JP2006220531A - Biological sample discrimination plate - Google Patents
Biological sample discrimination plate Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006220531A JP2006220531A JP2005034029A JP2005034029A JP2006220531A JP 2006220531 A JP2006220531 A JP 2006220531A JP 2005034029 A JP2005034029 A JP 2005034029A JP 2005034029 A JP2005034029 A JP 2005034029A JP 2006220531 A JP2006220531 A JP 2006220531A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- biological sample
- flow path
- sample
- buffer
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
【課題】 流路に充填された緩衝剤中で生体サンプルを移動させた際の輸送反応の検出時に、複数の検査項目を短時間で正確に検出結果を得ることができ、取り扱いも容易で且つ小型で軽量、安価な生体サンプル判別用プレートを提供する。
【解決手段】 生体サンプルが流れるサンプル流路と緩衝剤が流れる緩衝剤流路との合流部分に一定量の生体サンプルを前記緩衝剤流路に取り込む定量分取部を設け前記定量分取部に取り込まれた生体サンプルを緩衝剤中で移動させた際に得られる輸送反応を検出して前記生体サンプルの判別を行う生体サンプル判別用プレートにおいて、前記緩衝剤流路を形成する閉じられた流路の内側に前記サンプル流路を設ける。
【選択図】 図2a
PROBLEM TO BE SOLVED: To accurately detect detection results of a plurality of test items in a short time at the time of detection of a transport reaction when a biological sample is moved in a buffer filled in a channel, and is easy to handle. A small, lightweight and inexpensive biological sample discrimination plate is provided.
SOLUTION: A quantitative fractionation part for taking a certain amount of biological sample into the buffer flow path is provided at a confluence of a sample flow path through which a biological sample flows and a buffer flow path through which a buffer flows. A closed flow path that forms the buffer flow path in a biological sample determination plate that detects a transport reaction obtained by moving a captured biological sample in a buffer and determines the biological sample. The sample flow path is provided inside.
[Selection] Figure 2a
Description
本発明は、DNAやタンパクその他の生体サンプルを緩衝剤中で移動させ、その輸送反応を検出して生体サンプルを判別する生体サンプル判別用プレートに関する。 The present invention relates to a biological sample discriminating plate for discriminating a biological sample by moving DNA, protein or other biological sample in a buffer and detecting its transport reaction.
一般的な生体サンプルを考えた場合、大きくはDNAとタンパクが存在している。そして、近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。 When a general biological sample is considered, DNA and protein exist largely. In recent years, with the rapid development of molecular biology, the involvement of genes in various diseases has been understood fairly accurately, and attention has been focused on medical treatments targeting genes.
DNAに関しては、現在SNPs(single nucleotide polymorphismの略で「1塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における1暗号(1塩基)の違いの総称である。)が注目されている。その理由としては、SNPsの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や感受性を予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じSNPsを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。 With regard to DNA, SNPs (abbreviation of single nucleotide polymorphism, which is generally translated as “single nucleotide polymorphism” and is a general term for the difference of one code (one base) in a gene) are currently attracting attention. The reason for this is that the classification of SNPs can predict the prevalence of many diseases and the effects and susceptibility of each individual to drugs, and there are absolutely no humans on the planet who have the same SNPs, even if they are parents and siblings. This is because it is considered that the individual can be completely identified from not doing so.
現在SNPsを調べる方法としては、DNAの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング(塩基配列の決定)が最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケリング(Sanger法)である。なお、シーケンシングは、このSanger法を含め何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって1塩基長の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。 Currently, as a method for examining SNPs, sequencing (determination of base sequence) in which the base sequence of DNA is directly read from the end is most commonly used. There are several reports on the sequencing method, but the most common method is dideoxy sequencing (Sanger method). Sequencing is based on a technique that separates and identifies the difference in length of one base length by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis with high resolution or capillary electrophoresis in any method including the Sanger method. This is true.
また、他の方法として、アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動法がある。 Another method is affinity ligand capillary electrophoresis.
アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力(酵素と基質、抗原と抗体の親和力等)を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、塩基配列を特異的に認識するアフィニティリガンドを添加しておき、試料を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである(例えば、特許文献1参照)。 Affinity ligand capillary electrophoresis uses intermolecular affinity, particularly specific affinity in the ecosystem (enzyme and substrate, antigen and antibody affinity, etc.) to give specificity to separation. Specifically, When an affinity ligand that specifically recognizes the base sequence is added to the electrophoresis solution in the capillary tube and the sample is electrophoresed, only the molecular species that interact in the sample mixture will change in the moving speed. The analysis is performed with attention (for example, see Patent Document 1).
