JP2006160748A - エルゴチオネインの新規合成方法 - Google Patents

Abstract

【課題】エルゴチオネインの各種光学異性体の化学合成方法。
【解決方法】この方法では、Ｎα，Ｎα−ジメチル化ヒスチジンエステルの塩、必要な場合には光学的に活性な塩を合成または用い、この塩を塩基の存在下でアルキル、アルケニルまたはアリールハロゲノチオノホルメート、特にフェニルハロゲノチオノホルメートで処理し、得られた化合物の硫黄含有置換基を保護した後、保護された化合物をトリメチルアンモニウム型化合物へ変換し、ケン化または酸加水分解して所望のエルゴチオネインを遊離させる。この方法では収率が向上し、光学純度が優れる。
【選択図】なし

Description

本発明はエルゴチオネインの各種光学異性体、特にＤ，Ｌ−エルゴチオネインと天然分子であるＬ-(＋)-エルゴチオネインの新規な合成方法に関するものである。

Ｌ−エルゴチオネイン(ergothioneine) または２−メルカプト−Ｎα，Ｎα，Ｎα−トリメチル−Ｌ−ヒスチジンはライ麦角菌クラビセプスプルプレア(Claviceps purpurea)から単離された天然分子である(下記文献参照)。
Tanret C., C. R. Acad. Sci., 149 (1909)p222-224

その後、この物質はラットの赤血球と肝臓中で確認され、その他多くの動物組織、特に人間でも確認された（下記文献参照）。
Melville D. B., Vitam. Horm., 17, (1958), p.155-204

この物質は菌類とマイコバクテリアだけで生合成される。植物界では菌類によって分生胞子内でエルゴチオネインが合成され、それが根から吸収される。人間では食物を介してのみ取り込まれる。
エルゴチオネインの正確な生物学的役割はいまだに明らかではないが、その抗酸化特性はよく知られている(下記文献参照)。
Hartman P. E.,Meth. Enzymol., 186, (1990) p310-318 ； Akanmu D. 達、Journal Arch. Biochem. Biophys., 288, (1991) p10-16

従って、エルゴチオネインはその抗酸化特性から食品添加剤あるいは化粧品中または医薬品で使用することができると考えられる。
エルゴチオネインは微生物経路（下記特許文献１参照）または化学的経路（下記非特許文献５、６参照）で得られている。
特開昭43− 20716号公報 Heath H.達、Journal J. Chem. Soc., 1951,p2215-17 Sunko D. E. ／Wolf G. J. Chem. Soc., 1958, p4405-4406

後者の経路を確実に行うためには以下 の３つの問題点を克服しなければならない：
1) トリメチルアンモニウム基はアルカリ媒体中で容易にβ脱離して２−メルカプトウロカニン酸になる、
2) 窒素含有基は硫黄含有基の存在下でメチル化する、
3) エルゴチオネインはそのベタイン型構造のため弱アルカリ媒体中で極めて容易にラセミ化する。
しかも、この化合物を工業的規模で製造するには総合収率を少なくとも20％以上にする必要がある。

従来法で基本となる合成中間体は２−メルカプトヒスチジンであり、これはヒスチジンのイミダゾール環を分解し、次いでカリウムチオシアネートを用いて２−メルカプトイミダゾール環を合成する（上記ヒース参照）か、全合成によって（上記サンコおよびに下記文献に記載のヘジェダス (Hegedus B.) を参照）で得られる。
Journal Helv. Chim. Acta, 38, (1955), p. 22-27

2-メルカプトヒスチジンからエルゴチオネインを合成する場合には常に上記プロセス（上記ヒース参照）が用いられるが、この工程プロセスがこの合成の主たる障害になる。すなわち、最終メチル化段階で多量の酸化銀と、銀塩の除去のための硫化水素と、リンタングステン酸とを全て過酷な条件下で用いる必要がある。しかも，この最後段階は実験室では可能でも工業的規模でのエルゴチオネイン合成には適用不可能と思われる。最後に、得られるエルゴチオネインは部分的または全体的にラセミ化しており、この合成方法の総合収率は９％未満である。

上記文献に見られるエルゴチオネイン、特にＬ−（＋）−エルゴチオネインの重要性から、本出願人は上記欠点が無く、非常に緩やかな条件下で、好ましくは98％以上の非常に高い光学的純度で所望の生成物が高い総合収率で得られる新規な合成方法を研究した。

