JP2008003089A - 赤血球用懸濁媒体 - Google Patents

Abstract

【課題】赤血球を必要とする分析技法において、長期間、たとえば８週間にわたって赤血球試薬の完全性及び機能を維持することを可能にする赤血球用懸濁媒体を提供する。
【解決手段】赤血球用懸濁媒体は、任意のグループのアミノ酸の組み合わせ、並びにリン酸緩衝液、塩化ナトリウム、グルコース、アデニン、保存剤、ＥＤＴＡ及びグリシン、そしてさらにイノシン、シトレート、クエン酸及び重炭酸塩を含有し、アミノ酸の濃度はイオン強度を減少させるために必要なものより高い、ことを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、病院及び輸血センターで行われる、赤血球を必要とする主要な免疫血液学的凝集反応試験を行うための、赤血球用の新規の懸濁媒体に関する。血清型の判定、不規則抗体の検出及び同定、陽性対照及び陰性対照の作製、並びに特異な結果を検討するために試料を保存するには、それらの機能を維持する水性媒体中に再懸濁された赤血球を必要とする。

輸血による臨床の進歩は、免疫血液学の発展をもたらした。これがなくては、事故の被害者に対して、外科手術において、又は白血病、癌及びその他の疾患の処置において現在実行される多数の輸血は不可能であったであろう。スペインでは、２００４年に合計１６０万件の献血が行われ（非特許文献１）、米国では、１年に約１５００万バッグの血液が献血されると推定されており（非特許文献２）、そして世界保健機関は１７８か国のデータに基づいて、年間合計約８１００万の血液ユニットが献血されていると推定している（非特許文献３）。この献血数は、事前の免疫血液学的判定がなければ役に立たないであろう。判定される主要な血液型は、ＡＢＯシステム及びＲＨシステム、並びにこの第２のシステムに属する抗原Ｄ（ＲＨ１）である。

緊急の状態では、すべての人はＯ型の赤血球を輸血されてもよく、そしてＡＢの人はＡＢＯ型いずれの赤血球を輸血されてもよい。したがって、Ｏ型の人は共通のドナーとして既知であり、そしてＡＢの人は共通のレシピエントとして既知である。特定の血液型の人に由来する赤血球の他の人による受容は、レシピエントの血漿中に存在する抗体に対して条件が付けられる。したがって、Ｏ型の人は抗原Ａ及びＢに抗する抗体を有し、Ａ型の人はＢに抗する抗体を有し、Ｂ型の人に対しては逆であり、そしてＡＢ型の人は抗体を持たない。結果として、すべての血液型に与えることができるものはＡＢの人の赤血球ではなく、血漿である。

次に免疫学的分析のベースとなるのは、ＡＢＯ型及びＲＨ型の判定である。ＡＢＯシステムは抗原及び抗体（規則抗体として既知）によって決定され、ＲＨシステム及び他のシステムは、妊娠の結果及び輸血の結果としての抗体（不規則抗体として既知）だけを有する。しかし、人口に占める頻度は低いにもかかわらず、不規則抗体の判定はこの上なく重要であり、リスクを避け且つ極めて安全な輸血を行うために、すべての病院及び輸血センターで実施されている。新生児に起こる恐れがある溶血性疾患の診断と、母親がＲｈ-（抗原Ｄを欠如）で子がＲｈ+（抗原Ｄを示す）の際に母親に行うことになる予防との両方のために、新生児の判定も実施されている。

免疫血液学では、赤血球の型判別、適合性試験並びに規則抗体及び不規則抗体の検出のための新規な技術の導入が、この分野における最も大きな進歩をもたらしてきた。改良は特有の凝集反応に好都合な要素（たとえば、クームス溶液（Coombs solution）、ＬＩＳＳ溶液（低イオン強度溶液）、アルブミンを含む溶液、タンパク質分解酵素を含む溶液又は抗原−抗体結合の他の強化因子）に関連し、反応性の高い抗体（たとえば、モノクローナル抗体）の改良、さらに新規の、又は実質的に異なる手順（たとえば、マイクロシート及びゲル技法）が凝集反応を示すのに利用可能になってきている。ゲル又はカード技法としても既知の、カラム中のマイクロチューブ技法の出現は、免疫血液学の現代化のベースとなっている。１９８６年におけるカラム中のマイクロチューブ技法の出現（非特許文献４）以来、その技法はめざましい成長をし続けている。この方法は自動化が容易なため、その他の技法に取って代わり、表現型判定のために存続する唯一の方法であると予想されている。広く一般に行われている遺伝子型判定技法と一緒に、それらは免疫学的分析のベースを形成することになる。現在、遺伝子型判定のための方法の大部分は予備的段階にあり、いずれにせよ研究室での研究に限定されている。

