JP2008501364A - 機能的に連結されたｒｇｇ遺伝子及びｇｔｆｇプロモーターを含む発現系 - Google Patents
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Abstract
ストレプトコッカス・ゴルドニー、その他のストレプトコッカス株、及びその他の細菌によるＣ−リピート領域（ＣＲＲ）の産生を増強するために使用され得るプラスミドに基づく発現系が提供される。この系は、常在性の大腸菌又はストレプトコッカスのシャトルプラスミドｐＶＡ８３８からのＣＲＲの合成及び分泌を駆動するため、正の調節遺伝子ｒｇｇと組み合わせられたｇｔｆＧのプロモーター及び分泌シグナル配列を利用する。大腸菌から単離されたこのプラスミドは、Ｓ．ゴルドニーに容易に導入され、至適条件下で、分泌されるタンパク質の濃度を、表面タンパク質発現系（ＳＰＥＸ）による産生と比べてほぼ１０倍増加させた。
Description
（配列表の参照）
添付の配列表は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。
添付の配列表は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。
大腸菌（Escherichia coli）に基づく発現系は、異種タンパク質産物の作製のために広く使用されている。しかしながら、これらの発現系は、大腸菌タンパク質分解酵素による分解に対して感受性であるか、封入体内に発現されるか、又は許容されないほど低いレベルで産生される、特定のタンパク質の作製にとっては限られた有用性を保有している。従って、タンパク質の天然の生物学的活性を維持しており、容易に多量に入手される組換えタンパク質を作製する必要性が残っている。
多数の態様の中でも特に、異種のタンパク質及びポリペプチドの発現を増強するために常在性プラスミドが利用される新規の発現系が、本発明において提供される。一つの例において、異種抗原ＢＨ４ＸＣＲＲがＳ．ゴルドニー（gordonii）において発現される。この系を使用する場合、例えば、調節遺伝子ｒｇｇが、ＢＨ４ＸＣＲＲの発現を誘導するために利用され、ＢＨ４ＸＣＲＲ構造遺伝子のＧＴＦ分泌シグナル配列との融合により、分泌が促進される。従って、ｒｇｇ遺伝子（調節遺伝子）の産物が、次に、調節される遺伝子ＧＴＦを調節する。また、タンパク質の産生を許容し、その精製を促進する既知組成培地も提供される。
ＰＬＥＸ系は、大腸菌において発現された場合に大部分が分解される完全なタンパク質産物ＢＨ４ＸＣＲＲの発現のために有用であることが判明した（実施例１参照）。ＰＬＥＸは、大腸菌による発現が困難な他の異種タンパク質産物の作製のための、用途の広い系である。ＰＬＥＸはＳＰＥＸ発現系と適合性であるため、個々のタンパク質又は複数のタンパク質を発現させるために、両方の系が単一のクローンにおいて利用され得る。ＰＬＥＸは、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Streptococcus gordonii）の表面における異種抗原の発現のための有用なツールとしても役立ち、それは、次いで、例えばワクチンベクターとして使用され得る。他の細菌の種及び株も使用され得る。
機能的に連結されたｒｇｇ遺伝子、ｇｔｆＧプロモーター、及び目的のポリペプチドをコードする核酸を含む核酸が、本発明において提供される；目的のポリペプチドは、合成された場合、目的のポリペプチド及びＧＴＦシグナル配列の融合タンパク質である。目的のポリペプチドは、さらに、目的のポリペプチドのカルボキシ末端にアミノ酸配列ＬＰＸＴＧ（配列番号：２４）を含み得る。遺伝子、ｇｔｆＧプロモーター、及び／又はＧＴＦシグナル配列は、好ましくはストレプトコッカスに由来するが、別の細菌株に由来してもよい。好ましい細菌はＳ．ゴルドニーである。目的のポリペプチドには、抗原、抗体、抗体の免疫原性断片、酵素、又は本明細書に記載されたその他の任意のタンパク質が含まれ、低分子ペプチド及び薬学的薬剤も含まれ得るが、これらに限定されない。好ましい目的のポリペプチドは、ＢＨ４ＸＣＲＲと表記されるもの、及び免疫原性薬学的組成物（例えば、ワクチン）において使用され得るその他のポリペプチドである。好ましくは、調節遺伝子（ｒｇｇ遺伝子）は、ＧＴＦシグナル配列と同一の生物に由来する。例えば、ｒｇｇ遺伝子及びＧＴＦシグナル配列の両方が、Ｓ．ゴルドニー又は他のストレプトコッカスに由来するであろう。しかしながら、一つの種の調節遺伝子ｒｇｇ遺伝子が、例えば、他の細菌種の密接に関連したＧＴＦシグナル配列に適合し得ることも企図される。
免疫原性薬学的組成物において使用される場合、好ましくは、組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤等を含有している。免疫応答を強化することを目的とした薬学的組成物の形態の場合、組成物は、さらにアジュバントを含み得る。
目的のポリペプチドをコードする核酸の部分は、精製ポリペプチドをコードする第二の配列をさらに含み得る。例えば、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及び赤血球凝集素（ＨＡ）などの精製を補助するタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、精製ポリペプチドは、目的のタンパク質が精製ポリペプチドから切断され得るよう、切断可能なドメインを含む。精製及び／又は検出を促進するために使用され得るその他の配列には、ＢＨ４ＸＣＲＲ配列のカルボキシ末端に融合されるであろう６Ｘ−ヒスチジンタグ及びフラグ（Flag）タグが含まれるが、これらに限定されない。
別の態様は、ベクターに機能的に組み込まれた目的の核酸を有する。これらのベクターは、エッシェリヒア（Escherichia）及び／又はストレプトコッカスのレプリコンなどの適当なレプリコンをさらに含み得る。好ましいレプリコンは、例えば大腸菌からの回収可能なＤＮＡの量を増強するために、より高いプラスミドコピー数を提供するものであり得る。プラスミドコピー数を増加させることにより、各細胞の中の産生関連遺伝子の数の最大化の結果として、相応じて異種産物の量が増加する。
ベクターは、一つまたはそれ以上のポリリンカー及び／又は抗生物質選択遺伝子をさらに含み得る。好ましいポリリンカーは、一つまたはそれ以上のＫｐｎＩ及び／又はＥｃｏＲＩの制限部位を有し得るプラスミドへの異種遺伝子及び／又は融合遺伝子のクローニングを促進するため、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩの制限部位の間に挿入されるであろう。ベクターは、宿主細胞における複製及びポリペプチド発現が可能である。適当な抗生物質遺伝子には、クロラムフェニコール（既に存在しているのでなければ、エリスロマイシン）、カナマイシン（例えば、ネオマイシン）、テトラサイクリン（ｔｅｔR）、アンピシリン（ＡｍｐR）、及び／又はカルベニシリンが含まれ得る。
本発明の別の態様は、宿主細胞において形質転換又はトランスフェクトされた発現可能なベクターを有する。形質転換のための好ましい生物には、エッシェリヒア、ストレプトコッカス、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）の細菌、特に、大腸菌、Ｓ．ゴルドニー、Ｌ．ラクチス（lactis）、及びラクトバチルス種が含まれる。さらなる態様において、宿主細胞は、表面タンパク質発現（ＳＰＥＸ）ベクターにより共形質転換又はコトランスフェクトされ得る。共形質転換／コトランスフェクトされた、とは、ＳＰＥＸベクター及びＰＬＥＸベクターを含むベクターが同時に挿入された宿主細胞、又は一つのベクターがまず挿入され、続いて第二のベクターがトランスフェクトされた宿主細胞を意味する。
別の態様は、目的のポリペプチドの精製を企図する。ポリペプチドは、培養された宿主細胞の上清から精製され得る。又は、目的のポリペプチドがＬＰＸＴＧ（配列番号：２４）アンカリングモチーフを発現する場合、目的のポリペプチドは、抗原として使用するため細胞壁と組み合わせて収集され得る。好ましくは、目的のポリペプチドは実質的に精製されたポリペプチドである。実質的に精製された、とは、タンパク質がＰＡＧＥを介して分離された場合、ゲルのクーマシー染色の後に、目的のタンパク質のみが観察されることを意味する。
さらに、別の態様は、
（ａ）目的のポリペプチドをコードする請求項１の核酸をベクターと機能的に連結すること；
（ｂ）ベクターを宿主細胞に挿入すること；
（ｃ）目的のポリペプチドが合成される条件の下で核酸を発現する宿主細胞を培養すること；及び
（ｄ）目的のポリペプチドを単離し精製すること
