JP2006511218A - 薬物誘発性不整脈に関連する方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、被検体の薬物誘発性不整脈の発症に対する感受性を予測する心臓のカリウムチャンネルをコードする遺伝子における多型を特徴とする。本発明はまた、被検体が多型を有するかどうかを決定するために、被検体の遺伝子型解析を行う方法を提供する。
Description
本発明は、被検体の薬物誘発性不整脈の発生に対する感受性を評価する技術に関する。本発明はさらに、不整脈に罹った患者の治療において最適な有効性を有する可能性のある候補治療剤をスクリーニングする方法に関する。本発明はまた、臨床試験において、ＫＣＮＨ２遺伝子またはＫＣＮＱ１遺伝子のいずれかにおける多型の存在または非存在に基づき患者を階層化する方法に関する。本発明はさらに、患者のＫＣＮＨ２および／またはＫＣＮＱ１遺伝子型を決定するのに有用な方法、組成物およびキットを提供する。
心不整脈は、全ての自然死の約１１％を占める病因および死亡の共通原因である（Ｋａｎｎｅｌ等（１９８７年）Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，１１３：７９９〜８０４，Ｗｉｌｌｉｃｈ等（１９８７年）Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，６０：８０１〜８０６）。不整脈は、心臓の正常な伝導プロセスからの逸脱によって生じ、この状態において、心房と心室の協調的で安定した収縮が中断される。結果的に協調的な収縮が中断されることにより、血圧の減少、および、付随する意識の喪失（気絶として知られている）を引き起こす可能性がある。心臓リズムにおける長期の障害は、さらに永久的な脳損傷や死を引き起こす可能性がある。
心臓リズムの危険な変化を防ぐために、抗不整脈剤による薬物療法が施されれている。しかしながら、特定の例において、既存の不整脈を緩和することを目的とした薬物療法は、このような薬物療法を受けた患者の一部において副作用としてさらなる不整脈を引き起こすという目的としない結果を起こす可能性がある。実際、ほとんど全ての既知の抗不整脈薬は、目的としない副作用として悪性の不整脈（催不整脈作用）を誘発する可能性がある。加えて、特定の非心臓性の薬物療法は、心臓の収縮の分子メカニズムを妨害することがわかっており、不整脈を引き起こす可能性がある。薬物療法によって誘発された不整脈は、その他の病因がある不整脈と区別するために、薬物誘発性不整脈と呼ばれている。薬物誘発性不整脈を引き起こす素因がこれまでに同定されていないため、現在、薬物摂取後の不整脈に対する感受性の増加は治療が困難である。
特定のクラスＩＩＩおよびＩＡ抗不整脈剤による薬物療法は、迅速に活性化される心臓のカリウム電流ＩKrをブロックすることによって心臓の活動電位を持続延長させることによって作用する。従来、抗不整脈薬は、それらの分子の作用標的に基づき、４つの群に分類される。クラスＩ抗不整脈薬は、心臓のナトリウム（Ｎａ）チャンネルに結合するが、クラスＩＩ薬は、βアドレナリン受容体をブロックすることによって作用する；クラスＩＩＩ抗不整脈薬は、カリウム（Ｋ）チャンネルに結合するが、クラスＩＶ薬は、カルシウムチャンネルブロックする。その上、従来、クラスＩ抗不整脈薬は、以下のようにさらに分類される：クラスＩａ薬は、心臓の活動電位の最大速度（Ｖｍａｘ）を低くし、伝導組織の不応期を高めるが、クラスＩｂ薬は、上記活動電位の持続期間を短くし、クラスＩｃ薬は、Ｖｍａｘを抑制するが、不応期への付随作用はない。
上述したように、現在用いられているほとんど全ての既知の抗不整脈薬は、悪性の不整脈自体（催不整脈作用）を誘発する可能性があり、治療域を狭くする。より特定には、クラスＩａおよびＩＩＩでの薬物療法は、悪性の不整脈を誘発する特定の催不整脈性という副作用を有し、これは、トルサード・ド・ポワント（ＴｄＰ）という）または多形性心室頻拍（ＰＭＶＴ）という。この不整脈は、いわゆる心室組織の再分極および不応期のばらつきが生じるために起こると考えられている。すなわち、正常な伝導から生じる正常な脱分極波に応答する心室組織の能力において、不均質性がある。その結果、異常な伝導が続いて起こり、心室は、その主要な機能を実行したり、血液を体のその他の部分に送り出したり、正常な血圧を持続させることができなくなる。この特定の異常な心室の伝導は、心電図で、通常正常な洞律動よりもずっと速い速度での波状の正弦波パターンとして示され、これらが「トルサード・ド・ポワント」および「多形性心室頻拍」と呼ばれる。このタイプの不整脈が続くと、血圧が顕著に低下し、脳への血液の低潅流（ｕｎｄｅｒｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、および意識の喪失（気絶）を引き起こす。このような不整脈が連続して続くと、死を引き起こす。ＴｄＰの開始は予測不可能であり、発作性の事象として起こる。ＴｄＰは、一度認識されれば、数種の療法で容易に治療可能であり、このような療法としては、電気的除細動、マグネシウム点滴、または、人工ペースメーカーを用いた抗頻拍（オーバードライブ）ペーシングが挙げられる。しかしながら、医療的な観察外でＴｄＰの発症が起こると、治療時間が非常に重要となるため、その結果は致命的になる恐れがある。
ＴｄＰおよびＰＭＶＴは、上で外述したような新規の薬物療法によって誘発される可能性がある。しかしながら、多くの例において正常な洞律動ＥＣＧにおける異常を検出することができ、このような患者は、薬物誘発性のＴｄＰまたはＰＭＶＴに罹りやすいという可能性が増加している。特に、ＱＴ間隔（心室心筋の再分極を示す）は、クラスＩａおよびクラスＩＩＩ抗不整脈薬、三環式抗うつ薬、特定の抗ヒスタミン剤などによる特定の薬物療法、およびその他の様々な薬物療法によって異常に持続する場合がある。この持続性ＱＴまたはＱＴ延長は、ＴｄＰまたはＰＭＶＴに対して感受性の状態にする可能性のある、上述の心室の再分極のばらつきまたは不均質性を示す。
ＴｄＰおよびその他の悪性の不整脈の発症により重大な結果が起こるが、普通の集団における発生率は低く、抗不整脈薬を摂取している患者における発生率においてでも低い。そのため、これらの薬物療法は使用が認可されており、現在利用可能である。しかしながら、特定の個体の一部は、その遺伝的構成によってＴｄＰまたはその他の薬物誘発性不整脈を発症させやすい可能性が高い場合がある。特に、このような上述の薬物療法は、それらがイオンチャンネルと相互作用することによって治療効果を有するだけでなく、それらのイオンチャンネルとの相互作用を介して催不整脈性の作用も有すると考えられているため、このイオンチャンネルにおける多形性が、これらの薬物の催不整脈性の作用に対する感受性における差を説明していることがもっともらしいと考えられる。
これらの催不整脈性の作用に対する感受性を有する患者を予測するために、スクリーニングによる遺伝学的試験が利用可能であれば、顕著な利益が期待できる。現在、これらの催不整脈性の作用は予測が困難であるだけでなく、結果として、特定の抗不整脈薬（ドフェチリド、イブチライド、ソタロールなど）を投与された患者は、これらの薬物療法を施している間中、患者の環境において厳密にモニターする必要がある。このように厳密にモニターしても、最初にこのような薬物に耐性を有する患者の一部はなお、在宅中に発作的にＴｄＰを発症させる可能性がある。それゆえに、薬物誘発性不整脈を発症させやすい患者をスクリーニングする能力は、医療的なコミュニティーにおいてかなりの重要性があることは明白である。
本発明は、薬物誘発性不整脈の分子的および遺伝学的な病因において重要な単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、および、被検体の薬物誘発性不整脈に対する感受性を予測および／または診断する方法を目的とする。
本発明によれば、薬物誘発性不整脈に対する感受性は、患者のＫＣＮＨ２またはＫＣＮＱ１遺伝子のいずれかのＤＮＡ配列を多型の存在に関して解析することによって決定される。本発明はさらに、薬物誘発性不整脈を発症させる患者の確率を高めるＫＣＮＱ１またはＫＣＮＨ２遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングする方法を目的とする。被検体の薬物誘発性不整脈に対する感受性の早期の検出により、より詳細な治療計画のインフォームドチョイスが可能になり、患者のＴｄＰに対する感受性が高くなるという目的としない結果を起こす可能性のある薬物療法を受けている患者を入院させる必要性を低減することができる。特に、ＱＴ間隔を延長し、それゆえにＴｄＰに係る可能性を高める抗不整脈剤またはその他の薬物療法を受けている患者は、ＫＣＮＨ２チャンネル遺伝子、および、ＫＣＮＱチャンネル遺伝子における多型に関してスクリーニングされる。例えば、ＫＣＮＨ２チャンネルにおけるＲ１０４７Ｌ突然変異、または、ＫＣＮＱ１遺伝子におけるＫ２１８Ｅ突然変異の検出は、ＱＴ間隔を延長する薬物療法（例えばクラスＩＩＩまたはクラスＩａ抗不整脈剤）の投与の後にＴｄＰを発症させる可能性が高いことを示す。開示された突然変異は、ドフェチリド（クラスＩＩＩ抗不整脈剤）での治療の後にＴｄＰを発症させた患者において、合併症がなかったドフェチリド治療を受けた患者よりもかなり高い頻度で生じる。
本発明の診断および予測方法によれば、野生型ＫＣＮＱ１またはＫＣＮＨ２遺伝子の改変が検出され、これが、被検体の薬物誘発性不整脈に対する感受性を示すものとみなす。加えて、本方法は、野生型ＫＣＮＱ１またはＫＣＮＨ２を検出すること、それによって、この遺伝子座の結果として薬物誘発性不整脈に対する感受性がないことを確認することによって行うことができる。
以下の発明の詳細な説明と添付の請求項によって、その他の特徴および利点を明らかにする。
図面の簡単な説明
図１は、エキソン３多型：ＫＣＮＱ１対立遺伝子であり、図２は、エキソン１３多型：ＫＣＮＨ２対立遺伝子である。
図１は、エキソン３多型：ＫＣＮＱ１対立遺伝子であり、図２は、エキソン１３多型：ＫＣＮＨ２対立遺伝子である。
発明の詳細な説明
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項で用いられる特定の用語および成句の意味を以下に示す。
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項で用いられる特定の用語および成句の意味を以下に示す。
本発明で用いられる用語「対立遺伝子」は、相同な染色体群の同じ遺伝子座に位置する、遺伝子の１またはそれ以上のオルタナティブな形態を意味する。例えば、ＫＣＮＨ２遺伝子は、複数の異なる対立遺伝子を有し、それらのうち２つが本願で説明される。
本発明において核酸に関して用いられる用語「増幅」は、一本鎖または二本鎖型いずれかで１またはそれ以上の核酸コピーを生成させるあらゆる方法を包含するものとする。このような方法としては、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および、細胞中での核酸の複製が挙げられる。
本発明で用いられる用語「後天性ＱＴ延長症候群」は、心臓の正常な洞律動のあらゆる変異を意味し、この変異は、ＱＴ間隔延長に関連し、薬物療法の投与によって誘発される。薬物療法は、抗不整脈剤による薬物療法、その他の心臓の薬物療法、さらに非心臓性の薬物療法などのあらゆる種類のいずれかが可能である。
本発明で用いられる用語「不整脈」は、心臓の正常な洞律動のあらゆる変異を意味し、この場合の変異は、ほとんどの場合心房および／または心室の伝導特性の障害によって引き起こされる。このような変異としては、これらに限定されないが、頻拍性不整脈、心房細動、心房粗動、心房性頻脈、上心室頻脈、房室結節性リエントリー性頻拍、または、心室頻脈が挙げられる。
本発明で用いられる用語「生物学的サンプル」は、本発明で説明された方法において使用するための核酸サンプルを得るために被検体から回収されたあらゆる細胞、流体または組織を意味する。最も簡単には、血液を被検体から採取することができ、ＤＮＡは、血液サンプルから抽出することができる。あるいは、口腔内用綿棒、毛包の標本、脊椎穿刺、組織塗抹標本または鼻の吸引標本を用いて、必要な核酸サンプルを提供することができる。
本発明で用いられる用語「薬物誘発性不整脈」は、薬物療法の投与に関連する心臓の正常な洞律動のあらゆる変異を意味する。特定の実施形態において、このような変異は、心房および／または心室の伝導特性の障害によって引き起こされる可能性がある。薬物療法は、抗不整脈剤による薬物療法、その他の心臓の薬物療法、さらに非心臓性の薬物療法などのあらゆる種類のものが可能である。
本発明で用いられる「高い危険」は、ある集団における病気または障害の発症頻度が、コントロール集団におけるその病気または障害の発症頻度より高いことを意味する。高い危険に関連すると同定された因子は、「危険因子」と呼ばれている。代表的な実施形態において、特定の多型対立遺伝子は、薬物誘発性不整脈に関する危険因子であり得る。
本発明で用いられる用語「Ｋ２１８Ｅ多型」は、ＫＣＮＱ１のエキソン３の核酸配列における塩基対の変異を意味し、これは、ＫＣＮＱ１のアミノ酸配列の２１８位におけるＫからＥへの転位、それと共に、連鎖不平衡における対立遺伝子を生じる。
本発明で用いられる用語「ＱＴ間隔延長」は、ＱＴ間隔（心電図のＱ波とＴ波との時間間隔）がＲ−Ｒ間隔の約半分より長いことを意味する。
本発明で用いられる用語「核酸」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、場合によってはリボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。この用語は、ヌクレオチド類似体（例えばペプチド核酸）で構成されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの同等物、類似体として、ならびに、説明される実施形態に適用可能である、一本鎖（センスまたはアンチセンス）、および、二本鎖ポリヌクレオチドも含むものとする。
本発明で用いられる用語「多型」は、個体間のＤＮＡ配列における変異を意味する。少なくとも２つの異なる形態を有する遺伝子（例えば２つの異なるヌクレオチド配列）の部分は、「遺伝子の多型領域」と呼ばれる。例えば、多型領域は、例えば、これらに限定されないが、挿入、欠失、置換および／または配列リピートなどの単一または複数の塩基対の改変を含み得る。
本発明で用いられる用語「Ｒ１０４７Ｌ多型」は、ＫＣＮＨ２のエキソン１３の核酸配列における塩基対の変異を意味し、これは、ＫＣＮＨ２のアミノ酸配列の１０４７位における ＲからＬへの転位、および、それと共に連鎖不平衡における対立遺伝子を生じる。
本発明で用いられる用語「特異的にハイブリダイズする」または「特異的に検出する」は、核酸分子がサンプル核酸の少なくとも約６個の連続したヌクレオチドにハイブリダイズする能力を意味する。
