に触媒されないことであり、これはそれらの系がそのフォールダーゼを再生するペリプラズム空間の並外れた能力を欠いているからである。ペリプラズム空間原理によれば、ペリプラズム空間から導入された酸化酵素および異性化酵素は、機能するために持続的に再荷電される必要がある。この理由により、細胞質に導入された酸化酵素／異性化酵素装置と橋わたしをするために第3の成分が必要となる。この成分は、持続的な再荷電、および一方向の還元力の流れと、逆方向のジスルフィド架橋の伝達の保持によって、FA113で共過剰発現した異性化酵素と酸化酵素をリンクさせるものであるべきである。

本発明の方法によれば、組換え系は、系を再構成するよう人工的に相互作用を強いられる分子ではなく、自然に相互作用する、両コンパートメント（ペリプラズムおよび細胞質）由来の主要な酵素を用いる。天然の組み合わせとして、DsbA、DsbB、DsbC、およびDsbDがあるが、これら全てを細胞質に取り込むのは困難である。細胞質におけるDsbA、DsbB、DsbC、およびDsbDの同時共過剰発現が報告されている。しかしながら、それらの発現からの純収量は顕著なものではない（DsbA/DsbB/DsbC/DsbD発現プラスミド-CA2281035）。これは、膜に埋め込まれた分子として生理学的に機能するDsbBおよびDsbDが、細菌細胞質において可溶性タンパク質として発現された場合には、正しく機能しない可能性があるという事実によって説明しうる。第2に、上記のようにDsbBは電子伝達系と連結する。細胞質におけるDsbBの発現によって、タンパク質はDsbAを再荷電することができず、発現系が損なわれる可能性がある。他方、可溶型DsbDが細胞質中でも機能し、その上流パートナーであるチオレドキシンおよび下流パートナーであるDsbCと反応することができると仮定すれば、DsbC-DsbDの連携は影響を受けないかもしれない。細胞質においてDsbC-DsbDの連携が更に自己再生的になるように設計した系では、第3の成分である酸化酵素パートナーも必要である。DsbDはチオレドキシンAおよびDsbCのいずれとも自然に相互作用するので、DsbC-DsbD酸化酵素パートナーとして細胞質チオレドキシンA(チオレドキシン１)を使用するという考えは魅力的である。

DsbD分子は疎水性ドメインを提示する大型膜貫通タンパク質である。そのサイズおよび膜を貫通する疎水性β-ドメインのために、細胞質におけるDsbD α-ドメインの発現は完全長のDsbD分子の発現よりも好ましい。完全長のDsbDタンパク質は他の3つのタンパク質と同じ系で効率的に共発現するには大きすぎる。DsbDのα-ドメインはDsbDから19aaの切断可能なシグナル配列が除去されてできる、アミノ酸1-131に相当する。DsbD α-ドメインはインビトロにおいて、そのままでDsbCと効率的に相互作用し、それを還元状態に保持し、その後その異性化酵素パートナーを再荷電することができる（Goldstone, Haebelら, 2001；Goulding, Sawayaら, 2002）。化学量論的量の還元型DsbD α-ドメインおよび酸化型DsbCを混合すると急速な反応が起こり、DsbCは速やかに還元される。DsbD α-ドメインがDsbDの天然のパートナーであるチオレドキシンAと相互作用するかどうかはColletら（Collet, Riemerら, 2002）によって示唆されており、彼らはインビトロにおいて再構成された細菌のペリプラズムジスルフィド異性化系について報告している。まず、触媒量のDsbD α-ドメインのみの存在下では、3つのドメイン全てが共に存在する場合に測定されるのに匹敵する速度でDsbCの還元が行われた。これは、3つのドメイン全ての存在下で観察される活性がα-ドメインのみの寄与によってしか説明しえないことを示している。第2に、化学量論的量のチオレドキシンとDsbDα-ドメインを混合することによって、インビトロで直接、チオレドキシンが効率的にα-ドメインを還元するという、驚くべき発見がなされた。チオレドキシンを酸化型DsbD γ-ドメインまたは酸化型DsbCと共にインキュベートした場合は、非常に低い活性しか観察されなかった。DsbCは酸化系（ペリプラズムDsbA）から触媒的に分離しており、細胞質チオレドキシンと相互作用しないことが知られているので、この最後の知見は重大なものである。

本明細書に開示するように、E. coli trxB^-/gor^-二重変異体株（FA113）の細胞質内で新規の強力な酸化還元系を再現することができる。これは酸化酵素（チオレドキシンA）を異性化酵素（ΔssDsbC；成熟DsbCからシグナル配列を除いたもの）と組み合わせ、更に、DsbD α-ドメイン（ΔssDsbD α）（フォールダーゼ酵素装置を再生する能力を有する、欠失した分子要素である）を利用してそれらを同じコンパートメント内でリンクさせることによる。この新規のインビボ系においては、組換えジスルフィド含有真核生物タンパク質が回路を閉じ、DsbD α-ドメインは、酸化と異性化経路の間を埋めて、還元力がチオレドキシンからDsbCへ一方向に流れ、ジスルフィド架橋の持続的な伝達が逆方向で行われることを確実にするための重大な分子である。

チオレドキシンおよびDsbCの活性部位を変異させてこれらの酵素の活性を増加しようという試みが報告されている（Mossner, Huber-Wunderlichら, 1998；Bessette, Aslundら, 1999；Bessette, Qiuら, 2001）。野生型チオレドキシンは酸化還元電位が非常に低い（-270mV）活性部位を有するが、この値は細菌における還元酵素としてのその主要な機能と十分一致している。報告によれば、野生型チオレドキシンの活性部位モチーフCGPCを細菌グルタレドキシンAの活性部位モチーフCPYCと置換することによってチオレドキシンAの酸化酵素活性を増加することができる。そのような変更によって，チオレドキシンの活性部位酸化還元電位が-270mV（野生型）から-195mV（グルタレドキシン型）に変化し、変異グルタレドキシン型チオレドキシンはより良い酸化酵素となる。グルタレドキシン型変異体は、このチオレドキシン変異体およびジスルフィドリッチタンパク質を同じ系で共過剰発現させると、より高い収量のジスルフィドリッチタンパク質を生成することができた（Bessette, Aslundら, 1999）。

別の目的のチオレドキシン変異体は、PDI様チオレドキシン、すなわち真核生物タンパク質ジスルフィド異性化酵素活性部位モチーフを含有するチオレドキシンである。既に明らかにされているところによれば、野生型チオレドキシン活性部位モチーフを真核生物タンパク質ジスルフィド異性化酵素配列CGHCで置換することによって活性部位酸化還元電位が-270mVから約-229mVに増加する。酸化還元電位の変化によってPDI型チオレドキシンはFA113系におけるより有効な酵素、すなわち、野生型チオレドキシンより優れた酸化酵素というだけでなく、グルタレドキシン型チオレドキシン変異体より優れた還元酵素となる。

DsbCの活性部位変異体についても報告されている。DsbC活性部位CGYCを、異性化酵素活性を増加させることが明らかになっているCGFCまたはCTFCで置換した。これらの活性部位DsbC変異体を共過剰発現させると、FA113株において生成される多ジスルフィド結合タンパク質の収量が増加することが報告されている（Bessette, Qiuら, 2001）。

OrigamiおよびRosetta-gami株はtrxBおよびgor遺伝子産物における二重変異体であり、これによってE. coli細胞質における2つの主な酵素的還元経路は機能不能となる。これによって細胞質微小環境はより酸化的となり、最終的にこのコンパートメントはジスルフィド結合形成のためにより適した場所となる。

OrigamiおよびRosetta-gami株はE. coli野生型株で得られるものに近い増殖速度およびバイオマス収量を有するので、組換えCNの大量生成および精製に魅力的である。

E. coliにおける組換えCNの生成のために、Origami B(DE3)pLysS発現ホストから成る系が、強力なT7 lacプロモーターを有するpET32aベクター（Novagen）と併用されている。Origami Bホスト株は、BL21のlacZY変異体由来であること以外は、元のOrigami株（FA113）と同じtrxB/gor変異を有する。従ってOrigami B株はBL21（ompTおよびlonプロテアーゼ欠損）、Tuner、およびOrigamiホストの好ましい特性を1つの株に併せ持つ。

チオレドキシン還元酵素（trxB）およびグルタチオン還元酵素（gor）遺伝子の両方の変異によって、細胞質でのジスルフィド結合形成が大幅に促進されることが発見されている。Origami（DE3）での発現は，別なホストでの発現と比較して、全体の発現レベルは同程度であるにも関わらず、10倍活性の高いタンパク質を産生する（Prinz, Aslundら, 1997）。

IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）誘導因子の非存在下で、DE3溶原菌のlacUV5プロモーターから検出可能なレベルのT7 RNAポリメラーゼが発現され、組換えタンパク質の基底発現が起こった。E. coliにおけるそれらの低レベルの組換えタンパク質発現は細胞の正常な増殖過程を妨害し、従って細菌にとって“毒性”を示しうる。基底発現を制御する一つの方法はT7 lacプロモーターを含むベクターを使用することである（Studier, Rosenbergら, 1990；DubendorffおよびStudier, 1991）。これらのプラスミドはT7プロモーターのすぐ下流にlacオペレーター配列を含有する。また天然のプロモーターおよびlacリプレッサーのコード配列（lacI）を有し、これらはT7lacとlacIが別々の方向となるように配されている。ベクター内のlacリプレッサーはホスト染色体においてlacUV5プロモーターレベルで作用し、ホストのポリメラーゼによるT7RNAポリメラーゼ遺伝子の転写を抑制すると共に、ベクター内のT7lacプロモーターでも作用して、生成されたT7RNAポリメラーゼによる真核生物遺伝子の転写も抑制する。