一方、タンパク質は、細胞、組織、生体液中に存在し、生体活動の調節、細胞へのエネルギー供給、重要な物質の合成、生物構造体の維持、さらには細胞間でのコミュニケーションや細胞内情報伝達に関与している。現在では、タンパク質が様々な環境や、相互作用する他のタンパク質の存在、タンパク質が受けた修飾の程度や種類に応じて、複数の機能を有することが明らかになってきている。 On the other hand, proteins exist in cells, tissues, and biological fluids, regulate biological activities, supply energy to cells, synthesize important substances, maintain biological structures, and communicate between cells and intracellular information. Involved in transmission. Currently, it has become clear that proteins have multiple functions depending on the various environments, the presence of other interacting proteins, and the degree and type of modification that the protein has undergone.
タンパク質は、20種類のアミノ酸が遺伝子の指示(配列情報)により順番につながることでつくられており、その種類は数千万種と言われるが、その遺伝子の配列がわかれば、どのアミノ酸がどういう順番でつながってできているかの情報を得ることができる。生物の遺伝子(ゲノム)から作られるタンパク質の一そろいのセットは、プロテオームと呼ばれるが、ヒトゲノムの塩基配列解読が終わった今、プロテオームの解析が盛んに進められている。 Proteins are made by connecting 20 types of amino acids in order according to gene instructions (sequence information), and the types are said to be tens of millions. If you know the sequence of the gene, what amino acid is what? You can get information on whether they are connected in order. A complete set of proteins made from the genes (genomes) of organisms is called a proteome, and now the analysis of the proteome has been actively promoted after the nucleotide sequence of the human genome has been deciphered.
そして、このようなタンパク質の機能解析研究としては、同定やキャラクタリゼーションのみならず、生化学アッセイやタンパク質間相互作用研究、タンパク質ネットワーク、または細胞内外のシグナリング解明なども行っていく必要がある。このタンパク質機能の研究には、多方面の技術が使用され、酵素アッセイ、酵母 two−hybrid アッセイ、クロマトグラフィーによる精製、情報ツールとデータベース等があるが、特に、電気泳動によるたんぱく質の判別は重要な手法である。そして、電気泳動のように、キャピラリー管中のサンプル、分析物、緩衝剤、及び試薬等の液体を移動させた際に得られる輸送反応を検出して、該サンプルの分析、判別、判定等を行う場合の前記液体の輸送及び方向付けに関しては、さまざまな報告がある(例えば、特許文献2〜特許文献5)。
上述したように生体サンプルの分析においては、キャピラリー電気泳動装置を利用した方法が広く使われている。 As described above, in the analysis of biological samples, a method using a capillary electrophoresis apparatus is widely used.
実際に輸送反応を行なう部分であるキャピラリーは、外形300ミクロン、内径100ミクロン程度のガラス管が使用される例が多く、折れにくくするために表面はポリイミド等でコーティングされている。 In many cases, the capillary, which actually performs the transport reaction, uses a glass tube having an outer diameter of about 300 microns and an inner diameter of about 100 microns, and the surface is coated with polyimide or the like to make it difficult to break.
しかしながら、内部試料を検出するために検出窓として焼いたり薬品で溶かすなどしてコーティングを一部剥ぎ取る。 However, in order to detect the internal sample, a part of the coating is peeled off by baking as a detection window or dissolving with chemicals.
この時、コーティングを剥いだ部分は折れやすくなり取り扱いに十分注意する必要がある。折れた場合はなお危険である。 At this time, the part from which the coating has been peeled easily breaks, and it is necessary to be careful in handling. It is still dangerous if it breaks.
また、サンプルの注入においても、加圧や吸引で行なうのが一般的な方法であるが、一定量注入する必要があり、時間で調整するもののキャピラリー内の緩衝剤の粘度や温度変化により注入量が実験のたびに異なるという問題がある。サンプルの量は測定結果に及ぼす影響は大きく、大変重要な項目である。 In addition, sample injection is generally performed by pressurization or suction. However, it is necessary to inject a fixed amount, but the injection amount depends on changes in the viscosity and temperature of the buffer in the capillary, although it is adjusted over time. However, there is a problem that it is different for each experiment. The amount of sample has a great influence on the measurement result and is a very important item.
また、このようなキャピラリーを使用した装置の場合、構成上短い流路での電気泳動を行なうことは困難であり、必要以上の泳動距離と時間をかけて測定することになる。 In addition, in the case of an apparatus using such a capillary, it is difficult to perform electrophoresis in a short flow path because of the configuration, and the measurement takes a longer migration distance and time than necessary.