用語「治療（すること）」は、本発明で用いられる場合、病気の少なくとも１つの症状、または、障害に関連する少なくとも１つの異常を治すこと、同様に、改善することを包含するものとする。薬物誘発性不整脈を治療することは、不整脈を緩和する治療剤を投与することによって行うことができる。あるいは、薬物誘発性不整脈を治療することは、不整脈に関連する危険因子を改変する治療剤を投与することによって行うことができる。
用語「野生型の対立遺伝子」または「正常な対立遺伝子」は、被検体において２つのコピーで存在する場合、野生型の表現型を生じる遺伝子の対立遺伝子を意味する。遺伝子における特定のヌクレオチド変化は、そのヌクレオチド変化を含む遺伝子の２つのコピーを有する被検体の表現型に影響を与えない場合があるため、特定の遺伝子に数種の異なる野生型の対立遺伝子が存在する可能性がある。一般的に、「野生型の対立遺伝子」は、集団において最も一般的な対立遺伝子である。
薬物誘発性不整脈を発生させる治療剤
薬物誘発性または後天性不整脈は、抗不整脈剤による薬物療法、その他の心臓の薬物療法、または、非心臓性の薬物療法のいずれかによって引き起こされる可能性がある。薬物誘発性不整脈を引き起こすことがわかっている抗不整脈剤による薬物療法としては、クラスＩＩＩ抗不整脈薬（例えば、これらに限定されないが、ドフェチリドまたはソタロール（ｓｏｌａｔｏｌ））、クラスＩａ抗不整脈薬（例えば、これらに限定されないが、プロカインアミド）が挙げられる。
薬物誘発性または後天性不整脈は、抗不整脈剤による薬物療法、その他の心臓の薬物療法、または、非心臓性の薬物療法のいずれかによって引き起こされる可能性がある。薬物誘発性不整脈を引き起こすことがわかっている抗不整脈剤による薬物療法としては、クラスＩＩＩ抗不整脈薬（例えば、これらに限定されないが、ドフェチリドまたはソタロール（ｓｏｌａｔｏｌ））、クラスＩａ抗不整脈薬（例えば、これらに限定されないが、プロカインアミド）が挙げられる。
薬物誘発性心不整脈はまた、心臓の再分極に目的としない作用を有する非心臓性の薬物での治療の際にも起こる。薬物誘発性不整脈に関連する薬物の例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる： キニジン、テルフェナジン、シサプリド、エリスロマイシン、アミオダロン、フェノチアジン、三環式抗うつ薬、および、数種の利尿薬（例えば、Ｒｏｄｅｎ，Ｄ．Ｍ．（１９９８年）Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ，８２（４Ａ）：４９Ｉ−５７Ｉを参照）。薬物誘発性不整脈の分子メカニズムは未だにわかっていないが、これらの薬物療法の多くがＫＣＮＨ２チャンネルをブロックすることは重要である（総論として、Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｍ．Ｔ．等（２００１年）Ｃｅｌｌ．１０４：５６９〜５８０を参照）。加えて、キニジン、ソタロールおよびイブチライドで治療された患者の１０％もが、過度のＱＴ間隔の延長を起こすか、または、トルサード・ド・ポワントの急な発症を示す。この予測不可能な副作用は、低カリウム血症、低マグネシウム血症、付随するその他のＩKrブロッカーでの治療、および、最近の心房細動の変調のような同定可能な危険因子が存在しない場合に起こり得る。Ｔａｎ，Ｈ．Ｌ．等，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２２：７０１〜７１４（１９９５年）を参照。
患者を迅速に遺伝子型解析する能力により、治療剤または病気を予防する物質の試験および開発は、根本的に変化することが保証される。現在、病気を治療または予防するための物質の有効性は、患者プールに対してその物質を試験することによによって評価される。患者プールにおける多くの変異は制御されるが、遺伝学的な変異の作用は通常、評価されない。様々な患者プールで試験した場合には、統計学的に効果がない薬物でも、特定の遺伝学的特徴を有する患者の選択群には極めて有効である可能性がある。同様に、遺伝学的に定義された患者の部分集団においてのみ望ましくない副作用を引き起こす薬物でも、全体としての患者プールでは引き起こさない可能性がある。患者を遺伝子型によって分けない限り、選択された集団に対して大きな可能性がある多くの薬物が、全体としての集団に対して役に立たないものとして拒絶される可能性がある。加えて、患者の危険な薬物副作用に対する感受性の基礎となる多型を同定することにより、医師は、薬物療法の投与の前に、これらの素因の存在についてスクリーニングすることができる。このような前もって患者をスクリーニングする能力は、治療の最中に副作用を発症させている患者が生じる可能性を最小化し得る。
患者プールを遺伝子型に基づいて群に分けることができる場合、薬物が遺伝学的に定義された患者の部分集団に影響を与える能力について薬物を再試験することができる。このタイプのスクリーニングにより、除外された化合物の復活、新規の、または、より精製された化合物の同定、周知の化合物の新しい使用の同定、および、治療剤の投与の際に危険な副作用を発症させていないと推測される集団の同定が可能になる。
薬物誘発性不整脈に対する高い感受性に関連する多型
本発明は、薬物誘発性不整脈に対する高い感受性を有する患者を同定するのに有用な、ＫＣＮＨ２遺伝子およびＫＣＮＱ１遺伝子の新規の対立遺伝子の同定に基づいている（少なくとも部分的に）。それゆえに、被検体においてこれらの対立遺伝子が検出されることは、その被検体が、薬物療法によって誘発された副作用の発生（増加または減少した）に対して変化した感受性を有することを示す。さらに、対立遺伝子の検出は、特定のＫＣＮＨ２またはＫＣＮＱ１遺伝子型を有する患者に最適に有用であり得る治療剤の選択の決定を補助する。
本発明は、薬物誘発性不整脈に対する高い感受性を有する患者を同定するのに有用な、ＫＣＮＨ２遺伝子およびＫＣＮＱ１遺伝子の新規の対立遺伝子の同定に基づいている（少なくとも部分的に）。それゆえに、被検体においてこれらの対立遺伝子が検出されることは、その被検体が、薬物療法によって誘発された副作用の発生（増加または減少した）に対して変化した感受性を有することを示す。さらに、対立遺伝子の検出は、特定のＫＣＮＨ２またはＫＣＮＱ１遺伝子型を有する患者に最適に有用であり得る治療剤の選択の決定を補助する。
本発明で開示されたＫＣＮＨ２遺伝子およびＫＣＮＱ１遺伝子における突然変異を、患者のＴｄＰに対する感受性を想定する予想ツールとして用いることができる。特に、ドフェチリド治療の後にＴｄＰを発症した患者において、２つの独立した突然変異がより高い頻度で生じることが決定された。ＫＣＮＨ２のカリウムチャンネルにおいて、多型により、配列中の１０４７位におけるアミノ酸の改変が起こる。特に、アルギニンが、ロイシンと置換される。ＫＣＮＱ１カリウムチャンネルにおいて、多型により、配列中の２１８位におけるアミノ酸の改変が起こる。特に、リシンが、グルタミン酸と置換される。これらの発見の観点で、上記多型のいずれかの存在について被検体の遺伝子型を解析することにより、あらゆる薬物療法の投与の前に、ＴｄＰを発症させる危険に関して被検体をスクリーニングすることが可能となる。
単なる説明のための実施形態において、本方法は、（ｉ）患者から細胞サンプルを回収する工程、（ｉｉ）サンプルの細胞から核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）を単離する工程、（ｉｉｉ）核酸サンプルと、１またはそれ以上のプライマー（これは、対立遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下で、ＫＣＮＱ１またはＫＣＮＨ２のいずれかの少なくとも１つの対立遺伝子に５’および３’で特異的にハイブリダイズする）とを接触させる工程、および、（ｉｖ）増幅産物を検出する工程を含む。これらの検出スキームは、核酸分子が極めて少量しか存在しない場合のそのような分子の検出に特に有用である。
本発明で説明された対立遺伝子に加えて、当業者は、本発明における教示に基づいて、薬物誘発性不整脈に関連するその他の対立遺伝子（多型および突然変異を含む）、または、薬物誘発性不整脈に関連する対立遺伝子と連鎖不平衡にある対立遺伝子を容易に同定することが可能である。例えば、薬物誘発性不整脈がない被検体からなる第一群からの核酸サンプル、同様に、薬物誘発性不整脈がある被検体からなる第二群からのＤＮＡを回収することができる。次に、これら核酸サンプルを比較して、第一群と比べて第二群で過剰に示された対立遺伝子を同定することができ、この場合、このような対立遺伝子は、薬物誘発性不整脈に関連する可能性がある。あるいは、薬物誘発性不整脈に関連する対立遺伝子と連鎖不平衡にある対立遺伝子を同定することができ、例えば、大きい集団を遺伝子型解析して、統計学的解析を行い、一般的にどの対立遺伝子が予想よりも一緒にみられるか決定することによって同定することができる。好ましくは、このような群は、遺伝学的に関連した個体で構成されるように選択される。遺伝学的に関連した個体としては、同じ系統、同じ人種、または、さらに同じ家族からの個体が挙げられる。コントロール群と試験群との間の遺伝学的な関連度が増加するため、病気を引き起こす対立遺伝子とより離れて連鎖している多型対立遺伝子の予測値も増加する。これは、もとの集団において染色体に連鎖した多型が遺伝学的な交叉現象によって再分配されるほど進化の時間が経過していないためである。従って、系統特異的、人種特異的、さらに家族特異的な診断上の遺伝子型分析を発展させることができ、それにより、ヒトの進化中でより最近に発生した（例えば、主要な人種の分岐の後、ヒト集団が別個の人種へ分離した後の）病気の対立遺伝子、さらに特定の家系の最近の病歴の範囲内の対立遺伝子の検出が可能になる。
２つの多型マーカー間の、または、１つの多型マーカーと病気を引き起こす突然変異との間の連鎖不平衡は、準安定状態である。ヒトの進化の過程で、原因となる突然変異現象の選択圧力または散発性の連鎖した再発生がないため、多型は、やがて染色体の組換え現象によって分離し、それにより連鎖平衡に達する。従って、病気または状態を伴う連鎖不平衡における多型対立遺伝子を発見する可能性は、少なくとも２つの要因、すなわち、多型マーカーと病気を引き起こす突然変異との物理的距離の減少、および、連鎖した対の分離を可能にする減数分裂を起こす世代の数の減少における変化によって増加する可能性がある。後者の要因の考察により、２つの個体が近接して関連するほど、それらは、連鎖した多型を含む共通の親の染色体または染色体領域を共有する可能性が高くなり、この連鎖した対は、各世代で起こる減数分裂の交叉現象によって連鎖していない状態になる可能性は低くなることが示される。結果として、２つの個体が近接して関連するほど、遠く離れた多型が共遺伝される可能性が高くなる。従って、共通の系統、人種または家族で関連する個体にとって、さらにより遠く離れた多型座位の信頼度は、連鎖した病気を引き起こす突然変異の遺伝の指標として利用することができる。
遺伝学的スクリーニング（または、遺伝子型解析、または、分子スクリーニングともいう）は、病気状態を引き起こす、病気状態に寄与する（すなわち病気状態に関連する危険因子である）、病気状態を引き起こす突然変異に「連鎖」している、または、病気状態に寄与する突然変異に「連鎖」している突然変異（または、対立遺伝子もしくは多型）いずれかを、患者が有するかどうかを決定するための試験として、広く定義することができる。連鎖は、ゲノム中で近接して一緒に存在するＤＮＡ配列は、共に遺伝される傾向がある現象を意味する。共遺伝にはいくつか選択的な利点があるため、２つの配列は連鎖していてもよい。しかしながら、より典型的には、減数分裂性組換え現象が２つの多型間の領域内で起こる頻度が比較的低いため、２つの多型配列は共遺伝される。所定のヒト集団において、共遺伝した多型対立遺伝子は、集団のうち特定のいずれかのメンバーにおいて、両方とも生じるか、または、全く生じないかのいずれかの傾向があるため、共遺伝した多型対立遺伝子は互いに連鎖不平衡にあるといわれる。実際に、所定の染色体領域における複数の多型が、互いに連鎖不平衡にあることが発見された場合、これらの多型は、準安定な遺伝学的「ハプロタイプ」を定義する。それに対して、２つの多型座位間で生じる組換え現象は、これらの多型を別個の相同な染色体に分離させる。２つの物理的に連鎖した多型間の減数分裂性組換えが十分な頻度で生じる場合、この２つの多型は独立して分離するように観察され、連鎖平衡にあるといわれる。
一般的に、２つのマーカー間の減数分裂性組換えの頻度は、染色体上のそれらの間の物理的距離に比例するが、「ホットスポット」、同様に、抑制された染色体の組換えの領域の発生により、２つのマーカー間の物理的距離と、組換えの距離との不一致が生じる可能性がある。従って、特定の染色体領域において、広範な染色体ドメインにわたる複数の多型座位は、互いに連鎖不平衡にある可能性があり、それにより広範にわたる遺伝学的ハプロタイプを定義する。その上、病気を引き起こす突然変異が、このハプロタイプ内で、または、このハプロタイプと連鎖して発見される場合、ハプロタイプの１またはそれ以上の多型対立遺伝子を、上記病気を発症させる可能性を診断または予測する指標として用いることができる。このような、その他の良性の多型と病気を引き起こす多型との関連は、組換え現象により平衡が達成されるのに十分な時間が経過していないようなごく最近に病気の突然変異が発生する場合に生じる。それゆえに、病気を引き起こす突然変異の変化にわたるヒトハプロタイプ、または、それに連鎖しているヒトハプロタイプの同定は、個体において病気を引き起こす突然変異が遺伝している可能性の予測手段として役立つ。重要なことには、このような予測または診断方法は、実際の病気を引き起こす障害を同定し単離する必要なく利用が可能である。このことは、特に冠動脈疾患のような多因子性の病気の場合、病気プロセスに関与する分子的な欠陥を正確に決定することは困難で労力を要することがあるため、重要である。
実際に、病気状態と多型との統計学的な相関は、多型が障害を直接的に引き起こすことを必ずしも示すわけではない。むしろ、関連する多型は、介在する染色体部分における組換え現象によって平衡が達成されるのに十分な時間が経過していないような新しいヒトの進化過程で生じた障害を引き起こす突然変異に連鎖している（すなわち連鎖不平衡にある）良性の対立遺伝子変異体である可能性がある。従って、特定の病気の診断および予測分析の目的において、多型が、病気の原因論に直接的に関与するかどうかを考察しなくても、その病気に関連する多型対立遺伝子の検出を利用することができる。その上、所定の良性の多型座位が明白な病気を引き起こす多型座位と連鎖不平衡にある場合、良性の多型座位と連鎖不平衡にあるさらにその他の多型座位もまた、病気を引き起こす多型座位と連鎖不平衡にある可能性がある。従って、これらのその他の多型座位はまた、病気を引き起こす多型座位が遺伝している可能性の予測または診断になり得る。実際に、特定の病気または状態と、応答するヒトハプロタイプとの間の関連が見出されたら、広範にわたるヒトハプロタイプ（一連の連鎖した多型マーカーの対立遺伝子が共遺伝する典型的なパターンを意味する）を診断目的で標的とすることができる。従って、個体が特定の病気または状態を発症させる可能性の決定は、原因となる遺伝子変異を決定したり特徴付けたりしなくても、１またはそれ以上の病気に関連する多型対立遺伝子（または、さらに１またはそれ以上の病気に関連するハプロタイプ）を特徴付けることによって達成することができる。
