JP2006265189A - βアミロイドペプチド、及びそれを用いたアルツハイマー病治療薬又は予防薬のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】βアミロイドペプチドの凝集と神経細胞毒性の発現の構造因子を明らかにすることができるβアミロイドペプチド（Ａβ）と、当該Ａβを利用するＡＤ治療薬又は予防薬のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】４２アミノ酸残基から構成されるＡβ４２において、２２位及び２３位、又はそれに加えて３８位及び３９位に、それらの前後のアミノ酸配列に基づくβシート構造間のターン構造を導入したＡβ４２を作成した。
【選択図】図１０

Description

本発明は、アルツハイマー病の原因物質と考えられるβアミロイドペプチド、及び当該βアミロイドペプチドを利用するアルツハイマー病治療薬のスクリーニング方法に関するものである。

アルツハイマー病（Alzheimer’s disease：ＡＤ）は、神経変性疾患の一種であるが、現状では有効な治療方法がほとんどなく、ＡＤの発症機構の解明並びに根本的治療法の確立が強く望まれている。ＡＤ患者の脳には神経病理学上の特徴として、主として大脳新皮質に見られる球状の構造物である老人斑と、海馬及び大脳新皮質に出現する繊維状の封入体である神経原線維変化が認められる。老人斑はＡＤ患者に対する疾患特異性が高く、ＡＤ早期から高頻度で認められることから、多くの研究者に注目されてきている。これまでに、老人斑は主として４０及び４２残基のアミノ酸からなるβアミロイドペプチド（Ａβ）の凝集体であることが判明しており、前駆タンパク質として、アミノ酸残基数７７０のアミロイド前駆体タンパク質（amyloid precursor protein:ＡＰＰ）と命名された１回貫通型の膜タンパク質が同定されている。すなわちＡβは、ＡＰＰが細胞膜外でβ-セクレターゼ（β-secretase）によって切断され、次いで細胞膜内でγ-セクレターゼ（γ-secretase）によって切断されることで産生されるが、この代謝系は正常脳でも機能していることから、ＡβはＡＰＰの正常な代謝産物の一つであるといえる。

Ａβは主として４０残基のＡβ４０、４２残基のＡβ４２からなる。生理学的にはＡβ４０とＡβ４２は約１０：１の比率で存在するが、まず特に凝集能が高いＡβ４２が凝集して核となり、その周りにＡβ４０が凝集して老人斑を形成するという考え方が一般的である。Ａβは神経細胞死を引き起こすことから、ＡＤの原因物質と考えられており（アミロイド仮説）、その神経細胞毒性は凝集活性と密接に関連しているが、凝集体そのものの毒性は低く、Ａβのオリゴマー構造が毒性本体であると最近では考えられるようになってきてはいる。しかしながら、これまでのところ毒性を発するＡβのオリゴマー構造は明らかとなっていない。一方、Ａβが分子間βシート構造をとることによって凝集し、神経細胞毒性を発現することは明らかとなってきており、βシートコンホメーションをとるＡβの性質を利用して神経毒性を阻害する物質の検定方法が考えられている（特許文献１参照）。同文献には、Ａβのβシート構造と神経毒性との間に直接的な相関があることを示唆する記載はされているものの、具体的なデータは明らかにされておらず、細胞毒性のメカニズムについても何ら言及されていない。また、これまでの研究対象は、前記文献も含めて合成の比較的容易なＡβ４０に対するものがほとんどであり、Ａβ４０の生成量の約１／１０しかなく合成も困難なＡβ４２はさほど注目されていない。近年になり、Ａβ４２の抗体の治療への応用が試みられるようにはなってきたが、これらの抗体は、正常なＡβ４２を抗原として作られたものであるため、脳炎等の副作用のために実用化には至っていないのが現状である。
特開平０６−２９４７９８号公報

本発明は、Ａβ自体に神経細胞毒性があるのではなく、Ａβ４２がある特異的なコンホメーションを取ることで凝集活性が高まるとの観点から、Ａβ４２の凝集と神経細胞毒性の発現において鍵となるＡβ４２の構造因子を明らかにすることで、有害なコンホメーションをとるＡβ４２を提供するとともに、当該Ａβ４２を利用する有益なＡＤ治療薬又は予防薬のスクリーニング方法を提供することを主たる目的とするものである。

本発明者らは、遺伝変異を伴う家族性ＡＤ（familial Alzheimer’s disease：ＦＡＤ）におけるＡβ配列の変異、特にＡβの凝集体が脳血管壁に異常沈着する症例が報告されているＡβ配列内の変異に着目し、これらのＡβ４０及びＡβ４２変異体を高純度で化学合成し、それらの神経細胞毒性、凝集活性並びに二次構造を精査することによって、Ａβ４２の凝集並びに神経細胞毒性発現機構に関する新規な知見を得て、本発明をするに至った。