さらに、プレート上の流路を利用した場合でも試料の分離を行うのに、例えば特許文献5,6に記載の方法では、複数のキャビラリーチャンネルを交差させ、且つ少なくとも3つ電極を設けて、該少なくとも3つ設けられた電極のうちの2つの電極に印加して、前記交差部を通して前記試料を移動させているが、この方法では、流路が交差していることから、試料を電気泳動させる際にうまく泳動しない可能性があり、正確な測定結果が得られないという問題がある。また、例えば特許文献3,4に記載の方法では、プラットホームに微細チャンネルを埋設し、該プラットホームの回転速度を変化させることで、該回転から生じる向心力を変化させて試料を移動させているが、この方法では、試料を向心方向にしか移動させることができないという問題に加え、該微小チャンネルの形状がかなり複雑であるという問題もある。
Furthermore, in order to separate the sample even when the flow path on the plate is used, for example, in the methods described in
本発明は、流路に充填された緩衝剤中で生体サンプルを移動させた際の輸送反応の検出時に、複数の検査項目を短時間で正確に検出結果を得ることができ、取り扱いも容易で且つ小型で軽量、安価な生体サンプル判別用プレートを提供することを目的とする。 In the present invention, when a transport reaction is detected when a biological sample is moved in a buffer filled in a flow path, a plurality of test items can be accurately detected in a short time, and handling is easy. Another object is to provide a small, lightweight, and inexpensive biological sample discrimination plate.
前記課題を解決するために、本発明の生体サンプル判別用プレートは、生体サンプルが流れるサンプル流路と緩衝剤が流れる緩衝剤流路との合流部分に一定量の生体サンプルを前記緩衝剤流路に取り込む定量分取部を設け前記定量分取部に取り込まれた生体サンプルを緩衝剤中で移動させた際に得られる輸送反応を検出して前記生体サンプルの判別を行う生体サンプル判別用プレートにおいて、前記緩衝剤流路を形成する閉じられた流路の内側に前記サンプル流路を設けたことを特徴とする。 In order to solve the above-described problem, the biological sample discrimination plate of the present invention is configured such that a certain amount of biological sample is placed in a joint portion between a sample channel through which a biological sample flows and a buffer channel through which a buffer flows. A biological sample discriminating plate for determining a biological sample by detecting a transport reaction obtained when a biological sample taken into the quantitative fractionating unit is moved in a buffering agent, The sample channel is provided inside a closed channel forming the buffer channel.
さらに、前記緩衝剤流路の前記生体サンプル判別用プレートの中心から外周方向に形成された部分の長さが回転方向に形成された部分の長さに比べて長いことを特徴とする。 Furthermore, the length of the portion formed in the outer peripheral direction from the center of the biological sample discrimination plate of the buffer channel is longer than the length of the portion formed in the rotation direction.
さらに、前記緩衝剤流路の形状が矩形であることを特徴とする。 Further, the buffer channel is rectangular in shape.
さらに、前記緩衝剤流路が前記生体サンプル判別用プレートの重心を回転中心とする同心円上に形成されてなることを特徴とする。 Further, the buffer channel is formed on a concentric circle whose center of rotation is the center of gravity of the biological sample discrimination plate.
さらに、前記緩衝剤流路を設けた同心円の個数が2であることを特徴とする。 Furthermore, the number of concentric circles provided with the buffer flow path is two.
さらに、内周側の流路の流路断面積が外周側の流路の流路断面積より大きいことを特徴とする。 Furthermore, the flow path cross-sectional area of the inner peripheral flow path is larger than the flow path cross-sectional area of the outer peripheral flow path.
本発明の生体サンプル判別用プレートによれば、プレート上、流路の占める面積が小さいため、プレートサイズを更にコンパクトにすることが可能となる。更に、本発明の生体サンプル判別用プレートによれば、流路を多数形成できるため、同時に複数の項目を検査することが可能となる。 According to the biological sample discrimination plate of the present invention, since the area occupied by the flow path on the plate is small, the plate size can be further reduced. Furthermore, according to the biological sample discrimination plate of the present invention, since a large number of flow paths can be formed, a plurality of items can be inspected simultaneously.
(実施の形態1)
以下、図1〜図14を用いて、本実施の形態1における生体サンプル判別用プレートについて説明する。
(Embodiment 1)
Hereinafter, the biological sample discrimination plate according to the first embodiment will be described with reference to FIGS.
本発明は、生体サンプルを緩衝剤中で移動させて、生物学的、酵素的、免疫学的、及び化学的反応を行い、生体サンプルを容易かつ安価に精度よく短時間で判別することを実現するものである。 The present invention realizes that biological samples can be easily and inexpensively and accurately distinguished in a short time by moving biological samples in a buffer and performing biological, enzymatic, immunological and chemical reactions. To do.