サンプルの回収
あらゆる細胞型または組織を利用して、本発明で説明された方法において使用するための核酸サンプルを得ることができる。最も簡単には、血液を被検体から採取することができ、ＤＮＡは、血液サンプルから抽出することができる。あるいは、口腔内用綿棒、毛包標本、脊椎穿刺、組織塗抹標本または鼻の吸引標本が、必要な核酸サンプルを提供するための細胞源として用いられる。
あらゆる細胞型または組織を利用して、本発明で説明された方法において使用するための核酸サンプルを得ることができる。最も簡単には、血液を被検体から採取することができ、ＤＮＡは、血液サンプルから抽出することができる。あるいは、口腔内用綿棒、毛包標本、脊椎穿刺、組織塗抹標本または鼻の吸引標本が、必要な核酸サンプルを提供するための細胞源として用いられる。
組織サンプルは、後の解析のために核酸を保存する周知の保存手段によって、解析の前に保存することができる。このような方法としては、これらに限定されないが、凍結保護物質（例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、または、プロパンジオール−スクロース）の存在下での急速冷凍または制御冷凍法が挙げられる。
診断方法はまた、核酸の精製が必要ないように、生検または切除から得た患者の組織の組織切片（固定および／または凍結された）でインサイチュで直接行うことができる。核酸試薬を、このようなインサイチュでの方法のためのプローブおよび／またはプライマーとして用いることができる（例えば、Ｎｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．，１９９２年，ＰＣＲ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照）。
増幅技術
上述の組織サンプルに存在する核酸は、当業界既知のあらゆる従来の手段によって増幅することができる。一実施形態において、核酸サンプルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法によって増幅することができる。あるいは、増幅は、インビトロでの細胞培養法により達成することができる。
上述の組織サンプルに存在する核酸は、当業界既知のあらゆる従来の手段によって増幅することができる。一実施形態において、核酸サンプルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法によって増幅することができる。あるいは、増幅は、インビトロでの細胞培養法により達成することができる。
以下で説明される対立遺伝子識別技術はまた、解析の前に核酸を増幅する工程も含む。増幅技術は当業者既知であり、これらに限定されないが、クローニング、ＰＣＲ、特異的対立遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、自律的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：１８７４〜１８７８（１９９０年））、転写増幅システム（Ｋｗｏｋ，Ｄ．Ｙ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：１１７３〜１１７７（１９８９年））、および、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７（１９８８年））が挙げられる。
増幅産物は、多種多様な方法で分析することができ、例えば、サイズ解析、制限消化とそれに続くサイズ解析、反応生成物において特定のタグを有するオリゴヌクレオチドプライマーを検出すること、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的５’エキソヌクレアーゼ検出、配列解析、ハイブリダイゼーションなどが挙げられる。
ＰＣＲベースの検出手段としては、同時に複数のマーカーを多重増幅することが挙げられる。例えば、サイズがオーバーラップしておらず、同時に解析することができるＰＣＲ産物を生成するＰＣＲプライマーを選択することが当業界周知である。あるいは、区別をつけて標識されており、そのためそれぞれ区別して検出できるプライマーを用いて、異なるマーカーを増幅することが可能である。もちろん、ハイブリダイゼーションベースの検出手段により、サンプル中で複数のＰＣＲ産物を区別して検出することが可能である。複数のマーカーの複数の解析を可能にするその他の技術が当業界既知である。
ＫＣＮＱ１またはＫＣＮＨ２遺伝子の特異的領域にハイブリダイズするように、適切なプローブを設計することができる。当業者であれば、本発明の開示の観点でＫＣＮＱ１またはＫＣＮＨ２遺伝子の領域を増幅するのに有用なプライマーは明白である。適当なプライマーとしては、指定されたプライマーの約１ｋｂの範囲でハイブリダイズし、さらに長さが約１７ｂｐ〜約２７ｂｐのいずれかであるプライマーが挙げられる。固有のヒト染色体のゲノム配列を増幅するためのプライマーを設計するための概略的なガイドラインは、その融解温度が少なくとも約５０℃であることであり、この場合、およその融解温度は、式：Ｔmelt＝［２×（ＡまたはＴの＃）＋４×（ＧまたはＣの＃）］を用いて推測することができる。これらのプローブは、遺伝子間配列などの関連するゲノム遺伝子座その他の領域を含んでいてもよい。実際に、ＫＣＮＱ１またはＫＣＮＨ２遺伝子は、約２５,０００塩基対にわたり、１,０００塩基対ごとに平均１つの単一ヌクレオチド多型が存在すると推測され、単独で約２５個のＳＮＰ遺伝子座を含む。本発明での使用が可能なさらにその他の多型は、様々な公共の源から入手可能である。例えば、ヒトゲノムデータベースは、遺伝子内のＳＮＰを収集しており、配列によって検索可能であり、現在、約２,７００の登録を含む。また、マサチューセッツ工科大学（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が保持しているヒト多型データベース、または、ＳＮＰコンソーシアム（ＳＮＰ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）が保持しているデータベースも利用可能である。このような源から、ＳＮＰ、同様に、その他のヒト多型を発見することができる。
従って、本発明のヌクレオチドセグメントは、ＫＣＮＱ１またはＫＣＮＨ２遺伝子領域の相補的なストレッチと選択的に二本鎖分子を形成する能力において用いることができる。この目的に適したプローブの設計は、多数のファクターの考察を必要とする。例えば、ヌクレオチドの長さが１０、１５もしくは１８個のヌクレオチド〜約２０、または、〜約３０個のヌクレオチドのフラグメントが、特定の有用性がある。より長い配列、例えば４０、５０、８０、９０、１００、さらに全長に至る配列が、特定の実施形態においてさらにより好ましい。分子プローブとして有用となるように、少なくとも約１８〜２０個のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであれば、十分な特異的ハイブリダイゼーションが十分に可能であるため、当業者により十分許容できる。その上、想定された用途に応じて、様々な度合いの標的配列に対するプローブの選択性を達成するために、様々なハイブリダイゼーション条件を用いることが要求され得る。高い選択性が要求される用途のためには、典型的には、ハイブリダイズを形成するのに比較的ストリンジェントな条件を用いることが要求され得る。例えば、比較的低塩濃度および／または高温条件であって、例えば０.０２Ｍ〜０.１５ＭのＮａＣｌ、温度約５０℃〜約７０℃で提供された条件である。このような選択的な条件は、プローブと、テンプレートまたは標的鎖とのミスマッチをほとんど許容せず、起こったとしてもわずかである。
遺伝子型解析方法
ＳＮＰは、特に病気のマーカーとして有用な遺伝学的ツールである。ＳＮＰは、一般的に、例えばマイクロサテライトに対する、病気への感受性に関する好ましい遺伝子マーカーとみなされるが、その理由は以下のとおりである：（ａ）ＳＮＰは、ゲノム中に極めて広く存在する（これは、対象の遺伝子座において、ＳＮＰを同定できる可能性が高いことを意味する）、（ｂ）ＳＮＰの一部は、遺伝子のポリペプチド産物に直接影響を与えるため、病気の新規の分子メカニズムを明らかにできる、（ｃ）ＳＮＰは、その他の遺伝子マーカーより安定して遺伝する、および、最後に、（４）現存の遺伝子型解析方法は、対象のＳＮＰの存在または非存在について被検体をスクリーニングする比較的迅速で効率的な手段を提供する（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等（１９９８年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：７６９〜７７６）。
ＳＮＰは、特に病気のマーカーとして有用な遺伝学的ツールである。ＳＮＰは、一般的に、例えばマイクロサテライトに対する、病気への感受性に関する好ましい遺伝子マーカーとみなされるが、その理由は以下のとおりである：（ａ）ＳＮＰは、ゲノム中に極めて広く存在する（これは、対象の遺伝子座において、ＳＮＰを同定できる可能性が高いことを意味する）、（ｂ）ＳＮＰの一部は、遺伝子のポリペプチド産物に直接影響を与えるため、病気の新規の分子メカニズムを明らかにできる、（ｃ）ＳＮＰは、その他の遺伝子マーカーより安定して遺伝する、および、最後に、（４）現存の遺伝子型解析方法は、対象のＳＮＰの存在または非存在について被検体をスクリーニングする比較的迅速で効率的な手段を提供する（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等（１９９８年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：７６９〜７７６）。
現在、マルチ遺伝子型解析方法が利用可能である。現在利用可能な方法はいずれも標的配列の増幅を含むが、本発明はまた、配列の増幅を必要としない方法も考慮している。現在利用可能な方法の便利な要約が、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等（１９９８年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：７６９〜７７６の表Ｉに開示されている。このような方法としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接的なＤＮＡ配列解析、ＰＦＧＥ解析、サザンブロット解析、一本鎖高次構造解析（ＳＳＣＡ）、ＲＮアーゼ保護分析、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット解析、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、マイクロチップアレイ、および、ＷＡＶＥ核酸フラグメント分析システム（ＷＡＶＥ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）（以下で、および実施例で詳細に説明される）。
ＤＮＡ配列変異を検出するのに用いることができる数種の方法がある。遺伝子型解析プロセスは、以下の２つの一般的な工程に分離することができる：１）対立遺伝子の識別段階、および、２）解析段階（現在の方法論の総論として、例えばＧｕｔ（２００１年），Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．１７：４７５〜４９２；Ｋｗｏｋ（２００１年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＧｅｎｏｍｉｃｓＨｕｍ．Ｇｅｎｅｔ，２：２３５〜５８を参照）。
対立遺伝子の識別
多くの方法が、ヒト多型座位における特定の対立遺伝子を検出するために利用可能である。当業者であれば当然であるが、特異的な多型対立遺伝子を検出する好ましい方法は、部分的に多型の分子的な性質によるものがある。例えば、多型座位の様々な対立遺伝子型は、ＤＮＡの一塩基対ごとに異なることがある。このような単一ヌクレオチド多型（またはＳＮＰ）は、遺伝子変異を引き起こす主要な要因であり、そのうち８０％は全て既知の多型であり、それらのヒトゲノムにおける密度は、１,０００塩基対あたり平均１個と推測される。ＳＮＰは、最も高頻度の二対立遺伝子であり、２つの異なる型のみで生じる（ただし、ＤＮＡで生じる４つの異なるヌクレオチドの塩基に対応する最高４つの異なるＳＮＰの形態が論理上可能である）。それでもなお、ＳＮＰはその他の多型より突然変異に対して安定であり、そのためマーカーと未知の変異体との間の連鎖不平衡を用いて病気を引き起こす突然変異をマッピングする関連の研究に適している。加えて、ＳＮＰは典型的には２つの対立遺伝子しか有さないため、ＳＮＰは、長さの測定より簡単な、プラス／マイナス分析で遺伝子型解析することができ、オートメーション処理により適している。
多くの方法が、ヒト多型座位における特定の対立遺伝子を検出するために利用可能である。当業者であれば当然であるが、特異的な多型対立遺伝子を検出する好ましい方法は、部分的に多型の分子的な性質によるものがある。例えば、多型座位の様々な対立遺伝子型は、ＤＮＡの一塩基対ごとに異なることがある。このような単一ヌクレオチド多型（またはＳＮＰ）は、遺伝子変異を引き起こす主要な要因であり、そのうち８０％は全て既知の多型であり、それらのヒトゲノムにおける密度は、１,０００塩基対あたり平均１個と推測される。ＳＮＰは、最も高頻度の二対立遺伝子であり、２つの異なる型のみで生じる（ただし、ＤＮＡで生じる４つの異なるヌクレオチドの塩基に対応する最高４つの異なるＳＮＰの形態が論理上可能である）。それでもなお、ＳＮＰはその他の多型より突然変異に対して安定であり、そのためマーカーと未知の変異体との間の連鎖不平衡を用いて病気を引き起こす突然変異をマッピングする関連の研究に適している。加えて、ＳＮＰは典型的には２つの対立遺伝子しか有さないため、ＳＮＰは、長さの測定より簡単な、プラス／マイナス分析で遺伝子型解析することができ、オートメーション処理により適している。
