JP2008268197A - Protein-immobilized membrane, protein immobilization method, and biosensor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、タンパク質固定化膜、タンパク質の固定化方法および当該タンパク質固定化膜を用いてなるバイオセンサに関し、特に、グリセロール脱水素酵素を光架橋性樹脂層を形成させることにより被固定化部材に固定化させてなるタンパク質固定化膜、タンパク質の固定化方法および当該タンパク質固定化膜を用いてなるバイオセンサに関する。 The present invention relates to a protein immobilization membrane, a protein immobilization method, and a biosensor using the protein immobilization membrane, and in particular, glycerol dehydrogenase is formed on a member to be immobilized by forming a photocrosslinkable resin layer. The present invention relates to a protein-immobilized membrane that is immobilized, a method for immobilizing a protein, and a biosensor that uses the protein-immobilized membrane.
従来、血液や血清などの生体試料中の特定成分について、試料液の希釈や撹拌などの操作を行うことなく高精度に定量する方法として提案されているバイオセンサの構造は、絶縁性基板にリード線をそれぞれ有する白金などからなる測定極および対極を埋設し、これらの電極系の露出部分を酸化還元酵素および電子受容体を担持した多孔体で覆ったものである。試料液を多孔体上に滴下すると、多孔体中の酸化還元酵素と電子受容体が試料液に溶解し、試料液中の基質との間で酵素反応が起こり、電子受容体が還元される。酵素反応終了後、この還元された電子受容体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を求めることがなされていた（例えば、特許文献１参照）。 The structure of a biosensor that has been proposed as a method for quantifying a specific component in a biological sample such as blood or serum with high accuracy without performing operations such as dilution and stirring of the sample solution has led to an insulating substrate. A measuring electrode and a counter electrode made of platinum or the like each having a wire are embedded, and the exposed portions of these electrode systems are covered with a porous material carrying an oxidoreductase and an electron acceptor. When the sample liquid is dropped on the porous body, the oxidoreductase and electron acceptor in the porous body are dissolved in the sample liquid, an enzyme reaction occurs between the substrate in the sample liquid and the electron acceptor is reduced. After the completion of the enzyme reaction, the reduced electron acceptor is electrochemically oxidized, and the substrate concentration in the sample solution is obtained from the oxidation current value obtained at this time (see, for example, Patent Document 1).
また、上記以外の酸化還元酵素を目的部位に固定化する方法としては、次に説明するような４つのものがある（例えば、非特許文献１参照）。すなわち、第１の方法は、酸化還元酵素を含む材料液を対象物の目的部位に点着した後、材料液を乾燥させることにより対象物の目的部位に酸化還元酵素を固定化する方法である。第２の方法は、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を用いて、対象物の目的部位に酸化還元酵素を固定化する方法である。第３の方法は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などのポリマー中に酸化還元酵素を包括させた状態でポリマーとともに酸化還元酵素を固定化する方法である。第４の方法は、カーボンペーストなどの導電性成分中に酸化還元酵素を分散させたペーストを用い、このペーストを対象物の目的部位に塗りつけて酸化還元酵素を固定化する方法である。
しかしながら、このようにバイオセンサに利用する酵素の固定化方法である共有結合法、包括法等においては、多くの特許および研究報告があるが、その多くは固定化方法が煩雑で反応条件が厳しく、固定化操作により酵素活性が低下する、膜の強度が低い、使用中に膜が膨潤する等の問題点があった。 However, there are many patents and research reports on the covalent bonding method and the inclusion method, which are immobilization methods of enzymes used in biosensors, and many of them have complicated immobilization methods and severe reaction conditions. There have been problems such as a decrease in enzyme activity due to the immobilization operation, a low strength of the membrane, and a swelling of the membrane during use.
また、血液成分である血球やタンパク質が電極に吸着したり酵素反応を妨害したりすることによって、測定結果の精度に影響を与えていた。 In addition, blood cells and proteins, which are blood components, adsorb to the electrode and interfere with the enzyme reaction, thereby affecting the accuracy of the measurement results.
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、生体試料中の特定成分を容易かつ高精度に定量することのできるタンパク質固定化膜を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a protein-immobilized membrane capable of easily and accurately quantifying a specific component in a biological sample.
本発明の他の目的は、このようなタンパク質を固定化する方法を提供することである。 Another object of the present invention is to provide a method for immobilizing such proteins.
本発明の別の目的は、生体試料中の特定成分を容易かつ高精度に定量することのできるバイオセンサ、特にディスポーザブルタイプのバイオセンサを提供することである。 Another object of the present invention is to provide a biosensor, particularly a disposable biosensor, that can easily and accurately quantify a specific component in a biological sample.
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、アジド系感光基を有する光架橋性樹脂をグリセロール脱水素酵素と一体化させることによって、生体試料中の特定成分を容易かつ高精度に定量することのできるバイオセンサが製造できることを見出し、さらにこのようにして得られたバイオセンサはディスポーザブルタイプのバイオセンサにも十分適用できることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have integrated a photocrosslinkable resin having an azide-based photosensitive group with glycerol dehydrogenase, so that a specific component in a biological sample can be obtained. It has been found that a biosensor that can be quantified easily and with high accuracy can be produced, and furthermore, the biosensor obtained in this way has been found to be sufficiently applicable to a disposable biosensor, and the present invention is based on these findings. Was completed.
すなわち、上記目的は、グリセロール脱水素酵素が光架橋性樹脂層を有する被固定化部材に固定されてなることを特徴とする、タンパク質固定化膜によって達成される。 That is, the above object is achieved by a protein-immobilized membrane characterized in that glycerol dehydrogenase is immobilized on a member to be immobilized having a photocrosslinkable resin layer.
本発明の他の目的は、被固定化部材にグリセロール脱水素酵素を固定化する方法であって、前記被固定化部材に、紫外線照射により架橋するアジド系感光基を有する光架橋性樹脂、グリセロール脱水素酵素を含む光架橋性樹脂層を形成する段階、および前記光架橋性樹脂層に対して、グリセロール脱水素酵素を固定化する段階と、を有することを特徴とする、タンパク質の固定化方法によって達成される。 Another object of the present invention is a method for immobilizing glycerol dehydrogenase on an immobilization member, wherein the immobilization member is a photocrosslinkable resin having an azide-based photogroup that is crosslinked by ultraviolet irradiation, glycerol A method for immobilizing a protein, comprising: forming a photocrosslinkable resin layer containing a dehydrogenase; and immobilizing glycerol dehydrogenase on the photocrosslinkable resin layer. Achieved by:
本発明の別の目的は、本発明のタンパク質固定化膜を有するバイオセンサによって達成される。 Another object of the present invention is achieved by a biosensor having the protein-immobilized membrane of the present invention.
本発明によれば、電極系を含めたディスポーザブルタイプのバイオセンサを構成することができ、試料液を添加することにより、極めて容易に生体試料中の特定成分の基質濃度を測定することができる。 According to the present invention, a disposable biosensor including an electrode system can be configured, and the substrate concentration of a specific component in a biological sample can be measured very easily by adding a sample solution.
上記利点に加えて、反応層は電極系の表面にグリセロール脱水素酵素を光架橋性樹脂とともに水に溶解して塗布、乾燥そして紫外線を照射することで形成することができる。そして、この反応層に、試料液を滴下すると、電極の近傍で速やかにグリセロール脱水素酵素が溶けて反応し電極上に達し、測定の妨害となる試料中の血球等は光架橋性樹脂により防げるため、精度のよい測定が可能である。 In addition to the above advantages, the reaction layer can be formed on the surface of the electrode system by dissolving glycerol dehydrogenase in water together with a photocrosslinkable resin, applying it, drying it, and irradiating it with ultraviolet rays. When a sample solution is dropped into this reaction layer, glycerol dehydrogenase dissolves and reacts quickly in the vicinity of the electrode and reaches the electrode, and blood cells in the sample that interfere with the measurement can be prevented by the photocrosslinkable resin. Therefore, accurate measurement is possible.
本発明の第一は、グリセロール脱水素酵素が光架橋性樹脂層を有する被固定化部材に固定されてなることを特徴とする、タンパク質固定化膜に関するものである。 The first of the present invention relates to a protein-immobilized membrane, wherein glycerol dehydrogenase is immobilized on a member to be immobilized having a photocrosslinkable resin layer.