真核生物タンパク質の基底発現の低下は、少量のT7リゾチーム（天然のT7RNAポリメラーゼ阻害剤）を発現する適合性クロラムフェニコール耐性プラスミドを含むホスト株での発現によって行ってもよい（Studier, 1991）。pLysSホストは増殖速度にほとんど提供を与えず、全体としてpLysSは毒素インサートを有するプラスミドに対するλDE3溶原菌の耐性を増加させる。すなわち、不安定なプラスミドが安定化され、他の方法では構築されないプラスミドの保持および発現が可能となる。pLysSの存在によって細胞抽出物の調製が容易になるという更なる利点もあるが、これは凍結および解凍に対する細胞の耐性がより低く、容易に溶菌されるためである。

Tuner株および誘導体（Origami BおよびRosetta-gami B）はlacY1が欠失したBL21変異体であり、タンパク質の発現レベルを調整できない。Lac透過酵素（lacY1）変異によってIPTG（ラクトース誘導体）が細胞内に均一に侵入できるようになり、濃度依存性の均質なレベルの誘導を行うことができる。IPTGの濃度を調整することによって、発現を非常に低いレベルから高いレベルまで調整することができる；しかしながら、真核生物タンパク質発現レベルは、通常使用されるより有意に低いレベルのIPTGで最適となる。この方法では、IPTGに対するコストが節減される。

OrigamiおよびRosetta-gami株の重要な特徴は、外来組換えタンパク質のジスルフィド結合形成を触媒するのに十分な酸化力を提供する能力があることである。しかしながら、それらの系は異性化能を有さない。組換えタンパク質のジスルフィド結合形成は、Origami/Rosetta-gami細胞質では野生型E. coliに比較して速い速度で行われるが、正確なマッチングを保証し、野生型コンフォーマーと同じジスルフィドパターンを持つ産物を生成するための酵素装置は存在しない。

（ジスルフィド結合の形成ではなく）ジスルフィド結合の異性化は、野生型E. coli細胞のペリプラズムにおける複数のジスルフィド結合を有するタンパク質のフォールディングに制限を与える。Origami細胞は、ジスルフィド架橋の正確なペアリングを保証するか、または誤って形成されたものを正しく再配置する酵素装置を細胞質中に保有しない。従って、ホストタンパク質を更に遺伝子操作して、細胞質中の異性化活性レベルを増加させる必要があり得る。

E. coli Origami株(FA113)を改変してDsbC異性化酵素（そのシグナル配列を欠失したDsbC；“ΔssDsbC”）およびDsbD α-ドメイン（シグナル配列を欠失したDsbD；“ΔssDsbDα”）を細胞質中で過剰発現させてもよく、後者はDsbC異性化酵素の活性部位のシステインを還元する機能を果たす。いずれの理論にも拘束されることを望まないが、DsbD α-ドメインは細胞質における新規の酸化（TrxA）および異性化（DsbC）経路の間のギャップを埋め、チオレドキシンからDsbCへの一方向の還元力の流れ、および逆方向へのジスルフィド架橋の持続的な伝達を保持する重要な分子であると考えられる。これらの2つの特徴を組み合わせて、自己再生能力のある系を創成する。

ジスルフィド架橋を含有するタンパク質の高発現は、変異体trxAおよびdsbC遺伝子産物を用いて行ってもよい。高い酸化酵素および異性化酵素活性を有する活性部位変異体が報告されている（Mossner, Huber- Wunderlichら. 1998；Bessette, Aslundら. 1999；Bessette, Qiuら. 2001）。グルタレドキシンA活性部位モチーフCPYCおよび真核生物PDI活性部位モチーフCGHCを有する活性部位変異体チオレドキシンが好ましい。CGFCおよびCTFC活性部位モチーフを有する活性部位変異体DsbC異性化酵素も好ましい。

使用法
本明細書に記載するように生成した真核生物タンパク質を、野生型タンパク質を使用しうる種々の疾病および障害の治療に使用することができる。それらのタンパク質を医薬的に許容しうるキャリアーと共に製剤または薬物として投与できる。従って真核生物タンパク質を薬物または医薬組成物の製造に使用してもよい。

本明細書に記載するホモ二量体および単量体ディスインテグリン（例えばVN）を、野生型ホモ二量体ディスインテグリンを使用できる用途のいずれに使用してもよい。それらの使用については米国特許出願第2003/0186884号（2003年10月2日公開）に記載されている。

更に、ホモ二量体および単量体ディスインテグリンを使用して、インテグリンを発現する腫瘍細胞の接着、運動性、および侵襲性を調節してもよい。医薬的に許容される組成物として調製する場合、それらのタンパク質を使用して、αvβ3またはαvβ5インテグリンへのリガンド結合を伴う疾病過程の阻害または破壊によって患者を治療できる。

本明細書に記載するホモ二量体および単量体ディスインテグリン（例えばVN）を、αvβ3インテグリン発現細胞の運動性を低下させる方法に使用してもよく、この方法はインテグリン発現細胞上の少なくとも2つのαvβ3インテグリンを架橋結合させ、それによって該細胞の運動性を阻害することを含む。それらの架橋結合によってFAKシグナリングが破壊され、FAKおよびCASのチロシンリン酸化反応が活性化されると考えられる。更に、架橋結合は細胞の形態学の変化（細胞骨格の変化または局限性接着構造を含む）を誘導すると考えられる。好ましい態様では、αvβ3インテグリン発現細胞は腫瘍細胞である。

本明細書に記載するホモ二量体および単量体ディスインテグリン（例えばVN）を使用してインテグリン発現細胞のビトロネクチンへの接着を阻害してもよく、これは細胞をホモ二量体および単量体ディスインテグリンに暴露することによって行う。ホモ二量体および単量体ディスインテグリンは、インテグリン、特にαvβ3またはαvβ5インテグリンへの結合によって接着を阻害すると考えられる。

本明細書に記載するホモ二量体および単量体ディスインテグリン（例えばVN）を、哺乳動物における血栓症治療のための組成物として、単独で、または1つ以上の血栓溶解剤と併せて調製してもよい。特に、それらの組成物は動脈、静脈、および微小血管の血栓および血栓塞栓症の治療または予防に有用である。それらの組成物は卒中、一過性虚血発作、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、肺塞栓症、動脈瘤、および狭心症の治療にも有用である。それらの組成物は特に心筋梗塞の予防または治療に有用である。

本明細書に記載するホモ二量体および単量体ディスインテグリン（例えばVN）を使用して、黒色腫、癌腫、および肉腫患者の転移の阻害を行ってもよい。特定の態様では、ホモ二量体および単量体ディスインテグリンを使用して乳ガン患者の転移を予防してもよい。

本明細書に記載するホモ二量体および単量体ディスインテグリン（例えばVN）を使用して骨粗鬆症を治療してもよい。破骨細胞による骨吸収を阻害するのに有効な量のホモ二量体および単量体ディスインテグリンを用いる骨粗鬆治療のための組成物および方法を使用してもよい。

本明細書に記載するホモ二量体および単量体ディスインテグリン（例えばVN）を使用して創傷治癒を促進してもよい。ホモ二量体および単量体ディスインテグリンは細胞-細胞および細胞-細胞外マトリクス相互作用（フィブロネクチンとの相互作用を含む）を阻害し、それによってケロイド形成を含む創傷修復を促進しうる。それらの治療を必要としている患者に投与する場合、ホモ二量体および単量体ディスインテグリンを含有する組成物を用いて接着形成を阻止してもよい。

ホモ二量体および単量体ディスインテグリンを含有する医薬組成物は、所望の効果（すなわち血栓形成の阻止、ガン患者の転移の予防、接着形成の阻止など）を得るのに有効な最少量のタンパク質および好適なキャリアーまたは添加剤を含有すべきである。一般にこれらの組成物には、ホモ二量体および単量体ディスインテグリンが1日あたり約0.01mg/kgから約50mg/kg、好ましくは1日あたり約0.1mg/kgから約5.0mg/kg、そして最も好ましくは1日あたり約0.1mg/kgから約0.5mg/kgを提供するのに十分な量で含有される。それらの組成物は血栓形成の阻止に特に有用である。

ホモ二量体および単量体ディスインテグリンを、血栓を溶解するのに有効な量で含有される少なくとも1つの血栓溶解剤と併せて投与してもよい。好適な血栓溶解剤には、それらに限定されるわけではないが以下がある：アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体（APSAC）；組織型プラスミノーゲン活性化因子（tPA）；ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（uPA）；およびフィブロラーゼ（米国特許第4,610,879号（Markland, Jr.ら）に報告されているヘビ毒液線維素溶解剤）。

ホモ二量体および単量体ディスインテグリンの投与は、これを実質的な量で血流に運搬するのに好適な、種々の周知の方法で行うことができる。好適な液体賦形剤または添加剤中のホモ二量体および単量体ディスインテグリンの静脈内投与が現在のところ好ましい投与経路であると考えられる。ホモ二量体および単量体ディスインテグリンは水溶性であるため、好適な水溶液（例えばリン酸緩衝液）で便宜に投与してもよい。あるいはまた、ホモ二量体および単量体ディスインテグリンは経口投与するか（好適な結合剤もしくは添加剤と共に調製した錠剤もしくはカプセル剤の形態で、または水性もしくは油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ、エリキシルの形態で）、または非経口懸濁液として投与してもよい。当業者に周知の通り、局所麻酔剤、保存剤、緩衝剤、潤滑剤、湿潤剤、色素、香料、充填剤、および希釈剤のような補助剤を任意のこれらの製剤に好適に含有させてもよい。

本発明の多用途性を以下の実施例で例証するが、これは本発明の好ましい態様を例証するものであり、特許請求の範囲または明細書をいかなる様にも制限するものではない。

実施例１：E. coliのOrigami B株におけるコントートロスタチンの発現
FA113二重変異体に基づく細菌のOrigami株（Novagen）を使用して細菌における組換えCNの生成を行った。

