JP2006068003A - Oxidase and oxidation reagent containing the same - Google Patents
Oxidase and oxidation reagent containing the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006068003A JP2006068003A JP2005224132A JP2005224132A JP2006068003A JP 2006068003 A JP2006068003 A JP 2006068003A JP 2005224132 A JP2005224132 A JP 2005224132A JP 2005224132 A JP2005224132 A JP 2005224132A JP 2006068003 A JP2006068003 A JP 2006068003A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bilirubin
- enzyme
- activity
- protein
- oxidase activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 69
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 title description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 title description 4
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 claims abstract description 194
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 168
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 97
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 95
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 95
- 108010015428 Bilirubin oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 108010024957 Ascorbate Oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 66
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 66
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 37
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims abstract description 37
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 28
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 21
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 18
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 18
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 claims description 13
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 claims description 12
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 claims description 8
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims description 6
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 claims description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012802 pre-warming Methods 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 78
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 44
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 7
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 4
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Chemical group 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical group 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical group Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 2
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 2
- 241001442234 Cosa Species 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000008789 Direct Bilirubin Methods 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 125000000664 diazo group Chemical group [N-]=[N+]=[*] 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010799 enzyme reaction rate Methods 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IGHGOYDCVRUTSU-UHFFFAOYSA-M sodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;hydroxide Chemical group [OH-].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O IGHGOYDCVRUTSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DGPIGKCOQYBCJH-UHFFFAOYSA-M sodium;acetic acid;hydroxide Chemical group O.[Na+].CC([O-])=O DGPIGKCOQYBCJH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N Biliverdin Natural products CC1=C(C=C)C(=C/C2=NC(=Cc3[nH]c(C=C/4NC(=O)C(=C4C)C=C)c(C)c3CCC(=O)O)C(=C2C)CCC(=O)O)NC1=O GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N Biliverdin IX Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(\C=C/2C(=C(C)C(=C/C=3C(=C(C=C)C(=O)N=3)C)/N\2)CCC(O)=O)N1 RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N 0.000 description 1
- 101100246536 Caenorhabditis elegans pyc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010049152 Cold Shock Proteins and Peptides Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241000127897 Ganoderma tsunodae Species 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 241000223251 Myrothecium Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000828254 Streptomyces lividans TK24 Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N biliverdin-IXalpha Natural products N1C(=O)C(C)=C(C=C)C1=CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C=C)C(=O)N3)C)=N2)CCC(O)=O)N1 QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPYKTIZUTYGOLE-UHFFFAOYSA-N billirubin-IXalpha Natural products N1C(=O)C(C)=C(C=C)C1=CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(C=C3C(=C(C=C)C(=O)N3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- -1 vanadate ions Chemical class 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、熱安定性に優れたビリルビンオキシダーゼ活性及び／又はアスコルビン酸オキシダーゼ活性を示すバチラス・サチルスに属するバクテリアの内胞子皮構成成分（Endospore coat component、CotA）を含有する組成物、それを用いたビリルビン及び／又はアスコルビン酸酸化試薬、及びそれを用いた試料中のビリルビン及び／又はアスコルビン酸を酸化する方法に関する。 The present invention relates to a composition containing a bacterial endospore coat component (CotA) belonging to Bacillus subtilis exhibiting bilirubin oxidase activity and / or ascorbate oxidase activity excellent in thermal stability, and use thereof The present invention relates to a bilirubin and / or ascorbic acid oxidizing reagent, and a method for oxidizing bilirubin and / or ascorbic acid in a sample using the same.
血清中ビリルビンは、液体クロマトグラフィーにより、他の物質を抱合していない非抱合型ビリルビン、ビリルビン１分子あたり１分子のグルクロン酸を抱合したモノグルクロナイドビリルビン、ビリルビン１分子あたり２分子のグルクロン酸を抱合したジグルクロナイドビリルビン、およびアルブミンと結合したアルブミン結合ビリルビン（δビリルビン）に分画されることは知られており（非特許文献１）、さらに、それぞれの画分の比率や量は病態により変化する事が知られている（非特許文献２）。血清中ビリルビンの測定方法は、ビリルビンオキシダーゼなどの酵素を用いる酵素法、ジアゾ試薬やバナジン酸イオンなどを用いた化学法（特許文献１）、そして高速液体クロマトグラフィーを用いる方法に大別され、現在のところ、ジアゾ試薬を用いる方法で測定されたそれぞれのビリルビン濃度が、直接型ビリルビンまたは総ビリルビンとして各種肝疾患診断や黄疸鑑別などの診断の基準にされている。 Serum bilirubin is analyzed by liquid chromatography. Unconjugated bilirubin not conjugated with other substances, monoglucuronide bilirubin conjugated with 1 molecule of glucuronic acid per molecule of bilirubin, 2 molecules of glucuronic acid per molecule of bilirubin Is known to be fractionated into diglucuronide bilirubin conjugated with glycine and albumin-bound bilirubin (δ bilirubin) conjugated with albumin (Non-patent Document 1). It is known that it changes depending on the non-patent document 2). Methods for measuring serum bilirubin are broadly divided into enzyme methods using enzymes such as bilirubin oxidase, chemical methods using diazo reagents and vanadate ions (Patent Document 1), and methods using high performance liquid chromatography. However, each bilirubin concentration measured by a method using a diazo reagent is used as a standard for diagnosis such as various liver disease diagnosis and jaundice discrimination as direct bilirubin or total bilirubin.
血清中ビリルビン測定方法のうち、酵素法においては、ビリルビンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ラッカーゼ、またはチロシナーゼを用いる方法が報告されている（特許文献２、３、４、５など）が、ビリルビンオキシダーゼの安定性が高い酵素を用いることが当然望ましい。しかし、現在知られているビリルビンオキシダーゼは血清中ビリルビンに対する特異性は高いものの安定性が悪いため該酵素を含有する測定試薬が不安定という問題があったため、安定化のためのいろいろな添加剤が工夫されてきた（特許文献６、７など）。また、耐熱性ビリルビンオキシダーゼが報告されているが（特許文献８）、該酵素は生産性が低く未だ実用化に至っていない。そのため、スエヒロ茸由来のビリルビンオキシダーゼ（特許文献９）やミロセシウム属（Myrothecium）由来のビリルビンオキシダーゼ（特許文献１０）などの実用的に用いられているビリルビンオキシダーゼと比べて安定性の高いアスコルビン酸オキシダーゼを用いた試料中のビリルビン測定方法も開発されている（特許文献１１）。該アスコルビン酸オキシダーゼのもつビリルビンオキシダーゼ活性は６０℃３０分の熱処理で１００％の活性を保持するものの、８０℃３０分の熱処理では完全に失活する。
Among the methods for measuring serum bilirubin, in the enzyme method, methods using bilirubin oxidase, ascorbate oxidase, laccase, or tyrosinase have been reported (
また、特許文献８の耐熱性ビリルビンオキシダーゼは、８０℃１０分の熱処理で残存活性が９０％、９０℃１０分では５０％程度の残存活性を示す。さらに最近、ミロセシウム属由来のビリルビンオキシダーゼを遺伝子工学的手法で改変した報告がなされた。それによると、遺伝子改変前の酵素が６０℃３０分の熱処理で４６．６％の残存活性であるのに対し、遺伝子改変後には５９．８％の残存活性に改善されている（特許文献１２）。一方、アスコルビン酸オキシダーゼは、臨床診断薬分野においては血清中アスコルビン酸が測定値に干渉する事を防ぐ目的で、臨床診断薬に使用される汎用酵素である。現在、５５℃６０分の熱処理で残存活性が６０％になるという性質を有する熱安定性、保存安定性を有するアスコルビン酸オキシダーゼが知られている（特許文献１３）。バチラス・サチルスに属するバクテリアの内胞子皮構成成分（Endospore coat component、CotA）は、その遺伝子配列及びアミノ酸配列は知られており（非特許文献５）、ラッカーゼ活性を有することが知られている（非特許文献３）。
Further, the thermostable bilirubin oxidase of
本発明の課題は、現在知られているビリルビン及び／又はアスコルビン酸酸化試薬よりも、さらに有用なビリルビン及び／又はアスコルビン酸酸化試薬を提供することにある。さらには、該酸化試薬を用いた試料中のビリルビン及び／又はアスコルビン酸の酸化方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a bilirubin and / or ascorbic acid oxidizing reagent that is more useful than the currently known bilirubin and / or ascorbic acid oxidizing reagent. Furthermore, another object is to provide a method for oxidizing bilirubin and / or ascorbic acid in a sample using the oxidizing reagent.
上記課題を解決するために、本発明者らは、臨床診断薬としての利便性から液状で保存できる試薬が有用であると考えた。また、安定化剤の非存在下においても安定であることも重要であると考えた。そのためには、原料である臨床診断用酵素の安定性が重要と考えて、既存のビリルビンオキシダーゼ及び／又はアスコルビン酸オキシダーゼを検討した結果、いずれも安定性に問題があるという課題を見出した。本発明の課題は、安定化剤の非存在下において安定性に優れたビリルビン及び／又はアスコルビン酸酸化試薬、及びそれらを含有するビリルビン及び／又はアスコルビン酸測定試薬の提供、さらには、該測定試薬を用いた試料中のビリルビン及び／又はアスコルビン酸の酸化方法を提供することにある。 In order to solve the above problems, the present inventors considered that a reagent that can be stored in a liquid form is useful for convenience as a clinical diagnostic agent. It was also considered important to be stable even in the absence of a stabilizer. For that purpose, the stability of the enzyme for clinical diagnosis, which is a raw material, is considered important, and as a result of examining existing bilirubin oxidase and / or ascorbate oxidase, a problem was found that both had problems with stability. An object of the present invention is to provide a bilirubin and / or ascorbic acid oxidizing reagent excellent in stability in the absence of a stabilizer, a bilirubin and / or ascorbic acid measuring reagent containing them, and further, the measuring reagent An object of the present invention is to provide a method for oxidizing bilirubin and / or ascorbic acid in a sample.
