JP2008170350A - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供する。
【解決手段】電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面が親水性ポリマーでコーティングされ、長さが１０〜１００ｍｍ、幅が１０〜１００μｍである泳動路を有するマイクロチップと、ｐＨが５．０〜６．０、塩濃度が１０〜３００ｍＭである緩衝液とを用いて、１００〜２０００Ｖの電圧を負荷するヘモグロビン類の測定方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法に関する。

ヘモグロビン（以下、Ｈｂともいう）類、特に糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は、過去１〜２カ月間の平均的な血糖値を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。
従来、ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨＰＬＣ法、免疫法、電気泳動法等が用いられている。このうち、臨床検査分野で多く用いられているＨＰＬＣ法では、１試料当たり１〜２分での測定が可能であり、また、同時再現性試験のＣＶ値が１．０％程度の測定精度が実現されている。糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための測定方法としては、このレベルの性能が必要とされている。

一方、電気泳動法は、装置構成が簡便なため、マイクロチップ電気泳動のような安価で小型なシステムを作製することが可能な技術であり、電気泳動法におけるＨｂＡ１ｃの高精度測定技術の臨床検査への適用は、コスト面において非常に有益な効果が期待できる。
電気泳動法によるＨｂ類の測定は、通常とは異なるアミノ酸配列を有する異常Ｈｂ類の分離方法として古くから用いられているが、ＨｂＡ１ｃの分離は非常に困難であり、ゲル電気泳動の手法では３０分以上の時間が必要であった。このように電気泳動法は、測定時間及び測定精度の点で問題があるため、現在では糖尿病診断への応用はほとんど行われていなかった。

これに対して、１９９０年頃に登場したキャピラリー電気泳動法は、一般的に高分離・高精度測定が可能とされており、例えば、特許文献１には、キャピラリー電気泳動法によってＨｂＡ１ｃを分離する方法が開示されている。
しかしながら、特許文献１に開示された方法を用いた場合、測定時間が長いという問題点は解消されず、加えて、使用する緩衝液のｐＨが９〜１２と高く、Ｈｂが変性してしまう可能性があることから、この方法を臨床検査に適用することは困難であった。

また、特許文献２には、キャピラリー電気泳動法において、キャピラリーにカチオン性ポリマーを通液することによって、キャピラリー内面にカチオン性ポリマーを動的にコーティングし、硫酸化多糖類を含有する緩衝液を用いる方法が開示されている。この方法によれば、１０分間程度で測定することができ、ゲル電気泳動法と比較して短時間で測定することが可能となる。

しかしながら、この方法では、使用する緩衝液のｐＨが４．７と低いため、測定試料であるＨｂが変性してしまう可能性があった。また、使用する緩衝液の塩濃度が約３８０ｍＭと大きく、負荷電圧も８．５ｋＶと大きいため、ジュール熱の発生等によって得られるエレクトロフェログラムにおいてピークが変形して測定精度が低下するという問題や、小型システム化が困難であるという問題があった。

更に、糖尿病診断を行う場合は、ＨｂＡ１ｃの中でも糖尿病の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃを分離して、不安定型ＨｂＡ１ｃ、カルバミル化Ｈｂ、アセチル化Ｈｂ等の修飾Ｈｂ類の影響を排除しなければならない。しかしながら、特許文献１及び２に開示された方法によって得られるエレクトロフェログラムでは、分離性能及び測定精度が不充分であり、これらの方法に開示された技術範囲では安定型ＨｂＡ１ｃを分離することは困難であった。

また、このような緩衝液や、電圧負荷等の条件は、大型で高価なキャピラリー電気泳動装置にのみ適用することが可能であることから、このような方法を、小型で安価なマイクロチップ電気泳動法に適用して測定を行うことは不可能であった。
特表平９−５１０７９２号公報 特開平９−１０５７３９号公報

本発明は、低コストで、高精度の測定を短時間に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。

本発明は、電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面が親水性ポリマーでコーティングされ、長さが１０〜１００ｍｍ、幅が１０〜１００μｍである泳動路を有するマイクロチップと、ｐＨが５．０〜６．０、塩濃度が１０〜３００ｍＭである緩衝液とを用いて、１００〜２０００Ｖの電圧を負荷するヘモグロビン類の測定方法である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、鋭意検討した結果、所定の大きさを有し、かつ、内面が親水性ポリマーでコーティングされている泳動路を有するマイクロチップと、所定範囲のｐＨ及び塩濃度を有する緩衝液とを用いることによって、ヘモグロビン類の測定が、従来よりも低コストで、高精度かつ短時間に行うことが可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明のヘモグロビン類の測定方法において用いる電気泳動法は、マイクロチップを搭載した電気泳動装置に適用可能な方法である。このような電気泳動装置は、従来Ｈｂ類の測定に用いられてきたＨＰＬＣ装置やキャピラリー電気泳動装置よりも装置構成が簡便あって小型化が容易であり、低コストで作製可能である。

