JP2007511585A - アルキルホスファチジルコリン配合ワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１つのワクチン抗原を含む医薬組成物に関する。本発明の組成物は、式Ｉ［式中、Ｒ₁は低級アルキルであり、Ｒ₂およびＲ₃は同一であるかまたは異なっており、それぞれ、炭素原子１３〜２１個を有する線状炭化水素鎖を表すことができる］で示される構造を有する少なくとも１つのホスファチジルコリンのリン酸エステル誘導体を含むことを特徴とする。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、ワクチンの分野、より詳しくは、アジュバント添加ワクチンに関する。特に、本発明は、少なくとも１つのワクチン抗原および少なくとも１つのホスファチジルコリンのリン酸エステル誘導体を含む医薬組成物に関する。

従来技術によると、ワクチン中に存在する抗原によって誘発される免疫応答をアジュバントによって増強するかまたは方向付ける方法が知られている。単独で投与された抗原は特にその純度が非常に高いために十分に免疫原性ではないので、または、ワクチン中に存在する抗原の量またはブースターの投与回数を減少させることは望ましいので、または、ワクチンによって与えられる保護の期間を延長させることは望ましいので、この方法は望ましい。しばしば、それは、誘発される応答の定量的改善ではなく、定性的改善の問題である。

従来技術にはアジュバントとして使用され得る多数の提案された生成物があるが、ヒトの医薬における製造承認の対象であるアジュバント添加ワクチンのほとんどがアルミニウム塩またはエマルションによってアジュバント添加されていることが知られている。

現在、全く安全な投与の質を保持すると同時に免疫応答を改善することができる特性をもつ新規アジュバントの入手が実際に必要とされている。

また、トランスフェクションの分野である別の技術分野では、現在の技術水準では陽イオン性脂質の使用が提案されている。かくして、例えば、“Modulation of Cellular Immune Response Against Hepatitis C Virus Nonstructural Protein 3 by Cationic Liposome Encapsulated DNA Immunization”という題の刊行物では、リポソームを構成するいくつかの陽イオン性脂質を、目的のプラスミドＤＮＡを細胞にトランスポートするそれらの能力について試験している。該トランスフェクトＤＮＡは免疫系応答が望まれる抗原をコードするので、この刊行物はワクチン分野において価値あるものである。それらが該免疫系の良好な反応であるためには、まず第一に、抗原が発現されること、したがって、ＤＮＡが最良の条件下にてそれを発現する能力を有する細胞に「送達」されることが必要である。ＤＮＡに対して「トランスポーター」として作用するトランスフェクション剤が果たす役割は、医薬組成物中に存在するワクチン抗原に付随するアジュバントが果たす役割と異なる。この刊行物の著者によって得られた結果は、ＤＮＡが「そのままで（naked）」注入された場合よりもＤＮＡがリポソームによってトランスポートされた場合の方が得られた応答が大きいことを示している；しかしながら、リポソームの形成に用いる脂質の性質に依存して、得られる応答は性質および強度が変化する。

アジュバントとして使用することができる種々の生成物について数多くの文献があるにもかかわらず、投与される生物に対する危険を全く伴わずに用いることができ、投与するワクチン抗原に関する免疫系の応答を増強および／または改善することができる生成物が依然として必要とされている。

本発明の目的の１つはかかる生成物を提供することである。
本発明の別の目的は、原価が法外に高くならずにワクチン組成物に加えることができるような費用の、容易に入手可能なワクチンアジュバントを提供することである。

これらの目的を達成するために、本発明の主題は、構造：

［式中、
Ｒ₁は低級アルキルであり、
Ｒ₂およびＲ₃は同一であるかまたは異なっており、それぞれ、炭素原子１３〜２１個を有する線状炭化水素鎖を表すことができる］
を有する少なくとも１つのホスファチジルコリンのリン酸エステル誘導体を含むことを特徴とする、少なくとも１つのワクチン抗原を含む医薬組成物である。

特定の実施態様によると、Ｒ₁はエチル基を表す；かくして、投与された生物中でのこの誘導体の分解によって、生体適合性生成物であるホスファチジルコリンおよびエタノールが生産されるであろう。

本発明の特定の実施態様によると、Ｒ₂およびＲ₃は、以下の脂肪酸：ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸に由来する基から選択される。