上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、バチラス・サチルスの内胞子皮構成成分がビリルビンオキシダーゼ及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性を有することを発見し、さらに、該タンパク質が８０℃３０分の熱処理でも９５％以上の残存活性を有することを見出して、該タンパク質を利用した安定性に優れたビリルビン及び／又はアスコルビン酸酸化試薬の提供、及び該測定試薬を用いた試料中のビリルビン及び／又はアスコルビン酸を酸化する方法を確立して本発明に至った。 As a result of diligent research to solve the above problems, it was discovered that the endospore skin component of Bacillus subtilis has bilirubin oxidase and ascorbate oxidase activities, and the protein can be subjected to heat treatment at 80 ° C. for 30 minutes. Provided bilirubin and / or ascorbic acid oxidizing reagent with excellent stability using the protein, found to have a residual activity of 95% or more, and bilirubin and / or ascorbic acid in a sample using the measurement reagent As a result, the present invention has been established.
即ち、本発明は、
Ｉ）２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．５（２５℃））中０．１ｍｇ／ｍｌの酵素濃度で８０℃３０分間加熱処理した後の残存酵素活性を以下の酵素活性測定法に従って測定するビリルビンオキシダーゼ活性及び／又はアスコルビン酸オキシダーゼ活性が、加熱処理前に比べて８０％以上残存することを特徴とするバチラス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＡＴＣＣ ２３８５７）由来の内胞子皮構成成分（Endospore coatcomponent）タンパク質含有組成物、
That is, the present invention
I) Residual enzyme activity after heat treatment at 80 ° C. for 30 minutes at an enzyme concentration of 0.1 mg / ml in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5 (25 ° C.)) is measured according to the following enzyme activity measurement method. Endospore coatcomponent protein derived from Bacillus subtilis (ATCC 23857), characterized in that bilirubin oxidase activity and / or ascorbate oxidase activity remains at least 80% compared to before heat treatment Containing composition,
（１）ビリルビンオキシダーゼ活性測定法
１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））０．１ｍｌ、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））で希釈した酵素液０．０２ｍｌ、および蒸留水０．８８ｍｌからなる酵素活性測定溶液１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で３７℃１．５分間予備加温した後、基質として干渉チェックＡビリルビンＦ（成分はビリルビン）を０．９％ＮａＣｌで２０ｍｇ／ｄｌに調製したものを２０μｌ添加して酵素反応を開始し、反応開始後１分後から２分後までの４５０ｎｍにおける基質の吸光度差を測定する（Ａｓ）。盲検として１００℃で９０分間熱処理した同じ濃度の酵素液を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。酵素活性１単位（１ユニット）は３７℃で１分間に１マイクロモルのビリルビンを変化する酵素量、上記反応液中でのビリルビンＦのミリモル吸光係数は３６として、Ａｓ−Ａｂより酵素活性を求める。
(1) Method for measuring bilirubin oxidase activity Enzyme diluted with 0.1 ml of 1M potassium phosphate buffer (pH 6.0 (25 ° C.)) and 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0 (25 ° C.)) 1 ml of enzyme activity measurement solution consisting of 0.02 ml of liquid and 0.88 ml of distilled water was preheated at 37 ° C. for 1.5 minutes in a quartz cell having a layer length of 1 cm, and interference check A bilirubin F (component is bilirubin) as a
（２）アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定法
アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定溶液（０．５ｍＭのＬ−アスコルビン酸、０．４５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む９０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５（２５℃）））１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で３０℃５分間予備加温した後、０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５（２５℃））で希釈した酵素液０．１ｍｌを混和して酵素反応を開始し、反応開始後１分後から５分後までの２４５ｎｍにおけるＬ−アスコルビン酸の吸光度差を測定する（Ａｓ）。盲検として１００℃で９０分間熱処理した同じ濃度の酵素液を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。この酵素液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位（１ユニット）は３０℃で１分間に１マイクロモルのＬ−アスコルビン酸を変化する酵素量、上記反応液中でのＬ−アスコルビン酸のミリモル吸光係数は１０として、Ａｓ−Ａｂより酵素活性を求める。
(2) Ascorbate oxidase activity measurement method Ascorbate oxidase activity measurement solution (90 mM sodium phosphate buffer (pH 5.5 (25 ° C.) containing 0.5 mM L-ascorbic acid, 0.45 mM ethylenediaminetetraacetic acid)) ) After pre-warming 1 ml in a quartz cell having a layer length of 1 cm for 5 minutes at 30 ° C.,
ＩＩ）２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０（２５℃））中０．１ｍｇ／ｍｌの酵素濃度で８０℃３０分間加熱処理した後の残存酵素活性を請求項１に記載の酵素活性測定法に従って測定するビリルビンオキシダーゼ活性及び／又はアスコルビン酸オキシダーゼ活性が、９０％以上の活性を保持することを特徴とする上記Ｉ）に記載の内胞子皮構成成分タンパク質含有組成物、 II) The method for measuring enzyme activity according to claim 1, wherein the residual enzyme activity after heat treatment at 80 ° C for 30 minutes at an enzyme concentration of 0.1 mg / ml in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0 (25 ° C)) The endospore skin component protein-containing composition according to I) above, wherein the bilirubin oxidase activity and / or ascorbate oxidase activity measured according to
ＩＩＩ）少なくともビリルビンオキシダーゼ活性を示す、バクテリアの内胞子皮構成成分タンパク質を含有するビリルビン酸化試薬、
ＩＶ）タンパク質が、バチラス・サチルスに属するバクテリアが生産するタンパク質である上記ＩＩＩ）に記載のビリルビン酸化試薬、
Ｖ）少なくともアスコルビン酸オキシダーゼ活性を示す、バクテリアの内胞子皮構成成分タンパク質を含有するアスコルビン酸酸化試薬、
ＶＩ）タンパク質が、バチラス・サチルスに属するバクテリアが生産するタンパク質である上記V）に記載のアスコルビン酸酸化試薬、
ＶＩＩ）上記Ｉ）又はＩＩ）に記載のタンパク質含有組成物を含有するビリルビン酸化試薬、
ＶＩＩＩ）上記Ｉ）又はＩＩ）に記載のタンパク質含有組成物を含有するアスコルビン酸酸化試薬、
ＩＸ）配列番号２に記載のタンパク質を含有するビリルビン酸化試薬、
Ｘ）配列番号２に記載のタンパク質を含有するアスコルビン酸酸化試薬、
ＸＩ）配列番号１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を含有するビリルビン酸化試薬、
ＸＩＩ）配列番号１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を含有するアスコルビン酸酸化試薬、
に関する。
III) A bilirubin oxidizing reagent containing bacterial endospore coat protein that exhibits at least bilirubin oxidase activity,
IV) The bilirubin oxidizing reagent according to the above III), wherein the protein is a protein produced by a bacterium belonging to Bacillus subtilis,
V) an ascorbic acid oxidizing reagent containing bacterial endospore coat constituent protein exhibiting at least ascorbic acid oxidase activity,
VI) The ascorbic acid oxidizing reagent according to the above V), wherein the protein is a protein produced by a bacterium belonging to Bacillus subtilis,
VII) a bilirubin oxidation reagent containing the protein-containing composition according to I) or II) above,
VIII) an ascorbic acid oxidizing reagent containing the protein-containing composition according to I) or II) above,
IX) a bilirubin oxidation reagent containing the protein of SEQ ID NO: 2,
X) an ascorbic acid oxidizing reagent containing the protein of SEQ ID NO: 2,
XI) a bilirubin oxidation reagent containing a protein encoded by the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1,
XII) an ascorbate oxidizing reagent containing a protein encoded by the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1
About.
本発明により、安定性がよいビリルビンオキシダーゼ及び／又はアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつタンパク質を利用した試料中のビリルビン及び／又はアスコルビン酸を酸化する試薬を提供でき、該試薬を用いた試料中のビリルビン及び／又はアスコルビン酸を酸化する方法を提供できる。その結果、長期保存可能な臨床診断用試薬を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a reagent that oxidizes bilirubin and / or ascorbic acid in a sample using a highly stable protein having bilirubin oxidase and / or ascorbate oxidase activity, and bilirubin in a sample using the reagent and A method for oxidizing ascorbic acid can be provided. As a result, a clinical diagnostic reagent that can be stored for a long period of time can be provided.
本願発明について、以下具体的に説明する。
本明細書において、単に「ビリルビン」と記載した場合は、直接型ビリルビン、間接型ビリルビン、及び総ビリルビンの全てを含む意味である。
本発明で使用しうる試料とは、ビリルビン及び／又はアスコルビン酸を含有するものであれば特に限定されないが、生体試料、例えば、血漿、血清、尿などを挙げる事ができる。
本発明のビリルビンオキシダーゼ活性とは、ビリルビンを基質とする酸化反応の触媒作用を指す。
また、本発明のアスコルビン酸オキシダーゼ活性とは、アスコルビン酸を基質とする酸化反応の触媒作用を指す。
The present invention will be specifically described below.
In the present specification, the simple description of “bilirubin” includes all of direct bilirubin, indirect bilirubin, and total bilirubin.
The sample that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it contains bilirubin and / or ascorbic acid, and examples thereof include biological samples such as plasma, serum, and urine.
The bilirubin oxidase activity of the present invention refers to the catalytic action of an oxidation reaction using bilirubin as a substrate.
The ascorbic acid oxidase activity of the present invention refers to a catalytic action of an oxidation reaction using ascorbic acid as a substrate.