図6に示すpET32aベクターマップ（Novagen社）は、109アミノ酸のチオレドキシン野生型タンパク質配列の下流に融合したペプチド配列の発現に用いられている（LaVallie, DiBlasioら, 1993）。クローニング部位は、検出および精製のための切断可能なHisタグ配列およびS-タグ配列も含有する融合タンパク質を生成するために使用できる。本明細書に開示するように、組換えCN配列を含むディスインテグリンをチオレドキシンとの融合体として発現させ、ジスルフィド結合形成を促進させ、真核生物タンパク質の可溶性を向上することができる。

単量体ディスインテグリン、エキスタチンのC-末端アミノ酸配列に相当する配列HKGPATを、CNディスインテグリンドメイン配列のC-末端に含有させた。このコンストラクトはキメラであり、遺伝子操作によって異なる起源を持つ2つのヘビ毒液ディスインテグリン、すなわちエキスタチン（クサリヘビ科動物（vaperid）ディスインテグリン）およびコントートロスタチン（マムシ亜科動物（crotalid）ディスインテグリン）の配列を併せ持つ。このため、C-末端グラフト（graft）を保有するこのディスインテグリンコンストラクトを“ビクロスタチン（Vicrostatin）”または“VN”と称する。HKGPAT配列を有さないCNディスインテグリンドメインを“rCN”または“rCNコンストラクト”と称する。ビクロスタチンのアミノ酸配列を以下に示す。
DAPANPCCDAATCKLTTGSQCADGLCCDQCKFMKEGTVCRRARGDD LDDYCNGISAGCPRNPFHHKGPAT (SEQ ID NO: 5)

PCRによって、コントートロスタチン野生型ディスインテグリンドメインまたはエキスタチンC-末端グラフトを有するディスインテグリンドメインをpET32aベクターのチオレドキシン配列の下流に直接クローニングした。クローニングに用いた一連の制限酵素は以下である：Bg1II/NcoI。クローニングに用いたオリゴヌクレオチドプライマーは以下である：
CNfor1：Bg1II制限酵素部位を導入するrCN（ディスインテグリンドメイン）の順向きプライマー
5'GTTCCAGATCTCGAGAATCTTTACTTCCAAGGAGACGCTCCTGCAAATCCGTGCTGCGATGCTGCA3' （SEQ ID NO: ６）
CNback1：NcoI制限酵素部位を導入するrCN（ディスインテグリンドメイン）の逆向きプライマー
5'GTTATTCGCCATGGCTTAGGCATGGAAGGGATTTCTGGGACAGCCAGCAGA3' （SEQ ID NO: 7）
CNback2：NcoI制限酵素部位を導入するVN（ディスインテグリンドメイン）の逆向きプライマー
5'GTTATTCGCCATGGCTTAAGTAGCTGGACCCTTGTGGGGATTTCTGGGACAGCCAGCAGATATGCC3' （SEQ ID NO: 8）

順向きプライマーは独自のTEVプロテアーゼ切断部位を導入し、これによってNi-カラムクロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製後にチオレドキシン融合パートナーを除去することが可能となる。TEVプロテアーゼはこのコンストラクトにおいて組換えCNおよびチオレドキシン融合パートナーの間に配された基準となるENLYFQGアミノ酸配列を高い特異性で認識する。逆向きプライマーは融合タンパク質のC-末端にHKGPATセグメントを導入する。従って、上記のクローニング戦略を用いて所定の2つの組換え融合タンパク質、Trx-rCNおよびTrx-VNを生成した。

最初のクローニングを、recA^-endA^-であり、形質転換効率が高く、プラスミド収量が高いDH5α株で実施した。DH5α形質転換細胞から回収したコンストラクトのシーケンシングによってクローニングを確認した後、ベクターを発現ホスト、Origami B(DE3)pLysSに形質転換し、発現を最適化した。

Origami B/pET32a系は，最適化なしで20mg/Lの組換えCN（Trx-rCNおよびTrx-VNコンストラクトの両方）を生成した。形質転換したOrigami B細胞の1個のコロニーを、カルベニシリン（100μg/mL）、テトラサイクリン（12.5μg/mL）、カナマイシン（15μg/mL）、およびクロラムフェニコール（34μg/mL）を含有するLB培地10mLを含む初代培養液に接種した。培養液を高濁度となるまで一晩増殖させ、これを4つの抗生物質全てを含有する新たなLB培地1Lに接種した。第1の培養液を更に大容量のLB培地＋抗生物質に接種し、250rpmで撹拌しながら37℃でOD₆₀₀が1-2になるまで増殖させた。この時点で1mMのIPTGを添加し、細胞を更に3-5時間、250rpmで撹拌しながら37℃で増殖させた。

細胞を回収し、5mLの冷20mM Tris-HCl（pH7.5）に再懸濁し、超音波処理をして溶解した。遠心分離（40,000xg）で不溶性の細胞デブリを除去し、総可溶性タンパク質画分を回収した。総可溶性タンパク質画分を細胞溶解物から回収し、SDS-PAGEで分析したところ（図８）、融合タンパク質（Trx-rCNおよびTrx-VN）はこの細胞画分中で優勢な種であることが示唆された。製造者（Invitrogen）の取扱説明書に従って総可溶性タンパク質画分中の融合タンパク質に組換えTEVプロテアーゼによるタンパク分解処理を行い、その融合パートナー、チオレドキシンからrCNまたはVNを切断させた。TEVプロテアーゼ処理後（SDS-PAGEでモニタリング）、0.22μmフィルターを通過させてタンパク質分解物を滅菌し、更に30kDaの分子カットオフフィルター（Millipore, MA）を通過させた。濾液に含有される組換えディスインテグリン種（rCNまたはVN）を逆相HPLC精製によって更に回収した。あるいは、まずHisタグ配列を含む融合タンパク質を、市販のHis・Bind樹脂キット（Novagen）を用いてNi-キレートアフィニティークロマトグラフィー精製した。バッファー交換（過剰のイミダゾールの除去）の後、TEVプロテアーゼを用いて、TEVプロテアーゼ（システインプロテアーゼ）を還元（活性）状態に保持するためのごく少量のDTTまたはGSH/GSSGの存在下で、融合タンパク質を室温で一晩分解した。タンパク分解が完了した時点で（SDS-PAGEで評価）組換えCN種（rCNまたはVN）を逆相HPLC精製で回収した。

C18逆相HPLCを用いて組換えCNコンストラクトを精製した後、融合タンパク質のTEV切断を行った。rCNおよびVNに用いたHPLCカラム条件は野生型CNに用いたのと同じである。0.1% TFA水溶液中のVydac C18カラム（218TP54, Temecula, CA）を用いてHPLCを行った。負荷用溶液でカラムを（1ml/mlで）10分間洗浄した後、80%アセトニトリル／0.1% TFAを含む移動相を用い、50分間にわたって直線グラジエント（0-100%）溶出を行った。これらの条件下で、野生型CNおよび両型の組換えCNは41%アセトニトリルで溶出される。溶出された物質を還元SDS-PAGEで分析したところ、VNは野生型CNよりわずかに大きい、分子量約8kDaのシングルバンドを示し、これは5個の更なるアミノ酸を含有するという一次構造と一致している。回収したrCNは野生型CNとほとんど同一サイズであった。

HPLC精製したrCNおよびVNはELISAおよびウェスタンブロッティングアッセイのいずれでも、野生型CNに対して産生させたポリクローナル抗血清で認識された（データ未掲載）。

実施例２：組換えコントートロスタチン・コンストラクトの生体活性
A. インビトロ機能アッセイ
血小板凝集阻害アッセイで組換えCN産物の生体活性を評価した。このアッセイによれば、CNのGPIIb/IIIa（インテグリンαIIbβ3）への結合によって、ADP誘導型血小板凝集がRGD依存的に阻害される（Trikha, Roteら, 1994）。このアッセイでは、可能性のある阻害剤を新鮮多血小板血漿に添加し、しばらくの後、ADPを添加して最終濃度1μMとし、凝集を誘導する。阻害剤が存在すれば機能的凝集は起きない。IC₅₀は活性が50%阻害される濃度と定義され、阻害能の基準として使用される。

VNは血小板阻害アッセイで59nMのIC₅₀を示し、野生型CNで観察されるのとほぼ同じであった。しかしながらrCNコンフォーマーは、小型の合成RGDペプチドに有効な数μMの濃度でも、血小板凝集を阻害しなかった。ADP誘導型血小板凝集機能アッセイにおけるrCN、VN、および野生型CNの効果を図9に示す。

更に、キメラ組換えディスインテグリンVNはいくつかの他のインテグリンに基づくインビトロ機能アッセイ（固定化したフィブロネクチン（Fn）およびビトロネクチン（Vn）へのMDA-MB-435ガン細胞接着の阻害、または改変ボイデン（Boyden）チャンバーにおける人工基底膜（Matrigel）を通したMDA-MB-435細胞浸潤の阻害）で同様の結果を示した。細胞接着アッセイでは、MDA-MB-435乳ガン細胞を種々の濃度（0-1000nM）の野生型CNまたはVNで30分間前処理すると、MDA-MB-435細胞（100μlの細胞、105細胞／ml）の固定化フィブロネクチン（Fn）またはビトロネクチン（Vn）への接着が阻害された。前処理した細胞を25℃で1時間接着させ、未接着細胞を洗浄除去した後、MTS細胞生存能アッセイを用いて各条件での接着した細胞数を測定した。細胞浸潤アッセイで、24ウェル組織培養プレートにフィットする細胞培養インサートから成る浸潤チャンバーを使用した。インサートは、その一面にECMatrixTMの薄層を適用した8μm孔径のポリカーボネート膜を含む。ECMatrixTMはインビトロ再構成基底膜として機能し、Engelbreth Holm-Swarm（EHS）マウス腫瘍から調製したECMタンパク質の固体ゲルである。ECM層は膜孔を閉塞し、非浸潤性細胞の通過を遮断する。細胞を種々の濃度（10、100、1000nM）の野生型CNまたはビクロスタチンの存在下、25℃で30分間インキュベートした後、ボイデン・チャンバー内で8時間、通過移動させた。8時間の時点で孔を通過してチャンバー下部に浸潤した細胞を測定した。蛍光プレートリーダーを用いて、回収された標識DNAを定量することによって、各条件での浸潤した細胞数を概算した。結果を%浸潤で算出した（未処理コントロールを100%浸潤とみなす）。これらのインビトロ機能アッセイ全てにおいて、ビクロスタチン（VN）は同様の効力を示し、野生型CNとほぼ同じIC₅₀を示した（図１０および１１）。試験した全てのインビトロ機能アッセイにおいて、rCNコンストラクトはナノモルの範囲で不活性であった（データ未掲載）。

