JP2008195683A - 遺伝子導入剤 - Google Patents

Abstract

【課題】血管内皮細胞への遺伝子導入も可能な遺伝子導入剤を提供する。
【解決手段】芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物よりなり、ＲＧＤ配列を有するペプチドを該高分子鎖に結合させてなる遺伝子導入剤。前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなる。前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖にポリアミノスチレンを導入し、さらにペプチドをそのアミノ基に末端のカルボキシル基を結合させるようにして導入している。
【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子導入剤に係り、特に、血管内皮細胞への遺伝子導入が可能な遺伝子導入剤に関する。

近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。

従来、細胞へ遺伝子を導入する技術としては次のようなものが知られているが、いずれも以下に述べるような欠点がある。
（１）ウイルスベクター法
（２）エレクトロポーション法、マイクロインジェクション法等
（３）リポフェクチン法、ポリカチオン法等

（１）ウイルスベクター法
ウイルス全般については、合成工程が複雑で感染の危険性がある；ウイルス内には挿入できないような大きな核酸が導入できない（例えばアデノウイルスでは、導入サイズは９０００ｂ以下である。）；といった欠点がある。

（２） 細胞膜に一時的に孔を開けるマイクロインジェクション、エレクトロポーション、遺伝子銃、マイクロジェット等による方法は、細胞膜が不可逆的な損傷を受け、溶解してしまうため、生存率も５０％以下と低い。神経細胞など増殖性の低い細胞の場合、生存率が低いことは大きな問題となる。即ち、遺伝子を導入できても、細胞が死滅してしまえば遺伝子導入の意味がない。

（３） 細胞のエンドサイトーシスを利用するリポフェクチン法、りん酸カルシウム法、Ｎａｋｅｄプラスミド法、ポリカチオン法は、一般的に遺伝子導入効率が低い。スター型ポリマーよりなるベクターがＷＯ２００４／０９２３８８に記載されているが、内皮細胞に効率よく遺伝子導入することについての記載はない。
なお、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸配列すなわちＲＧＤ配列を有するペプチドを含んだ、骨／歯成長促進のための歯科用製品が特開２００６−８３１７６に記載されている。
ＷＯ２００４／０９２３８８ 特開２００６−８３１７６

本発明は、上記従来の実状に鑑みてなされたものであって、血管内皮細胞への遺伝子導入も可能な遺伝子導入剤を提供することを目的とする。

請求項１の遺伝子導入剤は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物よりなり、ＲＧＤ配列を有するペプチドを該高分子鎖に結合させてなるものである。なお、ＲＧＤ配列は、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸配列である。

請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とするものである。

請求項３の遺伝子導入剤は、請求項２において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とするものである。

請求項４の遺伝子導入剤は、請求項３において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とするものである。

請求項５の遺伝子導入剤は、請求項４において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とするものである。

請求項６の遺伝子導入剤は、請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とするものである。

請求項７の遺伝子導入剤は、請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個導入されていることを特徴とするものである。

請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とするものである。

請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とするものである。

請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項９において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とするものである。

請求項１１の遺伝子導入剤は、請求項１ないし１０のいずれか１項において、ＲＧＤ配列を有するペプチドの分子量が３００〜５０００であることを特徴とするものである。

請求項１２の遺伝子導入剤は、請求項１ないし１１のいずれか１項において、前記高分子鎖にアミノ基が導入され、このアミノ基が前記ペプチドの末端のカルボキシル基と脱水縮合していることを特徴とするものである。

請求項１３の遺伝子導入剤は、請求項１２において、前記高分子鎖の一部がポリアミノスチレンで構成されており、前記アミノ基は該ポリアミノスチレンのアミノ基であることを特徴とするものである。

本発明の遺伝子導入剤で用いられる高分子化合物は、芳香環に複数の高分子鎖を導入してなるスター型分岐ポリマーであって、ＲＧＤ配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列）を有するペプチドがこの高分子鎖に結合している。

本発明の遺伝子導入剤は、この高分子化合物（ＲＧＤ配列を有するスター型分岐ポリマー）と遺伝子を混合してナノ粒子状のポリプレックスを形成させ、生体に投与される。

核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。本発明の遺伝子導入剤を用いた核酸含有複合体では、核酸をスター型分岐ポリマーとの凝集体とし、酵素から保護するので、少なくとも凝集体内部の核酸を生体内で正常に機能させることができる。