を含む、宿主細胞において目的の異種ポリペプチドを合成する方法を企図する。
（ａ）目的のポリペプチドをコードする請求項１の核酸をベクターと機能的に連結すること；
（ｂ）ベクターを宿主細胞に挿入すること；
（ｃ）目的のポリペプチドが合成される条件の下で核酸を発現する宿主細胞を培養すること；及び
（ｄ）目的のポリペプチドを単離し精製すること
を含む、宿主細胞において目的の異種ポリペプチドを合成する方法を企図する。
本法は、任意の宿主細胞を使用し得るが、好ましくは、宿主細胞はストレプトコッカス又はエッシェリヒア、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、及びラクトバチルスの宿主細胞である。本法は、第二の目的のポリペプチドを含む表面タンパク質発現（ＳＰＥＸ）ベクターにより宿主細胞を共形質転換又はコトランスフェクトする工程をさらに含み得る。
図面は例示的なものに過ぎず、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
プラスミド由来発現（PLasmid-borne EXpression）（ＰＬＥＸ）系は、異種タンパク質産物の産生のために有用な技術である。これは、特定の内因性遺伝子及び異種遺伝子並びに目的のポリペプチドを発現する核酸を、適当なプラスミドベクターに挿入することにより達成され；次いで、ベクターはグラム陽性菌Ｓ．ゴルドニーに形質転換される。産生を促進する特定の挿入された配列、及び常在性プラスミド上へのそれらの配置の両方により、本発明は、独特のものとして、以前に確立された発現系から区別される。
典型的なインビトロ培養条件を使用した増殖の間、Ｓ．ゴルドニーは、培養上清に１７２ｋＤａのグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）を分泌する。正の調節遺伝子ｒｇｇは、Ｓ．ゴルドニーにおいて同定された。プラスミド補完（plasmid complementation）法を使用してｒｇｇが過剰発現された場合、ｒｇｇ遺伝子は培養上清中のＧＴＦ活性を増強する。
三つの遺伝因子――ｒｇｇ、ｇｔｆＧの部分、及び異種遺伝子配列が、目的の異種遺伝子産物の産生及び分泌のために必要とされる。異種遺伝子産物の発現は、ｇｔｆＧのための内因性プロモーターにより駆動される。ｇｔｆＧプロモーターからの発現は、Ｒｇｇにより正に調節される。産物の分泌は、異種産物のＧＴＦシグナル配列との融合により促進される。
これらの遺伝因子は、本発明の目的のため、適切なプラスミドへ挿入された。この役割のため選択されたプラスミドは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から公に入手可能なｐＶＡ８３８である。このプラスミドを本願にとって適当なものにするその特徴には、遺伝材料の挿入のためのクローニング部位、形質転換体の検出のための抗生物質耐性マーカーの存在、並びに大腸菌及びストレプトコッカス両方のレプリコンの存在が含まれる。別のプラスミドベクターも利用され得る。また、付加的なクローニング部位を含む因子（ポリリンカー）、カラーセレクションのためのカセット、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール）、異なるポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７及びＴ４）、並びに精製のために使用される迅速なカラム精製及びその後のタンパク質の切断を可能にする付加的な融合タンパク質配列のための核酸を含むが、これらに限定されない、付加的な遺伝因子が、上記の三つの遺伝因子を含むベクター又はカセットに挿入されてもよい。
ＰＬＥＸ系は、標準的な分子生物学技術並びに伝統的な微生物学的実験装置及び試薬と共に容易に利用され得る。
ＰＬＥＸ系は、最も比較可能な既知の発現系である、表面タンパク質発現（Surface Protein Expression）（ＳＰＥＸ）系に比べて、モデルタンパク質ＢＨ４ＸＣＲＲの発現において増強されたレベルを保有している。ＳＰＥＸ系は、米国特許第５，８２１，０８８号に詳細に記載されており、その内容は、参照により全ての目的のため完全に本明細書に組み込まれる。ＰＬＥＸ発現系は、以前に同定された至適増殖条件を使用して細菌が培養された場合、ＳＰＥＸと比べて、ほぼ１０倍の量のモデル産物ＢＨ４ＸＣＲＲを培養上清中に分泌すると推定された。ＰＬＥＸ系を使用した場合の培養上清中のＢＨ４ＸＣＲＲの濃度は、以前に精製されたＢＨ４ＸＣＲＲ標準濃度との比較により１０ｍｇ／Ｌと推定された。
ＰＬＥＸ系は、さらに、従来の大腸菌発現系に関連したある種の限界を克服する。従来の大腸菌発現系は、封入体内に発現される産物、大腸菌タンパク質分解酵素の基質となる産物、又はその細菌による高レベルの発現を示し得ないものを含む、特定の遺伝子産物を発現する能力に関して限界がある。さらに、大腸菌により発現されたタンパク質産物が免疫学的に使用すべきものである場合、非意図的に目的のタンパク質産物と共に共精製される少量の内毒素が研究を複雑にし得るため、問題が生じる。ＰＬＥＸ系の使用は、内毒素を含有していないグラム陽性菌によりタンパク質が産生されるため、これらの問題を排除する。
ＰＬＥＸ系の適用は、Ｓ．ゴルドニーなどの細菌共生ベクターを使用して、抗原の発現を含むよう容易に拡張され得る。Ｓ．ゴルドニーなどの共生ベクターは、表面発現された異種抗原に対する免疫学的応答を生成させるために使用され得る。ＰＬＥＸを使用した場合、異種産物のＣ末端へのＬＰＸＴＧ（配列番号：２４）アンカリングモチーフの付加により、異種タンパク質は、分泌されるのではなく、Ｓ．ゴルドニーなどの共生ベクターの表面に固定され得る。さらに、Ｓ．ゴルドニーなどの共生ベクターを、複数のＰＬＥＸ系プラスミドで形質転換することにより、複数の抗原が分泌型分子又は固定型分子のいずれかとして発現され得る。
ＢＨ４ＸＣＲＲと名付けられた連鎖球菌サブユニットワクチン候補を作製するために、大腸菌発現ベクターを使用するための材料及び方法も、本明細書に記載される。ＢＨ４ＸＣＲＲは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（pyogenes）Ｍ６タンパク質由来の４個のＣ−リピート領域から構成されたおよそ４５ｋＤａの抗原である（図１）。これらの試みは、ＢＨ４ＸＣＲＲが、大腸菌において発現された場合、分解に対して感受性であることを示した。しかしながら、それは、表面タンパク質発現（ＳＰＥＸ）系を使用すれば、グラム陽性Ｓ．ゴルドニーにより完全な形態で発現され分泌され得る。
ＳＰＥＸを使用した場合、Ｓ．ゴルドニー染色体に相同的な領域、及びＳ．ピオゲネス由来のｅｍｍ６．１遺伝子に相当する領域が構造遺伝子に隣接するよう、ｂｈ４ｘｃｒｒなどの異種構造遺伝子が、（機能的に連結された）プラスミドｐＳＭＢ１０４にクローニングされる（Myscofski et al.,1998 Protein Expression and Purification 14:409-417）。相同的な隣接領域は、Ｐ２プロモーターの下流への構造遺伝子の染色体組み込みを促進し、Ｓ．ピオゲネスＭ６タンパク質のＮ末端領域の１６アミノ酸（ａａ）との異種遺伝子の融合は、分泌シグナル配列を提供する。ＳＰＥＸ系は、Ｓ．ピオゲネスＭ６タンパク質の誘導体（Myscofski et al.,2000 Protein Expression & Purification 20:112-123）、マウスサイトカインＩＦＮ−γ及びＩＬ−２（Byrd et al.,2002 Vaccine 20:2197-2205）、並びにブドウ球菌ヌクレアーゼＡ（Dutton et al.,2000 Protein Expression & Purification 19:158-172）を含む多数の異種タンパク質の作製のため、成功裡に使用されている。しかしながら、ＳＰＥＸ系からのＢＨ４ＸＣＲＲの収率は、例えば、タンパク質の発現が低いこと及び非効率的なタンパク質の回収法のため、意図された適用にとって不十分であった。
