JP2007538261A - 選択されたイオンクロマトグラムを使用して先駆物質および断片イオンをグループ化するシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

サンプルが、液体クロマトグラフ１０４において処理され、質量分析計１１２において分析され、結果として得られるスペクトルデータが計算手段１２６によって処理される液体クロマトグラフィおよび質量分析計のシステムおよび方法。
【その他】 本願に係る特許出願人の国際段階での記載名称は「ウオーターズ・インベストメント・リミテツド」ですが、識別番号５０４４３８２５５を付与された国内書面に記載の名称が適正な名称表記であります。

Description

本出願は、参照によって本明細書に完全に組み込まれている米国仮出願６０／５７２５０３、２００４年５月２０日出願の利益を主張する。

本出願は、弁理士整理番号ＷＡＡ−３９４、名称「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ」（「ＷＡＡ−３９４出願」）を有する同時出願および同時係属のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／ に関する。

本発明は、一般的には、プロテオミクス、ならびに簡単な混合物および複雑な混合物におけるペプチドおよびタンパク質の分析に関する。より具体的には、本発明は、ペプチド先駆物質イオンおよび断片イオンを生成し、選択されたイオンクロマトグラムを使用してこれらのペプチド先駆物質イオンおよび断片イオンをグループ化するために、質量分析法と組み合わせて液体クロマトグラフィを使用することに関する。

プロテオミクスは、一般的には、タンパク質の簡単な混合物および複雑な混合物に関わる研究に関する。プロテオミクスの研究は、通常、生物学的システムにおけるタンパク質の同定または分類、または生物学的システムの異なる条件間における相対的存在度の変化の決定、あるいはその両方を対象とする。生物学的サンプルにおけるタンパク質の同定および定量化は、プロテオミクスの基本的な問題である。

タンパク質の同定および定量化は、病気を理解して病気と闘い、病気のバイオマーカを発見し、代謝経路を研究し、医薬品発見においてタンパク質標的を同定するのに必須である。タンパク質を同定および定量化するために使用されるプロテオミクス研究の不可欠な機器は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳ）と組み合わされた液体クロマトグラフィである。

従来のプロテオミクス研究では、対象のタンパク質は、通常、未処置のタンパク質を直接研究するのではなく、特定のセットのタンパク質分解ペプチドを生成するようにまず消化される。次いで、結果として得られるペプチドは、プロテオミクス分析中に特定化される。そのような消化に使用される一般的なタンパク質分解酵素は、トリプシンである。トリプシン消化では、複雑な混合物に存在するタンパク質は、トリプシンの開裂特異性によって決定されるペプチドを生成するために開裂される。トリプシン酵素は、アミノ酸のリシンおよびアルギニンのＣ末端側面に沿ってタンパク質を開裂する。

ＬＣ／ＭＳ分析では、ペプチド消化物は、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）分離、続いてオンライン質量分析（ＭＳ）によって分離され、分析される。ＬＣ分離において、ペプチドと静止相および移動相との相互作用が、そのペプチドの保持時間およびクロマトグラフィピーク形状を決定する。ＬＣによって分離される中性分子に言及するために、元の分子という用語を使用する。トリプシン消化物の場合、元の分子はペプチドである。分離された元の分子を含むＬＣの出力溶離液が、質量分析計に渡される。

質量分析計のイオン化源（ソース）が、元の分子をイオン化する。元の分子に対応するイオンは、先駆物質と呼ばれる。質量分析計に導入された後、先駆物質は、衝突により断片イオンに解離させる、または断片化することができる。質量分析計によって分析または質量測定されるのは、元の分子からの先駆物質イオンおよび断片イオンである。

混合物においてペプチドを同定する一般的な方法は、質量分析されたイオンと、知られているペプチドに対応するイオンのグループを含むデータベースとを比較するものである。比較を行うために、質量分析されたイオンは、関係付けられるイオンのグループに共にグループ化されなければならない。すなわち、断片イオンは、同じ先駆物質イオンに由来する可能性が高いグループに共にグループ化される。

従来の技術は、タンデム型質量分析計、ならびに先駆物質イオンのデータ依存選択および断片化を使用して、そのようなイオングループ分けを行う。タンデム質量分析計は、第１の質量分析計において先駆物質を選択することができ、選択された先駆物質を衝突セルにおいて衝突により断片化して、結果として得られる断片を第２の質量分析計において分析することができる。そのようなデータ依存分析（ＤＤＡ）では、グループ化は、第１の質量分析計における先駆物質イオン選択のみに基づいて行われる。しかし、複数の元の分子が、時間的に重なるクロマトグラフィピークを有することがあり、第１の質量分析計の透過ウィンドウ内にあるｍ／ｚ値を有することができる。そのような場合、第２の質量分析計において得られる断片スペクトルは、複数の先駆物質からの断片を含む。その結果、従来の技術は、実際には２つ以上の別個の元の分子に由来するイオンを意図せずにグループ化することがある。

イオンをグループ化する改良された手段が、参照によって本明細書に組み込まれているＢａｔｅｍａｎへの米国特許第６７１７１３０号（「Ｂａｔｅｍａｎ」）によって記載されている。Ｂａｔｅｍａｎでは、先駆物質および断片からのスペクトルは、ペプチド混合物の単一注入のＬＣ／ＭＳ分析の一部として適用される高エネルギーおよび低エネルギー切替えプロトコルを使用して得られる。そのようなデータでは、低エネルギースペクトルは、断片化されていない先駆物質からのイオンを主に含み、一方、高エネルギースペクトルは、断片化された先駆物質からのイオンを主に含む。したがって、このプロトコルは、低エネルギーモードおよび高エネルギーモードの２つのモードにおいてスペクトルを収集する。

各モードについてのこのプロトコルの出力は、時間の経過に伴う一連の質量スペクトルである。質量スペクトルは、１セットの選択されたイオンクロマトグラムを作成するために、時間的に組み合わせることができる。選択されたイオンクロマトグラムは、質量クロマトグラムと呼ぶこともできる。これ以後、「選択されたイオンクロマトグラム」および「質量クロマトグラム」という用語は、互換的に使用される。選択されたイオンクロマトグラムまたは質量クロマトグラムは、クロマトグラフィピークについて探索することができる。ピークは、同様のイオンを同定する。各イオンは、その頂点保持時間、質量対電荷比、および強度によって記述される。参照によって本明細書に組み込まれている同時係属ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／０４１８０、２００５年２月１１日出願、名称「Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｐｅａｋｓ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｄａｔａ ａｎｄ ｆｏｒ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｓｐｅｃｔｒａ ａｎｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ」（「４１８０出願」）は、イオンのリスト、ならびに各イオンの頂点保持時間、質量対電荷比、および強度を得るために、そのようなスペクトルに適用することができる２次元たたみ込み技術を記載している。

したがって、ＬＣ／ＭＳシステムの出力は、先駆物質および断片イオンの目録またはリストであり、各イオンは、その頂点保持時間、質量対電荷比、および強度によって記述される。低エネルギーモードは、主に断片化されていない先駆物質イオンを含む低エネルギーにおいて見られるイオンのリストを生成する。高エネルギーモードは、主に断片化された先駆物質イオンを含む高エネルギーにおいて見られるイオンのリストを生成する。

Ｂａｔｅｍａｎは、質量クロマトグラムにおいて見られるクロマトグラフィピークの保持時間のみに基づいてイオンのグループ化をどのように行うことができるかを記載している。‘４１８０出願は、イオンの保持時間のみに基づいてイオングループ化をどのように行うことができるかを記載している。

異なる保持時間を有する２つのイオンは、異なる元の分子に由来しなければならない。したがって、保持時間に基づくグループ化は、先駆物質のクロマトグラフィピーク幅内において溶離するイオンを排除することができる。グループのイオンが同じ保持時間を有さなければならないことを必要とすることによって、Ｂａｔｅｍａｎおよび‘４１８０出願の方法は、ピークがクロマトグラフィでは重なる場合でも、異なる保持時間を有するイオンを排除する。

しかし、複雑な混合物では、複数の元の分子が、本質的に同じ保持時間に依然として溶離することがそれでもなお可能である。その結果、保持時間のみに基づいてイオンをグループ化するベイトマンおよび‘４１８０出願において記述されている改良された方法でも、実際には２つ以上の別個の溶離分子に由来するイオンを意図せずにグループ化することがある。