すなわち、本発明に係るβアミロイドペプチドは、アミノ酸４２残基からなるβアミロイドペプチドであって、２２位及び２３位のアミノ酸残基においてその前後のアミノ酸配列によるβシート構造間のターン構造をなすことを特徴とする。ここで、アミノ酸４２残基のβアミロイドペプチド（Ａβ４２）の野生型のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、また比較のためアミノ酸４０残基のβアミロイドペプチド（Ａβ４０）の野生型のアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示す。

野生型Ａβ４０とＡβ４２は、何れも凝集活性と神経細胞毒性を示すが、Ａβ４２の方がＡβ４０よりも凝集活性が高く且つ神経細胞毒性も高く持続時間も長い、という違いがある。これらＡβ４０とＡβ４２の二次構造上の相違は、Ｃ末端領域にあることを本発明者らが見出した。つまり、Ａβ４２のＣ末端２残基は分子内βシート構造形成に関与しているが、Ａβ４０についてはＣ末端領域がβシート構造をとっていない。この相違が、Ａβ４０とＡβ４２の凝集活性及び神経細胞毒性に関する決定的な違いであることが示唆されたことから、本発明は特に、アミノ酸４２残基からなるβアミロイドペプチド（Ａβ４２）であって、２２位及び２３位のアミノ酸残基と、３８位及び３９位のアミノ酸残基において、それぞれそれらの前後のアミノ酸配列によるβシート構造間のターン構造をなすことを特徴とするβアミロイドペプチドである。

特に上記２つの本発明において、Ａβ４２の２２位及び２３位と３８位及び３９位で分子内βシート構造のターン構造を取りやすいアミノ酸残基としては、ターンのＮ末端に近い側（２２位、３８位）が、プロリン、セリン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン、グリシン、アスパラギン、アラニン、グルタミン酸から選択される何れか一のアミノ酸残基であり、それに隣接するアミノ酸残基（２３位、３９位）が、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、アルギニン、セリン、システイン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸、スレオニン、リジンから選択される何れか一のアミノ酸残基であることが望ましい。

なかでも、アミノ酸２残基の配列によるターン構造は、そのうちターンのＮ末端に近い側がプロリン残基である場合に生じやすいことから、本発明に係るＡβ４２については、２２位のグルタミン酸残基をプロリン残基に置換してなるものが好ましい。

特に、Ａβの強力な凝集活性と神経細胞毒性の機構を合理的に説明でき、且つＡＤ治療薬又は予防薬の創成に極めて役立つＡβ４２については、２２位のグルタミン酸残基及び３８位のグリシン残基を、共にプロリン残基に置換してなるものが最適である。

上述したようなＡβは、後に詳述するように合成により得ることができ、しかも高い凝集活性と神経細胞毒性を示すものであり、またこれまでにないＡβ４２の凝集及び毒性発現の新しいモデルを提供するものであることから、ＡＤの治療薬又は予防薬（抗体を含む）の開発に大いに寄与するものである。

したがって、上記の本発明に係るＡβ４２を利用することで、ＡＤ治療薬又は予防薬の有効成分となる物質をスクリーニングすることが可能となる。すなわち本発明に係るスクリーニング方法は、上記の何れかのＡβ４２に被験物質を接触させて、当該Ａβ４２の凝集活性を測定する工程を含むことを特徴とする方法である。

その他の本発明に係るＡＤ治療薬又は予防薬のスクリーニング方法には、上記の何れかに記載のＡβ４２に被験物質を接触させて、当該Ａβ４２による神経細胞毒性を測定する工程を含むことを特徴とする方法である。

本発明のβアミロイドペプチド（Ａβ４２）は、アルツハイマー病（ＡＤ）の病因と考えられる合理的なＡβ４２の新しい凝集モデル及び神経細胞毒性発現モデルを示すものであり、Ａβ４２自体がＡＤの原因となるのではなく、例えばプリオンタンパク質のように特異なコンホメーションを取ることでＡＤの要因となることを示唆するものである。したがって、このＡβ４２を用いてスクリーニングを行うことで、Ａβ４２の構造に基づいたＡＤ治療薬又は予防薬の開発に新たな且つ画期的な道筋をつけることが可能となる。