典型的なインビトロ培養条件、即ち、酵母抽出物を含むトッドヒューイット（Todd Hewitt）ブロス（ＴＨＹ）又はブレインハートインフュージョン（Brain Heart Infusion）（ＢＨＩ）ブロスを使用した増殖において、Ｓ．ゴルドニーは、培養上清中に１７２ｋＤａの酵素グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）を分泌する。この酵素は、歯表面上の微生物バイオフィルムのインビボ形成において重要な役割を果たし得るグルカンポリマーをショ糖から合成する（Vickerman et al.,2002 Infection & Immunity 70:1703-1714； and Vickerman et al.,1997 Applied & Environmental Microbiol.63:1667-1673）。ｇｔｆＧの直ぐ上流に位置する遺伝子ｒｇｇの突然変異誘発は、有意に減少したＧＴＦ活性をもたらし、このことから、ｒｇｇの可能性のある調節性の役割が示唆された（Sulavik et al.,1992 J.Bacteriol.174:3577-3586）。調節メカニズムについての調査は、Ｒｇｇが、ｇｔｆＧの転写及び翻訳の両方を増強するよう作用し得ることを示唆している（Vickerman et al.,1997 Applied & Environmental Microbiol.63:1667-1673）。Ｒｇｇの構造的な予測は、ＤＮＡ結合タンパク質を暗示するヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフの存在を示唆している（Bateman et al.,2000 Nuc.Acids Res.28:399-406）。Ｒｇｇとｒｇｇの３’領域に位置する配列との間の相互作用は、ＧＴＦプロモーターにおける転写活性を促進し得る（Sulavik et al.,1992 J.Bacteriol.174:3577-3586；及びVickerman et al.,2003 Microbiology 149:399-406）。Ｒｇｇは、多シストロン性のｒｇｇ／ｇｔｆＧ ｍＲＮＡ上のｇｔｆＧリボソーム結合部位を隔離している予測されたヘアピン−ループ二次構造を融解することにより、ＧＴＦの翻訳を増強し得るのかもしれない（Sulavik et al.,1992 J.Bacteriol.174:3577-3586）。プラスミド補完を使用してＳ．ゴルドニーにおいて過剰発現された場合、Ｒｇｇは、およそ６倍、培養上清中のＧＴＦ活性のレベルを増強した（Sulavik et al.,1992）。
ＰＬＥＸの系は、目的の異種ポリペプチドを発現する手段として、ｇｔｆＧプロモーターにおける活性を増強するＲｇｇの相互作用を利用する。ＰＬＥＸは、Ｓ．ゴルドニーにより分泌型又は表面固定型の異種産物を作製するために使用され得る。この系を使用して、ｇｔｆＧプロモーターから目的の構造遺伝子の発現を誘導するために、調節遺伝子ｒｇｇがプラスミドに組み込まれる。産物の分泌は、構造遺伝子のＧＴＦ分泌シグナル配列との融合により促進される。また、分泌された産物の迅速かつ効率的な精製を促進する特有の培養条件の組み合わせも記載される。Ｓ．ゴルドニーの表面上の異種産物の発現は、Ｓ．ピオゲネスＭタンパク質に由来するアンカリング配列と異種産物を融合させることにより達成される。さらに、Ｓ．ゴルドニーの表面における複数の異種抗原の発現のためのＰＬＥＸ系の使用が、本明細書に記載される。
本明細書に記載された発現系は、酵素、免疫原性調製物の調製において使用するための抗原、シグナリングタンパク質等を含む、病原体に由来する任意の目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。好ましくは、その発現は、ストレプトコッカス株、特にＳ．ゴルドニーにおいて行われる。好ましい目的のタンパク質は、分泌されるか、又はそれらが由来する生物の表面上に発現されるタンパク質である。
発現系は、組換えにより作製されたタンパク質の培養培地からの容易な収集のため、タンパク質を培養培地に直接発現させるためにも利用され得る。目的のタンパク質には、抗原、酵素、表面発現タンパク質、真核生物由来タンパク質、ポリペプチド断片、医薬品、抗体（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2等のような抗体の断片）、及び免疫原性ポリペプチドが含まれ得る。
別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。以下の用語は下に提供される。
「実質的に精製された」とは、ポリペプチド又は核酸の８０％以上が同一である、精製されたポリペプチド又は核酸を意味する。例えば、実質的に精製されたポリペプチドは、別の核酸から合成された他のポリペプチド夾雑物を有していないであろう。
本明細書に提供されるような略号及び定義は、別途示されない限り、当技術分野において受け入れられているものである。本明細書において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、前後関係により明白に否定されない限り、複数の指示対象が含まれる。従って、例えば、「患者（a patient）」との言及には、複数の患者が含まれ、「投薬量（the dosage）」との言及には、一つ又は複数の投薬量及び当業者に公知のそれらの等価物の言及が含まれる、等である。
略号
Ａｂ 抗体
ＢＨＩ ブレインハートインフュージョンブロス
ＣＡＡ カザミノ酸
ＣＤＭ 既知組成培地
ＣｍR クロラムフェニコール耐性
ＣＲＲ Ｃ−リピート領域
ＣＳＰ （一つ又は複数の）コンピテンス刺激ペプチド
ＣＶ カラム容量
ｄＨ2Ｏ 蒸留水
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ
ＧＳＴ グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ
ＧＴＦ グルコシルトランスフェラーゼ
ＨＡ 赤血球凝集素
ＩＦＮ−γ インターフェロンガンマ
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ（ガンマ）
ＩＬ−２ インターロイキン−２
ｋｂｐ キロ塩基対
ｋＤａ キロダルトン
ＬＢ ルリア（Luria）−ベルターニ（Bertani）ブロス
ｍＡｂ モノクローナル抗体
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＬＥＸ プラスミド由来発現系
ＰＶＤＦ ポリビニリデンフルオライド（膜）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＰＥＸ 表面タンパク質発現系
ＴＨＹ 酵母抽出物を含むトッドヒューイットブロス
(実施例)
略号
Ａｂ 抗体
ＢＨＩ ブレインハートインフュージョンブロス
ＣＡＡ カザミノ酸
ＣＤＭ 既知組成培地
ＣｍR クロラムフェニコール耐性
ＣＲＲ Ｃ−リピート領域
ＣＳＰ （一つ又は複数の）コンピテンス刺激ペプチド
ＣＶ カラム容量
ｄＨ2Ｏ 蒸留水
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ
ＧＳＴ グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ
ＧＴＦ グルコシルトランスフェラーゼ
ＨＡ 赤血球凝集素
ＩＦＮ−γ インターフェロンガンマ
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ（ガンマ）
ＩＬ−２ インターロイキン−２
ｋｂｐ キロ塩基対
ｋＤａ キロダルトン
ＬＢ ルリア（Luria）−ベルターニ（Bertani）ブロス
ｍＡｂ モノクローナル抗体
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＬＥＸ プラスミド由来発現系
ＰＶＤＦ ポリビニリデンフルオライド（膜）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＰＥＸ 表面タンパク質発現系
ＴＨＹ 酵母抽出物を含むトッドヒューイットブロス
(実施例)
本発明は、以下の実施例に関して詳細に記載されているが、本明細書に開示された組成物及び方法の精神から逸脱することなく、様々な修飾がなされ得ることが理解される。
異種産物の分泌
Ｓ．ピオゲネス由来のＭ−タンパク質Ｃ−リピート領域（ＣＲＲ）においてモデル化されたおよそ４５ｋＤａのタンパク質産物（ＢＨ４ＸＣＲＲと表記される）を発現させることにより、ＰＬＥＸ系の機能性を試験した。図２は、ＢＨ４ＸＣＲＲタンパク質の産生を促進するためのプラスミド上に置かれた際の、ｒｇｇ、ｇｔｆＧ、及びｂｈ４ｘｃｒｒコーディング配列の配置及び整列を詳細に示している。
細菌株及び増殖条件。大腸菌株は、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス（ディフコ（Difco）、デトロイト（Detroit）、ＭＩ）中又はＬＢ寒天（ディフコ）上で増殖させた。Ｓ．ゴルドニーは、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）（ディフコ）中又は１．５％寒天を含有しているＢＨＩ上で増殖させた。タンパク質産生のため、Ｓ．ゴルドニーを、５％カザミノ酸（ＣＡＡ）（フィッシャーサイエンティフィック（Fisher Scientific）、ピッツバーグ（Pittsburgh）、ＰＡ）を含有している既知組成培地（ＣＤＭ）（ＪＲＨバイオサイエンシーズ（Biosciences）、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）において培養した。抗生物質耐性決定因子を保持している株の選択及び増殖は、大腸菌株については２５μｇクロラムフェニコール／ｍＬで、Ｓ．ゴルドニーについては５μｇエリスロマイシン／ｍＬで実施した。