Ｂ．組換えディスインテグリン含有リポソームの調製
既に報告されているプローブ超音波処理法（Fujii, Changら, 1997）を用いて、外毒素未含有VN含有リポソーム（LVNと称する）および外毒素未含有野生型CN含有リポソーム（LCNと称する）を調製した。簡潔に記すと、脂質（ジステロイルホスファチジルコリン（disteroylphosphatidylcholine）、コレステロール、およびポリエチレングリコール誘導体化脂質）をクロロホルム／メタノール溶液に溶解した。脂質溶液のアリコートをピペットで採取してガラス製の丸底試験管に入れ、65℃、窒素ガス気流下で溶媒をエバポレートして脂質の薄層を創成した。フィルムを少なくとも24時間真空下に配し、残存する有機溶媒を除去した。10mMリン酸トリウム、9%スクロース（ｐH7.2）に溶解した野生型CNまたはVNで脂質膜を水和した後、リポソームを形成させた。混合物を65℃で5-10分間インキュベートした。水和の後、懸濁液が半透明になるまでプローブ超音波処理を行った。得られた懸濁液はCN/VNを捕捉するリポソームとカプセル化されていないCN/VNを含有した。カプセル化されていない画分を限外ろ過で除去した。洗浄後、0.22μmフィルターを通過させて懸濁液を滅菌した。

クロロホルム／メタノール／水（10：40：50）でリポソームを破壊した後14,000xgで遠心分離してリポソームに捕捉されたCN/VNの濃度を測定した。BCAタンパク質アッセイを用いて上清のCN/VN濃度を分析した（Smith, Krohnら, 1985）。H₂O：メタノール：クロロホルム溶液でLrCNを分解した後、BCAタンパク質測定を行って、カプセル化効率を評価した。

観察によれば、野生型CNでは80%であるのに対し、カプセル化溶液中の72%の組換えタンパク質VNがリポソーム内に封入された。LVNはカプセル化された野生型CNと同じ安定性およびサイズ分布（平均粒子サイズ140nm）を示した。

Ｃ．組換えディスインテグリン含有リポソームを用いる腫瘍治療
リポソームに封入されたCNの生体活性を、既に報告されているように評価した（Swenson, Costaら, 2004）。簡潔に記述すると、5検体のヌードマウスｘ3群の乳房脂肪体にMDA-MB-435ヒト乳ガン細胞を移植した。移植2週間後、触診可能な小型の腫瘍が生じ、治療を開始した。動物をLCNまたはLVNで処理した（105μg、週2回、静脈投与）；PBSで処理したコントロールも含めた。LVNによる腫瘍増殖に対する有意な阻害効果が観察された（図12）。VNの機能活性はそのインビボにおけるガン治療効果で示され、これは野生型CNと同様であることが見いだされた。

Ｄ．組換えディスインテグリン含有リポソームの抗血管新生活性
野生型CNおよびカプセル化された野生型CN(LCN)を用いた過去のインビボでの研究で、増殖中の腫瘍において血管新生に対する劇的な阻害効果が明らかになった（Zhou, Nakadaら, 1999；Zhou, Sherwinら, 2000；Markland, Shiehら, 2001；Golubkov, Hawesら, 2003；Swenson, Costaら, 2004）。そのため、MDA-MB-435乳ガンモデルにおける腫瘍血管新生に対するLVNの効果を、抗CD31（抗PECAM-1）モノクローナル抗体を有する血管の組織化学的同定を行って試験した。CD31は新生中の血管構造において、内皮細胞の表面上に報告されている約百万コピーで高度に発現されることが報告されている（Newman, 1994）。CD31は内皮細胞の側面ジャンクションでの細胞-細胞接触の最初の形成および安定化、血管透過障壁の保持、細胞移動の制御、および血管新生中の新たな血管の形成に関与することが報告されている（Newman, Berndtら, 1990；Ferrero, Ferreroら,1995；DeLisser, Christofidou-Solomidouら,1997）。CD31のこれらの特性を合わせて、血管新生の測定に最適なレポーター分子とする。

簡潔に記載すると、MDA-MB-435動物腫瘍モデルにおけるLCN/LVN有効性試験からの処理および未処理マウスの腫瘍を、既に報告されているように、通常の（normal）4%緩衝ホルマリン溶液中で固定化し、パラフィンブロックに包埋した（Shi, Keyら, 1991）。パラフィンブロックを5μm切片に切断し、ガラススライド上に配した。組織片を脱パラフィン、再水和、および抗原回復を行った（Pileri, Roncadorら, 1997）。3% H₂O₂に切片を暴露すると外来ペルオキシダーゼ活性が阻害された。標本を正常ヤギ血清（1：20）で30分間ブロッキングした後、1次抗体と共に1時間インキュベートした。CD31に対するウサギモノクローナル抗体（Sigma）を１次抗体として用いて小血管を検出した。その後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたヤギ抗ラビット２次（検出用）抗体（Zymed）をサンプルに適用し、室温で10分間インキュベートした後、PBSで複数回洗浄して未結合の抗体を除去した。色素原として3,3’-ジアミノベンジジン（DAB）を用い、製造者（Zymed HistoMouse Max）の取扱説明書に従って2次抗体の検出を行った。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。染色された血管の定量は“ホットスポット”分析（Gasparini, Weidnerら, 1993）で行ったが、“ホットスポット”は血管が高密度な領域と定義した（Weidner, Folkmanら, 1992；Swenson, Costaら, 2004）。SimplePCI高度イメージングソフトウェア（C-イメージングシステム, Cranberry Township,PA）を用いて所定のホットスポット内のピクセルに関して、ポジティブ染色を示した面積（倍率100）の定量を行った。

MDA-MB-435腫瘍切片におけるCD31による血管検出を図13Aおよび13Bに示す。図13Bの棒グラフは各処理群、すなわちPBS、静脈内リポソーム封入野生型CN（LCN）、および静脈内リポソーム封入VN（LVNと記載する）のポジティブ染色の違いを示す。LCNおよびLVN処理した腫瘍はいずれも統計学的に有意な（p<0.0005）小血管密度の低下を示し、これはLCN群の血管新生の90%の低下、およびLVN群の92%の低下に相当する。MDA-MB-435乳ガン異種移植片モデルにおいて、CD31免疫染色によって全ての処理群で観察された血管新生の低下は、LVNが血管新生の効果的な阻害剤であることを示している。

Ｅ．組換えディスインテグリンの構造分析
野生型CNおよびVNの構造を質量分析で評価した。α-シアノ-4-ヒドロキシケイヒ酸のマトリクスを用いてMALDI-TOF質量分析を行った。MALDI-TOFでの野生型CNを図14A、MALDI-TOFでのVNを図14Bに示す（分子量7143.41に単量体ピークが観察される）。これらの結果はVNが野生型CNで観察されるような二量体ではなく、単量体であることを示している。

電子スプレーイオン化質量分析を用いた野生型CNおよびVNの評価も行った。図15Aは、13507.0に二量体に相当するCNの大きなピークがあり、またおそらくは1個のアミノ酸が切断除去されたCNの、2つのより小さなピークを示している。図15Bは7146.0にVNのシングルピークがあり、これは単量体であることを裏付けている。

質量分析データは、VNは二量体型の野生型CNとは異なり、単量体構造であることを示している。上記のようにCNに関して測定した生体活性は分子のC-末端部分に存在するので、これはVNが少なくとも分子のC-末端部分では正確にフォールディングされており、正確なジスルフィド架橋の組み合わせとなっており、野生型コンフォーマーに存在するインテグリン結合性ループを保持していることを示唆している。しかしながら、野生型二量体立体配置とならないことは、VNのN-末端部分が野生型CNとは異なる様式でフォールディングされ、VNのN-末端システインの分子間ジスルフィド結合形成に関与する能力が損なわれていることを示している。これはVN中に少なくとも一つの遊離チオールが検出されたことによって確認された。天然の状態でCNの第7システイン（Cys-30）と対となる第1システイン残基（Cys-7）は、CN中で架橋するシステインの中で一番離れたものである。CN中のC7およびC30システインの架橋に内在する問題は、VNが二量体を形成できないことを説明しうるものである。

実施例３：コドン使用の最適化
Origami E. coli株（FA113）で考えられる問題は、コドン使用の最適化ができないことである。多くの生物で、61のtRNA種全てが同等に使用されるわけではない。いわゆるメジャー・コドンは発現された遺伝子に高い頻度で存在するものであり、マイナーまたはレア・コドンは発現された遺伝子中に低レベルで存在する傾向にある。61コドンのうちのいずれがレアであるかは生物に大きく依存する。

外来発現系においては、タンパク質生成を妨害するミスマッチなコドン使用のために、E. coliにおける真核生物タンパク質の翻訳が非効率的となる傾向がある（Makrides, 1996）。生物ごとのコドン使用は当業界で周知のコドン使用データベースに見られるが、これはオンラインで利用できる。E. coliにおけるコドン使用を図16に示す。この図の遺伝子は3つのクラスに分類される。クラスI遺伝子はほとんどの代謝過程に関与する。クラスII遺伝子は指数増殖期に高度かつ持続的に発現される遺伝子に相当する。クラスIII遺伝子はDNAの水平伝播に関係する。クラスIII遺伝子におけるコドンの分布は概ね均一であるが、クラスII遺伝子では非常に偏っている（特にAで終わるコドンはあまり選択されない）（Guerdoux-Jamet, Henautら, 1997）。通常、コドン使用の頻度は、それと同起源のtRNAの存在量を反映している。従って、発現すべきタンパク質のコドン使用が発現ホストの平均的なコドン使用と有意に異なる場合には、これが発現の際に問題となりうる。

