JP2007533665A

JP2007533665A - 新規ｇ−ｃｓｆ結合体

Info

Publication number: JP2007533665A
Application number: JP2007507939A
Authority: JP
Inventors: マリアベロネーゼ，フランチェスコ; ベルーナ，マヌエラ
Original assignee: ネクターセラピューティクス
Priority date: 2004-04-15
Filing date: 2005-04-06
Publication date: 2007-11-22
Also published as: EP1737496A2; IL178538A0; US20070166278A1; CN1960766A; WO2005099769A3; CA2562890A1; KR20060135887A; MXPA06011867A; EP1586334A1; WO2005099769A2; AU2005232475A1

Abstract

本出願は、PEG分子が、未変性G-CSF一次配列の17位のシステイン残基、またはG-CSF類似体の対応する位のシステイン残基に結合する新規PEG-G-CSF結合体に関する。本出願は、このような結合体の製造方法も説明し、当該方法は、以下のステップからなる。(i)G-CSFタンパク質をタンパク質の可逆的変性を誘発する状態にさせる。(ii)変性状態下で、ステップiで得られる変性タンパク質をチオール反応性PEGと結合する。(iii)ステップiiで得られる結合を生物学的に活性なG-CSF-PEGを得る結合の再生を促進する状態にさせる。

Description

本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の部位特定化学変性に関連する。

本発明の背景
生体内で主な顆粒球生成の制御因子である顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、現在、増殖、分化および顆粒球系統の細胞の生存を刺激する薬学的に活性なタンパク質を意味する。ヒトＧ−ＣＳＦは、骨髄でマクロファージおよび間質細胞により生成されるサイズが約２０ｋＤａの顆粒球である（Ｆｉｂｂｅら、１９８９年、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１ａｎｄｐｏｌｙ（ｒｌ）．ｐｏｌｙ（ｒＣ）ｉｎｄｕｃｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅＣＳＦ，ｍａｃｒｏｐｈａｇｅＣＳＦ，ａｎｄｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅＣＳＦｂｙｈｕｍａｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ，ＥｘｐＨｅｎｉａｔｏｌ．，Ｍａｒ１７（３），２２９−３４）。このヒトＧ−ＣＳＦは、最初に、ヒト膀胱癌細胞株名５６３７の調整培地から精製された（Ｗｅｌｔｅら、１９８５年、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，１５２６〜１５３０）。ヒトＧ−ＣＳＦをコード化するＤＮＡ配列の決定（日本国特許出願公開公報第５００６３６／８８）は、組換え遺伝技術により、ヒトＧ−ＣＳＦの生成を可能にした。大腸菌で発現されたＧ−ＣＳＦは、グリコシル化の欠如および細菌発現に付随するＮ末端メチオニル残基において、自然材料と異なる（Ｌｕら、１９８９年、Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅａｎｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ２６８，８１〜９２）。

Ｇ−ＣＳＦの臨床使用（ＮｅｍｕｎａｉｔｉｓＪ．，１９９７年、Ａｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｆｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，Ｄｒｕｇｓ５４，７０９〜７２９；ＷｅｌｔｅＫ．ら，１９９６年、Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（ｒ−ｍｅｔＨｕｇ−ＣＳＦ）：Ｔｈｅｆｉｒｓｔ１０ｙｅａｒｓ，Ｂｌｏｏｄ８８，１９０７〜１９２９で概説）は、化学療法で治療された癌患者において最初の臨床試験として、１９８６年に開始し（ＢｒｏｎｃｈｕｄＭ．Ｈ．ら、１９８７年、ＰｈａｓｅＩ／ＩＩｓｔｕｄｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｒｅｃｅｉｖｉｎｇｉｎｔｅｎｓｉｖｅｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５６，８０９〜８１３）、現在、好中球減少症の治療に広く使用されている。好中球減少症は、先天性欠損、薬物療法後の骨髄の抑制、および感染を含む幅広い疾患状況で引き起こる。この状態は、細胞障害性化学療法を受けた癌患者にも生じる。そして、好中球減少症は、細菌および二次感染の原因となり、多々、入院を必要とする。Ｇ−ＣＳＦは、好中球減少症の期間を減少または防止することができる。１９９１年、米国食料医薬品局は、化学療法中または後に好中球減少症を煩う患者によるニューポジェン（Ｎｅｗｐｏｇｅｎ）（フィルグラスチム、ｒｈ−ｍｅｔ−ｈｕＧ−ＣＳＦ）の使用を認可した。Ｇ−ＣＳＦを用いた治療は、より良い抗腫瘍効果を可能にしうる、高用量高強度スケジュールを可能にする（ＭｏｒｓｔｙｎＤ．およびＤｅｘｔｅｒＴ．Ｍ．、１９９４年、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（ｒ−ｍｅｔＨｕＧ−ＣＳＦ）ｉｎＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅ、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。後に、骨髄移植での使用が、世界各地で、また、最近、重度の慢性先天性好中球減少症の治療の使用が認可された。ニューポジェンは、移植における末梢血前駆細胞の動員に応用の可能性がある（Ｈｅｒｍａｎら、１９９６年、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ，ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＮｅｕｐｏｇｅｎ（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ），ａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ．，ＰｈａｒｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，３０３〜２８）。

８０以上のポリペプチド薬物が、米国で売りに出され、３５０以上が臨床試験を受けている。臨床試験の薬物の約３割は、ポリペプチドであるが、これらの薬物は、通常、生体内半減期において短い。多くの要因は、タンパク質分解による崩壊、肝臓濾過および免疫原性および抗原性反応のような循環からのペプチドの除去に関係する。さらに、ほとんどのポリペプチド薬物は、皮下または静脈内注入により与えられなければならなく、通常の低溶解度も問題かもしれない。

これらの弱点を克服するために、酵素および抗原性副作用による分解を削減するためにペプチドアミノ酸配列の変更、または半減期向上のために免疫グロブリンまたはアルブミンに融着し、リポソームのような送達に合体するという、ある方法が提案された。Ｇ−ＣＳＦに関する限り、多くの特許出願が、このような方法を使用して出願され、論文も発表された。一次配列のこれらの論文の多様性において、以下を引用する。

米国特許第５，２１４，１３２は、未変性Ｇ−ＣＳＦアミノ酸の代わりに、変異タンパク質がそれぞれアラニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）およびセリン（Ｓｅｒ）を持つ、１、３、４、５および１７位で未変性のｒｈＧ−ＣＳＦと異なるヒトＧ−ＣＳＦの遺伝的変異を報告している（Ｋｕｇａら、１９８９年、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５９，１０３〜１１１も参照）。

Ｍ．Ｏｋａｂｅら（Ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｍｕｔａｎｔｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｎｏｌｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ、１９９０年、Ｂｌｏｏｄ７５（９）５月１日、１７８８〜１７９３）は、アミノ酸が、ｒｈＧ−ＣＳＦのＮ末端領域の５配位座で置換えられたｒｈＧ−ＣＳＦの誘導体を報告した。誘導体は、二つの検定でマウスおよび／またヒト骨髄前駆細胞で無処理のＧ−ＣＳＦより高い特異的活性を示した。

米国特許第５，２１８，０９２は、未変性Ｇ−ＣＳＦアミノ酸の代わりに、変異タンパク質がそれぞれアラニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）およびセリン（Ｓｅｒ）を持つ、１、３、４、５、１７、１４５および１４７位で未変性のｒｈＧ−ＣＳＦと異なるヒトＧ−ＣＳＦの遺伝的変異を公開した。