Ｓ．ピオゲネス由来のＭ−タンパク質Ｃ−リピート領域（ＣＲＲ）においてモデル化されたおよそ４５ｋＤａのタンパク質産物（ＢＨ４ＸＣＲＲと表記される）を発現させることにより、ＰＬＥＸ系の機能性を試験した。図２は、ＢＨ４ＸＣＲＲタンパク質の産生を促進するためのプラスミド上に置かれた際の、ｒｇｇ、ｇｔｆＧ、及びｂｈ４ｘｃｒｒコーディング配列の配置及び整列を詳細に示している。
細菌株及び増殖条件。大腸菌株は、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス（ディフコ（Difco）、デトロイト（Detroit）、ＭＩ）中又はＬＢ寒天（ディフコ）上で増殖させた。Ｓ．ゴルドニーは、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）（ディフコ）中又は１．５％寒天を含有しているＢＨＩ上で増殖させた。タンパク質産生のため、Ｓ．ゴルドニーを、５％カザミノ酸（ＣＡＡ）（フィッシャーサイエンティフィック（Fisher Scientific）、ピッツバーグ（Pittsburgh）、ＰＡ）を含有している既知組成培地（ＣＤＭ）（ＪＲＨバイオサイエンシーズ（Biosciences）、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）において培養した。抗生物質耐性決定因子を保持している株の選択及び増殖は、大腸菌株については２５μｇクロラムフェニコール／ｍＬで、Ｓ．ゴルドニーについては５μｇエリスロマイシン／ｍＬで実施した。
ＤＮＡの単離及び操作。ＤＮＡの調製及び操作においては、標準的な分子生物学的技術に従った。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ（インビトロジェン（Invitrogen）（Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ））にクローニングし、製造業者の手法を使用して、大腸菌ＩｎｖαＦ’（インビトロジェン）に形質転換した。プラスミドは、キアゲン（Qiagen）精製キット（Valencia,CA）を使用して、大腸菌株から単離した。エンドヌクレアーゼによる消化の後、ＤＮＡ断片を電気泳動により分離し、キアクイックゲル抽出キット（QIAquick Gel Extraction Kit）（キアゲン）を使用してアガロースゲルから溶出させた。全ての制限エンドヌクレアーゼは、ニューイングランドバイオラブズ（New England Biolabs）（ビバリー（Beverely）、ＭＡ）から入手した。
プラスミドｐＶＡ８３８。大腸菌ストレプトコッカスシャトルプラスミドｐＶＡ８３８は、以前に特徴決定されており（Macrina et al.,1982 Gene 19:345-353）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手された大腸菌から単離した。ｐＶＡ８３８は、大腸菌に形質転換した場合、クロラムフェニコール及びエリスロマイシンに対する耐性を賦与する。Ｓ．ゴルドニーにおいては、ｐＶＡ８３８は、エリスロマイシン耐性のみを提供する。
ｒｇｇ／ｇｔｆＧの増幅。プライマー（順方向プライマーＴＷ３ ５’−ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴＧＡＣＧＧＡＧＡＴＴＡＧ−３’（配列番号：４）及び逆方向プライマーＴＷ４ ５’−ＣＣＧＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＧＡＣＴＧＴＴＣ−３’（配列番号：５））を、Ｓ．ゴルドニーチャリス（Challis）染色体を鋳型として使用した１．３ｋｂｐ産物の増幅のため設計した。これらのプライマーは、ｒｇｇにおいて公表されている配列及びｇｔｆＧ（ジェンバンク（GenBank）登録番号：Ｍ８９７７６）の５’領域に基づき設計した。ＴＷ３は、ｒｇｇ配列の５’末端にＢａｍＨＩ制限部位を導入した。ＴＷ３及び逆方向プライマーを使用したＰＣＲは、ｇｔｆＧ配列の３’末端にＫｐｎＩ制限部位を生成させた。
ＢＨ４ＸＣＲＲの設計及び増幅。ＢＨ４ＸＣＲＲは、Ｓ．ピオゲネス由来のＭタンパク質の保存されたＣ−リピート領域（ＣＲＲ）においてモデル化された４個の同一ドメインを含有している（図１）。各ＣＲＲセグメントは、７０アミノ酸を含有している。分子のＮ末端、及び各ＣＲＲセグメント間には、７アミノ酸スペーサーが存在し、それらは、各々異なるアミノ酸配列を有しているが、分子のアルファ−ヘリックスコイルド−コイル性を維持するために適切な配列内容を有している（Phillips et al.,1981 Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 78:4689-4693）。６残基ヒスチジンタグは、精製オプションを拡張するという最初の意図により、Ｃ末端に含めた。さらに、各セグメントのアミノ酸配列を同一に維持しながら、各ＣＲＲセグメントのヌクレオチド配列をできる限り改変させた。最後に、コドン使用頻度をＳ．ゴルドニーにおける発現のため至適化した。遺伝子は、ブルーヘロンバイオテクノロジー（Blue Heron Biotechnology）（Bothell,WA）により合成され、精製されたプラスミドの中のインサートとして供給された。このプラスミドを鋳型として使用して、ｂｈ４ｘｃｒｒ構造遺伝子を増幅するため、順方向プライマーＴＷ５（５’−ＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＡＣＡＡＧＡＧＴＴＡＧＡＣＧＡＧＧＧ−３’、配列番号：６）及び逆方向プライマーＴＷ６（５’−ＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＧ−３’、配列番号：７）を用いてＰＣＲを実施した。ｂｈ４ｘｃｒｒの増幅は、ｇｔｆＧ分泌シグナル配列とのインフレームの融合を促進するための２個の付加的なヌクレオチドと共に、５’末端にＫｐｎＩ制限部位が導入されるよう実施された。ｂｈ４ｘｃｒｒの３’末端にＳｐｈＩ制限部位及び終止コドンを導入するためにもＰＣＲ増幅を使用した。
ｐＬＥＸ１．０：ｂｈ４ｘｃｒｒの構築。クローニングのため、ｒｇｇ／ｇｔｆＧインサートを含有しているｐＣＲ２．１を、まずＫｐｎＩにより、次いでＢａｍＨＩにより、連続的に消化した。ＫｐｎＩによる消化は、３７℃で５時間、製造業者により推奨された試薬を使用して実施した。塩化ナトリウムを５０ｍＭに調整し、ＢａｍＨＩを、さらに５時間、反応物に添加した。アガロースゲル電気泳動を使用してＤＮＡ断片を分離し、１．３ｋｂｐバンドを切り出し、アガロースマトリックスから抽出し、さらに使用するまで−２０℃で保管した。
３７℃で３時間、製造業者により示されたプロトコルに従って、ＳｐｈＩ及びＫｐｎＩによる同時二重消化を利用して、ｂｈ４ｘｃｒｒコーディング配列をｐＣＲ２．１から切り出した。１ｋｂｐ ＤＮＡ断片を電気泳動を使用して分離した。このバンドを切り出し、アガロースマトリックスから抽出し、後に使用するため−２０℃で保管した。
プラスミドｐＶＡ８３８を、３７℃で４時間、製造業者により推奨された反応条件に従ってＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩの制限酵素を使用して、同時に消化した。およそ１０ｋｂｐのＤＮＡ断片を電気泳動後にゲルから切り出し、抽出し、−２０℃で保管した。