特に有利な実施態様によると、Ｒ₂およびＲ₃は同一であり、オレイン酸基を表す。化学合成によって全体的に製造することができるかかる生成物は、医薬用途に望まれる安全性および再現性の全ての保証を提供する。

本発明の主題は、また、ワクチンアジュバントを調製するための、構造：

［式中、
Ｒ₁は低級アルキルであり、
Ｒ₂およびＲ₃は同一であるかまたは異なっており、それぞれ、炭素原子１３〜２１個を有する線状炭化水素鎖を表すことができる］
を有するホスファチジルコリンのリン酸エステル誘導体の使用である。

本発明の主題は、また、少なくとも１つのワクチン抗原が哺乳動物に投与され、構造：

［式中、
Ｒ₁は低級アルキルであり、
Ｒ₂およびＲ₃は同一であるかまたは異なっており、それぞれ、炭素原子１３〜２１個を有する線状炭化水素鎖を表すことができる］
を有するホスファチジルコリンのリン酸エステル誘導体もまた該哺乳動物に投与される、哺乳動物を免疫化する方法である。

かくして、該免疫系の応答は、ワクチン抗原をホスファチジルコリン誘導体なしで投与した場合に得られる応答と比べて改善される。

以下の詳細な記載を読むと、本発明の他の多くの利点が明らかになるであろう。

本発明は、少なくとも１つのワクチン抗原を含む医薬組成物に関する。「ワクチン抗原」なる用語は、ヒトまたは動物に投与された場合に免疫系の応答を誘発する能力を有する抗原を意味するものである。この免疫系の応答は、抗体の産生またはある種の細胞（特に、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球）の活性化を引き起こすことができる。
当該医薬組成物は、予防目的または治療目的またはその両方の組成物であり得る。

ワクチンのために慣用的に用いられているかまたは推奨されるいずれもの経路（非経口経路、粘膜経路）を介して投与され得、種々の形態のもの（注射可能またはスプレー可能な液体、凍結乾燥したかまたは噴霧化によって乾燥したかまたは風乾した処方物など）であり得る。それは、筋肉注射、皮下注射または皮内注射用の注射器または無針注射器によって投与することができる。それはまた、粘膜が鼻、肺、膣または直腸のいずれのものであるかにかかわらず、乾燥散剤または液体スプレー剤を粘膜に送達する能力を有するネブライザーによって投与することもできる。本発明の医薬組成物において使用されるワクチン抗原は、「直接」抗原である。すなわち、それらは、これらの抗原をコードするＤＮＡでなく、抗原自体である；それらは、全微生物であってもこの微生物のほんの一部であってもよい；かくして、ワクチンにおいて慣用的に使用される抗原としては以下のものが挙げられる：
多糖類（単独であるかまたは担体タンパク質のような担体要素と結合しているかにかかわらない）、
生弱毒全微生物、
不活化微生物、
組換えペプチドおよびタンパク質、
糖タンパク質、糖脂質、リポペプチド、
合成ペプチド、
「スプリット」ワクチンといわれるワクチンの場合の破断微生物。

これらの抗原は、例えばジフテリア、テタヌス、ポリオ、狂犬病、百日咳、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎、黄熱病、腸チフス、水痘、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、日本脳炎、髄膜炎、肺炎球菌性感染症、ロタウイルス感染症、ＡＩＤＳ、癌、結核、ライム病、ＲＳＶ感染症、ヘルペス、クラミジア（Chlamydia）、ナイセリア・ゴノレア（Nisseria gonorrheae）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）もしくはヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenza）・タイプＢによって引き起こされる細菌性疾患、マラリア、リーシュマニア症、リステリア症などのような種々の疾患の治療または予防に用いられるかまたは用いることができる抗原である。

本発明の医薬組成物は、単一の病原体または癌に対する免疫化を意図する組成物であってよく、すなわち、それは単一の病原体または癌の１つまたはそれ以上の抗原を含むか、または、それは、いくつかの病原体または癌に対する免疫化を意図する組成物であってよい（これは、以下、混合ワクチンと記す）。

