JP2007010341A

JP2007010341A - 免疫分析方法

Info

Publication number: JP2007010341A
Application number: JP2005188222A
Authority: JP
Inventors: Hisao Nakanishi; 久雄中西; Takehiko Kitamori; 武彦北森
Original assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology; Sumitomo Bakelite Co Ltd
Current assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology; Sumitomo Bakelite Co Ltd
Priority date: 2005-06-28
Filing date: 2005-06-28
Publication date: 2007-01-18
Also published as: US20060292641A1

Abstract

【課題】操作が簡便で、且つ反応のばらつきの少ない免疫分析方法を提供する。
【解決手段】本発明の免疫分析方法は、微細流路内に固相化抗体を有するマイクロチップを用いたサンドイッチ法による免疫分析方法であって、標識された抗体および検体を混合した流体を前記微細流路に送液する工程を含むものである。
【選択図】なし

Description

本発明は、微細流路を具備したマイクロチップを用いたサンドイッチ法による免疫分析方法に関する。

有機化学、生化学分野において混合、反応、合成、抽出、分離、分析について高速化、微少試料、微小空間での操作が注目されており、その技術を確立するためにマイクロチップの研究が精力的に進められている。

一般的にマイクロチップは、微細な流路をもったガラス基板と試料を導入及び排出する孔をもったガラス基板の２枚が接合されたものである。

該マイクロチップ内でサンドイッチ法を行う場合、流路内の特定の部位に検体中に含まれる特定のタンパク質（以下、マーカーと呼ぶ）を捕捉する能力を有する抗体を固定する。その後、該抗体が固定化されていない部分を該反応に影響を及ぼさないタンパク質、例えば牛血清アルブミン等で被覆する。次に該抗体に接触するように検体を送液し、その後、界面活性剤を含んだ緩衝液を送液し流路内を洗浄する。次にマーカーに特異的に結合する酵素、蛍光、ビオチン等で標識された抗体を送液し、同様に流路内を洗浄する。例えば、酵素標識を用いた場合、その後基質を含む液体を送液しその際に起こる酵素反応による基質の発色量を測定する。
特開２００１−４６２８号公報

ところで、前述のサンドイッチ法を行う場合、流路内に送液する試料液体の種類が多い為に操作が面倒で且つ、各試料溶液ごとに異なる工程にて送液するため、この各工程の切り替え時において気泡や不純物が流路内に混入する確率が上がり、反応のばらつきの原因となる。

本発明は、これら課題を解決すべく操作が簡便で、且つ反応のばらつきの少ない免疫分析方法を提供することを目的とする。

本発明は、
（１）微細流路内に固相化抗体を有するマイクロチップを用いたサンドイッチ法による免疫分析方法であって、標識された抗体および検体を混合した流体を前記微細流路に送液する工程を含むことを特徴とする免疫分析方法、
（２）前記標識が酵素、蛍光、又はビオチンの何れかである（１）記載の免疫分析方法、
である。

本発明の免疫分析方法によれば、マイクロチップに検体および標識抗体を適用する前に、この検体と標識抗体とを予め混合している為、検体送液、洗浄液送液、標識抗体送液の３つに分けて行われていた工程が１工程に短縮される。これにより、反応に要する時間が短縮されると同時に、前述したような試薬交換時の不具合も解消する。

本発明によれば、操作が簡便で、且つ反応のばらつきの少ない免疫分析方法を提供することができる。

以下、本発明の実施形態について説明する。
本実施形態の免疫分析方法は、微細流路内に固相化抗体を有するマイクロチップを用いたサンドイッチ法による免疫分析方法であって、標識された抗体および検体を混合した流体を前記微細流路に送液する工程を含むものである。

本実施形態では、標識抗体および検体を含む流体を微細流路に流し、固相化抗体と検体中のマーカーとの反応、および固相化抗体に結合したマーカーと標識抗体との反応を同一工程で行う。反応後に、固相化抗体に結合したマーカーと反応した標識抗体について定量することができる。この定量結果から、検体に含まれるマーカーを定量することができるため、当初微細流路に流した流体中にどれくらいのマーカーが含まれていたのかの免疫分析を行うことができる。

従来においては、この定量に際して、検体を含む流体を微細流路に流して検体中のマーカーと固相化抗体と反応させた後に、標識抗体を含む流体をこの微細流路に流して標識抗体と固相化抗体に結合したマーカーと反応させていた。この場合、検体送液、洗浄液送液、標識抗体送液の３つの工程を別々に行う必要があり、流路内に送液する試料の種類が多い為に操作が煩雑になる。さらに、各工程の合間において、気泡や不純物が流路内に混入する確率が上がり、反応のばらつきの原因となるおそれもあった。

一方、本実施形態では、標識抗体および検体を予め混合してから微細流路に流すので、検体送液、洗浄液送液、標識抗体送液の３つに分けて行われていた工程が１工程に短縮される。

また、本実施形態では、微細流路中で固相化抗体、検体中のマーカーおよび標識抗体の分子間距離が、従来の方法と比較して、十分に小さくなることが考えられる。したがって、固相化抗体とマーカーとの反応、および固相化抗体に結合したマーカーと標識抗体との反応を効率よく行うことができると考えられる。

本実施形態の免疫分析方法は、例えば図１および図２に示したようなマイクロチップにより実現される。
このマイクロチップ１は、流体導入するための流体導入口２、導入された流体を流すための微細流路３、微細流路３を流れてきた流体を排出するための排出口６を具備している。また、微細流路３の途中には、抗体が固定化された反応部４が設けられており、反応部４の下流側には流体の流れをせき止めるダム部５が設けられている。