以下、本発明の実施の形態を説明する。 Embodiments of the present invention will be described below.
本発明において、光架橋性樹脂層は、被固定化部材に形成されてなり、光架橋性樹脂、グリセロール脱水素酵素を含む。 In the present invention, the photocrosslinkable resin layer is formed on the member to be immobilized, and contains a photocrosslinkable resin and glycerol dehydrogenase.
本発明に用いられる光架橋性樹脂は、グリセロール脱水素酵素、好ましくはグリセロール脱水素酵素および電子受容体を固定化できるものであれば特に制限されないが、アジド系感光基を有する、より好ましくは紫外線照射により架橋するアジド系感光基を有する高分子であることが好ましい。ここで、アジド系感光基を有する高分子とは、アジド基（−Ｎ３）を有する感光性化合物を意味する。このようなアジド系感光基を有する高分子としては、例えば、ビニルアルコール系化合物、ビニルピロリドン系化合物、アクリルアミド系化合物、酢酸ビニル系化合物、アクリル酸（塩）系化合物および無水マレイン酸系化合物、ならびにこれらの誘導体などの、単量体を（共）重合することによって得られる高分子にアジド系感光基がペンダントしたものなどが挙げられる。なお、本発明によるアジド系感光基を有する高分子は、アジド基を有する上記化合物／誘導体を（共）重合することによって得てもあるいは上記化合物／誘導体を（共）重合して得られた（共）重合体にアジド基を付加することによって得てもいずれでもよい。この際、上記単量体は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。すなわち、本発明で好ましく使用される光架橋性樹脂としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリル酸などが挙げられる。また、このような高分子の重合度は、特に制限されないが、平均重合度が、通常、２００〜５，０００、より好ましくは３００〜３，０００である。 The photocrosslinkable resin used in the present invention is not particularly limited as long as it can immobilize glycerol dehydrogenase, preferably glycerol dehydrogenase and an electron acceptor, but has an azide-based photosensitive group, more preferably ultraviolet light. A polymer having an azide-based photosensitive group that is cross-linked by irradiation is preferable. Here, the polymer having an azide-based photosensitive group means a photosensitive compound having an azide group (—N 3 ). Examples of such a polymer having an azide-based photosensitive group include a vinyl alcohol compound, a vinyl pyrrolidone compound, an acrylamide compound, a vinyl acetate compound, an acrylic acid (salt) compound, and a maleic anhydride compound, and Examples thereof include polymers obtained by (co) polymerizing monomers, such as these derivatives, with an azide-based photosensitive group pendant. The polymer having an azide-based photosensitive group according to the present invention may be obtained by (co) polymerizing the above compound / derivative having an azide group or (co) polymerizing the above compound / derivative ( Either may be obtained by adding an azide group to the (co) polymer. In this case, the monomers may be used alone or in the form of a mixture of two or more. That is, examples of the photocrosslinkable resin preferably used in the present invention include polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylamide, polyvinyl acetate, and polyacrylic acid. The degree of polymerization of such a polymer is not particularly limited, but the average degree of polymerization is usually 200 to 5,000, more preferably 300 to 3,000.
これらのうち、アジド基を有する芳香環を有する化合物およびその誘導体を少なくとも単量体として使用して製造される高分子がより好ましい。ここで、アジド基を有する芳香環を有する化合物とは、芳香環にアジド基が結合している化合物（即ち、−Ｐｈ−Ｎ３；Ｐｈは、フェニル基を表わす）およびその誘導体である。すなわち、このような高分子としては、例えば、ポリビニルアルコール、ビニルアルコール系化合物と上記した他の化合物との共重合体などが挙げられる。なお、光架橋性樹脂が紫外線照射により架橋するアジド系感光基を有する高分子である際の架橋反応における紫外線の照射については、紫外線照射により架橋を誘導できる波長による紫外線照射であれば特に制限されず、使用される光架橋性樹脂の種類によって適宜選択される。波長は、好ましくは３００〜４００ｎｍである。また、紫外線露光量もまた、紫外線照射により架橋を誘導できる量であれば特に制限されず、膜厚によって適宜選択することができる。好ましくは、紫外線露光量は、１０〜１０００ｍＪ／ｃｍ２、より好ましくは２０〜２００ｍＪ／ｃｍ２である。 Among these, a polymer produced by using a compound having an aromatic ring having an azido group and a derivative thereof as at least a monomer is more preferable. Here, the compound having an aromatic ring having an azide group is a compound in which an azide group is bonded to the aromatic ring (that is, -Ph-N 3 ; Ph represents a phenyl group) and derivatives thereof. That is, examples of such a polymer include polyvinyl alcohol and a copolymer of a vinyl alcohol-based compound and the above-described other compounds. The irradiation of ultraviolet rays in the crosslinking reaction when the photocrosslinkable resin is a polymer having an azide-based photosensitive group that is crosslinked by ultraviolet irradiation is particularly limited as long as it is ultraviolet irradiation with a wavelength capable of inducing crosslinking by ultraviolet irradiation. However, it is appropriately selected depending on the type of the photocrosslinkable resin used. The wavelength is preferably 300 to 400 nm. Further, the ultraviolet exposure amount is not particularly limited as long as it is an amount capable of inducing crosslinking by ultraviolet irradiation, and can be appropriately selected depending on the film thickness. Preferably, the ultraviolet exposure is 10 to 1000 mJ / cm 2 , more preferably 20 to 200 mJ / cm 2 .
本発明において、上記化合物の誘導体としては、特に制限されないが、上記した化合物の、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の塩の形態；上記した化合物の少なくとも一の水素原子を、スルホ基、スチリル基、ビニル基、メチル基等のアルキル基などで置換した形態のものが挙げられる。 In the present invention, the derivative of the above compound is not particularly limited, but is a salt form of the above compound such as sodium salt, potassium salt, ammonium salt, etc .; at least one hydrogen atom of the above compound is substituted with sulfo group, styryl. And a group substituted with an alkyl group such as a vinyl group, a methyl group or the like.
本発明において、光架橋性樹脂は、上記したように合成したものを使用してもあるいは上記したような構造を有する市販品を使用してもよい。前者の場合には、上記した単量体を、公知の方法であるいは当該方法を適宜修飾して、（共）重合することによって得られる。後者の場合に使用できる市販品としては、特に制限されず、バイオチップやバイオセンサ用途（タンパク質・酵素の固定化）に一般的に使用される光架橋性樹脂（感光性樹脂を含む）が使用される。具体的には、Ｂｉｏｓｕｒｆｉｎｅ−ＡＷＰ（東洋合成工業株式会社製；アジド系感光基をポリビニルアルコールにペンダントした水溶性の感光性樹脂）などが挙げられる。 In the present invention, the photocrosslinkable resin may be synthesized as described above or may be a commercially available product having the structure as described above. In the former case, the above-described monomer can be obtained by (co) polymerization by a known method or by appropriately modifying the method. Commercial products that can be used in the latter case are not particularly limited, and photocrosslinkable resins (including photosensitive resins) commonly used for biochips and biosensor applications (immobilization of proteins and enzymes) are used. Is done. Specific examples include Biosurfine-AWP (manufactured by Toyo Gosei Co., Ltd .; a water-soluble photosensitive resin in which an azide-based photosensitive group is pendant to polyvinyl alcohol).
本発明において、光架橋性樹脂層中の光架橋性樹脂の含有量（濃度）は、特に制限されず、試料やその添加量、使用するグリセロール脱水素酵素や電子受容体の種類などによって適宜選択することができる。通常、光架橋性樹脂の含有量は、光架橋性樹脂層の総質量に対して、好ましくは１〜５０質量％、より好ましくは２〜２５質量％である。 In the present invention, the content (concentration) of the photocrosslinkable resin in the photocrosslinkable resin layer is not particularly limited, and is appropriately selected depending on the sample, the amount added, the type of glycerol dehydrogenase and electron acceptor used, and the like. can do. Usually, content of photocrosslinkable resin becomes like this. Preferably it is 1-50 mass% with respect to the total mass of a photocrosslinkable resin layer, More preferably, it is 2-25 mass%.