使用されるホスファチジルコリンのリン酸エステル誘導体の作用は、かかる化合物の不在下にて得られる応答と比べて、ワクチン組成物を補助すること、すなわち、ワクチン組成物を投与される生物の免疫系応答を増強または改善することである。特に、体液性応答または細胞性応答またはその両方の増強がある。該作用は、応答の増強ではなく、誘発される応答の異なる方向付けであってもよい；例えば、体液性応答よりもむしろ細胞性応答へ方向付けること、他のサイトカインよりもむしろある種のサイトカインの生産へ方向付けること、他の抗体よりもむしろある種のタイプまたはサブタイプの抗体の生産へ方向付けること、他の細胞よりもむしろある種の細胞の刺激へ方向付けることなどである。該アジュバントの作用はまた、経時的に免疫応答の期間を増大させることにもあり得る。それはまた、免疫化される個体が保護を得るのに要する投与の回数を減少させること、または、投与量に含まれる抗原の量を減少させることができることも含み得る。

本発明に係る誘導体および抗原を投与する場合に該誘導体を医薬組成物の抗原と組み合わせる場合、すなわち、該誘導体が医薬組成物中に直接存在する場合、または免疫原力の改善が望まれる抗原とは別々に該誘導体が投与される場合のいずれでも、該誘導体のアジュバント作用を得ることができる。しかしながら、投与しようとする抗原と同一の医薬組成物中にて該誘導体を使用することが好ましい。本発明において、「ホスファチジルコリン」なる用語は、グリセロール１分子、２つの脂肪酸、ホスフェート基およびコリンからなるリン脂質を意味するものである。レシチンとも称されるこれらの化合物は、その脂肪酸によって様々である。

本発明の都合上、２つの脂肪酸Ｒ₂およびＲ₃は、同一であっても異なっていてもよく、飽和であっても不飽和であってもよい；好ましくは、少なくとも１３個の炭素原子を有する脂肪酸（特に、以下の酸：ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸またはオレイン酸）のエステル化に由来するホスファチジルコリンが使用される。

「低級アルキル基Ｒ₁」なる用語は、最大限５個の炭素原子を有するアルキル基を意味するものである。詳しくは、本発明によると、ホスファチジルコリン誘導体は、ホスファチジルコリンのリン酸エステルである；それは、ホスファチジルコリンとメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールまたはペンタノールとの反応に由来するエステルであってよく；エタノールに由来するエステルの場合に特に良好な結果が得られた。

本発明に適した化合物は、完全な化学合成によって、または、大豆もしくは卵から抽出したホスファチジルコリンのような天然ホスファチジルコリンのエステル化によって得ることができる。これらは、医薬上許容される塩の形態、特にクロライド形態で使用することができる化合物である。特に適当な化合物としては、特にAvanti^R Polar Lipids Inc.から入手可能な、１,２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン、１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン、１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン、１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンまたは１,２−パルミトイルオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンが挙げられる。これらの化合物は、粉末の形態またはクロロホルム中溶液で入手可能である。

本発明によると、当該化合物を水または水性バッファー中に分散させて懸濁液を形成し、次いで、ワクチン抗原を含む溶液と混合するか、または、ホスファチジルコリンのリン酸エステル誘導体を含有する該懸濁液を使用して、ワクチン抗原を含む凍結乾燥物を溶解する。別法として、ホスファチジルコリンのエステル誘導体を、既に少なくとも１つのワクチン抗原を含んでいる水またはバッファーで分散させるかまたは水和させることができる。

次いで、使用されたホスファチジルコリンのリン酸エステル誘導体は、脂質小胞またはリポソームを形成することができ、その大きさは、有利には、５０〜２２０ｎｍである。

エマルションを含む組成物中にて該本発明に係るアジュバントを使用することもできる。

以下の実施例は、本発明の実施の例を非限定的に説明する。

実施例１： 抗原としてＴＡＴタンパク質を有するワクチン組成物
１.１． 組成物の調製
ＡＩＤＳに対するワクチンにて使用することができる組換えタンパク質をワクチン抗原として含むワクチン組成物を調製する；それは、WO 99/33346（そこでは「カルボキシメチル化Ｔａｔ」なる用語の下に同定されている）に記載されているようにイー・コリ（E. coli）中での発現および種々のクロマトグラフィー工程による精製、次いで、化学的不活化によって得られる、解毒したＴＡＴ ＩＩＩ Ｂタンパク質である。