なお、本実施の形態1では、説明を具体的にするために、前記生体サンプルがDNAサンプルで、前記緩衝剤が分離用DNAコンジュゲート及びDNA結合制御剤を含むものであるとし、本生体サンプル判別用プレートが、流路中に充填させた分離用DNAコンジュゲート中に、定量された前記DNAサンプルを添加して電気泳動させ、該流路中の蛍光度あるいは吸光度を検出して、該DNAサンプルのSNPs(一塩基多型)の有無を判別するものとする。 In the first embodiment, for the sake of specific explanation, it is assumed that the biological sample is a DNA sample, and the buffering agent includes a separation DNA conjugate and a DNA binding control agent. The plate adds the quantified DNA sample to the separation DNA conjugate packed in the flow path, performs electrophoresis, detects the fluorescence or absorbance in the flow path, and detects the DNA sample. The presence or absence of SNPs (single nucleotide polymorphisms) shall be determined.
まず、図1〜図5を用いて、本実施の形態1における生体サンプル判別用プレートの構成について説明する。図1は、本実施の形態1における生体サンプル判別用プレートの流路形成面からみた図である。
図2aは図1に示す生体サンプル判別用プレート1に形成された外周側パターン2の詳細形状を示す図である。
First, the configuration of the biological sample discrimination plate according to the first embodiment will be described with reference to FIGS. FIG. 1 is a diagram seen from the flow path forming surface of the biological sample discrimination plate according to the first embodiment.
FIG. 2a is a diagram showing a detailed shape of the outer
本実施の形態1における生体サンプル判別用プレート1には図2aに示す外周側パターン2が16個放射線状に形成されており、その内側には内周側パターン2'が8個放射線状に形成されており、これらの外周側パターン2と内周側パターン2'とによって、同時に24検体のDNA判別が可能である。この外周側パターン2と内周側パターン2'とは、生体サンプル判別用プレート1の重心を中心とした同心円上に形成されている。
The biological
図1に示すように本実施の形態1における生体サンプル判別用プレート1の外形は8センチ四方の正方形で4角のうち3角はRが設けられ、残りの1角は面取りされている。
As shown in FIG. 1, the external shape of the biological
更に穴4を設けているが、これは外形を非対称にしてパターンの場所を特定できるようにされている。材料はアクリル系の樹脂を使用し厚みは2mmである。流路形成面には溝が形成されさらに厚さ50μmのアクリル製フィルムを接着することで密閉流路が形成されている。
Further, a
また、重心5は本生体サンプル判別用プレートの重心であり、重心5を中心に本生体サンプル判別用プレートを回転部に固定するための孔を設けている。 The center of gravity 5 is the center of gravity of the biological sample discriminating plate, and a hole for fixing the biological sample discriminating plate to the rotating portion is provided around the center of gravity 5.
図2aに示す緩衝剤注入口6は緩衝剤であるDNAコンジュゲートを注入する緩衝剤注入口、緩衝剤注入部7は注入された緩衝剤を一旦保持するための緩衝剤注入部、サンプル注入口8はDNAサンプルを注入するためのサンプル注入口、サンプル注入部9は注入されたDNAサンプルを一旦保持するためのサンプル注入部である。緩衝剤注入部とサンプル注入部は同様の形状をしており、周辺断面を図3に示す。
The
図3は緩衝剤注入部やサンプル注入部近傍の断面を表した図であり、斜線でハッチングした部分が生体サンプル判別用プレート1である。35が緩衝剤注入口6およびサンプル注入口8にあたり、36が緩衝剤注入部7およびサンプル注入部9である。37が前述したフィルムであり溝24にフタをするように貼り付けることで密閉流路が形成される。ちなみに流路形成面は下部である。
FIG. 3 is a view showing a cross section in the vicinity of the buffer injection part and the sample injection part, and the hatched portion is the biological
正電極の挿入部12、負電極の挿入部13は、流路14を介して接続されており、さらには流路10,11により緩衝剤注入部ともそれぞれ接続されている。
The positive electrode insertion portion 12 and the negative
チャンバー部16は、流路15によりサンプル注入部9と接続されている。
The chamber part 16 is connected to the
また、20はサンプル保持部であり流路17と流路18によりチャンバー部16と接続されているが、流路17は細く、流路18は流路17に比べ太い。本実施の形態では、流路17の幅が25μmに対し、流路18は50μmである。また、流路の深さは共に30μmである。尚、生体サンプル判別用プレート1に形成された内周側パターン2’の場合、流路17’の幅は40μm、流路18’は80μmで形成され、流路深さは全て50μmとなっている。
21はバッファ部であり、流路17、流路18、流路19によりチャンバー部16、サンプル保持部20とそれぞれ接続されており、さらにサンプル注入部9とバッファ部21とをつなぐ流路22によってバッファ部21の空気抜きが可能となる。
緩衝剤注入部7、流路10、流路11、正電極部12、負電極部13、流路14は閉じられた流路となっており、この閉じられた流路を緩衝材が流れ、緩衝剤流路を構成している。
The
図1において内周側パターン2’に示すように、緩衝剤流路のパターン形状はプレートの中心に対し、外周方向に配置した、矩形の形状をしており、外周に向かってのびる流路長さの方が、円周上、回転方向にのびる流路長さに比べ長くなるようになっている。これは、プレートの同心円上に数多くの流路パターンを形成するためである。
