JP2006008704A - 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）の低量投与による敗血症の処置 - Google Patents

Abstract

【課題】 敗血症の致死的作用を阻害し、そして同時に、潜在的に重篤な副作用を最小限にする処置アプローチを提供すること。
【解決手段】 １つの局面において、本発明は、敗血症または敗血症ショックを予防的または治療的に処置するための方法を提供し、この方法は、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）またはＴＦＰＩアナログを、敗血症または他の炎症状態に苦しむ患者に投与する工程を包含する。この方法はまた、有害な副作用を避けるために、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの低用量での連続静脈内注入の使用を含む。
【選択図】 なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００１年１０月１５日に出願された仮出願番号６０／３２８，８０６に対する優先権を主張し、その全体が、本明細書中で参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、敗血症、敗血症性ショック、および急性または慢性炎症を予防的および治療的に処置し、一方では有害な副作用を最小限にするための方法である。より詳細には、敗血症および敗血症性ショックと関連する増幅または活性生理的経路を減衰させるために、これは、低量の組織因子経路インヒビタータンパク質を投与する工程を包含する。

敗血症およびその続発性敗血症性ショックは、手術後および危険な病気にある患者において最も恐れられる合併症である。疾病コントロールセンターは、米国における死亡の主要原因の第１３番目として（ＭＭＷＲ，１９８７，３９：３１およびＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，３７：７， １９８９）、そして高齢アメリカ人の間の死亡の主要原因の第１０番目として（ＭＭＷＲ，１９８７，３２：７７７を参照）敗血症を列する。これらの疾患の発生数は、増加し、そして死亡率は、高いままである。敗血症を有する患者の医療は、毎年数百万ドルのコストがかかることが見積もられる（ＭＭＷＲ，１９８７，３９：３１）。死亡は、２８％〜６０％の患者に生じ、そしてこのパーセンテージは、２０年以上の間いかなる評価可能な改善は見られてない。グラム陽性細菌感染およびグラム陰性細菌感染は、敗血症および敗血症性ショックに等しくつながるようである。

敗血症は、感染の観点では、細菌、真菌、寄生生物、ウイルス、およびそれらの産物（例えば、グラム陰性細菌の内毒素）を含む種々の微生物の蔓延から生じる有毒な状態である。敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）は、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）の形態であり、そしてより詳細には、感染の観点では、細菌性産物の血流への浸潤から生じる有毒な状態である。敗血症は、多くの経路（いくつかは、感染初期段階に関連し、そしていくつかは、細菌の内毒素の全身系への効果に関連する）でショックを生じ得る。例えば、敗血症において、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦのような）に加えて、細菌性産物が凝固システムを活性化しそして血小板凝集を開始する。このプロセスは、高度増殖全身性炎症および臨床症状（血圧急降下および最終には腎、心臓および肺不全）と関連する広くいきわたった血餅化または重度の出血につながる。

敗血症性ショックは、不適正組織灌流によって特徴づけられ、組織への不十分な酸素供給、低血圧症および尿量過少症につながる。細菌およびその産物（ＬＰＳのような）を含む微生物が直接免疫機構ならびに凝固、および補体系（一連のクロストーク機構によってお互いを次々と増幅する）を含む他の宿主防衛機制を直接活性化するので、敗血症性ショックが、生じる。これらの宿主防衛機制の重複増幅は、最終的に細胞傷害および多臓器不全を導く微小血管における変更血流を生じる。微生物は、しばしば古典的補体経路を活性化し、そして内毒素は、代替経路を活性する。補体活性、ロイコトリエン産出、および好中球に対する内毒素の直接的効果は、肺におけるこれらの炎症性細胞の蓄積、酵素の放出および毒性酸素ラジカル（肺動脈内皮を損傷しそして急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を開始する）の産生につながる。ＡＲＤＳは、敗血症性ショックを有する患者における死亡の主要原因であり、そして肺性うっ血、顆粒凝集、出血、および毛細管血栓によって特徴付けられる。

劇症播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）（過剰凝固または重度の出血によって特徴付けられる）は、敗血症患者の８０％に及んで生じることが見られ、そして全ての型の凝固異常は、より頻繁である（Ｌｅｖｉら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：６９５〜７０５頁，１９９９）。凝固は、最終的に多臓器不全（重度の敗血症患者における死亡の主要直接原因である）につながり得る。ＤＩＣは、小脈管において広く行き渡るフィブリン沈着によって特徴付けられる、微生物の侵入に応じて生じる凝固異常疾患である。ＤＩＣの開始原因は、トロンボプラスチン（組織因子）の血液循環への放出であることは明白である。このプロセスの間、フィブリノゲンおよび血小板の減少があり、そして血管におけるフィブリン沈着を生じさせるフィブリン分離産物の上昇がある。患者は、この疾患プロセスの間、凝固プロテアーゼインヒビターの消耗の程度に依存して、血栓症または出血のいずれかに苦しむ。ＤＩＣの共通合併症のいくつかは、重度の臨床出血、血栓症、組織虚血および壊死、溶血および臓器不全である。この凝固カスケードの調節の一部は、血流の速度に依存する。流れが減少される場合（ＤＩＣおよび敗血症においてそうであるように）、この問題は大きくなる。ＤＩＣ（臨床的に中度〜重度形態）は、敗血症性ショック患者およびいくつかの他の症候群（頭部の外傷およびやけど、産科の合併症、輸血反応、および癌のような）において高頻度で生じることが考えられる。

ＤＩＣは、種々の炎症性状態と関連する。敗血症患者において、ＤＩＣおよび急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、７日目までの死亡のうち、もっとも予測的な変数である（リスク比４および２．３）（Ｍａｒｔｉｎら，１９８９，Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｉｎ ｔｈｅ １９８０ｓ，要約番号３１７，ＩＣＡＡＣ会議，Ｄａｌｌａｓ）。敗血症事象のカスケード（内皮上での組織因子の発現または血液への組織因子の曝露および組織因子の血液循環への放出を含む）、非常に複雑である。種々のサイトカインが活性化単球、内皮細胞、および他のものから放出される。これらのサイトカインとしては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン １（ＩＬ−１）（組織因子発現をアップレギュレートすることが公知である）、インターロイキン ６（ＩＬ−６）、γインターフェロン（ＩＦＮγ）、インターロイキン ８（ＩＬ−８）、および他のものが挙げられる。敗血症患者の血漿中のＣ３ａおよびＣ５ａレベルの上昇によって立証されるように、補体カスケードもまた、活性化される。

組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ)は、哺乳動物血漿中に存在するセリンプロテアーゼインヒビターである。Ｔｈｏｍａｓ，Ｂｕｌｌ．Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｈｏｓｐ．８１，２６（１９４７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４９，１２３（１９４７）；Ｂｒｏｚｅ ａｎｄ Ｍｉｌｅｔｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，１８８６（１９８７）。ＴＦＰＩはまた、組織因子インヒビター、組織トロンボプラスチンインヒビター、第ＩＩＩ因子インヒビター、外因性経路インヒビター（ＥＰＩ）、およびリポタンパク質関連凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）として公知である。「組織因子経路インヒビター」（ＴＦＰＩ）との名称は、１９９１年６月３０日に、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓによって採択された。

血液凝固活性は、流体血液の固体ゲルまたは凝血塊への転換である。加えて、凝固プロテアーゼの消費は、過剰な出血につながる。フィブリン自体は、全凝血塊の０．１５％を形成するに過ぎないが、主要な事象は、溶解性フィブリノーゲンの不溶性フィブリン鎖への転換である。この転換は、複雑な酵素カスケードにおける最終段階である。この成分（因子）は、チモーゲン（タンパク質分解酵素の不活性前駆体）として存在し、これらは、特定の部位でのタンパク質分解切断によって活性酵素に転換される。少量の１つの因子の活性化は、次の因子のより多量の形成などを触媒し、極度に迅速なフィブリンの形成を生じる増幅を生じる。

凝固は、第ＶＩＩａ因子を組織因子（ＴＦ）に曝す脈管損傷によって開始されると考えられ、これは、内皮の下の細胞上で発現される。第ＶＩＩａ因子−ＴＦ複合体は、第Ｘ因子を第Ｘａ因子へと切断し、そして第ＩＸ因子を第ＩＸａ因子へと切断する。ＴＦＰＩは、第ＶＩＩａ因子および第Ｘａ因子の両方に結合する。ＴＦＰＩ、第ＶＩＩａ因子（ＴＦと結合している）と第Ｘａ因子との間に形成された複合体は、維持された止血に必要な第Ｘａ因子および第ＩＸａ因子の形成をさらに阻害する。Ｂｒｏｚｅ，Ｊｒ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４６：１０３（１９９５）。

血流に直接導入された、細菌内毒素による凝固カスケードの活性化は、動脈表面への過度のフィブリン沈積、ならびに、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子、ならびに血小板の枯渇を生じ得る。さらに、フィブリン溶解系が刺激され、フィブリン分解産物のさらなる形成が生じる。

凝固活性化が、細菌産物（例えば、エンドトキシン）によって明らかに開始されると同時に、反対の機構はまた、凝血、すなわち、フィブリン溶解系の活性化によって活性化されるようである。活性化された第ＸＩＩＩ因子は、プラスミノーゲンプロアクチベーターをプラスミノーゲンアクチベーターに転換し、これは次にプラスミノーゲンをプラスミンに転換して、それによって、凝血塊溶解を媒介する。それゆえに、血漿フィブリン溶解系の活性化はまた、出血傾向の一因となる。

内毒血症は、組織プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ）の循環レベルの増加に関連する。このインヒビターは、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）を迅速に不活化し、それによって、プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化を介するフィブリン溶解を促進する能力を妨げる。フィブリン溶解を損なうことにより、血管中へのフィブリン沈積を引き起こし得、従って、敗血症ショックに関連するＤＩＣの一因となる。

敗血症および関連凝固障害の予防または処置のための満足のいく介入を同定するための努力が続いている。凝固経路を妨害する薬剤は、敗血症性ショックの治療的処置または予防的処置としては、必ずしも効果的ではない。例えば、ヘパリンは、一般的に使用されている抗凝固剤である。しかし、ヘパリンの使用の管理は、困難である。なぜなら、ヘパリンは、過度の出血を誘発し得るか、または凝固異常を減衰させ得るが、生存利益は提供し得ない。Ａｏｋｉら、「Ａ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｄｏｕｂｌｅ−ＢＬＩＮＤ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｔｒｉａｌ ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ａｎｄ Ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ Ｈｅｐａｒｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７５、５４０〜４７（２００２）を参照のこと。幾つかの臨床試験では、主に劇症ＤＩＣが顕著な特徴である髄膜炎菌内毒血症において、ヘパリン処置による敗血症における死亡率の減少の実証は失敗に終わっている。例えば、Ｃｏｒｒｉｇａｎら、「Ｈｅｐａｒｉｎ Ｔｈｒａｐｙ ｉｎ Ｓｅｐｔａｃｅｍｉａ ｗｉｔｈ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｎｄ ｏｎ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ Ｄｅｆｅｃｔｓ」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８３：７７８〜７８２（１９７０）；Ｌａｓｃｈら、「Ｈｅｐａｒｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ（ＤＩＣ）」、Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｄｉａｔｈｅｓ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．、３３：１０５（１９７４）；Ｓｔｒａｕｂ、「Ａ Ｃａｓｅ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｄｉａｔｈｅｓ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．、３３：１０７（１９７４）を参照のこと。

凝固カスケード活性を減衰させ、そして炎症性応答を改善し、そして内毒素と結合する公知の能力に起因して、ＴＦＰＩは敗血症を処置するために有用な薬剤として提案される。組換えヒトａｌａ−ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩアナログ）の投与は、敗血症の動物モデルにおいて生存率の改善を示してきた。例えば、米国特許第６，０６３，７６４号を参照のこと。内因性タンパク質として、ＴＦＰＩは、十分に許容される。静脈内注入または皮下注射によるＴＦＰＩ投与は、凝血能を低下させることが示されており、これは、増加したプロトロンビン時間（ＰＴ）として表わされる。動物およびヒトの研究において、ＰＴの延長は、血漿ＴＦＰＩの増加に対して線形的に関連する。Ａ．Ａ．Ｃｒｅａｓｅｙ、Ｓｅｐｓｉｓ ３：１７３（１９９９）。

