JP2007521798A - トマトｈｉｇｈｐｉｇｍｅｎｔ−１突然変異表現型（ｈｐ−１及びｈｐ−１Ｗ）に関与する単離ヌクレオチド配列及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、トマト ｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ １（ｈｐ−１）及びｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ １^ｗ（ｈｐ−１^ｗ）表現型に関与する単離ヌクレオチド配列（該配列は、改変トマトＤＤＢ１遺伝子配列又はその断片を含有し、該改変配列又は断片における該改変は、ｈｐ−１の場合は該ＤＤＢ１遺伝子配列のヌクレオチド９３１でのＡからＴへの塩基転換を、ｈｐ−１^ｗの場合は該ＤＤＢ１遺伝子配列のヌクレオチド２３９２でのＧからＡへの転位を含有する。）を提供する。

Description

本発明は、トマトにおけるｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ−１及びｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ−１^Ｗ表現型の作出に関与する改変ヌクレオチド配列に関する。より具体的には、本発明は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）及びヒトＤＤＢ１（ＵＶ損傷ＤＮＡ結合タンパク質１）遺伝子のトマトホモローグ内の点突然変異及び前記改変ヌクレオチド配列の使用を開示する。

植物は、光形態形成と称される一連の相互作用の進行過程を調節することにより、光強度、方向、持続時間及びスペクトルの性質に応答する。光形態形成突然変異体は、光と植物発生との間の複雑な相互作用の研究における優れたツールであることが分かっており、その中には、いくつかの農作物育種プログラムにおいて使用されているものもある。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、タバコ、トマト及びエンドウ豆を含む、数々の種において光形態形成突然変異体が報告されてきた。一般に、これらの突然変異体は、光受容体における欠陥又は光シグナル伝達連鎖のいくつかの局面における変化のいずれかとして分類され得る（Ｃｈｏｒｙ，１９９３）。

トマト（ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、リコペルシコン・エスクレンタム）においていくつかの光形態形成突然変異体が記載されている。これらのうち、一遺伝子性劣性 ｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ（ｈｐ−１、ｈｐ−１^Ｗ、ｈｐ−２及びｈｐ−２^ｊ）及びｄａｒｋ ｇｒｅｅｎ（ｄｇ）突然変異を有する突然変異体の特徴は、それらの過剰な光反応性である。

これらの突然変異体は、それらの半同質遺伝子の野生型植物と比較して、アントシアニンレベルが高く、胚軸が短く、果実の着色が濃い（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ及びＫａｍｉｍｕｒａ １９８４；Ｗａｎｎら、１９８５）。これらの突然変異体で見られる果実着色の増加は、カロテノイドレベルの顕著な上昇、主としてリコピン、成熟した完熟赤色果実ではフラボノイドによるものである。果実の色におけるこれらの影響の結果として、ｈｐ及びｄｇ突然変異が、いくつかの業務用加工及び最近、Ｌｙｃｏｐｅｎｅ Ｒｉｃｈ Ｔｏｍａｔｏｅｓ（リコピン高含有トマト）（ＬＲＴ）として販売されている生食用トマト栽培品種に遺伝子導入された（Ｗａｎｎ、１９９７）。

このｈｐ−１突然変異体は、本来、Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ｓｏｕｐ Ｃｏｍｐａｎｙ 農場（Ｒｉｖｅｒｔｏｎ，ＮＪ）において１９１７年に自然発生突然変異として発見された（Ｒｅｙｎａｒｄ，１９５６）。ｈｐ−１^Ｗ突然変異体は、遺伝子型ＧＴのメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）処理種子からの実生の植物子孫の中で現れ（Ｐｅｔｅｒｓら、１９８９）、ｈｐ−２突然変異体は、１９７５年に、Ｉｔａｌｉａｎ Ｓａｎ Ｍａｒｚａｎｏ栽培品種において報告され（Ｓｏｒｅｓｓｉ １９７５）、ｈｐ−２^ｊ突然変異体は、Ｔ−ＤＮＡ−形質転換植物（ｃｖ Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）の子孫の中で発見され（ｖａｎ Ｔｕｉｎｅｎら、１９９７）、ｄｇ突然変異体は、Ｍａｎａｐａｌ栽培品種の棚栽培において現れた（Ｋｏｎｓｌｅｒ １９７３）。当初、ある程度の混乱はあったが、現在、染色体２及び１にそれぞれマッピングされるトマトゲノムにおける２種類のＨＰ遺伝子（ＨＰ−１及びＨＰ−２）があること明らとなっている（ｖａｎ Ｔｕｉｎｅｎら、１９９７；Ｙｅｎら、１９９７）。（Ｖａｎ Ｔｕｉｎｅｎら、１９９７；Ｙｅｎら、１９９７）。これらの遺伝子座のそれぞれにおいて、上述の突然変異対立遺伝子２個が最初に同定された：ｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ、ｈｐ−２及びｈｐ−２^ｊ（Ｋｅｒｃｋｈｏｆｆ及びＫｅｎｄｒｉｃｋ １９９７；Ｖａｎ Ｔｕｉｎｅｎら、１９９７）。

ＷＯ ９９／２９８６６は、ＨＰ−２遺伝子のクローニング及び配列決定を開示しており、この遺伝子は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）核タンパク質 ＤＥＥＴＩＯＬＡＴＥＤ１（ＤＥＴ１）のトマトホモローグをコードすることが分かっている。この刊行物ではさらに、点突然変異及び欠失変異（両者とも、ＨＰ−２のコード配列の３’末端のエクソン１１に位置する。）が既に同定されているｈｐ−２^ｊ及びｈｐ−２突然変異体をそれぞれ生じさせるということを開示している。ｈｐ−２突然変異の場合、点突然変異は、エクソン１１において９塩基対の欠失を引き起こすイントロン１０の選択的スプライシングを導く。

共に所有するのＷＯ ０３／５７９１７は、ｄｇ突然変異に関与し、したがってＨＰ−２遺伝子座において３番目の突然変異対立遺伝子を含む、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＤＥＴ１遺伝子のトマトホモローグにおける別の点突然変異を開示している。

本発明の目的は、トマト植物のｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ−１（ｈｐ−１）及びｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ−１^Ｗ（ｈｐ−１^Ｗ）光形態形成突然変異体に関与する突然変異を含有する単離ヌクレオチド配列を提供することである。

さらなる本発明の目的は、ｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ突然変異体の同定及び選択のための分子診断ツールとして使用し得るＤＮＡマーカーを提供することである。

またさらなる本発明の目的は、リコピン促進二重突然変異の作出において遺伝子型選択のために使用し得る分子診断ツールを提供することである。

説明の進行につれて、本発明のその他の目的及び長所が明らかとなろう。

今や、ｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ突然変異表現形両方に関与する突然変異が、ヒト及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＶ損傷ＤＮＡ結合タンパク質１（ＤＤＢ１）遺伝子のトマトホモローグに存在することが分かった。

本発明は第一に、トマトｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ表現型に関与する単離ヌクレオチド配列に関し、前記配列のそれぞれは改変トマトＤＤＢ１遺伝子配列又はその断片もしくはホモローグを含有する。ｈｐ−１突然変異の場合、前記配列もしくは断片もしくはホモローグにおける改変には、ＤＤＢ１コード配列のトマトホモローグにおけるＡ^９３１からＴ^９３１への一塩基転換が含まれる。ｈｐ−１^Ｗ突然変異の場合、前記配列もしくは断片もしくはホモローグにおける改変には、ＤＤＢ１コード配列のトマトホモローグにおける１個のＧ^２３９２からＡ^２３９２への転位が含まれる。