As shown in the inner
続いて、サンプル注入部9、流路15、チャンバー部16、流路17、流路18、流路19、サンプル保持部20、バッファ部21、流路22も閉じられた流路となっており、この閉じられた流路を生体サンプルが流れ、サンプル流路を構成している。緩衝剤流路とサンプル流路とはサンプル定量分取部23で合流し、このサンプル定量分取部23において定量されたDNAサンプルを実際に判別する。
Subsequently, the
ここで、本実施の形態では、緩衝剤流路の内部にサンプル流路を配置した。これは、検査項目を可能な限り増やすことを目的に、流路パターンの同心円方向のスペースが狭くなるよう設計した。仮に、サンプル流路を緩衝剤流路と同心円方向に並べた場合、図2bに示すように、流路パターンの同心円方向のスペースが広くなるため、結果として、流路パターン数が本実施の形態の24流路に比べ、18流路と少なくなる。 Here, in the present embodiment, the sample channel is disposed inside the buffer channel. In order to increase the number of inspection items as much as possible, the space in the concentric direction of the flow path pattern was designed to be narrow. If the sample flow paths are arranged concentrically with the buffer flow paths, the space in the concentric direction of the flow path pattern becomes wider as shown in FIG. 2b. Compared to 24 channels, the number is 18 channels.
チャンバー部16、サンプル保持部20、バッファ部21は同様の形状をしており、その周辺の断面図を図4に示す。図4は下方が流路形成面である。
The chamber part 16, the
溝24がチャンバー部16、サンプル保持部20、バッファ部21にあたる部分であり、流路形成面からみて1.5mmの深さの器状になっている。25、26が各部からのびる流路となる。
The
次に、正電極部12と負電極部13について図5を用いて説明する。
Next, the positive electrode portion 12 and the
図5は正電極部12と負電極部13の周辺の断面図であり、下方が流路形成面である。
FIG. 5 is a sectional view of the periphery of the positive electrode portion 12 and the
穴30が正電極部12と負電極部13にあたる部分であり、プレートを貫通した穴である。両面にはフィルム37とフィルム27が貼り付けてあるが、フィルム37が非導電性の材料を必要とするのに対してフィルム27は導電性のものでもよい。導電性の場合外部からフィルム27に電圧を印加することで電極部30内の試料に電圧を印加することができる。非導電性の場合は針状の電極を突き刺し内部へ挿入することで電圧印加が可能となる。
The
また、フィルム37がプレート前面に貼られているのに対してフィルム27は電極部近傍のみにそれぞれ貼られている。
Moreover, while the
それでは、以下、前述した該DNAサンプルのSNPs(一塩基多型)の有無を判別するまでの具体的操作および動作の一例を、外周側パターン2の詳細形状を示す図2aを利用して説明する。
Now, an example of specific operations and operations up to the determination of the presence or absence of SNPs (single nucleotide polymorphisms) in the DNA sample will be described below with reference to FIG. 2 a showing the detailed shape of the outer
まず、検体となるDNAサンプルを準備する。 First, a DNA sample as a specimen is prepared.
本来、DNAは2本鎖の螺旋構造をしたものであるが、本実施の形態1においては、判別したいSNPs部位を含む約60塩基長の1本鎖DNAを準備する。
Originally, the DNA has a double-stranded helical structure, but in
抽出方法や1本鎖化については本発明とは直接関係がないので詳細説明は省略する。 Since the extraction method and single strand formation are not directly related to the present invention, detailed description thereof is omitted.
次に、緩衝剤としてDNAコンジュゲートを準備する。 Next, a DNA conjugate is prepared as a buffer.
DNAコンジュゲートとは、6〜12塩基長1本鎖DNAの5’末端に高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらにDNAは、正常型に対しては相補であるが変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型DNAに対しての結合力が強く、変異型DNAに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、5’末端に結合したリニアポリマーがおもりとなり泳動速度がかなり遅いという特性もある。 The DNA conjugate is obtained by covalently bonding a high molecular linear polymer to the 5 'end of a 6 to 12 base long single-stranded DNA. Furthermore, DNA is a sequence that is complementary to the normal type but not complementary to the mutant type, has a strong binding force to the normal type DNA, and a weak binding force to the mutant type DNA. There are characteristics. In addition, when electrophoresed, the linear polymer bonded to the 5 'end has a characteristic that the migration speed is considerably slow.