ｂｈ４ｘｃｒｒ及びｒｇｇ／ｇｔｆＧ断片を三重ライゲーション反応においてＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで消化されたｐＶＡ８３８にクローニングした。消化されたＤＮＡを、５：５：１ ｂｈ４ｘｃｒｒ：ｒｇｇ／ｇｔｆＧ：ｐＶＡ８３８の量比で反応物に添加した。ライゲーションは、製造業者により示された反応条件を使用して、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（プロメガ（Promega）（Madison,WI））と１３℃で一晩インキュベーションすることにより達成された。ライゲーション産物を直ちに大腸菌のＩｎｖαＦ’株に形質転換した。ｐＶＡ８３８：ｒｇｇ／ｇｔｆＧ／ｂｈ４ｘｃｒｒを保持している形質転換体を、クロラムフェニコール耐性コロニーから選択した。さらなる選択は、適切なサイズの１１．５ｋｂプラスミドの単離、並びに鋳型としての単離されたプラスミド及びプライマーＴＷ３及びＴＷ６を使用したＰＣＲに基づいていた。インサートのＤＮＡ配列は、配列決定プライマーＴＷ７（５’−ＧＣＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧ−３’；配列番号：８）、ＴＷ８（５’−ＣＴＴＧＴＧＧＣＴＣＣＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧ−３’；配列番号：９）、及びＴＷ９（５’−ＧＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＡＣＴＴＧＡＣＣＧＣ−３’；配列番号：１０）を使用して確認した。そのプラスミド構築物を、ｐＬＥＸ１．０：ｂｈ４ｘｃｒｒ（図２参照；配列番号：１）と名付けた。
精製されたｐＬＥＸ１．０：ｂｈ４ｘｃｒｒを、以前に確立された形質転換法（Pozzi et al.,1990 Res.Microbiol.141:659-670）を使用して、Ｓ．ゴルドニーＧＰ２５１に導入した。簡単に説明すると、Ｓ．ゴルドニーを、コンピテンスを誘導するため１０％ウシ胎仔血清の存在下でＢＨＩで増殖させ、４５０μｌずつに分割して−８０℃で保管した。プラスミドｐＬＥＸ１．０：ｂｈ４ｘｃｒｒを、３７℃で２時間、新鮮に解凍されたコンピテント細胞と共にインキュベートした。この培養物を、５％脱繊維素ヒツジ血液を含有している液状ＢＨＩ寒天と混合し、ＢＨＩ寒天に重層した。短時間、この層を凝結させた後、５μｇエリスロマイシン／ｍＬを含有している液状ＢＨＩ寒天をプレートに慎重に注入した。３７℃で４８時間の増殖の後に選択されたコロニーを、耐性をさらに確認するため、および純粋なクローンの選択のため、５μｇエリスロマイシン／ｍＬを含有しているＢＨＩ寒天に画線した。３７℃で５μｇエリスロマイシン／ｍＬを含有しているＢＨＩで一晩増殖させた後、培養上清中のＢＨ４ＸＣＲＲのウェスタンブロットを使用した検出に基づき、形質転換体を確認した。
電気泳動及びウェスタンブロット。Ｓ．ゴルドニー培養上清中のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離した。ゲルを、クーマシーブリリアントブルーを使用して染色するか、又はポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。膜を３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によりブロッキングした。抗体を、０．５％トゥイーン（Tween）２０、０．０２％ナトリウムアジド、０．５Ｍナトリウムクロライド、及び０．０１Ｍトリス（Tris）（ｐＨ８．２）を含有している緩衝液で希釈した。膜を、２μｇ／ｍＬの濃度のＳ．ピオゲネスのＭ−タンパク質Ｃ−リピート領域に見出されるエピトープに特異的なｍＡｂ １０Ｆ５（Jones et al,1986 J.Exp.Med.164:1226-1238）及び１：１０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ ＡＰコンジュゲート抗体（バイオラド（BioRad）（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を使用して探索した。ブロットを、０．０６Ｍトリス、０．０２％ナトリウムアジド、０．０６％マグネシウムクロライド６水和物（ｐＨ９．８）を含有している緩衝液で希釈されたＡＰコンジュゲート基質キット（バイオラド）を使用して現像した。
Ｓ．ゴルドニーの形質転換の後、エリスロマイシン耐性コロニーを、ＢＨＩブロスで３７℃で一晩増殖させた。全ての培養物は、エリスロマイシンを含有しているＣＤＭ／ＣＡＡで逆希釈（back-diluted）し、静止期（ｄＨ2Ｏでの１：５希釈後、ＯＤ650＝０．４５）に達するまで、各培養物の光学濃度をモニタリングした。培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥのため調製し、ＢＨ４ＸＣＲＲをウェスタンブロットにより可視化した（図３）。ＢＨ４ＸＣＲＲを分泌するＳＰＥＸ株から試料を培養し、加工して、これらの２つの発現系の産生レベルの比較が許容されるようにした。ｐＬＥＸ１．０：ｂｈ４ｘｃｒｒ形質転換Ｓ．ゴルドニー１０個のうち８個の培養上清中に、完全なＢＨ４ＸＣＲＲが検出され、全ての形質転換体における産生が、ＳＰＥＸ株における産生に比べて増強されていた（図３）。単一のｐＬＥＸ１．０：ｂｈ４ｘｃｒｒ形質転換Ｓ．ゴルドニーの培養物を保持し、ＳＲＬ４４と名付けた。
ＢＨ４ＸＣＲＲは、ｍＡｂ １０Ｆ５により探索されたウェスタンブロットを使用して、培養上清中に容易に検出され得たが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、培養上清中のＢＨ４ＸＣＲＲ濃度を定量化するための多数のアプローチは不成功であった。別法として、ウェスタンブロットを使用して、ＳＲＬ４４培養上清中のＢＨ４ＸＣＲＲバンド強度を、段階希釈された、以前に精製された、ＳＰＥＸ系により産生されたＢＨ４ＸＣＲＲのものと比較した（図４）。バンド強度を濃度測定を使用して定量化し、その値から回帰直線を計算した。この評価から、ＢＨ４ＸＣＲＲが、ＳＲＬ４４により、１０ｍｇ／Ｌの濃度で培地中へ分泌されたことが決定された。
異種産物ＢＨ４ＸＣＲＲの産生及び精製
ＳＲＬ４４の凍結ストック（−８０℃）を使用して、５μｇエリスロマイシン／ｍＬを含有している１０ｍＬのＢＨＩに接種し、この培養物を３７℃で一晩インキュベートした。それを５％ＣＡＡ及び５μｇエリスロマイシン／ｍＬが補足された１Ｌの濾過滅菌されたＣＤＭで逆希釈し、静止型３７℃インキュベーターにおいてＯＤ650＝０．４５（ｄＨ2Ｏで１：５希釈；ｄＨ2Ｏによるブランクを差し引いたもの）になるまで増殖させた。細胞を遠心分離によりペレット化し、上清を０．４５μｍのカットオフを有するフィルターユニットを使用して濾過した。疎水性相互作用クロマトグラフィの準備のため、（ＮＨ4）2ＳＯ4を１．５Ｍの濃度で上清に添加し、沈殿物を除去するために上清を再び濾過した。５カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．０）によりストリッピングされ、５ＣＶの５０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4／１．５Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4（ｐＨ７．０）により平衡化された５ｍＬのハイトラップブチル（HiTrap Butyl）ＦＦカラム（アマシャムバイオサイエンシーズ（Amersham BioSciences）（Piscataway,NJ））に、その上清を負荷した。試料が負荷された後、カラムを、１０ＣＶの５０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4／１．５Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4（ｐＨ７．０）により洗浄した。１．５から０Ｍへの１０ＣＶの（ＮＨ4）2ＳＯ4勾配を使用してタンパク質を溶出させ、２ｍＬ画分を収集した。全ての工程は、５ｍＬ／分の流速で実施した。この手法の有効性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で画分を泳動することにより評価し、タンパク質をクーマシーブリリアントブルーによる染色により可視化した（図５）。試料がほぼ完全にカラムに負荷された際に採取された素通りの試料にはＢＨ４ＸＣＲＲは検出されず、このことから、産物が上清から効率的に抽出されたことが示唆された。ＢＨ４ＸＣＲＲは、限られた数の画分においてカラムから溶出し、単一の暗く染色された４５ｋＤａのバンドとして表され、このことから、それがこの加工工程中に主に完全なままであったことが示唆された。さらに、ＢＨ４ＸＣＲＲは、勾配溶出においてＳ．ゴルドニーにより分泌された多数のその他のタンパク質から分離された。