本発明のある好ましい実施形態において、ｈｐ−１突然変異をコードする単離ヌクレオチド配列は、配列リストにおける配列番号１として定義される配列を含有する。同封の配列リストに含まれる配列は全て、本開示の不可欠な部分を形成するとみなされるべきことに注意すること。

本発明の別の好ましい実施形態において、ｈｐ−１^Ｗ突然変異をコードする単離ヌクレオチド配列は、配列リストにおける配列番号２として定義される配列を含有する。本発明がまた、その範囲内にｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ突然変異をコードする上記で定義した配列の全断片も含み、該断片が突然変異の起こったヌクレオチドを含有するＤＤＢ１遺伝子配列の領域（ｈｐ−１突然変異の場合はヌクレオチド９３１を含有する領域、ｈｐ−１^Ｗ突然変異の場合はヌクレオチド２３９２を含有する領域。）を含むことを理解されたい。

本発明はまた、植物材料におけるｈｐ−１及び（独立に）ｈｐ−１^Ｗ突然変異の存在を検出するための方法に関する。

このように、この局面のある実施形態において、本発明は、植物におけるｈｐ−１突然変異の存在を検出するための方法を提供し、この方法には、ゲノムＤＮＡを該植物から単離し、ＰＣＲ技術の使用により、該ゲノムＤＮＡから該ｈｐ−１突然変異を含有する遺伝子断片を増幅し、前記ゲノムＤＮＡにおける該ｈｐ−１突然変異の存在を決定する段階が含まれる。

別の実施形態において、本発明は、植物におけるｈｐ−１^Ｗ突然変異の存在を検出するための方法を提供し、この方法には、ゲノムＤＮＡを該植物から単離し、ＰＣＲ技術の使用により、該ゲノムＤＮＡから該ｈｐ−１^Ｗ突然変異を含有する遺伝子断片を増幅し、前記ゲノムＤＮＡにおける該ｈｐ−１^Ｗ突然変異を決定する段階が含まれる。

植物材料における、ｈｐ−１及び（独立に）ｈｐ−１^Ｗ突然変異の存在を決定するために、何らかの適切な技術を使用し得る。しかし、好ましい実施形態において、前記突然変異の存在は、ピロシークエンス技術の使用により決定され、該技術から得られた配列データを配列番号１（ｈｐ−１の場合）及び配列番号２（ｈｐ−１^Ｗの場合）で定義される配列と比較する。

特に好ましい実施形態において、上記で定義したｈｐ−１及び（独立に）ｈｐ−１^Ｗ突然変異の存在の決定方法を、リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）種から得られた材料に適用する。

ある特に好ましい実施形態において、上記で開示した、ｈｐ−１及び（独立に）ｈｐ−１^Ｗ突然変異の存在の決定方法を、栽培品種及びそれらの親系統におけるｄｇ対立遺伝子の存在を検出するための、品質管理又は採種におけるポストコントロールの手段として使用する。ポストコントロールという用語は、本明細書中で、その種子の意図する遺伝子型を確認するために採種の後に行われる品質管理チェックを指すために使用される。

別の局面において、本発明はまた、植物における２種類の異なる光形態形成突然変異の存在を決定するための方法に関し、該突然変異の一方は、ｈｐ−１又はｈｐ−１^Ｗ突然変異のいずれかであり、遺伝子型又は表現型選択手段のいずれかによるｈｐ−１又はｈｐ−１^Ｗ突然変異以外の光形態形成突然変異の存在を検出すること、及び、ここに上記で開示した手段によりｈｐ−１又はｈｐ−１^Ｗ突然変異の存在を検出することを含む。本発明のこの局面のある好ましい実施形態において、非ｈｐ−１、非ｈｐ−１^Ｗ光形態形成突然変異の存在を決定するための表現型選択手段には、５００ｎｍ未満の波長を有する光を遮光する黄色プラスチックスクリーン下の温度調節チャンバー内での、前記突然変異の存在が調べられている植物から得られた種子の発芽及び非黄化苗木の選択が含まれる。

本発明はまた、遺伝子型ｈｐ−１／ｈｐ−１ ｐ／ｐ（ここでｐは、遺伝学的にｈｐ−１突然変異に連鎖しない何らかの劣性光形態形成リコピン促進突然変異を表す。）を有するリコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の二重突然変異系統を作出するための方法にも関し、この方法は、
ａ）二重ヘテロ接合ｈｐ−１／＋ ｐ／＋ Ｆ_１植物を得るための、同型接合ｈｐ−１／ｈｐ−１系統又は植物の、同型接合ｐ／ｐ系統又は植物とのクロス交雑（ｃｒｏｓｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）と、
ｂ）Ｆ_２種子を得るための、段階（ａ）で得られたＦ_１植物の自家交配と；
ｃ）請求項７で定義した方法及び前記ｐ突然変異の存在を検出するための方法の適用による、二重同型接合植物ｈｐ−１／ｈｐ−１ ｐ／ｐの同定と；
ｄ）Ｆ_３種子を生成させるための、段階（ｃ）で同定された二重同型接合植物の自家交配及び該種子の発芽と、の段階を含有する。

本発明のこの局面のある好ましい実施形態において、この突然変異ｐは、ｄｇ突然変異である。この場合、前記方法の段階（ｃ）におけるｄｇ突然変異の存在の決定は、共に所有する、同時係属出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００２３で開示されるｄｇ突然変異に対するマーカーを使用して行われ得る。

同様に、本発明はまた、遺伝子型ｈｐ−１^ｗ／ｈｐ−１^ｗ ｐ／ｐ（ここでｐは、遺伝学的にｈｐ−１^ｗ突然変異に連鎖しない何らかの劣性光形態形成リコピン促進突然変異を表す。）を有するリコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の二重突然変異系統を作出するための方法にも関し、この方法は、
ａ）二重ヘテロ接合ｈｐ−１^ｗ／＋ ｐ／＋ Ｆ_１植物を得るための、同型接合ｈｐ−１^ｗ／ｈｐ−１^ｗ系統又は植物の、同型接合ｐ／ｐ系統又は植物とのクロス交雑（ｃｒｏｓｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）と、
ｂ）Ｆ_２種子を得るための、段階（ａ）で得られたＦ_１植物の自家交配と；
ｃ）請求項１０で定義した方法及び前記ｐ突然変異の存在を検出するための方法の適用による、二重同型接合植物ｈｐ−１^ｗ／ｈｐ−１^ｗ ｐ／ｐの同定と；
ｄ）Ｆ_３種子を生成させるための、段階（ｃ）で同定された二重同型接合植物の自家交配及び該種子の発芽と、の段階を含有する。

本発明のこの局面のある好ましい実施形態において、この突然変異ｐは、ｄｇ突然変異である。この場合、前記方法の段階（ｃ）におけるｄｇ突然変異の存在の決定は、共に所有する、同時係属出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００２３で開示されるｄｇ突然変異に対するマーカーを使用して行われ得る。

本発明はまた、上記で開示した方法により作出される、遺伝子型ｈｐ−１／ｈｐ−１ ｐ／ｐ及び及び（独立に）ｈｐ−１^Ｗ／ｈｐ−１^Ｗ ｐ／ｐを有するリコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）種の二重突然変異交配種植物もその範囲内に包含する。