以下、本発明について図面を参照して詳細に説明する。
＜Ａβ４２の凝集モデル＞ 図１は、細胞膜 (cell membrane) を貫通するアミロイド前駆体タンパク質ＡＰＰからγ-セクレターゼにより切断されて産生される２種類のβアミロイドペプチド（Ａβ４０，Ａβ４２、但し、何れも野生型）と、家族性アルツハイマー病（familial Alzheimer’s disease：ＦＡＤ）におけるＡβ配列の変異を示すモデル図である。なお同図では、各アミノ酸を１文字表記で表している。Ａβの配列内の中央部付近に突然変異を有するＦＡＤにおいては、２１位のアラニン残基がグリシン残基に変異している（Ａ２１Ｇ-Ａβ）家系（Flemish）、２２位のグルタミン酸残基がグルタミン残基に変異している（Ｅ２２Ｑ-Ａβ）家系（Dutch）、２２位のグルタミン酸残基がリジン残基に変異している（Ｅ２２Ｋ-Ａβ）家系（Italian）、２２位のグルタミン酸残基がグリシン残基に変異している（Ｅ２２Ｇ-Ａβ）家系（Arctic）、２３位のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に変異している（Ｄ２３Ｎ-Ａβ）家系（Iowa）がある。そこで、後述する実施例に示す方法により、これらＦＡＤに見られる５種類の変異型Ａβ４０及びＡβ４２（Ａ２１Ｇ，Ｅ２２Ｑ，Ｅ２２Ｋ，Ｅ２２Ｇ，Ｄ２３Ｎ）を高純度で化学合成し、これらの変異体の神経細胞毒性についてＰＣ１２細胞を用いたＭＴＴ法によって調べたところ、図２に示すように、２２位、２３位のＡβ４０及びＡβ４２変異体は何れも野生型（Wild-type）よりも高い毒性を示した。また、Ａβ４２変異体の毒性は、対応するＡβ４０変異体と比較して５０倍から２００倍高かった。これらの結果から、Ａβ４２変異体がＦＡＤの病因となっている可能性が示唆された。次に、各変異体の凝集活性を、遠心分離後の上清をＨＰＬＣにより定量することによって調べたところ、図３（ａ）に示すように、Ｅ２２Ｇ-Ａβ４２（Arctic）及びＤ２３Ｎ-Ａβ４２（Iowa）の凝集活性は野生型とほぼ同程度であったのに対して、Ｅ２２Ｋ-Ａβ４２（Italian）及びＥ２２Ｑ-Ａβ４（Dutch）は、野生型よりも著しく凝集した。この結果は、Italian及びDutch家系ＦＡＤ患者の脳内で、Ａβの凝集体の異常沈着が認められる（Science, 248, 1124-1126 (1990)，Alzheimer’s Rep., 2, S28 (1999)）こととよく符合する。さらにこれらの凝集体の電子顕微鏡撮影を行ったところ、いずれの変異体においても野生型と同様のフィブリル（微小線維）が観察された。以上の結果より、Ａβの２２位及び２３位の変異体において、神経細胞毒性と凝集活性との間に高い相関が認められることが明らかとなった。一方、Ａ２１Ｇ-Ａβ４２（Flemish）は、野生型とほぼ同程度の神経細胞毒性を示したが凝集能は低かったことから、Ａβのフィブリル形成は、神経細胞毒性の発現においては必ずしも必要なのではなく、結果である可能性が示唆される。

ところで、Ａβが凝集するためには、特定部位においてβシート構造をとることが重要であると考えられており（Int. J. Exp. Clin. Invest., 5, 121-142 (1998)）、上記の各Ａβ４２変異体の凝集前後の試料についてフーリエ変換赤外分光法（FT-IR）にて二次構造解析を行った結果、何れの試料も凝集によりβシート含有量が増大することが認められた。一方、高い凝集活性が認められた前記各変異体の２２位及び２３位の２アミノ酸残基の配列を考慮してみると、何れも分子内βシート構造の折り返しとなるターン構造によく認められる配列である（J. Mol. Biol., 115, 135-175 (1977)）ことが判明した。そこで、上述した各種ＦＡＤの変異体と同様の方法により、ターン構造を最も取りやすいアミノ酸残基であるプロリン残基と、ターン構造を最も取りにくいアミノ酸残基であるバリン残基でそれぞれ２２位のグルタミン酸残基を置換したＡβ４２（Ｅ２２Ｐ-Ａβ４２，Ｅ２２Ｖ-Ａβ４２）、同じく２２位のグルタミン酸残基をプロリン残基で置換したＡβ４０（Ｅ２２Ｐ-Ａβ４０）を合成して、それらの凝集活性（図３（ｂ））と神経細胞毒性（図２参照）を調べた。その結果、Ｅ２２Ｐ-Ａβ４２とＥ２２Ｐ-Ａβ４０は野生型と比べて極めて高い凝集活性と毒性を示したのに対して、Ｅ２２Ｖ-Ａβ４２は凝集活性も毒性も示さなかった。以上の結果から、Ａβの凝集と神経細胞毒性には、Ａβの２２位及び２３位でのターン構造が強く関与していることが判明した。