本発明の目的は、２−メルカプトイミダゾール環の新規合成方法に基づくエルゴチオネインの新規合成方法を提供することにある。

本発明方法の鍵となる段階は「求核性付加反応−開環−閉環(Addition Nucleophile-Ouverture du Cycle-Refermeture du Cycle)、ＡＮＯＲＣ」型の機構と類似の反応機構によってイミダゾール環に硫黄原子を導入するという新規な方法に基づいている。
より正確には、本発明の対象は下記 (a)〜(d) 段階で構成されることを特徴とするエルゴチオネインの各種光学異性体、特に（Ｄ、Ｌ）および（Ｌ）型異性体の化学合成方法に関するものである：
(a) Ｎα，Ｎα−ジメチル化ヒスチジンエステルの塩（必要な場合には光学的に活性なもの）を合成または用い、
(b) この化合物を、塩基の存在下でアルキル、アルケニルまたはアリールハロゲノチオノホルメート、特にフェニルハロゲノチオノホルメートで処理し、
(c) 得られた化合物の硫黄含有置換基を保護した後、保護された化合物をトリメチルアンモニウム型化合物へ変換し、
(d) ケン化または酸加水分解して所望のエルゴチオネインを遊離させる。

ヒスチジンエステルはＣ₁〜Ｃ₆アルキルエステル、特にメチルエステルが有利である。
塩はハライド、特にジクロロハイドレートが有利である。
市販のＬ−ヒスチジンをメチル化したメチルエステルのジクロロハイドレートから出発することができる。
また、下記文献に記載のレインホールド(Reinhold V. N.)達の方法で得られるＮα，Ｎα−ジメチル−Ｌ−ヒスチジンメチルエステルの塩から出発することもできる。
：J. Med.Chem., 11, (1968), p. 258-260)

アリールハロゲノチオノホルメートはフェニルクロロチオノホルメートが有利である。
この化合物で処理する際に用いる塩基は、例えば重炭酸ナトリウムまたはアミンまたはアルキルアミン、特にトリエチルアミンである。
硫黄含有置換基の保護はアシル化、好ましくは通常のハロゲノホルメート、例えばエチルまたはフェニルハロゲノホルメート、特にクロロホルメートで保護することができる。
トリメチルアンモニウム型化合物への変換はハロゲン化メチル、特にヨウ化メチルまたは硫酸ジメチル等のアルキル化剤を用いて行う。
トリメチルアンモニウム型化合物は水／アルコール混合物中で例えばアミン、特にアルキルアミン、好ましくはトリエチルアミンによって鹸化される。好ましいアルコールはメタノールである。

変形例、特に光学活性なエルゴチオネインを合成するために光学活性な化合物を出発材料をする場合のトリメチルアンモニウム型化合物は、酸溶液、例えば高濃度の塩化水素酸溶液を用いて、好ましくは大過剰のメルカプタンの存在下で、加水分解するのが有利である。使用するメルカプタンはアルキル−またはアリールメルカプタン、好ましくはβ−メルカプトプロピオン酸にするのが好ましい。

本発明の好ましい実施例では、下記 (a)〜(e) 段階よりなることを特徴とするＤ，Ｌ−エルゴチオネインの化学合成方法が提供される：
(a) Ｎα，Ｎα−ジメチル化ヒスチジンエステルの塩を合成または使用し、
(b) この化合物を、塩基の存在下でアルキル、アルケニルまたはアリールハロゲノチオノホルメート、特にフェニルハロゲノチオノホルメートで処理し、
(c) 得られた化合物の硫黄含有置換基を塩基、好ましくはトリエチルアミンの存在下で保護、好ましくはアシル化、特に好ましくはアルキルまたはフェニルハロゲノホルメートで保護し、
(d) 保護された化合物をアルコール中でアルキル化剤、好ましくはハロゲン化メチルで処理し、
(e) 水／アルコール混合物中で鹸化、好ましくはアミンで鹸化して所望のＤ，Ｌ−エルゴチオネインを遊離させる。

本発明の好ましい実施例では、下記 (a)〜(e) 段階よりなることを特徴とするＬ−（＋）−エルゴチオネインの化学合成方法が提供される：
(a) Ｎα，Ｎα−ジメチル化ヒスチジンエステルの塩を合成または使用し、
(b) この化合物を、塩基の存在下でアルキル、アルケニルまたはアリールハロゲノチオノホルメート、特にフェニルハロゲノチオノホルメートで処理し、
(c) 得られた化合物の硫黄含有置換基を塩基、好ましくはトリエチルアミンの存在下で保護、好ましくはアシル化、特に好ましくはアルキルまたはフェニルハロゲノホルメートで保護し、
(d) 保護された化合物をアルコール中でアルキル化剤、好ましくはハロゲン化メチルで処理し、
(e) 酸加水分解、好ましくは強酸の溶液を用いて所望のＬ−（＋）−エルゴチオネインを遊離させる。