本発明の上記ならびにその他の特徴及び長所は全て、この後の、その好ましい実施形態の説明のためであり非限定的な例からさらに理解されよう。

好ましい実施形態の詳細な説明
１つの局面において、本明細書で上述したように、本発明は、植物におけるｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ突然変異の存在を検出するための方法を提供する。

ｈｐ−１突然変異の場合、この方法には、ｈｐ−１表現型に関与する一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）の部位（ヌクレオチド位置９３１）を含有するＤＤＢ１遺伝子の領域を含むゲノムＤＮＡ断片を単離し、前記断片をクローニングし、該クローニング断片を配列決定し、配列決定したゲノム断片の位置９３１におけるＡ／Ｔ塩基変換を検出することによりｈｐ−１突然変異の存在を決定する段階が含まれる。

本発明のこの方法の特に好ましい実施形態において、クローニングされた断片の配列決定は、ピロシークエンス反応により達成される。ピロシークエンス反応の前に、ＳＮＰ含有ゲノム断片をＰＣＲ技術により増幅する（その詳細は本明細書で後述する。）。

「ＰＣＲ」（又はポリメラーゼ連鎖反応）技術という用語は、本明細書上記及び下記で使用される場合、反復的なポリメラーゼ反応により特異的なＤＮＡ配列の増幅（つまり、コピー数を増やすこと）を達成するために熱安定性ポリメラーゼを使用することを基にした、一群の技術を意味する。この反応は、クローニングの代わりに使用することができるが、必要であるのは、核酸配列の知識のみである。ＰＣＲを行うために、関心のある配列に相補的なプライマーを設計する。次にそのプライマーを自動ＤＮＡ合成により作成する。

ＰＣＲ及びその他のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ増幅方法は、当技術分野で周知であり、本明細書中で与えられる教示及び指示に基づき、並外れた経験を必要とせずに本発明に従い行うことができる。いくつかのＰＣＲ法（ならびに関連技術）は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号、ならびに、Ｉｎｎｉｓら編、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓで述べられている。

次の実施例は、説明を目的として、及び本発明をより具体的に説明し述べるために提供される。しかし、本発明は、これらの実施例において開示される特定の実施形態に限定されない。

実施例
材料及び方法
植物材料及び交配種
正常な開放受粉トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、リコペルシコン・エスクレンタム）ｃｖ．Ａｉｌｓａ Ｃｒａｉｇ及びｈｐ−１突然変異に対する準同質遺伝子及び同型接合系統からの種子は、Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡのＪ．Ｊ．Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉの好意により提供された。

ｈｐ−１突然変異（ＬＡ３００４）に対するｃｖ．Ｒｕｔｇｅｒｓ同型接合からの種子ならびに、ＧＴバックグラウンドにおけるｈｐ−１^Ｗ／ｈｐ−１^Ｗ突然変異植物及びそれらの同質遺伝子の正常な植物からの種子（それぞれＬＡ ＬＡ４０１２及びＬＡ４０１１）は、Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ，ＵＣ Ｄａｖｉｓ，ＣＡ，ＵＳＡのＲ．Ｔ．Ｃｈｅｔｅｌａｔにより提供された。遺伝子型ＧＴは、トマト育種系統であり、モザイクウイルスに耐性があり、元々Ｄｅｒｕｉｔｅｒｚｏｎｅｎ，Ｂｌｅｉｓｗｉｊｋ ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆら、１９９０）から得られた、ｃｖ．Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒと形態的に類似している。ｈｐ−１^Ｗ／ｈｐ−１^Ｗ突然変異植物は、遺伝子型ＧＴのＥＭＳ処理種子から栽培された植物の子孫の中で現れた（Ｐｅｔｅｒｓら、１９８９）。したがって、これらの植物は、正常ＧＴ遺伝子型に対して非常に同質遺伝子的である。突然変異体ｈｐ−１^Ｗ／ｈｐ−１^Ｗ植物は、ｈｐ−１／ｈｐ−１植物と比較して、より極端な表現型を示し、ｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗが対立遺伝子的であることが明確に示された（Ｐｅｔｅｒｓら、１９８９）。

Ｖｏｌｃａｎｉ Ｃｅｎｔｅｒの、故Ｒ．Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｄ．Ｌａｐｕｓｈｎｅｒ及びＩ．Ｌｅｖｉｎにより、プロセシングｈｐ−１／ｈｐ−１突然変異交配種、ＬＲＴ８９、２つのｈｐ−１／ｈｐ−１育種系統、Ｌ５２５及びＬ５２７及び正常な育種系統、Ｎ６７１が開発された。Ｈａｚｅｒａ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ， Ｉｓｒａｅｌにより開発された２種類のｈｐ−１／ｈｐ−１ プロセシング交配種、ＨＡ３５０１及びＨＡ３５０２由来の種子は、Ｍｒ．Ｅｚｒｉ Ｐｅｌｅｇにより提供された。ヘテロ接合のｈｐ−１／＋ 栽培品種、ｃｖ．１２４の種子もまた、Ｈａｚｅｒａ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｉｓｒａｅｌにより提供された。この研究で使用されたいくつかの正常な＋／＋ トマト栽培品種、つまり、Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ、Ｍ８２、Ｂｒｉｇａｄｅ、ＶＦ−３６、１８９、Ｍａｎａｐａｌ、ＮＣ８２８８及びＦｌｏｒｉｄａは、Ｖｏｌｃａｎｉ ｃｅｎｔｅｒで入手可能な種子ストック由来であった。ＤＮＡはまた、ＡＢ４２７、ＡＢ５１０及びＡＢ７４７の、Ｓｅｅｄｓ Ｉｎｃ．，Ｉｓｒａｅｌにより開発された３種類のｈｐ−１／ｈｐ−１ プロセシング交配種の単一の植物から抽出した。

Ｆ_１種子を得るために、正常なｃｖ．Ａｉｌｓａ Ｃｒａｉｇ植物をそれらの準同質遺伝子的なｈｐ−１突然変異植物と交配させた。Ｆ_２種子を得るためにこれらのＦ_１植物を自家受粉させた。１２３Ｆ_２苗木の試料をこの研究において行われる連鎖解析のために使用した。

ゲノムＤＮＡ抽出及びサザンブロットハイブリダイゼーション
ゲノムＤＮＡは、Ｆｕｌｔｏｎら、１９９５に従い、個々の植物から抽出した。トマトゲノムにおけるＤＤＢ１遺伝子のコピー数を調べるために、次の手順に従いサザンブロットハイブリダイゼーションを行った：Ｌ．エスクレンタム（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（ｃｖ．Ｍ８２）及びＬ．ペンネリー（Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）の両者から抽出されたゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＤｒａＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＳｃａＩ及びＭｖａＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。１．０％アガロースゲルでの電気泳動及びサザン転写に続いて、ＤＤＢ１遺伝子の５’コード配列の１３４６ｂｐを含有するＰ^３２標識ＤＮＡプローブとそのＤＮＡをハイブリダイズさせた。Ｌｅｖｉｎ及びＳｍｉｔｈ（１９９０）に従い、サザンブロット転写及びＤＮＡハイブリダイゼーションを行った。

ＰＣＲプライマーの設計
ＤＮＡＭＡＮ、配列解析ソフトウェアバージョン４．１（Ｌｙｎｎｏｎ ＢｉｏＳｏｆｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、配列解析及び遺伝子座特異的プライマー設計を行った。使用したＤＮＡプライマーは全て、Ｍ．Ｂ．Ｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ Ｌｔｄ．，Ｎｅｓｓ−Ｚｉｏｎａ，Ｉｓｒａｅｌより購入した。