ＬＣ／ＭＳ実験において、クロマトグラフから溶離する分子が、複数のイオンを生じることがある。クロマトグラフィで分離され、カラムから溶離するそのような分子を元の分子と呼ぶ。元の分子のクロマトグラフィプロファイルは、それが生じるすべてのイオンのクロマトグラフィプロファイルを決定する。したがって、そのような分子に由来するイオンは、すべて、同じ保持時間を有さなければならず、また同じクロマトグラフィピークの形状を有さなければならない。

元の分子は、例えば、エレクトロスプレー源においてイオン化することができ、イオン化されるとき、そのような分子は、質量分析計によって検出することができる。元の分子に対応するイオンは、一般に、先駆物質イオンと呼ばれる。先駆物質の例は、タンパク質またはペプチドなどの大きな分子、あるいは代謝の産物などの小さい分子とすることができる。

先駆物質イオンは、かなり多数の機構によって断片化することができる。そのような断片化は、ソースにおいて行うことができ、または衝突セルにおいて誘起することができる。そのような分子断片は、質量分析計によって測定することができる。断片は、断片化することができ、原理的にはイオン化分子のＮ世代を生じ、そのすべては、質量分析計によって検出することができる。先駆物質、または断片のいずれかは、１つまたは複数の電荷状態において出現することがあり、各電荷状態の分子が、１つまたは複数の同位体質量において出現することがある。したがって、元の分子は、それぞれ質量分析計によってすべて検出することができる１つまたは多くのイオンを生じることがある。

これらのイオンのそれぞれによって呈示されるクロマトグラフィ保持時間、およびこれらのイオンのそれぞれによって呈示されるクロマトグラフィピークプロファイルは、元の分子の保持時間およびピーク形状の両方を正確に反映しなければならない（これ以後、保持時間は、クロマトグラフィ保持時間であると理解され、ピーク形状は、クロマトグラフィピーク形状であると理解されたい）。イオンについて測定された保持時間およびピーク形状は、元の分子の保持時間およびピーク形状から偏向することがあるが、これらの偏向は、削減不可能な測定誤差、または無関係なイオンによる干渉のみの結果でなければならない。あらゆるそのような相違は、イオンとその元の分子との保持時間またはピーク形状の本質的な相違から生じるとすることはできない。したがって、先駆物質とその断片イオンの保持時間およびピーク形状は、互いに本質的に同一であり、元の分子の保持時間およびピーク形状と本質的に同一である。

本発明の実施形態は、共通の元の分子に由来する先駆物質および断片のクロマトグラフィ保持時間およびクロマトグラフィピーク形状におけるこの対応を使用する。この対応を使用して、本発明の実施形態は、保持時間およびピーク形状について関係付けられる、ＬＣ／ＭＳ実験において検出されたイオンをグループ化する。

動作時、イオンのリスト、ならびにイオンの特性（保持時間、質量、および強度）、およびそのクロマトグラフィプロファイルが与えられると、本発明の実施形態は、共通の保持時間およびピーク形状を共有するイオンのグループを見つける。イオンは、保持時間およびピーク形状の両方によってグループ化される。イオンは、その保持時間またはピーク形状がそのグループのイオンの保持時間またはピーク形状に対応しない場合、特定のグループ化から排除される。具体的には、イオンがそのグループのイオンと同じ保持時間を共有する場合でも、ピーク形状の相違は、特定のグループ化からイオンを排除する。

適切なイオングループ化を決定するとき、保持時間に加えて、ピーク形状を使用することが重要であるが、その理由は、２つの異なる元の分子が、同じ保持時間で溶離することがあるからである。保持時間のみに基づいてイオンをグループ化する方法は、これらの分子を共にグループ化する。ピーク形状が異なる場合、ピーク形状を考慮に入れて、本発明の実施形態は、共通の保持時間にもかかわらず、２つの分子が単一の溶離分子に由来せず、２つ以上の別個の溶離分子に由来すると判定することができる。

本発明の実施形態によれば、ピーク形状は、２つのイオンが同じまたは異なるピーク形状を有するかを判定するために、パターン整合アルゴリズムによって比較される。同じまたは一貫した保持時間を有するが、一貫しないピーク形状を有するイオンは、異なる溶離分子に由来すると見なされ、グループ化されない。一貫した保持時間および一貫したピーク形状を有するイオンは、同じ溶離分子に由来するとすることができ、グループ化することができる。本発明の実施形態は、共通の元の分子に由来するとすることができないイオンを排除するために、保持時間と関連してピーク形状を使用する。

本発明の実施形態は、ＬＣ／ＭＳシステムでサンプルを分析し、そのサンプルにおいて検出されたイオンのリストを得る。イオンは、その保持時間、質量対電荷比、および強度によって記述される。ＬＣ／ＭＳ分析において、分子は、元の分子の断片である分子となるように、断片化を受けることができる。そのような断片化は、ソースにおいて行うことができ、または、衝突セルにおいて意図的に誘起することができる。元に関係なく、そのような断片イオンは、保持時間およびピーク形状の両方について、互いに同一であり、かつ元の分子と同一であるクロマトグラフィピークをももたらさなければならない。

別個の分子断片を生成することに加えて、ペプチドなどの分子は、元の分子および各そのような断片から複数のイオンを生成することができる。同じ分子に共通であるこれらのイオンは、同位体の質量および電荷状態について異なる可能性がある。再び、そのようなイオンは、保持時間およびピーク形状の両方について、互いに同一であり、かつ元の分子と同一であるクロマトグラフィピークを生成しなければならない。

ＬＣ／ＭＳによってサンプルを分析した後、本発明の実施形態は、様々な可能な規則の１つによって基準イオンをまず選択することによって、イオンのクラスタを同定する。規則は、一般に、元の分子に対応する先駆物質イオンである可能性が高い基準イオンを拾い出すように最適化される。

イオンのグループを基準イオンでクラスタ化するために、方法は、次いで、保持時間が基準と本質的に同じであるイオンを選択する。保持時間に基づいてイオンをクラスタ化した後、本発明の実施形態は、グループのイオンのピーク形状を基準と比較する。ピーク形状が基準のピーク形状と測定できるほどに異なるイオンは、排除される。このピーク形状の比較は、最小２乗適合法、神経回路網、または他のパターン整合アルゴリズムなどを含めて、様々なアルゴリズムの１つによって実施することができる。形状が基準と整合しないイオンが排除された後、保持時間およびピーク形状について整合する残りのイオンは、そのようなグループ化のデータベースにおいて記憶することができる。次いで、他のグループ化が存在するかを調べるために、イオンのリストを調べることができる。

基準イオンを拾い出した後、グループのイオンをさらに制約するために、追加の要件を適用することができる。例えば、イオンは、質量または強度に基づいて拒否されることが可能である。例えば、質量または強度が基準の質量または強度より大きいイオンを排除することができる。

イオンのグループ化は、基準イオンをまず同定せずに、形成することができる。例えば、比較的広い保持時間ウィンドウ内のすべてのピーク形状を分析することができる。さらに、グループ内において同じ保持時間およびピーク形状を有するグループにイオンを最適に分離するグループ化を見つけるために、ピーク形状比較のみを使用するパターン整合アルゴリズムを使用することができる。

図１は、本発明の実施形態による質量クロマトグラムを得るためのＬＣ／ＭＳシステムの概略図である。ＬＣ／ＭＳ実験は、応答または強度を時間および質量の関数として提供する。サンプル１０２が、注入装置１０６を経て液体クロマトグラフ１０４に注入される。ポンプ１０８が、カラム１１０を経て保持時間に従って混合物を成分部分に分離するために、カラムを経てサンプルをポンピングする。

カラムからの出力は、分析のために質量分析計１１２に入力される。質量分析計１１２などの質量分析計が、時間および質量対電荷比の関数として、応答または強度を測定する。まず、サンプルは、脱溶媒和／イオン化デバイス１１４によって脱溶媒和およびイオン化される。例えばヒータ、気体、および気体と組み合わされたヒータ、または他の脱溶媒和技術を含めて、任意の脱溶媒和技術を使用することができる。イオン化は、例えばエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、または他のイオン化技術を含めて、任意のイオン化技術によることができる。イオン化から得られるイオンは、イオンガイド１１６によって衝突セル１１８に供給される。衝突セル１１８は、イオンを断片化するために使用することができる。例えば、Ｂａｔｅｍａｎに記載されているように、断片化を行うために、交流電圧を衝突セル１１８に印加することができる。スペクトルが、先駆物質（衝突なし）および断片（衝突の結果）について収集される。