個体における特定の一ヌクレオチド多型対立遺伝子の存在を検出するために、多種多様な方法が利用可能である。この分野における進歩により、正確で簡単な、低コストの大規模ＳＮＰ遺伝子型解析が提供されている。ごく最近、例えば、数種の新しい技術が説明されており、例えば、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシーケンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎ(R)システムが挙げられ、同様に、様々なＤＮＡ「チップ」技術、例えばアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ＳＮＰチップ（サンタクララ，カリフォルニア州）が挙げられる。これらの方法は、典型的にはＰＣＲによる標的遺伝子領域の増幅を必要とする。近年、侵入的な切断による小さいシグナル分子の生成、それに続くマススペクトロメトリーまたは固定化パッドロックプローブ、および、ローリングサークル増幅をベースとした方法がさらに開発されており、この方法は、最終的にはＰＣＲの必要性を省くこともできる。特異的単一ヌクレオチド多型を検出する当業界既知の方法のいくつかを以下に概説する。本発明の方法は、利用可能な全ての方法を含むものと理解される。
遺伝子型解析へのハイブリダイゼーションアプローチは、同一なＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡフラグメントの融解温度は、配列が異なるフラグメントの融解温度とは異なるという観察を利用する。重要なことには、この方法論によれば、適切なストリンジェンシー条件下で、単一ヌクレオチド多型によって生じた一つのヌクレオチドのミスマッチでも検出することが可能である。ストリンジェンシーを操作する方法は当業界周知であるが、ストリンジェンシー条件は、温度状態および緩衝液の選択、または、ＰＮＡのような修飾オリゴヌクレオチドの使用によって影響を受けることはよく知られている（Ｅｇｈｏｌｍ等（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６〜５６８）。対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、なかでもＤＮＡマイクロアレイ遺伝子型解析システムの基礎を形成する。
加えて、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼまたはヌクレアーゼのような様々な酵素は、様々な対立遺伝子のなかからよりよく識別するのに用いることができる。
一連の方法として、増幅不応性変異システム（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；ＡＲＭＳ）（Ｎｅｗｔｏｎ等（１９８９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：２５０３〜２５１６）、および、カイネティックＰＣＲ（Ｇｅｒｍｅｒ等（２０００年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１０：２５８〜２６６）は、ミスマッチした３’−残基を有するオリゴヌクレオチドは適切な条件下でのＰＣＲでプライマーとして機能しないため、ＰＣＲ産物の形成またはＰＣＲ産物の形成速度は、テンプレートに存在する対立遺伝子に依存し得るという観察によるものである。このアプローチで得られたＰＣＲ産物は、標準的なゲル電気泳動（ＡＲＭＳ）、または、形成中のＰＣＲ産物への蛍光色素の取り込みの解析（カイネティックＰＣＲ）のいずれかによってＳＮＰの存在に関して解析される。
一実施形態において、ＳＮＰは、５’ヌクレアーゼ分析の使用によって同定することができ、これはまた、ＴａｑＭａｎ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））として知られている。この方法論は当業界既知であり、ＰＣＲ反応への標的ＤＮＡの内部配列に相補的な標識プローブの添加が必要であり、この場合、プローブは、ＳＮＰを有する相補オリゴヌクレオチドに結合し、色素およびクエンチャー分子としてのプロセス中の分解および蛍光が分離される（Ｈｏｌｌａｎｄ等（１９９１年）；Ｌｉｖａｋ等（１９９５年）；Ｋａｌｉｎｉｎａ等（１９９７年））。
その他の実施形態において、ＳＮＰスコアリングのプライマー伸長の方法論が用いられる（「ミニシーケンス」）（総論としては、例えば、Ｓｙｖａｎｅｎ等（１９９９年）Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．，１３：１〜１０を参照）。この方法論において、オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＰＣＲアンプリコンにおける多型部位に隣接してアニールする。この工程に続いて、ＤＮＡポリメラーゼが添加され、続いて、標識された鎖終結ジデオキシヌクレオチドの存在下で、酵素によりプライマーを伸長させる。プライマー伸長方法は、多数の会社による多種多様なプラットフォームで利用可能であり、このような方法としては、これらに限定されないが、比色検出を用いたＥＬＩＳＡスタイルマイクロタイタープレートフォーマット（オーキッド・バイオサイエンス（Ｏｒｃｈｉｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）のＳＮＰ−ＩＴTM）、ＤＮＡマイクロアレイ検出システム（アフィメトリックス，アマシャム・ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＡＰＥＸ）、蛍光ビーズに基づく反応分類装置（ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ））、液相蛍光偏光法検出システム（ＬＪＬバイオシステムズ（ＬＪＬ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、マススペクトロメトリー（シーケノム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ））、および、自動化キャピラリーＤＮＡ配列解析（ＡＢＩのＳＮａＰｓｈｏｔ(R)）が挙げられる。
その他の実施形態において、オリゴヌクレオチドライゲーション分析（ＯＬＡ製）が、対立遺伝子を識別するのに用いられる。この方法において、ライゲーション位置の隣の塩基が、テンプレートオリゴヌクレオチドに完全に相補的である場合に、オリゴヌクレオチドはライゲートされる（例えば、Ｂａｒａｎｙ等（１９９１年）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，８８：１８９〜１９３；Ｓａｍｉｏｔａｋｉ等（１９９４年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０：２３８〜２４２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４,９９８．６１７；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．等（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７〜１０８０（１９８８年）を参照）。ＯＬＡプロトコールは、標的の一本鎖の隣接する配列にハイブリダイズできるように設計された２種のオリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドの一方は、分離マーカー（例えばビオチン化された）と連結しており、他方は、検出可能に標識されている。標的分子において正確な相補配列が発見される場合、そのオリゴヌクレオチドは、それらの末端が隣接し、ライゲーション基質が作製されるようにハイブリダイズし得る。次に、ライゲーションにより、標識されたオリゴヌクレオチドを、アビジン、またはその他のビオチンリガンドを用いて回収することができる。Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．等は、ＰＣＲおよびＯＬＡの特性を組合わせた核酸検出分析を説明している（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：８９２３〜２７（１９９０年））。この方法において、ＰＣＲを用いて、標的ＤＮＡの指数関数的な増幅を達成し、次に、これらはＯＬＡを用いて検出することができる。
このＯＬＡ方法に基づく数種の技術が開発されており、ＫＣＮＨ２またはＫＣＮＱ１対立遺伝子を検出するのに用いることができる。例えば、米国特許第５,５９３,８２６号は、ホスホロアミデート結合を有する抱合体を形成するための、３’−アミノ基と、５’−リン酸化オリゴヌクレオチドとを有するオリゴヌクレオチドを用いたＯＬＡを説明している。ＯＬＡのその他の改変法は、Ｔｏｂｅ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３７２８（１９９６年））で説明されている。ＰＣＲと組合わせたＯＬＡにより、１つのマイクロタイターウェルで２つの対立遺伝子のタイプ分けが可能である。固有のハプテン、すなわちジゴキシゲニンおよびフルオレセインを有するそれぞれの対立遺伝子特異的プライマーを作製することによって、それぞれのＯＬＡ反応は、異なる酵素レポーター、アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼで標識されたハプテン特異的抗体を用いて検出することができる。このシステムにより、２つの異なる色の生産が起こるハイスループットフォーマットを用いた２つの対立遺伝子の検出が可能である。
その他の実施形態において、パッドロック方法を用いてもよい。この方法において、一つのヌクレオチドは、ライゲーションにより環化される（Ｎｉｌｓｓｏｎ等（１９９４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：２０８５〜２０８８；Ｎｉｌｓｓｏｎ等（１９９７年）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ，１６：２５２〜２５５；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等（１９９６年）Ｍｅｔｈｏｄｓ，９：８４〜９０）。
被検体分析の一実施形態において、ＫＣＮＨ２またはＫＣＮＱ１の対立遺伝子が、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の使用により制限酵素切断パターンを改変することによって同定される（Ｍｙｅｒｓ，ＭａｎｉａｔｉｓおよびＬｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：５０１〜５２７（１９８７年））。例えば、サンプルおよびコントロールＤＮＡを、単離し、増幅し（場合により）、１またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、フラグメント長さを、ゲル電気泳動によって決定する。この方法は、制限エンドヌクレアーゼがそれらの基質に対して高い特性を有するという利点がある。いくつかの場合において、ＳＮＰは、制限酵素の認識部位を変化させ得る。このような状況において、酵素消化により新規の消化フラグメント群が生産され、このような群は、ＳＮＰの存在を示す可能性がある。一実施形態において、この方法論は、電気泳動によるサイズ分離技術、それに続く、サザンブロットでの標識されたプローブＤＮＡフラグメントを用いたサイズの差の検出を必要とする。その他の実施形態において、この方法に必要なゲノムＤＮＡの量を維持するために、消化の前にＤＮＡを増幅してもよい。あるいは、プロセスをさらに容易にするために、新規の制限部位を導入してもよい。
その他の実施形態において、ＳＮＰは、ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）の使用により検出される（ＨａｒｒｉｎｇｔｏｎおよびＬｉｅｂｅｒ（１９９４年）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，８：１３４４〜１３５５；Ｍｅｉｎ等（２０００年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１０：３３０〜３４３）。この分析において、５’オーバーハング（ｆｌａｐ）を有する２つのオリゴヌクレオチド（インベーダーおよびシグナルオリゴ）が、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。このようなシグナルオリゴと標的との完全なマッチが存在する場合、ｆｌａｐは切断される。次に、５’オーバーハングの切断により、シグナルを生成する他の反応が促進される（Ｒｙａｎ等（１９９９年）Ｍｏｌ．Ｄｉａｇ．４：１３５〜１４４０）。重要なことには、この方法は、ＰＣＲの使用が必要ない。この技術の一例であるインベーダー（ｉｎｖａｄｅｒ）TMシステムは、サード・ウェーブ・テクノロジーズ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）より入手可能である。
さらにその他の実施形態において、当業界既知のあらゆる多種多様なシーケンス反応を、対立遺伝子を直接配列解析するのに用いることができる。代表的なシーケンス反応としては、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７４：５６０（１９７７年））、または、Ｓａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．（ＵＳＡ）７４：５４６３（１９７７年））によって開発された技術に基づくものが挙げられる。被検体分析を行う場合、あらゆる多種多様な自動配列解析方法（例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８（１９９５年）を参照）の利用も考慮することができ、例えば、マススペクトロメトリーによる配列解析（例えば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ等，Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７〜１６２（１９９６年）；および、Ｇｒｉｆｆｉｎ等，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７〜１５９（１９９３年）を参照）が挙げられる。当業者には当然であるが、特定の実施形態において、シーケンス反応で決定するには、１つのみ、２または３個の核酸塩基の存在が必要である。例えば１つのみの核酸が検出されるＡ−トラックなどが行うことができる。
その他の実施形態において、単一ヌクレオチド多型は、パイロシーケンシング（それぞれのさらなる塩基対の伸長を示す化学発光反応を用いて短いＤＮＡストレッチを連続してリーディングすることができる方法）で検出される（Ｒｏｎａｇｈｉ等（１９９６年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４２：８４〜８９；Ｒｏｎａｇｈｉ等（１９９９年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７：６５〜７１）。
