JP2008179710A - Method for producing low-molecular-weight hyaluronic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は低分子量ヒアルロン酸の製造方法、特に簡便で時間的、コスト的に有利であり、着色も生じない低分子量ヒアルロン酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing low molecular weight hyaluronic acid, and particularly to a method for producing low molecular weight hyaluronic acid which is convenient, advantageous in terms of time and cost, and does not cause coloring.
ヒアルロン酸は、化粧料、医薬品、食品などの分野において用いられており、その低分子量化技術としてはアルカリあるいは酸を用いて加水分解することが知られている（特許文献１〜２）。従来の方法は、ヒアルロン酸水溶液をアルカリあるいは酸で処理して低分子量化するものである。
Hyaluronic acid is used in the fields of cosmetics, pharmaceuticals, foods, and the like, and as its low molecular weight technology, it is known to hydrolyze using an alkali or an acid (
しかしながら、ヒアルロン酸は分子量が非常に大きく、水に溶解した場合には低濃度でも水溶液の粘弾性が非常に大きくなるため、工業的規模で水に溶解するには非常に時間と手間がかかり、また、ヒアルロン酸水溶液の濃度を高くできないという問題があった。また、ヒアルロン酸水溶液をアルカリや酸で処理して低分子量化した後は、ＣＰＣなどのカウンターイオンやアルコールを用いて水溶液から低分子量化ヒアルロン酸を沈殿させる必要があるため、工程が煩雑となり、収率も低く、コスト面でも不利であった。さらに、ヒアルロン酸水溶液をアルカリや酸で処理した場合にはヒアルロン酸が劣化して褐変することがあった。
本発明は、前記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、より簡便且つ低コストで収率が高く、またヒアルロン酸の着色も生じず、工業的な大量生産にも好適な低分子量化ヒアルロン酸の製造方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and the object thereof is simpler, lower cost, higher yield, no coloration of hyaluronic acid, and suitable for industrial mass production. The object is to provide a method for producing low molecular weight hyaluronic acid.
前記課題を達成するために本発明者らは鋭意検討を行った結果、ヒアルロン酸粉末を溶解させずに、含水液媒体中に粉末のまま分散させた状態で、酸の存在下においてマイクロ波を照射して加水分解することにより低分子量化することができ、しかも着色も生じないことを見出し、本発明を完成するに至った。 In order to achieve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted intensive investigations. As a result, the hyaluronic acid powder was not dissolved but dispersed in a hydrated liquid medium in the form of a powder, and microwaves were present in the presence of an acid. It has been found that the molecular weight can be reduced by irradiation and hydrolysis, and no coloration occurs, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明にかかる低分子量化ヒアルロン酸の製造方法は、ヒアルロン酸粉末を、ヒアルロン酸粉末を溶解しない含水液媒体中に分散させた状態で、酸の存在下においてマイクロ波を照射することにより加水分解して低分子量化することを特徴とする。
本発明の方法において、前記含水液媒体が、ヒアルロン酸粉末を溶解せず且つ水を溶解する有機溶媒と、水と、酸と、を含む一液相であることが好適である。
また、本発明の方法において、前記有機溶媒がメタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールから選ばれる少なくとも一つであることが好適である。
That is, the method for producing low molecular weight hyaluronic acid according to the present invention comprises irradiating microwaves in the presence of an acid in a state where the hyaluronic acid powder is dispersed in a water-containing liquid medium that does not dissolve the hyaluronic acid powder. It is characterized by lowering the molecular weight by hydrolysis.
In the method of the present invention, it is preferable that the aqueous liquid medium is a one-liquid phase containing an organic solvent that does not dissolve hyaluronic acid powder and dissolves water, water, and an acid.
In the method of the present invention, it is preferable that the organic solvent is at least one selected from methanol, ethanol, propanol and isopropanol.
本発明の方法によれば、含水液媒体中にヒアルロン酸粉末を溶解させずに粉末のまま分散させた状態で、酸存在下においてマイクロ波を照射することにより低分子量化するため、従来のヒアルロン酸水溶液を用いた低分子量化方法におけるヒアルロン酸溶解工程及び沈殿工程を省略することができ、収率も高く、時間的、コスト的に非常に有利である。特に、マイクロ波照射は短時間での低分子量化に有効である。また、本発明の方法によれば低分子量ヒアルロン酸の着色も生じない。 According to the method of the present invention, the hyaluronic acid powder is dispersed in the water-containing liquid medium without being dissolved, and the molecular weight is reduced by irradiation with microwaves in the presence of an acid. The hyaluronic acid dissolution step and the precipitation step in the method for reducing the molecular weight using an acid aqueous solution can be omitted, and the yield is high, which is very advantageous in terms of time and cost. In particular, microwave irradiation is effective for reducing the molecular weight in a short time. Further, according to the method of the present invention, coloring of low molecular weight hyaluronic acid does not occur.