ＷＯ０１／０４３２９−Ａは、１、２、３または１７位で未変性のｒｈＧ−ＣＳＦと異なるｒｈＧ−ＣＳＦ変異タンパク質を報告した。

ＷＯ０２／２０７６６−Ａおよび０２／２０７６７は、ヒスチジンにより置換られるＧ−ＣＳＦ類似体の構成を開示した。

ＷＯ０２／０７７０３４−Ａは、一つまたはそれ以上のＴ細胞エピトープの除去またはＭＨＣアロタイプの数の減少により得た、減少した免疫原性をもつ変性Ｇ−ＣＳＦを報告した。

除去率の削減、安定性の向上またはタンパク質の抗原性の破壊のための代替方法は、タンパク質がポリ（エチレングリコール）鎖の使用により化学的に変更される、ペグ化である。ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）が適切にポリペプチドに連結されると、酵素活性または受容体認識のような生物学的機能が維持されうる一方でその特性の多くを変更する。ＰＥＧ結合体は、タンパク質の表面を覆い、ポリペプチドの分子サイズを増加する、よって、肝臓の限外濾過を削減し、抗体または抗原プロセシング細胞の接近を阻止し、タンパク質分解酵素のよる分解を削減する。最終的に、ＰＥＧは、その物理化学的性質を分子に伝達する、よって生体内分布およびペプチドおよび非ペプチド薬物の溶解性も変更する。ペグ化の一般的な方法および結果の概説においては、以下の発表および特許の他の論文を参照のこと。

基本的と考えられる、Ｄａｖｉｓら、米国特許第４，１７９，３３７、Ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、１９７７年。

ＤｅｌｇａｄｏＣ．ら、１９９２年、ＴｈｅｕｓｅｓａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＰＥＧ−ｌｉｎｋｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｗ．Ｔｈｅｒ．ＤｒｕｇＣａｒ．Ｓｙｓ，９（３，４），２４９〜３０４。

ＺａｌｉｐｓｋｙＳ．，１９９５年、Ａｄ．ＤｒｕｇＤｅｌ．Ｒｅｖ．：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｐｏｌｙｅｃｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１６，１５７〜１８２。方法のコレクションおよび重要な報告が記載されている。

Ｆ．Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，２００２年、ＰｅｐｔｉｄｅａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ａｒｅｖｉｅｗｏｆｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１〜１３；Ｆ．Ｍ．ＶｅｒｏｎｅｓｅａｎｄＪ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編、Ａｄ．ＤｒｕｇＤｅｌ．Ｒｅｖ．、追加の論文コレクションが記載されている、Ｔｈｅｍｅｉｓｓｕｅｏｎ“ＰｅｐｔｉｄｅａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＰｅｇｙｌａｔｉｏｎＩ”、２００２年、５４，４５３〜６０６。

ＨａｒｒｉｓＪ．Ｍ．ａｎｄＶｅｒｏｎｅｓｅＦ．Ｍ．，Ａｄ．ＤｒｕｇＤｅｌ．Ｒｅｖ．，Ｔｈｅｍｅｉｓｓｕｅｏｎ“ＰｅｐｔｉｄｅａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＰｅｇｙｌａｔｉｏｎＩＩ−ｃｌｉｎｉｃａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎ”、２００３年、５５：１２５９〜１３５０）。

ＷＯ９９５３７７は、小さいＰＥＧ部分分子のステップ−ワイヤー取付け、次に大きいＰＥＧ誘導体の付加を伴い、立体的にインターフェロン部位の修正を可能にするＰＥＧ−ＩＮＦベータ結合体の生成方法を開示した。

タンパク質のペグ化方法を記載した他の発表は、Ｆ．Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、２００１年、ＰｅｐｔｉｄｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ．Ａｒｅｖｉｅｗｏｆｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌ．２２（５），４０５−４１７。

Ｒ．Ｓ．Ｇｏｏｄｓｏｎら、１９９０年、ＳｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄＰＥＧｙｌａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ａｔｉｔｓｇｌｙｃｏｓｉｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ，Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｔｕｒｅｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｖｏｌ８（４），３４３〜３４６。

以下を含む、本もこの技法において出版された。
Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．ＭｉｌｔｏｎＨａｒｒｉｓａｎｄＳａｍｕｅｌＺａｌｉｐｓｋｙ編、１９９７年、ＡＣＳＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ６８０。

Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓｅｄｒ．，１９９２年、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ。

現在まで、半減期の延長または生体内免疫原性の減少などのタンパク質のペグ化による一般的な利点が、よく知られている。数多くの研究が、抗体および抗体断片をペグ化するため、および異種原性的に投与して免疫原性を減少するために実行された。

いくつかの他の研究は、Ａ．Ｐ．ＣｈａｐｍａｎｉｎＡ．Ｄ．Ｄ．Ｒ．，２００２年、ＰＥＧｙｌａｔｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔｓｆｏｒｉｎｐｒｏｖｅｄｔｈｅｒａｐｙ：ａｒｅｖｉｅｗ５４，５３１〜５４５により報告されるように、ペグ化後、抗体または抗体断片の変更された生体内分布は、正常な組織では高レベルでない、腫瘍の多大な蓄積を導くことを示す。

Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈは、１２ｋＤａモノメトキシポリエチレングリコールをインターフェロンα−２ｂ（イントロンＡ）に結合することによる新規薬物を開発した。この新規薬物は、著明な臨床利益を提供しながら、持続型インターフェロンαタンパク質の必要条件を満たす（Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｙｏｕｎｇｓｔｅｒ，Ｍ．Ｇｒａｃｅら、２００２年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｅｇｙｌａｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｌｐｈａ−２ｂａｎｄｉｔｓｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｄ．Ｄ．Ｒ．５４，５４７〜５７０）。

文献は、結果として、週２回の代わりに週１回の投与スケジュールとなる、持続的吸収および肝臓浄化の減少を示す、高分子量ＰＥＧに結合されたインターフェロン、つまり、ペグインターフェロンα−２ａ（４０ｋＤａ）（つまり、４０ｋＤａ分枝ポリエチレングリコール部分に結合されたインターフェロンα２ａ）も記述している（Ｋ．Ｒ．Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｗ．Ｍｏｄｉ，Ｓ．Ｐｅｄｄｅｒ，２００２年、Ｕｓｅｏｆｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｌｐｈａ−２ａ（４０ｋＤａ）（Ｐｅｇａｓｙｓ）ｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＣ，Ａ．Ｄ．Ｄ．Ｒ．５４，５７１〜５８６）。

米国特許第４，７６６，１０６は、ポリエチレングリコールまたはポリオキシエチル化ポリオールから選択された、水ポリマーに選択的に結合するタンパク質を使用した医薬組成物に対するタンパク質の溶解性の増加を開示した。

米国特許第５，０９３，５３１および５，２１４，１３１において、Ｓａｎｏら発明者は、ポリエチレングリコール誘導体がペプチドのグアニジン基を変更できると報告した。

米国特許第５，１２２，６１４は、水性緩衝液中のタンパク質のアミノ基と容易に反応するＰＥＧ（ポリエチレングリコール−Ｎ−炭酸スクシンイミド）の新形態を開示した。

米国特許第５，２５２，７１４でＨａｒｒｉｓらは、アミノ基との結合のためにポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドの生成および使用を報告した。

