JP2008037870A - 心臓病及び心不全の治療のためのホスホランバン活性の阻害方法 - Google Patents

Abstract

【課題】新規な心不全の治療のための方法の提供。
【解決手段】心筋細胞内でのホスホランバンと筋小胞体Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）の相互作用を阻害することにより、不全心臓における収縮能を高め、高血圧症を有する個人において血圧を低下させるように機能する小ペプチド複合体と組換え蛋白質の使用を通して、心不全の治療のための方法を提供する。さらに、そのような治療薬を心筋細胞の細胞質及び核内に輸送するための手段を提供する。
【選択図】図１

Description

本出願は、１９９８年１１月２日出願の米国特許仮出願通し番号第６０／１０６，７１８号及び１９９９年７月２７日出願の米国特許仮出願通し番号第６０／１４５，８８３号の優先権を主張するものであり、これら２つの出願はその全体が参照してここに組み込まれる。

（技術分野）
本発明は、一般に心不全の治療のための方法、より特定すると心筋機能不全の治療のためのホスホランバン（ＰＬＢ）活性の阻害に関する。

心不全は米国や他の先進国における罹病率と死亡率とを合わせた主要原因である。うっ血性心不全は心臓の収縮低下と弛緩の遅延を特徴とするが、心うっ血の病態生理学的経路を促進する基礎的な分子機序は大部分が不明である。心臓病の現在の治療は主として緩和的であり、心筋機能不全の発症と進行を導くと考えられる基礎的な生物学的経路を標的としていない。

心筋不全は複雑で統合的な多因子性疾患であり、この疾患においては、感受性を与える遺伝的経路が、心損傷、圧及び容積過負荷を伴う生体力学的ストレスの環境刺激、ならびに細胞骨格成分の遺伝的欠損と織り合わせられている。この生体力学的ストレスに応答して、一連の平行する収束性シグナル伝達経路が活性化され、心代償性肥大という適応反応を導く。その後、生存可能な筋細胞の喪失、収縮要素の減少、筋フィラメントの配列の乱れ及び間質性線維症に結びつく心室拡張と心力不全への移行が起こりうる。

最近、プログラムされた細胞死の開始の引き金となるシグナル伝達経路の活性化が心不全への病的移行を促進すること、ならびにｇｐ１３０依存性筋細胞生存経路がプロアポトーシス経路の作用を遮断し、心不全や心筋症の早期発症を防ぎうることが示唆された。筋細胞適応のためのこれらの外因性ストレス関連経路に加えて、心臓の興奮収縮（ＥＣ）連関の損傷及び心不全表現型の進行の臨床的証明である心収縮力の付随する重大な欠損を導く内因性シグナル伝達経路も存在するはずである。

筋小胞体（ＳＲ）は、心臓組織全体にわたって細胞質ゾルＣａ^２＋の運動のコーディネーションにおいて欠くことのできない役割を果たす。Ｍｅｒｃａｄｉｅｒら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９０；８５：３０５‐３０９）、Ａｒａｉら（Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，１９９３；７２：４６３‐４６９）、ｄｅ ｌａ Ｂａｓｔｉｅら（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１９９０；６６：５５４‐５６４）、及びＦｅｌｄｍａｎら（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１９９３；７３：１８４‐１９２）による別々の試験において、ヒトの不全心臓及び心不全の動物モデルに関する研究から、ＳＲによる細胞質ゾルＣａ^２＋の取込みの低下がが拡張期弛緩延長の原因であり、ＳＲに貯蔵されたＣａ^２＋が細胞質ゾル中に放出されて心筋の収縮を活性化し、その後弛緩を実現するために再び蓄積されることが示唆された。
心臓のＳＲ Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）の活性はＳＲへのＣａ^２＋の再取込みの速度決定因子であり、ＳＥＲＣＡ２ａ活性自体は、５２アミノ酸の筋特異的ＳＲリン蛋白質であるホスホランバンによって調節される。

ホスホランバン（ＰＬＢ）は、Ｔａｄａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７４；２４９：６１７４‐６１８０）による研究においてＳＲ膜における主要なリン酸化標的として初めて同定され、その非リン酸化形態ではＳＥＲＣＡ２ａ活性の強力な阻害因子であると思われた。ＳＥＲＣＡ２ａへのＰＬＢの阻害作用は、細胞内カルシウムの増加によって、あるいはβ‐アデレナリン作動性刺激に応答したＰＬＢのリン酸化によって低下する。ＰＬＢは主として五量体の形態で存在し、高温に供すると、５個の等しいモノマーに解離する。

モノマーＰＬＢのアミノ酸は３つの物理的及び機能的ドメインに分けられる。
Ｉａ及びＩＩドメインはα‐らせんに富み、より構造化されていないＩｂドメインに接続している。Ｉａドメインはアミノ酸１‐２０から成り、その大部分がα‐らせんコンフォメーションであって、実効正電荷を持つ。Ｉｂドメインはアミノ酸残基２１‐３０から成り、モノマーの細胞質セクターを構成する。ＩＩドメインのアミノ酸３１‐５２は膜貫通セクターであり、五量体構造を安定化させる役割を担う非荷電残基だけでできている。

ＰＬＢはｃＡＭＰカスケードを通してのカテコールアミンによる心筋機能調節におけるメディエイターである。ＩａドメインのＳｅｒ（１６）とＴｈｒ（１７）は、それぞれｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）及びＣａ／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼの結合部位であり、ＰＬＢのホスホエステルリン酸化を触媒するように機能し、それが今度はＳＥＲＣＡ２ａ活性へのその阻害を軽減することが確認されている。Ｓｅｒ（１６）とＴｈｒ（１７）はキナーゼによってリン酸化されうるので、アミノ酸の実効電荷は正から中性へ、さらには負へと移動しうる。ＳＥＲＣＡ２ａの荷電残基と共に、ＰＬＢのＩａドメインにおける電荷の移動はＰＬＢ‐ＳＥＲＣＡ２ａ系の蛋白質‐蛋白質相互作用の大きな変化をもたらしうる。ＩＩドメインはまた、ＩＩドメインのらせんの１つの面のアミノ酸がＳＥＲＣＡ２ａの膜貫通ドメインと結合しているという点で、ＰＬＢの機能的発現のための鍵となるいくつかのアミノ酸も含んでいる。

ＰＬＢがＣａ^２＋‐ＡＴＰアーゼ活性を調節する方法は２つあると考えられる：１）ＰＬＢのリン酸化とカルシウムポンプ活性の抑制を含む速効性の短期的機序、及び２）遺伝子発現の制御によってもたらされるＣａ^２＋‐ＡＴＰアーゼに対するＰＬＢの分子比の変化を含む、遅効性であるが長期的なプロセス。生理的条件下で、ＰＫＡによるＳｅｒ（１６）のリン酸化は、ＳＲへのＣａ^２＋取込み速度の比例的上昇を導き、心室弛緩を促進する主要事象である。ＳＥＲＣＡ２ａに対するＰＬＢの相対的比率の上昇は、実験的及びヒトでの心不全の両方においてＳＲ機能不全の重要な決定因子である。さらに、ＰＫＡによるＰＬＢリン酸化の低下は、弛緩機能の損傷、及びβ‐アドレナリン作動性レセプタ‐ｃＡＭＰ系が交感神経緊張の上昇によって大きく下方調節される、不全心臓における延長されたＣａ^２＋一過性貯留の原因であると考えられる。

Ｔｏｙｏｆｕｋｕら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９：３０８８‐３０９４）による詳細な突然変異誘発研究は、ＰＬＢの細胞質ドメインのいくつかのアミノ酸がその阻害機能にとって重要であることを明らかにした。この研究は、一部のアミノ酸を異なる電荷のアミノ酸に変異させたとき、ＰＬＢ突然変異体はＨＥＫ２９３細胞においてコトランスフェクションしたＳＥＲＣＡ２ａへの阻害作用を喪失することを示した。しかし、これらの突然変異体を担うＰＬＢが内因性の野生型ＰＬＢに優勢な負の作用を及ぼし、その結果として心筋細胞において内因性ＳＥＲＣＡ２ａを刺激しうるのかどうかはまだ不明である。さらに、これらのＰＬＢの点突然変異の心筋細胞への移動機序が、内因性ＳＥＲＣＡ２ａ活性を生じさせるためにどのようにして細胞質膜関門を越えるのかは不明である。

Ａｒｂｅｒら（Ｃｅｌｌ，８８：３９３‐４０３；１９９７）による拡張型心筋症の遺伝に基づくマウスモデルは、心室拡張と心不全の進行が心筋小胞体における特異的なＣａ^２＋循環欠損に依存することの証拠を提供する。マウスモデルでは、ホスホランバン（ＰＬＢ）の遮断は、心不全に類似した構造的、機能的及び分子表現型のスペクトルを回復した。さらに、ＰＬＢ点突然変異のインビボでの強制過剰発現を通してのホスホランバン‐ＳＥＲＣＡ２ａ相互作用の解除は、主として心室筋細胞の収縮能を活性化した。従って、ＰＬＢ‐ＳＥＲＣＡ２ａ相互作用に干渉することは、心不全を予防するための新しい治療アプローチを提供する可能性がある。