本発明のビリルビンオキシダーゼ活性及び／又はアスコルビン酸オキシダーゼ活性は、後述したビリルビンオキシダーゼ活性の熱安定性及び／又はアスコルビン酸オキシダーゼ活性の熱安定性の測定条件において、それぞれ独立して、少なくとも８０度３０分熱処理後も８０％以上の活性を保持していることが好ましく、少なくとも８０度３０分熱処理後も８５％以上の活性を保持していることがさらに好ましく、少なくとも８０度３０分熱処理後も９０％以上の活性を保持していることが特に好ましく、少なくとも８０度３０分熱処理後も９５％以上の活性を保持していることが最も好ましい。
The bilirubin oxidase activity and / or ascorbate oxidase activity of the present invention is independently at least 80
本発明のビリルビンオキシダーゼ活性及び／又はアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつ内胞子皮構成成分は、バクテリアの内胞子皮構成成分であれば何ら限定されるものではないが、好ましくはバチラス属に属する微生物が生産する内胞子皮構成成分、さらに好ましくはバチラス・サチルスが生産する内胞子皮構成成分ＣｏｔＡが挙げられる。さらには、該ＣｏｔＡは、ビリルビンオキシダーゼ活性及び／又はアスコルビン酸オキシダーゼ活性を有するものであれば、遺伝子的に改変したものであっても良い。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましく、配列番号１に記載の遺伝子配列でコードされるタンパク質も大変に好ましい。 The endospore skin component having bilirubin oxidase activity and / or ascorbate oxidase activity of the present invention is not limited as long as it is a bacterial endospore skin component, but preferably a microorganism belonging to the genus Bacillus is produced. And an endospore coat component CotA produced by Bacillus subtilis. Furthermore, the CotA may be genetically modified as long as it has bilirubin oxidase activity and / or ascorbate oxidase activity. Further, a protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is also preferable, and a protein encoded by the gene sequence described in SEQ ID NO: 1 is very preferable.
本発明者らは、配列番号２に記載されたバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡ遺伝子がコードするタンパク質がビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつ事を見出した。 The present inventors have found that the protein encoded by the endospore coat component CotA gene of Bacillus subtilis described in SEQ ID NO: 2 has bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity.
以下に、本発明の酵素のビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ １．３．３．５）活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ １．１０．３．３）活性の測定法および理化学的性質を示す。尚、本発明で使用した実験に使用した試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業社製、国産化学社製、シグマアルドリッチ社製など市販で容易に入手できるものを使用した。 The measurement methods and physicochemical properties of the bilirubin oxidase (EC 1.3.3.5) activity and ascorbate oxidase (EC 1.10.3.3) activity of the enzyme of the present invention are shown below. The reagents used in the experiments used in the present invention were commercially available, such as those manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Kokusan Kagaku Co., and Sigma Aldrich unless otherwise specified.
＜酵素作用＞
ビリルビンを基質として用いたときの反応式は式１である。生成物のビリベルジンは、条件によって、ビリルビンオキシダーゼ及び／又は空気酸化によってさらに無色の物質に変換される場合もある。
Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ＋ Ｏ２ ＝＞ ｂｉｌｉｖｅｒｄｉｎ ＋ Ｈ２Ｏ （式１）
アスコルビン酸を基質として用いたときの反応式は式２である。
２ Ｌ−ａｓｃｏｒｂａｔｅ ＋ Ｏ２ ＝＞ ２ ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂａｔｅ ＋ ２ Ｈ２Ｏ （式２）
<Enzyme action>
The reaction formula when bilirubin is used as a substrate is Formula 1. Depending on the conditions, the product biliverdin may be further converted into a colorless substance by bilirubin oxidase and / or air oxidation.
Birubin + O 2 => bilivedin + H 2 O (Formula 1)
The reaction formula when ascorbic acid is used as a substrate is
2 L-ascorbate + O 2 => 2 dehydrosorbate + 2 H 2 O (Formula 2)
＜ビリルビンオキシダーゼ活性測定法＞
１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））０．１ｍｌ、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））で適当な濃度に希釈した酵素液０．０２ｍｌ、および蒸留水０．８８ｍｌからなる酵素活性測定溶液１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で３７℃１．５分間予備加温した後、基質として国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＦ（成分はビリルビン）を０．９％ＮａＣｌで２０ｍｇ／ｄｌに調製したものを２０μｌ添加して酵素反応を開始し、反応開始後１分後から２分後までの４５０ｎｍにおける基質の吸光度差を測定する（Ａｓ）。盲検として１００℃で９０分間熱処理した同じ濃度の酵素液を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。酵素活性１単位（１ユニット）は３７℃で１分間に１マイクロモルのビリルビンを変化する酵素量、上記反応液中でのビリルビンＦのミリモル吸光係数は３６として、Ａｓ−Ａｂより酵素活性を求める。
<Method for measuring bilirubin oxidase activity>
0.1 ml of 1M potassium phosphate buffer (pH 6.0 (25 ° C.)), 0.02 ml of enzyme solution diluted to an appropriate concentration with 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0 (25 ° C.)) , And 1 ml of enzyme activity measurement solution consisting of 0.88 ml of distilled water was preheated at 37 ° C. for 1.5 minutes in a quartz cell having a layer length of 1 cm, and then interference check A bilirubin F (component) of International Reagents Co., Ltd. as a substrate Is added 20 μl of 0.9% NaCl adjusted to 20 mg / dl, the enzyme reaction is started, and the difference in absorbance of the substrate at 450 nm from 1 minute to 2 minutes after the start of the reaction is measured ( As). As a blind test, the difference in absorbance is measured by performing the same operation using an enzyme solution of the same concentration that has been heat-treated at 100 ° C. for 90 minutes (Ab). Enzyme activity is determined from As-Ab, where 1 unit of enzyme activity (1 unit) is the amount of enzyme that changes 1 micromole of bilirubin per minute at 37 ° C., and the millimolar extinction coefficient of bilirubin F in the reaction solution is 36. .
＜アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定法＞
アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定溶液（０．５ｍＭのＬ−アスコルビン酸、０．４５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む９０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５（２５℃）））１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で３０℃５分間予備加温した後、０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５（２５℃））で適当な濃度に希釈した酵素液０．１ｍｌを混和して酵素反応を開始し、反応開始後１分後から５分後までの２４５ｎｍにおけるＬ−アスコルビン酸の吸光度差を測定する（Ａｓ）。盲検として１００℃で９０分間熱処理した同じ濃度の酵素液を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。この酵素液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位（１ユニット）は３０℃で１分間に１マイクロモルのＬ−アスコルビン酸を変化する酵素量、上記反応液中でのＬ−アスコルビン酸のミリモル吸光係数は１０として、Ａｓ−Ａｂより酵素活性を求める。
＜ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡのビリルビンオキシダーゼ比活性＞
上記のビリルビンオキシダーゼ活性測定法において、国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＣ（成分はジタウロビリルビン）に対して２．５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇで、Ｆ−ビリルビンに対して１３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。
＜ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡのアスコルビン酸オキシダーゼ比活性＞
上記のアスコルビン酸オキシダーゼ活性測定法において５．２μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。
<Ascorbate oxidase activity measurement method>
1 ml of ascorbate oxidase activity measurement solution (90 mM sodium phosphate buffer (pH 5.5 (25 ° C.)) containing 0.5 mM L-ascorbic acid, 0.45 mM ethylenediaminetetraacetic acid) quartz cell with a layer length of 1 cm After preheating at 30 ° C for 5 minutes, 0.1 ml of enzyme solution diluted to an appropriate concentration with 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.5 (25 ° C)) containing 0.05% BSA is mixed. The enzyme reaction is started, and the absorbance difference of L-ascorbic acid at 245 nm from 1 minute to 5 minutes after the start of the reaction is measured (As). As a blind test, the difference in absorbance is measured by performing the same operation using an enzyme solution of the same concentration that has been heat-treated at 100 ° C. for 90 minutes (Ab). The enzyme activity is determined from the difference in absorbance (As-Ab) between the absorbance (As) using this enzyme solution and the absorbance (Ab) in the blind. 1 unit of enzyme activity (1 unit) is the amount of enzyme that changes 1 micromole of L-ascorbic acid per minute at 30 ° C., and the millimolar extinction coefficient of L-ascorbic acid in the above reaction solution is 10, As-Ab Determine enzyme activity.
<Specific activity of bilirubin oxidase of endospore skin component CotA of Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity>
In the above-described method for measuring bilirubin oxidase activity, 2.5 μmol / min / mg for interference check A bilirubin C (component is ditaurobilirubin) of International Reagents Co., Ltd. and 13 μmol / min / mg for F-bilirubin. Met.
<Ascorbate oxidase specific activity of endospore skin component CotA of Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity>
In the above ascorbate oxidase activity measurement method, it was 5.2 μmol / min / mg.
＜タンパク質濃度測定法＞
タンパク質濃度はバイオラッド社のプロテインアッセイキットを用いて使用説明書記載の方法に従って測定し、ＢＳＡをスタンダードとして算出した。
<Protein concentration measurement method>
The protein concentration was measured according to the method described in the instruction manual using a protein assay kit manufactured by Bio-Rad, and calculated using BSA as a standard.
＜ビリルビンオキシダーゼ活性の熱安定性＞
酵素を０．１ｍｇ／ｍｌになるように２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５（２５℃））中に溶解し、各温度で３０分間熱処理した後のビリルビンオキシダーゼの残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。図１中○は本発明のビリルビンオキシダーゼ、●はビリルビンオキシダーゼ活性をもつアクレモニウム由来アスコルビン酸オキシダーゼ（旭化成ファーマ社製）、△はＴｒａｃｈｙｄｅｒｍａ ｔｓｕｎｏｄａｅ由来ビリルビンオキシダーゼ（タカラバイオ社製）を示す。図１に示すとおり、本発明のビリルビンオキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスが生産する内胞子皮構成成分ＣｏｔＡは少なくとも８０度３０分熱処理後も９５％以上の活性を保持していた。
<Thermal stability of bilirubin oxidase activity>
The enzyme activity was determined by dissolving the enzyme in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5 (25 ° C.)) to a concentration of 0.1 mg / ml and heat-treating it at each temperature for 30 minutes. Measured according to the method. In FIG. 1, ○ indicates bilirubin oxidase of the present invention, ● indicates acremonium-derived ascorbate oxidase (manufactured by Asahi Kasei Pharma) having bilirubin oxidase activity, and Δ indicates Trachyderma tsunodae-derived bilirubin oxidase (manufactured by Takara Bio). As shown in FIG. 1, the endospore skin constituent component CotA produced by Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity of the present invention retained an activity of 95% or more even after heat treatment at least at 80 ° C. for 30 minutes.