以下のとおり組成物を調製する。
Avanti^R Polar Lipids Inc.により供給される粉末状の１,２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチルＰＣ）クロライドを準備し、クロロホルム／メタノール（４／１）混合物に可溶化して２ｍｇ／ｍＬの濃度を得る。

得られた溶液３.１８ｍＬ、すなわち、エチルＰＣ６.３６ｍｇをガラス製丸底フラスコに入れる；該丸底フラスコの壁に均一な脂質フィルムが得られるまでロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去する。次いで、このフィルムを高真空下にて乾燥させて残留溶媒を完全に除去する。
次いで、超音波浴を使用して該フィルムを４０℃の蒸留水４ｍｌで再度水和する。窒素圧下、５０℃に温度調節した押出器（Lipex Biomembranes, Inc.）に取り付けた数枚のポリカーボネート膜（０.８μｍ；０.４μｍおよび０.２μｍ）を介して、得られた小胞の分散体を押し出す。

得られた１.５９ｍｇ／ｍＬの濃度のリポソーム懸濁液と、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＲＩＳ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４からなるバッファー中の２００μｇ／ｍＬの濃Ｔａｔ溶液とを等量混合する。
アジュバントを含まずにＴＡＴ抗原だけを含む組成物もまた調製する。
以下の組成をもつ用量２００μｌが得られる：
１） ＴＡＴ ２０μｇ
２） ＴＡＴ ２０μｇおよびエチルＰＣ １５９μｇ

１.２． 免疫化
８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹ずつの２つのグループにパラグラフ１.１で調製した組成物の１つをマウス１匹につき１回の用量２００μｌで皮下注射する；該注射は、０日目および２１日目に行う。
一次応答を評価するために１４日目に、また、二次応答については３５日目に、眼窩後洞から血液試料を採取する。標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して、特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価を測定する。
３７日目にマウスを屠殺する；その脾臓を取り出し、脾細胞を単離する。

体液性応答に関して得られた結果を下記表にまとめて記載する。表中、ＩｇＧ力価は任意のＥＬＩＳＡ単位（log１０）で表される。
各グループのマウスについて、示された値は、各マウスについて得られた値の幾何平均力価である。

得られた結果は、本発明の組成物が、抗原を単独で投与した場合に得られる体液性応答よりも明らかに大きい体液性応答を得ることができることを示している。
どちらかと言えばＴＨ１型応答へ方向付けられる免疫応答を示しているＩｇＧ２ａ応答に関してアジュバント効果が全く明らかであることが観察される。

細胞性応答に対する本発明の医薬組成物の効果を評価するために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、γ−インターフェロンを生産する能力を有する脾細胞を計数する。このアッセイは、新鮮な細胞および再刺激した細胞のどちらについても行う。
該アッセイを行うために、培地単独または組換えＴＡＴ抗原のどちらかの存在下にて、脾細胞を１ウェル当たり２００,０００細胞の割合で細胞培養プレートにて培養する。１６時間培養した後、ＥＬＩＳＰＯＴを展開する。すなわち、γ−インターフェロンを分泌する細胞に対応するスポットの数を計数する。得られた結果を下記表にまとめて記載する；示された値は、組換えＴＡＴを有するウェル中の細胞１００万個につき計数したスポットの数と培地だけを有するウェル中の細胞１００万個につき計数したスポットの数との差（各マウスについて算出した）の平均値（１グループのマウス当たり）である。
下記表は新鮮な細胞について得られた結果をまとめて示す。