ＰＣＲ反応
マッピング、クローニング及び直接配列決定及びピロシークエンスに対するＤＮＡ産物の増幅のために、ＰＣＲ反応を用いた。これらの目的全てのために、１０ｎｇ テンプレートＤＮＡ、２５ｍＭ ＴＡＰＳ（２５℃にてｐＨ＝９．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ Ｂ−メルカプトエタノール、４種類のデオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ） 各０．２ｍＭ、２種類のプライマー 各１０ｐｍｏｌ及び熱安定性のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ １ユニット（ＳｕｐｅｒＮｏｖａ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｍａｄｉ Ｌｔｄ．，Ｒｉｓｈｏｎ Ｌｅ Ｚｉｏｎ，Ｉｓｒａｅｌ）を用いて、増幅反応（２５ｍｌ最終体積）を行った。自動化サーモサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）において反応を行った。

マッピング及び直接配列決定に対して、最初のインキュベーションを９４℃にて３分間行い、次いで、９４℃にて３０秒間の変性、５８℃にて３０秒間のアニーリング及び７２℃にて１分間から２分間（ＰＣＲ産物の大きさに依存する。）の重合を３５サイクル行った。上記サイクル終了後に、最後の７２℃での重合を５分間行った。ＰＣＲ増幅産物を１．０％ アガロースゲルでの電気泳動により視覚化し、臭化エチジウムを用いた染色により検出した。

ピロシークエンス反応に先立つＰＣＲ増幅に対して、最初のインキュベーションを９４℃にて２分間行い、次いで、９４℃にて３０秒間の変性、５７℃にて３０秒間のアニーリング及び７２℃にて２０秒間の重合を３５サイクル行った。上記サイクル終了後に、最後の７２℃での重合を５分間行った。

ＤＤＢ１遺伝子のマッピング
ＤＤＢ１は、リコペルシコン・ペンネリー（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ（Ｌ．）ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）遺伝子浸透系統を用いてマッピングされた（Ｅｓｈｅｄら、１９９２）。それらの起源となる親系統Ｍ８２及びＬ．ペンネリーを含む、この遺伝子浸透系統それぞれの個々の植物から抽出したＤＮＡをＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。これらのマッピング反応のために使用したプライマーは、ｍＴＤＤＢ Ｆ及びｍＴＤＤＢ Ｒ（表１）であった。これらのプライマーは、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＤＤＢ１遺伝子の両コピーに対して高い相同性が見られたＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）データベース登録ＴＣ１１７３７２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／）に由来するものであった。Ｍ８２とＬ．ペンネリー（Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）との間で多形性を得るために、ＰＣＲ反応後にそのＰＣＲ産物をＰｓｔＩ エンドヌクレアーゼで消化した。

ｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ突然変異植物からのトマトＤＤＢ１ ｃＤＮＡのクローニング及び配列決定
個々のｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ突然変異苗木及びそれらの準同質遺伝子開放受粉野生種遺伝子型（それぞれ、Ａｉｌｓａ Ｃｒａｉｇ及びＧＴ）の葉組織２５ｍｇからトータルＲＮＡを抽出した。ＴＲＩｚｏｌ試薬システム（ＧｉｂｃｏＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡ抽出を行った。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ プレ増幅システム（ＧｉｂｃｏＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を用いたファーストストランドｃＤＮＡ合成のためにテンプレートとしてトータルＲＮＡを使用した。突然変異体及び正常な遺伝子登録物（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）の両者からトマトＤＤＢ１をコードする遺伝子の重複断片を増幅するために、調製したｃＤＮＡをＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。次に、直接的に、又はｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓを使用して、製造者の推奨する方法に従い（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒにクローニングした後のいずれかで、そのＰＣＲ産物の配列決定を行った。ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒにクローニングした後、増幅した重複断片のそれぞれの４種類又は５種類の独立したクローンに対して、ベクター Ｔ７、ＳＰ６及びトマトＤＤＢ１遺伝子に対して相補的なプライマーを基にして配列決定を行った。直接配列決定を使用した場合は常に、トマトＤＤＢ１遺伝子に対して相補的な各プライマーの組み合わせを表す少なくとも２つのＰＣＲ産物を配列決定した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて配列決定を行った。

Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）ＤＤＢ１遺伝子の両コピーに対して高い相同性を有するＴＩＧＲデータベース登録ＴＣ１１７３７２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／）に対して相補的なプライマーを用いて増幅した重複断片を使用することにより、トマト ＤＤＢ１遺伝子の３’領域を直接配列決定した。これらのプライマーは、下記、表１に示す：

ＤＤＢ１遺伝子の５’領域は、次のプライマーを用いて、最初に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^（Ｒ）ＳＫ（＋／−）ファージミド ｃＤＮＡライブラリーからクローニングした：Ｔ７＝５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１４）及び５’ＴＤＤＢ＿Ｒ＝５’−ＣＴＧＧＡＣＴＴＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡＧＣＣＴ−３’。

Ｖｏｌｃａｎｉ Ｃｅｎｔｅｒ，ＩｓｒａｅｌのＲ．Ｂａｒｇ及びＹ．Ｓａｌｔｓの好意により提供されたこのｃＤＮＡライブラリーは、条件的な単為結実の有限花序系統 Ｌ−１７９（ｐａｔ−２／ｐａｔ−２）由来の直径４ｍｍから６ｍｍの若い単為結実の果実から調製された（開花後約４日から８日）。この系統は、既に記載されていた（Ｂａｒｇら、１９９０）。このライブラリーは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ Ｉｎｃ．のｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ＃２００４００、Ｚａｐ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ＃２００４０１及びＺａｐ ｃＤＮＡ Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ＃２００４５０を用いて、製造者の使用説明書に従い調製された。

トマトＤＤＢ１遺伝子の５’ＵＴＲに対して相補的な上記プライマー（５’ＴＴＤＢ＿Ｒ）及びプライマー ＴＤＢ＿ＵＴＲ＝５’−ＡＴＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＧＧＧＡＡＧＡＴＡＣ−３’（配列番号１５）を用いて、ｈｐ１／ｈｐ１及びｈｐ１^Ｗ／ｈｐ１^Ｗ突然変異系統ならびにそれらの対応する準同質遺伝子正常系統からのトマトＤＤＢ１遺伝子の５’領域を直接、配列決定した。ピロシークエンス遺伝子型決定（下記参照）のために使用されるものなどの、上記断片に対して相補的ないくつかの重複プライマーを、トマトＤＤＢ１遺伝子の５’コード配列の配列確認のために使用した。

連鎖解析
ｈｐ−１突然変異植物と野生型植物（ｃｖ．Ａｌｉｓａ Ｃｒａｉｇ）との間の交配種のＦ_２種子を用いて、トマトＤＤＢ１遺伝子座と、ｈｐ−１突然変異体の特徴である過剰な光形態形成的脱黄化反応との間の連鎖の解析を行った。環境的に制御された栽培箱（昼間 ２５℃／夜間 １８℃）の中、５００ｎｍ未満の波長の光の透過を防ぐ黄色のプラスチックスクリーン下で、これらの種子を発芽させた（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ及びＫａｍｉｍｕｒａ １９８４）。これらの発芽及び最初の栽培条件の結果、この突然変異体と正常植物との間で胚軸の長さの差が大きくなった（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ及びＫａｍｉｍｕｒａ １９８４）。個々のＦ_２苗木の胚軸の長さを播種後８日に測定し、本明細書中で開示し記載するピロシークエンスに基づくＤＮＡマーカーを用いてそれらの遺伝子型の決定を行った。