コドン使用に関する以下の問題が起こりうる：
・翻訳の妨害-種々の切断型タンパク質産物が生じる
・フレームシフト-タンパク質産物の翻訳ミスを引き起こす
・アミノ酸の導入ミス-例えばAGAコドンの結果としてアルギニンの代わりにリジンとなり、これはタンパク質の分子量が28Da減少するため質量分析で検出できる
・タンパク質合成および細胞増殖の阻害-発現収量に有意な影響を与える

結果として、観察される発現レベルは多くの場合低いか、または検出不能である。レア・コドンがｍRNAの5’-末端に存在する、または連続的なレア・コドンが見られる場合は特に、発現レベルは低く、切断型タンパク質産物が生成される。種々の生物における8つの最も使用頻度の低いコドンの比較を図17に示す。

CN遺伝子では、E. coliにおいてほとんど使用されないコドンが39個あり（図18Aに太字で示す）、このためこの発現系でのCN野生型遺伝子のコドン使用は困難である。別のE. coli発現ホストであるRosetta-gami B（Novagen）は、AGA、AGG、GGA、ATA、CTA、およびCCCを補充するtRNAを提供することによってコドン使用を最適化するが、CGGまたはACAは最適化されない。従って、向上された細菌ホスト、Rosetta-gami Bを使用しても、CN遺伝子には、この高度に遺伝子操作されたE. coliでもサポートしきれない2つのコドンが残る。CGGは古典的レア・コドンであり、DNA配列において置換されるのが好ましい。ACAコドンはスレオニンをコードし、レア・コドンに分類されるほどは使用頻度が低くないが（図18A参照）、野生型CN遺伝子に非常によく出現する（コード配列中に11個のACAコドンが存在）ので重要である。従ってACAコドンはコード配列中で可能な限り置換すべきである。

ある態様では、CN遺伝子のディスインテグリンドメイン中の11個のACAコドンのうち8個を、よりホストとの適合性がある相同体と置換する。一組のオーバーラップしたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、PCRにより2つの群のコドンを置換し（部位特異的変異誘発）、より使用頻度の高い相同体とした（それぞれCGTおよびACC/ACT）。PCRで構築した変異型CN遺伝子配列を図17Bに示す。この図で、太字で示すコドンは置換されていないACAコドンのみである。

以下のオーバーラップしたオリゴヌクレオチドプライマーを生成し、これを用いて上記のように野生型CN遺伝子のCGGおよびACAコドンを置換した：
CNCGGfor -CGGおよび第11 ACAコドンを置換するCNディスインテグリンドメイン順向きプライマー：
5'ACCGTATGCCGTAGAGCAAGGGGTGATGACCTGGATGATTAC3' （SEQ ID NO: 9）
CNCGGback -CGGおよび第11 ACAコドンを置換するCNディスインテグリンドメイン逆向きプライマー：
5'TGCTCTACGGCATACGGTTCCTTCTTTCATAAATTTGCACTG3' （SEQ ID NO: 10）
CNACAfor -第8、第9、および第10 ACAコドンを置換するCNディスインテグリンドメイン順向きプライマー：
5'TGCGATGCTGCAACCTGTAAACTGACCACCGGGTCACAGTGTGCAGAT3' （SEQ ID NO: 11）
CNACAback -第8、第9、および第10 ACAコドンを置換するCNディスインテグリンドメイン逆向きプライマー：
5'CAGTTTACAGGTTGCAGCATCGCAGCACGGATTTGC3' （SEQ ID NO: 12）
CNMACA12for -最初の2つのACAコドンを置換するCNメタロプロテアーゼドメイン順向きプライマー：
5'TCTGATGGCAGAAAAATTACCACCAACCCTCCGGTTGAG3' （SEQ ID NO: 13）
CNMACA12back -最初の2つのACAコドンを置換するCNメタロプロテアーゼドメイン逆向きプライマー：
5'AATTTTTCTGCCATCAGAGGAATAATG3' （SEQ ID NO: 14）
CNMACA45for -第4および第5 ACAコドンを置換するCNメタロプロテアーゼドメイン順向きプライマー：
5'CATAGTGCAATAAATCTTTGGGTTGCAGTTACTATGGCCCATGAG3' （SEQ ID NO: 15）
CNMACA45back -第4および第5 ACAコドンを置換するCNメタロプロテアーゼドメイン逆向きプライマー：
5'ATTTATTGCACTATGATCCTGAACAATTCCGGTAGAAAGCTTCGG3' （SEQ ID NO: 16）

実施例４：遺伝子操作したホスト系
細胞質におけるジスルフィド異性化酵素活性を有し、同じコンパートメント内で酸化還元酵素装置を自己再生する能力を有するように遺伝子操作したRosetta-gami Bホストを、細菌における組換えCN生成に用いてもよい。ホストを遺伝子操作して、チオレドキシンに融合したジスルフィド含有真核生物タンパク質を、その細胞質でΔssDsbCおよびΔssDsbDαと共に同時過剰発現させることができる。この目的は同じ系に共存できる1対のベクターを用いて達成することができる。このベクターセットの最低限の特徴は、3つのタンパク質全てに同時に使用できるT7lacのような強力なプロモーターの存在、並びに、ベクターに導入された異なるMCS（マルチクローニング部位）での便宜な複数の制限酵素認識部位の存在である。異なるレプリコンを有することによって互いに和合性があり、Rosetta-gami B発現ホストとも和合性がある２つのNovagenベクター（pET32aおよびpCDFDuet-1）は上記の特性を有し、本明細書に記載する系に使用することができる。これら2つのベクターを用いることによって、3つのタンパク質全ての発現を1つの強力なプロモーターT7lacで同時に制御するという、統合システム使用のシナリオが実現される。Novagenから販売されているpCDFDuet-1ベクターのマップを図19に示す。

いくつかの野生型および活性部位変異型チオレドキシン-CN遺伝子コンストラクトを調製した。これらはチオレドキシン（N-末端に）と以下とを含む融合タンパク質を発現する：ディスインテグリンドメイン（CN）、またはエキスタチンC-末端グラフト（VN）を含有するディスインテグリンドメイン、またはエキスタチンC-末端グラフトを含有する、もしくは含有しない、CNのプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインから成る、より大型の真核生物タンパク質（rCN PMDおよびVN PMDと記載する）。以下で使用する広義の“TrxA-ディスインテグリンコンストラクト”という用語は、本明細書に記載するように調製した以下のコンストラクトをいう：TrxA-rCN（CNディスインテグリンドメインに融合したチオレドキシンA）、TrxA-VN（エキスタチンC-末端グラフトを含むCNディスインテグリンドメインに融合したチオレドキシンA）、TrxA-rCN PMD（CNプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインから成る大型タンパク質に融合したチオレドキシンA）、TrxA-VN PMD（エキスタチンC-末端グラフトを含有するCNプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインから成る大型タンパク質に融合したチオレドキシンA）、TrxA（CPYC）-rCN（CNディスインテグリンドメインに融合した、CPYCモチーフを有する活性部位変異型チオレドキシンA）、TrxA (CPYC)-VN（エキスタチンC-末端グラフトを含有するCNディスインテグリンドメインに融合した、CPYCモチーフを有する活性部位変異型チオレドキシンA）、TrxA (CPYC)-rCN PMD（CNプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインから成る大型タンパク質に融合した、CPYCモチーフを含有する活性部位チオレドキシンA）、TrxA (CPYC)-VN PMD（エキスタチンC-末端グラフトを含有するCNプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインから成る大型タンパク質に融合した、CPYCモチーフを含有する活性部位チオレドキシンA）、TrxA (CGHC)-rCN（CNディスインテグリンドメインに融合した、CGHCモチーフを含有する活性部位変異型チオレドキシンA）、TrxA (CGHC)-VN（エキスタチンC-末端グラフトを含有するCNディスインテグリンドメインに融合したCGHCモチーフを含有する活性部位変異型チオレドキシンA）、TrxA (CGHC)-rCN PMD（CNプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインから成る大型タンパク質に融合したCGHCモチーフを含有する活性部位変異型チオレドキシンA）、およびTrxA (CGHC)-VN PMD（エキスタチンC-末端グラフトを含有するCNプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインから成る大型タンパク質に融合したCGHCモチーフを含有する活性部位変異型チオレドキシンA）。

発現ホスト細胞質中の組換え真核生物タンパク質転写物、特にプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインを含有する（エキスタチンC-末端グラフト含有または未含有の）大型転写物の安定性を向上するために、種々の長さのヌクレオチド配列を含有するように組換えコンストラクトを設計した。それらの配列は通常、CN野生型mRNAの3’-非翻訳領域、すなわちCN野生型転写物にみられる転写の終了を知らせる終止コドンの下流に見られるものである。CN cDNAをテンプレートとして用いて、CN野生型mRNAをモデルとした更なる非コードヌクレオチド領域と共に、いくつかのディスインテグリンコンストラクトをクローニングした（Zhou, Huら, 2000）。野生型CN cDNAはFrancis S. Markland研究所（USC）で入手可能である。