下記表は、ＩＬ２の存在下にて組換えＴＡＴで再刺激した細胞について得られた結果をまとめて示す。

これらの結果は、本発明の医薬組成物を用いて得られた、ＣＤ４＋細胞の刺激に対する正の効果を示している。

２．抗原としてサイトメガロウイルス糖タンパク質ｇＢを有するワクチン組成物
２.１． 組成物の調製
ｇＢと称されるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）Ｔｏｗｎｅ株のエンベロープ糖タンパク質に由来する組換えタンパク質をワクチン抗原として含むワクチン組成物を調製する。該組換えタンパク質のヌクレオチド配列およびタンパク質配列は米国特許第5,834,307号に記載されている。この組換えタンパク質は、修飾ｇＢ遺伝子を含有するｐＰＲｇＢ２７ｃｌｖ４と称されるプラスミドを導入した組換えＣＨＯ系によって産生される。実際、ＣＨＯ系によるこの組換えタンパク質の生産を促進するために、該ｇＢ遺伝子は前もって、バリン６７７７とアルギニン７５２との間のアミノ酸配列に相当するｇＢタンパク質の膜貫通領域をコードする遺伝子の一部を除去することおよび天然ｇＢの既存の切断部位が除去されるように３つの点変異を導入することによって修飾した。実際、組換えＣＨＯ系によって産生された組換えタンパク質は、ｇＢｄＴＭと称される、切断部位および膜貫通領域を欠いている短縮型ｇＢタンパク質に相当する。
プラスミドｐＰＲｇＢ２７ｃｌｖ４の構築および組換えＣＨＯ系による短縮型ｇＢタンパク質（ｇＢｄＴＭ）の産生は、米国特許第6,100,064号に記載されている。短縮型ｇＢタンパク質の精製は、L. Rasmussen et al.（J. Virol. (1985) 55: 274-280）によって記載された１５Ｄ８モノクローナル抗体を使用してイムノアフィニティークロマトグラフィーカラムにて行われる。

Avanti^R Polar Lipids Inc.によって供給される粉末状の１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチルＤＳＰＣ）クロリドおよび１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチルＤＯＰＣ）クロリドを準備する。この生成物のそれぞれについて、以下の操作を行う：
粉末５ｍｇをクロロホルム／メタノール（４：１（容量／容量））５ｍｌに可溶化する。該溶液をガラス製丸底フラスコ中にてロータリーエバポレーターにより乾燥させて丸底フラスコの壁に脂質フィルムを得る。次いで、このフィルムを高真空下にて乾燥させて残留溶媒を完全に除去し、次いで、最終濃度２ｍｇ／ｍｌになるように６０℃の水２.５ｍｌに溶解する。得られたリポソーム懸濁液を１０分間のボルテックスおよび超音波浴中にて５分間の超音波処理によってホモジナイズし、次いで、５０℃に温度調節したＬｉｐｅｘ押出器（Northern Lipids Inc.、カナダ国バンクーバー）によって０.２μｍの多孔をもつポリカーボネート膜を介して５回押し出す。

エマルション中エチルＰＣを含む処方物を調製する。
このために、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンクロリド（エチルＤＯＰＣ；Avanti Polar Lipids）２５ｍｇをガラス製丸底フラスコ中にてクロロホルム／メタノール（４：１（容量／容量））１０ｍｌによって可溶化する。得られた溶液をロータリーエバポレーターによって乾燥させて丸底フラスコの壁に脂質フィルムを得る。次いで、このフィルムを高真空下にて乾燥させて残留溶媒を完全に除去する。
Merckによって提供されるプラントＴｗｅｅｎ^R ８０ ３７５ｍｇをビーカー中に計り取り、それに水２９.２９ｇを加え、該界面活性剤が完全に溶解してしまうまで該混合物を撹拌する。
次いで、上記工程で得られた脂質フィルムをこのＴｗｅｅｎ^R ８０溶液と混合する。この懸濁液にスクアレン（Fluka）１４７５ｍｇを添加し、得られるエマルションをＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（８０００〜９５００ｒｐｍ）でホモジナイズし、次いで、Ｍ１１０マイクロフルイダイザー（Microfluidics、マサチューセッツ州ニュートン）で６０ｐｓｉにて２０回ホモジナイズする。
このエマルション中のスクアレンの最終濃度は５％である。

上記アジュバント処方物または水とｇＢタンパク質１６０μｇ／ｍｌの抗原貯蔵水溶液およびＰＢＳバッファーとを混合することによって免疫化用量を調製して、以下の組成を有する用量５０μｌを得る。
１） ｇＢ ２μｇ
２） ｇＢ ２μｇおよびエチルＤＯＰＣ ５０μｇ
３） ｇＢ ２μｇおよびエチルＤＳＰＣ ５０μｇ
４） ｇＢ ２μｇ、エチルＤＯＰＣ ５０μｇ、スクアレン１.２５ｍｇおよびＴｗｅｅｎ^R ８０ ０.３ｍｇ