一実施形態において、単一塩基多型は、特殊化したエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを用いて検出することができ、これは、例えばＭｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４,６５６,１２７号）によって説明されている。この方法によれば、対立遺伝子配列に３’直後から多型部位に向かって相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトから得た標的分子にハイブリダイズさせることが可能である。標的分子上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含む場合、その誘導体は、ハイブリダイズしたプライマーの末端に組み込まれる。このような組込みにより、プライマーをエキソヌクレアーゼに対して耐性にし、それにより、その検出が可能になる。サンプルのエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の同一性がわかっているため、プライマーのエキソヌクレアーゼ耐性を検出することにより、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドは、この反応で用いられたヌクレオチド誘導体の多型部位に相補的であることを明確にすることができる。この方法は、大量の外部の配列データでの決定が必要ないという利点を有する。
本発明のその他の実施形態において、溶液ベースの方法が、多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するのに用いられる。Ｃｏｈｅｎ．Ｄ．等（フランス国特許第２,６５０,８４０号；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９１／０２０８７）。米国特許第４,６５６,１２７号のＭｕｎｄｙ法にあるように、対立遺伝子配列に３’直後から多型部位に向かって相補的なプライマーが用いられる。この方法は、標識されたジデオキシヌクレオチド誘導体（多型部位のヌクレオチドに相補的な場合、プライマーの末端に取り込まれる）を用いてその部位のヌクレオチドの同一性を決定する。
その代わりの方法として、遺伝子ビット解析（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）またはＧＢＡTMとして知られているものがあり、これは、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．等（ＰＣＴ出願番号９２／１５７１２）で説明されている。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．等の方法は、標識ターミネーターと、３’から多型部位に向かった配列に相補的なプライマーの混合物を用いている。従って、取り込まれた標識ターミネーターは、評価される標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドによって決定され、それらに相補的である。Ｃｏｈｅｎ等（フランス国特許２,６５０,８４０；ＰＣＴ公報番号Ｗ０９１／０２０８７）の方法に対して、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．等の方法は、好ましくは、ヘテロジニアスフェーズアッセイであり、この方法において、プライマーまたは標的分子は、固相に固定される。
ＤＮＡにおける多型部位を分析するための、様々なプライマーガイドヌクレオチドの取り込み方法が説明されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９〜７７８４（１９８９年）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０年）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．等，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：６８４〜６９２（１９９０年）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３〜１１４７（１９９１年）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．等，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９〜１６４（１９９２年）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．等，ＧＡＴＡ ９：１０７〜１１２（１９９２年）；Ｎｙｒｅｎ．Ｐ．等，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１〜１７５（１９９３年））。これらの方法は、いずれも多型部位での塩基間の差を識別するのに標識デオキシヌクレオチドの取り込みを利用する点でＧＢＡTMとは異なる。このような様式において、シグナルは、取り込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドの配列で生じる多型は、配列の長さに比例するシグナルを生産することができる（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．等，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６〜５９（１９９３年））。
タンパク質翻訳の早期終結を起こす突然変異に関して、プロテイントランケーションテスト（ＰＴＴ）が、効率的な診断アプローチを提供する（Ｒｏｅｓｔ等（１９９３年）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１７１９〜２１；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｉｊｔ等（１９９４年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０：１〜４）。ＰＴＴについて、最初に利用可能な組織からＲＮＡを単離し、逆転写し、対象のセグメントをＰＣＲで増幅する。次に、この逆転写ＰＣＲ産物が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、真核性の翻訳を開始させる配列とを含むプライマーを用いたネステッドＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いられる。対象の領域を増幅した後、プライマーに取り込まれた特有のモチーフにより、ＰＣＲ産物の連続的なインビトロでの転写および翻訳が可能になる。翻訳産物のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、短縮化されたポリペプチドの外観は、翻訳の早期終結を引き起こす突然変異の存在を示す。この技術の改変法において、対象の標的領域が、単一のエキソンから得られる場合、ＰＣＲテンプレートとしてＤＮＡ（ＲＮＡと反対である）が用いられる。
主として１つの核酸配列の検出に焦点を当てた方法に加えて、このような検出スキームにおいて、プロファイルも評価され得る。フィンガープリントプロファイルは、例えばディファレンシャルディスプレイ方法、ノーザン解析および／またはＲＴ−ＰＣＲを利用することによって製造できる。
その他の検出方法は、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションであり、この方法において、ＫＣＮＨ２またはＫＣＮＱ１ハプロタイプの少なくとも１つの対立遺伝子の領域がオーバーラップしており、突然変異または多型領域の周辺に約５、１０、２０、２５または３０個のヌクレオチドを有するプローブが用いられる。本発明の好ましい実施形態において、心臓血管疾患に関与するその他の対立遺伝子変異体に特異的にハイブリダイズすることができる数種のプローブを、固相支持体に付着させ、このような固相支持体としては、例えば「チップ」（これは、〜約２５０,０００個のオリゴヌクレオチドを保持することが可能である）が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、リソグラフィーのような多種多様なプロセスによって固体支持体に結合させることができる。これらのオリゴヌクレオチドを含むチップを用いた突然変異の検出解析はまた、「ＤＮＡプローブアレイ」とも呼ばれており、例えば、Ｃｒｏｎｉｎ等，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４（１９９６年）で説明されている。一実施形態において、チップは、遺伝子の少なくとも１つの多型領域の対立遺伝子変異体を全て含む。次に、固相支持体と、試験核酸とを接触させ、特異的プローブへのハイブリダイゼーションが検出される。従って、簡単なハイブリダイゼーション実験で、１またはそれ以上の遺伝子の多数の対立遺伝子変異体の同一性を同定することができる。
さらなる実施形態において、切断剤（例えばヌクレアーゼ、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、および、ピペリジン）からの保護を用いて、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出することができる（Ｍｙｅｒｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２（１９８５年））。一般的に、「ミスマッチ切断」技術は、まず、野生型の対立遺伝子を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡと、サンプルとをハイブリダイズさせることによって形成されたヘテロ二本鎖を提供する。二本鎖の一本鎖領域（例えば、このような領域は、コントロール鎖とサンプル鎖間の塩基対ミスマッチにより生じる可能性がある）を切断する物質で、二本鎖の二重らせんを処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖は、ＲＮアーゼで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイズは、Ｓ１ヌクレアーゼで処理して、ミスマッチ領域を酵素的に消化するとができる。その他の実施形態において、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、および、ピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域を消化した後、次に、得られた材料は、変性ポリアクリルアミドゲルでサイズに応じて分離され、突然変異部位を決定することができる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：４３９７（１９８８年）；および、Ｓａｌｅｅｂａ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６〜２９５（１９９２年）を参照。好ましい実施形態において、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識することができる。
さらにその他の実施形態において、ミスマッチの切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１またはそれ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を用いる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕ等，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７〜１６６２（１９９４年））。代表的な実施形態によれば、ハプロタイプの対立遺伝子に基づくプローブは、試験細胞からのｃＤＮＡまたはその他のＤＮＡ産物にハイブリダイズする。その二本鎖はＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理され、切断産物（存在する場合）は電気泳動プロトコールなどで検出することができる。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照。
対立遺伝子を検出するその他の技術の例としては、これらに限定されないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または、選択的プライマー伸長が挙げられる。例えば、既知の突然変異またはヌクレオチドの差（例えば対立遺伝子変異体における）が中心に置かれ、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションが可能な条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを製造することができる（Ｓａｉｋｉ等，Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３（１９８６年））；Ｓａｉｋｉ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：６２３０（１９８９年））。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術は、オリゴヌクレオチドが、ＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡにハイブリダイズする場合、１反応あたり１つの突然変異または多型領域を試験すること、または、オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズメンブレンに付着し、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合、様々な突然変異または多型領域の数を試験することに用いることができる。