ＳＲＬ４４の凍結ストック（−８０℃）を使用して、５μｇエリスロマイシン／ｍＬを含有している１０ｍＬのＢＨＩに接種し、この培養物を３７℃で一晩インキュベートした。それを５％ＣＡＡ及び５μｇエリスロマイシン／ｍＬが補足された１Ｌの濾過滅菌されたＣＤＭで逆希釈し、静止型３７℃インキュベーターにおいてＯＤ650＝０．４５（ｄＨ2Ｏで１：５希釈；ｄＨ2Ｏによるブランクを差し引いたもの）になるまで増殖させた。細胞を遠心分離によりペレット化し、上清を０．４５μｍのカットオフを有するフィルターユニットを使用して濾過した。疎水性相互作用クロマトグラフィの準備のため、（ＮＨ4）2ＳＯ4を１．５Ｍの濃度で上清に添加し、沈殿物を除去するために上清を再び濾過した。５カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．０）によりストリッピングされ、５ＣＶの５０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4／１．５Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4（ｐＨ７．０）により平衡化された５ｍＬのハイトラップブチル（HiTrap Butyl）ＦＦカラム（アマシャムバイオサイエンシーズ（Amersham BioSciences）（Piscataway,NJ））に、その上清を負荷した。試料が負荷された後、カラムを、１０ＣＶの５０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4／１．５Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4（ｐＨ７．０）により洗浄した。１．５から０Ｍへの１０ＣＶの（ＮＨ4）2ＳＯ4勾配を使用してタンパク質を溶出させ、２ｍＬ画分を収集した。全ての工程は、５ｍＬ／分の流速で実施した。この手法の有効性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で画分を泳動することにより評価し、タンパク質をクーマシーブリリアントブルーによる染色により可視化した（図５）。試料がほぼ完全にカラムに負荷された際に採取された素通りの試料にはＢＨ４ＸＣＲＲは検出されず、このことから、産物が上清から効率的に抽出されたことが示唆された。ＢＨ４ＸＣＲＲは、限られた数の画分においてカラムから溶出し、単一の暗く染色された４５ｋＤａのバンドとして表され、このことから、それがこの加工工程中に主に完全なままであったことが示唆された。さらに、ＢＨ４ＸＣＲＲは、勾配溶出においてＳ．ゴルドニーにより分泌された多数のその他のタンパク質から分離された。
この一次清浄化の後、ゲル濾過クロマトグラフィを使用して、さらにＢＨ４ＸＣＲＲを精製した。ＢＨ４ＸＣＲＲを含有している疎水性相互作用分離からの画分をプールし、（ＮＨ4）2ＳＯ4の６０％飽和溶液を使用してタンパク質を沈殿させた。沈殿物をペレット化し、５０ｍＭクエン酸（ｐＨ２．８）に再溶解させ、平衡化されたハイプレップ（HiPrep）１６／６０セファクリル（Sephacryl）Ｓ−３００カラム（アマシャム）に負荷した。ＢＨ４ＸＣＲＲは、試料が負荷された後４０〜７５分後に溶出した画分において、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で可視化されたが、主に５０〜６５分の間に収集された４つの５ｍＬ画分に溶出した（図６）。これらの画分は、検出不可能な量の夾雑タンパク質を含有していた。６０及び６５分に溶出された画分においては、主要なＢＨ４ＸＣＲＲバンドの下に、弱いバンド生成パターンが観察された。このバンド生成パターンは、微量のＢＨ４ＸＣＲＲの分解を暗示しており、これらのバンドの反応性は、ｍＡｂ １０Ｆ５により探索されたウェスタンブロットを使用して確認された。
１ＬのＳＲＬ４４培養上清からのＢＨ４ＸＣＲＲの精製のために使用された方法が、下記表１に提供される。工程は、表示された順序で行われる。
ＰＬＥＸプラスミドを使用した固定型異種産物の発現
ＳＰＥＸ系に関連した遺伝学を使用して、グラム陽性アンカリングモチーフを含有しているＳ．ピオゲネスＭ−タンパク質由来のＣ末端領域と構造異種遺伝子を融合させることにより、異種遺伝子産物をＳ．ゴルドニーの細胞壁に固定することができる（Myscofski et al.,1998 Protein Expression & Purification 14:409-17）。このアンカリング配列をＰＬＥＸ発現プラスミドへ組み込むことにより、ＰＬＥＸ発現系を使用して、ワクシニアウイルス抗原Ａ２７ＬをＳ．ゴルドニーの表面上に発現させた。
ＳＰＥＸ系に関連した遺伝学を使用して、グラム陽性アンカリングモチーフを含有しているＳ．ピオゲネスＭ−タンパク質由来のＣ末端領域と構造異種遺伝子を融合させることにより、異種遺伝子産物をＳ．ゴルドニーの細胞壁に固定することができる（Myscofski et al.,1998 Protein Expression & Purification 14:409-17）。このアンカリング配列をＰＬＥＸ発現プラスミドへ組み込むことにより、ＰＬＥＸ発現系を使用して、ワクシニアウイルス抗原Ａ２７ＬをＳ．ゴルドニーの表面上に発現させた。
ｐＬＥＸ１．１：ｂｈ４ｘｃｒｒの構築。ｒｇｇ／ｇｔｆＧ配列の機能性を保持しながら、クローニング目的のための、プラスミド上の付加的なＥｃｏＲＩ部位の使用を促進するため、ｒｇｇの３’領域内に位置するＥｃｏＲＩ部位の部位特異的突然変異により、プラスミドｐＬＥＸ１．１：ｂｈ４ｘｃｒｒを作製した。部位特異的突然変異誘発は、製造業者のプロトコルに従ってクイックチェンジ（QuickChange）ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン（Stratagene）（La JoIIa,CA））を使用して実施した。鋳型としてのｐＬＥＸ１．０：ｂｈ４ｘｃｒｒ並びにプライマーＥｃｏＲＩ−Ｆ（５’−ＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＴＴＴＧＡＧＣＧＡＡＴＣＣＡＡＣＴＡＡＣＡＧＴ−３’；配列番号：１１）及びＥｃｏＲＩ−Ｒ（５’−ＴＣＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴＡＧＴＴＧＧＡＴＴＣＧＣＴＣＡＡＡＴ−３’；配列番号：１２）を使用して、サイレントＴ８６０Ｃヌクレオチド突然変異をｒｇｇに導入した。親プラスミドをＤｐｎＩを使用して消化し、産物を大腸菌ＸＬ−１０ゴールド（Gold）細胞（ストラタジーン）に形質転換した。ＥｃｏＲＩが消化反応中にバンドを切除し得ないことを確認することにより、エリスロマイシン耐性クローンを突然変異の存在に関してスクリーニングした。その後、突然変異をさらに確認するため、このプラスミドを配列決定した。そのプラスミド構築物をｐＬＥＸ１．１：ｂｈ４ｘｃｒｒと名付けた。
ｐＬＥＸ１．１：ａ２７ｌ（ａ）の構築。ワクシニアウイルスコペンハーゲン（Copenhagen）Ａ２７Ｌ（ｐ１４）タンパク質をコードする遺伝子を、プライマー５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＧＡＡＣＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣ−３’（配列番号：１３）及び５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＴＡＴＧＧＡＴＣＴＧＡＡＣ−３’（配列番号：１４）（下線付きの配列は、それぞれ、プライマーへ組み込まれたＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩの制限部位を示す）並びに鋳型としてのワクシニアウイルスコペンハーゲンＤＮＡを使用したＰＣＲにより作製した。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１（インビトロジェン）にサブクローニングし、プラスミドｐＣＲ２．１：Ａ２７Ｌを形成させた。制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩによるプラスミドｐＣＲ２．１：Ａ２７Ｌのその後の消化により、２８６ｂｐ断片が生じ、それをＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩにより消化されたＳＰＥＸクローニングベクターｐＳＭＢ１０４とライゲートさせた。このようなライゲーションは、終止コドンを欠くａ２７ｌ構造遺伝子を、Ｓ．ピオゲネスＭ６タンパク質由来のアンカリング領域の直ぐ上流にインフレームで位置付けた。この固定型のａ２７ｌ遺伝子をａ２７ｌ（ａ）と名付けた。ｐＳＭＢ１０４：ａ２７ｌ（ａ）のＡ２７Ｌをコードする領域のＤＮＡ配列を、配列決定により確認した。ｐＳＭＢ１０４：ａ２７ｌ（ａ）を鋳型として使用して、順方向プライマーＬＢ３７（５’−ＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＧＡＡＣＴＣＴＴＴＴＣ−３’；配列番号：１５）及び逆方向プライマーＭＬ１１（５’−ＣＧＧＣＣＧＴＣＧＣＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＧＴＴＡ−３’；配列番号：１６）を使用して、ＫｐｎＩ及びＮｒｕＩの制限部位が隣接しているａ２７ｌ（ａ）遺伝子を保有しているＰＣＲ産物を作製した。この産物をＫｐｎＩ及びＮｒｕＩにより消化し、１．０ｋｂｐバンドを単離した。ｂｈ４ｘｃｒｒ遺伝子を切り出すため、ｐＬＥＸ１．１：ｂｈ４ｘｃｒｒをＫｐｎＩ及びＮｒｕＩにより消化した。この反応物から単離された９．８ｋｂｐバンドを、１．０ｋｂｐのＫｐｎＩ及びＮｒｕＩにより消化されたＰＣＲ産物とライゲートさせ、挿入された領域の配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。ｐＬＥＸ１．１：ａ２７ｌ（ａ）と名付けられたこのプラスミドの配列（配列番号：２）。