好ましい実施例ではハロゲン化メチルはヨウ化メチルであり、アルコールはメタノールである。
好ましい実施例ではＬ−（＋）−エルゴチオネインを遊離させるための酸加水分解を大過剰のメルカプタンの存在下で行う。
メルカプタンとしてはアルキルまたはアリールメルカプタンを用いるのが有利である。特に好ましいメルカプタンはβ−メルカプトピロピオン酸である。上記の強酸は高濃度塩酸溶液が有利である。
エステルに対するメルカプタンのモル比は50以上、好ましくは70以上にするのが有利である。このメルカプタンは酸加水分解で生じたカルボカチオンを補集して２−メルカプトイミダゾール環の硫黄原子との反応(reaction parasite) を無くす役目をする。
反応雰囲気に制限はないが、実用的な理由から以下の実施例は不活性窒素雰囲気下で行った。

本発明では、アルキル、アルケニルまたはアリールハロゲノチオノホルメートによる化合物の処理を極性溶媒中で塩基を用いて行うことができる。この場合の塩基は重炭酸塩、アミンまたはアルキルアミン、特にジエチルアミンまたはトリエチルアミンの中から選択することができる。

収率を高くするのに好ましい実施例では、上記処置が２段階で行われる。第１段階では弱塩基、好ましくはｐＫａ約９以下の塩基、特に重炭酸塩の水性溶液中でクロロチオノホルメートの溶解度を良くする極性溶媒、例えばエチルエーテルの存在下で行うのが有利である。この反応はハロゲノチオノホルメートの極性溶媒溶液を室温で重炭酸塩水溶液に処理されるべき化合物を含む溶液中に１滴ずつ添加するのが有利である。開環したイミダゾール環よりなる中間体は有機溶媒相（例えばエチルエーテル、好ましくは硫酸マグネシウム等で脱水して残留水分を除去したもの）中に回収し、油状になるまで蒸発させる。次いで、この油状物質を別の塩基、好ましくはｐＫａが約10以上の塩基、好ましくは有機塩基、さらに好ましくはアミンまたはアルキルアミン、特にジエチルアミンまたはトリエチルアミンを
用いて室温で数時間、好ましくは極性溶媒の存在下で処理する。この極性溶媒はエーテルが好ましく、特にテトラヒドロフランが好ましい。次いで、溶媒を除去して所望の反応生成物を得る。

光学活性な出発原料がラセミ化する危険性が非常に高いので、第１段階は特に難しいという点に注意されたい。このラセミ化の危険性は強塩基が存在すると特に高くなることが観察されている。従って、第１段階は弱塩基の存在下で行わなければならない。この反応には重炭酸塩が特に適している。また、イミダゾール環の形成の総合収率は約70％で、１段階プロセスで得られる約40％の収率に比べてはるかに高くなる。
また、エルゴチオネインのＤおよびＬ型の各光学異性体は、公知のアミノ酸分解法と類似の方法で（Ｄ，Ｌ）−エルゴチオネインラセミ体から得ることができる。

本発明の上記以外の目的、特性および利点は以下の本発明実施例から明らかとなろう。しかし、本発明が以下の実施例に限定されるものではない。

以下の実施例では特に記載がない限りパーセンテージは全て重量％である。また、特に記載のない限り、反応は全て不活性窒素雰囲気下で行った。
質量分析はネルマグの装置(Nermag R10-10B)で採った。イオン化法としては70ｅＶの電子衝撃法（ＥＩ）、アンモニア中での化学的イオン化法（ＣＩ）またはグリセロールマトリクス上でのＦＡＢ法(fast atom bombardment) を用いた。
¹Ｈおよび¹³ＣのＮＭＲスペクトルはバリアンの装置(Varian Gemini-200)を用いて採った。化学シフトはテトラメチルシランに対してｐｐｍで表した。多重度に関してはｓはシングルレット、slは幅の広いシングルレット、ｄはダブレット、ｔはトリプレット、ｑはクワトレット、ｍはマルチプレットを表す。

融点（m. p. ℃）はガレンカンプの装置(Gallenkamp)で測定したもので、修正なしに示してある。
旋光能（α_D）はパーキンエルマー(Perkin Elmer 241)で25℃でナトリウムのＤ線で測定した。
カラム液体クロマトグラフィーによる精製はメルク社のシリカ（ＲMerck Si60 F₂₅₄）またはマイクロクリスタラインセルロース（ＲMerck microcrystalline cellulose） を用いて行った。