ピロシークエンス遺伝子型決定
ｈｐ−１／ｈｐ−１突然変異系統とｃｖ．Ａｉｌｓａ Ｃｒａｉｇバックグラウンドにおけるその準同質遺伝子正常系統との間の、上述の１ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）に基づくピロシークエンス遺伝子型決定システム（Ｒｏｎａｇｈｉ ２００１により広範囲にわたり概説されている。）を開発した。この目的のために、ＳＮＰを含有するゲノム断片をクローニングし、図１で示すように配列決定した。この反応に対するビオチン標識フォワードプライマーは、５’−ＴＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＣＴ−３’（配列番号１６）であり；リバースプライマーは、５’−ＴＡＧＣＴＴＧＡＧＣＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡ−３’（配列番号１７）であり；配列決定プライマーは、５’−ＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＴ−３’（配列番号１８）であった。この反応における単位複製配列の大きさは１０６ｂｐであった。

ピロシークエンス反応に先立つＰＣＲ増幅反応は、上記に記載するとおり（ＰＣＲ反応参照）であった。ピロシークエンス解析前に配列決定プライマー ２ｐｍｏｌを増幅反応に添加した。ＭｅｇａＢＡＳＥ１０００機器（Ｄａｎｙｅｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｅｓ Ｚｉｏｎａ，Ｉｓｒａｅｌ）を用いて解析を行った。配列決定プライマーは逆方向なので、図３で示されるように、同型接合突然変異体ｈｐ−１遺伝子型がＳＮＰ位置でＡにより表されている一方で、正常な遺伝子型は、Ｔにより表されている。

統計解析
ＪＭＰ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。ＱＧＥＮＥソフトウェアバージョン３．０６ｄを用いて連鎖解析及びＬＯＤスコア決定を行った（Ｎｅｌｓｏｎ １９９７）。Ｃｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ １９８８）を用いてアミノ酸配列のアラインメントを行った。

ＤＤＢ１のトマトホモローグの同定及びクローニング
ＤＤＢ１タンパク質は、２つのサブユニット、ＤＤＢ１及びＤＤＢ２からなるヘテロ二量体である。コメ、ニワトリ、ヒト、マウス、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びシゾサッカロミセス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（分裂酵母）とは異なり、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ゲノムは、２つの相同性の高いＤＤＢ１遺伝子のコピー、ＤＤＢ１Ａ及びＤＤＢ１Ｂを有し（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、２００２；Ｚｏｌｅｚｚｉら、２００２；Ｆｕら、２００３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、２００３）、両者とも、１０８８アミノ酸長である（それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ タンパク質登録ＮＰ＿１９２４５１及びＮＰ＿１９３８４２）。これらの２つのタンパク質登録物のそれぞれを、トマト Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ（発現配列タグ）（ＥＳＴ）を含有するＴＩＧＲデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／）に対するｔｂｌａｓｔｎ解析においてクエリーとして使用した場合、両者とも２つの相同性の高い配列：ＴＣ１１７３７１（３９４ｂｐ）及びＴＣ１１７３７２（２２０６ｂｐ）を示した。シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ） 登録ＮＰ＿１９２４５１は、トマトＴＣ１１７３７１及びＴＣ１１７３７２登録物とそれぞれ、８７％及び８６％の同一性を有することが分かった。一方、登録ＮＰ＿１９３８４２は、トマトＴＣ１１７３７１及びＴＣ１１７３７２登録物とそれぞれ、８７％及び８３％の同一性を有する。最初に、より長いＴＩＧＲ登録物、ＴＣ１１７３７２、及び後にｃＤＮＡライブラリーから発明者らがクローニングした１個の遺伝子に基づく慎重な配列解析をおこなったところ、２つのトマトＴＩＧＲ登録物、ＴＣ１１７３７１及びＴＣ１１７３７２が同じ遺伝子配列に対して相補的であることが明らかになった。さらに、トマトゲノムＤＮＡのサザンブロット転写及びプローブとしてＤＤＢ１遺伝子配列を用いたハイブリダイゼーションにより、このトマトゲノムが実際に、ＤＤＢ１遺伝子の１個のコピーを含有することが明らかとなった（データは示さない）。

トマトＤＤＢ１のマッピング
トマトＤＤＢ１遺伝子のおよそのマップ位置を含む、部分マッピングの結果を図２で示す。これらの結果から、ＨＰ−１遺伝子を有する遺伝子浸透系統において、ＤＤＢ１がトマト染色体２に位置することが示される（Ｙｅｎら、１９９７）。

ｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ突然変異体におけるトマトＤＤＢ１の配列特性
Ａｉｌｓａ Ｃｒａｉｇバックグラウンドのｈｐ−１植物及び正常植物からの苗木の葉から調製したｃＤＮＡにおいて直接的配列決定を行うために、トマトＤＤＢ１遺伝子（ＴＩＧＲ登録ＴＣ１１７３７２）の３’領域に対して相補的ないくつかのフォワード及びリバースプライマー（表１）を使用した。この領域においてｈｐ−１植物と正常植物との間で多形性は得られなかった。したがって、２種類の遺伝子型においてＤＢＢ１遺伝子の５’領域をクローニングし、さらに、完全に配列を決定した。コンピューターによる全配列の翻訳の結果、トマトＤＤＢ１が１０９０アミノ酸タンパク質であることが分かった。ｈｐ−１及びその準同質遺伝子正常遺伝子型からのＤＤＢ１コード配列の配列解析により、突然変異ｈｐ−１植物のＤＤＢ１遺伝子のコード配列における、Ａ^９３１からＴ^９３１への一塩基転換が明らかとなった。この塩基転換の結果、保存されているアスパラギン^３１１がチロシン^３１１に置換されることとなった（図４）。

Ａｉｌｓａ Ｃｒａｉｇバックグラウンドにおいて得られた配列情報に基づき、発明者らはまた、ＧＴバックグラウンドにおけるｈｐ−１^Ｗ突然変異植物及びその同質遺伝子正常対照物のＤＤＢ１遺伝子の全コード領域を配列決定した。ｈｐ−１^Ｗはｈｐ−１に対して対立遺伝子的であるので、ｈｐ−１^Ｗ突然変異体でのＤＤＢ１遺伝子のコード配列における大きな突然変異は、トマトＤＤＢ１遺伝子がｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ突然変異表現型の両方を引き起こすという仮説を強く支持することとなる。実際に、保存されているグルタミン酸^７９８からリジン^７９８への置換を引き起こす、ｈｐ−１^Ｗ突然変異植物でのＤＤＢ１コード配列におけるＧ^２３９２からＡ^２３９２への一塩基転換が観察された（図４）。正常野生型トマトＤＤＢ１遺伝子の完全なヌクレオチドコード配列及び推定アミノ酸配列を図５及び図６でそれぞれ示す。