この遺伝子導入剤は、ＲＧＤ配列を有するペプチドを有していることにより、血管内皮細胞のインテグリンを介して血管内皮細胞内へも容易に侵入し得る。

なお、他の公知の合成カチオン性ポリマーと遺伝子のポリプレックスまたはカチオン性脂質と遺伝子のポリプレックスとＲＧＤ配列を有するペプチドを混合したものでトランスフェクションを行っても効果は得られない。一般のカチオン性ポリマーベクターと遺伝子のポリプレックスは、ペプチドなどを混合するとポリプレックス同士が凝集して沈殿していまい、遺伝子導入効果が発現されないのが一般的である。

本発明で使用したスター型分岐ポリマーは、その独自の分子構造によるイオン強度・電荷密度がポリプレックスの形成に至適と考えられ、水溶液中で安定して分散するポリプレックスが得られる。ポリプレックスへ包埋された遺伝子は、ペプチドはもちろん酵素の作用に対しても安定である。

本発明の遺伝子導入剤に結合されたペプチドは、ＲＧＤアミノ酸配列を有するものである。このＲＧＤ配列は、血管内皮細胞のインテグリンに対し指向性を有する。従って、このＲＧＤ配列を有するペプチドを固定した本発明の遺伝子導入剤であれば、血管内皮細胞への遺伝子導入が可能である。

以下に本発明の遺伝子導入剤の実施の形態を詳細に説明する。

［高分子化合物］
まず、本発明の遺伝子導入剤において用いられる高分子化合物について説明する。

この高分子化合物は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入され、かつこの高分子鎖にＲＧＤ配列を有するペプチドが化学結合された化合物である。

ここで、この高分子鎖の核となる芳香環としては、炭素数５〜８の芳香環、特に炭素数６の芳香環（即ちベンゼン環）の、単環又は２〜６個の縮合環、例えば、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環、ピレン環が挙げられ、好ましくはベンゼン環である。

核となる芳香環に導入される高分子鎖の数は、ベンゼン環であれば２〜６個、ナフタレン環の場合２〜８個、アントラセン環、ピレン環の場合２〜１０個であるが、多い程効果的であり、例えばベンゼン環であれば２，３，４又は６個、特に４又は６個、とりわけ６個であることが好ましい。

高分子鎖を導入するための原料となる芳香環化合物としては、例えば芳香環がベンゼン環の場合、次のようなベンゼン誘導体が挙げられる。

即ち、３分岐鎖用としては、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。

芳香環に導入された高分子鎖のうちの少なくとも一つ、好ましくはそのすべてがその先端側に活性高分子ブロック鎖を有するものである。この高分子鎖は、ビニル系単量体の単独又は異なるビニル系単量体の共重合体よりなるビニル系高分子ブロック鎖、特に３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨＣ_３Ｈ_６Ｎ（ＣＨ_３）_２等の重合体よりなるポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖であることが好ましい。

芳香環にこのような高分子鎖を導入してなる高分子化合物、例えば、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体よりなる高分子ブロック鎖を導入した高分子化合物を合成するには、まず、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドと前述の各ベンゼン誘導体とをメタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの低極性溶媒の溶液として混合し、光重合反応させることにより、ベンゼン環に対し上記ベンゼン誘導体由来の−ＣＨ_２−等を介して３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体が結合した高分子化合物を製造する。

次いで、この高分子ブロック鎖にアミノ基を導入する。このアミノ基を導入するには、アミノ基を有するポリマー鎖を上記高分子ブロック鎖に結合させるのが好ましい。アミノ基を有するポリマー鎖としては、ポリアミノスチレン、メタクリル酸２−アミノエチル、などが使用可能であるが、とりわけポリアミノスチレンが好適である。ポリアミノスチレンを導入するには、上記３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体が結合した高分子化合物を溶媒に溶解させ、アミノスチレンを添加し、光照射重合させるのが好ましい。高分子鎖１本当りに導入するポリアミノスチレンの重合度は２分子ブロック〜２０分子ブロック程度が好適である。

このようにアミノ基を導入した高分子化合物に対しＲＧＤ配列を有するペプチドを導入する。詳しくは、ペプチドのＣ末端及び又は側鎖（残基）のカルボキシル基と、上記アミノ基とを脱水縮合させる。このペプチドの分子量は３００〜５０００程度が好ましく、直鎖状でも環状でも構わない。ペプチドの例としては、『Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ』、『Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ』、『Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ-Ｐｒｏ-Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ』、『Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ』、『Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ』などが挙げられる。

ペプチドを上記アミノ基を有する高分子化合物に導入するには、この高分子化合物をリン酸バッファー中に溶解させ、Ｎ−［ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンアミドエステルを触媒として添加し、ペプチドを混合し、室温程度で反応させればよい。