ゲル技法は、ゲル（特許文献１、特許文献２）、ガラス又はその他の球状物質（特許文献３、特許文献４、特許文献５）から成る小球によって形成された濾過マトリックス中で遠心分離することにより、凝集した細胞と凝集しなかったものとを分離する。ゲルカラムの上方に位置する反応チャンバーであるマイクロチューブの上部に試料を懸濁させる。ゲル又は濾過マトリックスを含有するカラム中には、クームス溶液として既知の緩衝溶液が存在し、かかる溶液は分析に応じて、特有の抗体（たとえば、抗−Ａ、抗−Ｂ又は抗−Ｄ）又はヒト抗グロブリン（ヒト抗−ＩｇＧ又は抗−ＩｇＭ抗体）を含有していてもよい。濾過マトリックスは緩衝水溶液中で沈殿する球状の粒子から成る。免疫血液学的凝集反応を表示するために、遠心分離を行い、細胞（赤血球）を濾過マトリックスに強制的に通過させる。粒子間に残っている空間は十分大きく、凝集しなかった細胞、すなわち、個々の細胞が通過することを可能にする。凝集反応が起こっている間、凝集した細胞は球間に保持される。厳密には定性的技法であるが、濾過マトリックスの通過は、異なる程度の凝集反応の識別を可能にする。ゲルの上部にある陽性試料では、非常に強い凝集物が保持されるが、弱い凝集物は或る程度の距離のマトリックスを通過して、たとえば、中間に留まっていることもある。凝集反応が起こらないことは、すべての細胞がマイクロチューブの底部に到達することを意味する（陰性反応）。従来の免疫血液学において見いだされるように、赤血球の強い赤色のために、この技法は抗原（赤血球）−抗体結合のいずれのマーカー又は増幅手段も必要としない。

ゲル技法は陽性の結果と陰性の結果、すなわち、ゲルの上部における陽性（高強度の凝集物）、カラムに沿ったもの（中間又は弱い凝集物）、そしてカラムの底部における陰性の結果（非凝集赤血球）を物理的に分離することを可能にする。

血漿又は血清中の規則抗体及び不規則抗体を検出するための免疫血液学的試験では、赤血球試薬が使用される。赤血球は、或る期間、慣例では１〜４週間、それらの機能及び完全性を維持するために溶液中で調製される。血液銀行研究所又は輸血に関与する研究所では、特有の抗原を持つ赤血球が選択され、その結果それらはそれぞれの免疫血液学的試験において、赤血球試薬としての役割を果たすことができる。スクリーニング細胞、抗体の検出を可能にする具体的な抗原特異性を有する２、３又は４の赤血球の集合、又はパネル、検出される抗体の特異性の同定を可能にする１１以上の赤血球の集合を調製するために必要な組み合わせは作製が容易ではなく、そしてそれらはさらに中規模のセンターでは実施が困難であることがある。赤血球の懸濁溶液又は赤血球の希釈液を利用できるようにすることが不可欠な要求であるのと同じように、頻繁にこれらの赤血球試薬を調製することの必要性に加え、上記のスクリーニング細胞又はパネルを得ることの難しさは当業者にはよく知られていることである。さらに、特有の血液型の反応性を強化するために、スクリーニング細胞又はパネルは酵素処理（たとえば、パパイン処理）によっても調製される。この処理により強化される血液型は当業者には既知である。