また、本発明に用いられるグリセロール脱水素酵素は、補酵素結合型であれば特に制限されず、公知のグリセロール脱水素酵素が同様にして使用できる。具体的には、補酵素としては、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）などのニコチン化合物、ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）などのフラビン化合物、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）などのキノン化合物を有するものを、所望の用途によって適宜選択することができる。好ましくは、ＰＱＱ結合型グリセロール脱水素酵素が使用される。 The glycerol dehydrogenase used in the present invention is not particularly limited as long as it is a coenzyme-linked type, and a known glycerol dehydrogenase can be used in the same manner. Specifically, as a coenzyme, a nicotine compound such as NAD (nicotinamide adenine dinucleotide), a flavin compound such as FAD (flavin adenine dinucleotide), and a quinone compound such as PQQ (pyrroloquinoline quinone), It can be appropriately selected depending on the desired application. Preferably, PQQ-linked glycerol dehydrogenase is used.
本発明において、光架橋性樹脂層中のグリセロール脱水素酵素の含有量は、特に制限されず、試料やその添加量、使用する光架橋性樹脂や電子受容体の種類などによって適宜選択することができる。通常、グリセロール脱水素酵素の含有量は、光架橋性樹脂の０．１〜４質量％水溶液１ｍｌに対し、好ましくは０．１〜１００，０００活性単位、より好ましくは、１０〜１，０００活性単位の割合で存在する量である。 In the present invention, the content of glycerol dehydrogenase in the photocrosslinkable resin layer is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the sample, the amount of addition thereof, the type of photocrosslinkable resin and electron acceptor used, and the like. it can. Usually, the content of glycerol dehydrogenase is preferably 0.1 to 100,000 activity units, more preferably 10 to 1,000 activities with respect to 1 ml of a 0.1 to 4% by weight aqueous solution of a photocrosslinkable resin. It is the amount that exists in unit proportions.
本発明では、光架橋性樹脂層はさらに電子受容体を含むことが好ましい。これにより、以下に詳述するバンオセンサにおける反応層は、光架橋性樹脂層一層となるため、製造工程上好ましい。本発明に用いられる電子受容体には、酸化還元反応により生成した電子を受容できるものであれば特に制限されず、所望の用途によって適宜選択されうる。具体的には、フェリシアン化カリウム［Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］］、フェロセンカルボン酸、２，６−ジクロロインドフェノールナトリウム、ｐ−ベンゾキノン、ｐ−ベンゾキノン誘導体、フェナジンメトサルフェート、フェナジンメトサルフェート誘導体、メチレンブルー、チオニン、インジゴカーミン、ガロシアニン、α−ナフトキノン、α−ナフトキノン誘導体、およびサフラニンなどが挙げられる。ここに、ｐ−ベンゾキノン誘導体、フェナジンメトサルフェート誘導体、α−ナフトキノン誘導体としては、それぞれ、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、α−ナフトキノンの少なくとも１個の水素原子が、炭素数１または２のアルキル基で置換されたもの、炭素数１または２のアルコキシで置換されたもの、およびフッ素原子、塩素原子、臭素原子などのハロゲン原子で置換されたものなどが挙げられる。具体的には、メトキシＰＭＳ(1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate)、２−メチル−ｐ−ベンゾキノン(2-Methyl-ｐ-benzoquinone）、２−メチル−α−ナフトキノン(2-Methyl-α-Naphthoquinone)などが挙げられる。これらのうち、フェリシアン化カリウム、メトキシＰＭＳ、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、２−メチル−ｐ−ベンゾキノン、α-ナフトキノンが好ましく、フェリシアン化カリウム、メトキシＰＭＳがより好ましい。 In the present invention, the photocrosslinkable resin layer preferably further contains an electron acceptor. Thereby, since the reaction layer in the Bano sensor explained in full detail becomes a photocrosslinkable resin layer, it is preferable on a manufacturing process. The electron acceptor used in the present invention is not particularly limited as long as it can accept electrons generated by the oxidation-reduction reaction, and can be appropriately selected depending on a desired use. Specifically, potassium ferricyanide [K 3 [Fe (CN) 6 ]], ferrocenecarboxylic acid, 2,6-dichloroindophenol sodium, p-benzoquinone, p-benzoquinone derivative, phenazine methosulfate, phenazine methosulfate derivative, Examples include methylene blue, thionine, indigo carmine, galocyanine, α-naphthoquinone, α-naphthoquinone derivatives, and safranin. Here, as the p-benzoquinone derivative, phenazine methosulfate derivative, and α-naphthoquinone derivative, at least one hydrogen atom of p-benzoquinone, phenazine methosulfate, and α-naphthoquinone is an alkyl group having 1 or 2 carbon atoms, respectively. , Substituted with an alkoxy having 1 or 2 carbon atoms, and substituted with a halogen atom such as a fluorine atom, a chlorine atom or a bromine atom. Specifically, methoxy PMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate), 2-methyl-p-benzoquinone, 2-methyl-α-naphthoquinone (2-Methyl-α-Naphthoquinone) ) And the like. Of these, potassium ferricyanide, methoxy PMS, p-benzoquinone, phenazine methosulfate, 2-methyl-p-benzoquinone and α-naphthoquinone are preferred, and potassium ferricyanide and methoxy PMS are more preferred.
本発明において、光架橋性樹脂層がさらに電子受容体を含む場合の、光架橋性樹脂層中の電子受容体の含有量（濃度）は、特に制限されず、使用するグリセロール脱水素酵素や対象とする試料の種類などによって適宜選択することができる。通常、電子受容体の含有量は、０．５〜１０μｌの試料を添加する場合には、光架橋性樹脂層の総質量に対して、好ましくは０．１〜３０質量％、より好ましくは２〜２０質量％である。 In the present invention, when the photocrosslinkable resin layer further contains an electron acceptor, the content (concentration) of the electron acceptor in the photocrosslinkable resin layer is not particularly limited, and the glycerol dehydrogenase to be used and the target It can be appropriately selected depending on the type of sample. Usually, the content of the electron acceptor is preferably 0.1 to 30% by mass, more preferably 2%, based on the total mass of the photocrosslinkable resin layer when a sample of 0.5 to 10 μl is added. ˜20 mass%.
本発明において、上記グリセロール脱水素酵素及び光架橋性樹脂ならびに必要であれば電子受容体を含む光架橋性樹脂層が被固定化部材に形成される。この際、被固定化部材としては、特に制限されず、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、テフロン、セラミック、ガラスエポキシ、アクリル等の絶縁性樹脂により形成される。 In the present invention, a photocrosslinkable resin layer containing the glycerol dehydrogenase and the photocrosslinkable resin and, if necessary, an electron acceptor is formed on the member to be immobilized. At this time, the member to be fixed is not particularly limited, and is formed of an insulating resin such as polyethylene terephthalate (PET), Teflon, ceramic, glass epoxy, acrylic.
本発明のタンパク質固定化膜の製造方法（タンパク質の固定化方法）は、特に制限されず、公知の方法が同様にしてもしくは適宜修飾して、またはこれらの方法を適宜組合わせて適用される。好ましくは、被固定化部材に、紫外線照射により架橋するアジド系感光基を有する光架橋性樹脂、グリセロール脱水素酵素ならびに必要であれば電子受容体を含む光架橋性樹脂層を形成する段階、および前記光架橋性樹脂層に対して、グリセロール脱水素酵素（場合によっては、電子受容体）を固定化する段階と、を有する。したがって、本発明の第二は、被固定化部材にグリセロール脱水素酵素を固定化する方法であって、前記被固定化部材に、紫外線照射により架橋するアジド系感光基を有する光架橋性樹脂、グリセロール脱水素酵素を含む光架橋性樹脂層を形成する段階、および前記光架橋性樹脂層に対して、グリセロール脱水素酵素を固定化する段階と、を有することを特徴とする、タンパク質の固定化方法である。 The production method of the protein-immobilized membrane of the present invention (protein immobilization method) is not particularly limited, and a known method is applied in the same manner or appropriately modified, or these methods are appropriately combined. Preferably, a photocrosslinkable resin having an azide-based photosensitive group that is cross-linked by ultraviolet irradiation, a photocrosslinkable resin layer containing glycerol dehydrogenase and, if necessary, an electron acceptor, are formed on the member to be immobilized, and Immobilizing glycerol dehydrogenase (in some cases, an electron acceptor) to the photocrosslinkable resin layer. Therefore, the second of the present invention is a method of immobilizing glycerol dehydrogenase on the member to be immobilized, wherein the member to be immobilized has a photocrosslinkable resin having an azide-based photosensitive group that is crosslinked by ultraviolet irradiation, A step of forming a photocrosslinkable resin layer containing glycerol dehydrogenase, and a step of immobilizing glycerol dehydrogenase to the photocrosslinkable resin layer. Is the method.