ＰＬＢ‐ＳＥＲＣＡ２ａ相互作用に干渉することは心不全の治療のための潜在的治療標的になりうるという理解が存在するが、生存筋細胞による心筋収縮能を高めるための外因性分子のインターナリゼーションはまだ解決されていない問題である。治療薬を心筋細胞の細胞質と核に直接供給送達するための手段が提供されねばならない。トランスロケーション特性を備えたペプチドのクラスであるペネトラチンは、形質膜を横切って親水性化合物を運搬する能力を持つ。Ｓｃｈｗａｒｚｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９‐１５７２；１９９９）による研究は、変性ＨＩＶ ＴＡＴ蛋白質（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号ＡＦ０３３８１９）からのＮＨ_２末端の１１アミノ酸蛋白質形質導入ドメインを含むペネトラチンベースの融合蛋白質を用いた蛋白質形質導入へのアプローチを明らかにした。この非細胞型特異的移入系を使用すると、オリゴペプチド及びオリゴヌクレオチドを細胞質と核とに直接標的化することが可能になる。最もよく特徴づけられているトランスロケーションペプチドのひとつが、アンテナペディアの残基４３〜５８に対応するペプチド、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）転写因子である。トランスロケーションペプチドは細胞膜の外側で荷電リン脂質と相互作用すると考えられている。二重層の不安定化は、細胞膜を横切り、場合によって細胞質側に開口するペプチドを含む逆ミセルの形成をもたらす。カーゴ分子を細胞内に移動させる輸送ペプチドの使用は新規ではないが、輸送ペプチドが心筋細胞において良好に働くことは明らかにされていなかった。

それ故、心筋細胞におけるＰＬＢ／ＳＥＲＣＡ２ａ相互作用を操作するために、ＰＬＢの突然変異体または小分子阻害因子の使用を通してＰＬＢを阻害する方法、ならびに心臓病や心不全の治療のために、ＰＬＢのこれらの突然変異体又は小分子阻害因子を、筋小胞体膜関門を横切って心筋細胞の細胞質内に輸送する手段が求められている。本発明はこれらの必要を満たし、それに伴う利益も提供する。

（発明の概要）
心組織におけるＣａ^２＋取込みへのホスホランバンの作用を阻害することによって心不全の治療のための方法を提供することが本発明の利点である。

心筋細胞内でのホスホランバンと筋小胞体Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）の相互作用を阻害することにより、不全心臓における収縮能を高め、高血圧症を有する個人において血圧を低下させるように機能する、小ペプチド複合体と組換え蛋白質の両方を提供することが本発明のもうひとつの利点である。

野生型、突然変異体、又はトランケートされたＰＬＢに共有結合した輸送ペプチドから成る化合物のファミリーを提供することが本発明のさらにもうひとつの利点である。

本発明の最初の実施態様では、ＰＬＢとＳＥＲＣＡ２ａの正常な抑制相互作用を選択的に中断し、主として心筋収縮能を活性化させる能力を持つ野生型又は突然変異形態のＰＬＢの発現を促進する組換えアデノウイルスを構築する。

本発明の第二の実施態様では、ＰＬＢの組換えアデノウイルス突然変異体（Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅ）であるコントラクチリンをホスホランバンに結合して、リン酸化を模倣させる。これは筋小胞体のカルシウムポンプの活性化を導き、従って心筋収縮能を上昇させる。

本発明の３番目の実施態様では、１）１６残基の輸送ペプチドと２）トランケートされたホスホランバン蛋白質又は同様のペプチドの融合から成る化合物を、レセプタ非依存的に細胞膜を横切って輸送する。ひとたび心筋細胞の細胞質内に入ると、トランケートされたホスホランバン又は同様のペプチドは内因性ホスホランバンのＳＥＲＣＡ２ａとの相互作用の競合的阻害因子として働く。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
Ｃａ^２＋サイクルの欠陥が心不全への移行（transition）に果たす役割を直接的に評価するために、筋肉特異的ＬＩＭタンパク質（ＭＬＰ）欠損マウスの心筋症を、ＰＬＢをコードする遺伝子を除去することにより逆転できる。ＭＬＰの無くなったマウスは、多くのヒト拡張型心筋症の表現型特性を、分子、細胞、および生理学的レベルで示す。末期拡張型心筋症の均一な特性は、心臓壁応力の顕著な増加であり、これに伴って心房心室壁が薄くなり、心収縮性および弛緩の低下も伴う。カルシウムサイクルは、心弛緩および収縮性の両方に重要であり、筋小胞体からのカルシウムの取込みおよび放出を制御する経路の欠陥は、心不全の進行を駆動する主要な候補である。

ＭＬＰの欠損に加えて、ＰＬＢの欠損したマウスの創製は、ＭＬＰ単一ノックアウト（ＭＬＰＫＯ）マウスに通常見られる、全てのヒト心不全の表現型特徴からの回復を示す。ＭＬＰＫＯマウスにおけるＰＬＢ切除に関連した機能的利点は、特に、ＰＬＢとＳＥＲＣＡ２ａの間の直接的相互作用の欠失を反映するかを決定するために、本発明の出願人は、ＰＬＢとＳＥＲＣＡ２ａの間の機能的阻害相互作用を妨害する、ＰＬＢ遺伝子の点変異を操作した。ＰＬＢに点変異をコードする組換えアデノウイルスの創製により、心不全における興奮−収縮共役の進行的欠陥は、ＰＬＢによるＳＥＲＣＡ２ａの阻害の増強に関連し、心肥大症トランスジェニックモデルの設定への、ホスホランバン欠損症の導入により、心機能は回復されることが示される。これらの結果は、ＳＥＲＣＡ２ａの心特異的過剰発現を指示する導入遺伝子を有するＭＬＰ欠損マウスも、心筋症表現型の回復を示すという事実により独立的に支持される。合わせて考慮すると、これらの結果により、筋小胞体カルシウムサイクルは、心不全の進行に重要であり、心不全の進行において、ＰＬＢがＳＥＲＣＡ２ａ活性の阻害において重要な調節的役割を示す明白な証拠が提供される。よって、これはＰＬＢが、鍵となる治療標的である可能性を指摘する。

ＭＬＰ−ＰＬＢノックアウト（ＤＫＯ）マウスのさらなる研究により、心筋症変異の設定でＰＬＢ欠損を誘導することにより、最大の心収縮能の刺激が得られ得る。基底レベルでのＤＫＯ心臓の収縮性は、最大β−アドレナリン作用性刺激後に、野生型心臓の収縮性と同程度であった。この結果により、ＳＲカルシムポンプ機能のＰＬＢによる持続性阻害を取り除いた後、心筋症心臓の心収縮機能に関して、本質的に「この上ない回復」が得られることが示唆される。ＰＬＢは、サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡおよびカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼの両方によるリン酸化の直接的な基質であるので、ｃＡＭＰ依存性刺激による心収縮性の調節は、ＰＬＢのリン酸化を介して起こり得、次いでこれは、ＳＥＲＣＡ２ａとの阻害性相互作用を防ぐ。

ＰＬＢのリン酸化の背景にある理論によると、心筋症ＭＬＰ欠損マウスの、ＰＬＢ欠損の設定での極めて普通のレベルへの「この上ない回復」は、心収縮性の持続性阻害における律速段階の除去を単に反映し得る。この理論に一致して、Ｒｏｃｋｍａｎ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：７０００〜７００５：１９９８）による研究は、ＭＬＰ欠損マウスにおけるβ−アドレナリン作用性脱感作の軽減もまた、拡張型心筋症表現型をかなり回復し得ることを実証した。ＰＬＢは少なくとも３つの調節成分（ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼ、およびプロテインホスファターゼ）と相互作用するＳＲタンパク質であるので、心収縮能向上に対するＰＬＢ欠如の主な効果は、ＰＬＢとＳＥＲＣＡ２ａの慢性的相互作用を反映するのか、或いは、この救済効果は、ＰＬＢと他の既知または新規な心タンパク質との相互作用に関連するのかを決定すべきである。