実施例１
Ｄ、Ｌ−エルゴチオネインの合成
Ａ) Ｌ-(＋)-Ｎα，Ｎα−ジメチルヒスチジンのメチルエステルのジクロロハイドレートの合成
150mlの脱イオン水にＬ−（＋）−ヒスチジンメチルエステルのジクロロハイドレート(Janssen； 18.16ｇ、75 mmol)を溶かした溶液に37％のホルムアルデヒド水溶液(Janssen；12.29ｇ、150 mmol) を添加する。得られた混合物をチャコールに担持させた10％のパラジウム(Aldrich；1.0ｇ)の存在下で室温で加圧下（７バール）で５時間水素化する。触媒を濾過分離した後、水洗し、濾液を減圧蒸発すると所望の生成物を油状で得る（20.3ｇ）。この生成物は次の段階で直接使用する。
物理特性
1)¹ＨＮＭＲ（200 MHz, D₂O）：
2.91 ppm (s; 6H); 3.50 ppm (m; 2H); 3.72 ppm (s; 3H);
4.48 ppm (dd; J=5.54-9.04 Hz; 1H); 7.38 ppm (s; 1H);
8.61 ppm (s; 1H)

Ｂ) （Ｄ、Ｌ)- 2'-メルカプト−Ｎα，Ｎα−ジメチルヒスチジンのメチルエステルの合成
Ｎα，Ｎα−ジメチルヒスチジンメチルエステルのジクロロハンドレート（27.0ｇ；100mmol）を 450mlの水に溶かす。重炭酸ナトリウム (Labosi；58.8ｇ；700mmol)をゆっくりと添加した後、 450mlのＴＨＦを添加する。得られた混合物にフェニルクロロチオノホルメート(Lancaster34.5ml；250mmol)を30分かけて攪拌しながら１滴ずつ添加する。
反応混合物を80℃で 24 時間攪拌する。二相混合物を重力分離し、有機相を乾燥するために溶媒を減圧蒸発させる。残った有機相をSiＯ₂ 上でクロマトグラフィーにかけ（溶出液；酢酸エチル）て所望のエステル 12.02ｇを得る。２’−メルカプト−Ｎα，Ｎα−ジメチルヒスチジンメチルエステルの収率は52％である。
物理特性
1) ｍ. ｐ. ：171-173 ℃
2) ¹ＨＮＭＲ（200 MHz, CDCL₃) ：
2.39 ppm(s; 6H); 2.78 ppm(d; J=7.30 Hz; 2H); 3.38ppm (t;J=7.30Hz; 1H); 3.72 ppm (s;3H); 6.44 ppm (s; 1H); 10.08 ppm(bs; IH); 10.24 ppm (bs;1H)
3) ¹³ＣＮＭＲ （50 MHz, DMSO-d₆)：
24.52 ppm (t); 41.03 ppm (q); 51.03 ppm (d); 65.04
ppm (q); 112.74 ppm (d); 126.13 ppm (s); 160.35 ppm
(S);171.17 ppm (s)
4) ＭＳ（EI，70eV) ：
229 (M+; 25); 170(8); 116(100)

Ｃ) （Ｄ，Ｌ)-1'- エトキシカルボニル-2'-エトキシカルボニルチオ−Ｎα，Ｎα−ジメチルヒスチジンメチルエステルの合成
２’−メルカプト−Ｎα，Ｎα−ジメチルヒスチジンメチルエステル（12.80 ｇ；55.9mmol）を不活性雰囲気下で 200mlのジクロロメタンに溶かす。トリエチルアミン(Janssen；23.3ml；168mmol)を添加した後、エチルクロロホルメート(Janssen；12.8ml；134mmol)を温度０℃で30分間かけて１滴ずつ添加する。反応混合物を室温で１時間攪拌した後、塩化ナトリウムの飽和水溶液を 150ml添加して加水分解する。有機相を重力分離した後、等量の塩化ナトリウムの飽和水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で脱水し、減圧下蒸留させる。粗生成物をシリカカラムでクロマトグラフィーして精製する（溶出液：酢酸エチル／シクロヘキサン１／１）と所望の生成物 18.71ｇが得られる
（収率：90％）。
物理的特性
1)¹ＨＮＭＲ（200 MHz, CDCL₃) ：
1.25 ppm (t; J=7.16 Hz; 3H); 1.35 ppm(t;J=7.16 Hz; 3H); 2.31ppm (s; 6H); 2.81 ppm (dd; J=6.54-14.66 Hz;
1H); 2.96 ppm(dd; J=8.46-14.66 Hz; 1H);3.60 ppm (dd; J=6.54-8.46 Hz; 1H) 3.62 ppm (s;3H); 4.26 ppm (q;J=7.16 Hz; 2H);4.36 ppm (q;J=7.16 Hz;2H); 7.41 ppm (s;1H)
2)¹³ＣＮＭＲ（50 MHz, CDCl₃)：
17172.41 ppm (s); 167.40ppm (s); 148.55 ppm (s);140. 76 ppm (s); 135.12 ppm (s); 120.15 ppm (d); 66.89
ppm (q); 65.17 ppm (t); 64.88ppm (t); 51.51ppm (d); 41.99ppm(q); 27.97 ppm(t); 14.37 ppm(q); 14.18ppm(q)3) ＭＳ（EI，70eV) ：
373 (M+; 6); 314(26); 116(100)