２.２． 免疫化
８週齢の雌性ＯＦ１非近親交配マウス８匹ずつの４つのグループにパラグラフ２.１で調製した組成物の１つをマウス１匹につき１回の用量５０μｌで皮下注射する；該注射は、０日目および２１日目に行う。
一次応答を評価するために２０日目に、また、二次応答については３４日目に、眼窩後洞から血液試料を採取する。標準的なＥＬＩＳＡアッセイによって特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価を測定する。
３７日目にマウスを屠殺する；その脾臓を取り出し、脾細胞を単離し、組換えｇＢタンパク質で刺激するか、または刺激しない。
次いで、ｇＢタンパク質で５日間刺激した脾細胞からの上清中および非刺激細胞からの上清中のサイトカイン（ＩＬ５、γ−ＩＦＮおよびＴＮＦ−α）の濃度をＥＬＩＳＡアッセイによって測定して、比較によりサイトカインの特異的生産を推定する。

体液性応答に関して得られた結果を下記表にまとめて記載する。表中、ＩｇＧ力価は任意のＥＬＩＳＡ単位（log１０）で表される。
各グループのマウスについて、示された値は、各マウスについて得られた値の幾何平均力価である。

サイトカインについての結果を下記表に示す；各サイトカインについて示された値は、ｇＢタンパク質で刺激した細胞について測定されたサイトカインの量の平均と培地単独中にて培養した細胞について測定されたサイトカインの量の平均（該アッセイのバックグラウンドノイズであると考えられる）との差（ｐｇ／ｍｌ）である；したがって、示された量は、ｇＢタンパク質による刺激に応答して特異的に生産された量であると考えられ得る。

このアッセイで得られた結果は全て、ホスファチジルコリンのリン酸エステルの良好なアジュバント効果を示しており、抗原によって既に誘発されているＴｈ２型応答を阻害することなく大きいＴｈ１型免疫応答増強（ＩｇＧ２ａおよびγ−インターフェロンの増加）能力を有する。

３．皮内投与されるワクチン組成物
３.１． 組成物の調製
Avanti^R Polar Lipids Inc.によって供給される粉末状の１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチルＤＯＰＣ）クロリドを準備し、その５ｍｇをクロロホルム／メタノール（４：１（容量／容量））１０ｍｌに可溶化する。得られた溶液をガラス製丸底フラスコ中にてロータリーエバポレーターによって乾燥させて丸底フラスコの壁に脂質フィルムを得る。次いで、このフィルムを高真空下にて乾燥させて残留溶媒を完全に除去し、次いで、最終濃度２ｍｇ／ｍｌになるように６０℃の水２.５ｍｌと混合する。得られたリポソーム懸濁液を１０分間のボルテックスおよび超音波浴中にて５分間の超音波処理によってホモジナイズし、次いで、５０℃に温度調節したＬｉｐｅｘ押出器（Northern Lipids Inc.、カナダ国バンクーバー）によって０.８μｍポリカーボネート膜を介して１回、次いで、０.４μｍポリカーボネート膜を介して１回、最後に、０.２μｍの多孔をもつポリカーボネート膜を介して５回押し出す。

上記実施例に記載したようにして得られる１６０μｇ／ｍｌの濃度のｇＢタンパク質からなる抗原貯蔵溶液を調製する。

用量５０μｌ当たり以下の組成を有する実験ワクチンを得るように算出した割合で、抗原溶液を２ｍｇ／ｍｌのアジュバント懸濁液と混合する。
１） ｇＢ ２μｇ
２） ｇＢ ２μｇおよびエチルＤＯＰＣ ５０μｇ
３） ｇＢ ０.２μｇ
４） ｇＢ ０.２μｇおよびエチルＤＯＰＣ ５０μｇ