欧州特許出願０，２３６，９８７および０，５３９，１６７は、タンパク質、ペプチドおよび遊離アミノ基を持つ有機化合物の変更のために、ＰＥＧの新規イミデート誘導体および他の水性ポリマーを開示した。

いくつかの論文および特許は、特にＧ−ＣＳＦおよびそのペグ化を論じている。米国特許第５，９８５，２６５で、Ｋｉｎｓｔｌｅｒらは、Ｎ末端的にタンパク質を変更する新方法を開示している。還元アルキル化を使用して、最終産物（水性ポリマーへのアミノ結合をもつタンパク質）は、アミノ結合をもつ同じポリマー−タンパク質結合より遥かに安定していることが発見された。研究論文において、Ｏ．Ｋｉｎｓｔｌｅｒらは、ｒｈＧ−ＣＳＦをポリエチレングリコールに結合する部位特定方法を記述している（２００２年、Ｍｏｎｏ−Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ａ．Ｄ．Ｄ．Ｒ．５４，４７７〜４８５）。この選択性は、ｐＨ５でＰＥＧプロピオンアルデヒドをもつタンパク質の還元アルキル化を実施することにより達成される。ｒｈＧ−ＣＳＦおよびｒｈＭＧＤＦを使用した実施例として、これらのタンパク質の供給特性および治療価値を向上するための本方法の応用を実際に示す。

ＷＯ９９０３８８７は、システイン残基が自然に存在するタンパク質配列に投入される、部位特定突然変異により得られたＧ−ＣＳＦ誘導体を開示している。これらの誘導体は、任意でペグ化される。

ＷＯ９０／０６９５２は、遊離アミノまたはカルボキシル基を介して結合したＰＥＧ鎖を使用して化学的に変更されたＧ−ＣＳＦを開示している。このＰＥＧ変更Ｇ−ＣＳＦは、体内で延長された半減期をもち、好中球減少症からの回復を促進し、基本的に同じ生物学的活性をもつ。

ＷＯ００／４４７８５は、優れた安定性、高溶解度、強化された血中半減期および血漿滞留時を含む改善された性質を示す、１〜５ＰＥＧ鎖に結合したｒｈＧ−ＣＳＦの結合を報告している。

ＷＯ９０／０６９５２は、基本的に、体内で同じ生物学的活性、長い半減期をもつ、ＰＥＧを使用して化学的に変形され、日本国特許出願公開公報第５００６３６／８８で開示された方法により生成された、ヒトＧ−ＣＳＦの遺伝的変異を開示している。さらに、このＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ結合体は、好中球減少症からの回復を促進しうることが観察されている。

ＷＯ０３／００６５０１−Ａは、アミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基および少なくとも一つの非ポリペプチド部分分子結合体をもつ、未変性ｒｈＧ−ＣＳＦと異なるｒｈＧ−ＣＳＦを開示している。

ＷＯ８９／０６５４６は、生物学的活性の維持および血中哺乳類半減期を増加する、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールホモポリマーに結合された、ＣＳＦ−１の遺伝的変異を開示している。

ＷＯ９０／０６９５２は、アミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを介してポリエチレングリコールと結合する新しく化学的に変更されたＧ−ＣＳＦを報告している。

異なる構造および性質を持つＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ結合体が、さらに欧州特許第０，３３５，４２３で開示された。

他のポリマー変更されたＧ−ＣＳＦが、ＷＯ０２／２００３３およびＷＯ０２／２００３４で開示された。

ペグ化されたＧ−ＣＳＦも、タンパク質の異なる投与速度、つまり、肺送達を研究するために使用された。これは、Ｒ．Ｗ．Ｎｉｖｅｎら、１９９４年、Ｐｕｌｍｏｎａｒｙａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌａｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（ＰＥＧｒｈＧ−ＣＳＦ），Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ３２，１７７〜１８９で報告された。

最後に、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの物理的性質は、Ｓａｔａｋｅ−Ｉｓｈｉｋａｗａ、１９９２年、Ｃｈｅｍｉｃａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｂｙｐｏｌｙｅｔｈｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｔｓｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｖｉｖｏ，ＣｅｌｌＳｔｒｕｃｔＦｕｎｃｔ．１７，１５７〜１６０により記述されている。

上述のＧ−ＣＳＦ結合体は、タンパク質アミノ基を介して結合により得られる。ＳＨ基の官能化により生成された誘導体は、今のところ、ない。これは、多分、本基がタンパク質の三次構造に組み込まれており、アクセスするのが非常に難しいためである。

本発明は、この問題を解決し、高純度および物理的に活性である単一産物としてＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ結合体ができる簡単な方法を提供する。

本発明は、治療的使用に適切なＧ−ＣＳＦ形成の生成に関与する問題を解決する方法を開示する。治療におけるタンパク質およびタンパク質中のＧ−ＣＳＦの応用において、当該分野で既知であることは、高除去率、タンパク質分解による崩壊およびさらには免疫原性反応のため、生体内での短い半減期という制限である。

本発明の目的は、ポリ（エチレングリコール）（つまりＰＥＧ）の一鎖が、未変性のシステイン１７アミノ酸残基を介して、共有結合で結合される、新規活性ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ結合体である。本発明の目的に使用されるＧ−ＣＳＦ分子は、未変性分子と同様、Ｎ末端メチオニル残基（フィルグラスチム）と組換えしたものである。

代替的にＧ−ＣＳＦの類似体が使用できる。本明細書の類似体は、自然に存在するタンパク質の一次構造の保存およびその生物学的活性を維持する産物と定義する。好ましくは、これらの類似体は、ヒト配列の一つまたはそれ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換える組換え技術により生成される。これらは、通常変異タンパク質と呼ばれる。

本発明のさらなる目的は、ＰＥＧを生物学的活性タンパク質に結合するための新しい工程である。多くのＰＥＧ結合体の応用は、ポリペプチドまたはタンパク質のような不安定な分子を処理する、従って、結合反応は、軽い化学的状態が必要とされる。ポリマー結合に適したタンパク質の最も一般的な反応基は、リジンのエプシロンアミノ基およびＮ末端アミノ酸のαアミノ基である。Ｎ末端アミンまたは遊離型リジンのいずれも、あらゆるタンパク質またはペプチドおよびタンパク質／ペプチド中のＧ−ＣＳＦに、ほぼいつも存在する。そして、それらは、容易に反応するため、ＰＥＧは、これらのアミノ基を介してタンパク質と頻繁に結合される。実際、ＷＯ００／４４７８５は、ＰＥＧ鎖がリジンまたはＮＨ₂末端残基に結合するＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ結合体を開示した。この結合は、Ｇ−ＣＳＦで、４リジン（リジン１６、リジン２３、リジン３４、リジン４０）、１α末端遊離アミノ基の存在、およびそれら全ての水混合溶媒への接触が可能である。報告されたケースにおいて、結合体混合物は、有益な使用のために分離および特徴づけされなければならない、異なる部位で結合されたＰＥＧをもつタンパク質種の多様性により示される。結合の多様性の問題を克服するために、ある著者は、ｐＫａが約９．５であるので、リジンε−アミンはｐＨ８以上で良好なヌクレオフィル（Ｎｕｃｌｅｏｐｈｙｌ）であり、Ｎ末端アミノ酸のα−アミノ基がリジンより塩基性が低く、低いｐＨで反応するという事実の有用した。反応ｐＨは、よって、結合の選択性を達成するのに重要であり、従って、簡易化された混合物の産物が得られる。