そこで、Ａβ４２について、各位のアミノ酸残基を順にプロリン残基に置換した変異体を３４種作成し、それぞれの変異体の凝集活性を調べた。その結果を図４に示す。同図からも明らかなように、１５位から３２位の変異体のなかでは、２２位の変異体（Ｅ２２Ｐ-Ａβ４２）だけが野生型よりも極めて高く且つ迅速な凝集活性を示したが、１５位から２１位、２４位から３２位の変異体については凝集しにくいという結果が得られた。すなわち野生型よりも凝集活性が低下する部位はβシート構造をなしており、逆に凝集活性が低下しない部位はもともとターン構造をなしているといえる。このことから、Ａβの１５位から２１位、２４位から３２位はそれぞれβシート構造をなしており、２２位及び２３位はターン構造であることが分かった。同様に、凝集活性の低下が認められた部位と認められない部位との検討から、Ａβの３５位から３７位、及び４０位から４２位はβシート構造をなしており、３３位と３４位、及び３８位と３９位はターン構造であることが分かった。以上の結果に基づいて、図５（ａ）に、２２位及び２３位、３３位及び３４位、３８位及び３９位にそれぞれターン構造を有する本発明のＡβ４２凝集モデルを示す。図中、板状の矢印はβシート構造をなす部位を表している。最近の研究では、Ａβ４０のＣ末端は、βシートを形成していないことが明らかになってきている（J. Mol. Biol., 335, 833-842 (2004)）ことから、Ａβ４２とＡβ４０の二次構造上の決定的な相違は、Ｃ末端にβシートが存在するか否か、という点にあるといえる。なお、２つのアミノ酸残基の配列によるターン構造の取りやすさは、ターンのＮ末端に近い側をプロリン残基とした場合に限られるものではない。すなわち図５（ｂ）にターン構造を取りやすいアミノ酸２残基の組み合わせを一覧表として示すように、上述のＡβ４２凝集モデルにおいてターン構造をとる部位のＮ末端に近い側（first position）のアミノ酸残基には、プロリン残基以外に、セリン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン、グリシン、アスパラギン、アラニン、グルタミン酸の各残基のうちの何れかを適用することができる。他方、ターンのＣ末端に近い側のアミノ酸残基（second position）には、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、アルギニン、セリン、システイン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸、スレオニン、リジンの各残基のうちの何れかを適用することができる。

＜Ａβ４２の凝集及び神経細胞毒性発現機構＞ ＡＤ患者の脳には、酸化ストレスの増大が特徴的に認められる。その原因としては、酸素分子がCu(II)、Zn(II)、Fe(III)等の金属触媒存在下でＡβによって還元されて過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）が発生し、脂質やタンパク質等の生体分子が損傷されることによって神経細胞毒性が発現することにある。その機構は、Ａβの１０位のチロシルラジカルと３５位のメチオニンラジカル（メチオニン残基の硫黄原子上に生成されるラジカル）の両方が関与している、との報告がなされている（Brain Res. Bull., 50, 133-141 (1999)，Biochemistry, 43, 560-568 (2004)等）が、未だ不明な点が多い。さらに上述したように、これまでの研究はＡβ４０を対象にしたものがほとんどであり、Ａβ４２とＡβ４０との凝集能及び細胞毒性の差異を合理的に説明できなかった。

しかしながら、図５（ａ）に示したＡβ４２の凝集モデルであれば、このＡβ４２とＡβ４０との凝集性及び細胞毒性の差異を説明できる可能性が考えられた。そこでまず、Ａβ４２の２２位及び２３位のターン形成がＡβ４２の神経細胞毒性発現に与える影響について調べた。そのために、２２位のグルタミン酸残基に変異のある前述のＥ２２Ｋ-Ａβ４２（Italian）、Ｅ２２Ｑ-Ａβ４２（Dutch）、Ｅ２２Ｇ-Ａβ４２（Arctic）、Ｅ２２Ｐ-Ａβ４２、Ｅ２２Ｖ-Ａβ４２、野生型（Wild-type）Ａβ４２を用い、それらのＨ_２Ｏ_２の生成について検討した。図６（ａ）に示すように、Ｅ２２Ｋ-Ａβ４２、Ｅ２２Ｑ-Ａβ４２、Ｅ２２Ｇ-Ａβ４２、Ｅ２２Ｐ-Ａβ４２は野生型Ａβ４２の２倍以上のＨ_２Ｏ_２を生成したのに対して、Ｅ２２Ｖ-Ａβ４２は野生型Ａβ４２よりも低いＨ_２Ｏ_２生成量しか示さなかった。また、ＰＢＮ（N-tert-butyl-α-phenylnitrone）をトラップ試薬として用いた電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光分析でも、図６（ｂ）に示すように、暗所、３７℃の条件下で４８時間後には、Ｅ２２Ｖ-Ａβ４２を除く各変異体には野生型Ａβ４２よりもシグナル強度の増大が認められた一方、Ｅ２２Ｖ-Ａβ４２については野生型Ａβ４２よりも低下が認められ、特に前４者の変異体では特徴的な４重線が認められた（図６（ｃ））。これらの結果は、Ｈ_２Ｏ_２の産生、ラジカル形成、神経細胞毒性に高い相関関係があることを示しており、これより、Ａβ４２の２２位と２３位におけるターン構造がラジカル形成を通じた神経細胞毒性発現に不可欠であるという結論が導かれる。なお詳述しないが、本発明者らは、Ｅ２２Ｋ-Ａβ４２のフィブリルを対象とした固体ＮＭＲにより、２２位と２３位にターン構造が存在することを確認しており、このことは上記の結果をよく支持するものであるといえる。