衝突セル１１８からの出力は、質量分析装置１２０に入力される。質量分析装置１２０は、４極子、飛行時間（ＴＯＦ）、イオントラップ、磁気セクタ質量分析装置、ならびにその組合せを含めて、任意の質量分析装置とすることができる。検出器１２２が、質量分析装置１２２から放出されたイオンを検出する。検出器１２２は、質量分析装置１２０と一体式とすることができる。例えば、ＴＯＦ質量分析装置の場合、検出器１２２は、イオンの強度を計数する、すなわち検出器に当たって形成されるイオンの数を計数するマイクロチャネルプレート検出器とすることができる。記憶媒体１２４が、分析のためにイオン計数を記憶するための永続的な記憶装置を提供する。例えば、記憶媒体１２４は、内部または外部のコンピュータディスクとすることができる。分析コンピュータ１２６が、記憶データを分析する。データは、記憶媒体１２４に記憶することを必要とせずに、実時間で分析することもできる。その場合、検出器１２２は、データを永続的記憶装置にまず記憶せずに、分析されるデータをコンピュータ１２６に直接渡す。

衝突セル１１８は、先駆物質イオンの断片化を実施する。断片化は、ペプチドの１次配列を決定し、続いて元のタンパク質の同定を得るために使用することができる。

衝突セル１１８は、窒素などの気体を含む。帯電ペプチドが気体原子と相互作用するとき、結果として生じる衝突は、１つまたは複数の特徴的な結合においてペプチドを分断することによって、ペプチドを断片化することができる。最も一般的な結果として得られる断片は、ＹイオンまたはＢイオンと記述される。そのような断片化は、ペプチド先駆物質のＭＳスペクトルを得る低電圧状態（低エネルギー）と、先駆物質の衝突誘起断片のＭＳスペクトルを得る高電圧状態（高エネルギー）との間で衝突セルの電圧を切替えることによって、オンライン断片化として達成することができる。高電圧および低電圧は、高エネルギーおよび低エネルギーと呼ばれるが、その理由は、電圧は、運動エネルギーをイオンに付与するために使用されるからである。

ＬＣ／ＭＳ実験は、その出力の１つとして質量クロマトグラムを生成することができる。質量クロマトグラムは、特定の質量値において時間の関数として報告される応答（強度）のセットまたはグループである。質量クロマトグラムでは、質量値は、ある範囲内の中央値とすることが可能である。すなわち、所与の時間における強度は、特定の範囲の質量値にわたって収集された強度を組み合わせることによって得ることが可能である。通常、質量クロマトグラムは、１つまたは複数のクロマトグラフィピークを含む。

単一の分子または化学実体は、特定の質量を有する。ＬＣ／ＭＳ実験では、その分子のイオン化形態は、電荷で除算されたそのイオンの質量値（質量対電荷比）においてクロマトグラフィピークとして観測される。クロマトグラフィピークは、ピークプロファイルまたは溶離プロファイルを有する。クロマトグラフィピークプロファイルは、頂点保持時間、ピーク幅、リフトオフ時間、およびタッチダウン時間を含めて、いくつかの特徴を使用して特定化することができる。クロマトグラフィピーク幅は、特定のピーク高さにおける幅（ＦＷＨＭ、５０％高さにおける幅）、または変曲点間の幅、あるいは標準偏差として記述することができる。頂点強度またはクロマトグラフィピーク高さは、クロマトグラフィピークプロファイルにおいて見られる最大強度である。一般的に、頂点強度は、補正されたベースラインである。

クロマトグラフィ分離によって分離され、カラムから溶離する溶離液の分子は、共通溶離分子または元の分子と呼ばれる。元の分子は、質量分析計のイオン化源を経てイオン化される。結果として生じるイオンは、ＬＣ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳ^Ｅにおいて測定される。同位体組成およびまたは断片化プロセスの結果として、各元の分子は、それぞれが質量および電荷の固有値を有するイオンの複数のカテゴリを生じることがある。元の分子に対応するイオンは、先駆物質イオン、または単に先駆物質と呼ばれる。ペプチド消化物では、元の分子はペプチドであり、ペプチドに対応するイオンは、先駆物質と呼ばれる。元の分子に由来するあらゆるイオンは、プロセッサまたは断片に関係なく、先駆物質と同じ保持時間およびクロマトグラフィピークプロファイルを有さなければならない。

ＬＣ／ＭＳ実験では、イオンは、その保持時間、質量対電荷比、および強度によって記述および／または言及することができる。単一分子が、イオンのクラスタとしてＬＣ／ＭＳクロマトグラムにおいて出現することがある。ペプチドは、１つまたは複数のイオンクラスタを生じる。各クラスタは、異なる電荷状態に対応する（例えば、Ｚ＝１またはＺ＝２）。クラスタの各イオンは、ペプチドの異なる同位体組成に対応する。共通のペプチドからのイオンのクラスタでは、単一同位体は、最低質量を有するイオンであり、すべての同位体は、最も豊富な低質量状態にある。クラスタのイオンは共通の元の分子に由来するので、共通の保持時間およびピークプロファイルを共有しなければならない。

元の分子は、同位体および電荷の影響により、複数のイオンを生じることがある。イオンの追加の重要なソースは、元の分子の断片である。これらの断片は、元の分子を分断するプロセスから生じる。これらのプロセスは、イオン化源または衝突セルにおいて行うことができる。断片イオンは共通の溶離する元の分子に由来するので、元の分子と同じクロマトグラフィ保持時間およびピークプロファイルを有さなければならない。

一般的には、元の分子がＮのイオンを生じ、これらが、質量分析計によって適切に解明される場合、Ｎの質量クロマトグラムが存在することができ、各質量クロマトグラムは、元の分子に由来するイオンのクロマトグラフィプロファイルであるピークを有する。これらのＮのイオンのそれぞれの保持時間およびピークプロファイルは同一である。共通保持時間実体という用語は、ＬＣ／ＭＳ分離において、すべてが同じ保持時間およびピーク形状を有するクロマトグラフィピークを生じる元の分子のすべてのイオンを指す。

共通の元の分子に由来するイオンの保持時間およびピーク形状は同じであるが、その理由は、イオン形成、断片化、およびイオン検出の時間は、一般に、元の分子のピーク幅よりはるかに短いからである。例えば、半値全幅（ＦＷＨＭ）において測定された通常のクロマトグラフィピーク幅は、５から３０秒である。イオン形成、断片化、およびイオン検出の時間は、通常、サブミリ秒である。したがって、クロマトグラフィの時間スケールでは、イオン形成の時間は、瞬間的なプロセスである。それにより、元の分子から導出されたイオンについて観測された保持時間の差は、実質的にはゼロになる。すなわち、元の分子に由来するイオン間のサブミリ秒の保持時間の差は、クロマトグラフィのピーク幅に比較して小さい。

元の分子に関連付けられるイオンは、いくつかのカテゴリの１つに属する。元の分子から導出されたイオンは、先駆物質、先駆物質の断片、または断片の断片、あるいは上記の質量のいずれかのニュートラルロスとすることができる。これらの質量のいずれかは、１つまたは複数の離散同位体状態において、および１つまたは複数の電荷状態において見ることができる。

ペプチドの場合、所与のペプチドは、一般に、それぞれが別個の同位体状態にあり、それぞれが１つまたは複数の電荷状態にあるイオンのクラスタであると見なされる。理想的には、イオン化源は、中性の元の分子のプロトネート形態である先駆物質を生成する。１つまたは複数の陽子を中性分子に添付することができ、したがって、先駆物質は、電荷Ｚ＝＋１または＋２などを有する中性より高い１つまたは複数の質量単位とすることができる。実際、この先駆物質（ｍｗＨＰｌｕｓと呼ばれる）には、水、アンモニア、またはリン酸塩など、中性分子の損失から得られるより低い質量の実体が付随することが可能である。断片化は、ソースにおいて行うことができ、通常、ＹイオンまたはＢイオンをもたらす。断片化は、衝突セルにおいて気体分子との下流相互作用によって意図的に誘起することもできる。

本発明の実施形態は、特徴的なクロマトグラフィピークプロファイルに基づいて、共溶離するイオンの異質混合物から、関係付けられたイオンのグループをクラスタ化する。例えば、通常のＬＣ／ＭＳ実験において（低エネルギーモードにおいて実施される）、本発明の実施形態は、高い質量精度または分解能を有してまたは有さずに、異なる電荷状態のイオンを同じ親先駆物質成分に整合させる。さらに、先駆物質の分子が単一エネルギー（例えば、低エネルギー）において解離するように十分に不安定である場合、本発明の実施形態は、すべての関係付けられたイオン（先駆物質またはソース内断片であるかに関係なく）のすべての観測された電荷状態を元の親の先駆物質成分にクラスタ化することができる。