米国特許第５，９８５，２６５において、この性質が利用され、約ｐＨ５の反応を使用して優先的にＮ末端アミノ酸残基を変更する化学的方法が、開示された。このケースにおいて、反応は未完全で、非常に低い程度でリジンアミノ基も反応しうるが、優先的にＮ末端アミノ酸残基に対して反応した。混合物の獲得は、よって産物の所望する均一性に達するために精製されなければならない。

タンパク質における他の重要な潜在的な反応残基は、当該分野ですでに既知の方法で反応させた、モノメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（ｍ−ＰＥＧ−マレイミド）、ｍ−ＰＥＧ−ｏ−ピリジルジスルフィド、ｍ−ＰＥＧ−ビニルスルホンなどのいくつかのチオール反応性ＰＥＧに対して非常に反応するチオール基である（ＶｅｒｏｎｅｓｅＦ（２００１）ＰｅｐｔｉｄｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ａｒｅｖｉｅｗｏｆｐｒｏｂｌｅｍａｎｄｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２２，４０５〜４１７；ＲｏｂｅｒｔｓＭＪら、（２００２）ＣｈｅｍｉｓｔｒｙｆｏｒｐｅｐｔｉｄｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，４５９〜４７６）。

いくつかの論文は、システイン残基の特定のペグ化を記述している（ＣａｎｔｉｎＡＭら、２００２年、ＰｏｌｙｅｔｈｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎａｔＣｙｓ２３２ｐｒｏｌｏｎｇｓｔｈｅｈａｌｆ−ｌｉｆｅｏｆａｌｐｈａｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｅｌｌＭｏｌＢｉｏｌ．：２７（６）：６５９〜６５；ＬｅｏｎｇＳＲら、２００１年、Ａｄａｐｔｉｎｇｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆａｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８ａｎｔｉｂｏｄｙｆｏｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｐｐｌｉｃａｉｏｔｎｓｕｓｉｎｇｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｅｇｙｌａｔｉｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅ．１６（３）：１０６−１９；ＣｏｌｌｅｎＤら、２０００年、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｖａｒｉａｎｔｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｔａｐｈｙｌｏｋｉｎａｓｅｆｏｒｓｉｎｇｌｅ−ｂｏｌｕｓｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆａｃｕｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１０２（１５）：１７６６〜７２；ＧｏｏｄｓｏｎＲＪら、１９９０年、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｐｅｇｙｌａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ａｔｉｔｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８（４）：３４３〜６；Ｐａｉｇｅら、Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｂｙｃｏｎｖａｌｅｎｔｌｉｎｋａｇｅｔｏａｌｂｕｍｉｎｔｈｒｏｕｇｈａｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．１２，１９９５年）。

あいにく、システイン残基は、遊離形態でタンパク質にほとんど存在せず、さらに、これらは、通常、システインにジスルフィドとして存在する。遊離であるとき、これらは、しばしば、分子の活性領域に関与する。さらに、これらは、アクセスが難しい分子領域に存在する。例えば、これらは、狭い疎水性間隙に組み込まれており、一部が溶媒に曝されているだけである。これは、これらの残基を化学的に阻害し、自然条件下で、非常にゆっくりまたは非常に低収量の反応であることを意味する。

ｒｈＧ−ＣＳＦ一次配列において、五つのシステインがある。そのうち四つは、二つのジスルフィド結合（システイン３６−システイン４２、システイン６４−システイン７４）に関与するが、幸運にも一つのシステイン１７は遊離である。Ａｒａｋａｗａら（１９９３年）は、システイン１７は、未変性構造下で、親水性剤、ヨード酢酸によるカルボキシメチル化にアクセス可能ではないが、ｒｈＧ−ＣＳＦが変性されると、完全に反応性になることを報告している。他の実験において、遊離スルフィドリルは、非変性状態下で、疎水性変性剤であるジチオビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）と非常にゆっくり反応する。これらの実験およびＮＭＲにより評価された三次元構造から、遊離システイン残基は、分子の疎水性環境内に存在し、そのため、疎水性化剤は、よりアクセス可能であるのに、親水性アルキル化剤による化学的変性は、アクセス不可能であると仮定される。Ｇ−ＣＳＦの立体配座研究は、事実、１７位の−ＳＨがタンパク質の疎水性ポケットにあり、一部が溶媒に曝されているだけであることを示した。さらに、Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄら（１９８８年、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｎｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（Ｇ−ＣＳＦ），ＢｉｏｃｈｅｍＪ．１１月１５日；２５６（１），２１３〜８）は、１７位でのシステインのセイン置換えは、タンパク質の物理学的および生学物的性質において、大きな変化を生じないことを発見した。

本発明は、システイン１７のチオール基で特に結合する、Ｇ−ＣＳＦ結合体の製造方法を発見した。

本方法は、以下のステップからなる。
ｉ）Ｇ−ＣＳＦタンパク質をタンパク質の可逆的変性を誘発する条件にさらす。
ｉｉ）変性状態下で、ステップ（ｉ）で得られる変性タンパク質をチオール反応性ＰＥＧと結合させる。
ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られる結合を、結合の再生を促進し、所望の結合体をもたらす条件にさらす。

発明者により報告された生物学的実験は、上述の方法で生成されるＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ結合体は、細胞増殖検定で生物学的活性を維持する。

ステップ（ｉ）の可逆性変性は、尿素、塩化グアニジンまたはイソチオシアネート、ジメチル−尿素、高天然塩濃度および溶媒（例えば、アセトニトリル、アルコール類、有機エステル、ジメチルスルホキシド）のような一つまたはそれ以上の変性剤の存在下で実行される。可逆化学変性において、変性におけるタンパク質は、未変性の構造および機能の双方を失うが、変性剤の除去によって、構造または機能性質のいずれかを回復することを意味する。このような変性剤（等）の存在下で、タンパク質が変性され、システイン−１７のチオール基が曝され、官能化のためにアクセスが可能になる。変性工程は、遠紫外ＣＤスペクトルにより監視されうる。変性剤の量は、使用される変性剤により、当該分野に既知の者によって選択されうる。

変性剤は、尿素、塩化グアニジン、イソチオシアネートまたはジメチル−尿素であり、そのような変性剤は、好ましくは２Ｍより高濃度、より好ましくは３Ｍより高濃度、さらに好ましくは２から４Ｍの濃度である。例えば、塩化グアニジンの場合、塩化グアニジンの濃度は、好ましくは２Ｍより高い、より好ましくは３Ｍより高い、さらに好ましくは４Ｍから６Ｍである。

ステップ（ｉｉ）で得られた変性タンパク質を、変性状態を維持しながら、チオール基「チオール反応性ＰＥＧ」に対して特定の反応性をもつ活性化ＰＥＧと反応させる。

チオール反応性ＰＥＧは、当該分野の者には既知である。好まれるのは、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、Ｎ−マレイミド、ヨードアセトアミドである。

ＰＥＧは、直鎖または分枝鎖で、８００から８０．０００Ｄａ、好ましくは５．０００から４０．０００Ｄａの分子量を持つ。

ＯＰＳＳ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ、ＶＳ−ＰＥＧ−ＶＳ、ＶＳ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ、ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＭＡＬ、ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ、ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＶＳのような二官能化ＰＥＧも、使用されうる。