敗血症の致死的作用を阻害し、そして同時に、潜在的に重篤な副作用を最小限にする処置アプローチの必要性が、当該分野において存在したままである。

上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
項目１．敗血症を処置する方法であって：
敗血症を有するか、または敗血症になる危険性のある患者にＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを、少なくとも約７２時間の投与期間、約０．０００２５〜約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の投与速度で連続静脈内注入によって投与する工程、
を包含する方法。
項目２．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目１に記載される方法。
項目３．上記ＴＦＰＩアナログが、配列番号１のアミノ酸１９〜８９からなる第１のＫｕｎｉｔｚドメインを含む、項目１に記載される方法。
項目４．上記ＴＦＰＩアナログが、さらに配列番号１のアミノ酸９０〜１６０からなる第２のＫｕｎｉｔｚドメインを含む、項目３に記載される方法。
項目５．上記ＴＦＰＩアナログが、配列番号１のアミノ酸１〜１６０を含む、項目１に記載される方法。
項目６．上記ＴＦＰＩアナログが、配列番号１のアミノ酸９０〜１６０からなる第２のＫｕｎｉｔｚドメインを含む、項目１に記載される方法。
項目７．上記投与速度が、約０．０１０〜約０．０４５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩ投与と同等である、項目１に記載される方法。
項目８．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目７に記載される方法。
項目９．上記投与速度が、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩ投与と同等である、項目７に記載される方法。
項目１０．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目９に記載される方法。
項目１１．上記投与期間が、少なくとも約９６時間である、項目１に記載される方法。
項目１２．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目１１に記載される方法。
項目１３．上記投与速度が、約０．０２４〜約４．８ｍｇ／ｋｇの合計用量での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の合計用量を提供するように投与される、項目１１に記載される方法。
項目１４．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目１３に記載される方法。
項目１５．上記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の投与速度で投与される、項目１１に記載される方法。
項目１６．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目１５に記載される方法。
項目１７．上記投与速度が、約０．００６ｍｇ／ｋｇ〜約１．２ｍｇ／ｋｇの１日の用量での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の１日の用量を提供するように投与される、項目１に記載される方法。
項目１８．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目１７に記載される方法。
項目１９．上記ＴＦＰＩまたは上記ＴＦＰＩアナログが、少なくとも約１．２時間のベースライン国際標準比（ＩＮＲ）を有する患者に投与される、項目１に記載される方法。
項目２０．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目１９に記載される方法。
項目２１．上記患者が、ベースラインＩＮＲを少なくとも２０％超えるか、または少なくとも約２．５の値を有するかのいずれかのＩＮＲを有する場合、上記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを投与する工程を終了させる工程をさらに包含する、項目１に記載される方法。
項目２２．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目２１に記載される方法。
項目２３．上記患者が、少なくとも２０のＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアを有する、項目１に記載される方法。
項目２４．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目２３に記載される方法。
項目２５．上記患者が、少なくとも約１０００ｐｇ／ｍｌのベースライン血漿ＩＬ−６濃度を有する、項目１に記載される方法。
項目２６．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目２５に記載される方法。
項目２７．上記患者が、ショックに苦しむ、項目１に記載される方法。
項目２８．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目２７に記載される方法。
項目２９．上記患者が、ＡＲＤＳに苦しむ、項目１に記載される方法。
項目３０．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目２９に記載される方法。
項目３１．上記患者が、上記投薬期間の間に増加する肺スコア、ＩＣＵスコア、または多臓器不全スコアを有する、項目１に記載される方法。
項目３２．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目３１に記載される方法。
項目３３．上記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む凍結乾燥した組成物から調製される、項目１に記載される方法。
項目３４．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目３３に記載される方法。
項目３５．上記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、アルギニンを含む処方物として投与される、項目１に記載される方法。
項目３６．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目３５に記載される方法。
項目３７．上記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、シトレートを含む処方物として投与される、項目１に記載される方法。
項目３８．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目３７に記載される方法。
項目３９．上記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、約３００ｍＭのアルギニン塩酸塩および約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、かつｐＨが約５．５を有する処方物中で、約０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する、項目１に記載される方法。
項目４０．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目３９に記載される方法。
項目４１．上記投与期間の間または２４時間以内で、抗生物質、抗体、エンドトキシンアンタゴニスト、抗凝固活性を有する組織因子アナログ、免疫賦活剤、細胞接着ブロッカー、ヘパリン、ＢＰＩタンパク質、ＩＬ−１アンタゴニスト、ｐａｆａｓｅ（ＰＡＦ酵素インヒビター、ＴＮＦインヒビター、ＩＬ−６インヒビター、および補体のインヒビターからなる群から選択されるさらなる薬剤を投与する工程をさらに包含する、項目１に記載される方法。
項目４２．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目４１に記載される方法。
項目４３．上記さらなる薬剤が抗体であり、この抗体が、ＴＮＦ、ＩＬ−６、およびＭ−ＣＳＦからなる群から選択される抗原に特異的に結合する、項目４１に記載される方法。
項目４４．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目４３に記載される方法。
項目４５．敗血症の危険性および重症度を減少させるための予防方法であって、この方法が敗血症に感受性であるか、または敗血症であると推測される患者にＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを、少なくとも約７２時間の投与期間で、約０．０００２５〜約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の投与速度で連続静脈内注入することによって投与する工程を包含する、方法。
項目４６．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目４５に記載される方法。
項目４７．上記ＴＦＰＩアナログが、配列番号１のアミノ酸１９〜８９からなる第１のＫｕｎｉｔｚドメインを含む、項目４５に記載される方法。
項目４８．上記ＴＦＰＩアナログが、さらに配列番号１のアミノ酸９０〜１６０からなる第２のＫｕｎｉｔｚドメインを含む、項目４７に記載される方法。
項目４９．上記ＴＦＰＩアナログが、配列番号１のアミノ酸１〜１６０を含む、項目４５に記載される方法。
項目４９．上記ＴＦＰＩアナログが、配列番号１のアミノ酸９０〜１６０からなる第２のＫｕｎｉｔｚドメインを含む、項目４５に記載される方法。
項目５０．上記投与速度が、約０．０１０〜約０．０４５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等である、項目４５に記載される方法。
項目５１．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目５０に記載される方法。
項目５２．上記投与速度が、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等である、項目５０に記載される方法。
項目５３．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目５２に記載される方法。
項目５４．上記投与期間が、少なくとも約９６時間である、項目４５に記載される方法。
項目５５．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目５４に記載される方法。
項目５６．上記投与速度が、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等である、項目５４に記載される方法。
項目５７．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目５６に記載される方法。
項目５８．敗血症および敗血症性ショックを含む急性炎症を予防的および治療的に処置するための方法であって、この方法が、患者に（ｉ）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの、約０．０００２５〜約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の投与速度で連続静脈内注入物ならびに（ｉｉ）抗生物質、モノクローナル抗体、サイトカインインヒビター、および補体インヒビターからなる群から選択されるさらなる薬剤を投与する工程を包含する、方法。
項目５９．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目５８に記載される方法。
項目６０．ＤＩＣと関連せず、ＴＮＦ、ＩＬ−１、または別のサイトカインが組織因子をアップレギュレートする疾患状態を処置するための方法であって、この方法が少なくとも約７２時間の投与期間で、患者にＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログからなる群から選択される薬剤の、約０．０００２５〜約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の投与速度で連続静脈内注入物を投与する工程を包含する、方法。
項目６１．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目６０に記載される方法。
項目６２．上記疾患状態が、慢性炎症または急性炎症である、項目６０に記載される方法。
項目６３．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目６２に記載される方法。
項目６４．上記患者が、上記投与期間の間に減少するＩＬ−６の血漿濃度を有する、項目６０に記載される方法。
項目６５．上記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである、項目６４に記載される方法。

（発明の要旨）
本発明の１つの実施形態は、敗血症処置方法（敗血症に罹患するか、またはその発症の危険性のある患者にＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを、少なくとも約７２時間の投与期間で、約０．０００２５〜約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の投与速度で連続静脈内注入することによって投与する工程を包含する）である。

本発明の別の実施形態は、敗血症の危険性および重症度を減少させるための予防方法（敗血症に感受性であるか、または敗血症であると推測される患者にＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを、少なくとも約７２時間の投与期間で、約０．０００２５〜約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の投与速度での連続静脈内注入することによって投与する工程を包含する）である。

本発明の別の実施形態は、敗血症および敗血症性ショックを含む急性炎症を予防的および治療的に処置するための方法（患者に（ｉ）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの、約０．０００２５〜約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の投与速度での連続静脈内注入ならびに（ｉｉ）抗生物質、モノクローナル抗体、サイトカインインヒビター、および補体インヒビターからなる群から選択されるさらなる薬剤を投与する工程を包含する）である。

本発明の別の実施形態は、ＤＩＣと関連せずおよびＴＮＦ、ＩＬ−１、または別のサイトカインが組織因子発現をアップレギュレートする疾患状態を処置するための方法であり、患者にＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログからなる群から選択される薬剤を、少なくとも約７２時間の投与期間で、約０．０００２５〜約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の投与速度で連続静脈内注入投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、疾患状態は、慢性または急性炎症である。別の好ましい実施形態では、前記患者は、前記投与期間に減少する血漿ＩＬ−６濃度を有する。

他の実施形態は、前記ＴＦＰＩアナログが、非グリコシル型ａｌａ−ＴＦＰＩである、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記ＴＦＰＩアナログが、配列番号１のアミノ酸１９〜８９からなる第１のＫｕｎｉｔｚドメインを含む、任意の上記実施形態を含む。好ましい実施形態では、前記ＴＦＰＩアナログは、さらに配列番号１のアミノ酸９０〜１６０からなる第２のＫｕｎｉｔｚドメインを含む。

他の実施形態は、前記ＴＦＰＩアナログが、配列番号１のアミノ酸１〜１６０を含むか、または前記ＴＦＰＩアナログが、配列番号１のアミノ酸９０〜１６０からなる第２のＫｕｎｉｔｚドメインを含む、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記投与速度が、約０．０１０〜約０．０４５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩ投与と同等である、任意の上記実施形態を含む。好ましい実施形態において、前記投与速度は、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩ投与と同等である。

他の実施形態は、前記投与期間が、少なくとも約９６時間である、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記投与速度が、約０．０２４〜約４．８ｍｇ／ｋｇの合計用量での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の合計用量を提供するように投与される、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記投与速度が、少なくとも約０．００６ｍｇ／ｋｇかつ約１．２ｍｇ／ｋｇ未満の１日の用量での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の１日の用量を提供するように投与される、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記ＴＦＰＩまたは前記ＴＦＰＩアナログが、少なくとも約１．２のベースライン国際標準比（ＩＮＲ）を有する患者に投与される、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、任意の上記実施形態を含み、さらに前記患者が、ベースラインＩＮＲを少なくとも２０％超えるか、または少なくとも約２．５の値を有するかのいずれかのＩＮＲを有する場合、前記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを投与する工程を終了させる工程を包含する。

他の実施形態は、前記患者が、少なくとも２０のＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアを有する、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記患者が、少なくとも約１０００ｐｇ／ｍｌのベースライン血漿ＩＬ−６濃度を有する、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記患者がショックに苦しむ、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記患者がＡＲＤＳに苦しむ、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記患者が、前記投薬期間の間に増加する肺スコア、ＩＣＵスコア、また多臓器不全を有する、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ含む凍結乾燥した組成物から調製される、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、アルギニンを含む処方物として投与される、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、シトレートを含む処方物として投与される、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、前記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、約３００ｍＭのアルギニン塩酸塩および約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、かつｐＨが約５．５を有する処方物中で、約０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する、任意の上記実施形態を含む。