系統及び栽培品種の遺伝子型特定
直接的配列決定及びピロシークエンス法の組み合わせにより、様々なソースから得られた１９系統又は栽培品種の遺伝子型を特定した（図３）。これらの中に含まれるものは、１個のヘテロ接合 ｈｐ−１／＋、１０個のｈｐ−１／ｈｐ−１及び８個の正常＋／＋の登録物であった。ＤＤＢ１遺伝子において同定されたＳＮＰとＨＰ−１遺伝子座におけるその植物の既知の遺伝子型との間での完全な一致が明らかとなった（結果は示さない。）。

ＤＤＢ１遺伝子座と光形態形成反応との間の連鎖解析
ＤＤＢ１遺伝子座と、ｈｐ−１突然変異苗木により示される特徴的な高感受性光形態形成反応（つまり、胚軸伸長表現型の抑制）との間の関連を調べるために、連鎖解析研究を行った。この目的のために、有限花序ｈｐ−１突然変異植物と野生型植物（ｃｖ．Ａｉｌｓａ Ｃｒａｉｇ）との間の交配種のＦ_２種子を制御栽培箱において黄色のプラスチックスクリーン下で発芽させた。播種から８日後、個々の苗木の胚軸の長さを記録し、上述のようにピロシークエンスＤＮＡマーカーを用いて、それらのＤＤＢ１遺伝子座の遺伝子型を決定した。この結果から、下記表２で示すように、ＤＤＢ１遺伝子座と胚軸の長さとの間に明らかな関連があることが示された。

同型接合劣性 ｈｐ−１／ｈｐ−１の苗木は、２つの他の２種類の遺伝子型群と比較して、胚軸伸長が非常に顕著に抑制されることが示され、より過剰な光形態形成脱黄化反応が示唆された（２５＜ＬＯＤ スコア＜２６、Ｒ^２＝６２．８％）。これらの結果から、ｈｐ−１突然変異植物のＤＤＢ１遺伝子座において同定された突然変異が、その主要な特徴的表現型のうち１つ、つまり苗木における胚軸伸長の抑制、と関連することが確かめられる。興味深いことに、この研究において、ｈｐ−１対立遺伝子に対する僅かな部分的優性効果が得られた。この効果は、＋／＋とｈｐ−１／＋群平均との間で得られる統計的有意差から気付くことができる（表２）。

続くセクションにおいて、本発明の様々な実際的実施形態を説明し述べるさらなる非限定例（操作及び理論）を与える。これらの実施形態は、説明目的のためにのみに述べるものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

ｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ突然変異を同定するための診断ツール
配列決定の結果（図１）を基にしてｈｐ−１突然変異植物を同定するための分子診断ツールとしての使用のために、広い範囲にわたりＲｏｎａｇｈｉ ２００１により概説されている、ピロシークエンスＤＮＡマーカーシステムを開発した。このＤＮＡマーカーは、ｃｖ．Ａｉｌｓａ Ｃｒａｉｇバックグラウンドにおける、ｈｐ１／ｈｐ１突然変異系統とその準同質遺伝子正常系統との間でこの研究において発見された一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を基にしたものである。この目的のために、ＳＮＰを含有するゲノム断片をクローニングし、配列決定を行った。このゲノム断片の配列を図１で示す。この反応のためのビオチン標識フォワードプライマーは、５’−ＴＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＣＴ−３’（配列番号１６）であり；リバースプライマーは、５’−ＴＡＧＣＴＴＧＡＧＣＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡ−３’（配列番号１７）であり；配列決定プライマーは、５’−ＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＴ−３’（配列番号１８）であった。この反応における単位複製配列の大きさは、１０６ｂｐであった。

ピロシークエンス反応に先立つＰＣＲ増幅反応は、述べたとおりであった（上記ＰＣＲ反応を参照）。ピロシークエンス解析前に、配列決定プライマー ２ｐｍｏｌを増幅反応に添加した。Ｄａｎｙｅｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｅｓ Ｚｉｏｎａ，ＩｓｒａｅｌによるＭｅｇａＢＡＳＥ １０００機器を用いて、この解析を行った。配列決定プライマーが逆方向であるため、図３で示されるように、同型接合突然変異体ｈｐ−１遺伝子型がＳＮＰ位置でＡにより表される一方で、正常な遺伝子型は、Ｔにより表される。

ピロシークエンス法及び上述のプライマーを用いて、図３で示されるように、ｈｐ−１と野生型植物との間での明らかな多形性が見られた。同型接合ｈｐ−１突然変異植物の場合、ＳＮＰ位置でアデニン（Ａ）を表す１個のピークが観察されたが、一方で、野生型植物では、ＳＮＰ位置でチミン（Ｔ）を表す１個のピークが観察された（図３）。予想されるように、ｈｐ−１突然変異に対してヘテロ接合である植物では、Ａ及びＴヌクレオチドの両方を表す２個のピークが得られた（図３）。

同様のピロシークエンスに基づく、ｈｐ−１^Ｗ突然変異植物において観察されるＳＮＰを基としたマーカーシステムも確立した。

単一のトマト交配種における２種類の遺伝学的に連鎖しないリコピン促進突然変異の取り込み：実験的アプローチ
同じ特徴に正方向に影響を与える２種類以上の突然変異を組み合わせるか又は取り込むのは、栽培者の間で一般的な方法である。このような手法は、困難で時間のかかる試験交配により確認することができる。本明細書中で生み出された診断ツールにより、単一の植物又は育種系統において２種類の光高感受性リコピン促進突然変異の取り込みが促進され得る。

トマトにおけるいくつかの突然変異は、成熟トマト果実においてリコピン含量に対して正方向に影響を与える。これらのうち、少なくとも５種類が、顕著な高感受性光反応を示す。これらには、
１．Ｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ−１（ｈｐ−１）
２．Ｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ−１^Ｗ（ｈｐ−１^Ｗ）
３．Ｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ−２（ｈｐ−２）
４．Ｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ−２^ｊ（ｈｐ−２^ｊ）
５．Ｄａｒｋ ｇｒｅｅｎ（ｄｇ）が含まれる。

ｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ突然変異は、トマト染色体２のＨＰ−１遺伝子座にマッピングされる（Ｙｅｎら、１９９７及び本発明による。）。ｈｐ−２、ｈｐ−２^ｊ及びｄｇ突然変異は、トマト染色体１のＨＰ−２遺伝子座にマッピングされる（Ｍｕｓｔｉｌｌｉら、１９９９；Ｌｅｖｉｎら、２００３）。ＨＰ−２遺伝子座のリコピン促進ｈｐ−２、ｈｐ−２^ｊ又はｄｇ及び、ＨＰ−１遺伝子座にマッピングされる２つの突然変異（ｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ）のうちいずれか１つの取り込みは、次の手順により、より効率的に達成することができる（ｄｇ及びｈｐ−１突然変異に対して説明する。）。

１．二重ヘテロ接合Ｆ_１植物を作出するために、同型接合ｈｐ−１突然変異体を同型接合ｄｇと交配させる：
ｄｇ／ｄｇ ＋／＋ Ｘ ＋／＋ ｈｐ−１／ｈｐ−１
↓
ｄｇ／＋ ｈｐ−１／＋
２．Ｆ_２種子を生じさせるために、Ｆ_１二重ヘテロ接合植物を自家交配させる。これらのＦ_２種子は、９種類の遺伝子型に分かれる：ｄｇ／ｄｇ ｈｐ−１／ｈｐ−１、ｄｇ／ｄｇ ｈｐ−１／＋、ｄｇ／ｄｇ ＋／＋、ｄｇ／＋ ｈｐ−１／ｈｐ−１、ｄｇ／＋ ｈｐ−１／＋、ｄｇ／＋ ＋／＋、＋／＋ ｈｐ−１／ｈｐ−１、＋／＋ ｈｐ−１／＋、＋／＋ ＋／＋。