反応の完結は、ＨＰＬＣまたは比色定量テストによりチオール基の存在を監視することによる、通常の分析方法で評価することができる。

ステップ（ｉｉ）が完結したら、結合は、例えば、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｆｏｌｄｉｎｇ，ＰａｉｎＲＨ（ｅｄｔ．），ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ，ＯｘｆｏｒｄＵ．Ｋ．，１９９４年およびＭｉｄｄｅｌｂｅｒｇＡＰＪ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｒｅｆｏｌｄｉｎｇ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，４３７〜４４３，２００２年（本明細書に参照として引用する）で開示されたような一般的な方法により、再生状態に曝すことにより再生され、元のαへリックス構造を得る。

一般的な方法は、透析、限外濾過、クロマトグラフィー方法による変性剤の除去に関与する。ステップｉ、ｉｉ、ｉｉｉで使用されたｐＨおよび温度は、当該分野に精通した者により選択され、使用される変性剤、活性ポリマーのタイプおよび分子量により異なる。

タンパク質のシステイン−Ｓ−Ｓ結合体の可逆的変性または切断が阻止されるため、状態および試薬は、選択されなければならない。

軽いｐＨ値が好まれる。例えば、４から１０、より好ましくは６から８、さらに好ましくは中立性に近い値である。

高分子量ＰＥＧ（ポリマー）の結合において、高い温度が使用されると（例えば４０℃）高収率が得られるが、０から３０℃の低温度が、好まれる。

当業者にとって、上述の結合方法は、「束縛」システイン基からなる、一切のタンパク質の結合を生成するために使用されうることも理解する。

本方法の最初のステップは、好ましくは、５℃から５０℃の間の温度で実行され、好ましくは２０℃から４０℃の間の温度である。

再生は、透析、限外濾過、クロマトグラフィーまたは稀釈により変性剤を除去することにより得られる。

モノ官能化タンパク質を生じる方法で実行された、Ｇ−ＣＳＦのチオール反応性ＰＥＧとの良好な結合は、本明細書で報告されるように、既知および広く利用されるペグ化の技術的および生物学的利点への道を固める。

提案された方法は、モル分子量、さらに重要なことには、分子の水力学的に多量の大幅な増加産物を得ることが可能である。

既知のように、ＰＥＧの水力学的量は、重量から予測される約３〜４倍と対応する。よって、本特許の実施例で記述したように、５０００，１００００および２００００ＤａＰＥＧとの結合は、約４００００，５００００および６００００Ｄａの量のタンパク質に対応する。

この産物量は、腎臓糸球体濾過の限界値を解決することで知られ、従って、血液の保持時間の著しい増加が、通常予想される。

よって、特許出願は、経口、投入、鼻または座剤または経皮的適用において、上述のように生成される結合からなる医薬組成物を開示している。

システイン残基（Ｇ−ＣＳＦの場合、これは、配列で残基番号１７）のＳＨ基を曝すための可逆的変性を結合のために使用する、本明細書で報告されたチオール結合工程は、アミノ基変性に基づく既存技術で報告されたそれより、より便利である。事実、アミノ基変性において、もしαアミノ酸残基のみを目標とするためにｐＨを低下して反応の特定性を上昇すると、一般的に、複数の製品が得られる。

ここで、提案された方法は容易に向上され、いくつかのステップが、最終産物を得るのに必要である。
ｉ．変性溶液での分解
ｉｉ．粉末形状の反応性ＰＥＧの添加
ｉｉｉ．変性剤の除去および透析またはカラムクロマトグラフィーによるタンパク質の再生

任意で、変性剤（つまり、グアニジンＨＣＩ、尿素またはたの変性剤）は、タンパク質の水性溶液に添加され、同時に反応性ＰＥＧをステップｉｉで添加する。変性剤は、尿素、塩化グアニジン、イソチオシアネートまたはジメチル−尿素で、このような変性剤は、好ましくは２Ｍより高濃度上、より好ましくは３Ｍより紅葉度、さらに好ましくは２から４Ｍの濃度である。例えば、塩化グアニジンの場合、塩化グアニジンの濃度は、好ましくは２Ｍより高い、より好ましくは３Ｍより高い、さらに好ましくは４Ｍから６Ｍである。

タンパク質ＰＥＧ結合体の共通の問題は、酵素の場合には触媒活性、またはサイトカインなどのような配位子修飾の場合には認識の欠如に依存することは、既知である。

典型的な例は、結合後に生じるαインターフェロン活性の数倍低下である。
これは、われわれのＧ−ＣＳＦチオール修飾の場合には見られない。多分、この確かな様態は、われわれに技術により達成された一付着点、つまり、認識部位から離れたタンパク質の三次元構造のＳＨの位置に関する。我々の結合の元の生物学的活性の維持は、ＮＦＳ−６０細胞を使用した細胞培養で評価された。これらは、Ｇ−ＣＳＦに対して過剰な数の受容体を備えており、細胞の成長は、サイトカイン濃度に比例する。ＥＣ５０として表現される（つまり、最大成長の５０％を刺激する濃度）Ｇ−ＣＳＦ活性は、報告された例および図ｎ．１０に例示されるように、未変性タンパク質に非常に類似していた。

本発明の多の側面において、二官能的に活性されるＰＥＧ誘導体（ＯＰＳＳ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ、ＶＳ−ＰＥＧ−ＶＳ、ＶＳ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ、ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＭＡＬ、ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ、ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＶＳ）は、二つのＧ−ＣＳＦ単量体が、ＰＥＧを介してシステイン１７のチオール基で一緒に連結する二量体Ｇ−ＣＳＦ（つまり、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ）を生成するために使用されうる。このような得られた二量体の試験管内活性は、対応するＧ−ＣＳＦのペグ型のそれと匹敵する。これらの二量体の主な利点は、分子量増加による、生体内除去率（対応するＧ−ＣＳＦのペグ型と比較すると）の低下である。

実施例１：直接ペグ化によりｒｈＧ−ＣＳＦに結合される５ｋＤａＰＥＧの生成
５ｋＤａメトキシ−ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィドによるＧ−ＣＳＦの変形
メトキシ−ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィド（１．８１ｍｇ、０．３６０ｍｏｌ）を、試薬対ｒｈＧ−ＣＳＦのモル比が１０／１の２ｍｌの緩衝液（０．５Ｍトリス，ｐＨ７．２）中の０．６７ｍｇ、０．０３５６ｍｏｌのｒｈＧ−ＣＳＦに添加した。反応は、ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検証される（以下を参照）ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ結合体の一定した形成に達するように、数時間、室温で進行させるために放置された。

ＰＥＧ−ＯＰＳＳ−Ｇ−ＣＳＦ結合体の特性
１．ＤＴＮＢ比色検定（Ｅｌｌｍａｎ）
５，５’−ジチオビス（２ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）のＥｌｌｍａｎ試薬は、タンパク質および他の生物学システムの遊離チオールの推定を可能にする。本検定の感度は、チオレート陰イオンとＤＴＮＢ（ＨａｂｅｅｂＡ．Ｆ．Ｓ．Ａ．、１９７２年、ＲｅａｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌｇｒｏｕｐｗｉｔｈＥｌｌｍａｎ’ｓｒｅａｇｅｎｔ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２５，４５７〜４６４）の反応から混合ジスルフィドと一緒に生成された、２−ニトロ−５−チオベンゾエート陰イオンの高モル吸光係数によるものである。これにより、未変性または結合タンパク質のスルフィドリル基の比率を検証できる。