本発明の方法は、ヒアルロン酸粉末を含水液媒体中に溶解させずに粉末のまま分散させた状態で、酸の存在下においてマイクロ波を照射することにより加水分解して低分子量化するものである。加水分解後は、固液分離して得られた粉末を洗浄、乾燥すれば低分子量化されたヒアルロン酸粉末が得られる。 In the method of the present invention, hyaluronic acid powder is hydrolyzed and reduced in molecular weight by irradiating with microwaves in the presence of acid in a state where the powder is dispersed without being dissolved in a water-containing liquid medium. is there. After the hydrolysis, the powder obtained by solid-liquid separation is washed and dried to obtain a low molecular weight hyaluronic acid powder.
ヒアルロン酸は、鶏冠のトサカなどの生体組織からの抽出、あるいは微生物を用いた培養などにより工業的に生産されており、その塩（ナトリウム塩など）も市販されている。本発明においては、含水液媒体中で溶解せずに粉末状態で分散し得る限りにおいてヒアルロン酸あるいはその塩を用いることができる。本発明においては、これをヒアルロン酸粉末という。 Hyaluronic acid is industrially produced by extraction from living tissue such as chicken crown Tosaka, or culture using microorganisms, and salts thereof (such as sodium salts) are also commercially available. In the present invention, hyaluronic acid or a salt thereof can be used as long as it can be dispersed in a powder state without being dissolved in a water-containing liquid medium. In the present invention, this is referred to as hyaluronic acid powder.
ヒアルロン酸粉末を分散させて低分子量化処理を行う含水液媒体としては、ヒアルロン酸粉末を溶解せず、水と、酸と、を含む一液相からなる液媒体を用いる。具体的には、ヒアルロン酸粉末を溶解せず且つ水を溶解する有機溶媒を主体とし、水と、酸と、を含む液媒体を用いることができる。
なお、本発明においてヒアルロン酸粉末を溶解しないとは、ヒアルロン酸粉末の溶解度が０．１ｇ／Ｌ（２５℃）以下であることを意味するものとする。
As the water-containing liquid medium in which the hyaluronic acid powder is dispersed and the molecular weight reduction treatment is performed, a liquid medium that does not dissolve the hyaluronic acid powder but includes water and an acid is used. Specifically, a liquid medium mainly containing an organic solvent that does not dissolve the hyaluronic acid powder and dissolves water and contains water and an acid can be used.
In the present invention, not dissolving the hyaluronic acid powder means that the solubility of the hyaluronic acid powder is 0.1 g / L (25 ° C.) or less.
ヒアルロン酸粉末を溶解せず且つ水を溶解する有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の低級アルコール類；アセトン等のケトン類；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類；ジメチルホルムアミド等のアミド類などが挙げられるが、コストや使用性、安全性等を考慮すれば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコールが好適である。 Examples of organic solvents that do not dissolve hyaluronic acid powder and dissolve water include lower alcohols such as methanol, ethanol, propyl alcohol, and isopropyl alcohol; ketones such as acetone; sulfoxides such as dimethyl sulfoxide; dimethylformamide and the like In view of cost, usability, safety and the like, methanol, ethanol, propyl alcohol, and isopropyl alcohol are preferable.
液媒体には、ヒアルロン酸粉末を加水分解して低分子量化するための水を含む。また、水は、後述する酸を液媒体中に均一に溶解する役割も果たす。ただし、水の量が多すぎると液媒体中にヒアルロン酸粉末が溶解し、系が増粘したり処理中にヒアルロン酸が劣化することがあるので好ましくない。また、水が有機溶媒に溶解せずに分離して２液相となった場合には効率が悪く、また、水相にヒアルロン酸粉末が溶解してしまい、系が増粘したりヒアルロン酸の劣化を招くこともある。 The liquid medium contains water for hydrolyzing the hyaluronic acid powder to lower the molecular weight. Water also serves to uniformly dissolve the acid described later in the liquid medium. However, if the amount of water is too large, the hyaluronic acid powder dissolves in the liquid medium and the system thickens or the hyaluronic acid may deteriorate during the treatment, which is not preferable. In addition, when water does not dissolve in an organic solvent and separates into a two-liquid phase, the efficiency is poor, and the hyaluronic acid powder dissolves in the aqueous phase, resulting in thickening of the system or hyaluronic acid. It may cause deterioration.