オリジナルのアルセバー溶液の変形である希釈溶液が現在使用されている。これらの溶液は一般に抗凝固剤（たとえばシトレート）、リン酸緩衝液、エネルギー源（たとえば、グルコース）、プリン及びヌクレオシド（たとえば、アデニン及びイノシン）、塩化ナトリウム、及び保存剤（抗生物質）を含有する。しかし、これらの慣用の溶液を用いて調製された赤血球試薬は、ゲル技術において課題を提示する可能性がある。非凝集赤血球の一部はカラムに沿って保持されることが多いため、ゲル技術を可能にしている物理的分離が影響を受ける可能性がある。この非特異的保持と中程度又は弱い凝集物は区別がつかないため、偽陽性の結果を生じる。

赤血球試薬の懸濁溶液は、凝集しなかった場合には、機能的特徴及びゲルカラムの底部までカラムを通過するそれらの能力を維持できるようにしなくてはならない。先に述べた免疫血液学研究室における赤血球調製の困難さのために、これらの特徴は可能な最大期間、維持されなければならない。この期間にわたって一定に維持されなければならないパラメータは、とりわけ、ｐＨ、浸透圧及びイオン強度である。同様に、赤血球がそれらの生存能力を維持するように、グルコース及びアデニンを供給することは必須である。これらの物質の集合及び濃度は、グリシンの添加によって減少するイオン強度の増加をもたらす。赤血球は遺伝子核及びいずれの生合成の能力も失っているため、このアミノ酸の添加は決してタンパク質生合成に関係しない。
欧州特許第１９４２１２号 欧州特許第３０５３３７号 欧州特許第４８５２２８号 欧州特許第７２５２７６号 欧州特許第７５５７１９号 Federacion Espanola de donantes de sangre (Spanish Blood Donor Federation). www.donantesdesangre.net. July 2005 Facts about blood. American Association of Blood Banks (2004) Global Database on Blood Safety : Report 2001-2002. Blood Transfusion Safety, Essential Health Technologies, World Health Organization. Geneva, Switzerland The gel test: A new way to detect cell antigen-antibody reactions. Y. Lapierre et al. Transfusion 33: 639-643 (1990) The preservation of red cell antigens at low ionic strength. J.C.Allan et al. Transfusion 30:423-426 (1990)

赤血球試薬において観察される特異性の損失を減少させるために本発明者らによって実施された研究では、驚くべくことに、グリシンのほかに、イオン強度を低下させるために必要な濃度より高い濃度におけるアミノ酸の組み合わせのこれらの赤血球試薬希釈溶液への添加が、赤血球試薬において観察される特異性の損失の減少を可能にする、すなわち、ゲルカラムに沿った非凝集赤血球の非特異的保持を著しく減少させることが見いだされた。

この理由から、本特許出願において、長期間、たとえば８週間にわたって赤血球試薬の完全性及び機能を維持することを可能にする、赤血球試薬の希釈溶液組成物に関して説明する。この期間中、赤血球は、変形能、完全性及び抗原性という特徴を維持しながら、ゲル又は任意の他の狭い空間を通過する能力及び非特異的に凝集しない能力を保持するため、それらは血清型判定、規則抗体を検出する試験、並びに不規則抗体の検査及び同定において、免疫血液学的試薬として使用することができる。

赤血球の希釈溶液又は懸濁媒体中における本発明のアミノ酸の組み合わせを混和することは、完全な状態において、ゲル技術におけるそれらの使用を可能にする機能性の特徴を有する赤血球を維持する。赤血球によるゲルマトリックスの通過は、新鮮な赤血球（懸濁のための初期調製時）と８週間保持された赤血球との間の保持における差を全く示さない。すなわち、希釈溶液中に混和されたアミノ酸は、赤血球において、新鮮な赤血球の初期の物理的特徴を維持することを可能にする。赤血球調製に時間がかかるほど、偽陽性の結果が出現する可能性がより高くなる。赤血球試薬は生細胞であるため、比較的短い時間で分解することが当業者によく知られている。