本明細書において、マイクロチップとは、無機系又は有機系素材からなり、数ｃｍ角程度の大きさを有する板状の基板をいう。具体的には、例えば、μ−ＴＡＳ、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐと呼ばれる技術に用いられる従来公知のチップ等が挙げられる。

上記マイクロチップを構成する素材としては特に限定されず従来公知の素材を用いることができるが、例えば、ホウケイ酸ガラス、石英等のガラス系、フューズドシリカ、ポリジメチルシロキサン等のシリカ系、ポリアクリル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリ乳酸系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、オレフィン系樹脂等の樹脂系等の素材が好ましい。なかでも、ガラス系、シリカ系、アクリル樹脂系の素材が好ましい。

上記マイクロチップは、泳動路を有する。
本発明において、泳動路とは、マイクロチップ上又はマイクロチップ内に形成された流路であって、電気泳動が行われる際に、その流路の内において、試料が移動及び／又は分離される部位（試料が注入された部位から、検出部によって検出される部位）をいう。

上記泳動路は、長さの下限が１０ｍｍ、上限が１００ｍｍである。１０ｍｍ未満であると、充分に試料が分離されないため、正確な測定をすることができないことがある。１００ｍｍを超えると、測定時間の延長や得られるエレクトロフェログラムにおいてピーク形状の変形が生じることによって、正確な測定をすることができないことがある。

上記泳動路は、幅の下限が１０μｍ、上限が１００μｍである。１０μｍ未満であると、検出器により検出するための光路長が小さく、測定精度が低下することがある。１００μｍを越えると、泳動路内で試料が拡散することにより得られるエレクトロフェログラムにおいてピークがブロードになり、測定精度が低下することがある。

上記泳動路の形状としては特に限定されず、例えば、直線状、一定の曲率を有する曲線状、又は、渦巻状等が挙げられる。なかでも直線状であることが好ましい。
上記泳動路の断面の形状としては特に限定されず、例えば、矩形、円形等が挙げられる。
上記マイクロチップは、単数の泳動路を有していてもよく、複数の泳動路を有していてもよい。

上記泳動路は、内面が親水性ポリマーによってコーティングされている。
上記コーティングを行うことによって上記泳動路内面に形成されるコーティング層は、単層であってもよく、同一又は異なる材料からなる多層であってもよい。
このように親水性ポリマーを用いてコーティングすることによって、泳動路の内面に親水性を付与し、泳動路の内部を通過する測定試料であるヒト血液中の蛋白質、脂質等の各成分の非特異吸着を抑制し、測定対象であるヘモグロビン類を充分に分離測定することが可能となる。親水性が不充分であると、測定試料中の各成分が上記泳動路の内面に非特異吸着を起こし、各成分の分離に悪影響を及ぼすことがある。
本明細書において、親水性ポリマーとは親水性の官能基を有するポリマーをいう。

上記泳動路のコーティングに用いられる親水性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、イオン性又は非イオン性の親水性ポリマーが挙げられる。
上記イオン性の親水性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（２―アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）、ポリ（２−ジエチルアミノエチルメタクリレート）、ポリエチレンイミン、ポリブレン等のイオン性合成高分子；コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等の硫酸基含有多糖類及びその塩類；アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類及びその塩類；セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類及びその誘導体へのイオン性基導入化物及びその塩類等のアニオン性多糖類、キチン、キトサン等のキトサン誘導体及びその塩類；アミノセルロース、Ｎ−メチルアミノセルロース等のＮ−置換セルロースの誘導体、及び、その塩類；デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、及び、その誘導体へのアミノ基導入化物、及び、その塩類等のカチオン性多糖類等；牛血清アルブミン、ラクトフェリン、スキムミルク等蛋白質類等が挙げられる。