以後記述する「DNAコンジュゲート」とは、電解質の役目もするpH緩衝剤およびMgCl2などのDNA結合力制御剤を含んだ物性とする。 The “DNA conjugate” described hereinafter has physical properties including a pH buffer that also serves as an electrolyte and a DNA binding force control agent such as MgCl 2 .
試料の準備が終わったところで、DNAコンジュゲートおよびDNAサンプルをプレート内へ注入する。DNAコンジュゲートはピペッター等により定量を緩衝剤注入口6から緩衝剤注入部7へ分注する。DNAサンプルも同様に定量をサンプル注入口8よりサンプル注入部9へ分注する。
When sample preparation is complete, the DNA conjugate and DNA sample are injected into the plate. The DNA conjugate is dispensed from the
分注量としては、パターンのスケールにより異なるが本実施の形態1においては、DNAコンジュゲートは3マイクロリットル、DNAサンプルは1マイクロリットルとする。 Although the amount of dispensing differs depending on the scale of the pattern, in the first embodiment, the DNA conjugate is 3 microliters and the DNA sample is 1 microliter.
次にモータ等に生体サンプル判別用プレート1を固定し、重心5を軸に回転させる。この時、分注されたDNAコンジュゲートとDNAサンプルは、遠心力により外周方向へと移動する。
Next, the biological
緩衝剤注入部7内のDNAコンジュゲートは流路10と流路11を通り正電極部12と負電極部13へ等分され正電極部12へ移動したDNAコンジュゲートはさらに流路14を通り定量分取部23まで移動する。負電極部13へ移動したDNAコンジュゲートも同様に流路14を通り定量分取部23まで移動する。回転開始から2分後、DNAコンジュゲートの移動が停止した状態が図6(a)である。また、定量分取部23周辺を拡大した図が図6(b)である。
The DNA conjugate in the
DNAコンジュゲート31は、正電極部12および負電極部13の7割程度まで充填されており、流路14を満たし、図6(b)に示すように定量分取部23まで達している。
The
正電極部12と負電極部13内に存在するDNAコンジュゲートの液面高さとサンプル定量分取部の液面高さは、重心5を中心とする同一円周上となる。
The liquid level height of the DNA conjugate existing in the positive electrode part 12 and the
次に、注入されたDNAサンプルの移動について図2aおよび図7を用いて説明する。サンプル注入部9内のDNAサンプルは流路15を通りチャンバー部16さらには流路17、流路18を通り外周側に位置するサンプル保持部20まで達する。しかしながら図7に示すように流路18はサンプル保持部20の外周側で接続されかつサンプル保持部20には空気抜き用の穴が存在しない。そのためサンプル保持部20内に残った空気は抜けることはなく加圧された状態となる。
Next, the movement of the injected DNA sample will be described with reference to FIG. 2a and FIG. The DNA sample in the
図7が回転開始から2分後のDNAサンプルの状態であり、32と33がDNAサンプルである。34が圧縮された空気であり、回転中のみこのような遠心力と加圧力とが平衡となった状態を維持する。本実施の形態では回転数4000rpmである。
FIG. 7 shows the state of the
それでは次の動作を説明する。 Next, the following operation will be described.
生体サンプル判別用プレート1を一定時間回転させDNAコンジュゲートとDNAサンプルの移動が停止した状態で回転を急停止させる。(例えば2秒で4000rpmより停止まで。)
するとサンプル保持部20内に存在していたDNAサンプル32は遠心力が無くなったため空気34の圧力によりサンプル保持部20から流路18へ逆流しようとする。さらに
DNAサンプル32はサンプル保持部20内の空気33が大気圧となるまで流路17、流路19へと移動しようとするが、この時流路17は流路19にくらべ細く形成されているためDNAサンプル32は流路17よりも流路19へ多く流れようとする。
The biological
Then, since the DNA sample 32 existing in the
そこで急停止した直後の状態を図8に示す。 FIG. 8 shows a state immediately after the sudden stop.
サンプル保持部20内のDNAサンプル32は空気34の膨張により流路18、19を通り定量分取部23およびバッファ部21まで達する。
The DNA sample 32 in the
特に定量分取部23では、充填されたDNAコンジュゲート31と接することになる。
In particular, the
このとき流路17を通りチャンバー部16へ移動するDNAサンプルも多少存在する。
At this time, there are some DNA samples that move to the chamber portion 16 through the
次に、生体サンプル判別用プレート1を中速にて数秒間もう一度回転させる。この時減速を緩やかにすることが重要である。
Next, the biological
停止後の状態が図9である。 FIG. 9 shows the state after the stop.
