JP2007167060A

JP2007167060A - ヒト光老化モデル皮膚

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Publication number: JP2007167060A
Application number: JP2006166376A
Authority: JP
Inventors: Teru Yatani; 輝八谷; Tsutomu Fujimura; 努藤村
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2006-06-15
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2026-06-15
Also published as: JP5072268B2; US7642402B2; US20070143866A1

Abstract

【課題】化粧料等の光老化予防及び改善効果を評価するために有用なヒト光老化モデル皮膚、モデル動物及びそれらの作成方法の提供。
【解決手段】ヒト皮膚を移植した免疫不全非ヒト動物の当該移植皮膚に、８０〜１００ｍＪ／ｃｍ^２のＢ波長紫外線を４〜８週間連続照射し、照射後少なくとも３週間放置することを特徴とするヒト光老化皮膚モデルの作成方法、当該方法により作成されたヒト光老化モデル皮膚、モデル動物。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトの光老化皮膚を備えたヒト光老化モデル皮膚、モデル動物及びそれらの作成方法に関する。

人間の皮膚は年齢と共にしわやたるみを生じ老化する。特に顔面や首筋、肩など太陽光のあたる部分の皮膚では、慢性的な紫外線の影響によりしわやたるみの形成やしみ、そばかすの形成が、他の光のあたらない部分と比較し顕著となる。同時に紫外線の影響により皮膚の弾力性の低下、皮膚の黒化、黄ばみの増加、角質水分量の減少なども誘導される。これら紫外線暴露部で起こる特異な皮膚老化の現象を光老化と呼んでいる。

従って、斯かる皮膚光老化のメカニズムを解明したり、光老化の悪影響、すなわちしわやしみ、そばかすの予防・改善に有用な化粧料、医薬品等を評価するためには、ヒトの光老化皮膚をより忠実に反映した光老化モデル皮膚の存在が有用となる。

光老化モデル皮膚やモデル動物の作成法としては、慢性的な紫外線へ暴露する系が最も汎用され、これまで、ヘアレスマウス背部皮膚やラットの足底の皮膚に紫外線を毎日、数週間連続照射する方法（非特許文献１、非特許文献２）や、in vitroではあるが３次元皮膚モデルに単回の紫外線を照射する方法（非特許文献３）が知られている。

また、ヒト皮膚を利用したモデルとしては、ヒト皮膚が移植されたヌードマウスに単回の紫外線照射を行う方法が知られているが（非特許文献４）、毎日、数週間連続照射するモデル系ではない。従って、この方法によっては、用いる皮膚はヒト由来ではあるが短期間での紫外線照射のため、移植されたヒトの皮膚に十分な光老化状態を引き起こすことはできないため、ヒト光老化モデル皮膚としては不十分である。

かように、ヒトの光老化皮膚をより忠実に反映したヒト光老化皮膚を持つヒトモデル皮膚やモデル動物はこれまでに得られていない。
Bissett DL, Hannon DP, Orr TV, Photochem Photobiol. 1987;46(3):367-78、 Imayama S, Nakamura K, Takeuchi M, Hori Y, Takema Y, Sakaino Y, Imokawa G, J Dermatol Sci. 1994 7(1):32-8 Nelson D, Gay RJ, Photochem Photobiol. 1993;57(5):830-7 Del Bino S, Vioux C, Rossio-Pasquier P, Jomard A, Demarchez M, Asselineau D, Bernerd F, Br J Dermatol. 2004;150(4):658-67

本発明は、化粧料、医薬部外品等の老化予防及び改善効果を評価するために有用なヒト光老化モデル皮膚、ヒト光老化モデル動物及びその作成方法を提供することに関する。

本発明者らは、ヒト皮膚移植動物における皮膚老化について検討したところ、移植皮膚に、特定量のＢ波長紫外線を４〜８週間連続照射し、少なくとも３週間放置することにより、光老化に極めて近いヒト光老化皮膚を備えたモデル動物を作成できることを見出した。

すなわち、本発明は、ヒト皮膚を移植した免疫不全非ヒト動物の当該移植皮膚に、８０〜１００ｍＪ／ｃｍ^２のＢ波長紫外線を４〜８週間連続照射し、照射後少なくとも３週間放置することを特徴とするヒト光老化モデル皮膚の作成方法に係るものである。

また本発明は、上記方法により作成されたヒト光老化モデル皮膚に係るものである。

また本発明は、上記方法により作成されたヒト光老化皮膚モデル動物に係るものである。

本発明の方法によれば、安定して皮膚老化状態を呈するヒト光老化モデル皮膚及びモデル動物が短期間で作成でき、これを用いることにより、ヒトの皮膚老化メカニズムの解明や皮膚老化防止・改善物質の評価をより正確に行うことが可能となる。