以下、グリセロール脱水素酵素および電子受容体を、光架橋性樹脂層を有する被固定化部材に固定して、本発明のタンパク質固定化膜を製造する方法の好ましい実施形態を以下に記載する。なお、本発明は、下記好ましい実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, a preferred embodiment of a method for producing a protein-immobilized membrane of the present invention by immobilizing glycerol dehydrogenase and an electron acceptor on a member to be immobilized having a photocrosslinkable resin layer will be described below. In addition, this invention is not limited to the following preferable embodiment.
すなわち、（ｉ）グリセロール脱水素酵素、電子受容体及び光架橋性樹脂を含む混合物を適当な溶剤に溶解し、これを被固定化部材上に塗布、乾燥して、塗布膜（光架橋性樹脂層）を形成した後、（ｉｉ）上記工程（ｉ）で形成された塗布膜（光架橋性樹脂層）に紫外線を照射することにより、光架橋性樹脂中のアジド系感光基を介して、グリセロール脱水素酵素および電子受容体を光架橋性樹脂に架橋（固定化）する方法が使用できる。 That is, (i) a mixture containing glycerol dehydrogenase, an electron acceptor and a photocrosslinkable resin is dissolved in an appropriate solvent, and this is applied onto an immobilization member and dried to form a coating film (photocrosslinkable resin). (Ii) by irradiating the coating film (photocrosslinkable resin layer) formed in the above step (i) with ultraviolet rays, via the azide-based photosensitive group in the photocrosslinkable resin, A method of crosslinking (immobilizing) glycerol dehydrogenase and an electron acceptor to a photocrosslinkable resin can be used.
上記工程（ｉ）は、グリセロール脱水素酵素、電子受容体及び光架橋性樹脂を含む塗布膜が形成できればよく、グリセロール脱水素酵素、電子受容体及び光架橋性樹脂の混合順序などは特に制限されず、個々の成分をそのままもしくは予め適当な溶剤に溶解したものを合わせる方法；３成分のうち２成分をそのままもしくは予め適当な溶剤に溶解したものと、残りの１成分をそのままもしくは予め適当な溶剤に溶解したものとを合わせる方法；および３成分をすべてそのままもしくは予め適当な溶剤に溶解する方法など、いずれの方法を使用してもよい。好ましくは、グリセロール脱水素酵素と電子受容体との組み合わせの混合液に、光架橋性樹脂を適当量加え、よく混合し、適量、好ましくは１〜１０μｌを電極上に直接塗布、乾燥する方法が使用できる。 The step (i) only needs to be able to form a coating film containing glycerol dehydrogenase, electron acceptor and photocrosslinkable resin, and the mixing order of glycerol dehydrogenase, electron acceptor and photocrosslinkable resin is particularly limited. First, combining each component as it is or previously dissolved in a suitable solvent; 2 out of 3 components as they are or dissolved in a suitable solvent, and the remaining 1 component as it is or in advance a suitable solvent Any method may be used, such as a method of combining the three components with each other, and a method of dissolving all three components as they are or in advance in an appropriate solvent. Preferably, a method of adding an appropriate amount of a photocrosslinkable resin to a mixed solution of a combination of glycerol dehydrogenase and an electron acceptor, mixing well, applying an appropriate amount, preferably 1 to 10 μl directly on an electrode, and drying. Can be used.
上記工程（ｉ）において、溶剤は、グリセロール脱水素酵素、電子受容体及び光架橋性樹脂を含む混合物を溶解できるものであれば特に制限されない。具体的には、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＭＯＰＳやＨＥＰＥＳのようなＧＯＯＤ緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられ、好ましくは、トリス−塩酸緩衝液である。また、被固定化部材上への塗布方法は、特に制限されず、スクリーン印刷法、沈積法、あるいはスプレー法、スピンコーティング法などの公知の方法が使用できる。 In the step (i), the solvent is not particularly limited as long as it can dissolve a mixture containing glycerol dehydrogenase, electron acceptor and photocrosslinkable resin. Specific examples include phosphate buffer, borate buffer, GOOD buffer such as MOPS and HEPES, Tris-HCl buffer, glycine-NaOH buffer, citrate buffer, and preferably Tris. -Hydrochloric acid buffer. Moreover, the coating method on the member to be fixed is not particularly limited, and a known method such as a screen printing method, a deposition method, a spray method, or a spin coating method can be used.
下記工程（ｉｉ）でグリセロール脱水素酵素および電子受容体を光架橋性樹脂中のアジド系感光基を介して、光架橋性樹脂に架橋（固定化）する。このため、上記工程（ｉ）では、グリセロール脱水素酵素および電子受容体の光架橋性樹脂への架橋（固定化）は可能な限り起こらないことが好ましい。このため、用いる光架橋性樹脂の性質にもよるが、本工程（ｉ）は、通常、太陽光を避けて室内ランプ点灯下で行なうことが好ましく、より好ましくは紫外線カット等の処理を行った室内ランプ下で行なう。 In the following step (ii), the glycerol dehydrogenase and the electron acceptor are crosslinked (immobilized) to the photocrosslinkable resin via the azide-based photosensitive group in the photocrosslinkable resin. For this reason, it is preferable that the glycerol dehydrogenase and the electron acceptor are not crosslinked (immobilized) to the photocrosslinkable resin as much as possible in the step (i). For this reason, although depending on the properties of the photocrosslinkable resin to be used, this step (i) is usually preferably performed under indoor lamp lighting avoiding sunlight, and more preferably subjected to treatment such as ultraviolet ray cutting. Perform under the indoor lamp.
上記（ｉ）の操作（溶解から乾燥までの操作を含む）条件は、所望の光架橋性樹脂層が形成できる条件であれば特に制限されない。具体的には、操作温度は、通常、１〜３０℃であるが、酵素の活性を考慮すると、常温操作を避けることが好ましく、ゆえに、より好ましくは１〜１５℃で、上記（ｉ）の操作を行なうことが好ましい。また、乾燥時間は、所望の塗膜が得られれば特に制限されないが、通常５〜６０分、より好ましくは１０〜３０分程度であることが好ましい。また、塗布膜の乾燥方法としては、自然乾燥、減圧乾燥、加熱乾燥などがあるが、好ましくは酵素活性の損失が少なく短時間で行える減圧乾燥である。 The operation (i) (including operation from dissolution to drying) is not particularly limited as long as the desired photocrosslinkable resin layer can be formed. Specifically, the operation temperature is usually 1 to 30 ° C., but considering the enzyme activity, it is preferable to avoid normal temperature operation, and more preferably 1 to 15 ° C. It is preferable to perform the operation. Further, the drying time is not particularly limited as long as a desired coating film is obtained, but it is usually preferably 5 to 60 minutes, more preferably about 10 to 30 minutes. Examples of the method for drying the coating film include natural drying, reduced-pressure drying, and heat drying. Preferably, the reduced-pressure drying can be performed in a short time with little loss of enzyme activity.
上記工程（ｉ）において、被固定化部材上に形成される光架橋性樹脂層（塗膜）の厚みは、特に制限されず、一般的に使用される厚みが同様にして適用される。具体的には、被固定化部材上に形成される光架橋性樹脂層の厚みは、０．０５〜１００μｍ、より好ましくは０．１〜１０μｍであることが好ましい。 In the said process (i), the thickness in particular of the photocrosslinkable resin layer (coating film) formed on a to-be-fixed member is not restrict | limited, The thickness generally used is applied similarly. Specifically, the thickness of the photocrosslinkable resin layer formed on the member to be immobilized is preferably 0.05 to 100 μm, more preferably 0.1 to 10 μm.