２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ｒｈＧ−ＣＳＦ誘導体化の量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、質的に推定される。低度の架橋結合（６０％アクリルアミド、０．８％ビスアクリルアミド）のゲルは、結合移動を可能にするために使用される。反応混合物は、異なる時間に分析される。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色により視覚化されたタンパク質は、主なスポットである出発材料未反応タンパク質と一緒にｒｈＧ−ＣＳＦに結合される５ｋＤａＰＥＧ−ＯＰＳＳＣ鎖に対応する、少量の新しい高分子量タンパク質種の存在を明らかにする。図１ｂ参照。

３．ＲＰ−ＨＰＬＣＣ４
反応混合物は、以下の容出条件によりＣ４Ｖｙｄａｃカラムを使用して逆相ＨＰＬＣにより分析される。容出液Ａ、水中で０．０５％ＴＦＡおよびＢ、アセトニトリル中で０．０５％ＴＦＡ以下の直線勾配が使用された。４分間の４０％Ｂ、１８分で最大７０％Ｂ、２分で９５％Ｂ、６分間９５％Ｂで留まり、２分で４０％Ｂ。フローは、０．８ｍｌ／分で、ＵＶランプは２２６ｎｍである。反応の時間経過は、制限される量の結合形成を示し、多くのタンパク質は、未変形で容出された。図１ａ参照。

５ｋＤａメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホンを用いたＧ−ＣＳＦの変形
メトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホン（５．２９ｍｇ、１．０５８ｍｏｌ）を、試薬対ｒｈＧ−ＣＳＦのモル比が１０／１の６ｍｌの緩衝液（０．５Ｍトリス、ｐＨ７．２）中の２．１８ｍｇ、０．１１６ｍｏｌのｒｈＧ−ＣＳＦに添加した。反応は、ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（以下を参照）により検証されるＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ結合体の一定した形成に達するように、数時間、室温で進行させるために放置された。図２ａまたはｂは、異なる時間の反応混合物のＨＰＬＣ曲線およびＳＤＳ−ＰＡＧＥである。図は、Ｇ−ＣＳＦの結合は行われたが、反応を数時間続行したにもかかわらず、非常に限られていることを示す。

実施例２：ｒｈＧ−ＣＳＦの可逆的変形
リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．２７）中のグアニジンＨＣＩ８Ｍを、２、４ｅ５モルの最終濃度に達するために、異なる量でｒｈＧ−ＣＳＦ緩衝液に添加した。室温で４時間保温した後、混合物は、変性を除去し、ｐＨ３．５のＧ−ＣＳＦ安定状態に達するため、酸性水溶液で透析された。

図３は、開始時のタンパク質および変形−再生プロセス後のＣＤスペクトルを示す。二次構造の回復は、治療前後の２２０〜２０８ｎｍ楕円率比から明らかである。以下の実験は、Ｇ−ＣＳＦが、元の構成に変性および再生されるかもしれないことを示す。

実施例３：変性条件下でのチオール試薬による５ｋＤａＰＥＧｒｈＧ−ＣＳＦ結合体の生成
５ｋＤａＰＥＧ−ＯＰＳＳおよびＰＥＧ−ＶＳのｒｈＧ−ＣＳＦへの結合
３ａ：最終濃度３Ｍ尿素に達するように、Ｇ−ＣＳＦ緩衝液（トリス０．５Ｍ）に６Ｍ尿素、ｐＨ７．２を添加した。この溶液に、タンパク質モル毎の１０モル試薬のモル比で、ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳまたはｍＰＥＧ−ＶＳを添加した。反応は、６時間、室温で進行させ、０．１ＮＨＣＩ添加により停止させた。

３ｂ：最終変性剤濃度が２、４、６Ｍになるように、Ｇ−ＣＳＦを、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．２７）中の８ＭグアニジンＨＣＩの溶液に添加した。前記変性Ｇ−ＣＳＦは、タンパク質モル毎の１０モル試薬のモル比に達するために、ＰＥＧ−ＯＰＳＳまたはＰＥＧ−ＶＳに添加された。室温で４時間後、反応は、ＨＣＩ０．１Ｎで停止された。

実施例４：ｒｈＧ−ＣＳＦに結合された５ｋＤａＰＥＧの特性
１．ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー
反応混合物は、以下の容出条件により、Ｃ４Ｖｙｄａｃカラムを使用して、逆相ＨＰＬＣにより分析された。容出液Ａ、水中で０．０５％ＴＦＡおよびＢ、アセトニトリル中で０．０５％ＴＦＡ以下の直線勾配が使用された：４分間の４０％Ｂ、１８分で最大７０％Ｂ、２分で９５％Ｂ、６分間９５％Ｂで留まり、２分で４０％Ｂ。フローは、０．８ｍｌ／分で、ＵＶランプは２２６ｎｍである。

図４Ａは、未変性Ｇ−ＣＳＦのクロマトグラフィーを示す。図４Ｂは、変性剤として尿素を使用した結合体（ＰＥＧ−ＯＰＳＳ）の形成を示す。図４Ｃ、Ｄ、Ｅは、異なる反応条件、つまり、図４ＣでのグアニジンＨＣＩ量は２Ｍ、４Ｄで４Ｍ、４Ｅで６Ｍでの結合体（−ＯＰＳＳ）の形成を示す。結合体の比率は、グアニジンの濃度に従って増加するのが図４Ｃ〜Ｅでみられる。図５Ｂ、Ｃ、Ｄは、それぞれ、図Ｃ、Ｄ、Ｅの同じ条件下（グアニジン濃度）での結合体（ＰＥＧ−ＶＳ）の形成を示す。

収量変形と軽度の変性状態間で良好の折衷を表すため、選択された最高の条件は、４Ｍのグアニジンである。
反応の時間経過は、制限された量の結合体形成を示し、多くのタンパク質は、未変性で容出された。

２．未変性Ｇ−ＣＳＦのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトロコピーおよびＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ（５ｋＤａ）結合体は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーを使用して、反応混合物から分取りされた。

図６Ａ（未変性Ｇ−ＣＳＦ）は、１８．９３０Ｄａでピークを示した。これは、未変性Ｇ−ＣＳＦの分子量に対応する。図６Ｂ（ペグ化Ｇ−ＣＳＦ）は、２４．７１１Ｄａでピークを示した。これは、ＰＥＧ−ＯＰＳＳ（５ｋＤａ）の単鎖に結合する未変性Ｇ−ＣＳＦの分子量に対応する。

図７（Ｇ−ＣＳＦの反応混合物）は、２４．５８３Ｄａでピークを示した。これは、ＰＥＧ−ＶＳ（５ｋＤａ）の単鎖に結合する未変性Ｇ−ＣＳＦの分子量に対応する。

３．未変性Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ結合体の遠紫外円偏光二色スペクトル
ＣＤスペクトルは、２５℃、約０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、０．１ｃｍの路長石英セルを使用して、ＪａｓｃｏモデルＪ−７００分光偏光計で記録された。

図８Ａは、未変性Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ結合体の遠紫外ＣＤスペクトルを示す。これらのスペクトルは、２０８および２２２ｎｍで楕円率極小値をもつα−ヘリカルポリペプチド類の典型である。未変性と結合体タンパク質間のα−ヘリカル比率の差異は、タンパク質濃度およびスペクトルの正常化を歪める、凝集問題によるものである。図８Ｂは、Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＶＳ結合体の遠紫外ＣＤスペクトルを示す。この場合、未変性と結合体間の二次構造の相違は、より明確である。