他の実施形態は、任意の上記実施形態を含み、前記投与期間の間または２４時間の以内で、抗生物質、抗体、エンドトキシンアンタゴニスト、抗凝固活性を有する組織因子アナログ、免疫賦活剤、細胞接着ブロッカー、ヘパリン、ＢＰＩタンパク質、ＩＬ−１アンタゴニスト、ｐａｆａｓｅ（ＰＡＦ酵素インヒビター）、ＴＮＦインヒビター、ＩＬ−６インヒビター、および補体のインヒビターからなる群から選択されるさらなる薬剤を投与する工程をさらに包含する。好ましい実施形態において、上記さらなる薬剤は、抗体であり、この抗体は、ＴＮＦ、ＩＬ−６、およびＭ−ＣＳＦからなる群から選択される抗原に特異的に結合する。

本発明のさらなる実施形態は、詳細な説明と共に以下に参照される図面を考慮して明らかである。

（発明の詳細な説明）
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの連続低投薬量投与は（本明細書中で以後「低用量ＴＦＰＩ投与」と称される）は、敗血症の予防および処置において効果的であり、より高用量で処置された患者の何人かにおいて見られる潜在的に有害な合併症を有意に最小限にする。概して、低用量ＴＦＰＩ投与は、少なくとも約０．０００２５ｍｇ／ｋｇ／時間かつ約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間未満の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の投与速度でのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの連続静脈注入によって実行される。

低用量ＴＦＰＩ投与は、急性炎症または慢性炎症（敗血症または敗血症性ショックを含む）を阻害するかまたは減衰させる。低用量ＴＦＰＩ投与が、少なくとも３日間継続される場合、敗血症による死亡の危険性は減少し、一方で有害な副作用、特に出血性障害に由来する合併症の割合が、ＴＦＰＩのより高用量での投与に比較して最小限になる。

低用量ＴＦＰＩ投与のさらなる利点は、十分高い用量で、ＴＦＰＩの血漿濃度を減少させ得る、耐性効果を回避することである。耐性効果は、約８５０ｎｇ／ｍｌの血漿ＴＦＰＩ濃度で最大の半分で刺激される一方、低用量ＴＦＰＩ投与を用いると、血漿レベルは、一般的に５００ｎｇ／ｍｌ未満にとどまる。

本発明は、敗血症のような炎症性障害の処置におけるＴＦＰＩの効果とＴＦＰＩアナログの効果との間の最適バランスおよび有害な副作用（より高用量または投与に関する代替的ストラテジーから生じ得る）の回避を達成する。低用量ＴＦＰＩ投与はまた、敗血症に関する凝固障害（例えば、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、および多臓器不全）の予防および処置において効果的である。

ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、少なくとも約０．０００２５ｍｇ／ｋｇ／時間（０．００４１７μｇ／ｋｇ／分）かつ約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間（０．８３３μｇ／ｋｇ／分）未満での投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の投与速度で投薬される場合、敗血症および他の炎症状態の処置におけるその効力は維持され、そして出血のような有害な副作用は、最小限にされる。最適に組み合わせられた効力および安全性のために、投与速度は、好ましくは、少なくとも約０．０１０ｍｇ／ｋｇ／時間（０．１６７μｇ／ｋｇ／分）かつ約０．０４５ｍｇ／ｋｇ／時間（０．８３３μｇ／ｋｇ／分）未満での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与速度と同等、または少なくとも約０．０２０ｍｇ／ｋｇ／時間および約０．０４０ｍｇ／ｋｇ／時間未満での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与速度と同等であり、そして最も好ましくは、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間（０．４１７μｇ／ｋｇ／分）の参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与速度と同等である。投与経路は、概して、静脈内投与であり、連続静脈内注入が好ましい。注入は、少なくとも約７２時間、９６時間、１２０時間、または２４０時間にわたって投与され得る。好ましくは、連続注入は、３〜８日間、より好ましくは３〜６日間、そして最も好ましくは約４日間にわたって投与され得る。連続注入による投与とは、この注入が、処方された持続期間のほとんどの間実質的な中断なしに、ほぼ処方された速度で維持されることを意味する。あるいは、間欠性静脈内注入も使用され得る。間欠性注入が使用される場合、時間で平均化された投与速度（上述される連続注入のための投与速度と同等である）が、使用されるべきである。さらに、間欠性注入のプログラムは、注入を使用することで得られる最大濃度を約２０％以下上回る最大血漿濃度を生じなければならない。患者内での有害な反応、特に出血を含む副作用の回避のために、この投与速度は、約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの連続静脈内注入と同等な投与速度未満であるべきである。

本明細書中に記載される全ての用量（投与速度および総用量を含む）は、実際には、プロトロンビンアッセイ（以下を参照のこと）でのタンパク質濃度および生物学的活性のような量の決定における不可避の不正確さに起因して、１０％までの変動を生じる。つまり、本明細書中で提示される用量より１０％まで高いかまたは１０％まで低い、任意の実際に投与される用量は、ほぼ提示された用量であるとみなされる。この理由のために、全ての用量は、「約」特定用量として提示されている。例えば、「約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間」と記述される用量は、０．０２２５〜０．０２７５ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲にわたる任意の実際の用量と同等であるとみなされる。

ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログのボーラス注射または短時間のより高い注入速度はまた、後に低用量のＴＦＰＩ投与が続く場合に、本発明の実施において使用され得る。例えば、ボーラス注射またはより高い注入速度は、患者の循環における投与されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの平衡時間を減少させるために使用され得る。その際に、ＴＦＰＩの最終定常状態の血漿中レベルは、より迅速に達成され得、そしてＴＦＰＩに対するレセプターはより速く飽和され得る。参照ａｌａ−ＴＦＰＩの約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間で２時間にわたるヒトへの投与は、ＴＦＰＩ（およびａｌａ−ＴＦＰＩ）の血漿中レベルを約８０ｎｇ／ｍｌから約１２５ｎｇ／ｍｌに増加させるか、または約５０％増加させる。注入速度が高められるかまたはボーラス注射が使用される場合、同じレベルはより速く達成される。注入が定常状態を得られるまで続けられる場合、より高い注入速度は、より高いレベルを生じる。敗血症に罹患した患者において、約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間での参照ａｌａ−ＴＦＰＩ投与に対する定常状態レベルは、約３００ｎｇ／ｍｌであり、そして約０．３３ｍｇ／ｋｇ／時間または０．６６ｍｇ／ｋｇ／時間での参照ａｌａ−ＴＦＰＩ投与に対しては、少なくとも約２μｇ／ｍｌである。

単回連続注入または分割注入用量で宿主に投与される１日の合計用量は、例えば、少なくとも約０．００６ｍｇ／ｋｇ／日〜約１．２ｍｇ／ｋｇ／日未満の参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の量であり得、より通常は、約０．２４ｍｇ／ｋｇ／日〜約１．２ｍｇ／ｋｇ／日未満の参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の量であり得、そして好ましくは約０．６ｍｇ／ｋｇ／日の参照ａｌａ−ＴＦＰＩと同等の量であり得る。この範囲内でのより低い量は、予防または他の目的のために有用であり得る。本発明の投与プロトコルはまた、患者に投与される合計用量としても表され得る。合計用量は、注入速度と総注入時間との数学的積である。例えば、参照ａｌａ−ＴＦＰＩについての好ましい投与速度（約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間）および好ましい注入時間（９６時間）において、合計用量は、体重１ｋｇあたり約２．４ｍｇの参照ａｌａ−ＴＦＰＩである。本発明に従って投与されるＴＦＰＩの合計用量は、少なくとも約０．７５μｇ／ｋｇかつ約４．８ｍｇ／ｋｇ未満の参照ａｌａ−ＴＦＰＩと同等である。好ましくは、合計用量は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇかつ約４．８ｍｇ／ｋｇ未満の参照ａｌａ−ＴＦＰＩと同等である。より好ましくは、合計用量は、約２．４ｍｇ／ｋｇの参照ａｌａ−ＴＦＰＩと同等である。

投薬レジメンを調整するために使用され得る１つの因子は、個々の患者の凝固機能であり、これは、代表的にはプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイ、すなわち国際標準比（ＩＮＲ）を用いて測定される。ＩＮＲは、ＰＴアッセイの標準化であり、ここで、このアッセイは国際参照トロンビン試薬に対して較正される。例えば、Ｒ．Ｓ．Ｒｉｌｅｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１４：１０１〜１１４（２０００）を参照のこと。健康なヒトボランティアにおけるａｌａ−ＴＦＰＩに対するＩＮＲ応答は、認められる血漿中濃度の範囲にわたってほぼ直線である（図３）。ＩＮＲにおける全体な変化は、血漿ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度の１μｇ／ｍｌの増加あたり１．２単位であった。健康なボランティアおよび敗血症患者被験体からの組み合わせられたデータを基にした薬力学的モデルにおいて、ａｌａ−ＴＦＰＩに対するＩＮＲ応答は、対数ＩＮＲがａｌａ−ＴＦＰＩの血漿中濃度に対して線形な、対数線形モデルによって最も説明された。この応答の対数線形特性は、ＩＮＲの高いベースライン（敗血症被験体に共通して見られる）を有する被験体が、おそらく、低ベースライン値を有する被験体（同レベルの循環ａｌａ−ＴＦＰＩを有する）よりもより高い抗凝固応答に直面することを意味する。さらに、濃度応答曲線の傾きは、健康なボランティアにおいてよりも敗血症患者被験体においてより高いようであり、重度な敗血症を有する被験体が、ａｌａ−ＴＦＰＩに対する増強した感受性を有し得ることを示唆する。この研究において、患者集団におけるａｌａ−ＴＦＰＩ投与速度は、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間での参照ａｌａ−ＴＦＰＩと同等な用量から、約０．６６ｍｇ／ｋｇ／時間での参照ａｌａ−ＴＦＰＩと同等な用量の範囲であった。約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間または約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間での参照ａｌａ−ＴＦＰＩと同等の投与速度を使用した敗血症患者でのａｌａ−ＴＦＰＩのフェーズＩＩ研究からのデータは、患者（そのベースラインＩＮＲは、少なくとも１．２であった）においてａｌａ−ＴＦＰＩによる死亡率のより大きな減少を示した（以下の表１１を参照のこと）。従って、本発明のいくつかの実施形態において、低用量ＴＦＰＩ投与は、低用量ＴＦＰＩ投与前のベースラインＩＮＲが、少なくとも１．２、１．２５、１．３、１．４、１．５、１．６、１．８、または２．０である患者に対してのみ実行される。他の実施形態において、低用量ＴＦＰＩ投与は、ＴＦＰＩ投与の投与速度を低下させることによって減少されるか、または患者のＩＮＲが少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、もしくは３０％、またはそれ以上ベースラインを超えて増大する場合、あるいは患者のＩＮＲが少なくとも約２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、３．０、もしくは３．５のような危険なまでに高い値に到達する場合、完全に終えられる。

上述の投与レジメン（ｍｇ／ｋｇ／時間基準での投与速度および１日の合計用量を含む）は、「参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等である」用量として表される。このことは、この投与レジメンが「参照ａｌａ−ＴＦＰＩ」（成熟した、１００％純粋な（タンパク質を基準）、適切に折り畳まれ、生物学的に活性な、非グリコシル化型ａｌａ−ＴＮＰＩとして規定される）の用量に対して正規化することによって定量的に決定されることを意味する。ａｌａ−ＴＦＰＩは、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＴＦＰＩのアナログである。ＴＦＰＩの他の形態もまた、本発明において使用され得、これらとしては、成熟した、完全長のＴＦＰＩおよびそのアナログが挙げられる（以下を参照のこと）。ａｌａ−ＴＦＰＩ以外のＴＦＰＩの形態および１００％未満純粋なａｌａ−ＴＦＰＩもしくは別のＴＦＰＩアナログの調製物を用いて本発明を実施するために適切な投与量範囲を決定するために、参照ａｌａ−ＴＦＰＩについて本明細書中に記載される投与量範囲は、ＴＦＰＩの特定形態の内因的な生物学的活性に基づいて調整され得、そしてさらに調製物の生物学的純度に基づいて調整され得る。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの内因的な生物学的活性は、成熟した、１００％の純度の、適切に折り畳まれたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログのプロトロンビンアッセイによって規定されるような比活性をいう。従って、同等な用量は、（参照ａｌａ−ＴＦＰＩ用量）／（（相対的な内因性活性）×（生化学的純度））として算出され、相対的な内因性活性とは、（アナログの内因性活性）／（参照ａｌａ−ＴＦＰＩの内因性活性）をいう。例えば、特定のＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの内因性生物学的活性の８０％の内因性生物学的活性を有する場合、特定のＴＦＰＩアナログについて同等な用量は、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの用量値を０．８で除算することによって得られる。さらに、患者に投与される処方物が、例えば、９０％だけ生物学的に純粋である（すなわち、１０％の、ＴＦＰＩの生物学的活性を欠く分子種を含む）場合、ａｌａ−ＴＦＰＩについての参照用量値のさらなる補正は、この用量値を０．９で除算することによって実施される。従って、８０％のａｌａ−ＴＦＰＩの内因性活性を有しかつ９０％の生物学的純度を有する仮想上のＴＦＰＩアナログが投与された場合、０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等な投与速度は、０．０３４７ｍｇ／ｋｇ／時間（すなわち、０．０２５／（０．８×０．９））である。