＜アスコルビン酸オキシダーゼ活性の熱安定性＞
酵素を０．１ｍｇ／ｍｌになるように２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５（２５℃））中に溶解し、80℃で図２の横軸の時間熱処理した後のアスコルビン酸オキシダーゼの残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。図２に示すとおり、本発明のアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスが生産する内胞子皮構成成分ＣｏｔＡは少なくとも８０度３０分熱処理後も９０％以上の活性を保持していた。
<Thermal stability of ascorbate oxidase activity>
Residue of ascorbate oxidase after the enzyme was dissolved in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5 (25 ° C.)) to a concentration of 0.1 mg / ml and heat-treated at 80 ° C. for the time on the horizontal axis of FIG. The activity was measured according to the enzyme activity measurement method. As shown in FIG. 2, the endospore skin constituent component CotA produced by Bacillus subtilis having the ascorbate oxidase activity of the present invention retained 90% or more of the activity even after heat treatment at least at 80 ° C. for 30 minutes.
＜電子受容体の影響＞
１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））０．１ｍｌ、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））で適当に希釈した酵素液０．０２ｍｌ、１ｍＭの表１に挙げた各電子受容体０．１ｍｌおよび蒸留水０．７８ｍｌからなる酵素活性測定溶液１ｍｌを使用して上記酵素活性測定法と同じ方法で酵素反応速度を求めた。基質として国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＦまたはビリルビンＣを０．９％ＮａＣｌで２０ｍｇ／ｄｌに調製したものを使用した。本反応液中でのビリルビンCのミリモル吸光係数は７４とした。結果を表１に示した。
<Effect of electron acceptor>
0.1M of 1M potassium phosphate buffer (pH 6.0 (25 ° C.)), 0.02 ml of enzyme solution appropriately diluted with 0.1M potassium phosphate buffer (pH 6.0 (25 ° C.)), 1 mM The enzyme reaction rate was determined by the same method as the above enzyme activity measurement method using 1 ml of enzyme activity measurement solution consisting of 0.1 ml of each electron acceptor listed in Table 1 and 0.78 ml of distilled water. As the substrate, interference check A bilirubin F or bilirubin C of International Reagents Co., Ltd. prepared with 0.9% NaCl to 20 mg / dl was used. The millimolar extinction coefficient of bilirubin C in this reaction solution was 74. The results are shown in Table 1.
＜見かけのＫｍとＶmax＞
国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＣおよびビリルビンＦに対する見かけのＫｍとＶmaxを測定した。見かけのＫｍとＶmaxを測定するための測定溶液は１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））０．１ｍｌ、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））で適当に希釈した酵素液０．０２ｍｌ、そして最終液量が１ｍｌになるように蒸留水で調製して使用した。国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＣまたはビリルビンＦの測定溶液中の濃度を、表２に示した各Ｋｍ値の１／１０倍から１０倍の間で５つ以上の異なる濃度になるように調製して、３７℃における本発明の酵素の各基質に対する、反応開始後１分目から１分間の反応速度を測定し、ラインウェーバー・バーク逆数プロットにより各見かけのＫｍ値とＶmax値を算出した。結果を表２に示した。本発明の酵素は、本条件下、ビリルビンＣよりビリルビンＦに高いＶmaxをもつ事が分かった。
<Apparent Km and Vmax>
Apparent Km and Vmax for interference check A bilirubin C and bilirubin F of International Reagent Co., Ltd. were measured. The measurement solution for measuring the apparent Km and Vmax was 0.1 ml of 1M potassium phosphate buffer (pH 6.0 (25 ° C.)), 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0 (25 ° C.)). 0.02 ml of the enzyme solution appropriately diluted in (1) and the final solution volume was adjusted to 1 ml with distilled water and used. The concentration of the interference check A bilirubin C or bilirubin F of International Reagents Co., Ltd. in the measurement solution is set to 5 or more different concentrations between 1/10 to 10 times the Km values shown in Table 2. Measure the reaction rate from 1 minute to 1 minute after the start of the reaction for each substrate of the enzyme of the present invention at 37 ° C., and calculate the apparent Km value and Vmax value by the Line Weber-Burk inverse plot did. The results are shown in Table 2. The enzyme of the present invention was found to have a higher Vmax in bilirubin F than bilirubin C under these conditions.
＜分子量＞
５８，７５７（アミノ酸一次配列からの計算値）。６０，０００（SDS-PAGEによる測定値）。
＜至適ｐＨ＞
国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＣおよびビリルビンＦに対する至適ｐＨを求めた。至適ｐＨを測定するための測定溶液は１Ｍの各緩衝液０．１ｍｌ、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））で適当に希釈した酵素液０．０２ｍｌ、および蒸留水０．７８ｍｌからなる酵素活性測定溶液１ｍｌを使用して上記酵素活性測定法と同じ方法で酵素反応速度を求めた。ｐＨ変化に伴うビリルビンＣおよびビリルビンＦのミリモル吸光係数の変化は考慮しなかった。図３に、緩衝液として、ｐＨ２．６からｐＨ３．４の範囲はグリシン−塩酸緩衝液（図中○印）、ｐＨ３．４からｐＨ５．９の範囲は酢酸−水酸化ナトリウム緩衝液（図中△印）、ｐＨ５．９からｐＨ６．８の範囲はクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（図中□印）、ｐＨ６．３からｐＨ７．４の範囲はリン酸カリウム緩衝液（図中●印）、ｐＨ７．３からｐＨ８．７の範囲はトリス−塩酸緩衝液（図中▲印）、ｐＨ８．４からｐＨ１１．０の範囲はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（図中■印）、を使用した場合のビリルビンＣに対する最大活性を１００％とした相対活性を示した。本発明の酵素のビリルビンＣに対する至適ｐＨはｐＨ３からｐＨ４であった。
<Molecular weight>
58,757 (calculated value from primary amino acid sequence). 60,000 (measured value by SDS-PAGE).
<Optimum pH>
The optimum pH for interference check A bilirubin C and bilirubin F of International Reagents Co., Ltd. was determined. The measurement solution for measuring the optimum pH was 0.1 ml of 1M buffer solution, 0.02 ml of enzyme solution appropriately diluted with 0.1M potassium phosphate buffer solution (pH 6.0 (25 ° C.)), and The enzyme reaction rate was determined by the same method as the above enzyme activity measurement method using 1 ml of the enzyme activity measurement solution consisting of 0.78 ml of distilled water. Changes in the millimolar extinction coefficient of bilirubin C and bilirubin F with changes in pH were not considered. In FIG. 3, as the buffer, the pH 2.6 to pH 3.4 range is glycine-hydrochloric acid buffer (marked with a circle in the figure), and the pH 3.4 to pH 5.9 range is acetic acid-sodium hydroxide buffer (in the figure). Δ mark), pH 5.9 to pH 6.8 range is citrate-sodium hydroxide buffer (□ in the figure), pH 6.3 to pH 7.4 range is potassium phosphate buffer (● in the figure) In the range from pH 7.3 to pH 8.7, Tris-hydrochloric acid buffer solution (marked with ▲ in the figure) was used, and in the range of pH 8.4 to pH 11.0, glycine-sodium hydroxide buffer solution (marked with ■ in the figure) was used. The relative activity with respect to bilirubin C was 100%. The optimum pH of the enzyme of the present invention for bilirubin C was pH 3 to
図４に、緩衝液として、ｐＨ２．６からｐＨ３．４の範囲はグリシン−塩酸緩衝液（図中○印）、ｐＨ３．４からｐＨ５．９の範囲は酢酸−水酸化ナトリウム緩衝液（図中△印）、ｐＨ５．９からｐＨ６．８の範囲はクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（図中□印）、ｐＨ６．３からｐＨ７．４の範囲はリン酸緩衝液（図中●印）、ｐＨ７．３からｐＨ８．７の範囲はトリス−塩酸緩衝液（図中▲印）、ｐＨ８．４からｐＨ１１．０の範囲はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（図中■印）、を使用した場合のビリルビンＦに対する最大活性を１００％とした相対活性を示した。本発明の酵素のビリルビンＦに対する至適ｐＨはｐＨ６からｐＨ８であった。
In FIG. 4, as the buffer solution, the pH 2.6 to pH 3.4 range is glycine-hydrochloric acid buffer solution (marked with a circle in the figure), and the pH 3.4 to pH 5.9 range is acetic acid-sodium hydroxide buffer solution (in the figure). △ mark), pH 5.9 to pH 6.8 range is citrate-sodium hydroxide buffer (□ in the figure), pH 6.3 to pH 7.4 range is phosphate buffer (● in the figure), When pH 7.3 to pH 8.7 is in use of Tris-hydrochloric acid buffer (marked with ▲ in the figure), and pH 8.4 to pH 11.0 is in the range of glycine-sodium hydroxide buffer (marked with ■ in the figure). The relative activity with respect to 100% of the maximum activity of bilirubin F was shown. The optimum pH of the enzyme of the present invention for bilirubin F was
本発明の配列番号２のアミノ酸配列１から５１５で表されるビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡにおいて、その配列番号２のアミノ酸配列の１から５１５で表記されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側はアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含む場合であってもよく、そのアミノ酸残基としてはシグナルペプチドまたはＴ７タグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、Ｔｒｘタグ、ＣＢＤタグ、ＤｓｂＡタグ、ＧＳＴタグ、Ｎｕｓタグなどが挙げられる。 In the DNA encoding the amino acid sequence of the endospore coat component CotA of Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity represented by amino acid sequences 1 to 515 of SEQ ID NO: 2 of the present invention, The N-terminal side and C-terminal side of the amino acid sequence represented by 1 to 515 of the amino acid sequence may include an amino acid residue or a polypeptide residue, and the amino acid residue includes a signal peptide or a T7 tag, Examples include His tag, S tag, Trx tag, CBD tag, DsbA tag, GST tag, Nus tag and the like.