未処置の先駆物質イオン衝突誘起解離から生成されるイオンに関して、本発明の実施形態は、適切な断片イオンを親先駆物質構成要素にクラスタ化することができる。このクラスタ化は、高低データ獲得モードにおいて質量分析計を使用するその後の断片化のために機器が単一の先駆物質を事前に選択することを必要とせずに達成される。より具体的には、本発明の実施形態は、複数の先駆物質が本質的に同じ保持時間において同時に断片化されているとき、関連するイオンを適切なグループにクラスタ化することができる。したがって、本発明の実施形態は、２つ以上の先駆物質の断片化が時間的に同じ瞬間に行われているとき、断片イオンをそれぞれの先駆物質に割り当てることができる。本発明の実施形態の能力は、すべての検出イオンを先駆物質に割り当てなければならない従来のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＤＤＡ技術に対して利点を呈示する。さらに、本発明の実施形態は、イオンを脱同位体化して、通常の一価表記（すなわち、ＭＨ＋）に電荷状態を低減するための計算負担を著しく軽減することができる。

本発明の方法は、元の分子が先駆物質イオンおよび断片イオンを生じるとすれば、ペプチド以外の混合物に適用することができる。したがって、本発明の実施形態は、プロテオミクス、メタボロミクス、およびメタボノミクスにおいて使用することができる。

カラム１１０などのクロマトグラフィ支持マトリックスから溶離する分子（ペプチド、代謝産物、天然産物）の保持時間およびクロマトグラフィピークプロファイルは、支持マトリックスと移動相との間における分子の物理的相互作用の関数である。分子が支持マトリックスと移動相との間において有する相互作用の程度は、その分子のクロマトグラフィプロファイルおよび保持時間を表す。複雑な混合物では、各分子は化学的に異なる。その結果、各分子は、クロマトグラフィマトリックスと移動相について異なる親和力を有することができる。結果として、それぞれが、固有のクロマトグラフィプロファイルを呈示することができる。

一般的に、特定の分子のクロマトグラフィプロファイルは固有であり、その分子の物理化学的特性を記述する。上述されたように、所与の分子のクロマトグラフィピークプロファイルを記述するために使用されるパラメータは、ごく少数を挙げると、初期検出時間（リフトオフ）、正規化された傾斜、ピーク頂点の時間に対する変曲点の時間、最大応答時間（ピーク頂点）、半値全幅（ＦＷＨＭ）および変曲点でのピーク幅、ピーク形状の非対称性、および最終検出時間（タッチダウン）がある。

本発明の実施形態を記述するのを補助するために、仮説ＬＣ／ＭＳ実験のデータの分析が、本発明の実施形態により実施される。仮説実験では、いくつかの化学成分は、ＬＣ／ＭＳデータ獲得中に不安定であり、かつ同時に関連イオン（断片）を生成すると想定される。他の化学構成要素は不安定ではなく、元の化学成分に特有の単一で未処置の質量のみを生成する。仮説実験では、ＬＣ／ＭＳデータ獲得は、１５のスペクトル走査を収集する。図２は、１５のスペクトル走査についての仮説ＬＣ／ＭＳ実験の結果を概述する表２００である。走査に関連付けられた時間は、列１〜１５に対応する。成分に関連付けられた質量は、行１〜１５に対応する。イオンは、検出器１２２によって検出される。各走査および各質量における検出は、ゼロより大きい応答（強度）によって表２００において示されている。

時間領域において１５のスペクトル走査において測定された強度は、同一の質量測定（５ｐｐｍなど、特定の質量の許容度内）が表２００の各行を作成するためにクラスタ化されるように、質量についてクラスタ化される。したがって、表２００の各行は、ほぼ同じ測定質量値を有するイオン検出のグループに対応する。

これらの質量測定は、特定の質量許容度内において同一とすることが可能であるが、質量は、分子の１つの物理的特性のみを記述する。例えば、表２００の第１行は、２つの化学実体に明らかに関係付けられる強度値を示す。２つの化学実体の強度は、同じ質量値を有する２つのクロマトグラフィピークとして出現する（表２００の同じ行において）。２つのクロマトグラフィピークは、図２のボックス２０２および２０４によって示され、図３のボックス３０２および３０４において１および２とラベル付けされている。

表２００の各行は、質量クロマトグラムである。表２００の質量クロマトグラムは、クロマトグラフィ頂点が、２つの個々の成分間において区別するため使用することができる追加の物理化学的特性であることを実証する。クロマトグラフィ頂点保持時間は、実体のクロマトグラフィ強度プロファイルがＬＣ／ＭＳデータ獲得中に最大にある点である。２つの分子の異なる頂点保持時間は、特定のカラム樹脂に対する化学実体の異なる物理相互作用を反映する（すなわち疎水性、親水性、極性など）。

クロマトグラフィ頂点保持時間を考慮に入れると、表２００の１５の個々の質量クロマトグラム（行）は、実際には２９の独立した区別可能な化学実体を含む。図３は、２９の化学実体のそれぞれに関連付けられたクロマトグラフィピークを数値で表す表３００である。表３００に示されるように、クロマトグラフィピークは、行の任意に割り当てられた１つずつ大きくなる数字によって同定される。したがってボックス３０２および３０４によって示されるピークは、それぞれ、表２００のボックス２０２および２０４によって表されるピークに対応する。

化学実体が不安定である場合、ＬＣ／ＭＳ獲得中に同時に生成される結果として生じる断片イオンは、１セットのクロマトグラフィピークとして出現する。これらのピークは共通の溶離親分子を元とするので、共通の保持時間を共有しなければならず、同じクロマトグラフィピークプロファイルを有さなければならない。これは、衝突セル１１８において交互の高／低エネルギーパターンの高エネルギー部分中に生成される断片イオンに当てはまる。化学実体が不安定ではない場合、単一の質量のみが、単一のクロマトグラフィピークとしてデータにおいて出現する。単一のプロファイルは、単一で未処置の化学実体を表す。

表２００のそれぞれの強度分配によって示されるように、クロマトグラフィピーク７、１２、および１８（表３００）の頂点保持時間は同じである。クロマトグラフィピークのこのセットは共通の頂点保持時間を共有するので、共通の溶離分子に由来する可能性が高い。同様に、クロマトグラフィピーク１、２４、２６、および２８は、表２００のそれぞれの強度分配によって示されるように、共通の頂点保持時間を共有する。これらの７つのピークの本体が重なる場合でも、異なる頂点保持時間は、これらのピークが２つの別個の元の分子に対応する２つのグループに属することを示唆することに留意されたい。表３００のピーク５は、単一の質量として出現し、あらゆる他のクロマトグラフィピークと共通の頂点保持時間を有さない。したがって、ピーク５は、元の分子に関連付けられたデータにおいて唯一のピークであると見なされる。

質量および保持時間は、簡単な混合物において成分をグループにクラスタ化するのに十分である可能性があるが、質量および保持時間のみでは、複雑な混合物の成分をクラスタ化するのに十分ではない可能性がある。複雑な混合物は、ほぼ同じ保持時間（区別できない差異）において溶離する多くの元の分子を含むことがある。その結果、追加の区別基準が、複雑なサンプルについて必要である可能性がある。

本発明の実施形態は、時間的に同じ瞬間に溶離する成分をさらに特定化するために使用される追加の情報をＬＣ／ＭＳデータから抽出することができる。例えば、頂点保持時間の他に、分子をグループにより良好にクラスタ化するために、各クロマトグラフィピークに関連付けられたクロマトグラフィプロファイルの形状を分析することができる。保持時間のみを使用することにより、クロマトグラフィピークをグループにクラスタ化することが可能になる。各クロマトグラフィピークのクロマトグラフィプロファイルを付加的に使用することにより、同一（区別できない差異）の保持時間を有するが、異なる元の分子に関連付けられるべきであるピークをさらに区別することが可能になる。

クロマトグラフィピークプロファイルの使用を説明するのを補助するために、例が提供される。図４は、表２００の２９のクロマトグラフィピークの強度が、それぞれのピークの最大頂点強度に対して正規化されている表４００を示す。ピーク−強度データを正規化することは、それぞれのプロファイルを簡単に比較することができるように、強度を縮尺調整する。