本明細書中で開示したｈｐ−１突然変異に対するピロシークエンスマーカーシステム及び共に所有する係属出願 ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００２３において開示されているｄｇ突然変異に対するマーカーを用いて、二重同型接合植物 ｄｇ／ｄｇ ｈｐ−１／ｈｐ−１を容易に同定し、この２つの突然変異に対して同型接合的な育種系統を得るために自家交配させることができる。

顕著にリコピン生産を増加させる、単一のトマト交配種における２種類の遺伝学的に連鎖しないリコピン促進突然変異の取り込み：操作例
Ｆ_１植物（ｈｐ−１／＋ ｄｇ／＋）を得るために、２つの半同質遺伝子交配種（一方はｈｐ−１突然変異に対する同型接合、ｈｐ−１／ｈｐ−１及び他方はｄｇ突然変異に対する同型接合、ｄｇ／ｄｇ）のクロス交雑（ｃｒｏｓｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。Ｆ_２苗木を得るために、これらのＦ_１植物の自家交雑（ｓｅｌｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。これらのＦ_２苗木の遺伝子型を決定し、実施例７で概説するように二重突然変異植物（ｈｐ−１／ｈｐ−１ ｄｇ／ｄｇ）を得るために自家交雑（ｓｅｌｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。２つの園芸的に許容可能な植物を選択し、２つのＦ_４系統を得るために自家交雑（ｓｅｌｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。二重突然変異交配種を得るためにこれらのＦ_４系統のクロス交雑（ｃｒｏｓｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。春季にオープンフィールド条件下でイスラエル北部の４ヶ所において、最初の交配（上記参照）で使用した半同質遺伝子の１個の突然変異交配種とともにこの交配種を試験した。表３（下記）で示される結果から、予想外に、二重突然変異交配種のリコピン生産がその同質遺伝子の単一突然変異交配種と比較して統計的に高いことが分かる。二重突然変異交配種のリコピン生産の増加は、ｄｇ／ｄｇ及びｈｐ−１／ｈｐ−１の単一突然変異交配種のリコピン生産比で、それぞれ、１９％及び６１％であった。

親系統及び交配種の種子のポストコントロール分析のための診断ツールの使用
種子会社は、親種子ストック及び交配種の種子のポストコントロール又は品質コントロールのために一連の分子マーカーを使用することが多い。いくつかの市販のリコピンに富むトマト栽培品種は、同型接合又はヘテロ接合状態のいずれかでｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ突然変異を有する。今まで、その種子の試料を発芽させる長期にわたる手法を遂行すること、及び親栽培品種及び次の世代における複雑な表現型解析を遂行することによってしか特定のストック内のｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ特性の検出を行うことができなかった。そのような栽培品種及びそれらの親系統においてｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ対立遺伝子をポジティブに検出するために、この研究において示される診断ツール（本明細書上記、実施例６を参照のこと。）を使用することができ、したがって、週又は月のかわりに１日から２日の時間スケールで行われる生産後品質管理が可能となる。

ＤＢＢ１遺伝子における、他の機能的に活性のある突然変異のマッピング
光形態形成突然変異体を得るために、正常な植物から取られた種子に対して、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）を用いて、又は、公知のプロトコールに従うその他のアプローチを用いて突然変異を起こすことができる（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆら、１９９０）。黄色プラスチックスクリーンなどの調光条件下で、これらの突然変異体を選択することができる。健康促進代謝産物のユニークな発現パターンについて、得られた光形態形成突然変異体をスクリーニングすることができる。これらの突然変異体はさらに、ｈｐ−１及び／又はｈｐ−１^Ｗに対する対立遺伝子試験により特徴を調べることができ、これらのうちいくつかは、これらの突然変異に対して対立遺伝子的であるとして特徴付けられ得る。このように、ｈｐ−１及び／又はｈｐ−１^Ｗに対して対立遺伝子的である突然変異植物が、ユニークな代謝産物プロファイルも有することを見出すことができる。これらの植物におけるＤＤＢ１遺伝子の配列解析により、このようなユニークな代謝産物構造を強調する正確な遺伝的改変が明らかになるはずである。これらの遺伝的改変により、マーカー利用選抜のための、本明細書の上記で概説したものと同様の特異的な分子マーカーの設計が可能となるであろう。また、そのような損傷のマッピングにより、トマト果実においてユニークな代謝産物プロファイルを有する植物を得るための効率的な遺伝子操作の標的としてのＤＤＢ１遺伝子内の領域が明らかとなり得る。

トマト果実及び／又はその他の植物種の果物及び野菜において健康促進代謝産物の過剰産生を達成するための、正常又は改変ＤＤＢ１遺伝子の過剰発現
ＤＤＢ１遺伝子は、多くの進化的に離れた種にわたり良く保存されている（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、２００２）。また、健康促進代謝産物の過剰産生へのその連鎖は、本明細書上記で概説している。これらの結果から、健康促進化合物の産生におけるＤＤＢ１遺伝子の効果がその他の植物種でも無視すべきでないことが示唆される。このような実際的見地から、構成的又は果実特異的プロモーター下で、センス又はアンチセンス（ＲＮＡｉ）方向で、正常もしくはｈｐ−１及びｈｐ−１^Ｗ突然変異体トマト植物又は何らかの他の植物種から、ＤＤＢ１遺伝子をクローニングし得る。何らかの植物種における何らかのこれらのコンストラクトの過剰発現の結果、果物及び野菜において機能的代謝産物の産生が増加し得る。

ｈｐ−１突然変異のためのピロシークエンスプライマーを設計するために使用されるゲノム断片のヌクレオチド配列（一ヌクレオチド多型は下線を付した太字で表し、フォワード及びリバースプライマーに下線を付し、配列決定プライマーは斜字体で表す。）。 トマトＤＤＢ１遺伝子の部分マッピングの結果（トマト染色体２のマップ。ＨＰ−１遺伝子（ｈｐ）の場所は、Ｙｅｎら（１９９７）から採用したものを示す。）。 ＤＤＢ１遺伝子座におけるｈｐ−１突然変異に対する、代表的なピロシークエンス遺伝子型決定の結果（配列決定プライマーが逆方向であるので、突然変異遺伝子型は、Ａで表され、正常遺伝子型はＴで表される。）。 ＤＤＢ１の部分的ＣｌｕｓｔａｌＷタンパク質アラインメント、ｈｐ−１（ａ）、ｈｐ−１^ｗ（ｂ）アミノ酸置換の位置を示す［シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ） ＤＤＢ１Ａ（Ａｔ＿ＤＤＢ１Ａ＝ＮＰ＿１９２４５１）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ） ＤＤＢ１Ｂ（Ａｔ＿ＤＤＢ１Ｂ＝ＮＰ＿１９３８４２）、トマト ｃｖ．Ａｉｌｓａ Ｃｒａｉｇ（Ｌｅ＝ＡＹ４５２４８０）、コメ（Ｏｓ＝ＢＡＢ２０７６１）、ヒト（Ｈｓ＝ＤＤＢ１＿Ｈｕｍａｎ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（Ｄｍ＝ＸＰ＿０８１１８６）、ニワトリ（Ｇｇ＝ＢＡＣ５６９９９）及びＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）（分裂酵母）（Ｓｐ＝ＮＰ＿５９３５８０）を示す。］。同一残基は黒い影を付し、類似残基は灰色の影を付す。 正常野生型トマトＤＤＢ１遺伝子の全ヌクレオチドコード配列（開始、ＡＴＧ及び停止、ＴＡＧコドンに下線を付す。塩基転換及び転位がｈｐ−１及びｈｐ−１^ｗ表現型をそれぞれ導くＡ^９３１及びＧ^２３９２の位置は、大きい太字で示す。）。 正常野生型トマトＤＤＢ１遺伝子の完全アミノ酸配列（その置換がそれぞれｈｐ−１及びｈｐ−１^ｗ表現型を導くアスパラギン^３１１及びグルタミン酸^７９８は、大きい太字で示す。）。