このようにして合成された高分子化合物よりなる遺伝子導入剤の分子量は５千〜５０万、特に１万〜２０万、とりわけ１万〜１０万程度であることが好ましい。この分子量が過度に大きいと、高分子化合物及び核酸で複合体を形成させた際の複合体のサイズが大きくなったり、溶解性が低くなったり、生体内へ使用する場合に、排泄に不利になることが考えられる。逆に過度に小さいと低分子量有機化合物としての性質が強く発生して細胞毒性、高浸透圧、など生物学的な弊害が出てしまう。

また、１本の高分子鎖中のポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖を構成する単量体数は５〜１０００程度であることが好ましい。

なお、本発明では、前記ベンゼン誘導体に対し先ずアミノ基を有するポリマー鎖を導入し、その後、前記ビニル系高分子ブロック鎖を導入してもよい。この場合、ＲＧＤ配列を有するペプチドの結合は、ビニル系高分子ブロック鎖の導入前であっても後であってもよい。

［核酸］
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。

所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。

この核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチド特にＤＮＡが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。

核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。

また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。

また、アンチセンスによるリプレッシングの他に、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを使用したＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ破壊などに利用することも可能である。

［ポリプレックスの形成］
この遺伝子導入剤と核酸とを複合させてポリプレックスを形成するには、この遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤を核酸に対し飽和状態に複合化させるのが好ましい。

ポリプレックスの粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、ポリプレックス内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。

［生体への投与］
上述のような高分子化合物（ＲＧＤ配列を有するスター型分岐ポリマー）と核酸とのポリプレックスは、生体内へ投与される。

本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」は血管やリンパ管の内皮細胞とくに血管内皮細胞であるが、ＥＳ細胞にも適用可能であると推察される。

本発明の遺伝子導入剤は任意の方法で生体に投与することができる。

体内へ挿入するデバイスとしては、経皮的に患部付近の組織へ刺入するものや、血管カテーテル、ステントグラフトのように血管内へ留置するものなどがあるが、この限りではない。

当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。

この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。

また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。

投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。

この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患等が挙げられる。

以下に実施例１，２及び比較例１を挙げて本発明をより具体的に説明する。

＜ペプチド＞
この実施例１，２及び比較例１ではペプチドとして市販の試薬（シグマ社、Ａ８０５２、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を使用した。

＜遺伝子導入剤＞
また、スター型分岐ポリマー（高分子ブロック鎖導入高分子化合物）よりなる遺伝子導入剤としては、次の［１］〜［２］のようにして合成したものを用いた。

ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン５ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３１．８ｇをエタノール１Ｌ中へ加え、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、ここへ１５０ｍＬの水を加えて液抽出を行って臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させた。濾過後、ｎ−ヘキサンを加えて再結晶を行って、微かに淡青色を帯びたヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの白色結晶を得た（収率９０％）。

^１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ_３）の測定結果は、δ １．２６−１．３１（ｔ，３６Ｈ，Ｊ＝６．９ Ｈｚ，−ＣＨ_２ＳＣ（Ｓ）Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），３．７１−４．０１（ｗｑ，２４Ｈ，Ｊ＝６．９ Ｈｚ，−ＣＨ_２ＳＣ（Ｓ）Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２)，４．５７（ｓ，１２Ｈ，−ＣＨ_２ＳＣ（Ｓ）ＮＥｔ_２）であった。

［２］６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーの合成

モノマーの３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、ＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）は、減圧蒸留で精製した。ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルチオカルバミルメチル）ベンゼン８．７ｍｇを２０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド３．９ｇを加えて混合し、全量をクロロホルムで希釈して５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした。２００Ｗ高圧水銀灯で３０分間の紫外光照射を行った。照度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ^２（２５０ｎｍ）に調整した。３０分後、重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで再沈殿させて精製した。これを少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させてヘキサキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼン（６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー）を得た（重合率４０％）。

分子量はＧＰＣにより１７，３００と測定され、^１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ_２Ｏ）の測定結果は、δ １．００−１．７０（ｂｒ，４１６Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ−ａｎｄ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−) ，１．９０（ｂｒ，１０４Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ−），２．０９（ｓ，６２４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_３）_２），２．２５（ｂｒ，２０８Ｈ，−ＣＨ_２Ｎ（ＣＨ_３）_２），２．９８（ｂｒ，２０８Ｈ，−ＣＯＮＨＣＨ_２−）であり、６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーであることを確認した。

［３］６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳの合成
このｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳはヘキサキス｛（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル（ポリ４アミノスチレン））−ブロック−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼンの略語である。

