JP2008180683A - 試料物質を濃縮した表面機能性粒子への励起光の直接照射による高感度蛍光分析法の開発 - Google Patents

Abstract

【課題】 溶液に含有する極微の試料物質を官能基を有するシリカまたは金属酸化物を加え、試料物質を結合濃縮させ、直接励起光を照射し、生じる蛍光を分析する、高感度で操作が簡便な蛍光分析法を提供する。
【解決手段】 本分析法は励起光源、分光器、計測用ガラス細管、検出器からなる蛍光分光システムで行うもので、上記試料物質を濃縮したシリカまたは金属酸化物を封入した該ガラス細管に直接励起光を照射することによって、簡便で、かつ高感度で定量分析を行うことができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光性試料溶液中に表面機能性物質を添加し、試料を濃縮した表面機能性粒子に励起光を直接照射して、生じる蛍光を分析することを特徴とする微量蛍光性物質の高感度蛍光分析法に関する。

蛍光分析法は、蛍光性試料に励起光を照射し、試料物質の分子軌道電子が励起した後、基底状態に戻るとき発光する蛍光を測定する分析法である。そのため測定をしようとする試料は蛍光性物質でなければならず、試料が蛍光性物質でない場合には、当該試料に蛍光性物質を結合させて測定する必要がある。

蛍光分析法には、試料溶液に励起光を直接照射して、生じる蛍光を測定する方法および液体クロマトグラフと蛍光分析を結合して用いる方法（例えばＫ．Ｔｏｄｏｒｏｋｉ等 Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１０３８巻，１１３−１２０頁，２００３年）や表面機能性物質を充填したカラムに試料溶液を通し、試料をカラムに濃縮させ、その後適当な溶剤をカラムに通すことによって、試料を回収した溶液を液体クロマトグラフ−蛍光分析で定量測定する方法（例えば残留動物用医薬品試験法、ＧＬサイエンス（株））などが用いられている。これらの 従来の蛍光分析法による定量可能な試料の濃度範囲は数ｐｐｂから数十ｐｐｍの範囲である。

前記の液体クロマトグラフによる方法は、数ｐｐｂオーダーの高感度分析が可能であるが、液体クロマトグラフを用い蛍光分析を行うこと、場合によっては一旦試料を表面機能性物質に結合濃縮させ、その後試料を適当な溶剤を用い、表面機能性物質から再度抽出し、抽出液を液体クロマトグラフを用い蛍光分析するなどの煩雑な行程を含むものであった。

一方試料溶液を前記の行程なしに直接蛍光分析を行う方法には、以降で示すように、検出感度に限界があった。

発明が解決しようとする課題

本発明は、従来知られている最も感度の高い蛍光分析方法と同等な感度で蛍光性試料の定量分析が可能な蛍光分析法であって、かつ操作がはるかに簡便な蛍光分析法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

前記の目的を達成するために、本蛍光分析法は、表面機能性物質およびガラス細管を用いる蛍光分析法であることを要旨とする。

請求項１記載の本蛍光分析法は蛍光性試料の検出感度を増強するために、一定量の表面機能性物質を試料溶液に添加し、表面機能性物質に試料を結合濃縮することを特徴とする蛍光分析法である。試料溶液には水溶液またはメタノール溶液を用いる。

請求項２および３記載の本蛍光分析法は、前記の方法によって、溶液中に存在する極微の試料物質を結合濃縮させた表面機能性物質をガラス細管に封入し、該細管に励起光を直接照射し、生じる蛍光を分析することを特徴とする蛍光分析法である。

したがって本蛍光分析法は、励起光光源と分光器および検知器以外の液体クロマトグラフや試料抽出装置が不必要で、簡便で、操作が容易であり、迅速に測定することが可能である。

以下図面を用いて本発明の蛍光分析法の詳細について説明する。

図１は本発明にかかわる蛍光分析法の測定システムの概略図である。光源からの励起光は光路上に固定されたガラス細管（内径０．４ｍｍ）に封入した、試料分子を結合濃縮させた−ＳＨ官能基を有するシリカ粒子（富士シリシア（株）、以降ＳＨシリカと呼ぶ）に照射される。生じた蛍光は光源と直角方向に配置した検出器によって測定される。

実施形態１について説明する。

上記発明の実施の形態において説明した本発明の蛍光分析システムを用いてローダミンＢの定量測定を行った。ローダミンＢのカルボキシル基はＳＨシリカ表面のチオール基（ＳＨ基）と結合して、ＳＨシリカに図２のように固定される。

１２．５、２５、５０および１００ｎＭの濃度の異なる４種類のローダミンＢ溶液を作成し、ガラス細管を用い毛管現象によって各溶液を細管中にとり、一方の端をペースト（ＣＲＩＴＯＳＥＡＬ，ＨＥＬＩＸ Ｃｏ．Ｌｔｄ）で閉じ、図１に示した測定システムによって、それぞれの溶液の蛍光スペクトル測定を行った。