上記コーティングに用いられる非イオン性の親水性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の多糖類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの親水性高分子類、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレート等のモノマーを重合又は共重合して得られる有機合成高分子類等が挙げられる。

上記親水性ポリマーを泳動路にコーティングする方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができ、例えば、上記親水性ポリマーを含有する溶液を上記泳動路の内部に通液することによってコーティングする動的コーティング法；上記親水性ポリマーを泳動路の内面に接触させて疎水性的又は静電気的な相互作用等を利用して物理的に吸着・固定化させる固定化コーティング法、泳動路の内面及び親水性ポリマーをそれぞれの物質が有する官能基や他の物質等を介して共有結合により結合・固定化させる固定化コーティング法等が挙げられる。上記固定化コーティング法を用いる場合、更に、加熱工程、乾燥工程等を経ることにより、コーティング層が剥離することがないため、繰り返し測定が可能となる。上記固定化コーティング法としては、具体的には例えば、上記泳動路内部に上記親水性ポリマーを含有する溶液を通液し、該泳動路に空気を注入することによって該溶液を追い出した後、乾燥することを繰り返す方法等が挙げられる。

なかでも、固定化コーティング法が好ましい。固定化コーティング法を用いることによって、いったんコーティングすれば剥離することがなく、測定毎に再びコーティングを行う必要がない。そのため、連続測定等の際には、測定時間の短縮を図ることができる。

上記泳動路に上記親水性ポリマーを固定化する際、上記泳動路内面と上記親水性ポリマーからなる層との間に、別種の層を形成してもよい。上記別種の層が形成される場合、上記親水性ポリマーからなる層は、上記泳動路最内面に形成されていればよい。

上記泳動路に上記親水性ポリマーをコーティングする際、上記親水性ポリマーは、その種類やコーティングの方法にもよるが、上記親水性ポリマーを含む溶液としてコーティングに供されることが好ましい。
上記親水性ポリマー溶液の濃度としては、好ましい下限が０．０１％、好ましい上限が２０％である。０．０１％未満であると、コーティングが不充分となることがある。２０％を超えると、上記親水性ポリマーからなる層を均一に形成することができず、ヘモグロビン類の測定途中に剥離し、再現性低下の原因となることがある。

本発明のヘモグロビン類の測定方法では、上記マイクロチップの流路内に緩衝液を満たした後、測定試料を流路内に導入して、同流路内に電圧を負荷して電気泳動を行うことによって、ヘモグロビン類を分離して測定する。
上記緩衝液のｐＨの下限は５．０、上限は６．０である。５．０未満であると、ヘモグロビン類が変性してしまうため、測定精度が低下することがある。６．０を超えると、ヘモグロビン類の等電点に近づくことから、ヘモグロビン類の電荷量が減少して、ヘモグロビン類の各成分の電気的差異が小さくなり、各成分の分離が不充分となるために測定精度が低下することがある。

上記緩衝液の塩濃度の下限は１０ｍＭ、上限は３００ｍＭである。１０ｍＭ未満であると、緩衝液中の電解質量が少なく、電流量が少なくなり過ぎるため、電気泳動が充分に行わず、各成分の分離性能が悪化することがある。３００ｍＭを超えると、電流量が大きくなり過ぎるため、発熱等の影響により得られるクロマトグラムにおいてピーク形状が変形して測定精度が低下することがある。好ましい下限は５０ｍＭ、好ましい上限は２５０ｍＭである。
なお、本明細書において、塩濃度とは、後述する緩衝能を有する緩衝液組成物のモル濃度をいう。後述する緩衝液組成物を複数使用する場合には、それらの合計モル濃度をいう。

本発明に用いられる緩衝液は、緩衝能を有する従来公知の緩衝液組成物を含有する。これらの緩衝液組成物としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸及びその塩類；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸及びその塩類；緩衝能を有するこれらの誘導体類等が挙げられる。これらの緩衝液組成物は単独で用いられてもよく、２種以上を併用してもよい。

上記緩衝液には、ｐＨ及び塩濃度が上記範囲を超えない程度であれば、カオトロピック化合物、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等、一般的に用いられる添加剤を適宜添加してもよい。

上記各種ポリマーとしては特に限定されず、例えば、イオン性ポリマーが挙げられる。
本明細書において、イオン性ポリマーは、分子内にイオン性の官能基を有するポリマーを意味する。
上記イオン性ポリマーは、イオン性の種類により、アニオン性ポリマーと、カチオン性ポリマーとに大別される。なかでも、アニオン性ポリマーが好ましい。