図５は、各クロマトグラフィピークが別の行に列挙されるように、表４００に列挙された各質量クロマトグラム内のクロマトグラフィピークが分離されている表５００を示す。表５００の第１列において、２９のピークは、１つずつ大きくなる数字（表３００）、および括弧内の表４００からの質量クロマトグラムの行によって同定される。表５００の各行は、データの固有質量成分（イオン）に対応する単一のクロマトグラフィピークを含む。

この方式においてクロマトグラフィピークを組織化することによって、各クロマトグラフィピークのプロファイルは、独立に分析することができる。表４００からの行１の質量クロマトグラムは、表５００の行１および２において示されるように、２つの離散ピーク１および２を含む。表５００から、クロマトグラフィピークは互いに関連付けられる可能性が高いことがわかる。例えば、ピーク３（２）、１４（８）、および２０（１１）（図２のピーク３、１４、および２０）は、互いに関連付けられる。同様に、ピーク７（４）、１２（７）、および１８（１０）（図２のピーク７、１２、および１８）は、互いに関連付けられる。

以下で記述されるように、クロマトグラフィピークは、頂点保持時間によってだけでなく、対応するクロマトグラフィピークプロファイルまたはクロマトグラフィピーク形状によっても自動的にクラスタ化することができる。ピーク形状情報を使用することにより、大腸菌および人の血清の消化物などのより複雑なデータセットにおいて見られるピークをクラスタ化するとき、より高い信頼性が可能になる。

図６は、図２のピーク１（項目６０６）、２４（項目６０４）、２６（６０２）、および２８（項目６０８）に対応する正規化されていない質量クロマトグラム（表２００）のプロットである。図６からわかるように、各クロマトグラムは、走査６において最大応答に到達する。

図７は、図６においてプロットされた正規化された質量クロマトグラム（表５００）のプロットである。上述されたように、ピークの各成分は、それぞれのピークの最大応答値に関して正規化されている。正規化は、成分のそれぞれにわたって応答測定を縮尺調整し、それにより、プロファイルが同一であるか、または異なるかを判定するために、結果として得られるピーク形状を直接比較することが可能になる。プロファイルが異なる場合、同じ元の分子から生じることはできない。プロファイルが同じ場合（または、本質的に区別不可能）、区別不可能なクロマトグラフィピークを生じるそれぞれのイオンは、同じ元の分子に由来すると見なされる。

図７からわかるように、ピーク１、２４、２６、および２８に対応するクロマトグラフィプロファイルは重なる（項目７０２）。これらは同一であるので、すべて同じ元の分子に由来することができると結論付けることができる。これらの質量成分は、時間的に正確に同じ瞬間に頂点となるプロファイルを有するだけでなく、重なるピーク７０２によって示されるように、同じ正規化されたクロマトグラフィプロファイル（ピーク形状）をも有する。

本発明の実施形態は、時間的に同じ瞬間に共溶離して頂点となるクロマトグラフィピークを解明するために使用することもできる。図８は、対応する走査時間に対してプロットされたピーク７（項目８０６）、１２（項目８０４）、および１８（項目８０２）（表２００および、３００）、ならびにピーク１（項目８１２）、２４（項目８１０）、２６（項目８０８）、および２８（項目８１４）（表２００および３００）に対応する正規化されていない強度応答の重ね合わせプロットである。図８にプロットされたピーククロマトグラムのそれぞれは、走査６において最大ピーク頂点応答に到達する。したがって、成分は、ピーク頂点保持時間のみの使用では区別不可能である。

しかし、ピーク形状も考慮される場合、成分は区別することができる。図９は、クロマトグラフィピークプロファイルの比較を容易にするための、図８に示されたクロマトグラフィピークに対応する正規化された強度応答の重ね合わせプロットである。プロファイルを正規化した後、２つの別個のクロマトグラフィプロファイル９０２および９０４が、明瞭に観測可能である。

正規化および重ね作業を実施した後、３つの質量−保持時間成分７、１２、および１８（項目９０４）は、共通の元の分子に由来すると見なされ、４つの残りの質量保持時間１、２４、２６、および２８（項目９０２）は、別の独立の元の分子に由来すると見なされると関連付けることができる。

ピークプロファイルは、グループのピークが比較される基準ピークを生成するために使用される。基準ピークは、所定のピークなどの標準ピークとすることができ、または、保持時間のグループ化においてイオンに関連付けられたピークから生成することができる。例えば、グループの１つのイオンを基準として任意に選択することができる。さらに、特定のグループ化においてイオンに関連付けられたデータから、平均ピークプロファイルを決定することができ、または、中央値ピークプロファイルを決定することができる。次いで、グループのピークは、平均ピークまたは中央値ピークと比較することができる。

他のよく知られているピーク形状比較技術も、同様に使用することができる。例えば、自己組織化マップ（ＳＯＭ）などのクラスタ化アルゴリズムを使用して、自動ピーク形状比較を実施することができる。自己組織化マップは、競合学習に基づく人工的な神経回路網の特別なクラスである。アルゴリズムは、同様の記録が互いに近接して出現し、より同様でない記録がより離れて出現する２次元格子（マップ）を生成する。マップから、どの記録が関係付けられるかを視覚的に調査することが可能である。したがって、ＳＯＭは、ある形態のクラスタ化を提供する。自己組織化マップの記述が、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｂ．Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ，Ｎｏｎｃｏｎｖｅｘ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｖｏｌｕｍｅ１１、Ｐａｒｄａｌｏｓ，Ｐ．およびＨｏｒｓｔ，Ｒ．、編集者、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、オランダ（１９９６）、ならびにＭａｃＱｕｅｅｎ，Ｊ．Ｓｏｍｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ（１９６７）、ｉｎ Ｌｅ Ｃａｍ，Ｌ．Ｍ．およびＮｅｙｍａｎ，Ｊ．、編集者、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｆｔｈ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、２８１〜２９７ページ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ、カルフォルニア州バークレーおよびロサンゼルス）において記載されており、両方とも本明細書に完全に組み込まれている。

ＳＯＭを支配する数学的理論は、上記で引用された参考文献において提供され、以下のように概述される（マサチューセッツ州サマヴィルのＳｐｏｔｆｉｒｅから入手可能なソフトウェアのＤｉｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎにおいて見られる記述から取られた）。

ＳＯＭは、反復適合により動作する。各反復中、有効半径によって確定される近傍関数を含む重量因子が計算される。反復ｔにおける有効半径は、以下によって与えられる。

ｒ（ｔ）＝ｒ（ｂｅｇｉｎ）＋Δｒ・ｔ
上式で

上式で、
ｔ＝それまでの反復数における時間
ｋ＝トレーニング長（使用者によって設定される）
ｒ（ｅｎｄ）＝終了半径（使用者によって設定される）
ｒ（ｂｅｇｉｎ）＝初期半径（使用者によって設定される）

バブル近傍関数およびガウス近傍関数の２つの近傍関数が、Ｓｐｏｔｆｉｒｅのソフトウェアにおいて利用可能である。ノードｊおよびウィニングノードｉ（ｘ）についてのバブル近傍関数は、以下のように確定される。

上式で、
ｄ_ｉｊ＝ノードとウィニングノードとのユークリッド距離
ガウス近傍関数は、以下のように確定される。

自己組織化マップは、学習関数に従って時間の経過と共に減少する学習因子を使用する。Ｓｐｏｔｆｉｒｅのソフトウェアは、逆関数および線形関数の２つの学習関数を提供する。逆学習関数において、反復ｔにおける学習率因子は、以下によって提供される。

上式で、
ｔ＝反復の時間数
ｂ＝トレーニング長／１００
ａ（０）＝初期学習率（使用者によって設定される）
線形学習関数では、反復ｔにおける学習率因子は、以下によって提供される。

上式で、
ｔ＝反復の時間数
ｔｒａｉｎｌｅｎ＝トレーニング長（使用者によって設定される）
ａ（０）＝初期学習率（使用者によって設定される）

特定のＳＯＭの品質は、マッピング精度およびトポロジ保存を使用して評価することができる。マッピング精度は、平均量子化誤差を測定し、以下のようにＳｐｏｔｆｉｒｅのソフトウェアにおいて計算される。