野生型および変異形のＰＬＢの発現を強制する組換えアデノウイルスを使用して、本発明は、ＰＬＢとＳＥＲＣＡ２ａの間の正常な阻害性相互作用を選択的に妨害でき、カテコールアミンの非存在下で心室筋細胞の心収縮性を主に活性化できる、ＰＬＢの点変異体を提供する。図１は、ＤＫＯマウスで観察された回復効果に関与する機序の概略を示す。ＰＬＢおよびＭＬＰの両方が、筋肉特異的タンパク質であり、従って、筋細胞生存経路を促進または抑制する外因性応力シグナルではなく、表現型の進行および回復に必要な筋肉細胞自律経路が存在するに違いない。ＰＬＢとＭＬＰは、タンパク質レベルで直接的に相互作用しないので、回復の基礎としてのＰＬＢとＭＬＰの間の直接的相互作用は排除されるので、ＰＬＢ調節経路を、拡張型心筋症の発症に連関させる、生化学的調節経路ではなく、生理学的調節経路が存在するに違いない。図１に示したように、正常な心臓では、ＳＲ−カルシウム貯蔵は、ＳＥＲＣＡ２ａの活性を通じて維持され、これにより、カルシウムがＳＲに取り込まれ、その結果、正常な心臓弛緩が維持され、壁応力が減少する。続いて、カルシウム放出チャネルを介する、ＳＲのカルシウム放出により、正常な素量的なカルシウム放出が起こり、その結果、心筋フィラメントが活性化され、心筋収縮に至る。従って、ＳＲにＣａ^２＋含量が増強されることにより、Ｃａ^２＋の放出が増強され、これに対応して心筋収縮性が増加する。

ＳＥＲＣＡ２ａの活性は、ＰＬＢとＳＥＲＣＡ２ａの直接的相互作用の阻害効果により調節され、これは、β−アドレナリン作動性刺激の送達後に、ＰＬＢのｃＡＭＰ依存性リン酸化により軽減され得る。心不全の設定において、鈍いβ−アドレナリン作動性応答により生じるＰＬＢの阻害性効果のために、ＳＥＲＣＡ２ａの機能は相対的に減少している。結果として、ＰＬＢのリン酸化度は減少し、ＰＬＢとの慢性的な相互作用を介して、ＳＥＲＣＡ２ａは構成的に阻害され、正常レベルに比べて、ＳＲカルシウム含量は相対的に減少する。このカルシウム貯蔵の減少は、カルシウム放出チャネルを介した、カルシウムの量的放出の減少を引き起こし、その結果、単一細胞カルシウム過渡応答およびインビボでの心収縮性は減少する。ＤＫＯマウスでは、ＰＬＢの阻害効果は、図１に示されるように除去されており、よって、ＳＲカルシウムポンプに対するＰＬＢの下流阻害効果から系は解放され、その結果、ＳＲカルシウム取込みは維持され、正常レベルへと壁応力は減少する。同時に、このＳＲカルシウム含量の増加により、正常なカルシウム素量的放出は維持され、これにより、正常な収縮性および弛緩が維持される。

筋肉特異的ＬＩＭタンパク質ノックアウトおよび二重ノックアウトマウス
本発明の試験は、２つの独立的な筋肉特異的遺伝子のホモ接合型切除を有する、二重ノックアウト（ＤＫＯ）マウスモデルを使用して実施した。この戦略のために、ＰＬＢノックアウト（ＰＬＢＫＯ）マウスを、拡張型心筋症の複雑なインビボでの心不全表現型の、分子的、構造的および生理学的特性を有する、ＭＬＰノックアウト（ＭＬＰＫＯ）マウスと交配する。これらのマウスのＦ３世代を、実際の実験に使用して、ＰＬＢＫＯまたはＭＬＰＫＯ系の、観察されたＤＫＯ系の心表現型に対する全てのあり得るバックグラウンド効果を排除する。

ＭＬＰＫＯマウス（６．３４±０．２２ｍｇ／ｇ、ｎ＝８）は、年齢および性の一致した野生型マウス（４．６０±０．２１ｍｇ／ｇ、ｎ＝７；ｐ＜０．００１）と比べて、心臓／体重比の顕著な増加を示す。ＤＫＯマウス（５．１３±０．１９ｍｇ／ｇ、ｎ＝９）での心臓／体重比は、ＭＬＰＫＯマウスよりも有意に小さく（ｐ＜０．０１）、野生型と統計学的差異はない。ＤＫＯマウスの心臓重量減少が、ＭＬＰＫＯマウスで観察された破壊された細胞骨格表現型の回復に関連しているかを評価するために、電子顕微鏡解析を、ＭＬＰＫＯおよびＤＫＯ同腹仔の心臓で実施する。ＭＬＰ^−／−の背景におけるＰＬＢの切除は、筋原繊維錯綜配列および塊状の繊維化巣を含む、ＭＬＰ欠損心臓に元来観察された、広範囲の非構造的欠陥を回復する。これらのデータにより、ＰＬＢの切除は、全心臓塊の増加を防ぐだけでなく、ＭＬＰＫＯ心筋症マウスの心筋細胞再構築の組織破壊および繊維症を防ぐことが示唆される。

インビボの全体的な心機能に観察された顕著な低下が、ＤＫＯマウスで回復されるかを評価するために、心エコー図法を、年齢の一致した同腹仔を用いて実施する。表１に記述したように、心室拡張予防が、ＤＫＯマウスで確認される。ＭＬＰＫＯマウスは、肥大した心房心室を有し、これは、左心室拡張終末期径（ＬＶＥＤＤ）および収縮終末期径（ＬＶＥＳＤ）の増加により判明し、一方、ＤＫＯマウスは、正常範囲のＬＶＥＤＤを有する。短縮率の比率（ＦＳ％）および外周繊維短縮平均速度（平均Ｖｃｔ）（収縮期心機能の指標である）は、表１に示したように、年齢の一致したＤＫＯ同腹仔で向上する。対照として同腹仔ではない野生型マウスと比較すると、ＤＫＯマウスの大半の心エコー図データは、野生型マウスと類似しているが、ＦＳ％は、ＤＫＯマウスでは僅かに減少している。
さらに、ＤＫＯマウスの心機能は、６ヶ月令を超えても正常な範囲に維持されている（ｎ＝２）。心房心室拡張の減少にも関わらず、ＤＫＯ心臓にはいくらかの肥大があるようである。ＬＶＥＤＤとＬＶ後壁の厚さの比は、ＤＫＯマウスでは顕著に減少し、こは、ＤＫＯマウスの壁応力が、ＭＬＫＰＯまたは野生型マウスに比較して減少していることを示す。これらの結果は、ＤＫＯマウスの全体的な心機能が、対照心臓のパラメータと同程度の範囲で保存されていることを示す。
ＰＬＢ欠損についてヘテロ接合型であるマウスは、ＭＬＫＰＯおよびＤＫＯマウスに比べて、中間の機能的回復レベルを示し、これは、ＰＬＢの部分的切除により、ＭＬＰＫＯマウスにおいて、心不全表現型がかなり機能的に改善され得ることを示唆する。

ＭＬＰＫＯマウスは、β−アドレナリン作動性応答の顕著な鈍化およびアデニル酸シクラーゼ活性の減少を示した。マウスにおける相同的組換えによるＰＬＢの切除により、心収縮能は、正常心臓の最大β−アドレナリン作動性刺激によるレベルと同等なレベルまで増大し得る。ＰＬＢの切除は、拡張型心筋症に関連した、血行動態欠陥および顕著なβ−アドレナリン受容体脱感作を逆転し得ることを確認するために、麻酔したマウスに心カテーテルを適用し、評価する。

数個の独立的な血行動態パラメータが、ＤＫＯマウスにおける、循環鬱血を伴う重度の心機能不全の、正常なレベルへの回復を実証する。基線でのＬＶ収縮性（ＬＶｄＰ／ｄｔｍａｘにより評価）およびＬＶ弛緩（ＬＶｄＰ／ｄｔｍｉｎにより評価）は、図２ａおよび２ｂに示したように、野生型マウスよりも高いようであり、ＰＬＢＫＯマウスと同等である。ＰＬＢの切除により、図２ｃに見られるように、ＭＬＰＫＯ心筋症マウスに観察された顕著に上昇したＬＶ拡張終末期圧は逆転する。

図２ｄの解析は、Ｔａｕ（ＬＶ弛緩および収縮機能の指標である）もまた、ＤＫＯマウスで基準化され、これは壁応力の向上と一致する。これらのデータにより、ＰＬＢの切除は、心筋症ＭＬＰＫＯマウスにおける、収縮期および拡張期の両方の機能不全を回復できることが示唆される。β−アドレナリン作動性刺激に対するＬＶｄＰ／ｄｔｍａｘおよびＬＶｄＰ／ｄｔｍｉｎの鈍い応答が、図２ｅおよび２ｆに示されるように、ＭＬＰＫＯマウスで観察され、ＭＬＰＫＯマウスに重篤なβ−アドレナリン脱感作が存在することを示す。ＤＫＯマウスでは、ドブタミンにより、心収縮性（ＬＶｄＰ／ｄｔｍａｘ）および弛緩（ＬＶｄＰ／ｄｔｍｉｎ）は全く刺激されず、これは図２ｅおよび２ｆに再度示されている。これらのパラメータは、ＤＫＯ心臓において基底条件下で、その最大レベルにまですでに刺激されている。