次に、１０位のチロシン残基（Ｔｙｒ-１０）と３５位のメチオニン残基（Ｍｅｔ-３５）の神経細胞毒性に与える影響について調べた。そのために、１０位のチロシン残基（Ｔｙｒ-１０）をフェニルアラニン残基に置換したＡβ４２変異体（Ｙ１０Ｆ-Ａβ４２）と、３５位のメチオニン残基（Ｍｅｔ-３５）をノルバリン（ｎＶ；２-アミノペンタン酸）に置換したＡβ４２変異体（Ｍ３５ｎＶ-Ａβ４２）と、１０位と３５位をそれぞれフェニルアラニン残基とノルバリンに置換したＡβ４２変異体（Ｙ１０Ｆ，Ｍ３５ｎＶ-Ａβ４２）について、ラジカル生成量を測定した。なお、ノルバリンは、メチル基がＳ-メチル基に似た疎水性を有しているために採用したものである。図７（ａ）に示すように、Ｙ１０Ｆ-Ａβ４２、Ｍ３５ｎＶ-Ａβ４２、Ｙ１０Ｆ，Ｍ３５ｎＶ-Ａβ４２の各変異体は何れも野生型Ａβ４２と比較して極めて低いＨ_２Ｏ_２の産生しか示さなかった。また、ＥＳＲ分光分析でも、図７（ｂ）に示すように、これらの各変異体は、２４時間のインキュベーション後に野生型と比べてシグナル強度の低下が認められた。さらに、各変異体のＰＣ１２細胞に対する神経毒性についても、図７（ｃ）に示すように、有意な低下が認められた。これらの結果から、１０位のチロシルラジカルと３５位のメチオニンラジカルは、Ａβ４２のラジカルを介した神経細胞毒性に関して極めて重要な役割を果たしていることを示している。一方、Ａβ２５-３６を用いた実験により、Ｍｅｔ-３５の酸化された硫黄原子のラジカルカチオンが酸化的ストレスを有効に引き起こすには、その寿命は短すぎると考えられる（J. Am. Chem. Soc. 122, 10224-10225 (2000)）。

ところで、上述したＡβ４２の凝集モデルでは、Ｃ末端領域において、３８位と３９位のターン構造により３５位から３７位のβシート領域と４０位から４２位の領域とが分け隔てられた構造を有している。このことから、図８（ａ）のＣ末端の構造モデルに示すように、Ａβ４２の３５位から４２位の間で、分子内逆平行βシートが形成されており、Ｍｅｔ-３５の酸化された硫黄原子とＣ末端のカルボン酸陰イオンとの反応を可能にしていることが示唆される。そこで、Ｃ末端のカルボン酸をアミドに変換したＡβ４２（amide）を用い、そのラジカル生産性と神経細胞毒性について検討した。Ａβ４２（amide）のＨ_２Ｏ_２産生量（図８（ｂ））とラジカル生成量（図８（ｃ））、神経細胞毒性（図８（ｄ））は、野生型Ａβ４２と比較して有意に低下した。この結果から、Ａβ４２のＣ末端領域における分子内逆平行βシートを通じたＣ末端のカルボン酸陰イオンと３５位のメチオニンラジカルは、Ａβ４２の神経細胞毒性発現に必須であることが強く示唆される。ここで、Ａβ４０の場合は、Ｃ末端領域にβシート構造を持たないために、３５位のメチオニンラジカルが不安定で、低い神経細胞毒性しか示さない。また、稀に生じる４３残基のＡβペプチド（Ａβ４３）のラジカル生成と神経毒性発現のレベルも低いことから（同図（ｂ）（ｃ）参照）、Ａβ４２のＣ末端領域の長さが、ラジカル生成を通じた神経細胞毒性発現に極めて重要であるといえる。