Ｓ．ゴルドニー（ＧＰ２５１株）を、合成コンピテンス刺激ペプチド（ＣＳＰ）Ｎ−ＤＶＲＳＮＫＩＲＬＷＷＥＮＩＦＦＮＫＫ−ＣＯＯＨ（配列番号：２５）を使用して、ｐＬＥＸ１．１：ａ２７ｌ（ａ）により形質転換した。簡単に説明すると、ＧＰ２５１を、５μｇクロラムフェニコール／ｍＬを含有しているＢＨＩで一晩増殖させた。形質転換のための細胞を調製するため、ＣＳＰ（１０μｇ／ｍＬ最終濃度）及びグリセロール（１０％最終濃度）を培養物に添加し、細胞を１００μＬずつに分割して−８０℃で凍結させた。Ｓ．ゴルドニーを形質転換するため、細胞を迅速に解凍し、１μｇ ＤＮＡ及び９００μＬ ＴＨＹを添加した。細胞を３７℃で３時間インキュベートし、５μｇエリスロマイシン／ｍＬを含有しているＢＨＩ寒天に播種した。
エリスロマイシン耐性形質転換体の選択の後、フローサイトメトリー分析を使用して、Ｓ．ゴルドニーの表面上のＡ２７Ｌの存在を評価した。Ｓ．ゴルドニー株ＧＰ２５１、ＳＲＬ２１（ＳＰＥＸ系を使用して、表面上にＡ２７Ｌを発現している）、及びｐＬＥＸ１．１：ａ２７ｌ（ａ）形質転換クローン（ＳＲＬ４５と名付けた）を、ＯＤ650＝０．５になるまで増殖させた。細胞を抗ワクシニアウイルスウサギ血清と共にインキュベートした。次いで、細胞をＦＩＴＣコンジュゲート抗ウサギ抗体（Ａｂ）を使用して標識し、１０，０００粒子の蛍光強度をベックマンコールター（Beckman Coulter）ＦＣ５００フローサイトメーターを使用して定量化した（図７）。親Ｓ．ゴルドニー株ＧＰ２５１は、低いバックグラウンドレベルの蛍光を示した（平均蛍光チャンネル（ＭＦＣ）＝２．３）。より大きな蛍光チャンネルへの実質的なシフトが、ＳＲＬ２１（ＭＦＣ＝１３．３）及びＳＲＬ４５（ＭＦＣ＝２３．２）の両方について観察された。これらの所見は、ウイルス抗原Ａ２７Ｌが、ＰＬＥＸ系を使用して、ＳＲＬ４５の表面上に成功裡に発現され固定されたことを示唆している。
考察。複数の異種産物が、大腸菌を使用して成功裡に産生されているため、連鎖球菌ワクチン候補ＢＨ４ＸＣＲＲの作製を、最初は、この細菌を使用して試みた。ＢＨ４ＸＣＲＲは大腸菌を使用して発現され得るが、本発明者らは、産物の実質的な分解を観察した。この例は、発現ベクターとしての大腸菌の使用に関連した限界を強調している。大腸菌を使用して特定の産物を作製する試みは、不十分な発現、不溶性タンパク質の封入体への発現、又は完全な形態で産物を発現する能力の欠如をもたらし得る。微量のリポ多糖（ＬＰＳ）が存在する可能性があることによる付加的な問題が、発現ベクターとして大腸菌を使用することから生じる。ＬＰＳは、所望の産物と共に非意図的に共精製され得る強力な毒素であり免疫刺激物質である。
グラム陽性菌Ｓ．ゴルドニーは、ＢＨ４ＸＣＲＲなどのＳ．ピオゲネスＭタンパク質の誘導体を含む多数の異種産物を発現させるために使用されている。ＳＰＥＸ系を使用した場合、異種配列が染色体に組み込まれ、産生がネイティブのＰ２プロモーターから駆動される。分泌は、Ｓ．ピオゲネス由来のｅｍｍ６．１遺伝子に由来する分泌シグナル配列との産物の融合により達成される。ＳＰＥＸ系は、特定の抗原の産生に大いに成功し、ＢＨ４ＸＣＲＲを作製する最初の試みは、特に完全な産物の発現に関して有望であった。しかしながら、ＢＨ４ＸＣＲＲの収率は、意図された適用にとって十分ではなかった。従って、ＰＬＥＸが、増強された発現系として開発された。
アプローチに役立ったのは、Ｓ．ゴルドニーが、多様な培養条件下で、ある高分子量タンパク質を分泌するという観察であった。このタンパク質は、培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において主要なタンパク質バンドとして規則的に検出された。Ｎ末端配列分析は、このタンパク質が、１７２ｋＤａグルコシルトランスフェラーゼ又はＧＴＦであることを明らかにした。ＧＴＦは、Ｒｇｇにより、転写レベルにおいても翻訳レベルにおいても、正に調節される。実際、プラスミド補完を使用したＲｇｇの過剰発現は、ほぼ６倍、ＧＴＦ活性をアップレギュレートする。
本明細書に記載された発現系は、ｇｔｆＧプロモーターからＢＨ４ＸＣＲＲ又はその他の目的のタンパク質もしくはポリペプチドの発現を駆動するために設計された。ｇｔｆＧプロモーターにおける活性を増強し、かつ翻訳を増強するために、ｇｔｆＧの正の調節剤Ｒｇｇのコーディング領域を含めた。産物の分泌は、ＧＴＦ分泌シグナル配列のｂｈ４ｘｃｒｒ構造遺伝子との融合により達成された。ＢＨ４ＸＣＲＲは、これらの遺伝子の複数のコピーが、増強された産生を促進するであろうという予想により、プラスミドから発現させるために選択した。Ｓ．ゴルドニーは、プラスミドｐＶＡ８３８：ｒｇｇ／ｇｔｆＧ／ｂｈ４ｘｃｒｒにより容易に形質転換され、形質転換体による完全なＢＨ４ＸＣＲＲの発現がウェスタンブロットを使用して確認された。５％ＣＡＡが補足されたＣＤＭにおける形質転換体ＳＲＬ４４の増殖の後、分泌された産物は、１０ｍｇ／Ｌの濃度で培養上清中に検出された。この培地におけるＳＲＬ４４の増殖は、疎水性相互作用クロマトグラフィの後のゲル濾過を含む二段階過程を使用した迅速な精製を促進する。ＢＨ４ＸＣＲＲの最小の分解が、この精製手法の後、観察された。
Ｓ．ゴルドニーの表面への複数の異種産物のアンカリング
Ｓ．ゴルドニーによるワクシニアウイルス抗原Ｂ５Ｒの表面発現。ＳＰＥＸ系を使用して、切断型のワクシニアウイルス抗原Ｂ５Ｒを発現させるため、ＳＲＬ３９株をＳ．ゴルドニーＧＰ２５１株から作出した。順方向プライマーＬＢ７（５’−ＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴＡＣＣＣＡＣＴＡＴＧＡＡＴＡＡＣ（配列番号：１７）、下線付きの領域はＫｐｎＩ制限部位をコードする）及び逆方向プライマーＬＢ９（５’−ＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＧＡＴＴＣＴＡＴＴＴＣ（配列番号：１８）；下線付きの領域はＳａｌＩ制限部位をコードする）並びに鋳型としてのワクシニアウイルスコペンハーゲンＤＮＡを使用して、Ｂ５Ｒアミノ酸２２〜２７６のコーディング配列を含有しているＰＣＲ産物を作製した。この産物をｐＣＲ２．１にサブクローニングしてｐＣＲ２．１：Ｂ５ＲΔを作製し、それをＫｐｎＩ及びＳａｌＩにより消化した。７６８ｂｐ断片を単離し、ＫｐｎＩ及びＳａｌＩにより消化されたｐＳＭＢ１０４とライゲートさせ、ｐＳＲＬ３９を作製した。Ｂ５ＲΔの配列を、配列決定により確認した。Ｓ．ゴルドニーＧＰ２５１株をｐＳＲＬ３９により形質転換した。形質転換体をエリスロマイシン耐性に基づきスクリーニングし、Ｂ５ＲΔ遺伝子構築物の存在を確認するためにＰＣＲを実施した。単一のクローンを保持し、ＳＲＬ３９と名付けた。
Ｓ．ゴルドニーによるワクシニアウイルス抗原Ｂ５Ｒの表面発現。ＳＰＥＸ系を使用して、切断型のワクシニアウイルス抗原Ｂ５Ｒを発現させるため、ＳＲＬ３９株をＳ．ゴルドニーＧＰ２５１株から作出した。順方向プライマーＬＢ７（５’−ＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴＡＣＣＣＡＣＴＡＴＧＡＡＴＡＡＣ（配列番号：１７）、下線付きの領域はＫｐｎＩ制限部位をコードする）及び逆方向プライマーＬＢ９（５’−ＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＧＣＴＴＣＴＡＡＣＧＡＴＴＣＴＡＴＴＴＣ（配列番号：１８）；下線付きの領域はＳａｌＩ制限部位をコードする）並びに鋳型としてのワクシニアウイルスコペンハーゲンＤＮＡを使用して、Ｂ５Ｒアミノ酸２２〜２７６のコーディング配列を含有しているＰＣＲ産物を作製した。この産物をｐＣＲ２．１にサブクローニングしてｐＣＲ２．１：Ｂ５ＲΔを作製し、それをＫｐｎＩ及びＳａｌＩにより消化した。７６８ｂｐ断片を単離し、ＫｐｎＩ及びＳａｌＩにより消化されたｐＳＭＢ１０４とライゲートさせ、ｐＳＲＬ３９を作製した。Ｂ５ＲΔの配列を、配列決定により確認した。Ｓ．ゴルドニーＧＰ２５１株をｐＳＲＬ３９により形質転換した。形質転換体をエリスロマイシン耐性に基づきスクリーニングし、Ｂ５ＲΔ遺伝子構築物の存在を確認するためにＰＣＲを実施した。単一のクローンを保持し、ＳＲＬ３９と名付けた。