特定の調製物と同等な用量はまた、相対的な生物学的活性を決定することによって、内因性活性もしくは生物学的純度のいずれも知ることなしに決定され得る。相対的生物学的活性は、プロトロンビン時間アッセイを用いて、ＴＦＰＩ生物学的活性標準とＴＦＰＩアナログの特定の調製物とを比較することによって決定され得る。例えば、ＷＯ ９６／４０７８４の実施例９の方法に従って生成されたａｌａ−ＴＦＰＩ（約８５〜９０％生物学的に活性なａｌａ−ＴＦＰＩ分子種を含む）は、ＴＦＰＩ生物学的活性標準として使用され得る。ＷＯ ９６／４０７８４の実施例９の方法に従って生成されたａｌａ−ＴＦＰＩは、プロトロンビンアッセイにおいて、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの約８５〜９０％の活性を有する。プロトロンビン時間標準曲線をプロットする際、凝固時間の対数はＴＦＰＩ濃度の対数に対してプロットされる。ＴＦＰＩ生物学的活性標準が参照ａｌａ−ＴＦＰＩの活性の８５〜９０％を有する場合、ＴＦＰＩ生物学的活性標準の濃度にプロットする前に０．８５を乗じる場合の参照ａｌａ−ＴＦＰＩについての標準曲線と同等な標準曲線が調製され得、その結果、プロットされた活性は１００％純粋な参照ａｌａ−ＴＦＰＩの活性と同等になる。特定のＴＦＰＩアナログ調製物についての凝固時間が標準曲線と比較される場合、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの同等な濃度は、この曲線から読み取られ得る。あるいは、標準曲線の直線部分の傾きが直線回帰分析によって得られる場合、この傾きは参照ａｌａ−ＴＦＰＩに対するＴＦＰＩ生物学的活性標準の活性に基づいて補正され得る。従って、特定のＴＦＰＩアナログ調製物の相対的生物学的活性は、アナログ調製物の活性に対する参照ａｌａ−ＴＦＰＩ活性の割合に等しい。例えば、特定のアナログが、１．００μｇの参照ａｌａ−ＴＦＰＩと同じプロトロンビン時間活性を生じるために１．４３μｇを必要とする場合、このアナログ調製物の相対的な生物学的活性は、１．００／１．４３、すなわち０．７である。このアナログ調製物について、参照ａｌａ−ＴＦＰＩ用量と同等な用量は、参照ａｌａ−ＴＦＰＩ用量をアナログ調製物の相対的な生物学的活性で除することによって得られる。例えば、参照ａｌａ−ＴＦＰＩについての０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間用量は、アナログの調製物の０．０３５７ｍｇ／ｋｇ／時間（すなわち、０．０２５／０．７）と同等である。

ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの生物学的活性は、プロトロンビンアッセイによって決定され得る。適切なプロトロンビンアッセイは、米国特許第５，８８８，９６８号およびＷＯ９６／４０７８４に記載される。簡単には、プロトロンビン時間は、凝固測定器（ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）（例えば、Ｃｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅ ＭＴＸ ＩＩ、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）を使用することで決定され得る。適切なアッセイ緩衝液は、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス（ｐＨ７．５に調節された）であり、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む。必要とされるさらなる試薬は、正常ヒト血漿（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａによる「Ｖｅｒｉｆｙ １」）、トロンボプラスチン試薬（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａによる「Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ Ｅｘｃｅｌ」）、およびＴＦＰＩ標準溶液（例えば、アッセイ緩衝液１ｍｌあたり２０μｇの１００％純粋な（またはそれと同等な）ａｌａ−ＴＦＰＩ）である。標準曲線は、ＴＦＰＩ標準溶液の一連の希釈物（例えば、１〜５μｇ／ｍｌの範囲にある最終濃度まで）の凝固時間を分析することによって得られる。凝血時間の決定のために、このサンプル、またはＴＦＰＩ標準は、第一にアッセイ緩衝液で希釈される。次いで、正常ヒト血漿が添加される。凝血反応は、トロンボプラスチン試薬の添加によって開始される。次いで、機器が凝血時間を記録する。直線のＴＦＰＩ標準曲線は、凝血時間の対数 対 ＴＦＰＩ濃度の対数のプロットから得られる。この標準曲線は、１００％純粋な標準物と同等なＴＦＰＩ濃度と対応するように、ＴＦＰＩ標準の純度を基にして調整される。例えば、この標準物が、生化学的に９７％純粋なａｌａ−ＴＦＰＩ調製物である（すなわち、ＴＦＰＩの生物学的活性を有さない分子種を３重量％含む）場合、この標準物の各希釈物の濃度は、ＴＦＰＩの実際の濃度を与えるために０．９７を乗じられる。従って、９７％純粋な調製物１ｍｌあたりの実際の重量に基づいて１．０μｇ／ｍｌであるＴＦＰＩ標準は、１．０×０．９７の濃度、すなわち０．９７μｇ／ｍｌと同等であり、そしてこの濃度として扱われる。

本明細書中で利用される場合、用語「敗血症」は、感染の中心からの細菌性内毒素の蔓延、および微生物またはそれらの産物の蔓延から生じる毒性状態を意味する。

本明細書中で利用される場合、用語「敗血症関連凝固障害」は、細菌性内毒素または微生物およびそれらの産物による凝固系活性化から生じるか、またはそれと関連する障害を意味する。このような敗血症関連凝固障害の例は、播種性血管内凝固症候群である。

概して、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、組織因子のアップレギュレーションに起因して生じる疾患について有用であり得、そしてこれゆえに、ＴＦ活性が、ＴＮＦ、ＩＬ−１、または他のサイトカインによって引き起こされ得る。低用量ＴＦＰＩ投与は、患者のＩＬ−６濃度または他のサイトカイン濃度を低下させ得る。低用量ＴＦＰＩ投与は、炎症（概して急性炎症および慢性炎症の両方を含む）を処置するために有用である。低用量ＴＦＰＩによって処置され得る代表的な炎症状態としては、以下が挙げられる：関節炎、敗血症性ショック、再灌流障害、炎症性腸疾患、急性呼吸性疾患（急性呼吸窮迫症候群すなわちＡＲＤＳを含む）、外傷、およびやけど。慢性または急性の炎症の処置において、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、抗敗血症方法における場合と同じ様式および同じ用量で投与され得る。

ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログはまた、細菌性内毒素または微生物およびその産物が循環中に存在することから生じる状態を処置するために使用され得る。そのような状態としては、菌血、腹膜炎、敗血症性ショックから生じる多臓器不全、およびＤＩＣ、ならびに重症肺炎および多臓器不全が挙げられる。

本明細書中で使用される場合、「ＴＦＰＩ」および「成熟した、完全長のＴＦＰＩ」はどちらも、２７６アミノ酸残基を含み、そしてその配列が配列番号１において示される成熟ポリペプチドのことをいう。

用語「ＴＦＰＩアナログ」とは、ＴＦＰＩ分子の誘導体、すなわち、１つ以上のアミノ酸の付加または置換（一般的に本質的に保存的なもの）、１つ以上のアミノ酸の欠失、あるいは１つ以上のアミノ酸への１つ以上の化学的部分の付加で改変された（これらの改変が、ＴＦＰＩの生物学的活性を破壊しない限り）ヒトＴＦＰＩ（配列番号１）の完全な２７６アミノ酸配列を含む分子をいう。ポリペプチドアナログを作るための方法は、当該分野で公知であり、そしてさらに以下に記載される。好ましいＴＦＰＩアナログは、Ｎ−Ｌ−アラニル−ＴＦＰＩ（ａｌａ−ＴＦＰＩ）であり、そのアミノ酸配列は、配列番号２において示される。ＴＦＰＩアナログは、以下に記載されるような生物活性アッセイによって決定されるようなＴＦＰＩの活性のいくつかの基準を有する。ＴＦＰＩおよびアナログに関する好ましい生物活性アッセイは、プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイである（上記参照のこと）。

特に好ましいＴＦＰＩアナログは、本質的に保存的な置換（すなわち、これらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換）を含む。詳細には、アミノ酸は、一般的に以下の４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非荷電性極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、およびチロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時々、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの単独置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での単独置換、トレオニンのセリンでの単独置換、または構造的に関連するアミノ酸での１つのアミノ酸の同様な保存的な置換は、生物学的活性に対して大きな影響を有さないことが、合理的に予測される。例えば、分子の所望の機能がインタクトのままである限り、目的のポリペプチドは、約１〜７０までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６〜５０、１５〜２５、５〜１０、または１〜７０までの任意の整数）を含み得る。当業者は、本明細書中に規定されるような残存生物学的活性を保持する合理的な可能性のあるように改変され得る、目的の分子の領域を容易に決定し得る。

「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分の間のパーセント類似性をいう。２つのポリペプチド配列は、これらの配列が少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列相同性、または特定の範囲の間での任意のパーセント相同性を、規定された分子の長さにわたって示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、「実質的に相同」はまた、特定のポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。

一般的に、「同一性」は、２つのポリペプチド配列のそれぞれ正確なアミノ酸 対 アミノ酸の対応をいう。パーセント同一性は、配列を整列し、２つの整列された配列の間の一致の正確な数を数え、短い方の配列の長さによって除算し、そしてその結果に１００を掛けることによる、２つの分子の間の配列情報の直接比較によって決定され得る。

好ましくは、天然に存在するＴＦＰＩアナログまたは天然に存在しないＴＦＰＩアナログは、配列番号１に由来するＴＦＰＩに対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％以上相同である、アミノ酸配列を有する。より好ましくは、これらの分子は、９８％または９９％相同である。パーセント相同性は、１２のギャップ開放ペナルティーおよび２のギャップ伸長ペナルティー、ならびに６２のＢＬＯＳＵＭマトリクスを用いたアフィンギャップ検索を使用する、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９（１９８１）に教示される。

本発明によるＴＦＰＩならびにそのフラグメントおよびアナログは、グリコシル化型または非グリコシル化型のいずれかであり得る。成熟した、完全長のヒトＴＦＰＩは、２７６アミノ酸および約３８，０００ダルトンの分子量を有する血清糖タンパク質である。それは、組織因子活性の天然のインヒビターであり、従って凝固を活性化する。米国特許第５，１１０，７３０号は、組織因子（ＴＦ）について記載し、そして米国特許第５，１０６，８３３号は、ＴＦＰＩについて記載する。ＴＦＰＩ ｃＤＮＡクローニングは、Ｗｕｎら，米国特許第４，９６６，８５２号において記載される。ＴＦＰＩのフラグメントおよびアナログは、米国特許第５，１０６，８３３において記載される。ａｌａ−ＴＦＰＩは、国際薬剤名「チファコギン（ｔｉｆａｃｏｇｉｎ）」のもとにまた公知であるＴＦＰＩアナログである。ａｌａ−ＴＦＰＩは、成熟した、完全長のヒトＴＦＰＩの全アミノ酸配列およびそのアミノ末端に付加的なアラニン残基を含む。このａｌａ−ＴＦＰＩのアミノ末端アラニン残基は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現を改善し、そしてアミノ末端メチオニン残基である何か他のものの切断をもたらすためにＴＦＰＩ配列の中に組み込まれた。米国特許第４，９６６，８５２号および同第５，２１２，０９１号を参照のこと。本発明の方法において使用されるＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、細胞もしくは組織から生成され得るか、または原核細胞もしくは真核細胞のいずれかにおいて組み換え生成され得る。