次に、上記工程（ｉ）で形成された塗布膜（光架橋性樹脂層）に紫外線を照射する［工程（ｉｉ）］。このような工程（ｉｉ）によって、形成された未架橋の光架橋性樹脂層に紫外線照射を行なうと、紫外線による架橋が起こり、光架橋性樹脂中のアジド系感光基を介して、グリセロール脱水素酵素および電子受容体が光架橋性樹脂に架橋（固定化）される。ここで、紫外線とは、１０〜４００ｎｍの波長を有し、可視光線より短く軟Ｘ線より長い不可視光線の電磁波を意味する。上記工程（ｉｉ）で照射する紫外線の波長は、紫外線照射により架橋を誘導できる波長による紫外線照射であれば特に制限されず、使用される光架橋性樹脂の種類によって適宜選択されるが、通常、２００〜４００ｎｍ、より好ましくは２８０〜３８０ｎｍの波長の紫外線が好ましく使用される。例えば、アジド系感光基をポリビニルアルコールにペンダントした水溶性の感光性樹脂である、Ｂｉｏｓｕｒｆｉｎｅ−ＡＷＰ（東洋合成工業株式会社製）を使用する場合には、３００〜４００ｎｍの紫外線を照射することが好ましい。また、紫外線露光量もまた、紫外線照射により架橋を誘導できる量であれば特に制限されず、膜厚によって適宜選択することができる。好ましくは、紫外線露光量は、１０〜１０００ｍＪ／ｃｍ２、より好ましくは２０〜２００ｍＪ／ｃｍ２である。さらに、紫外線照射に使用される装置は、上記したような所望の紫外線を発生し得る装置であれば、特に制限されず、公知の紫外線照射装置が使用できる。 Next, the coating film (photocrosslinkable resin layer) formed in the above step (i) is irradiated with ultraviolet rays [step (ii)]. When the uncrosslinked photocrosslinkable resin layer formed in such a step (ii) is irradiated with ultraviolet rays, crosslinking by ultraviolet rays occurs, and glycerol dehydrogenation occurs via an azide-based photosensitive group in the photocrosslinkable resin. The enzyme and electron acceptor are crosslinked (immobilized) to the photocrosslinkable resin. Here, the ultraviolet ray means an invisible electromagnetic wave having a wavelength of 10 to 400 nm and shorter than visible light and longer than soft X-ray. The wavelength of the ultraviolet ray irradiated in the step (ii) is not particularly limited as long as it is ultraviolet irradiation with a wavelength capable of inducing crosslinking by ultraviolet irradiation, and is appropriately selected depending on the type of the photocrosslinkable resin used. Ultraviolet rays having a wavelength of 200 to 400 nm, more preferably 280 to 380 nm are preferably used. For example, when using Biosurfine-AWP (manufactured by Toyo Gosei Co., Ltd.), which is a water-soluble photosensitive resin in which an azide-based photosensitive group is pendant on polyvinyl alcohol, it is preferable to irradiate ultraviolet rays of 300 to 400 nm. . Further, the ultraviolet exposure amount is not particularly limited as long as it is an amount capable of inducing crosslinking by ultraviolet irradiation, and can be appropriately selected depending on the film thickness. Preferably, the ultraviolet exposure is 10 to 1000 mJ / cm 2 , more preferably 20 to 200 mJ / cm 2 . Furthermore, the apparatus used for ultraviolet irradiation is not particularly limited as long as it can generate the desired ultraviolet light as described above, and a known ultraviolet irradiation apparatus can be used.
上記工程（ｉｉ）において、紫外線照射条件は、十分量のグリセロール脱水素酵素および電子受容体が光架橋性樹脂に架橋（固定化）できる条件であれば特に制限されない。具体的には、照射温度は、具体的には、操作温度は、通常、１〜３０℃であるが、酵素の活性を考慮すると、常温操作を避けることが好ましく、ゆえに、より好ましくは１〜１５℃で、上記（ｉｉ）の操作を行なうことが好ましい。また、照射時間は、十分架橋（固定化）が達成できる条件であれば特に制限されにないが、通常５秒〜１５分、より好ましくは２０秒〜５分程度であることが好ましい。 In the above step (ii), the ultraviolet irradiation conditions are not particularly limited as long as a sufficient amount of glycerol dehydrogenase and electron acceptor can be crosslinked (immobilized) to the photocrosslinkable resin. Specifically, the irradiation temperature is specifically 1 to 30 ° C., and the operation temperature is preferably 1 to 30 ° C. Considering the activity of the enzyme, it is preferable to avoid room temperature operation, and more preferably 1 to 30 ° C. The operation (ii) is preferably performed at 15 ° C. Further, the irradiation time is not particularly limited as long as sufficient crosslinking (immobilization) can be achieved, but it is usually 5 seconds to 15 minutes, more preferably about 20 seconds to 5 minutes.
なお、上記好ましい実施形態では、グリセロール脱水素酵素および電子受容体を、光架橋性樹脂層を有する被固定化部材に固定して、本発明のタンパク質固定化膜を製造する方法について詳述したが、本発明は、グリセロール脱水素酵素を、光架橋性樹脂層を有する被固定化部材に固定し、また電子受容体は別の層（電子受容体層）として形成されてもよい。このような場合には、上記好ましい実施形態において、電子受容体を使用せずにグリセロール脱水素酵素のみを使用すればよい。電子受容体層の形成方法は、従来と同様の方法が使用でき、具体的には、上記（ｉ）と同様の操作が使用できる。以下、電子受容体層の形成方法について簡単に説明する。 In the above preferred embodiment, the method for producing the protein-immobilized membrane of the present invention by fixing glycerol dehydrogenase and the electron acceptor to an immobilized member having a photocrosslinkable resin layer has been described in detail. In the present invention, glycerol dehydrogenase may be immobilized on a member to be immobilized having a photocrosslinkable resin layer, and the electron acceptor may be formed as a separate layer (electron acceptor layer). In such a case, in the preferred embodiment, only glycerol dehydrogenase may be used without using an electron acceptor. As a method for forming the electron acceptor layer, a method similar to the conventional method can be used, and specifically, the same operation as in the above (i) can be used. Hereinafter, a method for forming the electron acceptor layer will be briefly described.
すなわち、電子受容体及び高分子を含む混合物を適当な溶剤に溶解し、これを被固定化部材上に塗布、乾燥して、塗布膜（電子受容体層）を形成する。 That is, a mixture containing an electron acceptor and a polymer is dissolved in an appropriate solvent, and this is applied onto a member to be fixed and dried to form a coating film (electron acceptor layer).
ここで、高分子としては、高分子は特に制限されず、適宜選択されうる。例えば、セルロース、グアーガム、スターチ、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、グアーガム、ゼラチン、タンニン酸、ペクチン、カゼイン、カラギナン、ファーセレラン、プルラン、コラーゲン、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、リグニンスルホン酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、およびこれらの誘導体などが挙げられる。なお、血液などの体液に対する溶解性が優れる高分子として、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、およびこれらの誘導体が挙げられる。よって、血液などの体液を試料溶液として用いる場合には、これらの高分子を電子受容体層に含めるとよい。なお、上記の高分子は、１種のみが単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。また、上記以外の高分子が電子受容体層に含まれてもよいことは勿論である。 Here, the polymer is not particularly limited and may be appropriately selected. For example, cellulose, guar gum, starch, hydroxyethyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxyethyl methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, guar gum, gelatin, tannic acid, pectin, casein, carrageenan, far selelain, pullulan, collagen, chitin, chitosan, Examples thereof include sodium chondroitin sulfate, lignin sulfonic acid, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylamide, polyethylene glycol, and derivatives thereof. Examples of the polymer having excellent solubility in body fluids such as blood include carboxymethyl cellulose, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, and derivatives thereof. Therefore, when a body fluid such as blood is used as a sample solution, these polymers may be included in the electron acceptor layer. In addition, said polymer may be used individually by 1 type, or may be used with the form of 2 or more types of mixtures. Of course, polymers other than those described above may be included in the electron acceptor layer.
電子受容体層における高分子の含有量については特に制限はなく、電子受容体層のサイズなどに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、０．５〜１０μＬの試料溶液を添加して用いるバイオセンサの電子受容体層には、通常は０．０１〜１０００μｇ、好ましくは０．１〜１００μｇ、より好ましくは０．３〜５０μｇの高分子が含まれる。 There is no restriction | limiting in particular about content of the polymer in an electron acceptor layer, According to the size etc. of an electron acceptor layer, it can adjust suitably. For example, the electron acceptor layer of the biosensor used by adding 0.5 to 10 μL of the sample solution is usually 0.01 to 1000 μg, preferably 0.1 to 100 μg, more preferably 0.3. ˜50 μg of polymer is included.