Ｄ) （Ｄ，Ｌ)-1'- エトキシカルボニル-2'-エトキシカルボニルチオ−Ｎα，Ｎα，Ｎα−トリメチルヒスチジンのメチルエステルの合成
（Ｄ，Ｌ）−１’−エトキシカルボニル−２’−エトキシカルボニルチオ−Ｎα，Ｎα−ジメチルヒスチジンメチルエステル（0.64ｇ；1.72mmol）の20mlメタノール溶液にヨードメタン(Lancaster；0.6 ml；9.6 mmol) を添加する。得られた混合物を窒素雰囲気下で室温で70時間攪拌する。室温で溶媒と過剰なヨードメタンを減圧蒸発させて油状物質を得る。これは主として所望のアンモニウム化合物を含み、そのまま次段階に使用できる。
物理特性
1) ¹ＨＮＭＲ（200 MHz,アセトン−ｄ₆）：
1.26 ppm(t; J=7.16 Hz; 3H); 1.37 ppm(t; J=7.16 Hz; 3H); 3.50-3.60ppm (m;2H); 3.64 ppm (s;9H); 3.74 ppm (s;3H); 4.33 ppm (q;J=7.16Hz; 2H);4.44 ppm(q;J= 7.16 Hz; 2H);4.84 ppm (dd; J=4.08-10.84 Hz; 1H); 7.99 ppm (s;1H)

Ｅ) Ｄ，Ｌ−エルゴチオネインの合成
１’−エトキシカルボニル−２’−エトキシカルボニルチオ−Ｎα、Ｎα，Ｎα−トリメチルヒスチジンメチルエステル（0.85ｇ；1.65mmol）を25mlのトリエチルアミン／水／メタノール (１：４：６）に溶かす。この溶液を45時間、60℃に加熱する。減圧下で溶媒を蒸発させ、得られた残留固形物をセルロールカラムを用いたクロマトグラフィーで精製（溶出液：メタノール／水９／１）するとＤ，Ｌ−エルゴチオネインが得られる（0.35ｇ；89％）。
物理特性
1) ｍ. ｐ. ; 275 ℃（分解) ；エタノール／水＝１：１から再結晶化
2) ¹ＨＮＭＲ（200 MHz, D₂O)：
3.01-3.18 ppm (s; 9H mと重なっている; 2H) ；3.80 ppm (dd; J=4.52-11.24Hz; 1H); 6.70 ppm (s; 1H)
3) ¹³ＣＮＭＲ（50MHz, D₂O) ：
173.11ppm (s); 158.82 ppm(s); 126.68 ppm (s); 118.11 ppm (d); 79..82 ppm (d); 54.79ppm(q); 25.38ppm (t)
上記ＮＭＲスペクトルは市販(ICN France)のエルゴチオネインサンプルで得られるものと同じである。
4) ＵＶ（Ｈ₂Ｏ，ｃ＝36.7μＭ）：λ_max＝257 nm
この値はメルクインデックス（Merck Index 11版、1989)に記載の情報と一致する。
上記方法で得られたＤ，Ｌ−エルゴチオネインの総合収率は41％である。