成熟した、完全長のＴＦＰＩは、プロテアーゼインヒビターであり、そして３つのＫｕｎｉｔｚドメインを有する（２つは、それぞれ第ＶＩＩ因子および第Ｘａ因子と相互作用することが公知である）。第３のドメインの機能は、未知のままである。ＴＦＰＩは、不活性の、第Ｘａ因子：ＴＦＰＩ：第ＶＩＩａ因子：組織因子の４成分の複合体を形成することによって、インビボで凝固の開始を制限するために機能すると考えられる。Ｒａｐａｐｏｒｔ，Ｂｌｏｏｄ ７３：３５９〜３６５（１９８９）およびＢｒｏｚｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：７５３９〜７５４６（１９９０）による総論を参照のこと。ＴＦＰＩの多くの構造的特徴は、他の十分に研究されたプロテアーゼインヒビターとのその相同性から論理的に推理され得る。ＴＦＰＩは酵素ではない、それゆえ、ＴＦＰＩは多分化学量論的な様式でそのプロテアーゼ標的を阻害する、すなわち、ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメインの１つが、１つのプロテアーゼ分子を抑制する。好ましくは、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１および／または２が、本発明のＴＦＰＩ分子中に存在する。Ｋｕｎｉｔｚドメイン３の機能は、未知である。

（ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの獲得）
本発明の方法において使用されるＴＦＰＩおよびＴＦＰＩのアナログは、細胞または組織から単離および精製され得るか、化学的に合成され得るか、あるいは原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかにおいて組換え産生され得る。

ａｌａ−ＴＦＰＩは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を使用することで、組み換え非グリコシル化型タンパク質として発現される。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成された組み換えタンパク質をインビトロで再度折り畳むことによって高度に活性なａｌａ−ＴＦＰＩを生じる方法が、記載されている。例えば、ＷＯ９６／４０７８４を参照のこと。

ＴＦＰＩはまた、哺乳動物細胞宿主（Ｄａｙら，Ｂｌｏｏｄ ７６：１５３８〜１５４５（１９９０）によって開示されるマウスＣ１２７細胞、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６５：１６７８６〜１６７９３（１９９０）によって報告される新生ハムスターの腎細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびヒトＳＫヘパトーム細胞を含む）を使用することで、組み換えグリコシル化型タンパク質として発現される。このＣ１２７ ＴＦＰＩは、動物実験において使用され、そしてウサギにおける組織因子誘導脈管内凝固の抑制において（Ｄａｙら（前出））、イヌにおけるトロンビン溶解後の動脈の再閉塞の予防において（Ｈａｓｋｅｌら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８４：８２１〜８２７（１９９１））、およびヒヒにおけるＥ．ｃｏｌｉ敗血症モデルの死亡率の低下において（Ｃｒｅａｓｅｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２８５０（１９９３））効果的であることが示されている。

ＴＦＰＩは、いくつかの方法によって単離され得る。例えば、ＴＦＰＩを分泌する細胞としては、老化内皮細胞、約３〜４日間ＴＮＦで処理された若い内皮細胞、また肝細胞、またヘパトーム細胞が挙げられる。ＴＦＰＩは、従来の方法によってこの細胞培養から精製され得る。例えば、これらの方法としては、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９０，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６５：１６７８６〜１６７９３，Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９８９，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４：１８８３２〜１８８３７，Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９９１，Ｂｌｏｏｄ ７８：３９４〜４００，Ｗｕｎら、１９９０，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６５：１６０９６〜１６１０１，およびＢｒｏｚｅら、１９８７，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８４：１８８６〜１８９０に示される、クロマトグラフィー法が挙げられる。さらに、ＴＦＰＩは、血流中に見られ、そして血液から精製され得る（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（前出）を参照のこと）。しかし、十分量のＴＦＰＩを得るために大量の血液が、必要とされ得る。

ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、米国特許第４，９６６，８５２号に示されるように組換え的に生成され得る。例えば、所望されるタンパク質に関するｃＤＮＡは、原核生物中または真核生物中における発現のためにプラスミドに組込まれ得る。米国特許第４，８４７，２０１号は、微生物の特定のＤＮＡ配列での形質転換およびこれらのＤＮＡ配列の発現について、詳細を提供する。微生物を使用したタンパク質の発現に関する詳細を提供する、当業者に公知の多くの他の参考文献が存在する。これらの多く（例えば、Ｍａｎｉａｔａｓ，Ｔ，ら、１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）が、米国特許第４，８４７，２０１号に引用される。

微生物を形質転換し、そして、これらを使用して、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログを発現するための、種々の技術が利用可能である。以下は、可能なアプローチの単なる例である。ＴＦＰＩ ＤＮＡ配列は、単離され、そして適切な制御配列に連結されなければならない。ＴＦＰＩ ＤＮＡ配列は、米国特許第４，９６６，８５２号に示され、そしてｐＵＣ１３またはｐＢＲ３２２のようなプラスミド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍのような企業から市販される）に組込まれ得る。一旦、ＴＦＰＩ ＤＮＡが、ベクター中に挿入されると、このＤＮＡは、適切な宿主にクローン化され得る。ＤＮＡは、Ｍｕｌｌｉｓに対する米国特許第４，６８３，２０２号およびＭｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，１９５号に示されるような技術によって増幅され得る。ＴＦＰＩ ｃＤＮＡは、ヘパトーマ細胞（例えば、ＨｅｐＧ２およびＳＫＨｅｐ）のような細胞を誘導し、ＴＦＰＩ ｍＲＮＡを作製し、次いでｍＲＮＡを同定および単離し、ＴＦＰＩに対するｃＤＮＡを得るためにこれを逆転写することによって得られ得る。発現ベクターがＥ．ｃｏｌｉのような宿主に形質転換された後、この細菌は、発酵され得、タンパク質が発現され得る。好ましい原核微生物は、細菌であり、Ｅ．ｃｏｌｉは、特に好ましい。本発明で有用な好ましい微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２（Ｂｕｄａｐｅｓｔ条約の条項の下で、１９８４年２月１４日にＡＴＣＣに寄託されたＭＭ２９４株）である。受託番号３９６０７である。

もちろん、多細胞生物由来の真核生物宿主細胞培養物において、ポリペプチドをコードする遺伝子を発現することもまた可能である。例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９７３，ＣｒｕｚおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。有用な哺乳動物細胞株としては、マウス骨髄腫Ｎ５１、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ，Ｃ１２７、Ｈｅｐ Ｇ２、およびＳＫ Ｈｅｐが挙げられる。ＴＦＰＩおよびアナログはまた、バキュロウイルス感染昆虫細胞において発現され得る（米国特許第４，８４７，２０１号；同第５，３４８，８８６号；および同第４，７４５，０５１号もまた参照のこと）。Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，１９９０，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６５：１６７８６〜１６７９３もまた参照のこと。真核生物細胞用の発現ベクターは、通常、哺乳動物細胞と適合性のプロモーターおよび制御配列（例えば、Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０（ＳＶ４０）由来の通常使用される初期プロモーターおよび後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら、１９７８，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３）、または他のウイルスプロモーター（例えば、ポリオーマ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ２、ウシパピローマウイルス、またはトリ肉腫ウイルス由来のようなウイルスプロモーター）、または免疫グロブリンプロモーターおよび熱ショックプロモーター）を含む。哺乳動物宿主系形質転換の一般的な局面は、Ａｘｅｌによって、１９８３年、８月１６日に発行された米国特許第４，３９９，２１６号に記載された。「エンハンサー」領域は、発現を最適化することにおいて重要であることが、ここでまた、明らかである；これらは、一般的に、プロモーター領域の上流に見出される配列である。複製起点は、必要な場合、ウイルス供給源から得られ得る。しかし、染色体への組み込みは、真核生物におけるＤＮＡ複製のための共通の機構である。ここで、植物細胞もまた、宿主として利用可能であり、植物細胞と適合性の制御配列（例えば、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列など（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，Ａら、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．，１：５６１））は、入手可能である。植物細胞の形質転換のための方法およびベクターは、１９８５年１１月７日に公開されたＰＣＴ公開第ＷＯ８５／０４８９９に開示される。

哺乳動物細胞において発現されるＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの精製のために使用され得る方法は、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＭｏｎｏＱ、ＭｏｎｏＳ、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーの連続的適用を含む。Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（前出）；Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８８３２〜１８８３７；Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７８：３９４〜４００；Ｗｕｎら、１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６０９６〜１６１０１；Ｂｒｏｚｅら、１９８７，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８４：１８８６〜１８９０；米国特許第５，１０６，８３３号；および米国特許第５，４６６，７８３号を参照のこと。これらの参考文献は、哺乳動物産生ＴＦＰＩを精製するための種々の方法を記載する。

さらに、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、細菌または酵母において産生され、続いて精製され得る。一般的に米国特許第５，２１２，０９１号；同第６，０６３，７６４号；および同第６，１０３，５００号またはＷＯ９６／４０７８４に示される手順が使用され得る。ａｌａ−ＴＦＰＩおよび他のＴＦＰＩアナログは、ＷＯ９６／４０７８４およびＧｕｓｔａｆｓｏｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒ．５：２３３（１９９４）（これらは、本明細書中に参考として援用される）に従って、精製され、可溶化され、そして再折りたたみされ得る。例えば、ＷＯ９６／４０７８４の実施例９に従って調製される場合、成熟しており、適切に折りたたまれ、生物学的に活性であるａｌａ−ＴＦＰＩとして、総タンパク質の約８５重量％〜９０重量％を含み、そして総タンパク質の約１０重量％〜１５重量％が１つ以上の酸化メチオニン残基を有する、ａｌａ−ＴＦＰＩの調製物が得られ得る。これらの酸化形態は、プロトロンビンアッセイによって決定される場合、非誘導化ａｌａ−ＴＦＰＩの生物学的活性に等価である生物学的活性を有し、そして本明細書中において開示される本発明において活性であることが予想される。残存物質は、ａｌａ−ＴＦＰＩの種々の改変形態を含み、この形態としては、二量体化形態、凝集化形態、およびアセチル化形態が挙げられる。

ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、有意な数のシステイン残基を有し得、そして米国特許第４，９２９，７００号に示される手順は、ＴＦＰＩ再折りたたみに関連する。ＴＦＰＩおよびアナログは、種々のクロマトグラフィー法（例えば、上記されるクロマトグラフィー法）によって緩衝溶液から精製され得る。さらに、米国特許第４，９２９，７００号に示される方法が、使用され得る。任意の方法が、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログを精製するために使用され得、ヒトへの投与に適切な純度および活性のレベルを生じる。

ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ変異体は、化学的方法を使用してアミノ酸配列合成する工程（例えば、固相技術を使用する直接ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９〜２１５４，１９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９，２０２〜２０４，１９９５））で生成され得る。タンパク質合成は、手動での技術を使用して、または自動化された技術によって実行され得る。自動化での合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用することで達成され得る。必要に応じて、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ変異体のフラグメントは、分けて合成され得、そして化学的な方法を使用して組み合わせられ、完全長の分子を生成し得る。

（処方物）
本発明に従って、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの処方物は、好ましくは、静脈内注入によって投与される。本質的に連続的な静脈内注入が、好ましい。この投与を達成するための方法は、当業者に公知である。注入は、中心系（好ましくは）または末梢系によって実行され得る。投薬速度の大きな変動が避けられるべきであるのに対して、投与されたＴＦＰＩの得られる血漿レベルが、本発明の好ましい実施形態に従う一定の投与速度での連続注入から予想されるレベルの２０％以内である場合、本発明の投与速度からの短期間の偏差は、許容される。