さらに、本発明のビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを構成するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の１から５１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号２のアミノ酸配列の１から５１５のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したものの均等物も含まれる。 Furthermore, the amino acid sequence constituting the endospore coat component CotA of Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity of the present invention consists of the amino acid sequence represented by 1 to 515 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. An amino acid sequence substantially consisting of a part of the amino acid sequence 1 to 515 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a sequence of some amino acids not involved in the expression of the enzyme activity, which expresses the same effect as the expression of the enzyme activity by the polypeptide The equivalent of what was mutated, deleted or added to is also included.
本発明の配列番号２のアミノ酸配列１から５１５で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、そのＮ末端側およびＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであれば良い。 The DNA encoding the amino acid sequence represented by amino acid sequence 1 to 515 of SEQ ID NO: 2 of the present invention contains an amino acid residue or polypeptide residue on the N-terminal side and C-terminal side of each amino acid in the amino acid sequence. Any DNA consisting of any one of the corresponding series of codons may be used.
さらに、本発明のビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼをもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡをコードするＤＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列１から５１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、アミノ酸配列１から５１５中の一部分からなる実質的になるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよく、また酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したものの均等物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであっても良い。 Furthermore, DNA encoding the endospore coat component CotA of Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase according to the present invention is a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by amino acid sequences 1 to 515 of SEQ ID NO: 2. It may be DNA encoding a substantially amino acid sequence consisting of a part of amino acid sequences 1 to 515 that expresses the same effect as that of enzyme activity expression, and a part of amino acid sequences not involved in enzyme activity expression It may be DNA encoding the amino acid sequence of the equivalent of mutated, deleted or added.
ＤＮＡの供与体である微生物としては、ビリルビンオキシダーゼ活性及び／又はアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつ内胞子皮構成成分を生産するバクテリアであれば、なんら限定されるものではないが、好ましくはバチラス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＡＴＣＣ ２３８５７）が挙げられる。 The microorganism that is a donor of DNA is not limited as long as it is a bacterium that produces an endospore skin component having bilirubin oxidase activity and / or ascorbate oxidase activity, but preferably Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis, ATCC 23857).
本発明のビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼをもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡをコードするＤＮＡを組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＥＴ−３ａ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−３２ａなどのｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、酵母特にサッカロマイセス・セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用できる。このようなベクターを、ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡをコードするＤＮＡの切断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成し、ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡをコードするＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合させてビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡをコードするＤＮＡを目的のベクターに組み込むことができる。 As a vector into which DNA encoding the endospore coat component CotA of Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase of the present invention is used for gene recombination from a phage or plasmid that can autonomously grow in the host microorganism. As the phage vector, for example, when a microorganism belonging to Escherichia coli is used as a host microorganism, λgt · λC, λgt · λB, and the like can be used. Moreover, as a plasmid vector, for example, when Escherichia coli is used as a host microorganism, pET vectors (Novagen) such as plasmids pET-3a, pET-11a, and pET-32a, or pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13 PUC18, pUC19, pUC118, pIN I, Bluescript KS +, pWH1520, pUB110, pKH300PLK when Bacillus subtilis is used as the host, pIJ680, pIJ702 when using actinomycetes as the host, and yeast, particularly Saccharomyces cerevisiae YRp7, pYC1, YEp13, etc. can be used. Restriction of such a vector to produce the same end as the DNA produced by the restriction enzyme used to cleave the DNA encoding the endospore coat component CotA of Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity. A vector fragment is prepared by cleaving with an enzyme, and a DNA fragment encoding a Bacillus subtilis endospore coat component CotA having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity is linked to the vector fragment by a DNA ligase enzyme according to a conventional method. Then, DNA encoding Bacillus subtilis endospore coat component CotA having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity can be incorporated into the target vector.
プラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１ｔｒｘＢ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃｌ、エシェリヒア・コリ ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｏｒｉｇａｍｉ、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが利用できる。また、微生物宿主がバチラス属に属する微生物の場合、バチラス・サチリス、バチラス・メガテリウムなど、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ ＩＮＶＳＣ１などが使用できる。 As the host microorganism for transferring the plasmid, it is sufficient that the recombinant DNA can be stably and autonomously propagated. For example, when the host microorganism is a microorganism belonging to Escherichia coli, Escherichia coli BL21, Escherichia coli BL21 (DE3), Escherichia coli BL21trxB, Escherichia coli Rosetta (DE3), Escherichia coli Rosetta, Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS, Escherichia coli Rosetta (DE3) pLac, Escherichia coli Luis et Kori Origami, Escherichia coli Origami, Escherichia coli Tuner, Escherichia coli DH1, Escherry Hia coli JM109, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600, etc. can be used. In addition, when the microorganism host is a microorganism belonging to the genus Bacillus, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, etc., a microorganism belonging to actinomycetes, Streptomyces lividans TK24, etc., a microorganism belonging to Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae INVSC1 can be used.
また、本発明のビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡは公知の遺伝子操作手段により、本来の反応を触媒する性質を損なわないペプチドの変異をなしてもよく、このような変異体遺伝子は、本発明のビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は前出の部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られる。かくして取得された人工変異ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡ遺伝子をベクターに挿入して宿主微生物に移入させることによって変異体ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを発現させることが可能であり、優れた性質を有する変異体ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを製造することも可能である。 In addition, the endospore coat component CotA of Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity according to the present invention can be mutated by a known genetic manipulation means without damaging the property of catalyzing the original reaction. Well, such a mutant gene means an artificial mutant gene produced by genetic engineering techniques from the endospore coat component CotA gene of Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity of the present invention, This artificially mutated gene can be obtained using the above-mentioned site-specific mutation method or various genetic engineering methods such as replacement of a specific DNA fragment of the target gene with artificially mutated DNA. Mutant bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity by inserting the CotA gene of the endospore skin component of Bacillus subtilis having artificial mutant bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity thus obtained into a vector and transferring it to the host microorganism It is possible to express the endospore coat component CotA of Bacillus sacilli having an excellent property, and to produce the CosA component of the endospore coat of Bacillus sacilli having excellent properties of bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity. It is also possible to do.
また、形質転換微生物により該ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを製造するに当たっては、該形質転換微生物を栄養培地で培養して菌体内または培養液中に該ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡおよび／または適当な界面活性剤などを添加して該ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡの水溶液を濃縮するか、または濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度の良い該ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを得ることができる。 In addition, in producing the Bacillus subtilis endospore constituent component CotA having the bilirubin oxidase activity and the ascorbate oxidase activity by the transformed microorganism, the transformed microorganism is cultured in a nutrient medium and cultured in the bacterial body or in the culture solution. To produce the endospore coat component CotA of Bacillus subtilis having the bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity, and after completion of the culture, the resulting culture is collected by means such as filtration or centrifugation, Subsequently, the cells are destroyed by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme, and if necessary, EDTA and / or an appropriate surfactant is added to have the bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity. Bacillus subtilis endospore skin component Co The aqueous solution of A is concentrated or processed by adsorption chromatography such as ammonium sulfate fractionation, gel filtration, affinity chromatography and ion exchange chromatography without concentrating, and the bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity with high purity are processed. It is possible to obtain CotA, an endospore skin component of Bacillus subtilis having
形質転換微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。培養温度は微生物が発育し、ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは、１０から４５℃程度、さらに好ましくは１５から４２℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡをもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２から４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡをもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくはｐＨ６から８程度である。 Culture conditions for transformed microorganisms may be selected in consideration of their nutritional physiological properties. Usually, liquid culture is used in many cases, but industrially, deep aeration and agitation culture is advantageous. is there. As a nutrient source for the medium, those commonly used for culturing microorganisms can be widely used. The culture temperature can be appropriately changed within the range in which microorganisms grow and produce Bacillus subtilis endospore component CotA having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity. In the case of Escherichia coli, preferably from 10 It is about 45 ° C, more preferably about 15 to 42 ° C. Although the culture conditions differ slightly depending on the conditions, the timing of reaching the maximum yield of the Bacillus subtilis endospore coat component CotA having the Bacillus subtilis endospore coat component CotA having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity was estimated. In the case of Escherichia coli, it is usually about 12 to 48 hours. The pH of the medium can be changed as appropriate within the range in which the bacteria grow and produce Bacillus subtilis endospore coat component CotA having Bacillus subtilis endospore coat component CotA having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity. In the case of Escherichia coli, the pH is preferably about 6 to 8.
本発明の酵素は主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すれば良い。抽出法を例示すればまず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの菌体破砕手段を適宜選択組み合わせて、粗製の本発明の酵素液または本発明の酵素の封入体を得る。 The enzyme of the present invention is mainly contained and accumulated in the fungus body and may be extracted from the fungus body. To illustrate the extraction method, first, the culture is solid-liquid separated, and the obtained wet cells are dispersed in a solution such as phosphate buffer or Tris-HCl buffer, lysozyme treatment, ultrasonic treatment, French press treatment, By appropriately selecting and combining cell disruption means such as dynomill treatment, a crude enzyme solution of the present invention or an enzyme inclusion body of the present invention is obtained.