上式で、ｃは、実際のｘについての最適整合単位である。トポグラフィ誤差は、以下によって計算される。

上式で、ｕは、第１および第２最適整合単位が互いの近傍周辺にない場合１であり、そうでない場合、ｕはゼロである。

図１０は、ＳＯＭ分析を質量成分（クロマトグラフィピーク）１、７、１２、１８、２４、２６、および２８に適用した後のクラスタ化の結果を示すプロットである。ＳＯＭ分析からの類似度指数は、これらの成分は時間的に同じ瞬間に共溶離するが、関連付けられた質量成分は、２つの化学種から生じることを示す。４つの質量成分１、２４、２６、および２８（項目１００２）は、５．７０Ｅ−１４の類似度指数を有し、残りの３つの質量成分７、１２、および１８（項目１００４）は、９．１７Ｅ−１４の類似度指数を有する。

図１１は、表５００の２９のクロマトグラフィピークのデータセット全体に適用されたＳＯＭ分析のプロットである。図１１のプロットからわかるように、ＳＯＭ分析は、２９のクロマトグラフィピークを８つの別個のクラスタ１１０２ａ〜ｈに関連付ける。その結果、２９のピークは、８つの別の元の分子に由来すると見なされる。これらの結果は、同じ表において指定された同じカラーコードのグループに対応する。これは、クロマトグラフィ反応全体によって成分をグループ化するためにクラスタ化を使用する簡単な例である。

ピークをクラスタ化するために、多くの技術を使用することができる。ＳＯＭの他に、これらの技術には、（１）Ｍｉｒｋｉｎ，Ｂ．（１９９６）Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ，Ｎｏｎｃｏｎｖｅｘ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｖｏｌｕｍｅ １１、Ｐａｒｄａｌｏｓ，Ｐ．およびＨｏｒｓｔ，Ｒ．、編集者、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、オランダ（「Ｍｉｒｋｉｎ」）、Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．、Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ｔａｘｏｎｏｍｙ、第２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、サンフランシスコにおいて記載されている階層型クラスタ化；（２）Ｍｉｒｋｉｎにおいて記載されているＫ手段クラスタ化、および（３）Ｊｏｌｌｉｆｆｅ，Ｉ．Ｔ．，Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、ニューヨーク、シュプリンガー出版１９８６に記載されている主要成分分析があるが、これに限定されるものではない。

上述されたように、本発明の実施形態は、大腸菌の消化物など、複雑な混合物を分析するのに特に有用である。図１２は、大腸菌のトリプシン消化物の２５８２質量−保持時間成分からなる、データの２０走査（１．５分）のＳＯＭ分析から得られるクラスタ化を示すプロットである。図１２に示されるように、質量−保持時間成分は、対応するクロマトグラフィプロファイルの類似度に従って１６の別個のクラスタに分離される。

本発明の実施形態において使用することができるクロマトグラフィピーク形状を比較する他の技術は、参照によって本明細書に完全に組み込まれているＧｏｒｅｎｓｔｅｉｎ（「Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎ」）への米国特許第５９６９２２８号において記載されているクロマトグラフィパターン分析方法である。Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎでは、２つの注入から得られた２つのクロマトグラムが、標準とサンプルとの差を示す残留値を導出するために比較される。Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎにおいて開示されている技術は、同じ注入から得られた２つの質量クロマトグラムに適用することができる。Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎにおいて記述される方法は、２つの質量クロマトグラムのそれぞれにおいて同じ保持時間領域に適用される。質量クロマトグラムの一方は、先駆物質（標準）のクロマトグラフィピークプロファイルを含み、他方の質量クロマトグラムは、おそらくは元の分子（例えば、先駆物質の断片）から導出される他のピーク（サンプル）のクロマトグラフィピークプロファイルを含む。次いで、Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎにおいて記述されている方法は、導出された残留値に基づいて、第２ピークのプロファイルが先駆物質のクロマトグラフィピークプロファイルのものと同様であるか、または異なるかを判定するために使用される。

上述されたように、本発明の実施形態は、Ｂａｔｅｍａｎにおいて記載されているような高／低切替えプロトコルを使用して収集されたＬＣ／ＭＳデータに適用可能である。衝突セルは、２重の目的を果たす。低エネルギーにおいて、そのようなセルは、泳動イオンの内部エネルギーを冷却または低減し、より多くのイオンが下流の質量分析装置に入ることを可能にする。理想的には、衝突セルのそのような低エネルギー横断は、断片化のないより集束されたビームのみを生成する。通常の低エネルギー加速電位は、数ボルトである。より高い電圧が衝突セルに課される場合（１０から３０ボルト）、冷却に加えて、断片化のプロセスが行われ、先駆物質をイオン化された断片に分解する。高低切替え（Ｂａｔｅｍａｎの特許）において、切替えは、複数のサイクルがクロマトグラフィピークの時間スケール内において行われるように、交流サイクルにおいて行われる。その結果、低エネルギー先駆物質および高エネルギー断片の両方のピークプロファイルは、十分にサンプリングされる。それにより、各低エネルギーイオンおよび高エネルギーイオンの保持時間、クロマトグラフィピークプロファイル、および強度は、その質量対電荷比と共に正確に測定することができる。

Ｂａｔｅｍａｎにおいて記述されているように、クロマトグラフィピークプロファイルは、データ収集の低エネルギーモードおよび高エネルギーモードの両方について、質量クロマトグラム（例えば、選択されたイオンクロマトグラム）から得ることができる。したがって、低エネルギースペクトルにおいて検出された各イオンおよび高エネルギースペクトルにおいて検出された各イオンについて、クロマトグラフィピークプロファイルを得ることができる。

保持時間およびピークプロファイルの比較は、低エネルギーおよび高エネルギーにおいて見られるイオンについて実施することができる。保持時間およびピークプロファイルの比較は、単一モード実験において見られるイオンについて実施することも同様にできる。そのような単一モード実験は、通常、低（非断片化）エネルギーにおいて実施される。しかし、単一モード実験は、先駆物質と断片イオンの混合物を生成する本質的に固定されたエネルギーにおいて実施することもできる。本明細書において記述される方法は、質量分析法を動作するこれらの単一モードおよび複数モードの方法に適用される。

実施において、イオンのそのようなグループ化の保持時間とピーク形状との間のばらつきは、１つまたは複数の非理想性の結果として生じることがある。すべての測定は、ある形態の統計誤差の影響を受ける。ミクロチャネルプレート（ＭＣＰ）によるイオン検出の場合、削減不可能な統計誤差は、ポアソン統計によって説明されるように、計数雑音のためである。理想的には、非断片化モードにおいて収集されるすべてのイオンは、元の分子に由来し、断片化モードにおいて収集されるイオンは、それぞれの元の分子の断片である。上述されたように、共通の元の分子のすべてのイオンが同じ保持時間およびクロマトグラフィプロファイルを有さなければならない。したがって、そのようなイオンは、上述された方法を使用して保持時間およびピーク形状によって比較することができる。

このようにして、高／低切替えプロトコルを使用して得られたデータは、各ビン（低エネルギーおよびエネルギーの両方）に関連付けられた質量分析データが、各単一の化学成分、すなわち元の分子から生じる質量のみを含むように、各精確な質量−保持時間の成分を適切なグループに効率的に分離するために処理することができる。

図１２に示されるデータは、図１３および１４の表１３００および１４００にそれぞれ列挙されたアミノ酸配列情報を得るために、クラスタ１２０２の質量−保持時間成分のリストを使用して質量タグ付け計算を実施することによってさらに確認された。配列のタグ付けは、１）１セットの質量ビンを取り上げ、質量を減少させることによってそれらを分類する、２）記憶された質量間の質量差を決定する、３）アミノ酸残留物の配列シリーズまたは部分ペプチド配列を創出するために、特定の質量差をアミノ酸残留物に関連付けることによって、ペプチドを同定するプロセスである。３）部分ペプチド配列と共に、ペプチドを同定するために、軽いおよび重い精確な質量測定を使用することができる（Ｍａｎｎ Ｍ．、Ｗｉｌｍ Ｍ．、Ｅｒｒｏｒ−ｔｏｌｅｒａｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．１９９４年１２月１５日；６６（２４）：４３９０〜９；Ｍｏｒｔｚ Ｅ、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ＰＢ、Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ Ｐ、Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ＮＬ、Ｗｏｏｄ ＴＤ、ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ ＦＷ、Ｍａｎｎ Ｍ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｄａｔａ ａｇａｉｎｓｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｂａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６年８月６日；９３（１６）：８２６４〜７、ＰＭＩＤ：８７１０８５８；Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ Ａ、Ｊｅｎｓｅｎ ＯＮ、Ｐｏｄｔｅｌｅｊｎｉｋｏｖ ＡＶ、Ｓａｇｌｉｏｃｃｏ Ｆ、Ｗｉｌｍ Ｍ、Ｖｏｒｍ Ｏ、Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ Ｐ、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ Ａ、Ｂｏｕｃｈｅｒｉｅ Ｈ、Ｍａｎｎ Ｍ、Ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１９９６１２月１０日；９３（２５）：１４４４０〜５、ＰＭＩＤ：８９６２０７０を参照されたい）。