上記アニオン性ポリマーは、分子内にアニオン性の官能基を有するポリマーである。
上記アニオン性の官能基としては、特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。
上記アニオン性ポリマーは、親水性を有することが好ましい。
上記親水性を有するアニオン性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、アニオン性基含有多糖類、アニオン性基含有有機合成高分子等が挙げられる。
具体的には例えば、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸等の多糖類；ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（２―アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）及び、これらの共重合体等、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等の硫酸基含有多糖類及びその塩類；アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類、及び、その塩類；セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、及び、その誘導体へのイオン性基導入化物、及び、その塩類等のアニオン性多糖類、ポリ（メタ）アクリル酸、リン酸基含有（メタ）アクリル酸エステル重合体、スルホン酸基含有（メタ）アクリル酸重合体、２−アクリルアミド−ブチルスルホン酸重合体、及び、これらの共重合物等の水溶性アニオン性基含有有機合成高分子類が挙げられる。

本発明のヘモグロビン類の測定方法において、負荷される電圧の下限は１００Ｖ、上限は２０００Ｖである。１００Ｖ未満であると、電気泳動が充分行われないため、各成分の分離が不充分となることがある。２０００Ｖを超えると、発熱が大きくなり、得られるエレクトロフェログラムにおいて、ピークの変形等の不具合が生じることがある。好ましい下限は１５０Ｖ、好ましい上限は１５００Ｖである。

本発明のヘモグロビン類の測定方法において、測定対象となるヘモグロビン類としては特に限定されず、例えば、従来公知のヘモグロビン類が挙げられる。具体的には例えば、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２；アセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂ等の修飾ヘモグロビン；ＨｂＳ、ＨｂＣ等の異常ヘモグロビン等が挙げられる。なかでも、安定型ＨｂＡ１ｃを好適に測定することが可能である。

本発明によれば、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能な測定方法を提供することができる。具体的には、マイクロチップを用いた電気泳動法という、装置構成が簡易かつ低コストな方法を用いながら、特に安定型ＨｂＡ１ｃの測定において、１試料当たり数分という短時間に、同時再現性を示すＣＶ値が１．０％程度という高精度で測定することができる。そのため、電気泳動法によって糖尿病患者のＨｂＡ１ｃの数値の管理を好適に行うことが可能となる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
（１）マイクロチップの作製
ポリジメチルシロキサン製マイクロチップに、長さ８０ｍｍ、幅８０μｍの泳動路を形成し、クロス十字型の電気泳動用マイクロチップを作製した。泳動路に０．５％キトサン（親水性ポリマー）溶液を満たし、２０分間放置した。その後、空気を泳動路内に注入してキトサン溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再び、キトサン溶液の注入、空気の注入、及び、乾燥からなる一連の工程を５回繰り返すことによって、泳動路がコーティングされたマイクロチップを得た。得られたキトサンコーティングマイクロチップの泳動路に、２．０％のコンドロイチン硫酸を含む１５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）を満たすことによって、測定用マイクロチップを得た。

（２）健常人血の測定
健常人よりヘパリン採血した健常人全血７０μＬに、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（界面活性剤：和光純薬製）を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２００μＬを添加して溶血希釈し、溶血試料を得た。
上述のマイクロチップの泳動路の一方の端部に得られた溶血試料を添加し、泳動路の両端に１０００Ｖの電圧をかけて電気泳動を行い、４１５ｎｍの可視光における吸光度変化を測定することによって、安定型ＨｂＡ１ｃの測定を行った。
図１は、実施例１において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムをに示す模式図である。図１中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０を示す。なお、安定型ＨｂＡ１ｃの分離は、約６０秒の電気泳動時間で行うことができた。

（３）修飾Ｈｂを含む試料の測定
健常人よりヘパリン採血した健常人全血に、グルコースを２５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温し、修飾Ｈｂの一種である不安定型ＨｂＡ１ｃを多量に含む試料を人為的に調製した。
得られたマイクロチップの泳動路の一方の端部に得られた溶血試料を添加し、泳動路の両端に１０００Ｖの電圧をかけて電気泳動を行い、４１５ｎｍの可視光における吸光度変化を測定することによって、安定型ＨｂＡ１ｃの測定を行った。
図２は、実施例１において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムをに示す模式図である。図２中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図２に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃと修飾Ｈｂである不安定型ＨｂＡ１ｃが良好に分離された。