また、上記で使用される溶剤は、電子受容体及び高分子を含む混合物を溶解できるものであれば特に制限されない。具体的には、ｐＨ緩衝剤が好ましく使用される。電子受容体層がｐＨ緩衝剤を含むと、バイオセンサ１０の感度がより一層向上しうる。この理由は以下の通りであると推測される。すなわち、試料溶液の添加により電子受容体層が溶解する際、試料溶液の組成によっては、電子受容体層のｐＨが変動する場合がある。ｐＨ変動の一例としては、電子受容体層において試料溶液中の中性脂肪が分解することによる脂肪酸の遊離に伴うｐＨの低下が挙げられる。ここで、バイオセンサのメカニズムは、酸化還元酵素により酸化される基質の量を間接的に定量するというものであるから、電子受容体層のｐＨが変動すると、当該酵素の種類によっては、電子受容体層のｐＨと酵素の最適ｐＨとがずれてしまい、センサの測定感度の低下につながる場合がある。これに対し、電子受容体層がｐＨ緩衝剤を含むと、かようなｐＨ変動が抑制され、ｐＨ変動に伴うセンサの測定感度の低下が防止されるのである。ここで使用されるｐＨ緩衝剤の種類は特に制限されず、用いる酵素の最適ｐＨに応じて適宜選択されうるが、一例としては、グリシン−ＨＣｌ、グリシン−ＮａＯＨ、クエン酸−クエン酸ナトリウム、ＭＥＳ−ＮａＯＨ、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ、リン酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸などが挙げられる。なお、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、６〜９であることが好ましい。また、これらのｐＨ緩衝剤は、１種のみが単独で電子受容体層に含まれてもよいし、２種以上が併せて電子受容体層に含まれてもよい。また、上記以外のｐＨ緩衝剤が電子受容体層に含まれてもよいことは勿論である。ゆえに、電子受容体層を形成するのに使用される溶剤としては、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＭＯＰＳやＨＥＰＥＳのようなＧＯＯＤ緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸緩衝液などの上記緩衝剤を含む水溶液が挙げられ、好ましくは、トリス−塩酸緩衝液である。また、被固定化部材上への塗布方法は、特に制限されず、スクリーン印刷法、沈積法、あるいはスプレー法、スピンコーティング法などの公知の方法が使用できる。
The solvent used above is not particularly limited as long as it can dissolve a mixture containing an electron acceptor and a polymer. Specifically, a pH buffer is preferably used. When the electron acceptor layer contains a pH buffer, the sensitivity of the
また、電子受容体の具体例及び好ましい例は、上記したとおりである。電子受容体層における電子受容体の含有量についても特に制限はなく、試料溶液の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、０．５〜１０μＬの試料溶液を添加して用いるバイオセンサの電子受容体層には、通常は、０．０１〜２０００μｇ、好ましくは０．０５〜１５００μｇ、より好ましくは０．１〜１０００μｇの電子受容体が含まれるとよい。 Specific examples and preferred examples of the electron acceptor are as described above. There is no restriction | limiting in particular also about content of the electron acceptor in an electron acceptor layer, According to the addition amount of a sample solution etc., it can adjust suitably. As an example, the electron acceptor layer of a biosensor used by adding 0.5 to 10 μL of a sample solution is usually 0.01 to 2000 μg, preferably 0.05 to 1500 μg, more preferably 0.8. 1 to 1000 μg of electron acceptor may be included.
上記に加えて、電子受容体層は、上記に加えて界面活性剤を含んでもよい。電子受容体層に界面活性剤が含まれることにより、試料溶液中に脂溶性物質が含まれる場合であっても、当該脂溶性物質の電子受容体層への溶解が促進されうる。その結果、測定感度に優れるバイオセンサが提供されうる。電子受容体層が界面活性剤を含む場合に、使用できる界面活性剤の種類は特に制限されず、従来公知の界面活性剤が用いられうる。界面活性剤は、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤に大きく分類されるが、これらのいずれが用いられてもよい。ここで、陽イオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩などが挙げられる。陰イオン性界面活性剤としては、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩、コール酸塩などが挙げられる。両性界面活性剤としては、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチンなどが挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、アシルソルビタン、アルキルグルコシド、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）系界面活性剤、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）系界面活性剤、Ｂｒｉｊ系界面活性剤などが挙げられる。ただし、これら以外の界面活性剤が用いられてもよいことは勿論である。なかでも、好ましくは非イオン性界面活性剤が、より好ましくはトゥイーン系やトリトン系の界面活性剤が用いられる。また、電子受容体層における界面活性剤の含有量については特に制限はなく、試料溶液中の脂溶性物質の量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、０．５〜１０μＬの試料溶液を添加して用いるバイオセンサ１０の電子受容体層には、通常は０．１〜５００μｇ、好ましくは１〜１００μｇ、より好ましくは１〜５０μｇの界面活性剤が含まれる。
In addition to the above, the electron acceptor layer may contain a surfactant in addition to the above. By including a surfactant in the electron acceptor layer, even if the sample solution contains a fat-soluble substance, dissolution of the fat-soluble substance in the electron acceptor layer can be promoted. As a result, a biosensor excellent in measurement sensitivity can be provided. When the electron acceptor layer contains a surfactant, the type of surfactant that can be used is not particularly limited, and a conventionally known surfactant can be used. Surfactants are broadly classified into cationic surfactants, anionic surfactants, amphoteric surfactants, and nonionic surfactants, and any of these may be used. Here, examples of the cationic surfactant include cetyltrimethylammonium salt and dodecyltrimethylammonium salt. Examples of the anionic surfactant include sodium alkyl sulfate, alkyl benzene sulfonate, and cholate. Examples of amphoteric surfactants include lecithin, phosphatidylethanolamine, lysolecithin and the like. Nonionic surfactants include acyl sorbitans, alkyl glucosides, Tween surfactants, Triton surfactants, Brij surfactants, and the like. However, it goes without saying that surfactants other than these may be used. Among these, nonionic surfactants are preferably used, and tween and triton surfactants are more preferably used. Moreover, there is no restriction | limiting in particular about content of surfactant in an electron acceptor layer, According to the quantity of the fat-soluble substance in a sample solution, etc., it can adjust suitably. For example, the electron acceptor layer of the
このようにして得られたタンパク質固定化膜は、アジド系感光基を有する光架橋性樹脂と、グリセロール脱水素酵素またはグリセロール脱水素酵素および電子受容体とを、十分一体化できる。このため、本発明のタンパク質固定化膜をバイオセンサに使用することによって、グリセロール脱水素酵素を介した生体試料中の特定成分と電子受容体との反応を効率よく行なうことができ、ゆえに、このようにして得られたバイオセンサは、生体試料中の特定成分を容易にかつ高精度で定量することができる。したがって、本発明の第三は、本発明のタンパク質固定化膜を有するバイオセンサを提供し、好ましくはグリセロール脱水素酵素および電子受容体が被固定化部材に対して固定化されたバイオセンサであって、上記グリセロール脱水素酵素および電子受容体が光架橋性樹脂層に固定化されていることを特徴とするバイオセンサ、特にディスポーザブルタイプのバイオセンサに関する。 The protein-immobilized membrane thus obtained can sufficiently integrate the photocrosslinkable resin having an azide-based photosensitive group with glycerol dehydrogenase or glycerol dehydrogenase and an electron acceptor. Therefore, by using the protein-immobilized membrane of the present invention for a biosensor, a reaction between a specific component in a biological sample and an electron acceptor via glycerol dehydrogenase can be performed efficiently. Thus, the obtained biosensor can quantify the specific component in the biological sample easily and with high accuracy. Accordingly, a third aspect of the present invention provides a biosensor having the protein-immobilized membrane of the present invention, preferably a biosensor in which a glycerol dehydrogenase and an electron acceptor are immobilized on a member to be immobilized. In particular, the present invention relates to a biosensor, particularly a disposable biosensor, in which the glycerol dehydrogenase and the electron acceptor are immobilized on a photocrosslinkable resin layer.