質量タグにより、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＶＡＴＥＦＳＥＴＡＰＡＴＬＫ）に対するあいまいでないペプチド配列同定が得られる。ペプチドの同定は、８つの連続するｙ’’イオンの存在、ならびに前記ｙイオンの１つの特徴的なニュートラルロス（グルタミン酸残留物から水を引いたもの）によって検証された。図１５は、表１３００および１４００に列挙されたｙイオンのクロマトグラフィプロファイルのプロットである。

ピークの比較は、雑音源をも考慮に入れるべきである。例えば、誤差源は、他の元の分子からのイオンとの共溶離または干渉を含む。質量および保持時間におけるそのような干渉は、ピーク形状を歪ませ、保持時間の測定値を変化させることがある。

そのような非理想性を明確にする技術は、干渉されていると判断されるピークにフラグ付けすることと関連して、不純物をデコンボルブし（不純物を有効に除去し）、ピーク純度法を適用することを含む。ピークが、そのピーク形状を有効に決定するには信号対雑音について低過ぎる場合、または、ピークが干渉されている場合、所与のピークのピーク形状測定が、先駆物質のピークプロファイルとの比較に使用するには適切ではない可能性がある信号に、適切なフラグを設定することができる。

図１６は、本発明の実施形態による質量クロマトグラム（例えば、選択されたイオンクロマトグラム）を使用して先駆物質および断片イオンをグループ化する方法のフローチャートである。ステップ１６０２において、ＬＣ／ＭＳデータが得られる。ＬＣ／ＭＳデータは、サンプルの単一注入からのスペクトル走査の形態にあることが好ましい。サンプル混合物は、ＬＣ／ＭＳデータを生成するために、質量分析計によって分析された質量および液体クロマトグラフによって分離される。ステップ１６０４において、イオンが、ＬＣ／ＭＳデータにおいて検出される。かつて、そのような検出アルゴリズムが、同時係属ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／０４１８０、２００５年２月１１日出願、名称「Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｐｅａｋｓ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｄａｔａ ａｎｄ ｆｏｒ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｓｐｅｃｔｒａ ａｎｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ」（「‘４１８０出願」）に記載されており、これは、２次元たたみ込みフィルタで処理されたＬＣ／ＭＳデータマトリックス内において頂点を見つける。

これらのイオンは、Ｂａｔｅｍａｎによって記述されているように、低エネルギーモードおよび高エネルギーモードから得ることもできる。各モードにおいてイオンは検出され、その特性（保持時間、質量対電荷、および強度）は、‘４１８０出願において記載されている方法によって得られる。

これらのイオンがペプチドからである場合、これらのイオンは、ペプチドの単一同位体に対応するイオンを決定するためにさらに処理することが可能であり、それにより、単一同位体ではないイオンをペプチドから排除する。そのような処理の例が、参照によって本明細書に組み込まれている関連出願ＷＡＡ−３９４の図１７、およびその付随するテキストにおいて記載されている。例えば、ペプチドが電荷状態２において出現する場合、単一同位体イオンのみを保持し、観測された質量対電荷比を質量値に変換するために電荷状態を使用することが通例である。

以下の記述では簡単化のために、イオンという用語は、固有の分子を指す。さらに、その固有の分子が複数の電荷状態または同位体状態において出現する場合、その固有分子に関連付けられた観測イオンの集団の唯一の代表イオンが保持されるように、適切なアルゴリズムが適用されたと想定される。そのようなアルゴリズムは、参照によって本明細書に組み込まれている関連出願ＷＡＡ−３９４に記載されている。

ステップ１６０６において、保持時間、質量、およびピーク形状によって特定化されたイオンのリストが生成される。イオン検出の出力１６０４は、保持時間、質量（または質量対電荷比）、および強度である。ステップ１６０６において、各イオンのクロマトグラフィピーク形状は、質量クロマトグラム（例えば、選択されたイオンクロマトグラム）から得ることができ、質量チャネルは、イオンの質量と一致するように選択される。質量クロマトグラムの雑音（および質量クロマトグラムから得られるピーク形状の雑音）は、質量分析ピーク幅に対応するある範囲の質量値にわたって、よく知られている方式で質量クロマトグラムを組み合わせることによって低減することができる。例えば、飛行時間質量分析計が、２０ミリダルトンの質量スペクトルピーク幅、および質量チャネル間において４ミリダルトンの空間を有する場合、イオンの質量を中心として５つの質量クロマトグラムを組み合わせることにより、信号は増大し、質量クロマトグラムに沿った点に関連付けられた雑音は減少する。

ステップ１６０８において、基準保持時間が選択される。基準保持時間は、質量値、保持時間または走査数によって駆動される規則を使用して選択される。例えば、本発明の実施形態では、共通の保持時間を有するイオンが、当初選択される。共通の保持時間を有さないイオンは、共通の元の分子からとすることはできない。対象の基準イオンに対応する中心保持時間が選択されることが好ましい。例えば、基準イオンは、広範な保持時間ウィンドウ内にある知られている質量を有するイオンとすることができる。他の選択規則は、対象のイオンのグループ内において最大強度のイオンを選択する。そのような基準イオンが拾い出された後、その保持時間が基準保持時間となる。基準保持時間は、保持時間のウィンドウを確定するために使用される。保持時間ウィンドウは、ステップ１６１０において選択される。保持時間ウィンドウは、ピークの半値全幅（ＦＷＨＭ）において確定されるクロマトグラフィピーク幅の約１／５であるように選択されることが好ましい。したがって、ピークが３０秒のＦＷＨＭを有する場合、保持時間ウィンドウは、基準保持時間について＋／−３秒であるように選択される。ステップ１６１２において、基準保持時間に関連付けられたイオンが収集される。保持時間および保持時間ウィンドウが与えられると、そのウィンドウ内にあるすべてのイオンが見つけられる。選択されたイオンに関連付けることができないイオンを排除するために、追加の規則を適用することができる。例えば、基準イオンより小さい質量および低い強度を有するイオンのみを選択することが可能である。この規則は、基準イオンが先駆物質または元の分子であり、すべての他のイオンが断片であるという仮説と一貫する。方法のこのステージにおいて、収集されたイオンは、共通の元の分子の断片であるということと一貫するように、同じ保持時間、質量値、および強度を有する。

ステップ１６１４において、クロマトグラフィピーク形状比較アルゴリズムが適用される。ピーク形状比較アルゴリズムは、基準イオンのクロマトグラフィピーク形状と同様のピーク形状を有していないイオンを排除するために使用される。代替として、ピーク形状比較アルゴリズムは、グループのイオンと同様のピーク形状を有していないイオンを排除するために使用することができる。ピーク形状比較アルゴリズムは、上述されたアルゴリズムなど、ピーク形状を比較するための任意のアルゴリズムとすることができる。処理のこの段階において、収集されたイオンは、共通の元の分子の断片であるということと一貫するように、同じ保持時間、質量値、強度、およびピーク形状を有する。ステップ１６１６において、イオンのグループが記憶される。共通の保持時間およびピーク形状を有する（ならびに、他の質量および強度の規則を満たすことが可能である）イオンの各グループは、共通の元の分子に由来すると想定される。そのようなグループは、その後の分析のためにデータベースに記憶される。データベースは、サンプルおよびＬＣ／ＭＳ分析に関係付けられる他の情報と共にイオンのグループを記憶する。１セットのイオンがグループであると見なされた後、イオンのそのセットは、その後の反復において考慮から排除することができる（ステップ１６０８から１６１６）。ステップ１６１８において、処理すべき残りのイオンが存在するかが判定される。そうである場合、方法は、ステップ１６０８において続行される。処理すべきイオンがさらに存在しない場合、方法は終了する。