患者への投与の前に、製剤化剤は、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログに添加され得る。液体処方物が好ましい。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、異なる濃度で、異なる製剤化剤を使用し、そしてＴＦＰＩタンパク質の投与経路、ＴＦＰＩタンパク質の溶解度、そしてＴＦＰＩタンパク質の安定性に適合性の任意の生理学的に適切なｐＨで処方され得る。静脈内注入のための好ましい処方物は、約０．６ｍｇ／ｍｌまでのａｌａ−ＴＦＰＩ、３００ｍＭまでの塩酸アルギニン、およびｐＨ５．０〜６．０のクエン酸ナトリウム緩衝液を含有する。アルギニン、ＮａＣｌ、スクロース、およびマンニトールのような特定の溶質は、ａｌａ−ＴＦＰＩを可溶化し、および／または安定化するために提供される。ＷＯ９６／４０７８４を参照のこと。静脈内注入のために特に好ましい処方物は、約０．１５ｍｇ／ｍｌの参照ａｌａ−ＴＦＰＩ、３００ｍＭの塩酸アルギニン、および２０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を含有する。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログはまた、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ リン酸ナトリウムまたは別の緩衝液（ｐＨ５．５〜７．２）中に（必要に応じて０．００５％または０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を補充して）、約０．１５ｍｇ／ｍｌまでの濃度で処方され得る。他の処方物は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、８％（ｗ／ｖ）スクロース、または４．５％（ｗ／ｖ）マンニトールのいずれかを含む、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中に、約０．５ｍｇ／ｍｌまでのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含有する。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログはまた、高塩を使用して、数ｍｇ／ｍｌまでのより高い濃度で処方され得る。例えば、１つの処方物は、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に、約６．７ｍｇ／ｍｌまでのａｌａ−ＴＦＰＩを含有する。

ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログに関する製剤化剤のさらなる例としては、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩類、緩衝剤、アルブミン、界面活性剤、または充填剤が挙げられる。好ましくは炭水化物としては、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グルカンのような糖類または糖アルコールが挙げられる。糖類またはグルカンとしては、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、およびカルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合物が挙げられる。スクロースが最も好ましい。糖アルコールは−ＯＨ基を有するＣ_４〜Ｃ_８の炭化水素と定義され、そしてガラクチトール（ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ）、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールを含む。マンニトールが最も好ましい。上述のこれらの糖または糖アルコールは、単独でまたは組み合わせて用いられ得る。糖類または糖アルコールが水性調製物中で可溶である限りは、用いられる量に確固たる制限はない。好ましくは、糖類または糖アルコール濃度は１．０ｗ／ｖ％と７．０ｗ／ｖ％との間であり、より好ましくは２．０と６．０ｗ／ｖ％との間である。好ましくは、アミノ酸は左旋性（Ｌ）体のカルニチン、アルギニン、およびベタインを含む；しかし、他のアミノ酸も加えられ得る。好適なポリマーとしては、平均分子量２，０００と３，０００との間のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または平均分子量３，０００と５，０００との間のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。凍結乾燥前または再構成後の溶液のｐＨ変化を最小にするために、組成物中に緩衝液を用いることもまた好ましい。ほとんどの任意の生理緩衝液が用いられ得るが、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびグルタミン酸緩衝液またはそれらの混合物が好ましい。好ましくは、緩衝液の濃度は０．０１〜０．３Ｍである。処方物に添加され得る界面活性剤は、欧州特許第２７０，７９９号および同第２６８，１１０号に示される。

さらに、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、例えば、循環半減期を延長させるために、ポリマーを共有結合することで化学修飾され得る。好適なポリマー、およびペプチドにポリマーを結合させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、および同第４，６０９，５４６号に示される。好適なポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは室温で水に可溶であり、そして一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎＯ−Ｒ（ここでＲは水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基のような保護基であり得る）を有する。好ましくは、保護基は１個と８個との間の炭素を有し、より好ましくは保護基はメチル基である。記号ｎは、正の整数であり、好ましくは１と１，０００との間、より好ましくは２と５００との間である。好ましくは、ＰＥＧは、１０００と４０，０００との間の平均分子量を有し、より好ましくは２０００と２０，０００との間であり、最も好ましくは３，０００と１２，０００との間である。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、より好ましくはそれは１つの末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基は好ましくは活性化されて、インヒビター上の遊離アミノ基と反応する。しかし、反応基のタイプおよび量は本発明の共有結合ＰＥＧ／ＴＦＰＩを完成させるために変えられ得ることが理解される。

水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた本発明において有用である。これらポリオキシエチル化ポリオールとしては、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などが挙げられる。ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、モノ、ジ、トリグリセリドにおいて、例えば、動物およびヒトにおいて天然に存在する同様の骨格だからである。それゆえ、この分枝鎖は、必ずしも体内で外来因子としてみなされない。ＰＯＧはＰＥＧと同様の範囲の好適な分子量を有する。ＰＯＧの構造は、Ｋｎａｕｆら、１９８８，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０６４〜１５０７０に示され、そしてＰＯＧ／タンパク質結合体の説明が、米国特許第４，７６６，１０６号に見出される（どちらもその全体が、本明細書中で参考文献として援用される）。

ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、単独の活性抗凝固薬剤として投与され得るが、これらの分子はまた、１つ以上のさらなる治療剤との組み合わせて使用され得る。このようなさらなる治療剤としては、例えば、抗エンドトキシン、モノクローナル抗体（例えば、エンドトキシン結合Ｍａｂ）および抗ＴＮＦマウスＭａｂのような抗ＴＮＦ生成物のような、敗血症の処置のために有用な抗体が挙げられる。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログはまた、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、殺菌／浸透増進（ＢＰＩ）タンパク質、免疫賦活剤、ＰＡＦアンタゴニストのような抗炎症活性を有する化合物（例えば、Ｐａｆａｓｅ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ）、および細胞接着ブロッカー（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａインヒビターのような抗血小板因子）と組み合わせ得る。組み合わせとして投与される場合、治療剤は、同時または別の時点で与えられる別個の組成物として処方され得るか、あるいは、治療剤は、単一の組成物として与えられ得る。

ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、敗血症を処置するために効果的である他の薬剤との組み合わせで投与され得る。例えば、以下は、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログとの組み合わせで投与され得る：潜在する細菌感染を処置し得る抗生物質；細菌細胞壁成分に対して向くモノクローナル抗体；敗血症の経路に関与するサイトカインと複合体化し得るレセプター；敗血症とは関連の無い予防的治療のために要求される場合、低分子量ヘパリン、そして一般的には、敗血症または敗血症性ショックの効力を減少させ、そして減衰させるように敗血症の経路におけるサイトカインまたは補体タンパク質と相互作用し得る任意の薬剤またはタンパク質。

本発明において有用な抗生物質は、一般的な部類の内の以下を含む：βラクタム環（ペニシリン）、グリコシド結合におけるアミノ糖類（アミノグリコシド）、大環状ラクトン環（マクロライド）、ナフタセンカルボキサニド（ｎａｐｔｈａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｎｉｄｅ）の多環式誘導体（テトラサイクリン）、ジクロロ酢酸のニトロベンゼン誘導体、ペプチド（バシトラシン、グラミシジン、およびポリミキシン）、共役二重結合系大環状物（ポリエン）、スルファニルアミド（ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ）由来のサルファ剤（スルホンアミド）、５−ニトロ−２−フラニル基（ニトロフラン）、キノロンカルボン酸（ナリジクス酸）、および他多数。他の抗生物質および上記の特定の抗生物質のさらなる改良体は、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｙｍｅｒ（編）、第２巻、７８２〜１０３６頁（１９７８）および第３巻、１〜７８頁、Ｚｉｎｓｓｅｒ、ＭｉｃｒｏＢｉｏｌｏｇｙ、第１７版、Ｗ．Ｊｏｌｄｉｋら（編）２３５〜２７７頁（１９８０）、またはＤｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第２７版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ （１９８８）中に見出され得る。

ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログと組み合わせられ得る他の薬剤としては、エンドトキシンアンタゴニスト（例えば、Ｅ５５３１（リピドＡアナログ、Ａｓａｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２２：４３２（１９９９）を参照のこと）；抗凝固活性を有するＴＦアナログ（例えば、Ｋｅｌｌｅｙら、Ｂｌｏｏｄ ８９：３２１９（１９９７）およびＬｅｅ ＆ Ｋｅｌｌｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４１４９（１９９８）を参照こと）；敗血症経路に関与するサイトカインに対するモノクローナル抗体（例えば、ＩＬ−６もしくはＭ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体（Ｃｒｅａｓｅｙら，１９８９年１２月１５日に出願された米国特許出願番号０７／４５１，２１８を参照のこと）およびＴＮＦに対するモノクローナル抗体（Ｃｅｒａｍｉら，米国特許第４，６０３，１０６号を参照のこと））；ＴＮＦプロホルモン産生細胞から成熟ＴＮＦプロホルモンを切断するタンパク質のインヒビター（Ｋｒｉｅｇｌｅｒら，１９８９年８月１６日に出願された米国特許出願番号０７／３９５，２５３を参照のこと）；Ｈａｓｋｉｌｉら，１９９０年５月１日に出願された米国特許出願番号０７／５１７，２７６に示されるような、ＩＬ−１のアンタゴニスト；Ｗａｒｒｅｎら，１９９９年８月２４日に発行された米国特許第５，９４２，２２０号に示されるような、インヒビン（ｉｎｈｉｂｉｎ）のようなＩＬ−６サイトカイン発現のインヒビター；ならびにＩＬ−１のような種々のサイトカインのレセプターに基づくインヒビターが挙げられる。補体に対する抗体または補体のタンパク質インヒビター（例えば、ＣＲ_１、ＤＡＦ、およびＭＣＰ）もまた用いられ得る。

液体の薬学的組成物が調整されるあと、分解を防止しそして滅菌状態を保存するために、それは、凍結乾燥され得る。液体組成物を凍結乾燥するための方法は、当業者に公知である。使用する直前に、組成物は、付加的な成分を含み得る無菌の希釈剤（例えば、リンガー溶液、蒸留水、または無菌生理食塩水）で再構成され得る。再構成されると、組成物は、好ましくは連続静脈注入によって被験体に投与される。

上記で言及されるように、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、敗血症または敗血症性ショック（ＤＩＣを有するまたは有さない）を有するヒト患者を治療的または予防的に処置するために有用である。概して、敗血症を有する患者は、菌血に関連して、高熱（＞３８．５°Ｃ）または低体温（＜３５．５°Ｃ）、低血圧、頻呼吸（＞２０呼吸／分）、頻拍（＞１００拍動／分）、白血球増加症（＞１５，０００細胞／ｍｍ^３）および血小板減少症（＜１００，０００血小板数／ｍｍ^３）によって特徴付けられる。患者が敗血症であると推測され次第（すなわち、フィブリノーゲンの低下が２０％より大きいかまたは同等であることを示すか、もしくはフィブリン分離物または他の生化学的変化（患者体温の上昇、および白血球減少症、血小板減少症の診断、および敗血症と関連する低血圧、または全身性炎症応答（血圧降下（低血圧）、体温の増減、呼吸数の増加、白血球減少症、血小板減少症、などを含む）の提示、ならびに全身性抗感染症治療を容認する感染症の疑い）の出現）、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、投与されるべきである。ＴＦＰＩはまた、敗血症になる危険性のある患者（例えば、射創由来または外科的切開由来）に対して投与され得る。敗血症になる危険性のある患者とはまた、病院の救急室または集中治療室に収容されている患者および感染巣または全身性免疫応答症候群（ＳＩＲＳ）を有するか、または有すると推測される患者が挙げられる。

本発明は、特定の有利な実施形態を示す以下の実施例を参照することによってここで例示される。しかし、これらの実施形態は例示的であって、そしていかなる方法でも本発明を制限するものとして解釈されるものでないことは留意されるべきである。

（実施例１．健康なヒト被験体へのａｌａ−ＴＦＰＩおよびヘパリンの同時投与）
Ｅ．ｃｏｌｉで発現された非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩを、健康なボランティアにヘパリンと共に投与した。ヘパリンを、それぞれ３００Ｕまたは５０００Ｕの用量で、１１時間のａｌａ−ＴＦＰＩ注入（約０．５ｍｇ／ｋｇ／時間）の６時間後に静脈内注射または皮下注射によって投与した。ａｌａ−ＴＦＰＩレベルの一過性の増加は、いずれかの経路によるヘパリン投与に引き続いて（潜在的には、内皮結合部位からのａｌａ−ＴＦＰＩの置換に起因して）観察された。ＰＴおよびこの時間の間に活性化された一部のトロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）値は、多様であるが、概してわずかに上昇し、次いでａｌａ−ＴＦＰＩ濃度の変化と同時に下降した。ヘパリンのこれらの用量は、ａｌａ−ＴＦＰＩとの組み合わせで使用する場合、安全でそして十分に寛容であった。