封入体の本発明の酵素を可溶化する方法として、ｉｎ ｖｉｖｏでは大腸菌シャペロン遺伝子を共役発現して可溶性度を増大する方法、コールドショックプロテインベクター（タカラバイオ社製）を用いる方法、形質転換体のペリプラズム領域に発現する方法などがある。ｉｎ ｖｉｔｒｏではメルカプトエタノール、尿素やグアニジンのような変性剤で封入体を完全にアンフォールディングした後、透析あるいは希釈により変性剤を除去してリフォールディングできる。この際、リフォールディング効率を上げるためにシクロアミロース、シクロデキストリン、界面活性剤、グルタチオン、アルギニンなどを使用しても良い。 Methods for solubilizing the inclusion body of the enzyme of the present invention include, in vivo, a method of increasing the solubility by conjugating the E. coli chaperone gene, a method using a cold shock protein vector (manufactured by Takara Bio Inc.), There is a method of expressing in the periplasm region. In vitro, after the inclusion body is completely unfolded with a denaturing agent such as mercaptoethanol, urea, or guanidine, the denaturing agent can be removed by dialysis or dilution to be refolded. At this time, cycloamylose, cyclodextrin, surfactant, glutathione, arginine or the like may be used to increase the refolding efficiency.
粗製の本発明の酵素液から公知のタンパク質や酵素などの単離、精製手段を用いて精製酵素を得る。例えば、粗製の本発明の酵素液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩などによる塩析法などを適用して目的酵素を沈殿させ、回収する。さらに、この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法を適当に組み合わせることにより目的酵素の精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。 A purified enzyme is obtained from the crude enzyme solution of the present invention by means of isolation and purification of known proteins and enzymes. For example, the target enzyme is precipitated and recovered by applying a fractional precipitation method using an organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, or a salting out method using ammonium sulfate, sodium chloride, or the like to the crude enzyme solution of the present invention. In addition, after performing dialysis and isoelectric precipitation of this precipitate as necessary, column chromatography using an ion exchanger, gel filter agent, adsorbent, etc. until a single band is shown by electrophoresis or the like Purify by etc. Moreover, when the purification degree of a target enzyme increases by combining these methods appropriately, it can carry out combining suitably.
これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、界面活性化剤などを加え、あるいは加えることなく、限外濾過濃縮、凍結乾燥などの方法により、液状または固形のビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５から１０％程度添加しても良い。 Enzymes obtained by these methods can be used as stabilizers in the form of liquid or lyophilized by methods such as ultrafiltration concentration and lyophilization with or without the addition of various salts, sugars, proteins, lipids, surfactants, etc. A Bacillus subtilis endospore coat component CotA having solid bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity can be obtained, and may be appropriately lyophilized. In this case, saccharose, mannitol, salt Alternatively, albumin or the like may be added at about 0.5 to 10%.
本発明のビリルビンオキシダーゼを用いたビリルビン酸化試薬及び方法とは、ビリルビンオキシダーゼの作用により試料中ビリルビンを酸化する試薬、及び該酸化によって変化するビリルビンの光学的変化によりビリルビンを定量する安定性が高い試薬及び方法である。その結果、特に本発明のビリルビンオキシダーゼを液状試薬に使用すれば大幅な試薬の安定性の向上が見込まれる。 The bilirubin oxidation reagent and method using the bilirubin oxidase of the present invention are a reagent that oxidizes bilirubin in a sample by the action of bilirubin oxidase, and a reagent that has high stability for quantifying bilirubin by optical change of bilirubin that changes by the oxidation And method. As a result, if the bilirubin oxidase of the present invention is used as a liquid reagent, a significant improvement in reagent stability is expected.
本発明のアスコルビン酸オキシダーゼを用いたアスコルビン酸酸化試薬及び方法とは、アスコルビン酸オキシダーゼの作用により試料中アスコルビン酸を酸化する試薬及び方法である。特に本発明のアスコルビン酸オキシダーゼを液状試薬に使用すれば大幅な試薬の安定性の向上が見込まれる。 The ascorbate oxidizing reagent and method using the ascorbate oxidase of the present invention are a reagent and method for oxidizing ascorbic acid in a sample by the action of ascorbate oxidase. In particular, if the ascorbate oxidase of the present invention is used as a liquid reagent, a significant improvement in reagent stability is expected.
本発明の酵素を含有するキットとしては、ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡをもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを含有するキットであれば特に限定されないが、例えば、ビリルビン測定試薬が挙げられる。また、試料中及び／又は試薬中のビリルビン及び／又はアスコルビン酸によって測定値が干渉されうるキットにおいて、ビリルビン及び／又はアスコルビン酸による干渉を回避するために本発明の酵素を含有したキットであってもよい。 The kit containing the enzyme of the present invention is a kit containing Bacillus subtilis endospore skin component CotA having Bacillus subtilis endospore skin component CotA having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity. Although it does not specifically limit, For example, a bilirubin measuring reagent is mentioned. Further, in the kit in which the measurement value can be interfered by bilirubin and / or ascorbic acid in the sample and / or reagent, the kit contains the enzyme of the present invention in order to avoid interference by bilirubin and / or ascorbic acid. Also good.
これらの試薬やキットは液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品、又は液状品の乾燥品（加熱乾燥及び／又は風乾及び／又は減圧乾燥等による）として提供できる。液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品が好ましく、液状品、液状品の凍結乾燥品がより好ましく、液状品が最も好ましい。別の態様として、液状品の凍結物が好ましい場合もある。さらに別の態様としては、液状品の凍結乾燥が好ましい場合もある。 These reagents and kits can be provided as liquid products, frozen products of liquid products, freeze-dried products of liquid products, or dried products of liquid products (by heat drying and / or air drying and / or vacuum drying, etc.). Liquid products, liquid frozen products, and liquid freeze-dried products are preferred, liquid products and liquid freeze-dried products are more preferred, and liquid products are most preferred. In another embodiment, a frozen liquid product may be preferable. As yet another aspect, lyophilization of a liquid product may be preferred.
本発明のビリルビンオキシダーゼと公知のビリルビンオキシダーゼの性質を比較して表３に示す。本発明のビリルビンオキシダーゼは同一反応を触媒する公知の酵素とは性質の異なる新規な酵素であり、特に公知の酵素より高い安定性を示す。 Table 3 compares the properties of the bilirubin oxidase of the present invention and known bilirubin oxidase. The bilirubin oxidase of the present invention is a novel enzyme having properties different from those of known enzymes that catalyze the same reaction, and particularly exhibits higher stability than known enzymes.
尚、本発明の内胞子皮構成成分タンパク質と、特開昭６１−２０９５８７号公報に記載のタンパク質等について、アミノ酸配列（特にＮ末端）、核酸配列などを比較することは当業者であれば容易に行える。また、その他の酵素学的性質、物理化学的性質などで比較してもよい。 In addition, it is easy for those skilled in the art to compare the amino acid sequence (particularly the N-terminal), the nucleic acid sequence, etc. of the endospore coat constituent protein of the present invention and the protein described in JP-A-61-209588. It can be done. Further, other enzymological properties and physicochemical properties may be compared.
本発明を実施例、参考例、製剤例および試験例に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の例に限定されることはない。 The present invention will be described based on Examples, Reference Examples, Formulation Examples and Test Examples, but the scope of the present invention is not limited to the following examples.
［実施例１］
＜培養＞
バチラス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＡＴＣＣ ２３８５７）はＡＴＣＣの製品案内書に従い次のような培地で培養した；１Ｌあたり、ニュートリエントブロス２３ｇ、ポテト抽出液２０ｍｌ。該培地をオートクレーブ滅菌（１２１度１５分）してバチラス・サチルスを接種し、２６度で好気的に３２時間培養した。培養終了後、培養物を７，０００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。
[Example 1]
<Culture>
Bacillus subtilis (ATCC 23857) was cultured in the following medium according to ATCC product guide; 23 g of nutrient broth and 20 ml of potato extract per liter. The medium was autoclaved (121
［実施例２］
＜ＤＮＡの抽出＞
実施例１で培養したバチラス・サチルスの菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１５％シュークロースを含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液で３７℃、１０分処理した後、ＳＤＳを最終濃度０．２５％になるよう添加して菌体を溶解した。さらに等量のフェノール／クロロホルム＝１：１混合液を加え、３０分攪拌した後、１２，０００ｒｐｍで１５分遠心分離処理をして水層を回収した。回収した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を混合後、２倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムＤＮＡを、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（ＴＥバッファー）２０ｍｌに溶解し、２０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを２００μｌ加え、３７℃で１時間保温し、混在しているＲＮＡを分解した。次いで、等量のフェノール／クロロホルム混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に１０分の１量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムＤＮＡを分離した。この染色体を５０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層２０ｍｌに３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌとエタノール５０ｍｌを加え、撹拌後−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を７５％ エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりバチラス・サチルスのＤＮＡ標品約１０ｍｇを得た。
[Example 2]
<Extraction of DNA>
The Bacillus subtilis cells cultured in Example 1 were treated with a 1 mg / ml lysozyme solution containing 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0), 50 mM EDTA, and 15% sucrose at 37 ° C. for 10 minutes, and then SDS. Was added to a final concentration of 0.25% to dissolve the cells. Further, an equal amount of a phenol / chloroform = 1: 1 mixed solution was added, stirred for 30 minutes, and then centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes to recover the aqueous layer. A 1/10 volume of 3M sodium acetate (pH 5.5) was mixed with the recovered aqueous layer, and then twice the amount of ethanol was gently overlaid, and the genomic DNA was wrapped around a glass rod and separated. The separated genomic DNA is dissolved in 20 ml of 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0), 1 mM EDTA aqueous solution (TE buffer), 200 μl of 20 mg / ml RNase A is added, and the mixture is kept at 37 ° C. for 1 hour and mixed. RNA was degraded. Next, an equal amount of a phenol / chloroform mixed solution was added, and the mixture was treated in the same manner as described above to separate the aqueous layer. One-tenth volume of 3M sodium acetate (pH 5.5) and twice the volume of ethanol were added to the collected aqueous layer, and genomic DNA was separated once again by the method described above. This chromosome was dissolved in 50 ml of TE (10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)), and 20 ml of a 1: 1 mixture of TE saturated phenol and chloroform was added. After suspending, the same centrifugation was repeated, and the upper layer was transferred again to another container. 2 ml of 3M sodium acetate buffer (pH 5.5) and 50 ml of ethanol are added to 20 ml of the separated upper layer, and after stirring, cooled at -70 ° C. for 5 minutes and then centrifuged (2,000 G, 4 ° C., 15 minutes). The precipitated chromosome was washed with 75% ethanol and dried under reduced pressure. About 10 mg of Bacillus subtilis DNA preparation was obtained by the above operation.