よって、含水液媒体中の水の含有量の上限は、ヒアルロン酸粉末が溶解せず、且つ含水液媒体が一液相となる量とすることができる。有機溶媒としてメタノールやエタノール、プロパノール、イソプロパノールなどヒアルロン酸粉末が溶解しないものを用いることが重要である。例えば、エタノールを用いても、含水液媒体中における水の含有量が多いとヒアルロン酸粉末が溶解・膨潤し、液媒体中において粉末状態で攪拌することが困難となるなど操作性が著しく低下する場合がある。加熱や低分子量化による溶解度上昇も考慮すれば、液媒体中における水の含有量は１０容量％以下とすることが好適である。なお、酢酸ナトリウムや塩化ナトリウム等の塩析剤を含水媒体中に添加する場合にはこの限りではない。
また、液媒体中における水の含有量は１容量％以上、さらには５容量％以上とすることが好適である。
Therefore, the upper limit of the water content in the water-containing liquid medium can be set to an amount that does not dissolve the hyaluronic acid powder and the water-containing liquid medium becomes one liquid phase. It is important to use an organic solvent that does not dissolve hyaluronic acid powder, such as methanol, ethanol, propanol, and isopropanol. For example, even if ethanol is used, if the water content in the water-containing liquid medium is large, the hyaluronic acid powder dissolves and swells, making it difficult to stir in the powder state in the liquid medium. There is a case. Considering the increase in solubility due to heating or lowering the molecular weight, the content of water in the liquid medium is preferably 10% by volume or less. Note that this is not the case when a salting-out agent such as sodium acetate or sodium chloride is added to the water-containing medium.
The water content in the liquid medium is preferably 1% by volume or more, and more preferably 5% by volume or more.
含水液媒体には、ヒアルロン酸の加水分解を速やかに進行させる触媒として酸を溶解させる。酸としては特に限定されず、従来からヒアルロン酸の低分子量化に使用されているものを用いることができる。例えば、酸としては、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸等が挙げられる。 In the water-containing liquid medium, an acid is dissolved as a catalyst for promptly proceeding with the hydrolysis of hyaluronic acid. It does not specifically limit as an acid, The thing conventionally used for the molecular weight reduction of hyaluronic acid can be used. For example, examples of the acid include hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid and the like.
含水液媒体中における酸の濃度は、０．０１〜２Ｎ、好ましくは０．０３〜０．５Ｎである。濃度が小さすぎると加水分解がほとんど進行せず時間がかかりすぎる。一方、濃度を過剰に高くしてもそれに見合った効果は期待できず、かえって好ましくない反応を引き起こす懸念がある。
これらの酸は含水液媒体に均一に溶解していることが好ましい。分離している場合には効果が十分に発揮されないことがある。また、加水分解後の酸の除去が煩雑になる。
The concentration of the acid in the aqueous liquid medium is 0.01 to 2N, preferably 0.03 to 0.5N. If the concentration is too small, hydrolysis hardly proceeds and it takes too much time. On the other hand, even if the concentration is excessively high, an effect commensurate with it cannot be expected, and there is a concern of causing an undesirable reaction.
These acids are preferably dissolved uniformly in the aqueous liquid medium. When separated, the effect may not be fully exhibited. Moreover, the removal of the acid after hydrolysis becomes complicated.
本発明においては、ヒアルロン酸粉末が含水液媒体中で溶解せずに分散状態を維持する限りにおいて、ヒアルロン酸粉末、水、有機溶媒、酸の配合順序は制限されない。例えば、水及び有機溶媒を含む含水液媒体にヒアルロン酸粉末を分散してから酸（水溶液でもよい）を添加して、加水分解を行うことができる。あるいは含水液媒体中に酸を予め配合しておき、これにヒアルロン酸粉末を添加、分散して加水分解を行うこともできるが、これらに限定されるものではない。また、ヒアルロン酸粉末は予め有機溶媒に分散させて添加することもできる。 In the present invention, as long as the hyaluronic acid powder is not dissolved in the water-containing liquid medium and maintained in a dispersed state, the blending order of the hyaluronic acid powder, water, the organic solvent, and the acid is not limited. For example, the hydrolysis can be carried out by adding an acid (or an aqueous solution) after dispersing the hyaluronic acid powder in a water-containing liquid medium containing water and an organic solvent. Alternatively, it is possible to preliminarily mix the acid in the water-containing liquid medium, and then add and disperse the hyaluronic acid powder to carry out the hydrolysis, but it is not limited thereto. Further, the hyaluronic acid powder can be added after being dispersed in an organic solvent in advance.