実施例２
Ｌ-(＋)-エルゴチオネインの合成
Ａ) Ｌ-(＋)-2'−メルカプト−Ｎα，Ｎα−ジメチルヒスチジンのメチルエステルの合成
Ｌ−（＋）−Ｎα，Ｎα−ジメチルヒスチジンのメチルエステルのジクロロハイドレート（60.0ｇ；222 mmol）を 750mlの脱イオン水に溶かす。固体の重炭酸ナトリウム(Labosi；130.5ｇ；1.55mol)をゆっくり添加した後、 750mlのＴＨＦを添加する。激しく攪拌しながら５〜10℃の温度で30分間かけてフェニルクロロチオノホルメート(Lancaster；76ml；555mmol)を添加する。反応混合物を室温で 260時間攪拌する。水相を重力分離した後、塩化メチレンで抽出する（３×150 ml）。有機相を合わせて室温で減圧蒸発乾固させ、得られた残留物をシリカカラム上でクロマトグラフィーで精製し、濃度勾配（酢酸エチル−酢酸エチル／メタノール＝100 ％−95／５）を付けた溶出液で溶出して24.0ｇの純粋な生成物を得る。生成物（5.0ｇ）を150mlの塩化メチレンに懸濁した後、懸濁液を濾過する。濾液から溶媒を留去した後に得られる残留物はエナンチオマー純度が100％の生成物4.42ｇである（収率42％）。
エナンチオマー純度は¹ＨＮＭＲ（ＣＤCl₃ 中でサンプル３mgとEu(tfc)₃10mgとを用いて）測定した。
物理特性：
1) ｍ. ｐ. ：170-171 ℃
2) ¹ＨＮＭＲ（200 MHz, CDCl₃)：
2.39 ppm(s; 6H); 2.78ppm(d; J=7.3 Hz; 2H); 3.38 ppm (t; J=7.30Hz; 1H); 3.72 ppm (s;3H); 6.44ppm (s; 1H);10.08ppm(bs;1H); 10.24ppm(bs;1H)
3) ¹³ＣＮＭＲ（50MHz, DMSO)：
24.52 ppm (t); 41.03 ppm(q); 51.03 ppm (d); 65.04 ppm (q);112.74 ppm (d); 126.13 ppm (s); 160.35ppm (s)；171.17 ppm(s)
4) ＭＳ（ＥＩ，70ｅＶ）：
229 （Ｍ＋；25); 170(8)；116(100)
5) α_D(c=1.0；MeOH)= +31.2°

Ｂ) Ｌ-(＋)-1'−エトキシカルボニル-2'-エトキシカルボニルチオ−Ｎα，Ｎα−ジメチルヒスチジンメチルエステルの合成
10℃に冷却し上記化合物（3.85ｇ；16.8mmol） の80ml塩化メチレン溶液にトリエチルアミン(Janssen；5.85ml；42.0mmol)を添加する。この温度でエチルクロロホルメート(Janssen；3.5ml；37.0mmol) を１滴ずつ添加する。添加の終了時にトリエチルアミンクロロハイドレートの沈澱が生じる。反応化合物を10℃で 0.5時間攪拌した後、50mlの水を添加して過剰のエチルクロロホルメートを加水分解する。有機相を重力分離し、水で洗
浄し（２×50ml）、最後に硫酸マグネシウムを用いて脱水する。減圧下で溶媒を留去するとわずかに黄色がかった油状物質6.19ｇを得る。これはそのまま次の段階で使用する（収率：99％）。
物理特性：
1) ¹ＨＮＭＲ（200 MHz, CDCl₃) ：
1.28 ppm (t; J=7.16 Hz; 3H); 1.40 ppm (t; J=7.16 Hz; 3H); 2.33ppm (s; 6H); 2.83 ppm (dd; J=6.50-14.60Hz;1H); 2.98 ppm(dd ; J=8.50-14.60Hz; 1H); 3.65 ppm(dd; J=6.50-8.50Hz; 1H); 3.68 ppm (s;3H); 4.28 ppm (q; J= 7.16Hz; 2H); 4.42 ppm (q; J=7.16Hz;2H); 7.44 ppm (s; 1H)
2) ＭＳ（ＥＩ，70ｅＶ）：
373(M+;9); 314(29); 116(100)
3) α_D(c=1.1；CH₂Cl₂)= -5.8 °

Ｃ) Ｌ-(＋)-1'- エトキシカルボニル-2'-エトキシカルボニルチオ−Ｎα，Ｎα，Ｎα−トリメチルヒスチジンメチルエステルの合成
前段階の生成物 (6.19ｇ；16.8mmol) を、60mlの無水ＴＨＦに溶かし、ヨードメタン(Aldrich；2.0 ml；32.1mmol) を１滴ずつ添加する。反応混合物を室温で24時間攪拌する。沈澱物を濾過した後、ＴＨＦで洗うとヨウ化物の形の所望生成物7.03ｇが得られる。濾液を約10mlまで濃縮する。24時間室温に放置すると、さらに0.33ｇの生成物が回収される（この場合もヨウ化物）。これら２段階の合計収率は85％である。
物理特性
1) ｍ. ｐ. ：136 ℃ (分解)
2) ¹ＨＮＭＲ（200 MHz, CDCl₃） ：
7.84 ppm(s; 1H); 4.78 ppm (dd; J=4.32-9.52 Hz; 1H); 4.36ppm (q;J=7.0 Hz; 2H); 4.25 ppm (q;J=7.0Hz; 2H); 3.73ppm(s; 3H); 3.65ppm(s; mと重なった9H ;1H);3.32 ppm (dd;J=9.52-14.6Hz; 1H); 1.38ppm (t;J=7.0 Hz;3H); 1.26ppm(t;J=7.0Hz;3H)
3) ¹³ＣＮＭＲ(50 MHz, CDCl₃):
167.50ppm(s); 166.96ppm(s); 148.21ppm(s); 136.06 ppm (s); 135.63ppm(s); 122.26ppm(d); 73.93ppm (d); 65.54 ppm(t;2CH₂); 54.08ppm(q); 53.85 ppm (q;3CH₃); 26.99ppm (t); 14.40 ppm(q); 14.23 ppm(q)
4) α_D(c=1.0；MeOH)= +34.6°