ゲル技法は異なるサイズの凝集物間の目に見える定量化を可能にする。凝集反応の結果は、慣例的に表１のスコアに類似したスコア等級によって示される。先に記載したように、非凝集赤血球、カラムの底部で見いだされるべきである赤血球は、＋／-及び１＋に類似した結果を示す可能性があり、それは不正確な診断、不正確な陽性判定を与えることになる。

当業者に既知の通例の成分を含有する液体へ、本発明のアミノ酸の組み合わせを添加することは、赤血球試薬の非特異的な保持を著しく減少させる。これらの成分はリン酸緩衝液、塩化ナトリウム、グルコース、アデニン、保存剤（たとえばクロラムフェニコール及びネオマイシン）、ＥＤＴＡ及びグリシンである。

本発明のアミノ酸の組み合わせを形成するアミノ酸それぞれの濃度は、水性溶液におけるそれらの溶解度に従って変更してもよく、概して、赤血球希釈溶液の総容量オスモル濃度は１００〜７００ミリオスモル／ｋｇの範囲にある。

ここで、本発明の赤血球用懸濁溶液中のアミノ酸の組み合わせの例を説明する。たとえば、アミノ酸を含まないベース液体（液体番号１）にアミノ酸が添加された場合（液体番号２）、５０人の１０週間にわたる判定で得られた偽陽性の総数は、不規則抗体のためのクームス技法による２細胞のスクリーニングにおいて１３からゼロに減少する。赤血球試薬製造からの１０週間というのは、赤血球試薬の保存のための通常の限界を超える期間であることに言及すべきである。液体間の違いを定量化するための別の方法は、すべての人の判定から得られた平均スコアを比較することである。液体番号１及び液体番号２に対して１０週間にわたって評価された１０本のバイアルの５０の判定で得られた平均スコアは、それぞれ２．４４及び１．５２である。パパイン処理した赤血球による２細胞のスクリーニング技法の場合、偽陽性の数は、アミノ酸を含まない液体（液体番号１）とアミノ酸を含む液体（液体番号２）間で、４０から７に減少する。７つの偽陽性は１０週間で得られるが、液体番号１の偽陽性は懸濁液の調製からさらに短い期間で得られる。パパイン処理した赤血球に対するこの２細胞のスクリーニング技法における平均スコアの比較は、液体間の違いも明確に示し、液体番号１と液体番号２の５０の判定の平均スコア値はそれぞれ５．９２と１．８４である。

ベース液体（たとえば、液体番号１）に、アミノ酸の他に、記載されまた赤血球溶液中に広く使用される他の成分、たとえばイノシン、シトレート、クエン酸及び重炭酸塩を混合する（たとえば液体番号３）と、アミノ酸の効果はいっそう大きくなり得る。不規則抗体のためのクームス技法による２細胞のスクリーニングの場合、１０週間にわたった５０の判定において偽陽性は全く得られず、平均スコアは０．９６である。２つのパパイン処理細胞のスクリーニングでも偽陽性は得られず、平均スコアは０．８０である。

血液型の特異抗原（Ｍ、Ｐ１、Ｆｙ^ａ、Ｆｙ^ｂ、Ｓ及びｓ）は、低イオン強度の溶液に赤血球を再懸濁した場合、それらの抗原性を失うか、又は減少させる可能性があることが述べられている（非特許文献５）。アミノ酸の添加は、１０週間後まで、すなわち、製品の有効寿命中、懸濁液標本から観察される上記抗原の発現、同じ反応性、抗原性を変化させない。

アミノ酸を混和した液体中で観察される溶血は、アミノ酸を含まないか、又はグリシンだけを含む液体で得られたものより少ない。このことはこれらの物質の添加が、細胞の浸透圧抵抗に対して負の効果を与えないことを意味する。