本発明においては、このような酸含有ヒアルロン酸分散液にマイクロ波を照射する。マイクロ波を照射することにより、ヒアルロン酸の低分子量化を著しく促進することができ、分子量１万以下のヒアルロン酸でも効率よく得ることができる。このような効果は、酸の非存在下では十分に発揮されない。
本発明において、マイクロ波は波長約１ｃｍ〜１ｍ（周波数約３００ＭHｚ〜３０ＧＨｚに相当）の電磁波を指し、代表的なものは２４５０ＭＨｚ付近の電磁波である。マイクロ波の発振には、通常マグネトロン、クライストロン、ジャイロトロンなどが用いられる。
マイクロ波の照射条件は、目的とする分子量に応じて適宜決定することができるが、例えば、約２４５０Ｈｚのマイクロ波であれば、８０Ｗ〜１２００Ｗの出力で１０秒〜２時間程度照射することができる。
In the present invention, such an acid-containing hyaluronic acid dispersion is irradiated with microwaves. By irradiating with microwaves, the molecular weight of hyaluronic acid can be significantly reduced, and even hyaluronic acid having a molecular weight of 10,000 or less can be obtained efficiently. Such an effect is not sufficiently exhibited in the absence of an acid.
In the present invention, the microwave refers to an electromagnetic wave having a wavelength of about 1 cm to 1 m (corresponding to a frequency of about 300 MHz to 30 GHz), and a typical one is an electromagnetic wave around 2450 MHz. For the microwave oscillation, a magnetron, a klystron, a gyrotron, or the like is usually used.
The microwave irradiation conditions can be appropriately determined according to the target molecular weight. For example, if the microwave is about 2450 Hz, the irradiation can be performed for 10 seconds to 2 hours at an output of 80 W to 1200 W. .
マイクロ波照射により分散液の温度が上昇することがある。また、追加的に加熱してもよい。反応温度としては、２０〜１００℃とすることができるが、好ましくは２５〜１００℃である。なお、温度上昇によりヒアルロン酸粉末ならびに低分子量化したヒアルロン酸粉末が含水液媒体中に溶解しないように留意する。例えば、水を減量したり、酢酸ナトリウムや塩化ナトリウムなどの塩析剤を含水液媒体中に溶解させておくなどすることができる。なお、同じ反応温度であってもマイクロ波照射下では非マイクロ波照射下に比べてより反応が促進される。
加水分解後は、遠心分離や濾過など公知の方法により固液分離し、得られた粉末を常法により洗浄、乾燥することにより、低分子量化されたヒアルロン酸粉末を得ることができる。
Microwave irradiation may increase the temperature of the dispersion. Moreover, you may heat additionally. The reaction temperature can be 20 to 100 ° C., preferably 25 to 100 ° C. Note that the hyaluronic acid powder and the hyaluronic acid powder having a reduced molecular weight are not dissolved in the water-containing liquid medium due to the temperature rise. For example, the amount of water can be reduced, or a salting-out agent such as sodium acetate or sodium chloride can be dissolved in a water-containing liquid medium. Even at the same reaction temperature, the reaction is further promoted under microwave irradiation than under non-microwave irradiation.
After hydrolysis, solid-liquid separation is performed by a known method such as centrifugation or filtration, and the obtained powder is washed and dried by a conventional method, whereby a hyaluronic acid powder having a reduced molecular weight can be obtained.
従来のヒアルロン酸水溶液を加水分解する方法では、ヒアルロン酸が低濃度でも非常に高粘度となるため、水溶液の調製が非常に困難である。このため、処理に使用されるヒアルロン酸水溶液の濃度は通常１ｗ／ｖ％以下である。
これに対して、本発明の方法では、ヒアルロン酸粉末を溶解させずに粉末状態のまま液媒体中に分散させるので、液相の増粘が起こらない。分散液は、マグネティックスターラーや攪拌棒、振盪機などによる攪拌も非常に容易である。また、反応中においても液相の増粘は生じない。従って、高濃度のヒアルロン酸分散液を処理可能である。本発明においては、分散液中のヒアルロン酸粉末濃度は特に反応に支障のない限り制限されず、５０ｗ／ｖ％の高濃度でも処理可能であるが、通常０．１〜３０ｗ／ｖ％、好ましくは１〜２５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは２〜２０ｗ／ｖ％である。
In the conventional method of hydrolyzing a hyaluronic acid aqueous solution, it is very difficult to prepare an aqueous solution because hyaluronic acid has a very high viscosity even at a low concentration. For this reason, the density | concentration of the hyaluronic acid aqueous solution used for a process is 1 w / v% or less normally.