３.２． 免疫化
８週齢ＯＦ１マウス８匹ずつの４つのグループを準備する。
各グループのマウスに上記した４つの処方物の１つを皮内投与する。
０日目および２０日目に免疫化を行う。
一次応答を評価するために２０日目の２回目の免疫化前に、また、二次応答については３５日目に、眼窩後洞から血液試料を採取する。
標準的なＥＬＩＳＡアッセイによって、特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価を測定する。
３５日目にマウスを屠殺する；その脾臓を取り出し、脾細胞を単離し、組換えｇＢタンパク質で刺激するか、または、刺激しない。
ｇＢタンパク質で５日間刺激した脾細胞からの上清中および非刺激細胞からの上清中のサイトカイン（ＩＬ５、γ−ＩＦＮおよびＴＮＦ−α）の濃度をＥＬＩＳＡアッセイによって測定して、比較によりサイトカインの特異的生産を推定する。
体液性応答に関して得られた結果を下記表にまとめて記載する。表中、ＩｇＧ力価は任意のＥＬＩＳＡ単位（log１０）で表される。
各グループのマウスについて、示された値は、各マウスについて得られた値の幾何平均力価である。

サイトカインについての結果を下記表に示す；各サイトカインについての示された値は、ｇＢタンパク質で刺激した細胞について測定されたサイトカインの量の平均と培地単独中にて培養した細胞について測定されたサイトカインの量の平均（該アッセイのバックグラウンドノイズであると考えられる）との差（ｐｇ／ｍｌ）である；したがって、示された量は、ｇＢタンパク質による刺激に応答して特異的に生産された量であると考えられ得る。

このアッセイでは、本発明のアジュバントが皮内的に使用された場合に有効であること、および、同じ量の抗原に対する免疫応答を増強することができたり、注射した用量中に存在する抗原の量を減少させることができたりすることがわかる。
ここで、アジュバント効果は、Ｔｈ２型応答（ＩｇＧ１）に関して明白であるだけでなく、Ｔｈ１型応答（ＩｇＧ２ａ、γ−インターフェロン）に関して非常に明白である。

４． ＳＡＲＳ抗原を有するワクチン組成物
４.１． 組成物の調製
細胞系にて培養し、次いで、不活化することにより得られる、不活化ヒトコロナウイルス（この場合は、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）ウイルス）のウイルス懸濁液を調製する；使用した懸濁液は、不活化前の濃度が７.５６logＣＣＩＤ₅₀である；１０倍希釈して６.５６logＣＣＩＤ₅₀の濃度を有する懸濁液を得る。

Avanti^R Polar Lipids Inc.によって供給される粉末状の１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチルＤＯＰＣ）クロリドを準備し、その３０ｍｇをクロロホルム／メタノール（４：１（容量／容量））１０ｍｌに可溶化する。得られた溶液をガラス製丸底フラスコ中にてロータリーエバポレーターによって乾燥させて丸底フラスコの壁に脂質フィルムを得る。次いで、このフィルムを高真空下にて乾燥させて残留溶媒を完全に除去し、次いで、最終濃度６ｍｇ／ｍｌになるように６０℃の水５ｍｌと混合する。得られたリポソーム懸濁液を、１０分間のボルテックスおよび超音波浴中にて５分間の超音波処理によってホモジナイズし、次いで、５０℃に温度調節したＬｉｐｅｘ押出器（Northern Lipids Inc.、カナダ国バンクーバー）によって０.２μｍの多孔をもつポリカーボネート膜を介して５回押し出す。

下記表に示される混合を行うことによって２００μｌの免疫化用量を調製する。

４.２． 免疫化
ＢＡＬＢ／ｃマウス８匹ずつの４つのグループを準備し、上記処方物のうちの１つで３週間おきに免疫化する；注射は皮下投与する；注射した用量は毎回２００μｌである。
ＥＬＩＳＡアッセイによって抗全（不活化）ＳＡＲＳウイルス抗体応答を評価するために、各注射の２週間後に、すなわち、一次応答については１４日目に、二次応答については３３日目に、血液試料を採取する。
３３日目に脾細胞を取り出す。
エキソビボの、または不活化全ウイルスで７日間インビトロ刺激した後の、γ−インターフェロンを分泌する細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってＳＡＲＳ特異的細胞性応答を評価する。ケースごとに、脾細胞（エキソビボの、またはインビトロで再刺激した）を不活化全ウイルスまたはプールした１８量体ペプチドと一緒に１６時間インキュベートする。これらのペプチドの配列は重複しており（１０アミノ酸にわたる）、種々のＳＡＲＳウイルス抗原に対応する。
さらに、全不活化ウイルスまたはペプチドのプールで刺激した脾細胞によって分泌されたサイトカインのＥＬＩＳＡアッセイによって、誘発されたＴヘルパー細胞性応答の分極を評価する。