CNディスインテグリンドメイン配列（エキスタチンC-末端グラフト含有または未含有）またはプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインから成る大型CN配列（エキスタチンC-末端グラフト含有または未含有）をTrxAヌクレオチド配列の下流でpET32aベクターにPCRクローニングするのに使用したプライマーは以下である：
CNfor2 -NcoI制限酵素部位およびTEVプロテアーゼ切断部位を導入するCNディスインテグリンドメインのための順向きプライマー：
5'GTTCCCCATGGATGAGAATCTTTACTTCCAAGGAGACGCTCCTGCAAATCCGTGCTGCGATGCTGCA3' （SEQ ID NO: 17）
CNfor3 -NcoI制限酵素部位およびTEVプロテアーゼ切断部位を導入する完全長CNのための順向きプライマー：
5'GTTCCCCATGGATGAGAATCTTTACTTCCAAGGAATGATCCAGGTTCTCTTGGTGACTCTATGCTTA3' （SEQ ID NO: 18）
CNback3 -EcoRI制限酵素部位を導入するエキスタチンC-末端グラフト未含有CNコンストラクトのための逆向きプライマー：
5'GTTATTCGGAATTCTTAGGCATGGAAGGGATTTCTGGGACAGCCAGCAGA3' （SEQ ID NO: 19）
CNback4 -EcoRI制限酵素部位を導入するエキスタチンC-末端グラフト含有CNコンストラクトための逆向きプライマー：
5'GTTATTCGGAATTCTTAAGTAGCTGGACCCTTGTGGGGATTTCTGGGACAGCCAGCAGATATGCC3' （SEQ ID NO: 20）

CN野生型mRNAの非翻訳ヌクレオチド配列を含む種々のディスインテグリンコンストラクトをpET32aベクターにクローニングするのに使用した逆向きプライマーは以下である:
CNback5 -EcoRI制限酵素部位を導入するCN野生型転写物の生成のための逆向きプライマー：
5'GTTATTCGGAATTCATATTACAGAATTTGGATACCATCTGGAAGCTA3' （SEQ ID NO: 21）
CNback6 -EcoRI制限酵素部位を導入するCN野生型転写物の生成のための逆向きプライマー：
5'GTTATTCGGAATTCGAATGAGAATAGTTTGTTTATTGACGGAAGCAG3' （SEQ ID NO: 22）

活性部位チオレドキシン変異体を増幅し、それらを野生型TrxAヌクレオチド配列に代えてpET32aベクターにクローニングするために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは以下である：
Trxfor -XbaI制限酵素部位を導入し、活性部位変異体の5’末端をpET32aベクターに挿入するために設計したTrx順向き外側プライマー：
5'CCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACT3' （SEQ ID NO: 23）
Trxback -Bg1II制限酵素部位を導入し、活性部位変異体の3’末端をpET32aベクターに挿入するために設計したTrx逆向き外側プライマー：
5'TACCCAGATCTGGGCTGTCCATGTGCT3' （SEQ ID NO: 24）
TrxGrxfor -TrxA活性部位をグルタレドキシン様のものに変異させるTrx順向きプライマー：
5'TTCTGGGCAGAGTGGTGCCCGTATTGCAAAATGATCGCCCCG3' （SEQ ID NO: 25）
TrxGrxback -TrxA活性部位をグルタレドキシン様のものに変異させるTrx逆向きプライマー：
5'GCACCACTCTGCCCAGAAATC3' （SEQ ID NO: 26）
TrxPDIfor -TrxA活性部位をPDI様のものに変異させるTrx順向きプライマー
5'TTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCATTGCAAAATGATCGCCCCG3' （SEQ ID NO: 27）
TrxPDIback -TrxA活性部位をPDI様のものに変異させるTrx逆向きプライマー
5'GCACCACTCTGCCCAGAAATC3' （SEQ ID NO: 28）

DsbDクローニングでは、使用した制限酵素部位はNcoI/EcoRIであった。この制限酵素対を使用したのは、これによってpCDFDuet-1ベクターの第1マルチクローニング部位からHisタグ配列が除去され、ΔssDsbD α-ドメインがタグの付いていない分子として発現されるからである。DsbCクローニングではNdeI/XhoI制限酵素対を使用し、ΔssDsbCタンパク質がタグ無しで発現されるようにした。

野生型DsbC遺伝子はEcoRI制限酵素部位を保有する。このため、フォールダーゼ配列は以下のようにPCRで段階的にクローニングした：初めのクローニング段階でΔssDsbD α-ドメインヌクレオチド配列を１つのpCDFDuet-1ベクターのマルチクローニング部位に挿入し、その後、第2のクローニング段階でベクターの他のマルチクローニング部位にΔssDsbCヌクレオチド配列を挿入した。本明細書に記載する系で発現される唯一のHisタグタンパク質はTrxA-ディスインテグリン融合コンストラクトであるため、Niカラムクロマトグラフィー精製法を用いて容易に他の２つの共過剰発現タンパク質から分離できる。全てのTrxA-ディスインテグリンコンストラクトは、ジスルフィドを含有する組換えタンパク質（真核生物タンパク質）ヌクレオチド配列のすぐ上流に遺伝子操作で配置されたTEVプロテアーゼ切断部位を含む。TrxA-ディスインテグリンコンストラクトの全ての精製段階はOrigami系についての考察の項に記載するのと同じ方法で行った。しかしながら、いくつかのTrxA-ディスインテグリンコンストラクトはTEVプロテアーゼ切断部位の代わりにギ酸切断部位（Asp-Pro）を保有し、これも遺伝子操作でジスルフィド含有組換え真核生物タンパク質ヌクレオチド配列のN-末端のすぐ上流に配した。加水分解のためにギ酸を使用することによって、他のプロテアーゼ切断系（例えばTEVタンパク質分解系）に比較してコストが低減される。

（マルチドメインまたはエキスタチンC-末端グラフト含有または未含有）種々のCNコンストラクトのN-末端のすぐ上流にAsp-Proギ酸切断部位を保有するように遺伝子操作した種々のディスインテグリンコンストラクトをpET32aベクターにクローニングするために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは以下である：
CNfor4 -NcoI制限酵素部位およびAsp-Pro切断部位を導入するCNディスインテグリンドメインのための順向きプライマー：
5'GTTCCCCATGGATGACCCTGCAAATCCGTGCTGCGATGCTGCAACA3' （SEQ ID NO: 29）
CNfor5 -NcoI制限酵素部位およびAsp-Pro切断部位を導入する完全長CNのための順向きプライマー：
5'GTTCCCCATGGATGACCCTATGATCCAGGTTCTCTTGGTGACTCTATGCTTA3' （SEQ ID NO: 30）

ΔssDsbC、ΔssDsbD α-ドメインヌクレオチド配列、並びにそれらの活性部位変異体配列をpCDFDuet-1ベクターにPCRクローニングするために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは以下である：
DsbCUP -NdeI制限酵素部位を導入するDsbC順向きプライマー：
5'GTATTCATATGGATGACGCGGCAATTCAACAAACGTTA3' （SEQ ID NO: 31）
DsbCDN -XhoI制限酵素部位を導入するDsbC逆向きプライマー：
5'GTTCCCTCGAGTTATTTACCGCTGGTCATTTTTTGGTG3' （SEQ ID NO: 32）
DsbDUP -NcoI制限酵素部位を導入するDsbD順向きプライマー：
5'GTTATTCGCCATGGGATTATTCGACGCGCCGGGACGTTCA3' （SEQ ID NO: 33）
DsbDDN -EcoRI制限酵素部位を導入するDsbD逆向きプライマー：
5'GTCTACGAATTCGCTTAAGGCTGTGGCGCTGCGTTGTTGGC3' （SEQ ID NO: 34）

DsbC活性部位変異体を生成するために使用したオーバーラップ伸長オリゴヌクレオチドプライマーは以下である：
DsbCTFfor -活性部位変異型DsbC（CTFC）オーバーラップ伸長順向きプライマー：
5'TTTACTGATATTACCTGTACCTTCTGCCACAAACTGCATGAG3' （SEQ ID NO: 35）
DsbCGFfor -活性部位変異型DsbC（CGFC）オーバーラップ伸長順向きプライマー：
5'TTTACTGATATTACCTGTGGTTTCTGCCACAAACTGCATGAG3' （SEQ ID NO: 36）
DsbCOEback -活性部位変異型DsbCオーバーラップ伸長逆向きプライマー：
5'ACAGGTAATATCAGTAAACAC3' （SEQ ID NO: 37）

シーケンシングに使用したpET32aおよびpCDFDuet-1の外側および内側オリゴヌクレオチドプライマーは以下である：
DuetCDFUPl：
5'GGATCTCGACGCTCTCCCTTA3' （SEQ ID NO: 38）
DuetCDFUP2：
5'TTGTACACGGCCGCATAATCG3' （SEQ ID NO: 39）
DuetCDFDNl：
5'CGATTATGCGGCCGTGTACAA3' （SEQ ID NO: 40）
PETUPl：
5'GGAATTGTGAGCGGATAACAATTC3' （SEQ ID NO: 41）
PETUP2：
5'CGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACC3' （SEQ ID NO: 42）
PETDNl：
5'GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGG3' （SEQ ID NO: 43）

細菌チオール-ジスルフィド交換タンパク質DsbD α-ドメインおよびジスルフィド異性化酵素DsbCヌクレオチド配列をE. coli K-12 MG1655株ゲノムDNA（南カリフォルニア大学Francis S. Markland研究室で調製および精製した）からPCRにより、上記のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して直接増幅した。CN配列をPCRによってプラスミドから増幅し、そして／または変異を導入して、細菌でほとんど使用されない全ての野生型コドン、またはRosetta-gami Bによってサポートされないコドンを置換した。プロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインを含むCNヌクレオチド配列を、部位特異的変異誘発法を用い、いくつかのPCR段階でオーバーラップ伸長オリゴヌクレオチドプライマーを使用して突然変異させた。

野生型完全長CNヌクレオチド配列のPCR増幅、および最適化したコドンの置換を完了し、全てのフォールダーゼ配列を増幅させた後（活性部位変異を有する、または有しない）、これらの配列をpET32aおよびpCDFDuet-1ベクターに段階的にクローニングした。コドンを置換した完全長CNヌクレオチド配列は更に、エキスタチンC-末端グラフトを含むディスインテグリンコンストラクトを構築するためのテンプレートとしても使用した。野生型TrxA、エキスタチンC-末端グラフト含有または未含有ディスインテグリンヌクレオチド配列を、Bg1II/NcoI制限酵素部位を用いてpET32aベクターに直接挿入した。TrxA活性部位変異を有するTrxA-ディスインテグリンコンストラクトを構築するために、まずオーバーラップ伸長プライマーを用いてTrxA変異体を別個に増幅し、次いでXbaI/Bg1II制限酵素セットを用いてpET32aベクターに挿入して野生型TrxA配列を置換する。野生型TrxAヌクレオチド配列を含むpET32aベクターを、TrxA活性部位変異体の生成に必要な全てのPCR増幅段階でテンプレートとして使用した。更なる段階で、活性部位TrxA変異体をベクターに挿入した後、NcoI/EcoRI制限酵素セットを用いてディスインテグリンヌクレオチド配列をpET32aに挿入した。