流路19に充填されていたDNAサンプルはチャンバー部33へと流れるが、定量分取部23にはDNAサンプルが微量残存する。残存したDNAサンプルは他DNAサンプルに対して電気的にも絶縁された状態である。
Although the DNA sample filled in the
またこのように1回目の回転時と異なる動作をする理由は、回転速度が遅く減速度が緩やかであるためサンプル保持部20内の空気34が強く圧縮されることがないからである。よって逆流して流路19が再度充填されることもない。
The reason why the operation is different from that in the first rotation is that the rotation speed is slow and the deceleration is slow, so that the
以上の動作で定量分取部23に残存したサンプルDNAがSNPsの判別を行なう最終試料となる。尚、内周側パターン2’は、外周側パターン2に比べ、遠心力による輸送能力が低いため、流路断面積を外周側パターン2の流路断面積より多くとることで、遠心力の違いによる、輸送能力の差をなくす事が可能となり、その結果、1回の操作でプレート内全てのパターンにおいて、SNPsの判別を行なう最終試料を定量分取部に残存できる。
The sample DNA remaining in the
次に、電気泳動を行なう。電気泳動は、正電極部12に正電極、負電極部13に負電極を挿入し、数百Vの電圧を印加する。すると、流路14さらにはサンプルの定量分取部23において電界が発生し、定量分取部23に一定量残存したDNAサンプルは、流路14中を正電極側(図9中A方向)へ泳動する。
Next, electrophoresis is performed. In the electrophoresis, a positive electrode is inserted into the positive electrode portion 12 and a negative electrode is inserted into the
流路14中にはDNAコンジュゲートが充填されており、DNAサンプルはDNAコンジュゲートとの結合を繰り返しながら電気泳動する。この時、上述したようにDNAサンプル中の正常型DNAはDNAコンジュゲートとの結合力が強いため泳動速度が遅くなり、変異型DNAは結合力が弱いため正常型に比べ泳動速度は速くなる。つまりDNAサンプル中に正常型、変異型両方が存在した場合は、正常型のDNAと変異型のDNAが分離していくこととなり、SNPsの判別が行なえるのである。 The channel 14 is filled with a DNA conjugate, and the DNA sample is electrophoresed while repeatedly binding to the DNA conjugate. At this time, as described above, the normal DNA in the DNA sample has a strong binding force with the DNA conjugate, so the migration speed is slow, and the mutant DNA has a weak binding power, so the migration speed is faster than the normal type. That is, when both the normal type and the mutant type are present in the DNA sample, the normal type DNA and the mutant type DNA are separated, and SNPs can be discriminated.
図11は図10に示す流路14の一部40を電気泳動中にDNAをスキャンしたグラフである。
FIG. 11 is a graph obtained by scanning DNA during electrophoresis in a
DNAの検出は、蛍光標識(FITC)を修飾したDNAを470nmの光で励起し、520nm付近の光検出により行なった。DNAの検出は、260nmの吸光度により行なってもよい。 The DNA was detected by exciting the DNA modified with a fluorescent label (FITC) with light of 470 nm and detecting light at around 520 nm. DNA may be detected by absorbance at 260 nm.
横軸が40の部分の位置を表しDNAは左から右へ泳動する。つまり左側が定量分取部23で右側が正電極部12側である。縦軸は蛍光強度で、上から1分毎に計時変化した波形を表す。徐々に2つの山が分離していく様子がわかる。この場合DNAサンプル中には同量の正常型DNAと変異型DNAが存在していることが判定された。
The horizontal axis represents the position of the 40 portion, and DNA migrates from left to right. That is, the left side is the
グラフ右側の山は泳動速度が速いので変異型、左側が遅く泳動しているので正常型となる。 The mountain on the right side of the graph is a mutant type because the migration speed is fast, and the left side is a normal type because it migrates slowly on the left side.
以上のように、本実施の形態1によれば、サンプル保持部20をもうけることで回転動作のみによって生体サンプル判別用プレート1上の定量分取部23にDNAサンプルを一定量保持し、正電極部12と負電極部13と流路14によって電気泳動できるような構成とした。そして、サンプル流路を緩衝剤流路の内部に形成することで、流路パターンをコンパクトにすることができ、1枚のプレートで複数の項目を検査することが可能となる。さらには、流路断面積を変えることで2重の流路パターンを同時に検査することができるため、より複数の項目検査が可能となる。
As described above, according to the first embodiment, by providing the
本発明の生体サンプル判別プレートは、DNAサンプル等の生体サンプルの判別を、安価で、且つ簡便に行えるようにするものとして有用である。 The biological sample discriminating plate of the present invention is useful for enabling discrimination of a biological sample such as a DNA sample at low cost and simply.