Ｄ) Ｌ-(＋)-エルゴチオネインの合成
上記のトリメチルアンモニウム化合物(2.05 ｇ；4.0mmol)とβ−メルカプトプロピオン酸(Aldrich；30ｇ； 283mmol) との混合物に100mlの塩酸（SDS ；35％）を添加し、均質溶液を110℃に加熱した油浴を用いて26時間還流させる。減圧下で溶媒を留去して得られる残留物を50mlの脱イオン水に懸濁させ、エチルエーテル（３×50ml）で過剰のβ−メルカプトプロピオン酸を抽出する。この水溶液のpHをアンモニアの希釈水溶液を用いて６−７とし、再度減圧蒸発乾固させる。残留物をシリカカラム上でクロマトグラフィーを行って精製し、濃度勾配を付けた溶出液（酢酸エチル：100 ％、次いでメタノール 100％、最後にメタノール／水：95／５）で溶出する。所望の生成物が白色固体の状態で得られる（725 mg）。これを３mlの脱イオン水に溶解し、この溶液に30mlの無水エタノールを一気に添加する。24時間４℃に放置した後、固体を濾過し、無水エタノールで洗浄する（480 mg）。濾液を濃縮し、得られた沈澱物を同じ条件で２度再結晶化させる（100 mg）（収率：55％）。
得られたＬ−（＋）−エルゴチオネインの総合収率は19.5％である。
物理特性
1) ｍ. ｐ. ：263 ℃(dec)
2) ¹ＨＮＭＲ（200MHz D₂O):
3.17ppm(s; mと重なった9H; 2H); 3.80 ppm (dd; J= 4.5-11.2Hz;1H); 6.70 ppm (s;1H)
3) ¹³ＣＮＭＲ（50MHz,D₂O):
173.11ppm (s); 158.82ppm (s); 126.68ppm(s); 118.11: ppm(d); 79.82ppm (d); 54.79ppm(q); 25.38 ppm(t)
4) ＵＶ（H₂O, c=36.7 μＭ) ：λ_max＝257 nm
5) α_D(c=1.0；H₂O)= + 115.6 °
これらの値はメルクインデックス (Merck Index, 第11版、1989) に記載の値と一致している。

実施例３
Ｌ-(＋)-エルゴチオネインの合成
Ａ) Ｌ-(＋)-2'- メルカプト−Ｎα，Ｎα−ジメチルヒスチジンメチルエステルの合成
Ｌ−（＋）−Ｎα，Ｎα−ジメチルヒスチジンメチルエステルのジクロロハイドレート（1.35ｇ； 5.0mmol）の20ml脱イオン水溶液に、重炭酸ナトリウム (Labosi；3.36ｇ；40mmol) の水溶液と、20mlのエチルエーテルとを添加する。室温でフェニルクロロチオノホルメート（1.80ml；13.0mmol）を１滴ずつ添加する。反応混合物をこの同じ温度で５時間攪拌する。水相を重力分離し、有機相を脱イオン水で洗浄（２×50ml）し、硫酸マグネシウムを用いて脱水後、蒸発して油状の物質を得る。この油状物質を30mlのメタノールにとり、この溶液をトリエチルアミン(Janssen；2.2ml；15.8mmol) を用いて室温で16時間処理する。減圧下で溶媒を留去する。残留物をシリカカラム上でクロマトグラフィーで精製（溶出液：酢酸エチル、次いで酢酸エチル／メタノール19／１）して目的物質を得る。これを実施例２のＡ段階と同じ方法で再結晶させる（収率：76％）。
物理化学的な分析結果は、実施例１のＡ段階で得られた同じ化合物の場合と同じである。
Ｂ、ＣおよびＤ段階は実施例２と全く同じ方法で行う。
この方法で得られるＬ−（＋）−エルゴチオネインの最終的な総合収率は35.5％である。