以下の活性部位TrxA変異体を本明細書に記載する発現系に使用した：グルタレドキシン様TrxA（細菌グルタレドキシンA活性部位を有するチオレドキシンA）およびPDI様TrxA（真核生物タンパク質ジスルフィド異性化酵素活性部位を有するチオレドキシンA）。

ΔssDsbCの活性部位変異型配列を、オーバーラップ伸長プライマーを用い、PCRによってE. coli K-12 MG1655株ゲノムDNAから直接増幅した。以下の活性部位変異体を本明細書に記載する発現系に使用した：ΔssDsbC（CGFC）およびΔssDsbC（CTFC）。ΔssDsbD α-ドメインおよびΔssDsbCの野生型ヌクレオチド配列、またはΔssDsbCの活性部位変異型配列を、2組の制限酵素（それぞれNcoI/EcoRIおよびNdeI/XhoI）を用いてpCDFDuet-1ベクターの別々のマルチクローニング部位にクローニングした。pETDuet-1およびpCDFDuet-1ベクターコンストラクトを用いてエレクトロコンピテントDH5α細胞に共形質転換し、更に培養液中で増幅させた。その後、全てのコンストラクトをシーケンシングで確認し、組換えプラスミドを更に用いてRosetta-gami B発現ホストに共形質転換した。

全ての増殖段階は抗体の使用以外は、Origami系に関して前述したのと同じである。Rosetta-gami B共形質転換体を5つの抗生物質中で増殖させた：カルベニシリン（100μg/mL）、スペクチノマイシン（50μg/mL）、テトラサイクリン（12.5μg/mL）、カナマイシン（15μg/mL）、およびクロラムフェニコール（34μg/mL）。種々の組換えタンパク質のプロセッシングおよび精製段階は全て、Origami系に関して前述したのと同じである。

種々の共過剰発現されたフォールダーゼを含有する組換えディスインテグリン変異体の収量レベルおよび生体活性を、以下の発現の組み合わせを用いた後、最初に測定する：
１．TrxA-ディスインテグリン異性化酵素+ΔssDsbC＋ΔssDsbD α
２．TrxA（CPYC）-ディスインテグリン+ΔssDsbC+ΔssDsbD α
３．TrxA（CGHC）-ディスインテグリン+ΔssDsbC+ΔssDsbD α

種々のTrxA-ディスインテグリン融合タンパク質の構造および収量を比較することによって、最善の発現レベルで正しくフォールディングされた二量体が生成されるバージョンを選択する。正確にフォールディングされたタンパク質の発現レベルを更に向上するために、“ベスト酸化酵素-ディスインテグリン”と称される最善の酸化酵素バージョンを2つのDsbC変異体と併せて更に試験した。
４．ベスト酸化酵素-ディスインテグリン+ΔssDsbC（CGFC）+ΔssDsbDα
５．ベスト酸化酵素-ディスインテグリン+ΔssDsbC（CTFC）+ΔssDsbDα

組換えディスインテグリンの生成のために、実施例1に記載したものと同じ段階を用いた。しなしながら、発現された、プロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、およびディスインテグリンドメインを含む組換え変異体は翻訳後自己触媒的タンパク質切断を起こし、エキスタチンC-末端グラフトを含有する、または含有しないC-末端組換えディスインテグリンドメインを遊離しうるが、ディスインテグリンドメインは逆相HPLCによって細菌から回収した総可溶性タンパク質画分から直接更なる精製を行うことができる。この好ましい事象によって、組換えディスインテグリンの生成で使用される、Niカラムアフィニティークロマトグラフィー精製およびTEVプロテアーゼタンパク質分解またはギ酸加水分解が介在する段階の必要がなくなる。

実施例５．発現の最適化
より良好な収量を得るために、いくつかのパラメーターを変化させてこの系を最適化することができるが、それらには例えば以下の使用がある：全ての増殖段階で、βラクタマーゼ分解に対してより耐性が高い、より高濃度のカルベニシリン（より安定な型のペニシリン）；最適なIPTG濃度（Tuner誘導ホストで容易に行える特徴）；および最善の収量を得るのに最適な誘導温度。より均質な培養を行い、プラスミドのロスを防ぐための最も簡便な方法はより安定な抗生物質の使用であり、アンピシリンではなくカルベニシリンを使用してもよい。プラスミドの不安定性をも引き起こす現象である基底発現の制御を強化するために、培養液に1%グルコースを補足し、ほとんどのリッチな培養液（例えばLB）に存在するラクトースによるlacプロモーターの誘導を抑制してもよい。更に、少量のエタノール、ポリオール、およびスクロースの添加、または低分子量チオールによって、E. coliにおける可溶性タンパク質の発現を有意に促進できる（例えば数ミリグラムの組換えタンパク質から数十または数百ミリグラムまで）。また、既に記載したようにコドンの最適化を用いることができる。コドン使用を最適化する試みにおいて、Rosetta-gami B(DE3)pLysS発現ホスト（レアｔRNAで補足した株）をOrigami B(DE3)pLysSの代わりに優先的に使用してもよい。

実施例６：発現系の組み合わせ
以下の要素を本発明の方法に使用することができる。“TP”は真核生物タンパク質を意味する。
１．TrxA-TPまたはTrxA (CPYC)-TPまたはTrxA (CGHC)-TP
２．TPのためのインテグリン結合性（例えばHKGPAT）C-末端配列
３．項目１のためのタグ配列
４．項目1のための切断部位配列
５．ΔssDsbC
６．ΔssDsbDα
７．trxB変異体
８．gor変異体
９．ompT変異体
１０．lon変異体

この方法はTP発現のために上記の1-10を任意に組み合わせて含んでもよい。別の方法では、任意の以下の要素を組み合わせて、チオレドキシンに融合していない真核生物タンパク質を発現させてもよい。
１．チオレドキシンに融合していない真核生物タンパク質
２．TPのためのインテグリン結合性（例えばHKGPAT）C-末端タンパク質配列
３．項目１のためのタグ配列
４．項目1のための切断部位配列
５．ΔssDsbC
６．ΔssDsbDα
７．trxB変異体
８．gor変異体
９．ompT変異体
１０．lon変異体

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本発明について、当業者が生成および使用するために十分詳細に記述および例証してきたが、種々の代替、変更、および改良を本発明の意図および範囲から逸脱せずに施与できることは明白である。

当業者に容易に認識されるように、本発明は目的を実施し、記載した結果および利益、並びにそこに内在するものを得るために十分適合される。本明細書に提供する実施例は好ましい態様の代表例であり、例証であって、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。当業者はそれらの改変および他の使用をなしうる。これらの改変は本発明の意図に含まれ、特許請求の範囲で定義される。

当業者に容易に認識されるように、本発明の範囲および意図から逸脱することなく、本明細書に開示する本発明に種々の置換および改変を施与してもよい。

本明細書で言及する全ての特許および文献は、本発明が属する分野の当業者の水準を示すものである。全ての特許および文献は、個々の文献が参照により組み込まれることが明確かつ個別に示されるのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に例証的に記載する本発明を、本明細書には明記していない任意の要素（単数または複数）、制限（単数または複数）が無い状態で実施してもよい。従って、例えば本明細書中のいずれの場合でも、“を含む”、“本質的に…から成る”、および“…から成る”という用語は他の2つの用語のいずれで置き換えてもよい。使用した用語および表現は、制限ではなく説明の用語として用いたものであり、それらの用語または表現の使用において、明示および記述する特徴と同等のもの、またはその一部を除外することを意図するものではなく、認識されるように、種々の改変が請求項に記載した本発明の範囲内で可能である。従って、本発明について好ましい態様および他の特徴によって明確に開示したが、本明細書に開示する概念の改変および変更は、当業者によって使われる手段であり、それらの改変および変更は添付の請求項で定義される本発明の範囲内に含まれると見なされることは理解させるべきである。

他の態様は添付の特許請求の範囲の範囲内である。

図１は、E. coliペリプラズムにおける酸化経路を示す。図２は、E. coliペリプラズムにおける異性化経路を示す。図３は、DsbCの裂隙内へのDsbDαのドッキング後の、明らかにされているDsbCおよびDsbC-DsbDα相互作用の結晶構造を示す。図４は、E. coliペリプラズムにおける種々のDsbフォールダーゼによって触媒されるジスルフィド結合形成のモデルを示す。図５は、E. coli細胞質におけるチオレドキシンおよびグルタレドキシン経路を示す。図６は、pET32aベクター（Novagen）のマップを示す。図７は、インテグリンαvβ3結合ポケット内へのトリメスタチン（trimestatin）単量体ディスインテグリンのドッキング後の、推定されるトリメスタチン-受容体相互作用を示す。図８は、種々のTrx融合コンストラクトで形質転換したOrigami B (DE3) pLysS E. coliホストから回収した総可溶性タンパク質画分（TPF）のSDS-PAGEクマシー染色したゲルを示す。図９は、ビクロスタチン（VN）、rCNコンストラクト、および野生型CNによるADP-誘導型血小板凝集の阻害を示す。図１０は、固定化したフィブロネクチン（Fn）またはビトロネクチン（Vn）へのMDA-MB-435乳ガン細胞接着の阻害を示す。図１１は、人工基底膜を通したMDA-MB-435乳ガン細胞の浸潤の阻害を示す。図１２は、野生型CNおよびビクロスタチン（VN）含有リポソーム（それぞれLCNまたはLVN）投与後のマウス異種移植片モデルにおけるMDA-MB-435腫瘍の増殖を示す。図１３は、CNおよびVN含有リポソームで処理した異種移植マウスからから採取したMDA-MB-435腫瘍からの組織切片のCD31免疫染色で示されるCNおよびVNの抗新生効果を示す。図１４は、野生型CNおよびVNのMALDI-TOF質量分析を示す。図１５は、野生型CNおよびVNの電子スプレーイオン化（ESI）質量分析を示す。図１６は、E. coliにおけるコドン使用の概要を表に示す。図１７は、種々の生物における最も使用頻度の低いコドン８つを示す。図１８Ａは、野生型CN配列を示す。図１８Ｂは、CGGの全ておよびACAのほとんどを置換した後の野生型CN遺伝子配列を示す。図１９は、pCDFDuet-1ベクター（Novagen）のマップを示す。