本発明の実施形態を使用して同定されたイオンのグループ化は、ペプチドの同定、ならびに天然、合成、および半合成の産物の同定を含む様々な目的について使用することができる。図１７は、本発明の実施形態を使用して同定されたイオンのグループ化を使用してペプチドを同定する方法のフローチャートである。イオンのグループが本発明の実施形態により決定された後、イオンのグループは、タンパク質配列のデータベースから得られる、または導出される合成イオングループ化と比較される。通常、タンパク質配列のデータベースは、ペプチド配列の指標付けされたデータベースである。データベースは、一般的なタンパク質配列を含む、またはより集中させることができ、また、特定の生物学的実体を対象とする、または特定の研究において見られる可能性がより高いタンパク質配列を含むことができる。

ステップ１７０２において、合成イオングループが、データベースから得られる。合成イオングループは、データベースに事前に記憶することができ、または、データベースに記憶されているペプチド配列から導出することができる。合成イオングループを導出するために、データベースのタンパク質配列は、ペプチドを生成するために、知られている開裂部位を使用してその場で消化される（コンピュータ上において人工的に）。次いで、ペプチドは、予測されるｙイオンおよびｂイオンにその場で断片化される。ステップ１７０４において、ｙイオンおよびｂイオンは、本発明の実施形態から決定されたイオングループと比較される。ステップ１７０６において整合が検出される場合、ステップ１７０８において、その整合は、同定されたペプチドとして示される。整合が存在しない場合、プロセスはステップ１７０２において続行され、他の合成イオングループが、データベースから得られる、または導出される。

本発明の好ましい実施形態の以上の開示は、例示および記述のために呈示された。排他的である、または開示された正確な形態に本発明を限定することを意図するものではない。本明細書において記述された実施形態の多くの変更および修正が、上記の開示を考慮すると、当業者には明らかになるであろう。本発明の範囲は、添付の請求項およびその等価物によってのみ確定される。

さらに、本発明の代表的な実施形態を記述することにおいて、本明細書は、本発明の方法および／またはプロセスを特定のステップ順序として提示した可能性がある。しかし、方法またはプロセスが本明細書において述べられた特定のステップ順序に依拠しない範囲において、方法またはプロセスは、記述されたステップの特定の順序に限定されるべきではない。当業者なら理解するように、ステップの他の順序も可能とすることが可能である。したがって、本明細書において述べられたステップの特定の順序は、特許請求の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。さらに、本発明の方法および／またはプロセスを対象とする特許請求の範囲は、書かれた順序においてステップを実施することに限定されるべきではなく、当業者なら、順序は変更することが可能であり、本発明の精神および範囲内に依然としてあることを容易に理解することができる。

本発明の実施形態による、質量クロマトグラムを得るためのＬＣ／ＭＳシステムの概略図である。 本発明の実施形態による、仮説ＬＣ／ＭＳ実験の結果を概述する表である。 本発明の実施形態による、図２の表の実体のそれぞれに関連付けられたクロマトグラフィピークを数値で示す表である。 本発明の実施形態による、図２に示された強度データに対応する正規化された強度データを示す表である。 本発明の実施形態による、各ピークに関連付けられた強度データが別の質量クロマトグラム（行）に列挙されている表である。 本発明の実施形態による、図２および３のピーク１、２４、２６、および２８に対応する正規化されていない質量クロマトグラムのプロットを示す図である。 本発明の実施形態による、図６にプロットされたデータに対応する正規化された質量クロマトグラムのプロットを示す図である。 本発明の実施形態による、図２および３のピーク１、７、１２、１８、２４、２６、および２８に関連付けられた正規化されていない強度応答の重ね合わせプロットを示す図である。 本発明の実施形態による、図８にプロットされたピークに関連付けられた正規化された強度応答の重ね合わせプロットを示す図である。 本発明の実施形態による、質量成分１、７、１２、１８、２４、２６、および２８にＳＯＭ分析を適用した後のクラスタ化の結果を示すプロット図である。 本発明の実施形態による、図５の表の２９のクロマトグラフィピークの完全セットに適用されたＳＯＭ分析のプロットを示す図である。 本発明の実施形態による、大腸菌サンプルからのクロマトグラフィピーク強度データに適用されたＳＯＭ分析から得られるクラスタ化を示すプロット図である。 本発明の実施形態による、分析された大腸菌サンプルに対応するアミノ酸配列情報を列挙する表である。 本発明の実施形態による、分析された大腸菌サンプルに対応するアミノ酸配列情報を列挙する別の表である。 図１３および１４の表に列挙されたｙイオンのクロマトグラフィプロファイルのプロットを示す図である。 本発明の実施形態による、選択されたイオンクロマトグラムを使用して先駆物質および断片イオンをグループ化する方法のフローチャートである。 本発明の実施形態を使用して同定されたイオングループ化を使用してペプチドを同定する方法のフローチャートである。

Claims (20)

1. ＬＣ／ＭＳ実験中に得られたデータを使用して、イオンをグループ化するためのシステムであって、
   サンプル混合物を２つ以上の成分に分離するためにサンプル混合物が中に導入される液体クロマトグラフと、
   液体クロマトグラフの出力が、１つまたは複数の質量クロマトグラムを生成するために入力される質量分析計と、
   質量クロマトグラムにおける１つまたは複数のイオンに対応する質量クロマトグラフィピークを同定することと、
   同定されたピークに関連付けられた保持時間に基づいて、イオンを１つまたは複数のイオングループにグループ化することと、
   クロマトグラフィピークが基準クロマトグラフィピークプロファイルに整合しないイオンを排除するために、イオングループのそれぞれを分析することとを、
   コンピュータにさせるための、コンピュータ上で実行されるコンピュータソフトウェアを有するコンピュータとを備える、システム。
2. コンピュータソフトウェアが、質量クロマトグラムを分析するために、コンピュータにさらにそれを正規化させる、請求項１に記載のシステム。
3. 基準クロマトグラフィピークプロファイルが、標準クロマトグラフィプロファイルを使用して導出される、請求項１に記載のシステム。
4. コンピュータソフトウェアが、コンピュータに、各グループ化においてイオンを使用して基準クロマトグラフィピークプロファイルをさらに導出させる、請求項１に記載のシステム。
5. 基準クロマトグラフィピークプロファイルが、グループのイオンに関連付けられたクロマトグラフィピークの平均を使用して導出される、請求項４に記載のシステム。
6. 基準クロマトグラフィピークプロファイルが、グループのイオンに関連付けられたクロマトグラフィピークの中央値を使用して導出される、請求項４に記載のシステム。
7. コンピュータソフトウェアが、コンピュータに、保持時間に基づいてイオンをグループ化するために保持時間ウィンドウを選択させる、請求項１に記載のシステム。
8. クロマトグラフィピークプロファイルが、頂点保持時間、ピーク幅、リフトオフ時間、およびタッチダウン時間の１つまたは複数に基づいて比較される、請求項１に記載のシステム。
9. サンプル混合物が、液体クロマトグラフに導入される前に消化される、請求項１に記載のシステム。
10. コンピュータソフトウェアが、コンピュータに、イオングループに関連付けられたペプチドを同定させる、請求項１に記載のシステム。
11. ＬＣ／ＭＳ実験中に得られたデータを使用して、イオンをグループ化する方法であって、
    サンプル混合物を２つ以上の成分に分離することと、
    １つまたは複数の質量クロマトグラムを生成することと、
    質量クロマトグラムの１つまたは複数のイオンに対応する質量クロマトグラフィピークを同定することと、
    同定されたピークに関連付けられた保持時間に基づいて、イオンを１つまたは複数のイオングループにグループ化することと、
    クロマトグラフィピークが基準クロマトグラフィピークプロファイルに整合しないイオンを排除するために、イオングループのそれぞれを分析することとを含む、方法。
12. 質量クロマトグラムを分析するために、それを正規化することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 基準クロマトグラフィピークプロファイルを導出するために、標準クロマトグラフィピークプロファイルを使用することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
14. 基準クロマトグラフィピークプロファイルを導出するために、各グループ化においてイオンを使用することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
15. グループのイオンに関連付けられたクロマトグラフィピークの平均を使用して、基準クロマトグラフィピークプロファイルを導出することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
16. グループのイオンに関連付けられたクロマトグラフィピークの中央値を使用して、基準クロマトグラフィピークプロファイルを導出することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
17. 保持時間に基づいてイオンをグループ化するために、保持時間ウィンドウを選択することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
18. 頂点保持時間、ピーク幅、リフトオフ時間、およびタッチダウン時間の１つまたは複数に基づいて、クロマトグラフィピークプロファイルを比較することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
19. 液体クロマトグラフに導入される前に、混合物を消化することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
20. １つまたは複数のイオングループの１つまたは複数に関連付けられたペプチドを同定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。

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