（実施例２．高用量のａｌａ−ＴＦＰＩでの、ヒトにおける敗血症の処置）
１４人の被験体を、重篤な敗血症における非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩ治療の第ＩＩ相臨床研究の一部として補充した。この研究は、重篤な敗血症を有する被験体における、第ＩＩ相の、多施設の、二重盲検の、無作為化された、プラシーボ制御の、２工程の用量漸増研究、安全性研究、および寛容性研究であった。第一の目的は、ａｌａ−ＴＦＰＩの安全性プロフィールを評価することであった。第二の目的は、薬物動態、サイトカインおよび凝固マーカー、多臓器不全スコア、ならびに１５日および２８日後の生存を評価することであった。５人の被験体を、プラシーボに対して無作為化し、５人を、約０．３３ｍｇ／ｋｇ／時間のａｌａ−ＴＦＰＩ投与速度に対して無作為化し、そして４人を、約０．６６ｍｇ／ｋｇ／時間のａｌａ−ＴＦＰＩ投与速度で無作為化した（どちらの用量も、連続静脈内注入によって行った）。この研究は、予期された抗凝固および出血より高い抗凝固（高められたＩＮＲ）および出血に起因して、時期尚早に終結した。

有害事象（ＡＥ）を、被験体または薬学的産物を任意の用量で投与された臨床調査被験体（必ずしも原因となるこの処置との相関性を有しない）における、任意の医学的副作用（ｕｎｔｏｗａｒｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）として規定した。それゆえ、ＡＥは、任意の不都合であり、意図されない兆候（例えば、異常な検査室所見を含む）、症状、またはこの産物（医薬品に関係があるとみなされていようといなかろうと）の使用に時間的に関連する疾患であり得る。重篤な有害事象（ＳＡＥ）を、任意の医学的副作用（任意の用量で、死亡を生じさせ、生命を脅かし（すなわち、調査者の意見では、それが生じた場合、被験体は、その事象を原因とする即時的な死亡の危険にあった）、被験体の入院を必要とするか、または延長させ、永続的または著しい障害／無力を生じ（すなわち、正常な生命機能を行うヒトの能力の本質的な崩壊を引き起こす事象）、先天性奇形／出世時欠損である）として、または適切な医学的判断に基づいて、被験体を危険にさらし得、そして重篤な有害事象として規定される他の結果の１つを予防するために医学的または外科的介入を必要とし得る重要な医学的事象として規定した。

ａｌａ−ＴＦＰＩを与えた９人の被験体のうちの７人は、プラシーボを与えた５人の被験体のうちの１人と比較して出血を経験した。さらに、３人のａｌａ−ＴＦＰＩレシピエントは、活性な注入の間、ＩＮＲを著しく高めた。２人の被験体において、このＩＮＲは、注入を停止した後、急速に減退した。１人の被験体において、注入は中断しなかったが、このＩＮＲはベースラインに戻った。ＩＮＲレベルを高めた間、出血は報告されなかった。出血以外で最も共通するＳＡＥは、敗血症およびその関連合併症に起因した。

プラシーボを与えた５人の被験体のうちの１人、ａｌａ−ＴＦＰＩ（約０．３３ｍｇ／ｋｇ／時間）を与えた５人の被験体のうちの５人、およびａｌａ−ＴＦＰＩ（約０．６６ｍｇ／ｋｇ／時間）を与えた４人の被験体のうちの２人は、出血に関与する有害事象を経験した。プラシーボ群における５人の被験体のうちの２人（４０％）、ａｌａ−ＴＦＰＩ群（０．３３ｍｇ）における５人の被験体のうちの４人（８０％）、およびａｌａ−ＴＦＰＩ群（０．６６ｍｇ）における４人全ての被験体は、この研究の間に少なくとも１つのＳＡＥを経験した。

ＳＡＥの要約を、表１に示す。被験体は、１より大きいＳＡＥを経験し得ることに留意されたい。

出血に関与する４つのＳＡＥの合計およびＰＴの予想外の延長に関係のある２つのＳＡＥが、ａｌａ−ＴＦＰＩ群において生じた。他のＳＡＥは、重症敗血症の合併症に起因した。

（実施例３．ウサギ腹膜炎モデルにおける低用量ＴＦＰＩの効果）
ウサギにおける研究は、実施例２に記載したものより低用量のａｌａ−ＴＦＰＩが、効能的であり得たことを示した。低用量の非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩを与えた異なる５群を、ウサギＥ．Ｃｏｌｉ腹膜炎モデルにおいて評価した。約０．５ｍｇ／ｋｇボーラスのａｌａ−ＴＦＰＩ用量および２４時間の約５ｍｇ／ｋｇ／分での注入（ヒトでの０．８ｍｇ／ｋｇ／時間と同等）は、５８％のウサギを救ったので（表２）、これを陽性対照として取り扱った。ａｌａ−ＴＦＰＩ投与群とプラシーボとの間の生存パーセントにおける有意な違いは、最も低い用量（これらの研究において、プラシーボ処置した対照と同じ生存パーセント（２０％）を示した）を除いた全ての用量に関して見られた（表２）。

ウサギに、ヘモグロビン（４０μｇ／ｍｌ）、ブタのムチン（１５０μｇ／ｍｌ）、および生存可能なＥ．Ｃｏｌｉ株Ｏ１８：Ｋ１＋（１．０±０．５×１０^５ ＣＦＵ／ｋｇ）（ヒトにおけるＥ．Ｃｏｌｉ敗血症の全ての症例の２０％以上を引き起こす臨床分離菌）を含む懸濁剤を腹腔内に接種した。ゲンタマイシン処理（１２時間ごとに５ｍｇ／ｋｇ、５回投与）を、腹膜炎の誘導４時間後に開始した。４時間後、熱、悪寒、およびわずかな血圧降下の臨床症状が、代表的に存在した。その時点で、ウサギを無作為化し、プラシーボの２４時間注入またはａｌａ−ＴＦＰＩの６つの用量のうちの１つ（表２に示されるように、引き続くボーラス投与後に連続静脈内注入を行うことからなる）を与えた。７日後生きていたウサギを、生存とみなした。本モデルにおける死亡原因は、呼吸不全および多臓器不全である。剖検では、非生存ウサギの肺は、酷い浮腫状であり、そして気道は、ピンクで泡状の流体で満たされていた。腎臓は、出血し、そしてうっ血していた。肝臓は、代表的にはＥ．Ｃｏｌｉを芽生えさせた膿瘍を含んでいた。膿瘍は、腹膜腔中いたるところに存在した。対照的に、７日間生存したウサギは、最小限の肺うっ血の形跡を示した。小さな散乱した膿瘍が、しばしば腹膜腔中に存在したが、他の充実した器官（副腎、肝臓、および脾臓）は、おおいに正常であった。

（実施例４．敗血症ヒト患者の処置における低用量ａｌａ−ＴＦＰＩの安全性および効能）
本実施例は、重篤な敗血症に罹患した患者を処置するためのａｌａ−ＴＦＰＩ低用量投与の臨床的使用について記載する。

重篤な敗血症に罹患した被験体における、第ＩＩ相の一重盲検の（ｓｉｎｇｌｅ−ｂｌｉｎｄｅｄ）用量漸増研究を、Ｅ．Ｃｏｌｉ 対 プラシーボにおいて生成された０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間および０．０５ｍｇ／ｋｇ／時間の非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩの投与速度を評価するために実行した。ａｌａ−ＴＦＰＩを、２１０人の被験体（プラシーボ：ｎ＝６９、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間でのａｌａ−ＴＦＰＩ：ｎ＝８０、約０．０５ｍｇ／ｋｇ／時間でのａｌａ−ＴＦＰＩ：ｎ＝６１）において、９６時間の間連続静脈内注入（ＣＩＶ）注入によって投与した。被験体を、０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間でのａｌａ−ＴＦＰＩ用量で開始する、３０のブロックにおいて登録参加させた。投与段階１は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間でのａｌａ−ＴＦＰＩ群およびプラシーボ群における被験体を含んだ。投与段階２は、０．０５ｍｇ／ｋｇ／時間でのａｌａ−ＴＦＰＩ群およびプラシーボ群における被験体を含んだ。この研究は、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間での投与速度でのａｌａ−ＴＦＰＩが、安全で、そしてプラシーボに対して２８日間の全原因死亡の減少およびいくつかの多臓器機能不全（ＭＯＤ）スコアにおける改善への傾向と関連することを示した。ＭＯＤスコアを、表３に列挙された診断基準の評点化によって割り当てた。

患者を、重篤な敗血症の開始から２４時間以内に、この研究に参加させた。評価の全期間の間、患者は完全な集中治療管理（流体蘇生法（ｆｌｕｉｄ ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ）、昇圧薬、換気支援（ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒｙ ｓｕｐｐｏｒｔ）、非経口の抗微生物剤、および適切な外科的管理を含む）を受けた。

このプロトコルはまず、異なる群の患者が０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間〜０．１ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲にあるａｌａ−ＴＦＰＩ用量レベルを受け入れることを要求し、より低用量レベルからより高用量レベルに連続的に進行させた。被験体を、０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間のａｌａ−ＴＦＰＩ用量レベルで開始する、３０のブロックにおいて逐次登録した。２１０人の被験体を、無作為化し、そして投与段階１（Ｓ１）（プラシーボ［ｎ＝３９］および約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間のａｌａ−ＴＦＰＩ［ｎ＝８０］）において、または投与段階２（Ｓ２）（プラシーボ［ｎ＝３０］および約０．０５ｍｇ／ｋｇ／時間のａｌａ−ＴＦＰＩ［ｎ＝６１］）の間、１：２の比（プラシーボ 対 ａｌａ−ＴＦＰＩ）で注入し、そして４日間までプラシーボまたはａｌａ−ＴＦＰＩの連続静脈内注入（ＣＩＶ）を与えた。

本研究のために適格な被験体は、いずれかの性で年齢１８歳以上であり、インフォームドコンセントを受け、そして以下の診断基準全てを十分に満たす患者である：（１）感染の臨床的な形跡（明らかに証明できる感染巣を有する）；（２）全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）の兆候（ＳＩＲＳの兆候は、熱（芯温度、直腸温度、腋窩温度または鼓室温度が３８°Ｃ以上）もしくは低体温（芯温度または直腸温度が３６°Ｃ以下）、心拍数が１分あたり９０より大きく、呼吸数が１分あたり２０より大きい、あるいはＰａＣＯ_２（ＣＯ_２の肺胞分圧）が３２ｍｍＨｇ未満、または被験体が人工呼吸器を身に付けている場合、白血球数が１２，０００／ｍｍ^３より大きく、４，０００／ｍｍ^３未満、または１０％より多い未熟帯状形態からなった）；（３）肺の機能不全によって証明されるような器官機能不全／低灌流（ＯＤ）の兆候の少なくとも１つ（ＰａＯ_２／ＦｉＯ_２比（吸入されたＯ_２の分画に対するＯ_２の肺胞分圧の比）が２５０未満（もしくは、肺炎または他の局所性肺疾患の存在下で２００未満）、乳酸アシドーシスまたは増加した血漿中乳酸濃度のためと考えられる代謝性アシドーシス（ｐＨが７．３０以下または塩基欠乏が５．０ｍＥｑ／Ｌ以上（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上）、尿量過少（適切な流体蘇生法存在下での、最低限継続して２時間の間、尿排出量が０．５ｍＬ／ｋｇ／時間以下（被験体が長期の透析を続けている場合、器官機能不全としては有効ではない））、薬剤誘導性であると推定されない説明のつかない血小板減少症（血小板数が１００，０００細胞／ｍｍ^３以下））。本診断基準は、血小板減少症、または低血圧症を引き起こした思われる治療（治療用量で要求される昇圧薬（すなわち、ドパミンが５μｇ／ｋｇ／分より大きいもしくは少なくとも継続して２時間、９０ｍｍ Ｈｇより大きい周期性血圧を維持するためのエピネフリン、ノルエピネフリン、またはフェニレフリンの任意の用量））を受けた被験体においては使用し得なかった。