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅による対立遺伝子特異的増幅技術を本発明とあわせて用いてもよい。特異的増幅のプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、対象の突然変異または多型領域を、分子の中心に（増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションによって行われるように）（Ｇｉｂｂｓ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２４３７〜２４４８（１９８９年））、または、一方のプライマーの３’末端の最も端に（適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を防ぐか、または、減少させるように）（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ，Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８（１９９３年）含ませることができる。加えて、切断に基づく検出がなされるように突然変異領域に新規の制限部位を導入することが望ましい場合がある（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１（１９９２年））。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用のＴａｑリガーゼを用いて行うことができると予想される（Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：１８９（１９９１年））。このような場合において、ライゲーションは、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ起こり、増幅の存在または非存在を検索することによって特異的部位における既知の突然変異の存在を検出することが可能になる。
ＳＮＰ解析方法
マルチ解析の方法論は、可能性のある対立遺伝子変異体の解析に利用可能である。このような方法としては、これらに限定されないが、ゲル、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、コード化したスフェア、マススペクトロメーター、および、統合型のサーモサイクラーを有するマイクロタイタープレート蛍光リーダーが挙げられる。
マルチ解析の方法論は、可能性のある対立遺伝子変異体の解析に利用可能である。このような方法としては、これらに限定されないが、ゲル、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、コード化したスフェア、マススペクトロメーター、および、統合型のサーモサイクラーを有するマイクロタイタープレート蛍光リーダーが挙げられる。
一実施形態において、ＤＮＡ配列解析と組合わせてゲル解析が用いられる。その他の実施形態において、ゲル解析を含む、ＭＡＳＤＡ、ハイブリダイゼーションに基づく遺伝子型解析方法を用いることができる（Ｓｈｕｂｅｒ等（１９９７年）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：３３７〜３４７）。ゲル解析アプローチのその他の利用法としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：スラブゲル蛍光解析と組合わせたプライマー伸長方法（Ｐａｓｔｉｎｅｎ等（１９９６年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：１３９１〜１３９７）、ゲル解析と組合わせたオリゴヌクレオチドライゲーション分析（Ｇｒｏｓｓｍａｎ等（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（２１）：４５２７〜３４；Ｄａｙ等（１９９５年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９：１５２〜６２）、マイクロタイターアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）（ＤａｙおよびＨｕｍｐｈｒｉｅｓ（１９９４年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２２（２）：３８９〜９５）；ゲルに基づく解析と組合わせた制限消化による対立遺伝子検出（ＲＦＬＰ）（ＰａｒｓｏｎｓおよびＨｅｆｌｉｃｈ（１９９７年）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．３８７（２）：９７〜１２１）；９６−キャピラリー電気泳動シーケンサーと組合わせたプライマー伸長方法（例えば、ＳｎａｐＳｈｏｔ，アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製）；ＭＡＳＤＡ解析と組合わせたハイブリダイゼーション方法（Ｓｈｕｂｅｒ等（１９９７年）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．６：３３７〜３４７）；パッドロック解析と組合わせたライゲーション方法（Ｎｉｌｓｓｏｎ等（１９９４年）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等（１９９６年））。
さらにその他の実施形態において、電気泳動移動度における変化を、ＫＣＮＨ２またはＫＣＮＱ１対立遺伝子を同定するのに用いることができる。例えば、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を、突然変異体と野生型核酸との電気泳動移動度の差を検出するのに用いることができる（Ｏｒｉｔａ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８６：２７６６（１９８９年）、また、Ｃｏｔｔｏｎ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４（１９９３年）；および、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９（１９９２年）も参照）。サンプルおよびコントロールＫＣＮＨ２またはＫＣＮＱ１対立遺伝子の一本鎖ＤＮＡフラグメントを変性させ、再生させる。一本鎖核酸の２次構造は配列に応じて様々であるため、電気泳動移動度の変化が起こり、それによって１つの塩基の変化でも検出が可能である。ＤＮＡフラグメントは、標識プローブを用いて標識または検出することができる。分析の感度は、ＲＮＡ（ＤＮＡよりむしろ）を用いて増強することができ、この場合、２次構造は配列の変化に対する感度がより高くなる。好ましい実施形態において、この方法は、ヘテロ二本鎖分析を利用して、電気泳動移動度の変化に基づき二本鎖化したヘテロ二本鎖分子を分離する（Ｋｅｅｎ等，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．７：５（１９９１年））。
さらにその他の実施形態において、変性剤の濃度勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおける対立遺伝子の移動が、変性濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて分析される（Ｍｙｅｒｓ等，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５（１９８５年））。ＤＧＧＥが解析方法として用いられる場合、ＤＮＡを修飾して、完全な変性を防いでもよく、例えば、高融点のＧＣ−リッチなＤＮＡの約４０ｂｐのＧＣクランプをＰＣＲで付加することによってなされる。さらなる実施形態において、変性剤の濃度勾配の代わりに、温度勾配を用いて、コントロールＤＮＡとサンプルＤＮＡとの移動度の差を同定することができる（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３（１９８７年））。
対立遺伝子の検出技術はまた、解析手段として蛍光エネルギー移動と組合わせてもよい（総論としては、Ｇｕｔ．Ｉ．（２００１年）Ｈｕｍ．Ｍｕｔ １７：４７５〜４９２を参照）。例えば、この方法論を、コンビネーションオリゴヌクレオチドライゲーションに用いることができ（Ｃｈｅｎ，Ｘ．等（１９９８年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，８：５４９〜５５６）、または、プライマー伸長方法と組合わせて用いることができる（Ｃｈｅｎ，Ｘ．等（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５：３４７〜３５３；Ｃｈｅｎ，Ｘ．等（１９９９年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：４９２〜４９８）。
対立遺伝子の検出技術はまた、解析手段としてマイクロアレイまたはマススペクトロスコピーと組合わせてもよい（総論として、Ｇｕｔ，Ｉ．（２００１年）Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．１７：４７５〜４９２を参照）。
遺伝子型分析キット
本発明のその他の実施形態は、抗不整脈剤の投与または非心臓性の薬物療法のいずれかにより薬物誘発性不整脈を発症させる疾病素質を検出するためのキットを目的とする。これらのキットは、１またはそれ以上のオリゴヌクレオチド（例えば、５’および３’がＫＣＮＨ２またはＫＣＮＱ１のいずれかの少なくとも１つの対立遺伝子にハイブリダイズする５’および３’オリゴヌクレオチド）を含み得る。その後の解析に都合のよいサイズのＰＣＲ産物が生産されるように、ＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチドは、２５〜２５００塩基対離れて、好ましくは約１００〜約５００塩基離れてハイブリダイズするべきである。
本発明のその他の実施形態は、抗不整脈剤の投与または非心臓性の薬物療法のいずれかにより薬物誘発性不整脈を発症させる疾病素質を検出するためのキットを目的とする。これらのキットは、１またはそれ以上のオリゴヌクレオチド（例えば、５’および３’がＫＣＮＨ２またはＫＣＮＱ１のいずれかの少なくとも１つの対立遺伝子にハイブリダイズする５’および３’オリゴヌクレオチド）を含み得る。その後の解析に都合のよいサイズのＰＣＲ産物が生産されるように、ＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチドは、２５〜２５００塩基対離れて、好ましくは約１００〜約５００塩基離れてハイブリダイズするべきである。
本発明に係るキットの一実施形態に含まれるオリゴヌクレオチドは、対象の領域の増幅、または、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の、問題のマーカーへの直接的なハイブリダイゼーションに用いることができる。従って、このようなオリゴヌクレオチドは、対象のマーカーの端に存在する（ＰＣＲ増幅で要求されるように）か、または、マーカーが直接オーバーラップしている（ＡＳＯハイブリダイゼーションでのように）かのいずれかであり得る。
本発明の方法によるＫＣＮＨ２またはＫＣＮＱ１多型対立遺伝子のいずれかの増幅および検出において使用するためのオリゴヌクレオチドの設計は、ヒト第１１染色体（特定の位置１１ｐ１５．５）（ヒトＫＣＮＨ２遺伝子座を含む）、または、第７染色体（特定の位置７ｑ３５−ｑ３６）（ヒトＫＣＮＱ１遺伝子座を含む）の両方からアップデートされた配列情報、および、この遺伝子座に利用可能なアップデートされたヒト多型情報を入手することによって簡易化される。これらの遺伝子におけるヒト多型の検出に適したプライマーは、この配列情報と当業界既知のプライマー配列の設計および最適化に関する標準的な技術を用いて容易に設計することができる。このようなプライマー配列の最適な設計は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ２．１、Ｐｒｉｍｅｒ３またはＧｅｎｅＦｉｓｈｅｒ(R)のような市販のプライマー選択プログラムの使用によって達成することができる。
キットで使用するために、オリゴヌクレオチドは、あらゆる多種多様な天然および／または合成組成物が可能であり、例えば、合成オリゴヌクレオチド、制限フラグメント、ｃＤＮＡ、合成ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。本分析キットおよび方法はまた、標識オリゴヌクレオチドを用いて、分析における同定を簡単にしてもよい。使用可能な標識の例としては、放射標識、酵素、蛍光化合物、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、磁気成分、金属結合成分、抗原または抗体成分などが挙げられる。
本キットはまた、場合により、ＤＮＡサンプリング手段を含んでもよい。ＤＮＡサンプリング手段は、当業者周知である。ＤＮＡサンプリングのための試薬としては、ＤＮＡ精製試薬、例えばヌクレオン（Ｎｕｃｌｅｏｎ）TMキット、リシス緩衝液、プロテアーゼ溶液など；ＰＣＲ試薬、例えば１０×反応緩衝液、熱安定性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰなど；および、対立遺伝子の検出手段、例えばＨｉｎｆＩ制限酵素、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、および、ネステッドＰＣＲ用の、乾燥血液由来のディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。
本発明の実施は、特に他の指定がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、ミクロ生物学、組換えＤＮＡ、および、免疫学の従来の技術を用いるが、これらは当業界の技術範囲内である。このような技術は文献で説明されている。例えば、以下を参照：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）：１９８９年）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４年）；Ｍｕｌｌｉｓ等，米国特許番第４,６８３,１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ），１９８６年）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），ニューヨーク）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７年，コールドスプリングハーバーラボラトリー）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４および１５５巻（Ｗｕ等編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編，アカデミックプレス，ロンドン，１９８７年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６年）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク，１９８６年）。
例証
不整脈の分子遺伝学−心臓のカリウムチャンネル
不整脈に対する感受性は、少なくとも部分的に、様々なイオンチャンネル遺伝子における異常によって決定される。不整脈は、遺伝性不整脈、突発性不整脈、および、薬物誘発性不整脈にさらに分類することができる。