1 生体サンプル判別用プレート
2、2’ 流路パターン
3 回転部固定用穴
4 位置決め穴
5 プレート重心
6 緩衝剤注入口
7 緩衝剤注入部
8 サンプル注入口
9 サンプル注入部
10 第1の流路
11 第2の流路
12 正電極部
13 負電極部
14 第3の流路
15 流路
16 チャンバー部
17 流路
18 流路
19 流路
20 サンプル保持部
21 バッファ部
22 流路
23 定量分取部
24 溝
25 流路
26 流路
27 フィルム
28 流路
29 流路
30 穴
31 DNAコンジュゲート
32 DNAコンジュゲート
33 DNAコンジュゲート
34 空気
40 スキャン流路
A 泳動方向
DESCRIPTION OF
Claims (6)
6. The biological sample determination plate according to claim 5, wherein the flow path cross-sectional area of the inner peripheral flow path is larger than the flow path cross-sectional area of the outer peripheral flow path.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005034029A JP2006220531A (en) | 2005-02-10 | 2005-02-10 | Biological sample discrimination plate |
| US11/287,315 US20060160210A1 (en) | 2004-11-26 | 2005-11-28 | Biological sample analysis plate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005034029A JP2006220531A (en) | 2005-02-10 | 2005-02-10 | Biological sample discrimination plate |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006220531A true JP2006220531A (en) | 2006-08-24 |
Family
ID=36982955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005034029A Withdrawn JP2006220531A (en) | 2004-11-26 | 2005-02-10 | Biological sample discrimination plate |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2006220531A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111841673A (en) * | 2020-07-20 | 2020-10-30 | 厦门大学 | A micro-channel structure that can be directly inserted into a micro-electrode and its preparation method and application |
-
2005
- 2005-02-10 JP JP2005034029A patent/JP2006220531A/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111841673A (en) * | 2020-07-20 | 2020-10-30 | 厦门大学 | A micro-channel structure that can be directly inserted into a micro-electrode and its preparation method and application |
| CN111841673B (en) * | 2020-07-20 | 2024-08-06 | 厦门大学 | Micro-channel structure capable of being directly inserted into microelectrode, and preparation method and application thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chao et al. | Microfluidic single-cell analysis of intracellular compounds | |
| Choi et al. | Microfluidic-based biosensors toward point-of-care detection of nucleic acids and proteins | |
| CN105004596B (en) | Instrument and method for the sample preparation of integration, reaction and detection | |
| JP5298718B2 (en) | Centrifugal device for filling biological sample reaction chip with reaction solution | |
| JP2005130851A (en) | Method and apparatus for measuring specimen in liquid | |
| JP4556194B2 (en) | Biological sample reaction method | |
| KR19990072013A (en) | Apparatus and method using centripetal acceleration to drive fluid flow in microfluidic systems by informatics | |
| EP2684027B1 (en) | Rapid quantification of biomolecules in a selectively functionalized nanofluidic biosensor and method thereof | |
| JPWO2005064339A1 (en) | Biological sample discrimination device, biological sample discrimination method, and biological sample discrimination plate | |
| JP2022511168A (en) | Analytical systems with microfluidic devices and related methods | |
| JPWO2006062149A1 (en) | Biological sample analysis plate | |
| JP5131538B2 (en) | Reaction liquid filling method | |
| JP2006226752A (en) | Plate for biological sample discriminator | |
| JP2006220531A (en) | Biological sample discrimination plate | |
| JP2006308447A (en) | Biological sample analysis plate and biological sample analysis method | |
| JP2006242612A (en) | Biological sample discrimination plate | |
| JP2007075051A (en) | Biological sample discrimination plate | |
| JP4483608B2 (en) | Fluorescence analyzer | |
| US20060160210A1 (en) | Biological sample analysis plate | |
| JP2006349559A (en) | Reaction vessel and method for detecting substance using the same | |
| JP2010088317A (en) | Chip for biological sample determination, kit for biological sample determination and method for biological sample determination | |
| CA2932577C (en) | Gas evacuation system for nanofluidic biosensor | |
| Caetano et al. | Microfluidic devices with electrochemical detection towards Covid-19 detection | |
| JP2009171933A (en) | Biological sample reaction chip and biological sample reaction method | |
| JP2006153562A (en) | Plate for biological sample discriminator |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20071205 |
|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7421 Effective date: 20080115 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20090424 |