上述の通り、ＡβのＰＣ１２細胞への毒性と凝集機構には相関があることが認められるが、凝集が如何にラジカル形成に基づく神経細胞毒性と関係しているかという具体的なメカニズムを解明する必要がある。そこで次に、前記の１０位、３５位、４２位を置換した全てのＡβ変異体について、ラジカル生成能と凝集能について検討した。図９（ａ）に示すように、Ｙ１０Ｆ-Ａβ４２、Ｍ３５ｎＶ-Ａβ４２、Ｙ１０Ｆ，Ｍ３５ｎＶ-Ａβ４２の各変異体は何れも野生型Ａβ４２と比較して凝集が遅いことが分かった。このことは、１０位のチロシルラジカルと３５位のメチオニンラジカルがＡβ４２の凝集において重要な役割を担っていることを示唆している。また、Ａβ４２（amide）とＡβ４３については野生型Ａβ４２と同程度の反応速度であった（但し、Ａβ４２（amide）とＡβ４３の平衡状態下における水溶性ペプチドのモル濃度はそれぞれ、２．２±０．２２，２．３±０．１０μＭであり、野生型Ａβの同モル濃度の０．８５±０．０４μＭよりも高い）。このことは、Ａβ４２（amide）とＡβ４３のフィブリルの熱力学的な安定性が野生型Ａβ４２よりも低いことを示唆している。本結果は、Ｍｅｔ-３５の酸化された硫黄原子とＣ末端（Ａｌａ-４２）のカルボン酸陰イオンとの間のＳ-Ｏ結合によって、Ａβ４２のオリゴマーが極めて安定的となることを示している。

前述のＡβ４２におけるＣ末端の構造モデル（図８（ａ））によれば、Ｃ末端にコアを有するＡβ４２だけがオリゴマーないしフィブリル内にラジカルを蓄積することができ、モノマーへの平衡化により細胞が持続的に損傷されることを意味する。この仮説を証明するため、Ａβ４２とＡβ４０のラジカル生成量をＥＳＲ（明所、３７℃の条件下では、６重線のシグナルが認められる）により経時的に測定したところ、図９（ｂ）に示すように、Ａβ４２については１２．５時間のインキュベーション後に観測可能なレベルのシグナルが観測され、そのシグナル強度は２４時間のインキュベーション後まで増大して最大値に達した。これに対してＡβ４０は、２４時間のインキュベーション後でも有意なレベルのシグナルを示さなかった。一方、ＥＳＲ測定での濃度（１６５μＭ）よりも低濃度での凝集活性試験（２５μＭ）においては、図９（ｃ）に示すように、１６時間のインキュベーション後に９０％以上のＡβ４２が凝集した。これに対してＡβ４０は、２４時間のインキュベーション後でも有意な凝集を示さなかった。また、図８（ｄ）に示したように、Ａβ４０の神経細胞毒性は極めて低かった。以上のことから、Ａβ４０はオリゴマーないしフィブリル形成によるラジカル生成を安定化できない結果、Ａβ４２よりも神経細胞毒性が低いのに対して、Ａβ４２のオリゴマーないしフィブリルはラジカルを放出し続けることができることが明らかとなった。

以上の結果に基づいて、Ａβ４２の凝集と神経細胞毒性発現の機構モデルを図１０に示す。すなわち、まずＡβ４２は微量の金属イオンがＮ末端のヒスチジンにキレートすることで、１０位のチロシン残基（１０-Ｔｙｒ）のフェノール性水酸基が酸化される。そして、Ａβ４２の２２位及び２３位のターン構造が、酸化により生成したチロシルラジカルをＭｅｔ-３５の硫黄原子へ接近させることで、メチオニンラジカルが生成する（同図（ａ））。そして、このメチオニンラジカルは、３８位及び３９位でターンした３５位から３７位と４０位から４２位の分子内βシートを通じてＣ末端のカルボン酸陰イオンに接近して結合し、Ａβ４２のＣ末端領域が安定化する（同図（ｂ））。その結果、Ａβ４２のＣ末端にコアが形成されてＡβ４２のオリゴマー形成ないしフィブリル形成が誘導され、Ａβ４２モノマーの平衡化を通じて持続的に発生させられるラジカル種がＡβ４２オリゴマーによって安定化されることとなる（同図（ｃ））。このことは、Ｃ末端にβシート構造を持たないＡβ４０と比較して、Ｃ末端にβシート構造を持つＡβ４２が極めて凝集しやすく、且つ長時間に亘って神経細胞毒性を発現することと非常によく符合する。