Claims (21)

1. 改変トマトＤＤＢ１遺伝子配列又はその断片を含み、該改変配列又は断片中の該改変が、該ＤＤＢ１遺伝子配列のヌクレオチド９３１におけるＡからＴへの塩基転換を含む、トマト ｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ １（ｈｐ−１）表現型に関与する単離ヌクレオチド配列。
2. 配列リストにおける配列番号１として定義される配列を含む、請求項１に記載の単離ヌクレオチド配列。
3. 配列番号１の断片を含み、該断片が、前記ＤＤＢ１遺伝子配列のヌクレオチド９３１を含む、請求項１に記載の単離ヌクレオチド配列。
4. 改変トマトＤＤＢ１遺伝子配列又はその断片を含み、該改変配列又は断片中の該改変が該ＤＤＢ１遺伝子配列のヌクレオチド２３９２におけるＧからＡへの転位を含む、トマト ｈｉｇｈ ｐｉｇｍｅｎｔ １^Ｗ（ｈｐ−１^Ｗ）表現型に関与する単離ヌクレオチド配列。
5. 配列リストにおける配列番号２として定義される配列を含む、請求項４に記載の単離ヌクレオチド配列。
6. 配列番号２の断片を含み、該断片が前記ＤＤＢ１遺伝子配列のヌクレオチド２３９２を含む、請求項４に記載の単離ヌクレオチド配列。
7. ゲノムＤＮＡを植物から単離する工程と、ＰＣＲ技術の使用により前記ゲノムＤＮＡからｈｐ−１突然変異を含有する遺伝子断片を増幅する工程と、前記ゲノムＤＮＡ中の前記ｈｐ−１突然変異の存在を決定する工程と、を含む、植物におけるｈｐ−１突然変異の存在を検出するための方法。
8. ピロシークエンス技術の使用により前記ｈｐ−１突然変異の存在が決定され、前記技術から得られた配列データが、配列番号１において定義される配列と比較される、請求項７に記載の方法。
9. 前記ｈｐ−１突然変異体の存在がその中に検出されている植物が、リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）種である、請求項７に記載の方法。
10. ゲノムＤＮＡを植物から単離する工程と、ＰＣＲ技術の使用により前記ゲノムＤＮＡから前記ｈｐ−１^ｗ突然変異を含有する遺伝子断片を増幅する工程と、前記ゲノムＤＮＡ中の前記ｈｐ−１^ｗ突然変異の存在を決定する工程と、を含む、植物におけるｈｐ−１^ｗ突然変異の存在を検出するための方法。
11. ピロシークエンス技術の使用により前記ｈｐ−１^ｗ突然変異の存在が決定され、前記技術から得られる配列データが、配列番号２において定義される配列と比較される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ｈｐ−１^ｗ突然変異体の存在がその中に検出されている植物が、リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）種である、請求項１０に記載の方法。
13. 採種におけるポストコントロールの手段としての、請求項７又は請求項１０のいずれかに記載の方法の使用。
14. 遺伝子型又は表現型選択手段のいずれかによりｈｐ−１又はｈｐ−１^ｗ突然変異以外の光形態形成突然変異の存在を検出することと、請求項７又は請求項１０に記載の方法を用いてｈｐ−１又はｈｐ−１^ｗ突然変異の存在を検出することと、を含む、突然変異のうちいずれか一つがｈｐ−１又はｈｐ−１^ｗ突然変異である、植物中の２つの異なる光形態形成突然変異の存在を調べるための方法。
15. 非ｈｐ−１、非ｈｐ−１^ｗ光形態形成突然変異の存在を調べるための前記表現型選択手段が、５００ｎｍ未満の波長を有する光を遮光する黄色プラスチックスクリーン下の温度調節チャンバー内で前記突然変異の存在が調べられている植物から得られる種子を発芽させることと、非黄化苗木を選択することと、を含む、請求項１４に記載の方法。
16. ａ）二重ヘテロ接合ｈｐ−１／＋ ｐ／＋ Ｆ_１植物を得るための、同型接合ｈｐ−１／ｈｐ−１系統又は植物の、同型接合ｐ／ｐ系統又は植物とのクロス交雑（ｃｒｏｓｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）工程と、
    ｂ）Ｆ_２種子を得るための、段階（ａ）で得られたＦ_１植物の自家交配工程と；
    ｃ）請求項７で定義した方法及び前記ｐ突然変異の存在を検出するための方法の適用による、二重同型接合植物ｈｐ−１／ｈｐ−１ ｐ／ｐの同定工程と；
    ｄ）Ｆ_３種子を生成させるための、段階（ｃ）で同定された二重同型接合植物の自家交配及び該種子の発芽工程と、
    を含む、遺伝子型ｈｐ−１／ｈｐ−１ ｐ／ｐ（ここでｐは、遺伝学的にｈｐ−１突然変異に連鎖しない何らかの劣性光形態形成リコピン促進突然変異を表す。）を有するリコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の二重突然変異系統を作出するための方法。
17. 突然変異ｐがｄｇ突然変異である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記方法の段階（ｃ）におけるｄｇ突然変異の存在の決定が、共に所有する、同時係属出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００２３で開示されたｄｇ突然変異に対するマーカーを使用して行われる、請求項１７に記載の方法。
19. ａ）二重ヘテロ接合ｈｐ−１^ｗ／＋ ｐ／＋ Ｆ_１植物を得るための、同型接合ｈｐ−１^ｗ／ｈｐ−１^ｗ系統又は植物の、同型接合ｐ／ｐ系統又は植物とのクロス交雑（ｃｒｏｓｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）工程と、
    ｂ）Ｆ_２種子を得るための、段階（ａ）で得られたＦ_１植物の自家交配工程と；
    ｃ）請求項１０で定義した方法及び前記ｐ突然変異の存在を検出するための方法の適用による、二重同型接合植物ｈｐ−１^ｗ／ｈｐ−１^ｗ ｐ／ｐの同定工程と；
    ｄ）Ｆ_３種子を生成させるための、段階（ｃ）で同定された二重同型接合植物の自家交配及び該種子の発芽工程と、
    含む、遺伝子型ｈｐ−１^ｗ／ｈｐ−１^ｗ ｐ／ｐ（ここでｐは、遺伝学的にｈｐ−１^ｗ突然変異に連鎖しない何らかの劣性光形態形成リコピン促進突然変異を表す。）を有するリコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の二重突然変異系統を作出するための、方法。
20. 突然変異ｐがｄｇ突然変異である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記方法の工程（ｃ）におけるｄｇ突然変異の存在の決定が、共に所有する、同時係属出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／０００２３で開示されたｄｇ突然変異に対するマーカーを使用して行われる、請求項２０に記載の方法。

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