ドブタミンによる野生型心臓の最大刺激後に、ＬＶｄＰ／ｄｔｍａｘおよびＬＶｄＰ／ｄｔｍｉｎは、任意のカテコールアミン刺激の非存在下で、ＤＫＯマウスにおけるこれらのパラメータと識別不可能である。この証拠は、ＰＬＢとＳＥＲＣＡ２ａの相互作用は、正常および心筋症心臓の両方において心収縮性を抑制し、よって、この相互作用を阻害すれば、任意のカテコールアミン刺激の非存在下で心機能を最大化する上で主な効果を奏効し得ることを確認する。図２ｈは、ドブタミンに対する変時性応答は、ＤＫＯマウスおよびＭＬＰＫＯマウスの両方において保存され、よって、ペースメーカー細胞型に対する心筋細胞へのβ−アドレナリン性応答の特異性が実証される。

ＤＫＯマウスにおけるインビボでの心機能の回復に関与する機序を決定するために、Ｃａ^２＋シグナル伝達の数個の独立的なパラメータを評価する。ＤＫＯマウスにおける変化したＣａ^２＋ホメオスタシスが、血行動態変化、細胞内Ｃａ^２＋過渡応答およびＳＲのＣａ^２＋サイクルに関連したタンパク質の発現をもたらすことは明らかである。ＭＬＰＫＯ筋細胞は、図３ａ〜ｃに示されるように、正常レベルの拡張期Ｃａ^２＋濃度を有し、振幅の減弱されたＣａ^２＋過渡応答を示す。崩壊速度は、ＭＬＰＫＯマウスにおいて僅かに加速され、これにより代償機序が、ＭＬＰＫＯマウスのＣａ^２＋取込みの終了中に作動する。ＰＬＢの切除は、Ｃａ^２＋過渡応答の期間が短いこと、崩壊が速いこと、および振幅が保存されていることに関連する。図３ｄは、ＳＲのＣａ^２＋含量は、野生型マウスと比べて、ＭＬＰＫＯマウスで有意に減少し、ＤＫＯマウスで増加していることを示す。図３ｅに示した定量的イムノブロットにより、ＭＬＰ欠損は、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＰＬＢおよびカルセケストリンのタンパク質レベルの有意な変化に関連しないことが判明し、これは、ＭＬＰＫＯマウスのＣａ^２＋サイクルの欠陥は、ＳＥＲＣＡ２ａまたはホスホランバンのタンパク質レベルの減少を単に反映するのではなく、ＥＣカップリングの機能的障害に基づくものであることが示唆される。

心不全の特徴的特性の１つは、胚遺伝子プログラムの再活性化であり、これは、血行動態負荷の増加に対する代償性応答に寄与し得る。ＤＫＯマウスでの血行動態の改善が、転写レベルでの変化の回復を伴うかを確認するために、ＡＮＦ、α−骨格アクチン、およびβ−ＭＨＣｍＲＮＡ（心不全の十分に確立された胚マーカーである）の発現を調べる。図４ａおよび４ｂに示されるように、ＭＬＰＫＯマウスの心室は、２６倍のＡＮＦの増加、１３倍のα−骨格アクチンの増加、および８倍のβ−ＭＨＣ ｍＲＮＡの増強を示す。ＤＫＯマウスは、僅か１．９倍のＡＮＦの増加を示し、α−骨格アクチンまたはβ−ＭＨＣ ｍＲＮＡは有意に増加しない。従って、ＰＬＢの切除は、主に、ＭＬＰＫＯマウスの胚遺伝子プログラムの誘導を抑制する。

前記の研究により、ＰＬＢの切除は、心収縮性における心不全および関連した欠陥の独立的パラメータを回復する。回復効果の機序を規定するために、ＰＬＢとＳＥＲＣＡ２ａの慢性的相互作用が、事実、正常および心筋症心臓の両方において心収縮性に律速であるかを評価することが必要である。ＤＫＯマウスの基底心機能の、最大カテコールアミン刺激後の野生型マウスのものと同等のレベルへの「この上ない回復」により、この相互作用の阻害は、任意のカテコールアミン刺激の非存在下で、心機能を最大化する上で主な効果を奏効し得ることが示唆される。

ＰＬＢの組換えアデノウイルス導入遺伝子変異体
ＰＬＢの特定のアミノ酸残基が、ＳＥＲＣＡ２ａに対するその阻害効果を維持するのに必要であるという知識を使用して、ＰＬＢの数個の単一の点変異、Ｖ４９Ａ（配列番号２）、Ｅ２Ａ（配列番号３）、Ｒ１４Ｅ（配列番号４）、Ｓ１６Ｎ（配列番号５）、ＰＬＢの二重点変異、Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅ（配列番号６）およびセンスおよびアンチセンスＰＬＢ（配列番号１）導入遺伝子を、ＳＥＲＣＡ２ａに対するＰＬＢの阻害効果を破壊するために操作できる。インビボでのネズミ心遺伝子導入のための組換えアデノウイルスを使用すると、ＰＬＢの単一点変異の１つである、Ｖ４９Ａを過剰発現する筋細胞は、収縮性の増加を示すが、野生型ＰＬＢを過剰発現する筋細胞は、非感染筋細胞に比べて、収縮性の減少を示し、これは図５に実証されている。ＳＥＲＣＡ２ａとＰＬＢの間の相互作用の妨害の実行可能性および有用性は、明確に実証されていると結論づけることができる。ＰＬＢ−ＳＥＲＣＡ２ａの相互作用は、インビボでの基底心収縮性および弛緩の設定値を確立するための律速段階のようであり、よってこの相互作用の崩壊は、β−アドレナリン性経路を短絡化し得る。

モノクローナルＰＬＢ抗体（アフィニティーバイオリージェンツ）に対する、センスＰＬＢ（ｓＰＬＢ）、アンチセンスＰＬＢ（ａｓＰＬＢ）、Ｅ２Ａ、Ｒ１４Ｅ、Ｓ１６Ｎ、およびＫ３Ｅ／Ｒ１４Ｅを発現しているアデノウイルス導入遺伝子を含む筋細胞の追加的なウェスタンブロット解析を、図６ａに示す。添加のばらつきのためにα−アクチンに基準化し、導入遺伝子を欠くアデノウイルス／ＳＲ対照と比較した、ＰＬＢタンパク質含量の定量化により、ｓＰＬＢ、Ｅ２Ａ、およびＲ１４Ｅ変異体は、ＰＬＢタンパク質レベルを、１５０％（ＰＬＢ_５＋ＰＬＢ_１）、７２％および５７％それぞれ増加することが示される。これに対し、ａｓＰＬＢおよびＳ１６Ｎは、筋細胞内のＰＬＢタンパク質含量を５４％および３３％減少させる。Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅ導入遺伝子により関連された筋細胞の導入により、異なるパターンの五量体ＰＬＢが形成される。ＰＬＢ_５（五量体）に加えて、複数のＰＬＢバンドが出現する。これは、対照と比較して、量の少ないＰＬＢ_５を伴う。

ウェスタンブロットバンドパターンの性質をさらに、心筋細胞の代わりに、ＰＬＢ欠損Ｓｏｌ８細胞に置換することにより評価する。Ｓｏｌ８細胞を、導入遺伝子ｓＰＬＢまたはＫ３Ｅ／Ｒ１４Ｅ単独または組合せを発現している、組換えアデノウイルスで感染させる。図６ｂに見られるように、ウェスタンブロットにより、モノクローナルＰＬＢ抗体は、ｓＰＬＢにより感染された細胞中のＰＬＢは検出するが、Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅは検出できないことが示される。Ｓｏｌ８細胞を、アデノウイルス導入遺伝子の組合せで感染させると、複数のＰＬＢバンドが形成される。さらに、ＰＬＢ五量体は、上のバンドが出現すると同時に量が減少する。ＰＬＢは、非阻害性五量体との平衡で存在する、単量体として、ＳＥＲＣＡ２ａと相互作用しそれを主に阻害することは十分に確立されている。この知識に基づき、Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅおよび野生型ＰＬＢのヘテロ五量体は、野生型ＰＬＢのホモ五量体よりも安定であろう。それ故、ヘテロ五量体の単量体への解離（これによりＳＥＲＣＡ２ａは阻害される）は、好ましくない。Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅは、内因性ＰＬＢと相互作用し、かかる複合体を形成し、ホモ五量体形成の減少を伴う。同じように、単量体Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅは、ＳＥＲＣＡ２ａ−ＰＬＢ相互作用部位を遮断することにより、内因性野生型ＰＬＢの非阻害性競合物質として作用し得る。