次に前述の濃度の異なる４種類のローダミンＢ溶液を各３ｍｌとり、それぞれの溶液にＳＨシリカを１２．５ｍｇ加え、ローダミンＢを結合させ、得られたローダミンＢの結合したシリカそれぞれ約２．５ｍｇを４個のガラス細管中に封入し、蛍光スペクトル測定を行った。

上記の測定はすべての濃度のローダミンＢ溶液についてそれぞれ４回ずつ測定を行った。測定結果の一例として、ローダミンＢ濃度１００ｎＭ溶液で得られた蛍光スペクトルを図３に示す。この結果はメタノール溶液中の試料で得られた結果で、以降の図はすべてメタノール溶液中の試料で得られた結果を示す。この図から明らかなように、再現性のよいスペクトルが得られた。

蛍光スペクトル強度はローダミンＢ溶液のサンプリング量２ｍｌまではサンプリング量の増加で増加するが、サンプリング量が２ｍｌから３ｍｌで最大となり、その後のサンプリング量の増加で減少に転ずる。この減少はＳＨシリカに結合濃縮したローダミンＢの構造変化に起因すると思われる。したがって試料溶液のサンプリング量は２ｍｌまたは３ｍｌとした。

次に図３に示したスペクトル曲線の極大のスペクトル強度と、スペクトル強度が波長に対して一定になる波長７００ｎｍのスペクトル強度との差をそれぞれのローダミン溶液で得られたスペクトル曲線から求め、得られたスペクトル強度差をローダミンＢ溶液濃度に対してプロットした。図４は上述の濃度の異なる４種類のローダミンＢ溶液について、それぞれの溶液中に添加後のＳＨシリカとＳＨシリカ無添加のローダミンＢ溶液で得られた蛍光分析結果を示す。

得られた蛍光強度差とローダミンＢの濃度との間には、ローダミンＢ濃度５ｐｐｂから５０ｐｐｂにわたって良い直線関係がなりたつ。

ローダミンＢの溶液に添加したＳＨシリカの励起光照射で得られた蛍光強度差はローダミンＢ溶液の励起光照射で得られた蛍光強度差に比べ著しく大きく、ＳＨシリカによるローダミンＢの濃縮効果が蛍光スペクトル強度差に顕著に現れている。

この結果から、ＳＨシリカを痕跡のローダミンＢを含むメタノールまたは水溶液中に添加し、ローダミンＢを結合濃縮させたＳＨシリカを蛍光分析することによって、感度を１０倍程度高めることができ、本発明の蛍光分析法はローダミンＢについて、検出限界濃度５ｐｐｂに達する高感度を有することが確かめられた。

ＳＨシリカに濃縮されたローダミンＢ量のローダミンＢ濃度に対する等温線を調べた。以下にこの実験行程を示す。

まず上記の４種のローダミンＢメタノール溶液２ｍｌをそれぞれガラス細管にとり、蛍光スペクトルを測定し、ローダミンＢ溶液濃度とスペクトル強度の検量線を作成した。

次にそれぞれの溶液２ｍｌにＳＨシリカを１２．５ｍｇ加え、ＳＨシリカにローダミンＢを結合濃縮させた後、溶液のみをガラス細管にとり、蛍光スペクトル測定を行った。得られたスペクトル強度と前記検量線から以下の関係を用いてローダミンＢの濃縮による濃度の減少量−ΔＣおよびＳＨシリカ１グラムあたりのローダミンＢの濃縮量Ａ_Ｒを各溶液について求め、ＳＨシリカ添加後のローダミンＢ濃度に対してプロットし、等温線を作成した。
−ΔＣ＝Ｃ_１−Ｃ_２ （式１）
Ａ_Ｒ＝（−ΔＣ）×２×（１／１２．５） （式２）
ここでＣ_１はそれぞれの溶液におけるローダミンＢ濃度、Ｃ_２はＳＨシリカを加えた後のそれぞれの溶液のローダミンＢ濃度である。

得られた結果を図５に示す。この結果から１０ｎＭから９５ｎＭの濃度にわたって直線性のよい等温線が得られ、ＳＨシリカ１グラム当りに濃縮されたローダミンＢの量は０．４から２．３ミリモルとなることがわかる。

次に実施形態２について説明する。

上記の発明の実施の形態において説明した本発明の蛍光分析システムを用いて、メチレンブルーの定量分析を行った。メチレンブルーは溶液中で陽イオンとなり、シリカゲルのヒドロキシル基とイオン結合することによって、シリカ表面に図６のように固定される。

０．６２５、１．２５、２．５および５μＭの濃度の異なる４種類のメチレンブルーメタノール溶液を作成し、実施形態１と同じ方法でそれぞれの溶液をガラス細管にとり、図１に示した測定システムによって、蛍光スペクトルを測定した。

次に前述の４種類のメチレンブルー溶液を各１ｍｌとり、それぞれの溶液にシリカ（ＣＡＲｉＡＣＴ Ｑ−１０，富士シリシア（株），粒子径１００ｎｍ）１２．５ｍｇを加え、メチレンブルーを結合させ、得られたメチレンブルーの結合したシリカ２．５ｍｇをそれぞれ４個のガラス細管中に封入し、蛍光スペクトルを測定した。蛍光スペクトルは実施形態１の場合と同様、再現性良く測定された。