On the other hand, in the method of the present invention, the hyaluronic acid powder is not dissolved but dispersed in the liquid medium in the powder state, so that the liquid phase does not thicken. The dispersion is very easy to stir with a magnetic stirrer, stir bar, shaker or the like. Further, no thickening of the liquid phase occurs during the reaction. Therefore, a high concentration hyaluronic acid dispersion can be processed. In the present invention, the concentration of hyaluronic acid powder in the dispersion is not particularly limited as long as it does not hinder the reaction, and treatment is possible even at a high concentration of 50 w / v%, but usually 0.1 to 30 w / v%, preferably Is 1 to 25 w / v%, more preferably 2 to 20 w / v%.
また、本発明の方法によれば、従来非常に時間のかかっていたヒアルロン酸の溶解工程が不要である。また、加水分解処理後も低分子量化ヒアルロン酸が溶解せずに粉末のままであるので、従来のヒアルロン酸水溶液を用いた方法のようにＣＰＣなどのカウンターイオンやアルコールで低分子量化ヒアルロン酸を沈殿させる必要がない。また、着色も生じない。従って、本発明の方法によれば、従来法に比べて非常に効率がよく、製造時間やコストを大幅に低減できる。 Moreover, according to the method of the present invention, the hyaluronic acid dissolving step, which has been very time-consuming, is unnecessary. In addition, since the low molecular weight hyaluronic acid is not dissolved but remains in powder form after the hydrolysis treatment, the low molecular weight hyaluronic acid is reduced with a counter ion such as CPC or alcohol as in the conventional method using an aqueous solution of hyaluronic acid. There is no need to precipitate. Also, no coloring occurs. Therefore, according to the method of the present invention, it is very efficient as compared with the conventional method, and the manufacturing time and cost can be greatly reduced.
本発明の方法においては、反応温度、反応時間、用いる原料の種類や濃度等により種々の分子量の低分子量ヒアルロン酸を得ることができる。よって、所望の分子量に応じてこれらを適宜決定すればよい。 In the method of the present invention, low molecular weight hyaluronic acid having various molecular weights can be obtained depending on the reaction temperature, reaction time, type and concentration of raw materials used. Therefore, these may be appropriately determined according to the desired molecular weight.
また、上記のように、本発明においては塩析剤を用いてもよく、これにより含水液媒体中の水含有量を多くしても、ヒアルロン酸粉末の含水液媒体への溶解を防ぎ、ヒアルロン酸の劣化を抑制することができる。このような塩析剤としては、含水液媒体に溶解することによってヒアルロン酸粉末あるいはその低分子量化物の水への溶解を抑制できるものであれば特に制限されない。例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。 In addition, as described above, a salting-out agent may be used in the present invention, thereby preventing the hyaluronic acid powder from dissolving in the water-containing liquid medium even if the water content in the water-containing liquid medium is increased. Acid degradation can be suppressed. Such a salting-out agent is not particularly limited as long as it can suppress dissolution of hyaluronic acid powder or a low molecular weight product thereof in water by dissolving in a water-containing liquid medium. For example, sodium acetate, sodium lactate, sodium perchlorate, sodium chloride and the like can be mentioned.
例えば、エタノールを用いても、含水液媒体中における水の含有量が多いとヒアルロン酸粉末が溶解・膨潤し、液媒体中において粉末状態で攪拌することが困難となるなど操作性が著しく低下する場合がある。加熱や低分子量化による溶解度上昇も考慮すれば、塩析剤を用いなければ、含水液媒体中における水の含有量を１０容量％以上とすることは困難であるが、酢酸ナトリウム等の塩析剤を含水液媒体中１．０ｗ／ｖ％以上含有する場合には、水の含有量は３０容量％程度まで増量しても問題ない。同様に、メタノールを用いても、２５℃においては塩析剤を用いなければ、含水液媒体中における水の含有量を２０容量％以上とすることは困難であるが、酢酸ナトリウム等の塩析剤を含水液媒体中１０ｗ／ｖ％以上含有する場合には、水の含有量は５０容量％程度まで増量しても問題ない。
従って、塩析剤の使用により水使用量を増大でき、有機溶媒の使用量の低減が可能であるので、製造コストの点で非常に有利である。また、近年はグリーンケミストリーの観点から有機溶媒使用量の低減が強く望まれているところであり、この点においても優れている。
For example, even if ethanol is used, if the water content in the water-containing liquid medium is large, the hyaluronic acid powder dissolves and swells, making it difficult to stir in the powder state in the liquid medium. There is a case. Considering the increase in solubility due to heating or lowering the molecular weight, it is difficult to increase the water content in the hydrated liquid medium to 10% by volume or more without using a salting-out agent. When the agent is contained in the aqueous liquid medium in an amount of 1.0 w / v% or more, there is no problem even if the water content is increased to about 30% by volume. Similarly, even when methanol is used, if a salting-out agent is not used at 25 ° C., it is difficult to increase the water content in the water-containing liquid medium to 20% by volume or more. When the agent is contained in the aqueous liquid medium at 10 w / v% or more, there is no problem even if the water content is increased to about 50% by volume.