４．蛍光放出の研究
未変性Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳおよびＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＶＳ結合体の蛍光スペクトルは、２９５ｎｍでサンプル（１．３ｕＭ）を刺激し、波長範囲３０３〜５００ｎｍで発行蛍光を記録することにより、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬＳ−５０上で２５℃で記録された。スペクトルは、陰性（Ｎａｌ）および陽性（ＣｓＣＩ）消光剤添加後、同じ条件で記録された。未変性および結合体の蛍光クペクトルは、発行波長の５ｎｍの青方偏移（３５０から３４５ｎｍ）に対してのみ異なる。この相違は、溶媒へのフルオロフォール（Ｆｌｕｏｒｏｆｏｒ）（曝露の変化を示唆するには非常に小さい。

フルオロフォール（Ｔｒｐ５９、Ｔｒｐ１１９）は、周囲に極をもち、多分、未変性および結合タンパク質の双方で溶媒に曝露される。図９Ａ〜Ｂは、未変性Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳおよびＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＶＳにおいて、ＣｓＣｌ（Ａ）およびＮａｌ（Ｂ）を使用した消光実験を示す。これらの分析は、未変性および結合タンパク質のＴｒｐの溶媒到達性の小さな差異を明らかにする。この差異は、多分、Ｔｒｐ周囲のＰＥＧ鎖の存在による。

実施例５：変性剤状況でチオール試薬によりｒｈＧ−ＣＳＦに結合された１０ｋＤａＰＥＧの生成
５ａ．１．５ｍｌのｒｈＧ−ＣＳＦ（１．４６ｍｇ／ｍｌ）を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の１．５ｍｌの溶液６ＭグアニジンＨＣＩに添加した。この溶液に、ｒｈＧ−ＣＳＦモル毎１０モルのポリマー−のモル比で、ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳまたはｍＰＥＧ−ＶＳ（１０ｋＤａ）を添加した。反応混合物は、アルゴン環境で、２０時間、室温で進行され、反応は、ＨＣＩ０．１Ｍで停止させた。

５ｂ．結合体の特性は、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー（図１１）および遠紫外ＣＤスペクトル（図１３）により理解される。ＲＰ−ＨＰＬＣは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社Ｃ４カラムを使用して実行された。

実施例６：変性剤状況でチオール試薬（ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳおよびｍＰＥＧ−ＶＳ）によりｒｈＧ−ＣＳＦに結合された２０ｋＤａＰＥＧの生成
６ｂ．１．５ｍｌのｒｈＧ−ＣＳＦ（１．４６ｍｇ／ｍｌ）を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の１．５ｍｌの溶液６ＭグアニジンＨＣＩに添加した。この溶液に、ｒｈＧ−ＣＳＦモル毎１０モルのポリマーのモル比で、ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳまたはｍＰＥＧ−ＶＳ（２０ｋＤａ）を添加した。
反応混合物は、４０℃で１時間、次に室温で４時間進行された。反応は、ＨＣＩ０．１Ｍで停止させた。
６ｂ．結合体の特性は、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー（図１２）および遠紫外ＣＤスペクトル（図１３）により理解される。

実施例７：変性剤状況でチオール試薬（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）によりｒｈＧ−ＣＳＦに結合された２０ｋＤａＰＥＧの生成
溶液Ａ：０．５Ｍトリス−ＨＣＩを用いてｐＨ７．２に緩衝された３ｍｇ／ｍｌｒｈＧ−ＣＳＦが準備された（溶液Ａ）。

溶液Ｂ：３０ｍｇ／ｍｌ（ＰＥＧ−Ｍａｌ）の最終濃度を得るために、ｍＰＥＧ−マレイミドを、６ＭグアニジンＨＣＩ溶液に溶解し、トリス−ＨＣＩ（０．５Ｍ）を用いてｐＨ７．２に緩衝した。

６ｍｌの溶液Ａと６ｍｌの溶液Ｂを混合し、得られた混合物を室温で１時間反応させた（モル比、ｒｈＧ−ＣＳＦ／ＰＥＧ−Ｍａｌ＝１：１０）。ペグ化の収率は、９５％より高かった。

図１４は、未変性ｒｈＧ−ＣＳＦ（図１４Ａ）および室温での１時間後のこれらの反応混合物（図１４Ｂ）のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーを示す。

実施例８：ＮＦＳ−６０細胞での試験管内細胞増殖活性
感受性細胞株の増殖でのｒｈＧ−ＣＳＦの刺激作用の評価に基づく生物学的検定は、Ｇ−ＣＳＦ受容体（ＮＦＳ−６０細胞）のマウスの骨髄芽球性白血病リーチから開発された。細胞を結合するタンパク質は、飛躍的な増殖反応を導き、最終細胞濃度は、細胞培養に存在するＧ−ＣＳＦの濃度に対して比例することが解った。これは、用量−反応比率を適用することにより、Ｇ−ＣＳＦサンプル対一般または対照試料の生物学的効果を定量化させる。テストのために、ＮＦＳ−６０細胞は、最終濃度１８．０００ＵＩ／ｍｌの培地を得るために５％のウシ胎児血清、４ｍＭグルタミンおよびｒｈＧ−ＣＳＦで補填された、ＲＰＭＩ１６４０で懸濁培養として維持される。各実験前に、細胞は、成長培地に含まれるｒｈＧ−ＣＳＦＶを除去するために、氷冷のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄され、検定培地（２．５％のウシ胎児血清、４ｍＭグルタミン）で再度懸濁する。われわれの場合、Ｇ−ＣＳＦおよびＰＥＧ結合体の溶液は、検定培地で段階稀釈され、複製（５０ｕｌ）で９６ウェルプレートに移動され、１．０ｘ１０⁵細胞／ｍｌの最終密度にするため、等量の事前洗浄された細胞懸濁液と混合された。プレートは、１０ｕｌのＭＴＴ溶液（２０ｍｌの減菌で温かいＰＢＳで１００ｍｇＭＴＴ）の添加前に、ＣＯ₂で７２時間、３７℃で保温された。反応は、ＣＯ₂オーブンで３７℃で４時間進行させた。生細胞のミクロソーム脱水素化酵素は、ホルマザン塩ＭＴＴ（（３（ジメチルチアゾール−２イル）−２，５ジフェニルテトラソリウムブロミド）を青色結晶に変える。トリス結晶は、０．０１ＮＨＣＩ中のＳＤＳ１５％の溶液の１００ｕｌを使用して、可溶化される。
５７０ｎｍでの吸光度は、生細胞の数と正比例である。
ＥＣ₅₀値として活性図（図１０）から計算された、刺激因子としてのＧ−ＣＳＦおよび結合体の活性は、以下の表に示す。

ＥＣ₅₀値（ｐｍｏｌ／ｍＬ）は、最大細胞成長に対して５０％の細胞成長を促進する、ｒｈＧ−ＣＳＦの量である。よって、ＥＣ₅₀値が最小であればあるほど、ｒｈＧ−ＣＳＦ活性は最大である。

本方法の正確度を考慮すると、ｒｈＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳは、未変性ｒｈＧ−ＣＳＦのようにほぼ活性であると考えられる。