（実施例２）
（１）マイクロチップの作製
フューズドシリカ製マイクロチップに、長さ５０ｍｍ、幅５０μｍの泳動路を形成し、クロス十字型の電気泳動用マイクロチップを作製した。泳動路に０．５％プリブレン水溶液を満たし、２０分間放置した。その後、空気を泳動路内に注入してプリブレン水溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再び、プリブレン水溶液の注入、空気の注入、及び、乾燥を５回繰り返すことによって、泳動路の内面がコーティングされたマイクロチップを得た。得られたポリブレンコーティングマイクロチップの泳動路に、１．５％のデキストラン硫酸を含む５０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５．８）を満たすことによって、測定用マイクロチップを得た。
（２）健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定
泳動路の両端に５００Ｖの電圧をかけて電気泳動を行った以外は、実施例１と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図１と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。

（実施例３）
（１）マイクロチップの作製
メチルメタクリレート製マイクロチップに、長さ９０ｍｍ、幅３０μｍの泳動路を形成し、電気泳動用のマイクロチップを作製した。泳動路に０．５％のコンドロイチン硫酸水溶液を満たし、２０分間放置した。その後、空気を泳動路内に注入してコンドロイチン硫酸水溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再び、コンドロイチン硫酸水溶液の注入、空気の注入、及び、乾燥を５回繰り返すことによって、泳動路の内面がコーティングされたマイクロチップを得た。得られたコンドロイチン硫酸コーティングマイクロチップの泳動路に、２．０％のコンドロイチン硫酸を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を満たすことによって、測定用マイクロチップを得た。

（２）健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定
泳動路の両端に７００Ｖの電圧をかけて電気泳動を行った以外は、実施例１と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図１と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。

（実施例４）
（１）マイクロチップの作製
メチルメタクリレート製マイクロチップに、長さ６０ｍｍ、幅６０μｍの泳動路を形成し、電気泳動用のマイクロチップを作製した。泳動路に０．５％ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（以下、ポリ２−ＨＥＭＡともいう）水溶液を満たし、２０分間放置した。その後、空気を泳動路内に注入してポリ２−ＨＥＭＡ水溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再び、ポリ２−ＨＥＭＡ水溶液の注入、空気の注入、及び、乾燥を５回繰り返すことによって、泳動路の内面がコーティングされたマイクロチップを得た。得られたポリ２−ＨＥＭＡコーティングマイクロチップの泳動路に、２．０％の（２−アクリルアミド−ブチルスルホン酸）−（２−ＨＥＭＡ）共重合体を含む１００ｍＭリンゴ酸緩衝液（ｐＨ５．４）を満たすことによって、測定用マイクロチップを得た。

（２）健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定
泳動路の両端に４００Ｖの電圧をかけて電気泳動を行った以外は、実施例１と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図１と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。

（比較例１）
フューズドシリカからなるキャピラリー（ＧＬサイエンス製：内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）を０．２Ｎ−ＮａＯＨ、イオン交換水、０．５Ｎ−ＨＣｌの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、ＢＳＡ（カチオン性ポリマー：牛血清アルブミン：和光純薬製）を０．５重量％含有するリンゴ酸緩衝液を１分間通液し、キャピラリー内面をコーティングした。
得られたキャピラリーを、キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｅｒ社製Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ）にセットし、０．２重量％のコンドロイチン硫酸（和光純薬製）を含有するリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）を上述のキャピラリー内に満たした。
得られた測定用キャピラリー電気泳動装置を用いて１０ｋＶの電圧を負荷して修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。
図３は、比較例１において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
図３中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図４に示すように、得られたエレクトロフェログラムにおいて、安定型ＨｂＡ１ｃを示すピーク１と修飾Ｈｂを示すピーク３とが重なっている。

（比較例２）
マイクロチップの泳動路を長さ１２０ｍｍ、幅１４０μｍとした以外は、実施例１と同様に処理し、電気泳動用マイクロチップを得た。更に、実施例１と同様の測定条件により、健常人血の測定を実施した。
得られたエレクトロフェログラムでは、１本のヘモグロビンのピークが確認されたのみで、安定型ＨｂＡ１ｃの分離が全くできなかった。この結果は、緩衝液組成、設定電圧、泳動時間等の電気泳動の条件を変更して測定を行っても、改善されなかった。