不整脈の分子遺伝学−心臓のカリウムチャンネル
不整脈に対する感受性は、少なくとも部分的に、様々なイオンチャンネル遺伝子における異常によって決定される。不整脈は、遺伝性不整脈、突発性不整脈、および、薬物誘発性不整脈にさらに分類することができる。
これまで、個々のイオンチャンネルサブユニットをコードする６種の独立した遺伝子が、ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）などの遺伝性不整脈の病因に関与すると同定されている：ＫＣＮＱ１（ＬＱＴ１）、ＫＣＮＨ２（ｈ−ｅｒｇまたはＬＱＴ２）、ＳＣＮ５Ａ（ＬＱＴ３）、ＫＣＮＥ１（ＬＱＴ５）、ＫＣＮＥ２（ＭｉＲＰ１またはＬＱＴ６）、および、ＲｙＲ２（Ｃｕｒｒａｎ．等（１９９５年）Ｃｅｌｌ，８０：７９５〜８０３；Ｗａｎｇ等（１９９５年）Ｃｅｌｌ ８０：８０５〜８１１；Ｗａｎｇ．等（１９９５年）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：１６０３〜１６０７；Ｗａｎｇ等（１９９６年）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１７〜２３；Ｓｐｌａｗｓｋｉ．等（１９９７年）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３６：１５６２〜１５６７；Ｓｐｌａｗｓｋｉ等（１９９７年）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１７：３３８〜３４０；Ｃｈｅｎ等（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ，３９２：２９３〜２９６；Ａｂｂｏｔｔ等（１９９９年）Ｃｅｌｌ，９７：１７５〜１８７；Ｐｒｉｏｒｉ等（２０００年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０２：ｒ４９〜ｒ５３）。ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＥ２およびＫＣＮＨ２核酸は、カリウムチャンネルサブユニットをコードし、ＳＣＮ５Ａ核酸は、ナトリウムチャンネルサブユニットをコードし、ＲｙＲ２は、心臓のリアノジン受容体をコードする。
機能的なイオンチャンネルは、個々のサブユニットからなる多量体であり、これらサブユニットはホモまたはヘテロな組合わせのいずれかで組み合わせることができる。心臓のカリウムチャンネルの場合、ＫＣＮＨ２サブユニットは、ホモ多量体カリウムチャンネルに共にアセンブルされ、ＫＣＮＥ１およびＫＣＮＱ１（ＫＶＬＱＴ１）チャンネルサブユニットは、共にアセンブルされ、ヘテロ多量体カリウムチャンネルタンパク質を形成する。
近年の分子遺伝学の進歩により、頻発性の気絶（多くは運動または感情的なストレスの際の）、ＱＴ間隔の延長、および、ＥＣＧにおけるＴ波とＵ波の異常を特徴とする遺伝性ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）のほとんどの場合の遺伝学的な根拠の解明が促進されてきた。これは順に、これらの遺伝子の関係と、薬物誘発性または後天性のＱＴ間隔延長との、新たに発生した関連を導いてきた。気絶の一つの理由は、ＴｄＰであり、これは、心室細動および死に至る可能性がある。ＴｄＰ発症のメカニズムは、外部への再分極Ｋ+チャンネルの妨害、または、内部への脱分極Ｎａ+チャンネルの活性化による正常で完全な膜の再分極の不全である、後天性ＴｄＰと、遺伝性ＴｄＰの両方において類似している。正常な脱分極の不全は、脱分極の後に引き起され、ＱＴ間隔延長および心室不整脈の開始を起こす可能性がある。これは、後天性ＱＴ延長症候群と遺伝性ＱＴ延長症候群との間に関連がある可能性を示す。
大半のＬＱＴＳ被検体は、２種の心臓のカリウムチャンネル遺伝子、ＫＣＮＨ２およびＫＣＮＱ１のいずれかに突然変異を有するようであるが（Ｃｕｒｒａｎ，Ｍ．Ｅ．等，Ｃｅｌｌ ８０：７９５〜８０３（１９９５年）、および、Ｗａｎｇ．Ｑ．等，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ １２：１７〜２３（１９９６年）を参照）、さらなるケースは、カリウムチャンネル調節サブユニットＫＣＮＥ１およびＫＣＮＥ２（Ｓｐｌａｗｓｋｉ，Ｉ．等，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１７：３３８〜３４０（１９９７年）；Ａｂｂｏｔｔ，Ｇ．Ｗ．等，Ｃｅｌｌ ９７：１７５〜１８７（１９９９年）を参照）、心臓の電圧依存性ナトリウムチャンネルαサブユニットＳＣＮ５Ａ（Ｗａｎｇ，Ｑ．等，Ｃｅｌｌ ８０：８０５〜８１１（１９９５年）を参照）、および、その他の同定されていない遺伝子産物（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｊ．Ｊ．等，５７：１１１４〜１１２２（１９９５年）を参照）をコードする遺伝子における突然変異によって引き起こされる。
多くのＬＱＴＳは、常染色体優性型の障害（ロマノ−ウォード症候群）に属する。まれな常染色体劣性変異型のジャーベル−ランゲニールセン症候群は、聴覚消失症に関連する。ロマノ−ウォード症候群は、遺伝学的にヘテロジニアスであり、重症度と予後において表現型の差がある。それぞれ第１１染色体、第７染色体、第３染色体および第２１染色体に位置する４種の異なる遺伝子（ＬＱＴ１、ＬＱＴ２、ＬＱＴ３およびＬＱＴ５）における突然変異が、ＬＱＴＳの９０％超に関与する。第４染色体にある第５の遺伝子座は、フランス人の系統、および、残部を占めるその他のまだ同定されていない遺伝子（すなわち、これまでに同定された遺伝子への連鎖解析によって除外された）における障害に関連している。
ＬＱＴ１：ＬＱＴＳ発生率は約５０％であり、新しくクローニングされた遺伝子ＫＣＮＱ１（電圧活性化カリウムチャンネルに類似した５８１個のアミノ酸タンパク質をコードする）における突然変異を含む。ＫＣＮＥ１と組合わせて、これは、心臓におけるフェーズ３の再分極に関与する遅延整流性カリウム電流（ＩＫs）を構成するようである。これまで、この遺伝子に関して約３５の突然変異が同定されている。
ＬＱＴ２：ＬＱＴＳにおいて第二のカリウムチャンネル遺伝子（ＫＣＮＨ２）における突然変異が同定されており、第７染色体に連鎖している。ＫＣＮＨ２は、フェーズ３の再分極にも関与する迅速に活性化される遅延整流性カリウム電流（ＩＫR）に関与する。ドフェチリドのようなクラスＩＩＩ抗不整脈剤は、ＫＣＮＨ２チャンネルをブロックする。この遺伝子に関して少なくとも１７の突然変異が同定されている。
ＬＱＴ３は、第３染色体に位置するナトリウムチャンネル（ＳＣＮ５Ａ）に関する遺伝子に連鎖している。これまでに、３つの突然変異が同定されており、これらによって、チャンネルを迅速に不活性化することができなくなり、活性のバーストの延長を引き起こす。
ＬＱＴ５：第２１染色体に位置するＫＣＮＥ１は、カリウムチャンネルタンパク質をコードし、このタンパク質は、ＫＣＮＱ１によってコードされたタンパク質と機能的に相互作用し、ＩKS特性を有するイオン電流を形成する。ジャーベル−ランゲニールセン症候群に罹ったファミリーにおいて、化合物ヘテロ接合突然変異、Ｔｈｒ７ＩｌｅおよびＡｓｐ７６Ａｓｎが発見された。加えて、ＱＴ延長症候群を有する患者におけるＡｓｐ７６Ａｓｎ変異、および、その他の突然変異Ｓｅｒ７４Ｌｅｕは、活性化の電圧依存性をシフトさせ、チャンネル非活性化を促進することによって、ＩKsを減少させることが研究者により決定されている。
薬物誘発性ＴｄＰに対する影響
文献における証拠、同様に、本発明で開示された証拠が、イオンチャンネル遺伝子が、一様に障害の分子的な原因であることを示しているにもかかわらず、薬物誘発性不整脈の原因論についてはあまりわかっていない。
文献における証拠、同様に、本発明で開示された証拠が、イオンチャンネル遺伝子が、一様に障害の分子的な原因であることを示しているにもかかわらず、薬物誘発性不整脈の原因論についてはあまりわかっていない。
Ｋ+またはＮａ+イオンチャンネルの機能障害は、特徴付けられた突然変異に関連する。ＫＣＮＨ２において、例えばミスセンス突然変異は、一般的に、欠失が起こすより深刻なチャンネル機能の減少を引き起こす。しかしながら異なるミスセンス突然変異はまた、異なる作用を有する可能性がある：Ｙ６１１Ｈ、および、Ｖ８２２Ｍは、異常なチャンネルプロセシングを引き起こし、それによりタンパク質が小胞体内に保持される；Ｉ５９３ＧおよびＧ６２８Ｓは、正常にプロセシングされるが、機能しないチャンネルを生じる；一方、Ｔ４７４Ｉは、改変されたチャンネルゲーティングを起こす。従って個体は、潜在性の突然変異を有する可能性があるが、これは、Ｋ+チャンネルをブロックする、または、活動電位を延長する薬物を用いた試みにおいてのみ証明されている。ＫＣＮＱ１において、チャンネルのカルボキシ末端において置換をもたらす突然変異は、あまり深刻でない表現型を生じるようである。
最近まで、ＱＴ延長症候群を引き起こす突然変異の全てが、優性の負の作用を働かせる、すなわち、ヘテロ接合体が影響を受け、遺伝は常染色体優性であると考えられていた。近年、ＬＱＴ１を有するファミリーで機能的な突然変異が発見されており、この変異は、常染色体劣性遺伝であることが示されている。全てのヘテロ接合体は、正常なＱＴ間隔を有していた。機能的な突然変異は、より軽度のチャンネル活性の障害（総電流の減少、活性化の際の過分極のシフト、および、より速い活性化速度）を引き起こした。これは、ＬＱＴＳ遺伝子における軽度の突然変異は、一般的な集団において、そしておそらくは臨床的な結果を必ず引き起こす遺伝子より高い罹患率で存在し得ることを示す。
近年、キニジン治療の後にＬＱＴＳを発症した５９歳の女性において、ＫＣＮＨ２遺伝子のミスセンス突然変異が同定された。加えて、ＴｄＰを示し、シサプリド治療を受けている７４歳の女性、同様に、遺伝性ＱＴＳ間隔延長に罹っており、アステミゾールおよびエリスロマイシン摂取後にＴｄＰを発症した３０歳の女性において、ＫＣＮＱ１遺伝子の突然変異が同定された。
ここで一般的に説明した本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解可能であり、これら実施例は、本発明の特定の形態および実施形態を説明するために提供されるものであり、決して本発明を限定する意図はない。
実施例１．ＤＮＡの単離および増幅
ゲノムＤＮＡサンプルを、ＤＩＡＭＯＮＤ（Ｄａｎｉｓｈ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｏｎ Ｄｏｆｅｔｉｌｉｄｅ）試験、または、本質的にＤＩＡＭＯＮＤ試験と類似した臨床プロトコールに登録された患者の血液サンプルから得た。これらの研究は、２つの患者群に対するドフェチリドの作用に焦点を当てており、２つの患者群とは、うっ血性心不全に罹った群、および、左心室の機能障害に関連する心筋梗塞に最近罹った群（駆出率＜３５％）である（Ｍｏｌｌｅｒ，Ｍ．（１９９６年）Ｌａｎｃｅｔ，３４８（９０４１）：１５９７−８；Ｍｏｌｌｅｒ，Ｍ．等（１９９７年）Ｃｏｎｇｅｓｔ．Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ．，７（３）：１４６〜１５０）。ＤＮＡサンプルを、トータルで１０５人の患者から得た。１０５人の患者のうち７人が、ドフェチリドでの治療の際にトルサード・ド・ポワント（ＴｄＰ）を発症させたが、残りの９８人の患者は、副作用としてＴｄＰを発症させることなく治療に応答した。
ゲノムＤＮＡサンプルを、ＤＩＡＭＯＮＤ（Ｄａｎｉｓｈ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｏｎ Ｄｏｆｅｔｉｌｉｄｅ）試験、または、本質的にＤＩＡＭＯＮＤ試験と類似した臨床プロトコールに登録された患者の血液サンプルから得た。これらの研究は、２つの患者群に対するドフェチリドの作用に焦点を当てており、２つの患者群とは、うっ血性心不全に罹った群、および、左心室の機能障害に関連する心筋梗塞に最近罹った群（駆出率＜３５％）である（Ｍｏｌｌｅｒ，Ｍ．（１９９６年）Ｌａｎｃｅｔ，３４８（９０４１）：１５９７−８；Ｍｏｌｌｅｒ，Ｍ．等（１９９７年）Ｃｏｎｇｅｓｔ．Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ．，７（３）：１４６〜１５０）。ＤＮＡサンプルを、トータルで１０５人の患者から得た。１０５人の患者のうち７人が、ドフェチリドでの治療の際にトルサード・ド・ポワント（ＴｄＰ）を発症させたが、残りの９８人の患者は、副作用としてＴｄＰを発症させることなく治療に応答した。
実施例２．スクリーニング方法
Ｎｅｙｒｏｕｄ，Ｎ．等（１９９９年）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８４：２９０〜２９７で説明されたＰＣＲ法を用いて、単離されたＤＮＡを増幅した。フランキングイントロン配列に基づきプライマーを構築し、各エキソンを増幅するのに用いた。
Ｎｅｙｒｏｕｄ，Ｎ．等（１９９９年）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８４：２９０〜２９７で説明されたＰＣＲ法を用いて、単離されたＤＮＡを増幅した。フランキングイントロン配列に基づきプライマーを構築し、各エキソンを増幅するのに用いた。
自動化したＷＡＶＥ核酸フラグメント分析システム（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｋｕｋｌｉｎ．Ａ．等（１９９７年）Ｇｅｎｅｔ．Ｔｅｓｔ，１（３）：２０１−６；Ｋｕｋｌｉｎ，Ａ．等（１９９９年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ．１３（３）：２３９〜４２）、または、直接的な配列解析法のいずれかの使用によって、突然変異のスクリーニングを行った。ＫＣＮＱ１については、ＷＡＶＥを用いて突然変異のスクリーニングを行い、従来のジ−デオキシ配列解析技術を用いて候補の多型の存在を独立して確認した（例えば、Ｓａｎｇｅｒ等（１９７７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）７４：５４６３を参照）。ＫＣＮＨ２については、従来のジ−デオキシ配列解析技術を用いて突然変異のスクリーニングを行った。配列解析を用いて突然変異を確認した後、蛍光偏光法（ＦＰ）による遺伝子型解析（Ｃｈｅｎ，Ｘ．等（１９９９年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：４９２〜４９８）を、９６のコントロール（１９２の染色体）で行った。ＷＡＶＥ核酸フラグメント分析システムと、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を用いたヘテロ二本鎖分析（ＨＡ）とを組合わせて用いて、対立遺伝子型の多型の両方（ヘテロ接合体、または、両方の対立遺伝子の１：１の混合のいずれか）を含むＰＣＲ産物における変異体を、ヘテロ二本鎖の分離によって検出することができる。ＦＰ法は、分子によって放出された蛍光偏光の程度は、その分子の分子量に比例するため、対象の分子が多型を含むような場合には偏光の程度は変化し得るという観察による（総論としては、Ｋｗｏｋ，Ｐ．Ｙ．（２００２年）Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔ．，１９：３１５〜３２３を参照）。