以下、本発明のバイオセンサを、図１及び図２を参照しながら説明する。図１は、本発明の一実施形態に係るバイオセンサの斜視図である。図２は、図１のバイオセンサの断面図である。なお、本発明のバイオセンサは、グリセロール脱水素酵素（および必要であれば、電子受容体；以下、同様）が固定化された光架橋性樹脂層を有することに特徴があり、他の部材（例えば、絶縁性基板、測定極、参照極、対極などの材質や大きさなど）およびこれらの形成方法については、公知の同様の部材および方法が適用できる。なお、下記説明では、反応層がグリセロール脱水素酵素および電子受容体双方が固定化された光架橋性樹脂層である例をとってなされているが、上述したように、光架橋性樹脂層はグリセロール脱水素酵素のみが固定化されていてもよい。このような場合には、反応層が、グリセロール脱水素酵素のみが固定化された光架橋性樹脂層と、上記光架橋性樹脂層上に形成されかつ電子受容体を含む電子受容体層との、２層構造を有する以外は、下記と同様であるためここでは説明を省略する。 Hereinafter, the biosensor of the present invention will be described with reference to FIGS. 1 and 2. FIG. 1 is a perspective view of a biosensor according to an embodiment of the present invention. FIG. 2 is a cross-sectional view of the biosensor of FIG. The biosensor of the present invention is characterized by having a photocrosslinkable resin layer on which a glycerol dehydrogenase (and an electron acceptor; if necessary, the same) is immobilized, and other members ( For example, the same known members and methods can be applied to the insulating substrate, measurement electrode, reference electrode, counter electrode, and the like, and methods for forming them. In the following description, the reaction layer is taken as an example of a photocrosslinkable resin layer in which both glycerol dehydrogenase and electron acceptor are immobilized. As described above, the photocrosslinkable resin layer is Only glycerol dehydrogenase may be immobilized. In such a case, the reaction layer comprises a photocrosslinkable resin layer in which only glycerol dehydrogenase is immobilized, and an electron acceptor layer formed on the photocrosslinkable resin layer and containing an electron acceptor. Since it is the same as the following except that it has a two-layer structure, description is abbreviate | omitted here.
本発明のバイオセンサは、絶縁性基板１、ならびに当該絶縁性基板１に測定極２、参照極３及び対極４からなる電極系が形成される。また、電極系を部分的に覆い、各々の電極の電気化学的に作用する部分となる測定極作用部分２−１、参照極作用部分３−１、及び対極作用部分４−１を残すように、絶縁性ペーストを塗布／印刷し、加熱処理することにより絶縁層５が形成される。また、反応層６が、測定極作用部分２−１、参照極作用部分３−１、及び対極作用部分４−１を被覆するように形成される。この際、反応層６が、本発明におけるグリセロール脱水素酵素および電子受容体が固定化された光架橋性樹脂層に相当する。
In the biosensor of the present invention, an insulating
上記実施形態では、絶縁性基板１に測定極２、参照極３及び対極４が電極系として設けられていたが、これらの３要素すべてが設けられている必要は無く、少なくとも測定極２と対極３からなる電極系が絶縁性基板１に設けられていればよい。ただし、参照極を含めた３電極系であればより精度の高い測定が可能となるため、３電極系が好ましい。また、上述したように、反応層６は、グリセロール脱水素酵素、電子受容体およびアジド系感光基を有する光架橋性樹脂からなる水溶液（緩衝液）を電極系の表面に塗布、乾燥後、形成された塗布膜に紫外線を照射して架橋させることで、グリセロール脱水素酵素および電子受容体を光架橋性樹脂に固定化することによって形成される。本発明では、この反応層６に試料液を滴下して、所定の反応を行なわせ、当該反応を前記電極系で検知することにより、試料液中の基質濃度を測定することができる。
In the above embodiment, the
また、反応層（光架橋性樹脂層）を形成した後、これを電極基板と挟む形で絶縁性のスペーサーを設置することも可能である。これにより、試料液を毛細管現象で供給できる。このようなバイオセンサは、濃度測定装置（図示略）に装着した上で試料を供給することによって、濃度測定装置において目的成分の測定を自動で行わせることができる。また、このようなバイオセンサに対する試料液の供給は、濃度測定装置に装着する前、あるいは装着した後のいずれであってもよい。 Moreover, after forming the reaction layer (photocrosslinkable resin layer), it is also possible to install an insulating spacer so as to sandwich the reaction layer (photocrosslinkable resin layer). Thereby, a sample solution can be supplied by capillary action. Such a biosensor can automatically measure the target component in the concentration measuring device by supplying the sample after being attached to the concentration measuring device (not shown). Further, the sample solution may be supplied to such a biosensor either before or after being attached to the concentration measuring device.
本発明のバイオセンサは、いずれの形態で使用されてもよく特に制限されない。例えば、使い捨て用途としてのディスポーザブルタイプのバイオセンサ、少なくとも電極部分を人体に埋め込んで連続的に血糖値、ポリオールなどの所定の値を測定するためのバイオセンサなど、様々な用途に使用できる。以下、本発明のバイオセンサの用途の一実施形態として、本発明のバイオセンサ（グリセロール脱水素酵素としてＰＱＱ結合型グリセロール脱水素酵素を使用）を用いて、ポリオールを定量する方法について詳述する。 The biosensor of the present invention may be used in any form and is not particularly limited. For example, it can be used for various applications such as a disposable biosensor for disposable use, and a biosensor for continuously measuring a predetermined value such as a blood glucose level or a polyol by embedding at least an electrode part in a human body. Hereinafter, as an embodiment of the use of the biosensor of the present invention, a method for quantifying polyol using the biosensor of the present invention (PQQ-linked glycerol dehydrogenase is used as the glycerol dehydrogenase) will be described in detail.
上記実施形態において、例えば、グリセロール脱水素酵素は、下記式に示されるように、グリセロールと酸化型電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。 In the above embodiment, for example, glycerol dehydrogenase can convert glycerol and oxidized electron acceptor into the corresponding dehydrogenated product and reduced electron acceptor, as shown in the following formula.
上記式において、酸化型電子受容体の減少、還元型電子受容体の増加、ジヒドロキシアセトンの量を測定することによって、簡便にグリセロールを定量することができる。また、本発明のバイオセンサを使用すると、このようにグリセロール等のポリオールを含む試料中のポリオール量が定量できるが、この際試料としては、食品、血清、血漿や全血等が好ましく使用できる。また、本発明のバイオセンサは、血清や血漿、全血等の中性脂肪測定にも使用することができる。すなわち、これらの試料に含まれる中性脂肪は、例えばリポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールに分解されるが、ここで生じたグリセロールを、グリセロール脱水素酵素を使用することにより、定量することができるからである。中性脂肪測定時には精神病治療患者、透析患者では遊離グリセロールが問題になるが、本発明のバイオセンサを用いてグリセロールを予め消去するか、もしくはその量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めることが可能である。なお、本発明のバイオセンサは溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。 In the above formula, glycerol can be easily quantified by measuring the decrease in the oxidized electron acceptor, the increase in the reduced electron acceptor, and the amount of dihydroxyacetone. In addition, when the biosensor of the present invention is used, the amount of polyol in a sample containing a polyol such as glycerol can be quantified as described above. Food, serum, plasma, whole blood, etc. can be preferably used as the sample. The biosensor of the present invention can also be used for measuring neutral fat such as serum, plasma and whole blood. That is, the neutral fat contained in these samples is decomposed into free fatty acid and glycerol by, for example, lipoprotein lipase, and the glycerol produced here can be quantified by using glycerol dehydrogenase. Because. Free glycerol is a problem in patients with psychosis and dialysis when measuring triglycerides, but it is possible to eliminate glycerol in advance using the biosensor of the present invention or measure the amount of true triglycerides. A value can be determined. The biosensor of the present invention can accurately determine the polyol even if the solution contains a surfactant.
以上、本発明のバイオセンサ１０の構成について詳細に説明したが、上記の形態のみに制限されることはなく、従来公知の知見を適宜参照して、種々の改良を施すことも可能である。従来公知の知見としては、例えば、特開平２−０６２９５２号公報、特開平５−８７７６８号公報、特開平１１−２０１９３２号公報などが挙げられる。
As described above, the configuration of the
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、本発明において、グリセロール脱水素酵素の活性は、下記方法により測定した。 The effects of the present invention will be described using the following examples and comparative examples. However, the technical scope of the present invention is not limited only to the following examples. In the present invention, the activity of glycerol dehydrogenase was measured by the following method.