変異体およびアンチセンスＰＬＢの、ＳＥＲＣＡ２ａに対する効果はさらに、ＳＲカルシウム取込み活性の決定により評価する。様々なＣａ^２＋濃度で測定したＳＲによるＣａ^２＋取込みの初期速度は、ＳＥＲＣＡ２ａの活性を反映する。
図７に示したように、組換えアデノウイルス導入遺伝子Ｋ３Ｅ／Ｒ１４ＥおよびａｓＰＬＢで感染させた新生仔ラット筋細胞は、導入遺伝子を含まない対照と比較して、同じ活性のために、ＳＥＲＣＡ２ａにより必要とされるＣａ^２＋濃度の減少を示し、これは、ＳＥＲＣＡ２ａ活性の刺激を示す。取込み活性が最大の半分である、Ｃａ^２＋濃度のＥＣ_５０は、（μｍｏｌ／Ｌ）、導入遺伝子を含まない対照（ＳＲ−）については、０．２０±０．０２であり、Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅについては０．１１±０．０１であり、ａｓＰＬＢについては０．１３±０．０１である。Ｋ２Ｅ／Ｒ１４ＥおよびａｓＰＬＢのＳＥＲＣＡ２ａに対する効果も、成体ラット筋細胞で調べる。アデノウイルス導入遺伝子Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅは、ＥＣ_５０を有意（３６％）に減少させるが、ａｓＰＬＢ感染の結果としての変化は、統計的有意性の範囲内ではない。新生仔と成体心筋細胞の間の効果のこの見かけの矛盾はおそらく、異なる発達段階での筋細胞におけるＰＬＢの量の違いに関連するのだろう。ＰＬＢは、成体において、新生仔心筋のほぼ２倍である。

Ｋ３Ｅ／Ｒ１４ＥおよびａｓＰＬＢのＳＥＲＣＡ２ａに対する効果をさらに調べるために、新生仔筋細胞での細胞内Ｃａ^２＋過渡応答を、ｉｎｄｏ１蛍光指示薬を使用して測定する。各実験条件から得られたｉｎｄｏ１比率計量的データを、それぞれ最大および最小の各収縮性Ｃａ^２＋過渡応答に基準化し、次いで整列させ平均化する。図８に示したように、Ｋ３Ｅ／Ｒ１４ＥおよびａｓＰＬＢの崩壊曲線を、ＬａｃＺ対照の左に配置する。さらに、ほとんどの拡張期時点で、Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅは、ＬａｃＺとは有意に異なり、一方、数個の拡張期時点で、ａｓＰＬＢもまたＬａｃＺとは有意に異なる。ＬａｃＺ、Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅ、およびａｓＰＬＢの崩壊の半減期（ＲＴ_５０）は、０．２８秒（１００％）、０．２０秒（７３％）、および０．２２秒（７９％）とそれぞれ決定される。Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅ（７３％）およびａｓＰＬＢ（７９％）の数値は、ウイルス発現ＬａｃＺから得られた数値とは有意に異なる（ｐ＜０．０５）。

様々なＰＬＢの点変異、またはＰＬＢのセンスまたはアンチセンス配列を使用して、アデノウイルス導入遺伝子を作成するのに加えて、ＰＬＢペプチドに対して産生れ、従ってＲＮＡとして発現された抗体も、アデノウイルスベクターに挿入できる。ポリクローナルＰＬＢ抗体（「コントラクチリン」、すなわち機能亢進領域をもつニワトリ抗体ペプチド）を産生するために、ニワトリを、細胞質ドメインのアミノ酸３〜１９を示すＰＬＢペプチドを用いて繰返し免疫化する。１５、４２および５４日目に投与した、３回のブースター免疫化後、全ＩｇＹを、市販で入手できる精製システム（ＥＧＧｓｔｒａｃｔＩｇＹ精製システム−プロメガ）を使用して、卵黄から精製する。陽性免疫応答が確認されると、脾臓および骨髄からリンパ球を収集する。抗体の軽鎖および重鎖の両方からの超可変領域の形のＲＮＡが、これらの細胞から得られ、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、その方法は公知である。

次いで、増幅され精製された超可変領域ＲＮＡを、単一ｃＤＮＡ（配列番号９）に融合させ、続いて、ファージ表面タンパク質をコードする、プラスミドベクターにフレーム内にクローン化する。標準的なプラークディスプレイ技術を使用して、ニワトリの免疫ライブラリーを発現するファージを、ＰＬＢペプチドに対する陽性応答により選択する。ＰＬＢに特異的に結合するファージの一連の濃厚化の後、２０のクローンをＥＬＩＳＡ用に選択する。次いで、得られた５つの最善の結合物質を、放射性Ｃａ^２＋輸送アッセイを使用して解析する。２つの最善のＳＲＣａ^２＋輸送の活性化物質をさらに解析する。両方のクローンが、Ｃａ^２＋のＳＲへの輸送速度を劇的に刺激することが判明する。

コントラクチリン（ＰＬＢ抗体）より生成された組換え体タンパク質が、生細胞内でも機能できることを示すために、コントラクチリンを発現しているアデノウイルスベクターを構築した。アデノウイルス導入遺伝子を感染させた新生児および成体ラット心筋細胞のウエスタンブロット解析によって、コントラクチリンが心臓細胞で発現されうることが示されている。放射活性Ｃａ^２＋輸送解析により、変異体およびアンチセンスＰＬＢの場合、コントラクチリンが細胞質Ｃａ^２＋除去を加速することが示されている。

相補的アプローチにおいては、アデノウイルストランスフェクションよりもプラスミドトランスフェクションを遺伝子デリバリーのために使用した。一緒にトランスフェクトした緑色蛍光タンパク質によってモニタしたように、Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅ−およびａｓＰＬＢ−トランスフェクト筋細胞は、アデノウイルスベクターをトランスフェクトした細胞と比較して、それぞれＲＴ_５０の４３％（ｐ＜０．０５）および９％（ｐ＜０．１）の減少を示した。したがってアデノウイルスまたは共トランスフェクション技術のどちらかによる心筋細胞へのＫ３Ｅ／Ｒ１４ＥおよびａｓＰＬＢの導入は、拡張期Ｃａ^２＋過渡応答の持続時間を減少させる。これらの結果は、Ｃａ^２＋過渡応答の変化が、ＰＬＢの除去がＣａ^２＋過渡応答期間の短縮、よりはやい減衰、および振幅の保持に関連することを確かにするＤＫＯマウス対ＭＬＰＫＯマウスの発見を反映していると考えられた。一緒に考えると、これらのデータは、Ｋ３Ｅ／Ｒ１４ＥおよびａｓＰＬＢはＳＥＲＣＡ２ａ活性を刺激し、結果として筋細胞でのよりはやいＣａ^２＋過渡応答となることを確かにする。

ＰＬＢ変異体の結果としてのＳＥＲＣＡ２ａ活性の増強およびＣａ^２＋過渡応答の加速が収縮期動作の変化をもたらすかどうかを決定するために、エッジ検出を使用し、筋細胞収縮性を解析した。成体ウサギ筋細胞にＬａｃＺ、Ｋ３Ｅ／Ｒ１４ＥまたはａｓＰＬＢのアデノウイルス導入遺伝子を感染させた。３日間のインキュベーション期間の後、異なる群間で自発的収縮細胞の数には有意な違いがある（ＬａｃＺ＜＜ａｓＰＬＢ＜Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅ）。表２は筋細胞収縮性におけるＫ３Ｅ／Ｒ１４ＥおよびａｓＰＬＢの効果を提供する。表に示したように、ＬａｃＺ対照と比較すると、Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅは７４％まで分別短縮を増加させ、ＲＴ_５０での２５％減少および＋ｄＬ／ｄｔでの１１５％増加も同時に起こる。ａｓＰＬＢ感染の後に筋細胞収縮性を試験した場合、筋細胞の分別短縮は５７％まで有意に増加する一方、ＲＴ_５０および＋ｄＬ／ｄｔの変化は有意でないことが明らかになっている。

得られたデータは、ＳＥＲＣＡ２ａ活性の増加が、筋細胞の弛緩の加速に転換されることを示している。Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅ感染筋細胞は分別短縮の上昇を示し、このことはＳＥＲＣＡ２ａ活性の増強によるＣａ^２＋のＳＲ負荷における増加を示している。さらにＫ３Ｅ／Ｒ１４Ｅ感染はＣａ^２＋のＳＲ負荷の増加による振動Ｃａ^２＋量の増加にほとんど関連していると考えられる減少である、自発的収縮筋細胞の数を増加させる。共に考えると、これらのデータは、Ｋ３Ｅ／Ｒ１４Ｅは、ＳＥＲＣＡ２ａのその抑制を有意に減少させる方法にて内因性野生型ＰＬＢに影響を与え、したがって野生型ＰＬＢ上の顕著な抑制効果を持つことを示している。

ＰＬＢ活性の抑制に対するペプチドに基づいた治療
さらにまた、本発明は、ＰＬＢ機能が変異体ＰＬＢ分子で内因性ＰＬＢを圧倒することによるドミナントネガティブ様式で抑制されることができ、この抑制は心不全での機能の改善を導くという発見に基づいて、ホスホランバン活性の抑制に関するペプチドに基づいた治療およびそのような治療に関するデリバリー方法を提供する。