実施例３．薬物誘発性不整脈の原因となる多型に関する心臓のイオンチャンネルのスクリーニング
ＬＱＴＳに関する候補遺伝子を新規の多型の存在についてスクリーニングした。この研究においてスクリーニングされた候補のＬＱＴＳ遺伝子、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＨ２、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＥ２、ＳＣＮ５Ａ全ては、心臓のイオンチャンネルをコードする。イオンチャンネル遺伝子、それらの遺伝子座および染色体位置、コードされたタンパク質、ならびにタンパク質の機能の簡単な要約を以下に示す：
ＬＱＴＳに関する候補遺伝子を新規の多型の存在についてスクリーニングした。この研究においてスクリーニングされた候補のＬＱＴＳ遺伝子、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＨ２、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＥ２、ＳＣＮ５Ａ全ては、心臓のイオンチャンネルをコードする。イオンチャンネル遺伝子、それらの遺伝子座および染色体位置、コードされたタンパク質、ならびにタンパク質の機能の簡単な要約を以下に示す：
ドフェチリドに反応してＴｄＰを発症している患者における、新規の多型の存在（コントロールのドフェチリドで治療された患者には存在しない）は、これらの新規の突然変異が、薬物誘発性不整脈の分子遺伝学において役割を果たすことを示すと解釈される。以下の表に、スクリーニングの結果を示す：
同定された突然変異のなかでも、ＫＣＮＱ１およびＫＣＮＨ２遺伝子におけるアミノ酸置換のみが推測の機能的な重要性を有する新規の変化と決定された。加えて、ＫＣＮＱ１またはＫＣＮＨ２突然変異の存在について、９８のコントロール（１９６の染色体）を試験した。ＫＣＮＥ１におけるＧ３８Ｓ変異体が、これまでに同定された共通の変異体と決定され、一方で、ＳＣＮ５Ａで見出されたＣ／Ａイントロンは新規であるが、重要性は未知である。
実施例４．ドフェチリドで誘発されたＴｄＰを有する患者におけるＫＣＮＱ１多型の同定
ＷＡＶＥのＳＮＰ検出方法論を用いて、ドフェチリドでの治療の後にＴｄＰを発症している７人の患者において、変異が以下のように同定された：１人の患者（＃３）においてＡ６５２Ｇ、２人の患者（＃３および＃５）においてＧ１６３８Ａ、２人の患者（＃２および＃４）においてＣ１９８６Ｔ、１人の患者（＃４）においてＴ２２９５Ｃ、４人の患者（＃１、＃２、＃４および＃６）においてＡ２４２１Ｇ、および、１人の患者（＃６）においてＣ２４４２Ｔ。Ａ６５２Ｇを除いて、その他の変異は、機能的な重要性を有していないようであったため（例えば、サイレント突然変異、イントロン性など）それ以上追求しなかった。
ＷＡＶＥのＳＮＰ検出方法論を用いて、ドフェチリドでの治療の後にＴｄＰを発症している７人の患者において、変異が以下のように同定された：１人の患者（＃３）においてＡ６５２Ｇ、２人の患者（＃３および＃５）においてＧ１６３８Ａ、２人の患者（＃２および＃４）においてＣ１９８６Ｔ、１人の患者（＃４）においてＴ２２９５Ｃ、４人の患者（＃１、＃２、＃４および＃６）においてＡ２４２１Ｇ、および、１人の患者（＃６）においてＣ２４４２Ｔ。Ａ６５２Ｇを除いて、その他の変異は、機能的な重要性を有していないようであったため（例えば、サイレント突然変異、イントロン性など）それ以上追求しなかった。
ＫＣＮＱ１について、ＷＡＶＥを用いて突然変異のスクリーニングを行い、同定された変異体を配列解析を用いて確認した。突然変異を確認した後、９８のコントロール（１９６の染色体）に、蛍光偏光法（ＦＰ）による遺伝子型解析（Ｃｈｅｎ，Ｘ．等（１９９９年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：４９２〜４９８）を行った。ＦＰリバースプライマーは以下の通り：ＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＣＡＡＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴ（配列番号９）。
ＫＣＮＱ１多型は、ＫＣＮＱ１遺伝子の塩基番号６５２におけるＡからＧへの転位である（Ａ６５２Ｇ）。この多型は、図１で示すように、以下のような配列が端にある：ＣＡＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＣＴＧＣＧＴＧＧＧＣＴＣＣ Ａ／Ｇ ＧＧＧＧＣＡＧＧＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣＧＴＣＧＧＣ（配列番号１０）。一塩基対の転位は、トリプレットコードをＡＡＧからＧＡＧへ変化させ、アミノ酸配列の２１８位においてリシン（Ｋ）からグルタミン酸（Ｅ）へのアミノ酸置換が起こる（Ｋ２１８Ｅ）。
ドフェチリドでの治療の後にＴｄＰを発症している７人の患者において、Ｋ２１８Ｅのアミノ酸置換に対応するＡ６５２ＧのＳＮＰが、検出され、その頻度は、０.０７／０.９３（１突然変異／１４染色体）であった。ドフェチリドでの治療の後にＴｄＰを発症させなかった９８人のコントロール患者において、Ｋ２１８Ｅのアミノ酸置換に対応するＡ６５２ＧのＳＮＰが検出され、その頻度は、０.０であった。
実施例５．ドフェチリドで誘発されたＴｄＰを有する患者におけるＫＣＮＨ２多型の同定
ＫＣＮＨ２のコード配列を増幅するのに用いられたオリゴヌクレオチドプライマー対は以下の通り：（１）フォワードプライマー：ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＣＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣ（配列番号１１）、リバースプライマー：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＣ（配列番号１２）。ＫＣＮＨ２多型を、直接的な配列解析によって同定した。加えて、９８のコントロール（１９６の染色体）において、蛍光偏光法（ＦＰ）による遺伝子型解析（Ｃｈｅｎ，Ｘ．等（１９９９年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：４９２〜４９８）を行った。ＦＰフォワードプライマーは以下の通り：ＧＡＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号１３）。簡単に言えば、プロトコールには、５×緩衝液（２.０μｌ）、２５μＭのＧ／Ｔミックス（０.０５μｌ）、１００μＭのフォワードＦＰプライマー（０.１μｌ）、サーモシーケナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（０.０２５μｌ）、水（７.８２５μｌ）を必要とした。
ＫＣＮＨ２のコード配列を増幅するのに用いられたオリゴヌクレオチドプライマー対は以下の通り：（１）フォワードプライマー：ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＣＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣ（配列番号１１）、リバースプライマー：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＣ（配列番号１２）。ＫＣＮＨ２多型を、直接的な配列解析によって同定した。加えて、９８のコントロール（１９６の染色体）において、蛍光偏光法（ＦＰ）による遺伝子型解析（Ｃｈｅｎ，Ｘ．等（１９９９年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：４９２〜４９８）を行った。ＦＰフォワードプライマーは以下の通り：ＧＡＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号１３）。簡単に言えば、プロトコールには、５×緩衝液（２.０μｌ）、２５μＭのＧ／Ｔミックス（０.０５μｌ）、１００μＭのフォワードＦＰプライマー（０.１μｌ）、サーモシーケナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（０.０２５μｌ）、水（７.８２５μｌ）を必要とした。
ＫＣＮＨ２多型は、ＫＣＮＨ２遺伝子の塩基番号３１４０でのＧからＴへの転位である（Ｇ３１４０Ｔ）。エキソン１３多型は、図２で示すように、以下のような配列が端にある：ＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣ Ｇ／Ｔ ＣＣＡＧＣＴＣＡＡＣＡＧ（配列番号１４）。一塩基対の転位は、トリプレットコードをＣＧＣからＣＴＣに変化させ、アミノ酸配列の１０４７位においてアルギニン（Ｒ）からロイシン（Ｌ）へのアミノ酸置換を起こす（Ｒ１０４７Ｌ）。
ドフェチリドでの治療の後にＴｄＰを発症している７人の患者において、Ｒ１０４７Ｌのアミノ酸置換に対応するＧ３１４０ＴのＳＮＰが検出され、その頻度は、配列解析によって決定したところ、０.２１／０.７９であった（３突然変異／１４染色体）（５野生型，１ヘテロ接合突然変異体，１ホモ接合突然変異体）。ドフェチリドでの治療の後にＴｄＰを発症しなかった９８人のコントロール患者において、Ｒ１０４７Ｌのアミノ酸置換に対応するＧ３１４０ＴのＳＮＰが検出され、その頻度は、ＦＰで決定したところ、０.０２／０.９８であった（９４野生型，４ヘテロ接合体）。
同等物
当業者であれば、本発明で説明された本発明の特定の実施形態との多くの同等物を認識できるし、単なるルーチンの実験を用いてそれを確認することもできる。このような同等物は、以下の請求項に包含されるものとする。
当業者であれば、本発明で説明された本発明の特定の実施形態との多くの同等物を認識できるし、単なるルーチンの実験を用いてそれを確認することもできる。このような同等物は、以下の請求項に包含されるものとする。
特に他の指定がない限り、明細書および請求項で用いられた成分の量、反応条件などを示す数値は全て、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解できる。従って、反対の指示がない限り、本明細書と添付の請求項に記載の数値パラメーターは、本発明によって獲得しようと求める所望の特性に応じて変更可能な近似値である。
以下に列挙する項目を含む本明細書で記載された全ての出版物および特許は、その全体を参照により本発明に加入させ、それぞれ個々の出版物または特許が、特定に、個々に参照により本発明に加入させたものとする。矛盾する場合、本願は、本願におけるあらゆる定義を含めて調節可能である。また、公共のデータベースにおける登録（例えばゲノム研究所（Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；ＴＩＧＲ）、および／または、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）が保持しているもの）に関する登録番号を参照しているあらゆるポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列も、その全体を参照により本発明に加入させる。また、以下も参照により加入させる：ＵＳ６,４５８,５４２；ＵＳ６,３５５,４３４；ＵＳ６,２９１,１７５；ＵＳ５,８３４,２００；ＵＳ６,２８０,９４１；ＵＳ６,２９７,０１４；２００２００３２３１９；ＵＳ６,４７５,７３６；ＵＳ６,４４０,７０７；ＵＳ６,４２８,９６４；ＵＳ６,２６２,２５０；ＵＳ６,２３５,４７４；ＵＳ５,８３４,２００；ＵＳ５,７１２,０９８；ＵＳ５,５２９,９００；ＵＳ６,４３２,６４４；ＵＳ６,２０７,３８３；ＵＳ６,３４２,３５７；ＵＳ５,５９９,６７３；２００１００３４０２４；ＵＳ６,４７５,７３６。また、本願においてＧｅｎＢａｎｋ登録番号によって示された配列、同様に、以下の配列も参照により加入させる：ＡＪ００６３４５、ＡＢ００９０６９、ＡＢ００９０５Ｓ０１、ＡＢ００９０５Ｓ０２、ＡＢ００９０５Ｓ０３、ＡＢ００９０５Ｓ０４、ＡＢ００９０５Ｓ０５、ＡＢ００９０５Ｓ０６、ＡＢ００９０５Ｓ０７、ＡＢ００９０５Ｓ０８、ＡＢ００９０５Ｓ０９、ＡＢ００９０５Ｓ１０、ＡＢ００９０５Ｓ１１、ＡＢ００９０５Ｓ１２、ＡＢ００９０５Ｓ１３、ＡＢ００９０５Ｓ１４、ＡＢ００９０５Ｓ１５、ＡＢ０４４８０６、ＡＦ０３２８９７、ＮＭ０００２１８。
Claims (12)
- 薬物誘発性心不整脈に対する感受性に関してヒト被検体をスクリーニングする方法であって、被検体から得られたＫＣＮＨ２核酸におけるＲ１０４７Ｌ多型を検出することを含み、Ｒ１０４７Ｌ多型が存在する場合、被検体は、薬物誘発性不整脈に対して感受性が高いことを示す、上記方法。
- 薬物誘発性心不整脈に対する感受性に関してヒト被検体をスクリーニングする方法であって、被検体から得られたＫＣＮＱ１核酸におけるＫ２１８Ｅ多型を検出することを含み、Ｋ２１８Ｅ多型が存在する場合、被検体は、薬物誘発性不整脈に対して感受性が高いことを示す、上記方法。
- 薬物誘発性不整脈が、ＱＴ間隔延長に関連する、請求項１または２に記載の方法。
- 薬物誘発性不整脈が、トルサード・ド・ポワントである、請求項１または２に記載の方法。
- 薬物が、クラスＩＩＩ抗不整脈剤である、請求項１または２に記載の方法。
- 薬物が、ドフェチリドである、請求項５に記載の方法。
- Ｒ１０４７Ｌ多型が、配列番号３に対応するＤＮＡの１６位のヌクレオチドにおけるＧからＴへの転位を含む、請求項１に記載の方法。
- Ｋ２１８Ｅ多型が、配列番号１に対応するＤＮＡの２６位のヌクレオチドにおけるＡからＧへの転位を含む、請求項２に記載の方法。
- 配列番号２の少なくとも１１個の連続したヌクレオチドを含み、２６位がＧである（ＫからＥへのアミノ酸置換に相当する）、単離された核酸。
- 配列番号１の核酸にハイブリダイズしないと予想される条件下で、配列番号２にハイブリダイズする、核酸プローブ。
- 配列番号４の少なくとも１１個の連続したヌクレオチドを含み、１６位がＴである（ＲからＬへのアミノ酸置換に相当する）、単離された核酸。
- 配列番号３の核酸にハイブリダイズしないと予想される条件下で、配列番号４にハイブリダイズする、核酸プローブ。
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