Therefore, the amount of water used can be increased by using a salting-out agent, and the amount of organic solvent used can be reduced, which is very advantageous in terms of production cost. In recent years, reduction of the amount of organic solvent used is strongly desired from the viewpoint of green chemistry, and this point is also excellent.
塩析剤を用いる場合には、含水液媒体や塩析剤などにもよるが、含水液媒体中における水の含有量を１０容量％以上、さらには２０容量％以上とすることができる。
塩析剤は、含水液媒体中０．５ｗ／ｖ％以上、さらには１．０ｗ／ｖ％以上配合することが好適である。少なすぎると塩析剤の効果が充分に発揮されない。塩析剤は含水液媒体に対する飽和溶解度以下の濃度で使用可能であるが、多量に用いた場合には低分子量化ヒアルロン酸からの除去に時間がかかる場合がある。よって、塩析剤は含水液媒体中において２０ｗ／ｖ％以下、さらには１０ｗ／ｖ％以下とすることが好適である。
以下、具体例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
When a salting-out agent is used, although depending on the water-containing liquid medium and the salting-out agent, the water content in the water-containing liquid medium can be 10% by volume or more, and further 20% by volume or more.
The salting-out agent is preferably blended in the water-containing liquid medium at 0.5 w / v% or more, more preferably 1.0 w / v% or more. When the amount is too small, the effect of the salting-out agent is not sufficiently exhibited. The salting-out agent can be used at a concentration equal to or lower than the saturation solubility in the water-containing liquid medium, but when used in a large amount, it may take time to remove from the low molecular weight hyaluronic acid. Therefore, the salting-out agent is preferably 20 w / v% or less, more preferably 10 w / v% or less in the aqueous liquid medium.
Hereinafter, the present invention will be described with specific examples, but the present invention is not limited thereto.
試験例１
ヒアルロン酸（分子量１２０万）０．１ｇを、ガラス容器中、各種液媒体５０ｍＬに分散した。これを攪拌しながら、約１００Ｗの出力でマイクロ波（約２４５０Ｈｚ）を３０分間照射した。対照として、マイクロ波を照射せずに室温で３０分間攪拌した。処理後、遠心分離により固液分離し、得られた粉末を９０％エタノール、次いで９９．５％エタノールで洗浄、乾燥した。
乾燥後、内因性粘度を測定し、Ｌａｕｒｅｎｔらの定数（Ａ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ４２， ４７６−４８５，１９６０）を用いて平均分子量に換算した。結果を表１に示す。
Test example 1
0.1 g of hyaluronic acid (molecular weight 1,200,000) was dispersed in 50 mL of various liquid media in a glass container. While stirring this, microwaves (about 2450 Hz) were irradiated for 30 minutes at an output of about 100 W. As a control, the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes without being irradiated with microwaves. After the treatment, solid-liquid separation was performed by centrifugation, and the obtained powder was washed with 90% ethanol and then 99.5% ethanol and dried.
After drying, intrinsic viscosity was measured and converted to average molecular weight using Laurent et al. Constants (A Biochem. Biophys. Acta 42, 476-485, 1960). The results are shown in Table 1.
表１のように、ヒアルロン酸粉末分散液に酸存在下でマイクロ波を照射することによって、ヒアルロン酸の低分子量化が著しく促進された。また、着色も認められなかった。酸の非存在下では、マイクロ波照射しても低分子量化の促進作用はほとんど認められなかった。 As shown in Table 1, lowering the molecular weight of hyaluronic acid was significantly promoted by irradiating the hyaluronic acid powder dispersion with microwaves in the presence of acid. Also, no coloring was observed. In the absence of acid, microwave irradiation hardly promoted the reduction in molecular weight.