標的細胞系に影響を与えるためのＰＬＢ−ＳＥＲＣＡ２ａ相互作用の抑制剤のような治療薬剤に関して、細胞膜を介した細胞室内への内在化の方法を持たなければならない。前記抑制剤のデリバリーの方法は、ＰＬＢペプチドに基づいた輸送または浸潤のどちらかの方法であってよく、またはアデノウイルスまたは脂質小胞に基づいた輸送を含んでもよい。この目的のために、輸送ペプチドおよびＰＬＢタンパク質分子の融合体からなる化合物を構築した。輸送ペプチドはアンテナペディアに対する配列からの１６残基、ショウジョウバエ転写因子タンパク質を含む。前記複合体の第二のペプチドは、ＰＬＢタンパク質の切断配列であり得る。さらなる治療利益は、天然のＰＬＢタンパク質およびＰＬＢタンパク質の変異体または切断型に相当するペプチドを用いて行い得る。

輸送ペプチド−ＰＬＢ複合体の１つの有益な機能は、心筋細胞内でのＰＬＢとＳＥＲＣＡ２ａとの間の相互作用の抑制であり、結果として疾患心臓における収縮性を増大する。本発明はまた、結果として血管拡張および血圧の低下となるであろう循環系の動脈／細動脈を取り巻く平滑筋層内でのＰＬＢのＳＥＲＣＡ２ａとの相互作用も抑制する可能性がある。したがって、心疾患の治療において二重の利点があり、第一は心不全での心臓収縮性の増強であり、他は高血圧の個人における血圧の低下である。また、神経組織でのＳＥＲＣＡ１−ＰＬＢ相互作用のような、他の細胞型のＳＥＲＣＡタンパク質とのＰＬＢ相互作用の阻害も予想される。

前記分子の心臓に流れ込む血流中への導入は、冠動脈に局在させたカテーテルを用いて行うのがもっともよい。前記分子が心筋細胞を囲む細胞外環境中にある場合、すばやく心筋内に入り、ＰＬＢのＳＥＲＣＡ２ａとの結合を抑制する。トランスロケーション機能は、細胞膜を通してレセプター非依存的様式でそれ自身および付着した「カーゴ」ペプチドを素早くトランスロケーションさせる能力を示す輸送ペプチドに帰する。いったん心筋細胞の細胞室内に入ると、ＰＬＢ断片は、ＳＥＲＣＡ２ａとの内因性ＰＬＢ相互作用の競合阻害剤として働く可能性がある。

結合によるＰＬＢ阻害がない場合、ＳＥＲＣＡ２ａはより効率的にＳＲ内へＣａ^２＋をそそぎ込み、それによって心筋細胞のより強くはやく収縮する能力を増加させる。より強い心筋細胞の収縮性は、より強力な心臓収縮性に変換する。インビボにおいて、本発明は、心不全の治療として機能でき、最も簡単に投与でき、心臓が左心補助装置（ＬＶＡＤ）を必要とし、またはすでに移植されている患者においてもっとも効果的である。

アンテナペディアの残基４３〜５８はよく特性化されたトランスロケーションペプチドであり、本発明においてうまく働く一方、本発明はこの方法の輸送に限定されない。他の可能性のある輸送の方法には、輸送ペプチドおよびカーゴペプチドに連結する８−分岐ポリリジン骨格の使用が含まれるが、この多分岐構造に限定はされない。１つの長いペプチドとして１つのＰＬＢペプチドに接着した１つの標的ペプチドからなる化合物もまた調査されてきた。さらにまた、細菌内でヘキサヒスチジン（Ｈ６）タグ化ペネトラチンおよびペネトラチン−ＰＬＢ組換え体タンパク質を産出するために多くのＤＮＡ構築体も考慮されてきた。ペネトラチンペプチドは、タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端どちらかで存在するように作製した。

ＰＬＢの細胞質断片が、全ＰＬＢ分子のようにＳＥＲＣＡ２ａの細胞質部分に対する結合親和性を強く持つことが示されてきた。したがって、いったん輸送−ＰＬＢ分子が心筋細胞の細胞室内にあると、ＰＬＢ断片は、ＳＥＲＣＡ２ａとの内因性ＰＬＢの相互作用の競合抑制剤として働くと予想される。

治療の本型は、医学治療に対して難治性の心臓ポンプ機能の重度の減少を患っており、心臓移植を待っている間に機械的補助装置を必要とする患者に対して好適である。さらに、ＰＬＢ変異体のドミナントネガティブ機能に対する明示した分子機構を、阻害小分子に対する高処理スクリーニングの設計および履行で使用できる。

以下の実施例は本発明を制限することなしに、例示することを意図している。

実施例１ 超音波心臓検査のためのノックアウトマウス系統の作製
拡張性心筋症の心不全表現系のインビボでの複合体の構造的、生理学的特徴を解析するために、いくつかのノックアウトマウスの系統を、２つの独立した筋肉特異的遺伝子の同型接合体切断を内含する二重ノックアウト（ＤＫＯ）マウスモデルを使用して作製し、実施した。この戦略のために、ＰＬＢ^−／−（ホスホランバン欠損）同型接合体マウスをＭＬＰ^−／−（筋肉特異的ＬＩＭタンパク質）同型接合体マウスと配合した。Ｆ１子孫をＭＬＰ^−／−×ＰＬＢ^−／−同型接合体交配より作製し、ついで交配してＭＬＰ^＋／−、ＰＬＢ^＋／−二重異型接合体遺伝子型を作製した。Ｆ２子孫をＭＬＰ^＋／−／ＰＬＢ^＋／−二重異型接合体交配より作製し、これによって変異体ＭＬＰ対立遺伝子に関して同型接合体であり、変異体ＰＬＢ対立遺伝子に対して異型接合体であるマウス、またはＭＬＰ野生型であり、変異体ＰＬＢ対立遺伝子に対して異型接合体であるマウスを作製した。Ｆ３子孫をＭＬＰ^−／−／ＰＬＢ^＋／−配合によって作製し、ＭＬＰ^−／−／ＰＬＢ^−／−（ＤＫＯ）、ＭＬＰ^−／−／ＰＬＢ^＋／＋（ＭＬＰＫＯ）およびＭＬＰ^＋／＋／ＰＬＢ^−／−（ＭＬＰＫＯ／ＰＬＢｈｅｔ）同胞子を作製し、またはＭＬＰ^＋／＋／ＰＬＢ^＋／−交配からＭＬＰ^＋／＋／ＰＬＢ^−／−（ＰＬＢＫＯ）、ＭＬＰ^＋／＋／ＰＬＢ^＋／＋（野生型）およびＭＬＰ^＋／＋／ＰＬＢ^＋／−（ＰＬＢｈｅｔ）同胞子を作製した。遺伝を標的とした交配の遺伝子型をＰＣＲまたは尾生検から単離したゲノムＤＮＡによって決定した。

さまざまなノックアウトマウス系統の血流力学的特性を評価するために、心臓にカテーテルを通し、超音波心臓検査を、アベルチン（２．５％、２０μｌ／ｋｇ体重）またはキシラジン（０．００５ｍｇ／ｇ）と塩酸ケタミン（０．１ｍｇ／ｇ）のいずれかで麻酔した対象上において行った。経胸壁Ｍモード超音波心臓図検査トレーシングにより、ＭＬＰＫＯマウスが壁運動の減少を伴う室拡張をしていることが示唆され、このことは心機能の抑制および壁ストレスの増加を示し、一方で、ＤＫＯマウスでは室サイズおよび心機能は正常である。野生型（ＷＴ）、ｎ＝７、ＭＬＰＫＯ、ｎ＝８、ＤＫＯ、ｎ＝９およびＰＬＢＫＯ、ｎ＝５に関する基準線パラメータは図２ａ−ｄで示す。データは平均±ＳＥＭとして表した。ＭＬＰＫＯ対他の群、^＊ｐ＜０．５、^＊＊ｐ＜０．００１、ＷＴ対ＤＫＯ、^＃ｐ＜０．０１。図２ｅ−ｈにおいて、血流力学的査定は、ドブタミンの連続的注射に対するβ−アドレナリン性応答で行い、ＷＴ（□）、ｎ＝７、ＭＬＰＫＯ（●）、ｎ＝８、およびＤＫＯ（○）、ｎ＝９マウスである。ＭＬＰＫＯ対ＷＴまたはＤＫＯ、^＃ｐ＜０．０５、^＋ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．００１、ＷＴ対ＤＫＯ、∋ｐ＜０．０１。