＜ＡＤ治療薬又は予防薬のスクリーニング方法＞ 上述のようなＡβ４２の凝集モデルとそれに基づく神経細胞毒性発現のモデルを利用することで、ＡＤの治療薬又は予防薬となる成分を含む物質のスクリーニングを行うことが可能である。スクリーニングの方法としては、Ａβ４２の凝集活性を測定する方法、又はＡβ４２の神経細胞毒性を測定する方法を挙げることができる。ここで、利用可能なＡβ４２としては、２２位及び２３位と、３８位及び３９位にターン構造を有する前記の各種変異体の如く、一部のアミノ酸残基を置換した態様のものが適しているが、ターン構造を最もとりやすく且つこのスクリーニングに最適なペプチドは、配列番号３にアミノ酸配列を示す通り、２２位と３８位の両方にプロリン残基を導入したＡβ４２（Ｅ２２Ｐ，Ｇ３８Ｐ-Ａβ４２）である。

このようなＡβ４２を利用して、その凝集活性を測定することに基づくスクリーニング方法としては、例えばＡβ４２に被験物質と蛍光色素であるチオフラビンＴを加えてインキュベーションし、蛍光強度を低下させる物質をスクリーニングする方法（Ｔｈ-Ｔアッセイ；Anal. Biochem., 177, 244-249 (1989)，J. Biol. Chem., 278, 46179-46187 (2003)）を例示することができる。具体的な被験物質の候補には、食品、微生物代謝産物、植物抽出物に代表される天然物由来物質を例示することができる。

また、上記のＡβ４２を利用して、神経細胞毒性を測定することに基づくスクリーニング方法としては、ＲＮＡアプタマーを用いたランダムスクリーニングを例示することができる。この場合、神経細胞毒性を低下させる阻害剤の立体構造を明らかにして、それを模倣する低分子有機化合物をＡＤ治療薬又は予防薬としてデザインすることが期待できる。

以上のようなスクリーニング方法の他にも、例えばＡβ４２における２２位と３８位の何れか一方又は両方のターン構造を模倣する低分子化合物のデザインを行い、それをハプテンとしてモノクローナル抗体を作成することも、ＡＤ治療薬又は予防薬の創成のための有用な方法であると考えられる。

＜βアミロイドペプチド（Ａβ）変異体の合成＞ 上述した各種Ａβ４２変異体は、Ａβ４２（amide）を除き、固相合成法（Ｆｍｏｃ法（Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, 306-311 (2002) , J. Biol. Chem., 279, 52781-52788 (2004) , Biochem. Biophys. Res. Commun., 294, 5-10 (2002) , J. Biol. Chem., 278, 46179-46187 (2003)））に基づき、Pioneer （商品名）ペプチド合成機（ Applied Biosystems社製）において０．１ｍｍｏｌのFmoc-Ala-PEG-PS樹脂に段階的にFmocアミノ酸を供することで合成した。Ａβ４２（amide）の合成には、Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂を利用した。Ａβ４３は、株式会社ペプチド研究所（日本、大阪）から購入した。ペプチド鎖延長の完了後、各ペプチド-樹脂複合体を、最終的な脱保護と樹脂からの脱離のためにＴＦＡ溶液を含む混合物として処理した。ジエチルエーテルで沈殿させた粗ペプチドは、ＨＰＬＣにて塩基性下で精製した。そして、得られたＡβ４２に凍結乾燥を施し、ＨＰＬＣにて純度を確認した（＞９８％）。精製したＡβ４２は、MALDI-TOF-MS分析装置（ Applied Biosystems社製）にて満足のいくデータが得られた。すなわち、分子量の計算値と理論値の差は１質量単位未満であった。なお、この合成工程を図１１に示す。

＜in vitro 過酸化水素アッセイ＞ Ｈ_２Ｏ_２の産生は、カラーメトリックＨ_２Ｏ_２アッセイキット（OXIS社製）を用いその仕様書に従って計測した。各Ａβ変異体は、５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、pH７．４）に１６５μＭで溶解し、３７℃で４、８、１６、２４、４８時間インキュベートした。各溶液１００μｌを、ソルビトールとアンモニウム鉄硫酸塩による酸性溶液中、キシレノールオレンジを含有する呈色試薬１ｍｌに添加し、５６０ｎｍで吸光度を測定した。なお、ペプチド以外のバックグラウンド値は差し引いた。

＜ＥＳＲ分光分析＞ 各Ａβ変異体は、酢酸エチル／ヘキサン中で繰り返し再結晶化することで精製したＰＢＮ（Aldrich社製）５０ｍＭを含有する５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、pH７．４）に、１６５μＭに希釈して用いた。過度な金属触媒反応による影響を抑制するために、前記の緩衝液を、Chelex-100樹脂（Aldrich社製）の存在下、室温にて４８時間攪拌した。Ａβの添加前に、前記の緩衝液にデフェロキサミンメシレート（deferoxamine mesylate）を２ｍＭになるように加えた。得られたペプチド溶液は、３７度で２４時間又は４８時間インキュベートした。ＥＳＲ分析に備えて、各溶液４００μｌを、ＥＳＲフラットセル中に適当時間静置した。ＥＳＲ分光分析は、EMX ESR分光分析機（Burker社製）で、室温下３７℃にて行った。計測のパラメータは次の通りである。マイクロ波出力：２０ｍＷ，マイクロ波周波数：９．８ＧＨｚ，変調周波数：１００ｋＨｚ，振幅変調：１．０Ｇ，変換時間：４０．９６ｍｓ，スキャン：１００回（室温）又は２００回（３７℃）。ラジカル強度の積分演算は、バックグラウンドのスペクトルの除去後に行った。