このヘキサキス｛（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル（ポリ４アミノスチレン））−ブロック−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼンの合成は以下のように行った。前述のように合成した６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー１５０ｍｇをメタノールへ溶解し、４−アミノスチレン６２０ｍｇを混合して全量をメタノールで５０ｍＬに調整した。前述と同様の条件で光照射重合を行って、メタノール／ジエチルエーテル系で精製を行って６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーを得た(重合率３８％)。

分子量はＧＰＣにより、１８，３００と測定され、^１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ_２Ｏ）はδ １．００−１．７０（ｂｒ，４３２Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ− ａｎｄ −ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−），１．９０（ｂｒ，１０４Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ ｏｆ ＰＤＭＡＰＡＡｍ)，２．０６（ｓ，６２４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_３）_２ ｏｆ ＰＤＭＡＰＡＡｍ），２．２１（ｂｒ，２０８Ｈ，−ＣＨ_２Ｎ（ＣＨ_３）_２），３．０２（ｂｒ，２０８Ｈ，−ＣＯＮＨＣＨ_２−)，６．４０−６．８０（ｂｒ，１６Ｈ，３−Ｈ ａｎｄ ５−Ｈ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｒｉｎｇ ｐｒｏｔｏｎ），６．９５−７．３０（ｂｒ，１６Ｈ，２−Ｈ ａｎｄ ６−Ｈ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｒｉｎｇ ｐｒｏｔｏｎ）と測定された。

以上より、６分岐型ポリマーの６本のポリマー鎖に各々、６個モノマー単位のアミノスチレンがブロック化導入された６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳが合成された。

［４］６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーへのＲＧＤペプチドの導入

上記のＲＧＤペプチドを、その末端のカルボキシル基を６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳのアミノスチレン側鎖のアミノ基へ化学結合させることにより導入した。すなわち、６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーを１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．０）へ溶解し、濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。ここにＮ−［ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステルを終濃度０．１ｍＭとなるように混合し、室温で３０分間攪拌した。４倍モル量（実施例１）又は８倍モル量（実施例２）のＲＧＤペプチドを室温下で混合し、３時間放置した。未反応のペプチドなどを透析で除去して精製し、ＲＧＤペプチドが化学結合にて導入された６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーを得た。

＜ＲＧＤペプチドの導入の確認＞
ＲＧＤペプチド導入６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーを４Ｎの塩酸溶液に溶解し、終濃度を０．０１％とした。この溶液を高圧蒸気滅菌器により１２１℃で２０分間処理した。溶液をシリカゲルデシケーター中で減圧して放置し、乾燥させた。乾燥後、固形分から水溶性成分を採取し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過し、再度減圧乾燥させた。乾燥物をシリル化剤（Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド）で処理し、脱水酢酸エチルへ溶解し、ＧＣ−ＭＳ（島津製作所、ＱＰ５０５０）にて測定した。

Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ誘導体がほぼ１：１：１の比率で検出され、６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーへＲＧＤペプチドが導入されたことが確認された。

＜遺伝子導入実験に用いた細胞及びＤＮＡ＞
細胞にはマウス血管内皮細胞を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。

＜遺伝子導入実験＞
上記［４］にてＲＧＤペプチドを４倍モル量導入したものを実施例１とし、８倍モル量導入したものを実施例２とした。また、全く導入していないもの（［３］で合成した６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマー）を比較例とした。
これらの実施例１，２又は比較例の遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートし、これを培養細胞へ加えた。
トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１に示す。

図１の通り、ＲＧＤペプチドが結合された実施例１，２のｐＤＭＡＰＡＡＭホモポリマーを遺伝子導入剤として使用することにより、血管内皮細胞への効率の良い遺伝子導入が可能であることが確認された。

実施例及び比較例におけるルシフェラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。

Claims (13)

1. 芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物よりなり、ＲＧＤ配列を有するペプチドを該高分子鎖に結合させてなる遺伝子導入剤。
2. 請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
3. 請求項２において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とする遺伝子導入剤。
4. 請求項３において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とする遺伝子導入剤。
5. 請求項４において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
6. 請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
7. 請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
8. 請求項１ないし７のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とする遺伝子導入剤。
9. 請求項１ないし８のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
10. 請求項９において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
11. 請求項１ないし１０のいずれか１項において、ＲＧＤ配列を有するペプチドの分子量が３００〜５０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
12. 請求項１ないし１１のいずれか１項において、前記高分子鎖にアミノ基が導入され、このアミノ基が前記ペプチドの末端のカルボキシル基と脱水縮合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
13. 請求項１２において、前記高分子鎖の一部がポリアミノスチレンで構成されており、前記アミノ基は該ポリアミノスチレンのアミノ基であることを特徴とする遺伝子導入剤。

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