［実施例３］
＜ＰＣＲ法による配列番号１に示す遺伝子の増幅＞
ＰＣＲに用いたプライマーは次のとおりである。センス：５’−TCA TGT AGA TCT TGT GTG AGC ATA AAA AGC AGC TCC−３’、アンチセンス：５’−CTA TAG TAC TAG TTT GGA AAA TTT AG−３’。ＰＣＲ反応溶液組成は、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ、１０倍濃縮のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液５μｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム２μｌ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ７．５μｌ、１０１μｇ／ｍｌ バチラス・サチルスのＤＮＡ １０μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌ センスプライマー５μｌ、アンチセンスプライマー５μｌ、蒸留水１４．５μｌからなる。ＰＣＲ反応条件は、（１）９８度１５秒、（２）６５度２秒、（３）７４度３０秒、（１）から（３）の３０回繰り返し、であった。
[Example 3]
<Amplification of gene shown in SEQ ID NO: 1 by PCR method>
The primers used for PCR are as follows. Sense: 5'-TCA TGT AGA TCT TGT GTG AGC ATA AAA AGC AGC TCC-3 ', Antisense: 5'-CTA TAG TAC TAG TTT GGA AAA TTT AG-3'. The composition of the PCR reaction solution was as follows: 1 μl of KOD DNA polymerase, 5 μl of buffer attached to 10-fold concentrated KOD DNA polymerase, 2 μl of 1 mM magnesium chloride, 7.5 μl of 0.2 mM dNTP, 101 μg / ml DNA of Bacillus subtilis 10 μl, 10 pmol / μl It consists of 5 μl of sense primer, 5 μl of antisense primer, and 14.5 μl of distilled water. PCR reaction conditions were (1) 98
［実施例４］
＜ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡ発現プラスミドの構築１＞
実施例３で増幅したＰＣＲ産物はＳｐｅＩとＢａｍＨＩで切断して精製し、これをｐＥＴ−２１ａのＮｈｅＩとＢａｍＨＩの切断部位に挿入し、ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡ遺伝子が連結されたプラスミドを構築した。構築されたプラスミドは定法によってエシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
[Example 4]
<Construction 1 of a Bacillus subtilis endospore coat component CotA expression plasmid having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity 1>
The PCR product amplified in Example 3 was purified by digestion with SpeI and BamHI, and this was inserted into the NheI and BamHI cleavage sites of pET-21a, and among the Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity. A plasmid in which the spore skin component CotA gene was linked was constructed. The constructed plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) by a conventional method.
［実施例５］
＜ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡ発現プラスミドの構築２＞
実施例３で増幅したＰＣＲ産物はＳｐｅＩとＢａｍＨＩで切断して精製し、これをｐＷＨ１５２０のＳｐｅＩとＢａｍＨＩの切断部位に挿入し、ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡ遺伝子が連結されたプラスミドを構築した。構築されたプラスミドはバチラス・メガテリウムプロテインエクスプレッションシステム（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）の説明書に従ってバチラス・メガテリウムに形質転換した。
[Example 5]
<
The PCR product amplified in Example 3 was purified by digestion with SpeI and BamHI, and this was inserted into the cleavage site of SpeI and BamHI of pWH1520, and Bacillus subtilis endospore skin having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity. A plasmid in which the component CotA gene was linked was constructed. The constructed plasmid was transformed into Bacillus megaterium according to the instructions of Bacillus megaterium protein expression system (MoBiTec).
［実施例６］
＜形質転換大腸菌の培養とその細胞抽出液の調製＞
実施例４で作成したプラスミドを導入したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．６になったときにｌａｃプロモーター誘導剤である１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。その後、３７度でさらに４時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、２５ｐｐｍの塩化銅を含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。
[Example 6]
<Culture of transformed Escherichia coli and preparation of cell extract>
Escherichia coli BL21 (DE3) introduced with the plasmid prepared in Example 4 is inoculated into LB medium containing 50 μg / ml ampicillin, and when the absorbance at 600 nm of the culture solution becomes 0.6, the lac promoter inducer 1 mM IPTG was added. Thereafter, the cells were further cultured at 37 ° C. for 4 hours, collected by centrifugation (15,000 G, 1 minute, 4 ° C.), and suspended in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 25 ppm of copper chloride. The cells were crushed using an ultrasonic crusher, then centrifuged (15,000 G, 5 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was obtained to obtain a cell extract.
［実施例７］
＜形質転換バチラス・メガテリウムの培養とその細胞抽出液の調製＞
実施例５で作成したプラスミドを導入したバチラス・メガテリウを５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．３になったときに誘導剤である０．５％のキシロースを添加した。その後、３７度でさらに４時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、２５ｐｐｍの塩化銅を含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。
[Example 7]
<Culture of transformed Bacillus megaterium and preparation of cell extract thereof>
Bacillus megateriu introduced with the plasmid prepared in Example 5 was inoculated into an LB medium containing 50 μg / ml tetracycline, and when the absorbance at 600 nm of the culture solution became 0.3, 0.5% as an inducer Of xylose was added. Thereafter, the cells were further cultured at 37 ° C. for 4 hours, collected by centrifugation (15,000 G, 1 minute, 4 ° C.), and suspended in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 25 ppm of copper chloride. The cells were crushed using an ultrasonic crusher, then centrifuged (15,000 G, 5 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was obtained to obtain a cell extract.
［実施例８］
＜形質転換大腸菌の培養とその封入体の調製＞
実施例４で作成したプラスミドを導入したエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．６になったときにｌａｃプロモーター誘導剤である１ｍＭのＩＰＴＧ（和光純薬社製）を添加した。その後、３７度でさらに４時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、沈殿を取得して粗封入体とした。粗封入体は４％トライトン Ｘ−１００を含むＴＥで１回以上洗浄した後、蒸留水で１回以上洗浄した。
[Example 8]
<Culture of transformed E. coli and preparation of inclusion bodies>
Escherichia coli BL21 (DE3) introduced with the plasmid prepared in Example 4 is inoculated into LB medium containing 50 μg / ml ampicillin, and when the absorbance at 600 nm of the culture solution becomes 0.6, the lac promoter inducer 1 mM IPTG (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. Thereafter, the cells are further cultured at 37 ° C. for 4 hours, collected by centrifugation (15,000 G, 1 minute, 4 ° C.), suspended in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), and subjected to an ultrasonic crusher. The cells were crushed and centrifuged (15,000 G, 5 minutes, 4 ° C.), and a precipitate was obtained to obtain a crude inclusion body. The coarse inclusion body was washed once or more with TE containing 4% Triton X-100, and then washed once or more with distilled water.
［実施例９］
＜ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡの精製法１＞
実施例５または６で調整した粗酵素液は７５度で６０分間熱処理して、そのまま１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＢＢ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着させた。２５ｐｐｍの塩化銅を含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０および０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度２５％になるように硫酸アンモニウム添加し、２５％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平行化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着して２５および０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分はＧ−２５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）で脱塩した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ ｓｅｐ． ＨＰに吸着し、０および０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分を１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２５で脱塩して精製酵素とし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドである事を確認した。
[Example 9]
<Purification method 1 of endospore coat component CotA of Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity and ascorbate oxidase activity>
The crude enzyme solution prepared in Example 5 or 6 was heat-treated at 75 ° C. for 60 minutes, and directly equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5). It was made to adsorb | suck to BB (made by Amersham Pharmacia Biotech). After thoroughly washing with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 25 ppm of copper chloride, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 0 and 0.5 M potassium chloride was used. Elute with a linear gradient. After adding ammonium sulfate to the active fraction so as to have a final concentration of 25%, and then paralleling with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 25% ammonium sulfate, Phenyl sep. It was adsorbed on FF (Amersham Pharmacia Biotech) and eluted with a linear gradient using 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 25 and 0% ammonium sulfate. The active fraction was desalted with G-25 (Amersham Pharmacia Biotech) and then equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5). It was adsorbed on HP and eluted with a linear gradient using 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 0 and 0.5 M potassium chloride. The active fraction was desalted with G-25 equilibrated with 10 mM phosphate buffer pH 7.0 to obtain a purified enzyme, and a single band was confirmed by SDS-PAGE.
［実施例１０］
＜ビリルビンオキシダーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡの精製法２＞
実施例８で調製した封入体は２０ｍＭのメルカプトエタノールを含む６Ｍの塩酸グアジンで１ｍｇ／ｍｌになるようにアンフォールディングして溶解し、４００ｍＭ アルギニン塩酸塩、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ 還元型グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化型グルタチオン、０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液で６時間かけて６倍に希釈し、２日間４度で放置した後限外濾過膜で濃縮し、この酵素液を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて１５時間透析し、本発明の酵素の活性体を得た。
[Example 10]
<
The inclusion body prepared in Example 8 was dissolved by unfolding to 1 mg / ml with 6M guanidine hydrochloride containing 20 mM mercaptoethanol, 400 mM arginine hydrochloride, 2 mM EDTA, 5 mM reduced glutathione, 0.5 mM. Diluted 6-fold over 100 hours with 100 mM Tris-HCl buffer containing oxidized glutathione and 0.1 mM PMSF, allowed to stand at 4 degrees for 2 days, and concentrated with an ultrafiltration membrane. The enzyme solution was diluted with 10 mM Tris. -Dialyzed with hydrochloric acid buffer (pH 8.0) for 15 hours to obtain an active form of the enzyme of the present invention.