主要な排除診断基準は、以下であった：（１）予期された薬物投与から２時間以内の不応性低血圧症、（２）公知または推測された心内膜炎、（３）制御されない出血；ＩＮＲが３より大きい、（４）研究薬物の注入前１２時間以内の大手術、（５）６ヶ月以内の頭蓋内出血または１ヶ月以内の閉鎖性頭部外傷もしくは脳卒中あるいは出血の危険性が増大した他の神経学的状態の病歴、（６）血小板数が２０，０００／ｍｍ^３以下、（７）妊娠、（８）１５０ｋｇより大きい体重、（９）著しい肝臓疾患（Ｃｈｉｌｄ ＰｕｇｈグレードＣ）および／もしくは公知または推測された食道動脈瘤、（１０）確認された、臨床的に明らかな膵炎、（１１）研究開始前７２時間以内の心肺停止、（１２）急性または慢性移植拒絶反応の形跡；１０％より大きい体表面面積でのＩＩ度またはＩＩＩ度の火傷、（１３）抗凝固薬、抗血小板薬もしくは血栓溶解剤または組織プラスミノーゲンアクチベーターでの全身性処置、（１４）２０，０００国際単位より大きい１日のヘパリン用量、（１５）研究記録から３０日以内での、調査中の新たな薬剤または生物製剤の受け入れ、または（１６）同意時点での機械換気、血液濾過もしくは透析、電気的除細動または任意の要求される薬物／流体治療の拒否。

２つの投与段階への連続的な参加のために、各活性用量群を、それ自身のプラシーボ群と比較する。さらに、データを、全てのプラシーボ被験体 対 全てのａｌａ−ＴＦＰＩ被験体を比較して表示する。０．１ｍｇ／ｋｇ／時間用量を、０．０５ｍｇ／ｋｇ／時間用量で観察される重篤な有害事象のために、この研究から除去した。

研究薬物、ａｌａ−ＴＦＰＩは、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で発現されそして標準クロマトグラフィー技術によって精製された組み換え非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩである。この研究薬物を、０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で、無菌のａｌａ−ＴＦＰＩ溶液を１００ｍｌ容積で含むバイアルで供給し、そして等張性の緩衝剤中に処方した。プラシーボを、希釈緩衝剤で構成し、そしてパッケージし、そして研究薬物と同じ条件下で保管する。ａｌａ−ＴＦＰＩを、４日間にわたって一定の速度で、前もって規定した投薬レベルで注入した。薬物注入を、ａｌａ−ＴＦＰＩまたはプラシーボ専用の静脈カテーテル（中枢性または末梢性）をとおして実施した。

患者を、２８日間または死亡まで追従した。多臓器機能不全スコア（ＭＯＤＳ）および併用投薬を、８日目まで集めた。急性生理機能および慢性健康の評価（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアおよび病院の検査室ＩＮＲを、４日目まで集めた。慣用的な安全性検査室パラメーター（総ビリルビン、クレアチニン、トランスアミナーゼ、血清乳酸（ベースラインのみ）、差動および血小板を有する全血球算定（ＣＢＣ））を６日目まで集めた。学術検査室パラメーター（トロンビン−抗−トロンビン複合体（ＴＡＴｃ）、およびＩＬ−６）のような専門の試験および薬物動態学的サンプルを、それぞれ４日目および５日目まで集めた。臨床的に示される場合、心電図（ＥＣＧ）および胸部Ｘ線写真を６日目まで集めた。患者を、有害事象（ＡＥ）および死亡の全ての原因に関して２８日目までモニタリングした。

ＩＮＲを、ベッドサイドモニター（ＣｏａｇｕＣｈｅｃｋ Ｐｌｕｓ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）で、そして病院の検査室によって周期的に測定した。ａｌａ−ＴＦＰＩ動態および活性を、ＩＮＲ応答に対する効果によって測定した。使用した別の方法は、トロンビン−抗トロンビン複合体（ＴＡＴｃ）の測定である。ＴＡＴｃサンプルを、注入前（−２時間〜０時点）および２日目、３日目および４日目で回収した。病院でのＩＮＲは、スクリーニングから６時間以内、ならびに１日目（４時間）、２日目、３日目、および４日目で回収した；ベッドサイドでのＩＮＲを、注入前、注入１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、次いで投与の間６時間±２時間ごと、投与終了直前、投与終了４時間後および８時間後に回収した。投与調整および／または投与中止を、ＩＮＲの高さによって誘導した。予定外のサンプル（用量減少）を、用量減少の直前および用量減少４時間後に回収した。

組み換えａｌａ−ＴＦＰＩ血漿濃度を、注入前（−２時間〜０時点）、１日目（４時間後および８時間後）、２日目、および３日目、ならびに投与終了時に回収した。薬物動態学的サンプルを、ＴＦＰＩに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用して確証された電気化学的ルミネセンス免疫測定法を使用することで測定した。モノクローナル抗体は、ＴＦＰＩの第一のＫｕｎｉｔｚドメインに対して特異的であった。結果として、このアッセイは、内因性ＴＦＰＩおよびその組み換え型（ａｌａ−ＴＦＰＩ）を測定した。このアッセイ標準および品質対照を、ウサギ血漿で希釈した。ウサギ血漿は、免疫学的に交差反応するＴＦＰＩを含まないので、このアッセイは、ヒト血漿中の内因性ＴＦＰＩを測定し得る。定量性の下方限界は、５ｎｇ／ｍｌであった。

最初の２つの投与段階における患者の参加の間に、０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間 ａｌａ−ＴＦＰＩ群およびプラシーボ群と比較して、０．０５ｍｇ／ｋｇ／時間 ａｌａ−ＴＦＰＩ群において出血に関与するＳＡＥの増加傾向が観察された。これは、０．１ｍｇ／ｋｇ／時間用量で計画された研究を実行する必要性を除去した。

２８日間における全原因死亡の減少傾向が、プラシーボ群と比較して０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間 ａｌａ−ＴＦＰＩ用量群において留意された。ロジスティック回帰モデルは、ベースライン検査室ＩＮＲ相互作用効果による実質的な処置の存在を示し、このことは、より高いベースラインＩＮＲが、より明白なａｌａ−ＴＦＰＩ効果と関連することを示した。

多臓器機能不全スコア（ＭＯＤＳ）を、改変された敗血症関連器官不全評価（ＳＯＦＡ）スコアを用いることによって決定した（表５を参照のこと）。以下のＳＯＦＡ改変を行った。血小板注入を説明するために、凝固スコアを改変した（表８脚注３を参照のこと）。透析を説明するために、腎スコアを改変した（表８脚注４を参照のこと）。複合集中治療室（ＩＣＵ）スコアを加えた。ＩＣＵスコアは肺スコア、心臓血管スコア、および凝固スコア（特に血小板数）を組み合わせる。

ベースラインからのより高い％変化によって示されるように、正の傾向が、プラシーボと比較していずれかの用量のａｌａ−ＴＦＰＩレシピエントの間でも、いくつかの器官機能不全スコアにおいて観察された。これらの傾向は、肺スコアおよびＩＣＵスコアに関して最も明白であった。

被験体のＩＮＲが処置の間に被験体のベースラインＩＮＲを２０％以上超えて増加した場合、もしくは被験体のＩＮＲが２．５であったか、またはより高かった場合、ａｌａ−ＴＦＰＩの投与を中断した。高められたＩＮＲによる投与中断の頻度は、各群において低かった。これらのデータは、ＩＮＲの上昇は重篤な敗血症被験体において生じることを示唆する。プラシーボと比較してａｌａ−ＴＦＰＩ処置した被験体における投与中断のわずかの増加が、留意された。

ａｌａ−ＴＦＰＩ群 対 プラシーボ群において、全身系にわたって、ＡＥ、出血に関与するＡＥ，およびＳＡＥの発生数における主な違いは無かった。出血に関与するＳＡＥの全発生数は、低かった。０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間のａｌａ−ＴＦＰＩおよびＴプラシーボを与えた群と比較して、０．０５ｍｇ／ｋｇ／時間のａｌａ−ＴＦＰＩ群において、出血に関与するＳＡＥの発生数にわずかな増加があった。出血に関与するＳＡＥの発生を、表９によって表示されるようなベースラインＩＮＲによっても分析した（１．２以上（「高ＩＮＲ被験体」） 対 １．２未満（「非高ＩＮＲ被験体」））。

約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間のａｌａ−ＴＦＰＩおよびプラシーボと比較して、約０．０５ｍｇ／ｋｇ／時間のａｌａ−ＴＦＰＩを与えた「高ＩＮＲ」被験体において、出血に関与するＳＡＥの発生数に増加がみられた。「非高ＩＮＲ」被験体のコホートにおいては、出血に関与するＳＡＥ発生数は低かった。

（実施例５．患者小群にわたる死亡率）
死亡率を、実施例４に記載される第ＩＩ相低用量ａｌａ−ＴＦＰＩ研究における異なる患者小群について分析した。その結果を、表１３に要約する。結果を、全てのプラシーボ患者 対 全てのａｌａ−ＴＦＰＩ患者（０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度および０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度のどちらも）に関して比較する。

本発明は、特定の実施例を参照にして記載されている。しかし、本出願は、添付の特許請求項の範囲の意図および範囲から外れずに当業者によってなされ得る変更および代替を網羅することを意図する。

図１Ａおよび図１Ｂは、敗血症ヒト患者における生存率（１Ａ）およびＩＬ−６レベルの減少（１Ｂ）における低用量ａｌａ−ＴＦＰＩ投与の効果を示す。図１Ａは、プラシーボまたはＥ．Ｃｏｌｉで発現された組み換え非グリコシル化型ａｌａ−ＴＦＰＩのいずれかを、０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間または０．０．５ｍｇ／ｋｇ／時間のいずれかで連続静脈内注入によって受けた２１０人の敗血症患者に関するカプランマイヤー生存曲線を示す（詳細に関しては、実施例５を参照のこと）。これらの結果は、ａｌａ−ＴＦＰＩ処置で、死亡率が減少方向に向かう傾向にあることを示す。 図１Ａおよび図１Ｂは、敗血症ヒト患者における生存率（１Ａ）およびＩＬ−６レベルの減少（１Ｂ）における低用量ａｌａ−ＴＦＰＩ投与の効果を示す。図１Ｂは、図１Ａで示された同じ患者において、ベースラインＩＬ−６レベルの３５％まで減少させるための時間を示す。低用量ａｌａ−ＴＦＰＩ投与は、２つの異なる統計的アプローチ（Ｍ＆ＭおよびＬＯＣＦ；それぞれｐ＝０．００９および０．０２５）を使用することで、プラシーボと比較して有意にＩＬ−６レベルを減少させた。 図２Ａおよび図２Ｂは、実施例５で記載される２１０人の敗血症患者におけるトロンビン−抗トロンビン（ＴＡＴｃ）レベルの動態を示す。図２Ａにおいて、ＴＡＴｃレベルは、ａｌａ−ＴＦＰＩの０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間および０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間用量ならびにプラシーボ投与に関して分けて示される。図２Ｂは、０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間用量および０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間用量の両方 対 プラシーボに関して組み合わせられたデータを示す。ＴＡＴｃの幾何平均は、ａｌａ−ＴＦＰＩ投与の最初の２４時間以内にプラシーボ処置した患者に対して、ａｌａ−ＴＦＰＩ処置した患者 においては有意に低かった。ＴＡＴｃレベルは、７２時間通して有意に低いままであった。 図３は、健康なヒトボランティアにおけるＩＮＲとａｌａ−ＴＦＰＩ（「ｒＴＦＰＩ」）の血漿濃度との間の関係を示す。

Claims (1)

1. 敗血症を有するか、または敗血症になる危険性のある患者において敗血症を処置するための薬学的組成物であって：
   少なくとも約７２時間の投与期間、約０．０００２５〜約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間の投与速度での参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与と同等の投与速度で連続静脈内注入によって投与するために処方されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、
   を含有する組成物。

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