本発明のヒト光老化モデル皮膚の作成方法は、ヒト皮膚を移植した免疫不全動物の当該移植皮膚に、８０〜１００ｍＪ／ｃｍ^２のＢ波長紫外線を４〜８週間連続照射し、照射後少なくとも３週間放置するものである。

本発明において、ヒト光老化モデル皮膚とは、自然老化に極めて近い老化状態（例えば、しわ、たるみ、しみ、そばかす、皮膚の弾力性の低下、皮膚の黒化、黄ばみの増加、角質水分量の減少など）を呈するヒト光老化皮膚を備えたヒト光老化皮膚モデル動物における当該皮膚を意味する。

本発明の方法における動物は、免疫不全非ヒト動物が用いられ、例えばＳＣＩＤマウス、ＢＡＬＢｃＡ−ｎｕ／ｓｃｉｄ、Ｂ−１７／Ｉｃｒ−Ｓｃｉｄ等の免疫不全マウス、Ｆ３４４Ｊｃ１−ｒｎｕ等の免疫不全ラット等が挙げられ、紫外線の長期照射に耐えうるなどの点から、上記の免疫不全マウスを用いることが好ましい。
これらの動物は、ＳＰＦの環境下で１匹／１ケージの条件下で飼育することが好ましい。斯かる動物は、日本クレア株式会社やTaconic（NY）より入手可能である。

斯かる免疫不全非ヒト動物へ移植されるヒト皮膚としては、光があたっていない皮膚例えば、新生児の包皮や成人用由来のものであれば腹部皮膚を用いるのが好ましい。尚、当該皮膚は、割礼、美容整形手術により供給される皮膚、スキンセンターにより供給される死体皮膚を使用することができる。

当該ヒト皮膚は、２〜５mmの厚さで無菌的に採取し、動物に移植するまでの間は、適当な培養液、例えばL-グルタミンとantibiotic/antimycotic（Invitrogen, CA）を含むDMEM中で、２〜４℃に維持し、過密しない状態で保存するのが好ましい。

動物への皮膚移植は、公知の方法（Demarchez M, Hartmann DJ, Herbage D, Ville G, Dev Biol. 1987; 121(1): 119-29.）に準じて行えばよいが、例えば以下の方法により行うことができる。

動物をイソフルオラン／酸素（isofluorane/oxygen）やネンブタール等で麻酔後、その背部に２×２ｃｍ〜３×３ｃｍの皮膚の欠損部を作成する。この際、剃毛をしておくのが好ましい。その後、同様の大きさのヒト皮膚移植片を動物背部の皮膚欠損部に移植する。次いで、ナイロン系糸にて１０〜２０針縫合する。縫合後、移植皮膚とマウス皮膚の境界に局所麻酔薬、例えば「sensorcaine」（塩酸ブピバカイン）等を添加し、感覚脱脂失の処理を行うことが好ましい。
麻酔から覚めるまでの間、マウスは３７℃のインキュベーター内で維持される。

紫外線の照射は、移植皮膚の治癒が完了した後、すなわち移植から約１０週間程度経過した後に、開始するのが好ましい。

照射される紫外線は、２９０〜３２０ｎｍ領域のＢ波長紫外線であり、特に３０２ｎｍ付近にピークを持つものを使用するのが好ましい。

照射は、紫外線ランプと動物（移植皮膚）までの距離を、５〜８０ｃｍ、好ましくは３０〜５０ｃｍ程度とするのが紫外線の当たりむらを排除できる点は操作性の点からよい。

照射線量は、８０〜１００ｍＪ／ｃｍ^２とし、４〜８週間連続照射されるが、好ましくは６〜８週間である。

また、照射開始第１週〜第３週までは、１週間ごとに１０ｍＪ／ｃｍ^２ずつ増加し、第３週以降は１００ｍＪ／ｃｍ^２を維持するのが、紫外線の急性の影響を排除する点から好ましい。すわなち、紫外線照射開始第１週間目の照射線量は、８０ｍＪ／ｃｍ^２、第２週間目は９０ｍＪ／ｃｍ^２、第３週間目は１００ｍＪ／ｃｍ^２とし、照射開始第３週間目以降は１００ｍＪ／ｃｍ^２をとするのが好ましい。