実施例２ カルシウム過渡応答（transient）解析
ＳＲカルシウム含量およびカルシウム過渡応答におけるＰＬＢ阻害の効果を評価するために、筋細胞を野生型またはノックアウトマウスの左心室壁より単離した。細胞内カルシウムの変化をモニタするために、前記単離した筋細胞をカルシウム感受性色素、フルオ−３−ＡＭ（１μｇ／ｍｌ）と共に室温にて３０分間インキュベートした。次いでこの筋細胞を反転顕微鏡のステージ上の組織チャンバーに移し、１Ｈｚの速度にて連続的に刺激し、一定量のＳＲカルシウム負荷を保持した。細胞内蛍光を測定するために、この筋細胞を４８０ｎｍの励起波長にて発光させた。蛍光のすべての変化をマイクロフルオロメーター（ＦＭ−１０００、Ｓｏｌａｍｅｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して５１０ｎｍでモニタし、以後のＣｅｌｌｓｏｆｔ（Ｄ．Ｂｅｒｇｍａｎ、カルガリー大学）ソフトウェアを用いた解析のためにデジタルで記録した。蛍光値を式：
［Ｃａ^２＋］ｉ＝Ｋ_Ｄ（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／（Ｆｍａｘ−Ｆ） （１）
Ｋ_Ｄは８６４ｎＭと仮定し、式中Ｆは実験に基づいて得られた蛍光値、を用いて換算した。Ｆｍａｘは灌流溶液へ１０μＭのイオノマイシンを添加することで決定し、Ｆｍｉｎはそれぞれの筋細胞について灌流溶液に４ｍＭのＭｎＣｌ_２を添加することで決定した。

単離した筋細胞のＳＲカルシウム含量を標準カフェインパルスプロトコールを用いて評価した。カルシウム過渡応答の安定した記録にしたがって、１０ｍＭカフェインの２０秒パルスを筋細胞に与えた。このプロトコールは結果として、ゆっくりと基準値に減衰して戻る急速カフェイン誘導過渡応答となる。ＳＲカルシウム含量は、このカフェイン誘導カルシウム過渡応答の積分面積として定義した。図３ａはＷＴ、ＭＬＰＫＯおよびＤＫＯ筋細胞での応答性細胞内カルシウム過渡応答を例証している。ＭＬＰＫＯ筋細胞は通常のレベルの拡張期カルシウム濃度でのカルシウム過渡応答の振幅の減衰を示した。ＤＫＯ筋細胞は、持続期間が短く、より速く減衰し、振幅が保持されたカルシウム過渡応答を示した。図３ｂに示すように、カルシウム過渡応答の振幅はＭＬＰＫＯ筋細胞内で有意に弱くなり、ＤＫＯ筋細胞では回復した。図３ｃは、細胞内拡張期カルシウム濃度が、３つの異なる群の筋細胞間で異ならなかったことを示している。図３ｄにおいて、ＷＴマウスと比較したときに、ＳＲカルシウム含量がＭＬＰＫＯマウスにて有意に減少し、ＤＫＯマウスでは増加した。図３ｅでは、代表的な定量的免疫ブロッティングによって、ＭＬＰ欠失が、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＰＬＢおよびカルセケストリンのタンパク質レベルの有意な変化と関連しないことが明らかになった。

実施例３ 変異体ＰＬＢアデノウイルスの構築および遺伝子移送
ヒトＰＬＢをコードしているＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．共同ｃＤＮＡクローンはＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．を通して入手可能であった。ＰＬＢの全コード配列を含むＤＮＡ断片を、公知の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニングベクター（ＡＴＣＣ受け入れ番号８７０４７）であるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳベクター内にサブクローン化した。センス変異（Ｖａｌ４９Ａｌａ）を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより商業的に入手可能なＰＣＲに基づいた変異導入系を用いて導入した。野生型および変異体ヒトＰＬＢを発現している組換え体アデノウイルスを、プラスミドｐＪＭ１７とＲＳＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリＡ配列を含むシャトルプラスミドとの間の相同組換えによって作製した。濃縮したウイルス調製品を標準のプロトコールを使用して滴定した。効率よいインビボでの心臓遺伝子移送を、１日齢新生児マウスの心臓にアデノウイルスベクターを注入することで行った。筋細胞をマウス心臓内への注射の後４週間で単離し、細胞短縮を測定した。変異体導入遺伝子を含む筋細胞を、マーカーとしてＧＦＰを発現しているアデノウイルスベクターを共にトランスフェクトすることで同定した。

実施例４ ＰＬＢ阻害剤−輸送ペプチド複合体の構築
ＰＬＢ阻害分子を、輸送ペプチドとＰＬＢタンパク質を直接ポリリシン骨格に付着させて作製した。あるいはＰＬＢ分子はまた繰り返しカーゴペプチド配列に接着した輸送配列からなる単一長ペプチドとして作製できた。輸送ペプチドはアンテナペディアの残基４３〜５８（Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．７）、ショウジョウバエ転写因子タンパク質で構成された。カーゴペプチドは、ＰＬＢの最初の１６残基（Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．８）を使用して誘導した。このカーゴ配列はまた、野生型ＰＬＢまたは変異体ＰＬＢの任意の区画から由来可能であることに注意することが重要である。

ＰＬＢ阻害分子を、４輸送ペプチドをＰＬＢの最初の１６残基とマッチしている４ペプチドに結合することで構築した。骨格リンカーは８−分岐リシンであり、一般的に多重抗原性ペプチド（ＭＡＰ）合成で使用されたものである。ＭＡＰ樹脂の最初の４分岐を、アンテナペディアペプチドを合成するのに使用した。次いで、次の４分岐を脱保護し、ＰＬＢカーゴペプチドの合成の開始点として使用した。したがって、初期の特性化のために使用したこの特定のＰＬＢ阻害剤はアンテナペディアペプチドの４分岐およびＰＬＢカーゴペプチドの４分岐を持った。あるいは、ＰＬＢ阻害剤は互いに単一ペプチド結合によって接着したカーゴおよび輸送ペプチド、または互いにジスルフィド結合によって接着したカーゴおよび輸送ペプチドを持つ単一ペプチドとして構築できた。ＰＬＢ阻害分子を単離した新生児ラット心筋細胞内に効果的にトランスロケーションし、図５ａおよびｂで見ることのできる結果である、結果としての細胞の収縮性の増加が示された。非感染筋細胞と比較した場合、Ｖ４９Ａ ＰＬＢ点変異を過剰発現している筋細胞は収縮性の増加を示し、一方、野生型ＰＬＢを過剰発現した筋細胞は収縮性の減少を示した。

実施例５ ペネトラチンペプチドＴＡＴおよびＡＮＴ
細胞レベル研究をおこない、２つのペネトラチンに基づくペプチド、２つの変異体ＰＬＢ−ペネトラチンペプチドおよび２つの多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）の、単離したマウス心筋細胞の収縮サイクルを強化する能力を評価した。２つのペネトラチンに基づいたペプチドには、それぞれＡＮＴ（Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．１４）の５’末端またはＴＡＴ（Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．１５）の３’末端のどちらかに接着するＰＬＢ配列の２０残基部分を持つ、ＰＬＢ−ＡＮＴ（Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．１０）およびＴＡＴ−ＰＬＢ（Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．１１）が含まれる。２つの変異体ＰＬＢペプチド、変異体ＰＬＢ−ＡＮＴ（Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．１２）およびＴＡＴ−変異体ＰＬＢ（Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．１３）は、ＰＬＢ配列の２０残基のＳ１６Ｅ変異を示す。多重抗原ペプチドには８ペネトラチン領域をもつＭＡＰ（ＡＮＴ）および４ペネトラチン領域および４ＰＬＢ領域を持つＭＡＰが含まれる。

それぞれのペネトラチン−ＰＬＢペプチドを、単離したマウス心筋細胞の収縮サイクルを強化するその能力を測定して評価した。理想はペネトラチンＰＬＢペプチドがＰＬＢ−ＳＥＲＣＡ２ａ相互作用のドミナントネガティブ阻害剤として働くことである。単離した心筋細胞上でのＴＡＴ−ＰＬＢペプチドの結果を表３に示す。このデータに関しては、試験をいくつかの心筋細胞の組で繰り返し行い、ＴＡＴ−ＰＬＢペプチドあり（試料１−７）、およびペプチドなし（対照１−８）での収縮サイクルを通した相対的長さの変化を決定した。それぞれの試料には１０μＭのＴＡＴ−ＰＬＢペプチドの濃度を添加し、一方対照にはペプチドを添加しなかった。

測定は毎２０ミリ秒毎に行い、長さの単位は任意であるが、しかし一般的に１完全細胞長のオーダーに基づいた。パーセント収縮は（最大長−最小長）を最大長で割ったものとして計算した。時間対長さのプロットは、そこから最も直線の部分を選択したＵ型曲線となり、「Ｕ」の左側は収縮を表し、右側は弛緩を表している。ｒ２棒は、どれくらいデータが曲線にフィットしているかを示し、１．０が完全フィットを示す。