体液性応答に関して得られた結果を下記表に示す；結果は、ＥＬＩＳＡアッセイの任意の単位log１０で表され、各グループのマウスについての幾何平均力価を表す。

これらの結果は、本発明のアジュバントが、ウイルス抗原に対する体液性応答を増強することができることを示している。

細胞性応答に関して、全ウイルスで刺激した（エキソビボで）新鮮な細胞について行われたＥＬＩＳＰＯＴカウントにて得られた結果を下記表に示す。この表は各グループのマウスについての幾何平均を示す。

ペプチドプールに応答して得られた結果に関して、応答は使用したペプチドプールにより異なる。

不活化ＳＡＲＳウイルスでの再刺激後に得られたＥＬＩＳＰＯＴ結果もまた、使用したペプチドのいくつかに応答してγ−インターフェロンの生産がエチルＤＯＰＣの存在下で増加したことを示していた。

これらの結果は、本発明のアジュバントがウイルス抗原に対するＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を増強することができることを示している。

γ−ＩＦＮ（Ｔｈ１サイトカイン）およびＩＬ−５（Ｔｈ２サイトカイン）のサイトカインについてのＥＬＩＳＡアッセイに関して、不活化ウイルスでの刺激の後、γ−ＩＦＮの生産は、抗原に加えてエチルＤＯＰＣを投与したマウスについてかなり増加したこと；他方、ＩＬ−５の生産は明らかには変わらなかったことがわかった。

得られた結果を下記表に示す；結果はｐｇ／ｍｌで表され、グループのマウスの幾何平均を表す。

これらの結果は、本発明のアジュバントがＴｈ１型細胞性応答を増強することができることを示している。

これらの結果は全て、本発明のアジュバントが、不活化ウイルスからなる抗原を投与した場合に誘発される細胞性（Ｔｈ１）免疫応答および体液性免疫応答のどちらも有意に増強することができることを示している。

Claims (10)

1. 構造：
   

   

   ［式中、
   Ｒ₁は低級アルキルであり、
   Ｒ₂およびＲ₃は同一であるかまたは異なっており、それぞれ、炭素原子１３〜２１個を有する線状炭化水素鎖を表すことができる］
   を有する少なくとも１つのホスファチジルコリンのリン酸エステル誘導体を含むことを特徴とする、少なくとも１つの直接ワクチン抗原を含む医薬組成物。
2. Ｒ₁がエチル基を表すことを特徴とする、請求項１記載の組成物。
3. Ｒ₂およびＲ₃が以下の脂肪酸：ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸に由来する基から選択されることを特徴とする、請求項１または２記載の組成物。
4. Ｒ₂およびＲ₃が同一であり、オレイン酸基を表すことを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項記載の組成物。
5. エマルションも含むことを特徴とする、請求項１〜４いずれか１項記載の組成物。
6. ワクチンアジュバントを調製するための、構造：
   

   

   ［式中、
   Ｒ₁は低級アルキルであり、
   Ｒ₂およびＲ₃は同一であるかまたは異なっており、それぞれ、炭素原子１３〜２１個を有する線状炭化水素鎖を表すことができる］
   を有するホスファチジルコリンの誘導体の使用。
7. Ｒ₁がエチル基を表すことを特徴とする、請求項６記載の使用。
8. Ｒ₂およびＲ₃が以下の脂肪酸：ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸に由来する基から選択されることを特徴とする、請求項６または７記載の使用。
9. Ｒ₂およびＲ₃が同一であり、オレイン酸基を表すことを特徴とする、請求項６〜８いずれか１項記載の使用。
10. 少なくとも１つの直接ワクチン抗原が哺乳動物に投与され、構造：
    

    

    ［式中、
    Ｒ₁は低級アルキルであり、
    Ｒ₂およびＲ₃は同一であるかまたは異なっており、それぞれ、炭素原子１３〜２１個を有する線状炭化水素鎖を表すことができる］
    を有するホスファチジルコリンのリン酸エステル誘導体もまた該哺乳動物に投与される、哺乳動物を免疫化する方法。