尚、斯かる紫外線照射は、上記線量の紫外線を一日に１回の照射頻度で、一週間に５〜６回行なうのがよい。

上記のような条件で紫外線照射された、ヒト移植皮膚は、照射終了後３週間以上、好ましくは４週間以上の潜伏期間を経て老化状態を発現する。
従って、照射終了後少なくとも３週間、好ましくは３〜６週間放置するのが好ましい。

斯くして発現した老化状態は、図１に示すように、しわの形成等の光老化皮膚と極めて近似し、この状態は、8週間は持続する。また、当該皮膚においては、コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、コラーゲンVI、エラスチン（オキシタランファイバー）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）1、ＭＭＰ２、ＭＭＰ13、ケラチン６、ケラチン１２、ケラチン１６、フィラグリン、ロリクリン、インボルクリン等のタンパク質の発現増加あるいは低下といった光老化で皮膚に起こるタンパク質の発現変化を伴う。

斯くして得られた、本発明のヒト光老化モデル皮膚及びモデル動物は、ヒトの皮膚老化メカニズムの解明や皮膚老化防止・改善物質の評価、再生医療等に有用である。

１．皮膚移植方法
4-6週齢の免疫不全マウス（メス）に皮膚を移植した。実験の全期間を通して、マウスは無菌条件下で飼育された。皮膚を移植する直前に背部の毛を電気シェーバーを用いて除毛し、イソフルオラン／酸素（3%/0.8 liter）で麻酔した。移植手術中はイソフルオラン／酸素（2%/0.7 liter）の環境下で麻酔状態を維持した。マウス背部の皮膚を直径約2.0-3.0 cmの皮膚欠損（wound bed）が出来るように削除し、割礼により供給される包皮、美容整形手術により供給される皮膚、それからスキンセンターにより供給される死体皮膚を縫合し移植した。供給された皮膚は移植されるまでの間、L-グルタミンとantibiotic/antimycotic（Invitrogen, CA）を含むDMEM中で維持した（2-4℃）。縫合後、移植皮膚とマウス皮膚の境界にsensorcaineを添加し、感覚脱脂失の処理を行った。麻酔から覚めるまでの間、マウスは37℃ のインキュベーター内で維持した。

２．Ｂ波長紫外線（UVB）照射
UVBの照射は治癒が完了した少なくとも移植から10週間後に開始した。UVBのランプは302 nm の波長近くにピークを持つものを使用し、ランプから移植皮膚までの間隔は約30cmほどになるようにした。

移植皮膚の最小紅斑量（MED）が50〜80 mJ/cm²に相当することが明らかになったため、慢性的なUVBの照射は、80 mJ/cm²から開始することにした。週に5日間照射し、6週間連続照射を行った。3週目までは10 mJ/cm²ずつ照射量を上げていき、3週目から6週目までは100 mJ/cm²を維持した。照射中、マウスは100cm²の透明容器内を自由に動けるようにした。

３．老化皮膚状態の評価
（１）照射開始後、移植皮膚表面を、Charm View（登録商標；Moritex, Japan）により、反射した透過光を用いて肉眼にて観察すると共に、２週間毎にディジタル画像を撮影した。

（２）レプリカ剤を用いて当該移植皮膚のレプリカを作成し、得られたレプリカについて、以下に示す方法により粗さ解析を行った。

＜レプリカ粗さ解析＞
レプリカの作成は試験開始前、開始から2、4、10週目に行った。レプリカを作成する際も、イソフルオラン／酸素（2%/0.7 liter）の環境下で麻酔状態を維持した。
SILFLO（Flexico developments）で得られた移植皮膚のレプリカを、さらに別種のレプリカ剤（GC exafine）を用いて、極力平坦化されるように板などで圧力を加えることで得られたレプリカを解析対象とした。
レプリカの3次元形状をPRIMOS Compact（GF Messtechnik社）により測定した。計測後、フィルターにてうねりを除去した。

線粗さ解析は、得られたレプリカの長さ７−９mmの直線である解析線を引き、この部分の線粗さパラメーター数値を求めた。その際、極力シワに起因すると思われる以外の、疣などの形状を取りこまないようにした。面解析は先のレプリカの中央部分を４−５mm×７−９mm程度の長方形の範囲を指定し、その範囲内の面粗さ解析を行った。この際も極力疣などの形状を取りこまないように任意で範囲を選択した。

パラメーターとしては、Ra（算術平均粗）及びRz（十点平均粗さ）を用いて比較した。
Ra：算術平均粗さ
Rz：十点平均粗さ（最高の山から高い順に５番目までの山高さの平均と、最深の谷から深い順に５番目までの谷深さの和）