（評価）
（１）修飾Ｈｂ類の分離性能試験
実施例１〜４及び比較例１の測定条件について、健常人血試料と、同一健常人血を元に調製した修飾Ｈｂ含有試料、すなわち実施例１（３）修飾Ｈｂを含む試料の測定において調製した健常人血にグルコースを２５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られた不安定型ＨｂＡ１ｃ含有試料と、更に他の修飾Ｈｂ含有試料、すなわち該健常人血にアセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られたアセチル化Ｈｂ含有試料、シアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られたカルバミル化Ｈｂ含有試料を調製し、各試料における安定型ＨｂＡ１ｃ値を求めた。
なお、各試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）を求めることにより算出した。
得られた修飾Ｈｂ含有試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値から、得られた健常人血試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値を差し引いた値を求めた。
結果を表１に示した。

実施例１〜４の測定条件においては、修飾Ｈｂ含有試料と修飾Ｈｂを含まない健常人血試料の安定型ＨｂＡ１ｃの測定値の差はほとんどなく、測定値差は０．２％以下であり、修飾Ｈｂ類の存在下においても、安定型ＨｂＡ１ｃが正確に測定できることがわかった。一方、比較例１の測定条件では、修飾Ｈｂ類と安定型ＨｂＡ１ｃの分離が不充分なため、安定型ＨｂＡ１ｃ値が大きく変動し、正確な測定ができないことがわかった。

（２）同時再現性試験
実施例１〜４及び比較例１の測定条件を用いて、健常人血試料の同一試料を１０回連続して得られた安定型ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値を算出した。
また、比較例１では、１回の測定が終了した時点で、０．２ＮのＮａＯＨ、イオン交換水、０．５ＮのＨＣｌ溶液の順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、ＢＳＡ（カチオン性ポリマー：牛血清アルブミン：和光純薬社製）の０．５％リンゴ酸緩衝液を１分間通液して動的コーティングを施した後、次試料を測定することによって、測定を繰り返し行うことによって同時再現性試験を行った。
結果を表２に示した。

（３）耐久性試験
実施例１〜４及び比較例１の測定条件を用いて、健常人血試料の同一試料を１００回連続して測定して得られた安定型ＨｂＡ１ｃ値の最大値と最小値との差（Ｒ値）を算出した。
結果を表２に示した。

表２に示すように、実施例１〜４では、同時再現性試験において、バラツキ度合いを示すＣＶ値が１％前後であり良好な結果であった。また、耐久性試験における連続１００試料測定時のバラツキ幅についても、０．２％程度と非常に小さく、大量試料の連続測定においても精度良く安定型ＨｂＡ１ｃを測定できることがわかった。
一方、比較例１については、同時再現性試験におけるＣＶ値が４％以上と大きく、また耐久性試験時のバラツキ幅も最大０．５％程度であり、糖尿病患者のＨｂＡ１ｃ値を管理する上で全く不充分な値となっていた

（４）ｐＨ及び塩濃度の影響試験
実施例１及び２の測定条件において、実施例１で用いたクエン酸緩衝液、及び、実施例２で用いたコハク酸緩衝液のｐＨ及び塩濃度を変化させながら、上述した同時再現性試験を行うことによって、緩衝液のｐＨ及び塩濃度の影響を測定した。
ｐＨを変化させた場合の結果を図４ａ、塩濃度を変化させた場合の結果を図４ｂに示した。
実施例１、２ともに、ｐＨが５．０〜６．０、塩濃度が１０〜３００ｍＭにおいて、ＣＶ値が小さくなり、安定型ＨｂＡ１ｃを高い精度で測定することが可能となることが判明した。

本発明によれば、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。

実施例１、２、３及び４において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。 実施例１、２、３及び４において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。 比較例１において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。 実施例１及び２の測定条件において、緩衝液のｐＨを変化させた場合の同時再現性試験の結果を示すグラフである。 実施例１及び２の測定条件において、緩衝液の塩濃度を変化させた場合の同時再現性試験の結果を示すグラフである。

Claims (2)

1. 電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面が親水性ポリマーでコーティングされ、長さが１０〜１００ｍｍ、幅が１０〜１００μｍである泳動路を有するマイクロチップと、ｐＨが５．０〜６．０、塩濃度が１０〜３００ｍＭである緩衝液とを用いて、１００〜２０００Ｖの電圧を負荷することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
2. 緩衝液は、アニオン性ポリマーを含有することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法。

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