得られた濃度の異なるメチレンブルー溶液の蛍光スペクトルから、実施形態１の場合と同じ方法で得られたスペクトル強度差をメチレンブルー濃度に対してプロットした。結果を図７に示す。

得られた蛍光強度差とメチレンブルー濃度の間には、濃度０．１５−１．５ｐｐｍの範囲にわたってよい直線性が成り立つことがわかる。

メチレンブルーメタノール溶液に添加したシリカの励起光照射で得られた蛍光強度はメチレンブルー溶液の励起光照射で得られた蛍光強度に比べ著しく大きく、ローダミンＢ同様シリカによるメチレンブルーの濃縮効果が蛍光強度に顕著に現れることがわかる。

この結果から、シリカを痕跡のメチレンブルーを含む溶液に添加し、メチレンブルーをシリカ上に濃縮させ、これを蛍光分析することによって、感度を１５倍程度増強することができ、本発明の蛍光分析はメチレンブルーについて、検出限界濃度３０ｐｐｂに達する感度を有することが確かめられた。

（式１）、（式２）を用い、上記ローダミンＢの場合と同じ方法で求めたシリカ１ｇあたりに濃縮されたメチレンブルーの量は４５ｎｍｏｌから３１０ｎｍｏｌの範囲であった。

水溶液の場合は、メタノール溶液の場合に比ベローダミンＢ、ベチレンブルー双方の場合とも蛍光強度差と溶液濃度の関係は直線性が成立するが、測定プロットにメタノール溶液に比べいくらかばらつきがみられた。測定感度に関しては双方の溶液で本質的な違いがみられなかった。

利用分野

本発明は生体細胞や生乳、奨液、脳脊髄液など多くの生体物質を含む測定対象からがん細胞や、これらの物質に含まれる微量の抗生物質をローダミンＢやメチレンブルーなど種々の蛍光性物質を結合させることによって、定量分析を行うための簡便で高感度を有する蛍光分析法の開発に関する。

発明の効果

以上説明したように本発明の蛍光分析法は下記の効果を有する。

１．本蛍光分析法は極めて高感度であり、ローダミンＢでは５ｐｐｂ以上の濃度範囲、メチレンブルーでは３０ｐｐｂ以上の濃度範囲で定量的に測定することができる。

２ メタノール溶液や水溶液中に含まれる極微の試料は表面機能性物質の官能基によって結合濃縮され、該表面機能性物質に直接励起光を照射することによって、蛍光分析感度を著しく高めた。

３．前記に示したように、試料に直接励起光を照射し、蛍光を測定する方式により、蛍光測定システムが簡便であり、測定操作が容易である。

４．したがって本発明の蛍光分析法は医療分野、生理学分野、食品工業分野を問わず、広い産業および科学研究分野で応用されることが期待できる。

図１ 蛍光測定システムの側面図および平面図を示す図である。
図２ ローダミンＢのＳＨシリカへの結合を示す図である。
図３ ローダミンＢ濃度１００ｍＭ溶液中でローダミンＢを結合濃縮させた４つの異なるＳＨシリカ試料で測定した蛍光スペクトルを示す図である。
図４ ＳＨシリカに結合濃縮されたローダミンＢと用いたローダミンＢ溶液濃度およびローダミンＢ溶液のローダミンＢ濃度に対する蛍光強度を示す図である。
図５ ４つの濃度の異なるそれぞれのローダミンＢ溶液にＳＨシリカを添加後に到達するローダミンＢ濃度に対する該ＳＨシリカに結合濃縮したローダミンＢ量の関係を示す図である。
図６ シリカに結合濃縮されたメチレンブルーと用いたメチレンブルー溶液濃度およびメチレンブルー溶液のメチレンブルー濃度に対する蛍光強度を示す図である。

符号の説明

１１光源
１２検出器
１３分光器
１４励起光光路
１５蛍光光路
１６レンズ
１７ＳＨシリカまたはシリカ
１８ガラス細管

Claims (3)

1. 極微の蛍光性試料を含む溶液に、試料に対し活性な特有の官能基を有するシリカまたは金属酸化物（以下表面機能性物質）を加え、試料物質を結合濃縮させた該表面機能性物質に直接励起光を照射する方法によって、試料物質の検出感度を著しく向上させた高感度蛍光分析法。
2. 前記濃縮法により、試料物質を濃縮させた表面機能性物質をガラス細管中に封入し、ガラス細管を通して表面機能性物質に直接励起光を照射し、生じる蛍光を測定することを特徴とする高感度蛍光分析法。
3. 前記測定方法により、試料物質を結合濃縮させた表面機能性物質から試料物質をなんらかの溶剤によって抽出し、液体クロマトグラフを使用する煩雑な行程を経ることなく分析することを可能にした、簡易化された高感度蛍光分析法。

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