試験例２ マイクロ波による加熱の影響
ヒアルロン酸（分子量１２０万）３ｇを、ガラス容器中、０．０３Ｎ塩酸含有９０％エタノール５０ｍＬに分散した分散液に、出力約１００Ｗでマイクロ波（約２４５０Ｈｚ）を２時間照射し、分子量の変化を経時的に調べた。なお、マイクロ波照射により分散液は加熱されて約８０℃の還流状態となったため、対照としてはマイクロ波を照射せずに８０℃で２時間加熱還流した。処理後、試験例１と同様に固液分離、洗浄、乾燥し、分子量を測定した。結果を図１に示す。
図１からわかるように、何れの試験系においてもヒアルロン酸の分子量は処理時間とともに低下したが、マイクロ波を照射した場合には、加熱還流のみ（マイクロ波非照射）の場合に比べても分子量がより低くなった。また、着色も認められなかった。
Test Example 2 Effect of Heating by Microwave In a dispersion obtained by dispersing 3 g of hyaluronic acid (molecular weight of 1,200,000) in 50 mL of 90% ethanol containing 0.03N hydrochloric acid in a glass container, microwave (about 2450 Hz) was output at about 100 W. Irradiation was performed for 2 hours, and changes in molecular weight were examined over time. Since the dispersion was heated to a reflux state of about 80 ° C. by microwave irradiation, as a control, the dispersion was heated to reflux at 80 ° C. for 2 hours without being irradiated with microwaves. After the treatment, in the same manner as in Test Example 1, solid-liquid separation, washing and drying were performed, and the molecular weight was measured. The results are shown in FIG.
As can be seen from FIG. 1, the molecular weight of hyaluronic acid decreased with the treatment time in any of the test systems, but when irradiated with microwaves, the molecular weight was higher than when heated and refluxed only (no microwave irradiation). Became lower. Also, no coloring was observed.
また、図２は、ヒアルロン酸（分子量１２０万）１５ｇを、ガラス容器中、０．５Ｎ塩酸含有９０％エタノール２５０ｍＬに分散した分散液に、出力５００Ｗでマイクロ波（約２４５０Ｈｚ）を３０分照射し、分子量の変化を経時的に調べた結果である。マイクロ波照射により分散液は加熱されて約８０℃の還流状態となったため、対照としてはマイクロ波を照射せずに８０℃で３０分加熱還流した。処理後は、試験例１と同様に固液分離、洗浄、乾燥した。分子量の測定は、Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．ＨｅａｌｔｈＳｃｉ．，１２１，０３０−０３３，２００３に従った。
図２においても、図１と同様に、何れの試験系においてもヒアルロン酸の分子量は処理時間とともに低下したが、マイクロ波を照射した場合には、加熱還流のみ（マイクロ波非照射）の場合に比べても分子量がより低くなった。また、着色も認められなかった。
これらのことから、ヒアルロン酸の低分子量化には、マイクロ波による加熱作用以外に、マイクロ波特有の何らかの低分子化作用が寄与しているものと考えられる。
In addition, FIG. 2 shows that a dispersion liquid in which 15 g of hyaluronic acid (molecular weight 1,200,000) is dispersed in 250 mL of 90% ethanol containing 0.5N hydrochloric acid in a glass container is irradiated with microwaves (about 2450 Hz) at an output of 500 W for 30 minutes. This is the result of examining the change in molecular weight over time. Since the dispersion was heated to a reflux state of about 80 ° C. by microwave irradiation, as a control, it was heated to reflux at 80 ° C. for 30 minutes without being irradiated with microwaves. After the treatment, solid-liquid separation, washing and drying were performed in the same manner as in Test Example 1. The molecular weight measurement is described in Bull. Natl. Inst. HealthSci. 121,030-033, 2003.
In FIG. 2, as in FIG. 1, the molecular weight of hyaluronic acid decreased with the treatment time in any of the test systems. However, when microwaves were irradiated, heating and reflux only (no microwave irradiation) In comparison, the molecular weight was lower. Also, no coloring was observed.
From these facts, it is considered that the lower molecular weight of hyaluronic acid is contributed by some lower molecular weight action specific to microwaves in addition to the heating action by microwaves.