筋細胞においてより大きく、より速い収縮への傾向があるように見られた一方で、Ｔ検定解析では、データの大きな変動のためになんの統計学的な差も同定されなかった。

実施例６ ヘキサヒスチジンタグ化ペネトラチン
多くのＤＮＡ構造を、細菌内でヘキサヒスチジン（Ｈ６）タグ化ペネトラチンおよびペネトラチン−ＰＬＢ組換え体タンパク質を産出するために作製した。商業的に入手可能である発現ベクターｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ）を使用し、組換え体タンパク質Ｈ６−ＡＮＴ（Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．１６）を作製した。
この組換え体タンパク質はＰＬＢに接着していない一方で、心臓に入ったときにこのタンパク質を検出するのに使用するエピトープタグを持つように作製した。
Ｈ６−ＰＬＢ（Ｓ１６Ｅ変異体）−ＡＮＴタンパク質およびＨ６ ＰＬＢ （Ｖ４９Ａ変異体）ＡＮＴタンパク質（それぞれＳｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．１８および１９）に加えて、Ｈ６−ｗｔＰＬＢ−ＡＮＴ（Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．１７）のＨ６−ＡＮＴの変形体もまた、ＰＬＢ配列を含んで発現させた。Ｈ６−ベータ−ガラクトシダーゼ−ＡＮＴ、Ｈ６−ＴＡＴおよびＨ６−ベータ−ガラクトシダーゼ−ＴＡＴはまた低レベルで発現した（配列は記載していない）。ＴｒｐがＰｈｅに変異された残基６８および６７での２つの変異を持つ非機能的ＡＮＴ−ペネトラチンを、他の３つのペネトラチン−ＰＬＢタンパク質に対する陰性対照として作製した。

これらの組換え体ペネトラチンに基づいたタンパク質の心臓収縮における効果を測定するために、１匹のマウスに腹腔内に２ｍｇのＨ６−ＡＮＴペプチドを注射した。第二のマウスには腹腔内に２ｍｇのＨ６−ＡＮＴ変異体タンパク質を注射した。３時間のインキュベーション期間の後、マウスを犠牲死し、心臓を解析のために取り除いた。心臓内の血液を大動脈弓を通して流体を後方へ押すことで取り除いた。それぞれの心臓を心房組織、左心室組織および右心室組織に切り裂いた。すべての組織を、大量の生理学的平衡化ＰＢＳ溶液内で洗浄し、液体窒素内で瞬間冷凍した。次いでこの組織を８Ｍ尿素、２％ トリトン−Ｘ１００内で、１０分間で溶解し、同量の上清を１５％ＰＡＧＥ上で電気泳動した。バンドをＰＶＤＦ膜に写した。この膜を溶解物がエピトープタグ化タンパク質を含んだかどうかを同定するために坑Ｈｉｓ抗体で標識した。

本明細書で開示された本発明は、心筋細胞内でのホスホランバンと筋小胞体 Ｃａ^２＋−ＡＴＰａｓｅ間の相互作用を抑制するかまたは変更することを介した心不全の治療のさまざまな方法を提供する。本発明は、以上で提供された実施例に関して記述してきたが、さまざまな変更が、本発明の意図を逸脱せずに行われうることを理解すべきである。したがって、本発明は以下の請求項によってのみ制限される。

図１は、心不全の進行におけるＰＬＢ−ＳＥＲＣＡ２ａ相互作用の役割についての作動モデルを図示する図である。 図２は、ＤＫＯマウスにおけるインビボでの心臓機能不全の回復についての血行動態解析（ａ〜ｄ）およびドブタミンの連続注入に対するβ−アドレナリン作動性応答の血行動態評価（ｅ〜ｈ）を示し、図２ａは、ＬＶ圧の最大一次導関数、ＬＶｄＰ／ｄｔｍａｘのプロットを示す。図２ｂは、ＬＶ圧の最小一次導関数、ＬＶｄＰ／ｄｔｍｉｎのプロットを示す。図２ｃは、ＬＶ拡張終末期圧のプロットを示す。図２ｄは、Ｔａｕのプロットを示す。図２ｅは、ＬＶ圧の最大一次導関数、ＬＶｄＰ／ｄｍａｘのグラフを示す。図２ｆは、ＬＶ圧の最小一次導関数ＬＶｄＰ／ｄｔｍｉｎのグラフを示す。図２ｇは、ＬＶ拡張終末期圧のグラフを示す。図２ｈは、心拍数のグラフを示す。 図３は、ＤＫＯ筋細胞における生理学的カルシウムシグナル伝達欠陥の回復についての解析からの、プロットデータを示し、図３ａは、ＷＴ、ＭＬＰＫＯおよびＤＫＯ筋細胞における、一連の代表的な細胞内Ｃａ^２＋過渡応答のグラフである。図３ｂは、Ｃａ^２＋過渡応答の振幅の棒グラフである。図３ｃは、細胞内拡張期Ｃａ^２＋濃度の棒グラフである。図３ｄは、ＳＲのＣａ^２＋含量の棒グラフである。図３ｅは、ＭＬＰ欠損のイムノブロットである。 図４ａは、ＤＫＯマウスにおける心不全表現型の胚遺伝子マーカーの回復についてのドットブロット解析を示す。図４ｂは、野生型、ＭＬＰＫＯ、およびＤＫＯ筋細胞のｍＲＮＡの相対誘導を比較した棒グラフである。 図５は、ＰＬＢとＳＥＲＣＡ２ａの間の相互作用の阻害を示し、図５ａは、筋細胞の長さの変化をプロットした一連のグラフである。図５ｂは、細胞の長さの変化のデータの要約である。 図６ａは、モノクローナルＰＬＢに対する、センスＰＬＢ（ｓＰＬＢ）、アンチセンスＰＬＢ（ａｓＰＬＢ）、Ｅ２Ａ、Ｒ１４Ｅ、Ｓ１６Ｎ、およびＫ３Ｅ／Ｒ１４Ｅを発現しているアデノウイルス導入遺伝子を含む筋細胞のウェスタンブロット解析である。図６ｂは、ＰＬＢ、ｓＰＬＢおよびＫ３Ｅ／Ｒ１４Ｅによる細胞の感染力の結果を示すウェスタンブロットである。図６ｃは、ＳｏｌＢ細胞のＰＬＢ感染力のウェスタンブロット解析を示す。 図７は、示した遺伝子を発現しているアデノウイルスで感染させた、新生仔ラット心筋細胞のホモジネートにおける、ＳＲのＣａ^２＋取込みのプロットである。 図８は、ｉｎｄｏ１蛍光により促進された筋細胞のＣａ^２＋過渡応答から得られたデータのプロットを示す。

Claims (17)

1. ホスホランバン欠乏を誘導することを含む、心不全の治療のための方法。
2. 外因性ホスホランバン蛋白質がホスホランバン欠乏を誘導する、請求項１に記載の心不全の治療のための方法。
3. 外因性ホスホランバン蛋白質が、ＰＬＢの突然変異体、センスＰＬＢ、アンチセンスＰＬＢ、トランケートされたＰＬＢ、天然ＰＬＢ、及びＰＬＢに対する抗体から成る群から選択される、請求項２に記載の心不全の治療のための方法。
4. ＰＬＢの突然変異体がＰＬＢの点突然変異体を含む、請求項３に記載の心不全の治療のための方法。
5. ＰＬＢに対する抗体がコントラクチリンを含む、請求項３に記載の心不全の治療のための方法。
6. 複合体として第一ペプチドと第二ペプチドから成り、第一ペプチドが輸送ペプチドを含み、第二ペプチドがカーゴペプチドを含む、ホスホランバン活性を阻害するためのペプチドベースの治療薬。
7. 輸送ペプチドが、ペネトラチン、アデノウイルス、細菌及び脂質小胞ベースの輸送ペプチドから成る群から選択される、請求項６に記載のペプチドベースの治療薬。
8. カーゴペプチドが、ＰＬＢの突然変異体、センスＰＬＢ、アンチセンスＰＬＢ、トランケートされたＰＬＢ、及び天然ＰＬＢ蛋白質から成る群から選択される、請求項６に記載のペプチドベースの治療薬。
9. 第一ペプチドが細胞膜を横断して第二ペプチドを輸送する、請求項６に記載のペプチドベースの治療薬。
10. 第一ペプチドと第二ペプチドが共有結合によって結合している、請求項６に記載のペプチドベースの治療薬。
11. 共有結合が分枝ポリリシン骨格、単ペプチド結合、又はジスルフィド結合から成る、請求項１０に記載のペプチドベースの治療薬。
12. ＰＬＢ‐ＳＥＲＣＡ２ａ相互作用の阻害によって心筋収縮能を高めることを含む、心不全の治療のための方法。
13. 心筋小胞体のＣａ^２＋ＡＴＰアーゼへのＰＬＢの作用を阻害することによって心筋収縮能が高められる、請求項１２に記載の方法。
14. 外因性ホスホランバン蛋白質を使用してホスホランバン欠乏を抑制する、請求項１２に記載の方法。
15. 外因性ホスホランバン蛋白質が、ＰＬＢの突然変異体、センスＰＬＢ、アンチセンスＰＬＢ、トランケートされたＰＬＢ、天然ＰＬＢ、及びＰＬＢに対する抗体から成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. ＰＬＢの突然変異体がＰＬＢの点突然変異体を含む、請求項１５に記載の方法。
17. ＰＬＢに対する抗体がコントラクチリンを含む、請求項１５に記載の心不全の治療のための方法。

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