図２によれば、ダム部５は、微細流路３の底面８から上面７に向かって壁のような部材からなり、ダム部５と微細流路３の上面７との間には流体が通り抜けるための隙間が設けられている。これにより、反応部４にて流体がある程度留まるようになり、抗体−マーカーの反応、マーカー−標識抗体の反応をより効率よく行うことができるようになる。

まず、検体中に含まれるマーカーに特異的に結合する抗体を微細流路３内に固定化して固相化抗体とする。図２では、直径が１０〜１００μｍのマイクロビーズの表面に予め抗体を固定化し、ダム構造を持つ微細流路３に導入する方法が示されている。また、図示しないが、抗体を微細流路の表面に直接固定化してもよい。本発明においてはいずれの方法も適用できる。

このようにして、抗体を固定化したマイクロビーズを、固定化された抗体と反応性が低い牛血清アルブミン等を含むタンパク質含有水溶液でビーズ表面上の抗体が固定化されていない部分を被覆する。得られたマイクロビーズを微細流路３の反応部４内に導入し、必要量を反応部４内に充填する。このように、充填前にマイクロビーズの被覆処理を行っておくことで、標識抗体が含まれる流体が送液されるときに、この標識抗体のマイクロビーズ表面への非特異的吸着、すなわち固相化抗体の部分以外の露出部分への標識抗体の固定化を防止し、固相化抗体と結合したマーカーに結合した標識抗体を正しく定量することができる。

一方で、検体および標識抗体を含む溶液をそれぞれ必要量づつ取り出し、マイクロチューブなどの容器内で予め混合攪拌する。このようにして得られた混合液を、微細流路３に送液して、先に抗体を固定化したマイクロビーズを導入した反応部４に導入する。その後、必要に応じて界面活性剤等を含んだ洗浄液を微細流路３に導入して、反応部４内を洗浄する。ここで、この微細流路３は、固相化抗体、検体、標識抗体を流体中で十分に近づけて、それぞれの分子間距離を小さくするという観点から、巾０．０１〜１ｍｍ、深さ０．０１〜１ｍｍ程度であることが好ましい。

ここで、標識検体に用いる標識としては、酵素、蛍光およびビオチンが挙げられる。標識が酵素の場合は、検体および標識抗体の混合液を反応部４に送液した後、この標識酵素と反応する基質液を導入する。標識酵素の反応により発色した基質を熱レンズ顕微鏡（以下、ＴＬＭと略す）等の高感度に発色量を検出できる検出器で測定することで、検体中に含まれるマーカー濃度を特定する。また、標識がビオチンの場合は、酵素標識されたアビジン溶液を導入しビオチンと反応させる。その後、標識酵素の場合と同様に基質液を導入し、反応した基質の発色量を検出、定量する。また、標識が蛍光の場合は、検体および標識抗体の混合液を反応部４に送液した後に、蛍光を測定することにより、検体中に含まれるマーカー濃度を特定することができる。

以上のことにより、本実施形態によれば、マイクロチップを使用して、免疫分析を効率よく、短い時間で行うことができるようになる。また、検体と標識抗体とを予め混合してから微細流路に導入する為、従来において別々に行われていた検体送液、洗浄液送液、標識抗体送液の３つの工程が１工程に短縮されるため、操作が簡便になる。これにより、反応に要する時間を短縮することができ、３つの工程に分けてそれぞれ送液していたときのような各工程間での試薬交換時において、問題となっていた、気泡や不純物が流路内に混入する確率が下がり、反応のばらつきを抑えることができる。

以下、実施例及び比較例を用いて本発明を説明する。
（実施例）
図１のように、微細流路３内にダム部５を有するマイクロチップ１を用意した。そして抗ＣＥＡ（＝CARCINOEMBRYONIC ANTIGEN）抗体をポリスチレン製のマイクロビーズに固相化し、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液で抗ＣＥＡ抗体により被覆されていないマイクロビーズ表面を被覆した。該マイクロビーズを該マイクロチップに導入し微細流路３内に固定し、反応部４を形成した。

予めマイクロチューブ内でＣＥＡ抗原およびペルオキシダーゼ標識抗体溶液の混合液を送液し、固相化抗体の抗ＣＥＡ抗体と反応させた。次いで3,3',5,5'-TetramethylbenzidineおよびH₂O₂の混合溶液を基質として導入し酵素反応を実施した。該酵素反応により発色した基質を検出用マイクロチップ上でＴＬＭ（励起波長=６５０ｎｍ）を用いて検出し、発色量を計測した。同様の実験を、抗原濃度を変化させて実施した。

（比較例）
実施例と同様に抗ＣＥＡ抗体を固相化したマイクロチップに、ＣＥＡ抗原溶液、ペルオキシダーゼ標識抗体溶液を別々に微細流路３内に送液した場合について、実施例と同様の実験を試みた。
測定結果を表１に示した。実施例では、抗原濃度に比例したＴＬＭシグナルを比較例より高いレベルで得られた。また、測定時間も２７分から２１分へと短縮できた。

本実施形態を実現するためのマイクロチップの一例の概略図である。図１のマイクロチップの微細流路内のダム部の断面概略図である。

符号の説明

１マイクロチップ
２試薬導入口
３微細流路
４反応部（抗体が固定化されたマイクロビーズ）
５ダム部
６排出口
７微細流路の上面
８微細流路の底面

Claims

微細流路内に固相化抗体を有するマイクロチップを用いたサンドイッチ法による免疫分析方法であって、
標識された抗体および検体を混合した流体を前記微細流路に送液する工程を含むことを特徴とする免疫分析方法。
請求項１に記載の免疫分析方法において、
前記標識が酵素、蛍光、又はビオチンの何れかである免疫分析方法。