血清型判定、すなわち、規則抗体検出のための赤血球試薬の場合、アミノ酸を混和した赤血球の懸濁液は適切な機能を示す。

１０週間にわたる４種の血清型細胞（Ａ_１、Ａ_２、Ｂ及びＯ）を使用した２４０の判定における、アミノ酸を含まないベース液体、液体番号１による血清型技法では１８７件の偽陽性が得られたが、アミノ酸が添加された液体番号２及び液体番号３では偽陽性の総数はゼロに減少する。液体番号１の偽陽性は赤血球懸濁液の調製後２〜４週間目から得られるが、アミノ酸を混和した液体に関してはそれらの製造から１０週間たっても依然として偽陽性は観察されない。４種の血清型細胞を使用し、それぞれの細胞に１０バイアルを用いた２４０の判定の平均スコアは、液体番号１、液体番号２及び液体番号３に対して１０週間にわたり評価され、それぞれ４．０６、１．３７及び０．９４である。

バリン、ロイシン、イソロイシン及びメチオニン（はじめの３種は非極性脂肪族アミノ酸、最後のものは含硫アミノ酸に属する）以外のアミノ酸の添加も、非特異的保持を減少させる効果を有する。たとえば、非極性脂肪族アミノ酸、芳香族アミノ酸、親水性アミノ酸及び正、負又は中性電荷を有する極性アミノ酸を含有する液体番号４に関しては、ゲルカラムにおける赤血球の非特異的保持の減少が同様に得られる。

実施された試験によって示されるように、本発明によって、分析のための赤血球懸濁液の保存における有効寿命を４週間という通例期間から最低８週間まで、著しく増加させることが可能になった。

本発明は好ましい例示的な実施形態に関して記載されてきたが、これらは本発明を限定するものとして見なすべきではなく、それらは特許請求の範囲の最も広範な解釈により規定されることになる。

Claims (17)

1. 任意のグループのアミノ酸の組み合わせを含有することを特徴とする、赤血球を必要とする分析技法において使用される赤血球試薬用懸濁媒体。
2. リン酸緩衝液、塩化ナトリウム、グルコース、アデニン、保存剤、ＥＤＴＡ及びグリシンを含有する、請求項１に記載の懸濁媒体。
3. さらにイノシン、シトレート、クエン酸及び重炭酸塩を含有する、請求項１又は２に記載の懸濁媒体。
4. 前記アミノ酸の濃度がイオン強度を減少させるために必要な濃度より高い、請求項１に記載の懸濁媒体。
5. 脂肪族アミノ酸の組み合わせを含有する、請求項１に記載の懸濁媒体。
6. 前記脂肪族アミノ酸の組み合わせが、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン及びＬ−イソロイシンの組み合わせを含有する、請求項５に記載の懸濁媒体。
7. 脂肪族アミノ酸、芳香族アミノ酸及びイオウを含むアミノ酸の組み合わせを含有する、請求項１に記載の懸濁媒体。
8. 脂肪族アミノ酸の組み合わせ、並びに、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン及びＬ−システインの組み合わせである前記アミノ酸の組み合わせを含有する、請求項７に記載の懸濁媒体。
9. 前記アミノ酸の組み合わせが、Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンの組み合わせを含有する、請求項１に記載の懸濁媒体。
10. 疎水性アミノ酸及び親水性アミノ酸の組み合わせを含有する、請求項１に記載の懸濁媒体。
11. 脂肪族アミノ酸の組み合わせ、並びに無電荷、正電荷、及び負電荷極性アミノ酸の組み合わせを含有する、請求項１に記載の懸濁媒体。
12. 脂肪族アミノ酸の組み合わせ、及びＬ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸及びＬ−グルタミン酸の組み合わせである前記アミノ酸の組み合わせを含有する、請求項１１に記載の懸濁媒体。
13. 脂肪族アミノ酸の組み合わせ、並びに極性、中性又は（正及び／又は負）電荷、及び芳香族アミノ酸の組み合わせを含有する、請求項１に記載の懸濁媒体。
14. 非極性アミノ酸及び極性アミノ酸の組み合わせを含有する、請求項１に記載の懸濁媒体。
15. カラム中のゲル又はマイクロチューブでの免疫血液学的分析技法における、請求項１〜１４に記載の懸濁媒体の使用。
16. 赤血球試薬を必要とする免疫血液学的技法における、請求項１〜１４に記載の懸濁媒体の使用。
17. 赤血球を必要とする分析技法における、請求項１〜１４に記載の懸濁媒体の使用。