（グリセロール脱水素酵素活性の測定方法）
グリセロール脱水素酵素活性は、５０μＭ ＤＣＩＰ、０．２ｍＭ ５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ＰＭＳ）、４５０ｍＭ グリセロールを含んだ０．１％ トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ ７．０中に、酵素溶液を加え、酵素と基質との反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。ここで、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１活性単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ ７．０におけるミリモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
(Measurement method of glycerol dehydrogenase activity)
Glycerol dehydrogenase activity was determined as follows: 50 mM DCIP, 0.2 mM 5-methylphenazinium methyl sulfate (PMS), 10 mM phosphate buffer pH 7.0 containing 0.1% Triton X-100 containing 450 mM glycerol. The enzyme solution was added therein, the reaction between the enzyme and the substrate was followed by the change in absorbance of DCIP at 600 nm, and the rate of decrease in the absorbance was defined as the enzyme reaction rate. Here, the enzyme activity that reduces 1 μmol of DCIP per minute was defined as 1 activity unit (U). The millimolar extinction coefficient of DCIP at pH 7.0 was 16.3 mM- 1 .
実施例１
バイオセンサの一例として、グリセロール測定センサを以下のようにして作製した。図１は、グリセロール測定センサの一実施形態を示すものであり、各構成部分の分解斜視図である。図２は、図１のバイオセンサの断面図である。電極は、ＤＥＰ Ｃｈｉｐ ＥＲ−Ｎ（有限会社バイオデバイステクノロジー製）を使用した。ＤＥＰ Ｃｈｉｐ ＥＲ−Ｎは、絶縁性基板１の上に、それぞれカーボンからなる測定極２、参照極３、対極４が形成され、絶縁層５を挟んで、金からなる測定極作用部分２−１、銀塩化銀からなる参照極作用部分３−１、カーボンからなる対極作用部分４−１が形成されている。
Example 1
As an example of a biosensor, a glycerol measurement sensor was produced as follows. FIG. 1 shows an embodiment of a glycerol measurement sensor and is an exploded perspective view of each component. FIG. 2 is a cross-sectional view of the biosensor of FIG. As the electrode, DEP Chip ER-N (manufactured by Biodevice Technology Co., Ltd.) was used. In the DEP Chip ER-N, a
アジド系感光基を有する光架橋性樹脂としてＢｉｏｓｕｒｆｉｎｅ−ＡＷＰ（東洋合成工業株式会社製）の０．５質量％水溶液１ｍｌに、ＰＱＱ結合型グリセロール脱水素酵素２００Ｕと、電子受容体としてフェリシアン化カリウム及びメトキシＰＭＳとを、それぞれ５０ｍＭ及び１ｍＭの濃度になるように添加、溶解して、混合溶液を得た。このようにして得られた混合用液を、上記電極の表面に、２μｍの厚みとなるように塗布し、１０分間、減圧乾燥後、３００ｎｍ〜４００ｎｍの紫外線を２０秒照射して、反応層６を形成した。なお、上記操作は１０℃で行なった。この反応層６に、グリセロール標準液を滴下して２分後に、参照極を基準にして測定極の電位をアノード方向へ＋４５０ｍＶパルス電圧を印加し１秒後の電流を測定した。この場合、添加されたグリセロール標準液により光架橋性樹脂が電極上に安定で流動しにくく膨潤しにくいゲル層を形成し、ＰＱＱ結合型グリセロール脱水素酵素、フェリシアン化カリウムおよびメトキシＰＭＳが溶解し、グリセロールとＰＱＱ結合型グリセロール脱水素酵素が反応してメトキシＰＭＳが還元され、その還元されたメトキシＰＭＳとフェリシアン化カリウムが反応して、フェロシアン化カリウムを生成した。そこで、上記のパルス電圧の印加により、生成したフェロシアン化カリウムの濃度に基づく酸化電流が得られ、この電流値は基質であるグリセロール濃度に対応した。グリセロール標準液を滴下し応答電流を測定したところ、図３に示されるように、６ｍＭという高濃度まで良好な直線が得られた。
As a photocrosslinkable resin having an azide-based photosensitive group, 1 ml of a 0.5 mass% aqueous solution of Biosurfine-AWP (manufactured by Toyo Gosei Co., Ltd.), 200 U of PQQ-linked glycerol dehydrogenase, potassium ferricyanide and methoxy as electron acceptors PMS was added and dissolved to a concentration of 50 mM and 1 mM, respectively, to obtain a mixed solution. The mixing liquid thus obtained was applied to the surface of the electrode so as to have a thickness of 2 μm, dried under reduced pressure for 10 minutes, and then irradiated with ultraviolet rays of 300 nm to 400 nm for 20 seconds to obtain a
次に、血清にグリセロールを添加したものを試料液として使用する以外は、前記と同様にして実験を行ない、応答電流をグリセロール測定センサを用いて測定した。結果を図３に示す。図３に示されるように、試料液（図中、「血清（グリセロール含有）に相当」）についても、グリセロール標準液と同様、６ｍＭという高濃度まで安定した応答電流が得られた。これは、光架橋性樹脂を使用することによって、一定の膜厚の安定なゲル層が形成でき、血清中に含まれるタンパク質等の電極上の反応における妨害を抑止・防止できるため、精度の高い応答電流が得られたものと考察される。 Next, an experiment was performed in the same manner as described above except that glycerol was added to serum as a sample solution, and the response current was measured using a glycerol measurement sensor. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 3, the sample solution (in the figure, “corresponding to serum (containing glycerol)”) was able to obtain a stable response current up to a high concentration of 6 mM, similar to the glycerol standard solution. This is because by using a photocrosslinkable resin, a stable gel layer with a constant film thickness can be formed, and interference in reactions on electrodes such as proteins contained in serum can be suppressed / prevented. It is considered that the response current was obtained.
図３に、この酸化電流値とグリセロール濃度との関係を示した。上記で示したように光架橋性樹脂層を設け、試料液としてグリセロール標準液を用いた場合と、グリセロール含有の血清を用いた場合である。両方の電流値ともほぼ同じ値を示し、近似直線もほぼ一致した。以上の結果から、このように光架橋性樹脂層を設けることで、電極上の反応を妨害する血清中のタンパク質等を排除できているものと考察される。また、電極上における光架橋性樹脂の濡れ性について評価したところ、グリセロール含有の血清を用いた場合でも、グリセロール標準液を用いた場合と変わらず、良い濡れ性を示した。 FIG. 3 shows the relationship between the oxidation current value and the glycerol concentration. As shown above, a photocrosslinkable resin layer is provided and a glycerol standard solution is used as a sample solution, and a glycerol-containing serum is used. Both current values showed almost the same value, and the approximate straight lines almost coincided. From the above results, it is considered that by providing the photocrosslinkable resin layer in this manner, proteins in serum that interfere with the reaction on the electrode can be eliminated. In addition, when the wettability of the photocrosslinkable resin on the electrode was evaluated, even when glycerol-containing serum was used, the wettability was the same as when the glycerol standard solution was used.
なお、グリセロール脱水素酵素と電子受容体の組み合わせは前記実施例に限定されることはなく、本発明の主旨に合致するものであれば使用できる。一方、前記実施例においては、３電極系の場合について述べたが、対極と測定極からなる２電極系でも測定は可能である。 The combination of glycerol dehydrogenase and electron acceptor is not limited to the above examples, and any combination that meets the gist of the present invention can be used. On the other hand, in the above-described embodiment, the case of the three-electrode system has been described, but the measurement can also be performed by the two-electrode system including the counter electrode and the measurement electrode.
１ 絶縁性基板、
２ 測定極、
３ 参照極、
４ 対極、
５ 絶縁層、
６ 反応層。
1 Insulating substrate,
2 measuring electrodes,
3 Reference electrode,
4 counter electrode,
5 Insulating layer,
6 Reaction layer.
Claims (7)
前記被固定化部材に、紫外線照射により架橋するアジド系感光基を有する光架橋性樹脂、グリセロール脱水素酵素を含む光架橋性樹脂層を形成する段階、および
前記光架橋性樹脂層に対して、グリセロール脱水素酵素を固定化する段階と、
を有することを特徴とする、タンパク質の固定化方法。 A method of immobilizing glycerol dehydrogenase on a member to be immobilized,
A step of forming a photocrosslinkable resin having an azide-based photosensitive group that crosslinks by ultraviolet irradiation on the member to be immobilized, a photocrosslinkable resin layer containing glycerol dehydrogenase, and the photocrosslinkable resin layer, Immobilizing glycerol dehydrogenase;
A protein immobilization method comprising the steps of:
Priority Applications (1)
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