Claims (12)

1. 下記 (a)〜(d) 段階で構成されることを特徴とするエルゴチオネインの各種光学異性体、特に（Ｄ、Ｌ）および（Ｌ）型異性体の化学合成方法：
   (a) Ｎα，Ｎα−ジメチル化ヒスチジンエステルの塩、必要な場合には光学的に活性な塩を合成または用い、
   (b) この化合物を、塩基の存在下でアルキル、アルケニルまたはアリールハロゲノチオノホルメート、特にフェニルハロゲノチオノホルメートで処理し、
   (c) 得られた化合物の硫黄含有置換基を保護した後、保護された化合物をトリメチルアンモニウム型化合物へ変換し、
   (d) ケン化または酸加水分解して所望のエルゴチオネインを遊離させる。
2. 下記 (a)〜(e) 段階よりなることを特徴とするＤ，Ｌ−エルゴチオネインの化学合成方法：
   (a) Ｎα，Ｎα−ジメチル化ヒスチジンエステルの塩を合成または使用し、
   (b) この化合物を、塩基の存在下でアルキル、アルケニルまたはアリールハロゲノチオノホルメート、特にフェニルハロゲノチオノホルメートで処理し、
   (c) 得られた化合物の硫黄含有置換基を塩基、好ましくはトリエチルアミンの存在下で保護、好ましくはアシル化、特に好ましくはアルキルまたはフェニルハロゲノホルメートで保護し、
   (d) 保護された化合物をアルコール中でアルキル化剤、好ましくはハロゲン化メチルで処理し、
   (e) 水／アルコール混合物中で鹸化、好ましくはアミンで鹸化して所望のＤ，Ｌ−エルゴチオネインを遊離させる。
3. 下記 (a)〜(e) 段階よりなることを特徴とするＬ−（＋）−エルゴチオネインの化学合成方法：
   (a) Ｎα，Ｎα−ジメチル化ヒスチジンエステルの塩を合成または使用し、
   (b) この化合物を、塩基の存在下でアルキル、アルケニルまたはアリールハロゲノチオノホルメート、特にフェニルハロゲノチオノホルメートで処理し、
   (c) 得られた化合物の硫黄含有置換基を塩基、好ましくはトリエチルアミンの存在下で保護、好ましくはアシル化、特に好ましくはアルキルまたはフェニルハロゲノホルメートで保護し、
   (d) 保護された化合物をアルコール中でアルキル化剤、好ましくはハロゲン化メチルで処理し、
   (e) 酸加水分解、好ましくは強酸の溶液を用いて所望のＬ−（＋）−エルゴチオネインを遊離させる。
4. 酸加水分解をメルカプタンの存在下で行うＬ−（＋）−エルゴチオネインを得るための請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. メルカプタンをアルキルメルカプタンまたはアリールメルカプタンの中から選択し、好ましくはβ−メルカプトプロピオン酸とする請求項４に記載の方法。
6. ヒスチジンエステルがＣ₁〜Ｃ₆アルキルエステル、特にメチルエステルである請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 塩がハロゲン化物、特にジクロロハイドレートである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. アリールハロゲノチオノホルメートがフェニルクロロチオノホルメートである請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. ハロゲノチオノホルメートの処理で使用される塩基が重炭酸塩、特に重炭酸ナトリウム、アミンまたはアルキルアミン、特にジエチルアミンまたはトリエチルアミンの中から選択される請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 塩基を用いたハロゲノチオノホルメートの処理を極性溶媒中で好ましくは二段階で行い、第一段階は弱塩基、好ましくはｐＫａが約９以下の弱塩基、特に重炭酸塩を用い、好ましくはクロロチオノホルメートの溶解を助ける極性溶媒、例えばエチルエーテルの存在下で行い、第２段階は別の塩基、好ましくはｐＫａが約10以上の塩基を、好ましくは有機塩基、さらに好ましくはアミンまたはアルキルアミン型塩基、特にジエチルアミンまたはトリエチルアミンを用い、好ましくは極性溶媒、好ましくはエーテル、特にテトラヒドロフランの存在下で行う請求項９に記載の方法。
11. 鹸化をアミン、特にアルキルアミン、好ましくはトリエチルアミンを用いて水／アルコール混合物、特に水／メタノール中で行う請求項１、２、６〜10のいずれか一項に記載の方法。
12. アルキル化剤がハロゲン化メチル、特にヨウ化メチルのアルコール溶液、特にメタノール溶液である請求項１〜11のいずれか一項に記載の方法。