（３）遺伝子発現分析
移植された皮膚は最後にＵＶＢを照射してから２４時間後に採取した。トータルＲＮＡはTrizol 試薬 (Invitrogen, CA)で抽出し、RNeasy mini kit (Qiagen, CA)にて精製した。ＲＮＡサンプルの純度(28s/18s)はAligent bioanalyzerを用いて確認した。ビオチン標識された目的のｃＲＮＡはAffymetrix社のプロトコールに従って行った。簡単には、ダブルストランドｃＤＮＡをT7 (-dT) 24 プライマー 5’-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTAT AGGGAGGCGG-3’(配列番号１)及びSuperscript II reverse transcriptaseを用いて作製した。各サンプルからのｃＲＮＡはHuman Genome U133 plus 2.0 chip にハイブリダイズさせた。

４．結果
（１）外観
図１に、移植皮膚にＵＶＢを６週間照射後、４週間放置した時点（１０週時）での皮膚概観のコントロールとの比較を示した。図１から明らかなようにコントロールでは皮膚表面形状に大きな変化はないのに対し、ＵＶＢ照射した場合にはしわ様の線上の形状変化が観察され、増加していることが観察された（矢印）。

（２）レプリカ解析
図２に、包皮由来皮膚を用いた場合の、ＵＶＢ照射開始２、４週間後、及び６週間照射後４週間放置した時点（10週時）での皮膚レプリカの3次元粗さ解析結果のコントロールとの比較を示した。図２から明らかな様に、コントロールでは粗さパラメーターＲａ（算術平均粗さ）、Ｒｚ（10点平均粗さ）ともにほとんど変化は認められない、すなわち、皮膚表面の粗さに変化が認められないが、それに対しＵＶＢ照射した群では、ＵＶＢを６週間照射後４週間放置した時点（１０週時）でＲａ、Ｒｚ値に有意な増大が認められた。すなわち図１に示したしわ様の概観の凹凸変化が現れたことを示している。

図３に、腹部由来皮膚を用いた場合の、ＵＶＢ照射6週間照射後での皮膚レプリカの３次元粗さ解析結果のコントロールとの比較を示した。図３から明らかな様に、コントロールでは粗さパラメーターＲａ（算術平均粗さ）、Ｒｚ（10点平均粗さ）ともにほとんど変化は認められない、すなわち、皮膚表面の粗さに変化が認められないが、それに対し、ＵＶＢ照射した群では、ＵＶＢを 6週間照射した時点でＲａ、Ｒｚ値の増大が認められた。すなわち図１に示したしわ様の概観の凹凸変化が現れたことを示している。

（３）遺伝子発現プロフィール
ＲＮＡの精製度を確認の後、ＵＶＢ照射した腹部皮膚移植片での遺伝子発現プロファイルを、ＵＶＢを照射していないコントロール群を対照として作製した。コントロール群とＵＶＢを照射された群間のｍＲＮＡ転写物濃度の変化量を対数―対数プロットで示した。腹部皮膚移植片において、過剰発現した遺伝子としてケラチン６、ケラチン１６、ケラチン１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１、インボルクリン及びフィラグリンがあった。発現が抑制された遺伝子としてはコラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、コラーゲンVI及びＭＭＰ２があった。

移植皮膚にＵＶＢを6週間照射後、4週間放置した時点（10週時）での皮膚概観比較を示した図。ＵＶＢ照射開始２、４週間後、及び６週間照射後４週間放置した時点（１０週時）での皮膚レプリカの３次元粗さ解析結果を示したグラフ。腹部由来皮膚を用いた場合での、ＵＶＢ照射開始６週間後のレプリカの３次元粗さ解析結果を示したグラフ。

Claims

ヒト皮膚を移植した免疫不全非ヒト動物の当該移植皮膚に、８０〜１００ｍＪ／ｃｍ^２のＢ波長紫外線を４〜８週間連続照射し、照射後少なくとも３週間放置することを特徴とするヒト光老化モデル皮膚の作成方法。
紫外線を６〜８週間連続照射し、照射後３〜６週間放置するものである請求項１記載の方法。
Ｂ波長紫外線の照射量を、照射開始第１週〜第３週までは、１週間ごとに１０ｍＪ／ｃｍ^２ずつ増加し、第３週以降は１００ｍＪ／ｃｍ^２を維持するものである請求項１又は２記載の方法。
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法により作成されたヒト光老化モデル皮膚。
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法により作成されたヒト光老化皮膚モデル動物。