試験例３ 酸濃度の影響
さらに、マイクロ波照射時の塩酸濃度を変えて調べた。
ヒアルロン酸（分子量１２０万）３ｇを、０．０３Ｎ、０．１Ｎ又は０．５Ｎ塩酸含有９０％エタノール５０ｍＬに分散した分散液に、出力約１００Ｗでマイクロ波（約２４５０Ｈｚ）を２時間照射した。処理後、試験例１と同様に固液分離、洗浄、乾燥、分子量測定を行った。結果を図３に示す。
図３から明らかなように、塩酸濃度が高くなるに従ってヒアルロン酸の分子量は小さくなり、０．５Ｎ塩酸含有９０％エタノールでは約３，０００にまで著しく低下した。また、何れの場合にも、着色は認められなかった。
Test Example 3 Influence of Acid Concentration Further, the hydrochloric acid concentration during microwave irradiation was changed and examined.
Microwave (about 2450 Hz) was irradiated at a power of about 100 W for 2 hours to a dispersion in which 3 g of hyaluronic acid (molecular weight 1.2 million) was dispersed in 50 mL of 90% ethanol containing 0.03 N, 0.1 N or 0.5 N hydrochloric acid. After the treatment, solid-liquid separation, washing, drying, and molecular weight measurement were performed in the same manner as in Test Example 1. The results are shown in FIG.
As is apparent from FIG. 3, the molecular weight of hyaluronic acid decreased as the hydrochloric acid concentration increased, and the molecular weight decreased significantly to about 3,000 with 90% ethanol containing 0.5N hydrochloric acid. Moreover, coloring was not recognized in any case.
試験例４ マイクロ波出力の影響
ヒアルロン酸（分子量１２０万）３０ｇを、ガラス容器中、０．５Ｎ塩酸含有９０％エタノール５００ｍＬに分散した分散液に、出力２００、５００又は９３２Ｗでマイクロ波（約２４５０Ｈｚ）をそれぞれ４５分照射し、分子量の変化を経時的に調べた。処理後、試験例１と同様に固液分離、洗浄、乾燥した。分子量の測定は、Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．ＨｅａｌｔｈＳｃｉ．，１２１，０３０−０３３，２００３に従った。結果を図４に示す。
図４からわかるように、何れの試験系においてもヒアルロン酸の分子量は処理時間とともに低下したが、マイクロ波の出力が大きいほどより早く分子量が低下した。また、全てのサンプルで着色も認められなかった。
このことから、ヒアルロン酸の低分子量化には、マイクロ波の出力が影響すると考えられる。
Test Example 4 Influence of Microwave Output Microwave (about 2450 Hz) with an output of 200, 500, or 932 W in a dispersion obtained by dispersing 30 g of hyaluronic acid (molecular weight 1,200,000) in 500 mL of 90% ethanol containing 0.5N hydrochloric acid in a glass container. ) For 45 minutes, and the change in molecular weight was examined over time. After the treatment, solid-liquid separation, washing and drying were performed in the same manner as in Test Example 1. The molecular weight measurement is described in Bull. Natl. Inst. HealthSci. 121,030-033, 2003. The results are shown in FIG.
As can be seen from FIG. 4, the molecular weight of hyaluronic acid decreased with the treatment time in any of the test systems, but the molecular weight decreased earlier as the microwave output increased. Moreover, coloring was not recognized by all the samples.
From this, it is considered that the output of the microwave influences the molecular weight reduction of hyaluronic acid.
以上のように、酸存在下でヒアルロン酸粉末分散液にマイクロ波照射することにより、非常に短時間で効率よくヒアルロン酸を低分子量化することができる。
分子量１万以下の低分子量ヒアルロン酸の製造には、通常ヒアルロニダーゼ等の酵素が用いられるが、酵素を使用する製造では手間やコストがかかり、また、反応後に酵素を除去することが困難である。
本発明の製造方法によれば、短時間の内に効率的に低分子量化でき、例えば分子量１万以下のヒアルロン酸でも、酵素を用いずに効率よく製造することができる。また、ヒアルロン酸を粉末状態で処理するので、非常に簡便である。
As described above, hyaluronic acid can be reduced in molecular weight efficiently in a very short time by irradiating the hyaluronic acid powder dispersion with microwaves in the presence of an acid.
For the production of low molecular weight hyaluronic acid having a molecular weight of 10,000 or less, an enzyme such as hyaluronidase is usually used. However, the production using the enzyme is troublesome and costly, and it is difficult to remove the enzyme after the reaction.
According to the production method of the present invention, the molecular weight can be lowered efficiently within a short time, and for example, even hyaluronic acid having a molecular weight of 10,000 or less can be produced efficiently without using an enzyme. Moreover, since hyaluronic acid is processed in a powder state, it is very simple.
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| ES2390063A1 (en) * | 2011-04-13 | 2012-11-06 | Bioibérica, S.A. | Glycosaminoglycans with very low methanol content |
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