Ｂ５Ｒの表面発現を評価するため、ＧＰ２５１及びＳＲＬ３９をＯＤ650＝０．５になるまで増殖させた。ウサギ抗ワクシニアウイルス血清とのインキュベーションの後、吸着されたウサギ抗体を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ウサギＩｇＧを使用して検出した。１０，０００粒子に関連した蛍光を記録し、結果を図８に提示した。本発明者らは、ＳＲＬ３９試料について、ＧＰ２５１と比較してより高い蛍光チャンネルへの実質的なシフトを観察した。これらの所見は、予想と一致しており、Ｂ５ＲがＳ．ゴルドニーＳＲＬ３９株の表面上に発現していることを示唆している。
ｐＬＥＸ１．３：ａ２７ｌ（ａ）の構築。Ｓ．ゴルドニーの表面上に複数の異種抗原を発現させるため、ワクシニアウイルスタンパク質Ｂ５Ｒを固定型産物として発現するＳ．ゴルドニーＳＲＬ３９株を、Ａ２７Ｌの遺伝子を保持しているｐＬＥＸプラスミドにより形質転換した。受容株は、既にエリスロマイシンに対する耐性を保有していたため、エリスロマイシン選択を使用してｐＬＥＸ１．１：ａ２７ｌ（ａ）形質転換ＳＲＬ３９クローンをスクリーニングすることは不可能であった。従って、クロラムフェニコール耐性（ＣｍR）を賦与するために、ｐＬＥＸ１．１：ａ２７ｌ（ａ）を修飾した。
鋳型としてのｐＡＭ４０１並びにプライマーＭＬ１６（５’−ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＡＴ ＴＴＧ ＴＡＡ ＴＴＡ ＡＧＡ ＡＧＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＴＡＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＣＴ ＴＴＴ ＡＡＴ ＡＴＴ ＡＴＴ ＧＡＡ ＴＴＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＴＧＧ−３’；配列番号：１９）及びＭＬ１７（５’−ＣＣＡ ＡＡＴ ＴＴＡ ＣＡＡ ＡＡＧ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＴＡ ＧＡＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＣＴＡ ＡＡＴ ＣＣＡ ＡＴＣ ＡＴＣ ＴＡＣ ＣＣＴ ＡＴＧ−３’、配列番号：２０）を使用して、クロラムフェニコール耐性遺伝子をPCRにより増幅した。各プライマーの３’領域は、ｐＡＭ４０１のＣｍR遺伝子との相同性を保有しており、５’配列は、エリスロマイシン耐性を賦与する遺伝子に隣接するｐＬＥＸ１．１：ａ２７ｌ（ａ）の領域に相同である。ＰＣＲ反応物からの７２０ｂｐ産物を、ｐＬＥＸ１．１：ａ２７ｌ（ａ）を鋳型として使用したＰＣＲ反応を開始させるために使用した。この反応物からの産物を、親プラスミドを除去するためにＤｐｎＩにより消化し、大腸菌ＸＬ−１０ゴールド株に形質転換した。形質転換体をクロラムフェニコール耐性及びエリスロマイシンに対する感受性に基づきスクリーニングした。ｐＬＥＸ１．１：ａ２７ｌ（ａ）上のエリスロマイシン耐性遺伝子の置換を、ＤＮＡ配列決定により確認した。このプラスミド構築物を、ｐＬＥＸ１．３：ａ２７ｌ（ａ）（配列番号：３）と名付けた。
ｐＬＥＸ１．３：ａ２７ｌ（ａ）によるＳＲＬ３９の形質転換。Ｓ．ゴルドニーＳＲＬ３９株におけるＢ５Ｒ発現を確認した後、この株をｐＬＥＸ１．３：ａ２７ｌ（ａ）により形質転換することにより、付加的なワクシニアウイルス抗原Ａ２７Ｌを発現させた。プラスミド取り込みを促進するためのＣＳＰを使用して、ｐＬＥＸ１．３：ａ２７ｌ（ａ）をＳＲＬ３９へ導入した。形質転換体をクロラムフェニコール耐性に関してスクリーニングした。選択されたクローンの表面上のＡ２７Ｌの存在を、フローサイトメトリー分析を使用して評価した。ＧＰ２５１、ＳＲＬ２１、及び新たに獲得されたクローン（ＳＲＬ４６と名付けられた）を、Ａ２７Ｌに対して開発されたマウスモノクローナル抗体（ジェイフーパー博士（Dr.Jay Hooper）（USAMRIID,Fort Detrick,Maryland）より提供された）と共にインキュベートし、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用して分析のため標識した。１０，０００粒子の蛍光強度を、ベックマンコールターＦＣ５００フローサイトメーターを使用して、各試料について記録した。これらの分析からの分布ヒストグラムを図９に提示する。
ＧＰ２５１と比べてより大きな蛍光チャンネルへの実質的なシフトが、ＳＲＬ２１及びＳＲＬ４６両方の試料において観察された。この分析は、Ｓ．ゴルドニーのＢ５ＲΔ発現株へのｐＬＥＸ１．３：ａ２７ｌ（ａ）の導入が、付加的なワクシニアウイルス抗原Ａ２７Ｌの表面発現を促進したことを示唆している。
本願において言及された全ての引用された特許及び刊行物は、参照により全ての目的のため完全に本明細書に組み込まれる。優先権出願である２００４年５月２１日出願の米国仮出願第６０／５７２，９７４号も、参照により全ての目的のため完全に本明細書に組み込まれる。
Claims (23)
- 機能的に連結されたｒｇｇ遺伝子、ｇｔｆＧプロモーター、及び目的のポリペプチドをコードする核酸を含む核酸であって、目的のポリペプチドが、あるタンパク質とＧＴＦシグナル配列との融合タンパク質である、核酸。
- ｒｇｇ遺伝子、ｇｔｆＧプロモーター、及び／又はＧＴＦシグナル配列が、ストレプトコッカス（Streptococcus）に由来する、請求項１の核酸。
- ｒｇｇ遺伝子、ｇｔｆＧプロモーター、及びＧＴＦシグナル配列が、ストレプトコッカスに由来する、請求項２の核酸。
- ストレプトコッカスがＳ．ゴルドニー（gordonii）である、請求項２の核酸。
- 目的のポリペプチドが、抗原、抗体もしくはその断片、免疫原性ポリペプチド、薬学的薬剤、又は酵素を含む、請求項１の核酸。
- 目的のポリペプチドをコードする核酸が、目的のポリペプチドのカルボキシ末端にＬＰＸＴＧ（Ｘは任意のアミノ酸であり得る）（配列番号：２４）アンカリング・モチーフをコードする配列をさらに含む、請求項１の核酸。
- 目的のポリペプチドがＢＨ４ＸＣＲＲである、請求項１の核酸。
- 目的のポリペプチドをコードする核酸が、精製ポリペプチドをコードする核酸と機能的に接合しており、精製ポリペプチドが切断部位を含有している、請求項１の核酸。
- 請求項１の核酸を含むベクターであって、核酸が該ベクターに機能的に挿入されているベクター。
- エッシェリヒア（Escherichia）及び／又はストレプトコッカスのレプリコンを含む、請求項９のベクター。
- ポリリンカー及び／又は抗生物質選択遺伝子を含む、請求項９のベクター。
- 請求項９のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 表面タンパク質発現（ＳＰＥＸ）ベクターをさらに含む、請求項１２の宿主細胞。
- ストレプトコッカス菌、エッシェリヒア菌、ラクトコッカス（Lactococcus）菌、又はラクトバチルス（Lactobacillus）菌である、請求項１２の宿主細胞。
- ストレプトコッカス菌がＳ．ゴルドニーである、請求項１４の宿主細胞。
- 請求項１２の宿主細胞から合成された目的のポリペプチド。
- 実質的に精製された、請求項１２の宿主細胞から合成された目的のポリペプチド。
- 実質的に精製された、請求項１３の宿主細胞から合成された目的のポリペプチド。
- 実質的に精製された、請求項１５の宿主細胞から合成された目的のポリペプチド。
- 宿主細胞において目的の異種ポリペプチドを合成する方法であって、
（ａ）請求項１の核酸をベクターと機能的に連結すること；
（ｂ）ベクターを宿主細胞に挿入すること；
（ｃ）目的のポリペプチドが合成される条件の下で核酸を発現する宿主細胞を培養すること；及び
（ｄ）目的のポリペプチドを単離し精製すること
を含む方法。 - 宿主細胞がストレプトコッカス又はエッシェリヒアである、請求項２０の方法。
- 宿主細胞がＳ．ゴルドニーである、請求項２１の方法。
- 第二の目的のポリペプチドを含む表面タンパク質発現（ＳＰＥＸ）ベクターにより宿主細胞を共形質転換する工程をさらに含む、請求項２０の方法。
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