Claims

原核生物ホスト細胞において、その生体活性のために複数の鎖間または鎖内ジスルフィド架橋の形成を必要とする真核生物タンパク質を発現させる方法であって、
ａ）チオレドキシンをコードするN-末端セグメント、およびその生体活性のために少なくとも２つの鎖内または鎖間ジスルフィド架橋の形成を必要する真核生物タンパク質をコードするC-末端セグメントを含む融合タンパク質をコードする発現ベクターで原核ホスト細胞を形質転換し；そして
ｂ）生物学的に活性な形態で該チオレドキシンに融合した該真核生物タンパク質を発現させる
ことを含む上記方法。
ホスト細胞が、細胞の細胞質においてジスルフィド異性化酵素（DsbC）を発現するように改変されている、請求項１記載の方法。
DsbCがSEQ ID NO: 3に示す配列を有する、請求項２記載の方法。
DsbCが、その活性部位配列CGYCをCGFCまたはCTFCに変更するよう改変されている、請求項２記載の方法。
ホスト細胞が、細胞質においてチオールジスルフィド交換タンパク質（DsbD）α-ドメインフラグメントを発現するように改変されている、請求項１記載の方法。
DsbD α-ドメインがSEQ ID NO: 4に示す配列を有する、請求項５記載の方法。
ホスト細胞が、細胞質においてチオールジスルフィド交換タンパク質（DsbD）α-ドメインフラグメントを発現するように改変されている、請求項２記載の方法。
DsbDα-ドメインがSEQ ID NO: 4に示す配列を有する、請求項７記載の方法。
融合タンパク質のチオレドキシン部分が原核ホストと同じ型の生物由来である、請求項１記載の方法。
融合タンパク質のチオレドキシン部分がSEQ ID NO: 1に示す配列を有する、請求項１記載の方法。
融合タンパク質のチオレドキシン部分が活性部位配列としてCPYCを含有する、請求項１記載の方法。
融合タンパク質のチオレドキシン部分が活性部位配列としてCGPCを含有する、請求項１記載の方法。
ホストが、チオレドキシン還元酵素（trxB）、グルタチオン還元酵素（gor）、ompT、またはlon遺伝子産物のうちの任意の１つ以上を欠失している、請求項１記載の方法。
切断部位をコードする配列が、チオレドキシンをコードする配列と真核生物タンパク質をコードする配列との間に位置する、請求項１記載の方法。
切断部位がタンパク質分解に感受性である、請求項１４記載の方法。
切断部位が、ENLYFQGまたはENLYFQSから成る群から選択される配列を有するTEV切断部位である、請求項１５記載の方法。
切断部位が化学切断に感受性である、請求項１４記載の方法。
切断部位の配列がアミノ酸配列DPを有する、請求項１７記載の方法。
融合タンパク質が受容体のリガンドであるペプチド配列を含む、請求項１記載の方法。
ペプチド配列がポリヒスチジン配列を含む、請求項１９記載の方法。
ホストが細菌である、請求項１記載の方法。
細菌がE. coliである、請求項２１記載の方法。
E. coliがOrigami株である、請求項２２記載の方法。
真核生物タンパク質がディスインテグリンである、請求項１記載の方法。
ディスインテグリンが、PI、PII、またはIIIクラスから成る群から選択されるヘビ毒液毒素である、請求項２４記載の方法。
ディスインテグリンがコントートロスタチンである、請求項２４記載の方法。
ディスインテグリンが、そのC-末端にインテグリン結合性ドメインをコードする配列を含有する、請求項２４記載の方法。
該インテグリンが、インテグリンαIIbβ3、αvβ3、αvβ5、およびα5β1から成る群から選択される、請求項２７記載の方法。
該配列がHKGPATである、請求項２７記載の方法。
真核生物タンパク質がディスインテグリンドメインを含む、請求項１記載の方法。
真核生物タンパク質が、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、成長因子、免疫グロブリン、毒素、およびプラスミノーゲン活性化因子から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
真核生物タンパク質がハララギン、ディスインテグリンチスタチン、ヘビメタロプロテイナーゼフィブロラーゼ、ヒトインターロイキン-2前駆体、ヒトインターフェロン-γ、ヒトトランスフォーミング増殖因子ベータ-2、ヒト肝臓発現ケモカイン、CCL16、オメガ-コノトキシンCVID前駆体、サソリクロロトキシン、ヒトADAM 9前駆体、ヒト血管内皮増殖因子A（VEGF-A）、およびヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子前駆体（t-PA）から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
真核生物タンパク質が多量体である、請求項１記載の方法。
真核生物タンパク質が単量体である、請求項１記載の方法。
原核ホスト細胞においてディスインテグリンを発現させる方法であって、
ａ）チオレドキシンをコードするN-末端セグメントおよびディスインテグリンをコードするC-末端セグメントを含有する融合タンパク質をコードする発現ベクターで原核ホスト細胞を形質転換し；そして
ｂ）該ディスインテグリンに融合した該真核生物タンパク質を発現させる
ことを含む上記方法。
ホスト細胞が、細胞の細胞質においてジスルフィド異性化酵素（DsbC）を発現するように改変されている、請求項３５記載の方法。
DsbCがSEQ ID NO: 3に示す配列を有する、請求項３６記載の方法。
DsbCが、その活性部位配列CGYCをCGFCまたはCTFCに変更するよう改変されている、請求項３６記載の方法。
ホスト細胞が、細胞質においてチオールジスルフィド交換タンパク質（DsbD）α-ドメインフラグメントを発現するように改変されている、請求項３５記載の方法。
DsbD α-ドメインがSEQ ID NO: 4に示す配列を有する、請求項３９記載の方法。
ホスト細胞が、細胞質においてチオールジスルフィド交換タンパク質（DsbD）α-ドメインフラグメントを発現するように改変されている、請求項３５記載の方法。
DsbD α-ドメインがSEQ ID NO: 4に示す配列を有する、請求項４１記載の方法。
融合タンパク質のチオレドキシン部分がSEQ ID NO: 1に示す配列を有する、請求項３５記載の方法。
ホストが、チオレドキシン還元酵素（trxB）、グルタチオン還元酵素（gor）、ompT、またはlon遺伝子産物のうちの任意の１つ以上を欠失している、請求項３５記載の方法。
切断部位をコードする配列が、チオレドキシンをコードする配列と真核生物タンパク質をコードする配列との間に位置する、請求項３５記載の方法。
融合タンパク質が受容体のリガンドであるペプチド配列を更に含む、請求項３５記載の方法。
ディスインテグリンが、PI、PII、またはIIIクラスから成る群から選択されるヘビ毒液毒素である、請求項３５記載の方法。
ディスインテグリンがコントートロスタチンである、請求項３５記載の方法。
ディスインテグリンが、そのC-末端にインテグリン結合性ドメインをコードする配列を含む、請求項４８記載の方法。
該配列がHKGPATである、請求項４９記載の方法。
真核生物タンパク質がディスインテグリンドメインを含む、請求項３５記載の方法。
真核生物タンパク質が単量体として発現される、請求項３５記載の方法。
融合タンパク質が少なくとも1-3mg/Lのレベルで発現される、請求項３５記載の方法。
融合タンパク質が少なくとも7-9mg/Lのレベルで発現される、請求項３５記載の方法。
ディスインテグリンまたはディスインテグリンドメインにとって外来であるC-末端配列を含み、該C-末端配列が機能性インテグリン結合性ループをコードする、単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメイン。
該インテグリンがαIIbβ3である、請求項５５記載の単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメイン。
該インテグリン結合性ループC-末端配列がHKGPATを含む、請求項５５記載の単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメイン。
該インテグリン結合性ループが少なくとも1つの分子内ジスルフィド架橋によって安定化される、請求項５５記載の単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメイン。
該単量体ディスインテグリンまたはディスインテグリンドメインがコントートロスタチン由来である、請求項５５記載の単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメイン。
該単量体ディスインテグリンまたはディスインテグリンドメインがSEQ ID NO: 2に示すアミノ酸配列を含む、請求項５９記載の単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメイン。
ビクロスタチン（SEQ ID NO: 5）である、請求項５５記載の単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメイン。
実質的に精製されている、請求項５５記載の単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメイン。
αIIbβ3、αvβ3、αvβ5、またはα5β1から成る群から選択される１つ以上のインテグリンに特異的なインテグリン受容体を発現する細胞と、αIIbβ3、αvβ3、αvβ5、またはα5β1から成る群から選択される１つ以上のインテグリンとの間の結合を阻害する方法であって、細胞を請求項５５記載の単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメインと接触させることを含む方法。
該インテグリン受容体がビクロネクチン受容体である、請求項６３記載の方法。
インビボでの血小板凝集、細胞増殖、細胞接着、転移、または血管新生を阻害する方法であって、そのような治療を必要とする個体に有効量の請求項５５記載の単量体ディスインテグリンまたは単量体ディスインテグリンドメインを投与することを含む方法。
請求項１記載の方法によって得られる形質転換された原核生物ホスト。
請求項２４記載の形質転換された細胞から得られる融合タンパク質。