＜細胞生存の評価＞ ラットの副腎褐色細胞腫由来であるＰＣ１２細胞のミトコンドリアの機能をＭＴＴ（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）還元アッセイにより評価した。実験手法は既知の文献（Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, 306-311 (2002) , J. Biol. Chem., 279, 52781-52788 (2004) , Biochem. Biophys. Res. Commun., 294, 5-10 (2002) , J. Biol. Chem., 278, 46179-46187 (2003)）に記載の方法に従った。

＜凝集試験＞ 各Ａβ変異体の凝集速度は、沈降アッセイにより評価した。実験手法は既知の文献（Biochem. Biophys. Res.Commun.,295,306-311(2002)，J. Biol.Chem.,279,52781-52788(2004)，Biochem. Biophys. Res.Commun.,294,5-10(2002)，J. Biol. Chem.,278,46179-26187(2003)）に記載の方法に従った。２２０ｎｍの吸収領域を積分して、コントロールに対する割合で示した。Ａβフィブリルの熱力学的安定性は、Micro BCA proteinアッセイ（Pierce社製）を利用してその仕様書に従い、平衡状態にある可溶性Ａβのモル濃度を測定することにより評価した。

なお、本発明は上述した実施例に限定されることなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することができるのは勿論である。

ＡβがＡＰＰから切り出されるモデルを示す図 Ａβ４２変異体の神経細胞毒性活性試験結果を示す図 Ａβ４２変異体の凝集活性試験結果を示す図 Ａβ４２プロリン導入変異体の凝集活性試験結果を示す図 Ａβ４２の凝集モデルを示す図 Ａβ４２変異体の２２位及び２３位のターン形成が神経細胞毒性発現に与える影響を示す各種試験結果を表す図 Ａβ４２変異体のＴｙｒ-１０およびＭｅｔ-３５の神経細胞毒性に与える影響を示す各種試験結果を表す図 Ａβ４２変異体のＣ末端モデル、並びにラジカル生成と神経細胞毒性との関係を示す各種試験結果を表す図 Ａβ４２変異体のラジカル生成と凝集活性との関係を示す各種試験結果を表す図 Ａβ４２の凝集及び神経細胞毒性発現の機構を示すモデル図 Ａβ変異体の合成方法を示す概略的な工程図

符号の説明

Ａβ…βアミロイドペプチド
ＡＰＰ…アミロイド前駆体タンパク質

Claims (7)

1. アミノ酸４２残基からなるβアミロイドペプチドであって、２２位及び２３位のアミノ酸残基においてその前後のアミノ酸配列によるβシート構造間のターン構造をなすことを特徴とするβアミロイドペプチド。
2. ３８位及び３９位のアミノ酸残基において、それぞれそれらの前後のアミノ酸配列によるβシート構造間のターン構造をなすことを特徴とする請求項１記載のβアミロイドペプチド。
3. 前記ターン構造をなす２つのアミノ酸残基のうちＮ末端に近い側が、プロリン、セリン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン、グリシン、アスパラギン、アラニン、グルタミン酸から選択される何れか一のアミノ酸残基であり、それに隣接するアミノ酸残基が、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、アルギニン、セリン、システイン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸、スレオニン、リジンから選択される何れか一のアミノ酸残基である請求項１又は２記載のβアミロイドペプチド。
4. ２２位のグルタミン酸残基をプロリン残基に置換してなる請求項１記載のβアミロイドペプチド。
5. ２２位のグルタミン酸残基及び３８位のグリシン残基を、共にプロリン残基に置換してなる請求項２記載のβアミロイドペプチド。
6. アルツハイマー病治療薬又は予防薬の有効成分となる物質をスクリーニングする方法であって、請求項１乃至５の何れかに記載のβアミロイドペプチドに被験物質を接触させて当該βアミロイドペプチドの凝集活性を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
7. アルツハイマー病治療薬又は予防薬の有効成分となる物質をスクリーニングする方法であって、請求項１乃至５の何れかに記載のβアミロイドペプチドに被験物質を接触させて当該βアミロイドペプチドによる神経細胞毒性を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
   

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