図１ａ：ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。Ｇ−ＣＳＦ未変性（Ａ）；Ｃ４ＶＩＤＡＣ^TMカラムを使用した反応時間０．５、３．５、２８時間（Ｂ、Ｃ、Ｄ）で、生理学的状態でのＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ−ＯＰＳＳ（５ｋＤａ）の反応混合物；１ｂ：反応時間０．５、２．５、３．５、６、２８、５１時間（レーン２〜７）で、生理学的状態でのＧ−ＣＳＦ未変性（レーン１）およびＧ−ＣＳＦＰＥＧ−ＯＰＳＳ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。図２ａ：ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。Ｇ−ＣＳＦ未変性（Ａ）；Ｃ４ＶＩＤＡＣ^TMカラムを使用した、反応の２８時間後（Ｂ）の生理学的状態でのＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ−ＶＳ（５ｋＤａ）の反応混合物；２ｂ：反応時間０．５、２．５、３．５、６、２８、５１時間（レーン２〜７）で、生理学的状態でのＧ−ＣＳＦ未変性（レーン１）およびＧ−ＣＳＦＰＥＧ−ＶＳ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。図３：一般状態およびグアニジンＨＣＩによる未変性、再生プロセル後のＧ−ＣＳＦ変性の遠紫外ＣＤスペクトラム。スペクトラムは、ｐＨ３．５の酸性溶液中、２５℃で得られた。図４：Ｃ４ＶＩＤＡＣ^TMカラムを使用した、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。Ｇ−ＣＳＦ未変性（Ａ）；３Ｍ尿素（Ｂ）の存在で、Ｇ−ＣＳＦおよびＰＥＧ−ＯＰＳＳ（５ｋＤａ）の反応混合物；２、４、６ＭグアニジンＨＣＩ（Ｃ、Ｄ、Ｅ）存在でのＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ−ＯＰＳＳ（５ｋＤａ）の反応混合物。図５：ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。Ｇ−ＣＳＦ未変性（Ａ）；Ｃ４ＶＩＤＡＣ^TMカラムを使用した、２、４、６ＭグアニジンＨＣＩ（Ｂ、Ｃ、Ｄ）存在でのＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ−ＶＳ（５ｋＤａ）の反応混合物。図６：Ｇ−ＣＳＦ未変性（Ａ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトロコピー；ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｂ）により、反応混合物から得たＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ（５ｋＤａ）結合体。図７：Ｇ−ＣＳＦとＰＥＧ−ＶＳ（５ｋＤａ）間の反応混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトロコピー（Ａ）。スペクトル拡張（Ｂ）。図８：Ｇ−ＣＳＦ未変性および結合されたＡ、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ（５ｋＤａ）の遠紫外ＣＤスペクトラム。Ｂ、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＶＳ（５ｋＤａ）。スペクトラムは、２５℃、１０ｍＭ酢酸、０．００４％ツイーン、１０ｍｇ／ｍｌマンニトール、ｐＨ４で記録された。図９：Ｇ−ＣＳＦ未変性、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ（５ｋＤａ）およびＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＶＳ（５ｋＤａ）結合体の蛍光放出スペクトラム。スペクトラムは、ＣｓＣｌ（Ａ）、Ｎａｌ（Ｂ）の存在で、２９５ｎｍで刺激サンプル（１．３ｕＭ）を記録した。図１０：ＮＦＳ−６０細胞の増殖で、Ｇ−ＣＳＦ未変性、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳおよびＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−ＶＳ結合体の刺激作用の評価。反応は、５４０ｎｍでＤ．Ｏ．を読み込むＭＴＴ比色検定により得られた。図１１：Ｃ４Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ＃社製カラムを使用した、Ｇ−ＣＳＦおよびＰＥＧ−ＯＰＳＳ（１０ｋＤａ）の反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。図１２：Ｃ４Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ^TM社製カラムを使用した、Ｇ−ＣＳＦおよびＰＥＧ−ＯＰＳＳ（２０ｋＤａ）の反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。図１３：Ｇ−ＣＳＦ未変性およびＰＥＧ−ＯＰＳＳ結合体（５ｋＤａ黒、１０ｋＤａ紫、２０ｋＤａ緑）の遠紫外ＣＤスペクトラム。スペクトラムは、２５℃、１０ｍＭ酢酸、０．００４％ツイーン、１０ｍｇ／ｍｌマンニトール、ｐＨ４で記録された。図１４：３Ｍ塩化グアニジンでの未変性ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ａ）およびＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ−Ｍａｌ（２０ｋＤａ）（Ｂ）の混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。

Claims

ＰＥＧと、ヒトＧ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦの類似体との結合体であって、当該ヒトＧ−ＣＳＦの１７位のシステインチオールまたは当該Ｇ−ＣＳＦ類似体の対応する位がＰＥＧ分子に結合することを特徴とする前記結合体。
前記Ｇ−ＣＳＦは、天然ヒト配列の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換、付加または除去しながらも、Ｇ−ＣＳＦ活性を維持することによる遺伝子操作により得られた配列類似体である、請求項１に記載の結合体。
前記ＰＥＧは、直鎖または分枝鎖で、かつ、単官能性または二官能性である、請求項１または２に記載の結合体。
前記ＰＥＧは、二官能性であり、そしてポリマーの一分子およびＧ−ＣＳＦまたはその類似体の二分子を含む、請求項１または３に記載の結合体。
前記ＰＥＧが、８００〜８０．０００Ｄａ、そして好ましくは５．０００〜４０．０００Ｄａの範囲の分子量をもつ、請求項１〜４のいずれかに記載の結合体。
請求項１〜５のいずれかに記載の結合体を含む医薬組成物。
好中球減少症（慢性、化学療法誘発性、ＨＩＶ誘発性、骨髄移植）の治療のための医薬製剤製造のための、請求項１〜６のいずれかに記載の結合体の使用。
立体障害型システイン基のポリマーおよびポリペプチド結合体の製造方法であって、
（ｉ）ポリペチドを、ポリペプチドの可逆的変性を誘発する条件にさらすステップと、
（ｉｉ）変性状態下で、ステップ（ｉ）で得られた変性プロペプチドを、チオール反応性ポリマーと結合させるステップと、
（ｉｉｉ）ステッップ（ｉｉ）で得られた結合体を、結合の再生を促進し、所望の結合体をもたらす条件にさらすステップと
を含む前記方法。
前記ポリペプチドがＧ−ＣＳＦまたはその類似体であり、かつ、前記ポリマーがＰＥＧである、請求項８に記載の方法。
前記可逆的変性は、尿素、塩化グアニジンまたはイソチオシアネート、ジメチル−尿素から選択される変性剤にポリペプチドを曝すことにより得られ、そのような変性剤は、好ましくは２Ｍより高濃度、より好ましくは３Ｍより高濃度、さらに好ましくは２〜４Ｍの濃度である、請求項８に記載の方法。
前記変性剤が塩化グアニジンであり、そして塩化グアニジンの濃度は、好ましくは２Ｍより高い、より好ましくは３Ｍより高い、さらに好ましくは４〜６Ｍである、請求項１０に記載の方法。
前記ＰＥＧが、ＯＰＳＳ、ＶＳ、Ｎ−マレイミドまたはヨードアセトアミドから選択されるチオール反応性基をもつ、請求項９〜１１のいずれかに記載の工程。
前記再生が、透析、限外濾過、クロマトグラフィーまたは稀釈による変性剤の除去により得られる、請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
ｐＨ５〜１１の水性緩衝溶液中で実行されることを特徴とする、請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
前記緩衝剤がＴＲＩＳまたはリン酸緩衝液であり、そしてｐＨが約７である、請求項１４に記載の方法。
ステップ（ｉｉ）が５℃〜５０℃の間、好ましくは２０℃〜４０℃の間で実行されることを特徴とする、請求項８〜１５のいずれかに記載の方法。