［実施例１１］
＜バチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡのもつビリルビンオキシダーゼ活性を用いたビリルビンCの定量＞
国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＣを０．９％ＮａＣｌ水で希釈して０、４、５、７．５ｍｇ／ｄｌの検量線用標準液を調製した。１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ６．００．１ｍｌ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈した７．２５μｇ／ｍｌの本発明の酵素液０．０２ｍｌ、および蒸留水０．８８ｍｌからなるビリルビンＣ測定溶液１ｍｌを使用して上記酵素活性測定法と同じ方法で各検量線用標準液を測定した。その結果、図５に示すようにビリルビン濃度と波長４５０ｎｍでの吸光度の変化量はＲ２＝０．９９９６で直線状にプロットされ、波長４５０ｎｍの吸光度変化測定でビリルビンＣを定量できた。
[Example 11]
<Quantification of bilirubin C using bilirubin oxidase activity of endospore coat component CotA of Bacillus subtilis>
Interference check A bilirubin C of International Reagent Co., Ltd. was diluted with 0.9% NaCl water to prepare standard solutions for calibration curves of 0, 4, 5, and 7.5 mg / dl. 1M phosphate buffer pH 6.00.1 ml, 0.02 ml of 7.25 μg / ml enzyme solution of the present invention diluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0), and 0.88 ml distilled water Each calibration curve standard solution was measured by the same method as the above enzyme activity measurement method using 1 ml of the resulting bilirubin C measurement solution. As a result, as shown in FIG. 5, the amount of change in bilirubin concentration and absorbance at a wavelength of 450 nm was plotted linearly at R 2 = 0.9996, and bilirubin C could be quantified by measuring the absorbance change at a wavelength of 450 nm.
［実施例１２］
＜バチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡのもつビリルビンオキシダーゼ活性を用いたビリルビンＦの定量＞
国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＣを０．９％ＮａＣｌ水で希釈して０、２．５、４、５、７．５、１０ｍｇ／ｄｌの検量線用標準液を調製した。１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍｌ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈した７．２５μｇ／ｍｌの本発明の酵素液０．０２ｍｌ、および蒸留水０．８８ｍｌからなるビリルビンＦ測定溶液１ｍｌを使用して上記酵素活性測定法と同じ方法で各検量線用標準液を測定した。その結果、図６に示すようにビリルビン濃度と波長４５０ｎｍでの吸光度の変化量はＲ２＝０．９８５７で直線状にプロットされ、波長４５０ｎｍの吸光度変化測定でビリルビンＦの定量が可能であった。
[Example 12]
<Quantification of bilirubin F using bilirubin oxidase activity of endospore coat component CotA of Bacillus subtilis>
Interference check A bilirubin C of International Reagent Co., Ltd. was diluted with 0.9% NaCl water to prepare standard solutions for calibration curves of 0, 2.5, 4, 5, 7.5, and 10 mg / dl. 0.1 ml of 1M phosphate buffer (pH 6.0), 0.02 ml of 7.25 μg / ml enzyme solution of the present invention diluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0), and distilled
［実施例１３］＜ビリルビンオキシダーゼ活性をもつバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを用いた血清中総ビリルビン測定試薬の調整、及び該測定試薬を用いた検体の測定値と、市販の血清中総ビリルビン測定試薬（イアトロＴ−Ｂｉｌキット）を用いた同検体の測定値との比較＞
１）バチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを用いた血清中総ビリルビン測定試薬の調整
バチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを用いた血清中総ビリルビン測定試薬として以下に示した試薬キットを調整した。
１−１）試薬１ １００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ ７．２、
０．２％ コール酸ナトリウム、
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ
１−２）試薬２ １００ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ ７．２、
０．０２％ ＴＸ−１００、
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、
４Ｕ／ｍｌ ビリルビンオキシダーゼ（実施例９にて調整したバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡ）
２）血清中総ビリルビンの測定
日立７０８０形自動分析機を用いてヒト血清７０検体を上記試薬とイアトロＴ−Ｂｉｌキット（三菱化学イアトロン社製）を用いて測定した。日立７０８０形自動分析機の上記試薬の分析パラメーターは、２ポイントエンド測定、サンプル量１０μｌ、試薬１は２００μｌ、試薬２は１００μｌ、測定主波長４５０ｎｍ、副波長５４６ｎｍとした。イアトロＴ−Ｂｉｌキットは添付文書に従って使用した。測定値はイアトロＴ−Ｂｉｌキット用のキャリブレータを用いて総ビリルビン濃度に換算した。測定結果の相関図を図７に示したように、相関式がＹ＝１．０８Ｘ＋０．２７、相関係数がＲ２＝０．９９４であり、良好な相関を示された。これはバチラス・サチルスの内胞子皮構成成分ＣｏｔＡを用いた血清中総ビリルビン測定試薬で、ヒト血清中の総ビリルビンを精度良く測定できることを示している。
[Example 13] <Adjustment of serum total bilirubin measuring reagent using endospore coat component CotA of Bacillus subtilis having bilirubin oxidase activity, and measured value of specimen using the measuring reagent, and commercially available serum Comparison with the measured value of the same sample using the total bilirubin measuring reagent (IAtro T-Bil kit)>
1) Preparation of a reagent for measuring serum total bilirubin using CotA, an endospore coat component of Bacillus subtilis CotA The reagent kit shown below as a reagent for measuring serum bilirubin using CosA, an endospore coat component of Bacillus subtilis It was adjusted.
1-1) Reagent 1 100 mM phosphate buffer pH 7.2,
0.2% sodium cholate,
0.5 mM EDTA-2Na
1-2)
0.02% TX-100,
0.5 mM EDTA-2Na,
4 U / ml bilirubin oxidase (Bacilli subtilis endospore coat component CotA prepared in Example 9)
2) Measurement of serum total bilirubin Using a Hitachi 7080 automatic analyzer, 70 human serum samples were measured using the above reagents and Iatro T-Bil kit (manufactured by Mitsubishi Chemical Iatron). The analysis parameters of the above-mentioned reagent of Hitachi 7080 automatic analyzer were 2-point end measurement,
本発明により、安定化剤の非存在下において安定性、特に熱安定性に優れたビリルビンオキシダーゼ活性及び／又はアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつタンパク質を利用して、安定性に優れたビリルビン酸化試薬の提供を行うことが可能であり、また該酸化試薬を用いた試料中のビリルビン及び／又はアスコルビン酸の酸化方法の提供が可能である。 According to the present invention, a bilirubin oxidation reagent having excellent stability is provided by utilizing a protein having bilirubin oxidase activity and / or ascorbate oxidase activity excellent in stability, particularly heat stability, in the absence of a stabilizer. In addition, it is possible to provide a method for oxidizing bilirubin and / or ascorbic acid in a sample using the oxidizing reagent.
Claims (12)
（１）ビリルビンオキシダーゼ活性測定法
１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））０．１ｍｌ、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０（２５℃））で希釈した酵素液０．０２ｍｌ、および蒸留水０．８８ｍｌからなる酵素活性測定溶液１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で３７℃１．５分間予備加温した後、基質として干渉チェックＡビリルビンＦ（成分はビリルビン）を０．９％ＮａＣｌで２０ｍｇ／ｄｌに調製したものを２０μｌ添加して酵素反応を開始し、反応開始後１分後から２分後までの４５０ｎｍにおける基質の吸光度差を測定する（Ａｓ）。盲検として１００℃で９０分間熱処理した同じ濃度の酵素液を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。酵素活性１単位（１ユニット）は３７℃で１分間に１マイクロモルのビリルビンを変化する酵素量、上記反応液中でのビリルビンＦのミリモル吸光係数は３６として、Ａｓ−Ａｂより酵素活性を求める。
（２）アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定法
アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定溶液（０．５ｍＭのＬ−アスコルビン酸、０．４５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む９０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５（２５℃）））１ｍｌを層長１ｃｍの石英セル中で３０℃５分間予備加温した後、０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５（２５℃））で酵素液０．１ｍｌを混和して酵素反応を開始し、反応開始後１分後から５分後までの２４５ｎｍにおけるＬ−アスコルビン酸の吸光度差を測定する（Ａｓ）。盲検として１００℃で９０分間熱処理した同じ濃度の酵素液を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する（Ａｂ）。この酵素液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位（１ユニット）は３０℃で１分間に１マイクロモルのＬ−アスコルビン酸を変化する酵素量、上記反応液中でのＬ−アスコルビン酸のミリモル吸光係数は１０として、Ａｓ−Ａｂより酵素活性を求める。 The bilirubin oxidase activity is measured by measuring the residual enzyme activity after heat treatment at 80 ° C. for 30 minutes at an enzyme concentration of 0.1 mg / ml in 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5 (25 ° C.)) according to the following enzyme activity measurement method. And / or an endospore coat component protein-containing composition derived from Bacillus subtilis (ATCC 23857), wherein ascorbate oxidase activity remains 80% or more as compared with that before the heat treatment .
(1) Method for measuring bilirubin oxidase activity Enzyme diluted with 0.1 ml of 1M potassium phosphate buffer (pH 6.0 (25 ° C.)) and 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0 (25 ° C.)) 1 ml of enzyme activity measurement solution consisting of 0.02 ml of liquid and 0.88 ml of distilled water was preheated at 37 ° C. for 1.5 minutes in a quartz cell having a layer length of 1 cm, and interference check A bilirubin F (component is bilirubin) as a substrate 20 μl of 0.9) NaCl adjusted to 20 mg / dl is added to start the enzyme reaction, and the difference in absorbance of the substrate at 450 nm from 1 minute to 2 minutes after the start of the reaction is measured (As) . As a blind test, the difference in absorbance is measured by performing the same operation using an enzyme solution of the same concentration that has been heat-treated at 100 ° C. for 90 minutes (Ab). Enzyme activity is determined from As-Ab, where 1 unit of enzyme activity (1 unit) is the amount of enzyme that changes 1 micromole of bilirubin per minute at 37 ° C., and the millimolar extinction coefficient of bilirubin F in the reaction solution is 36. .
(2) Ascorbate oxidase activity measurement method Ascorbate oxidase activity measurement solution (90 mM sodium phosphate buffer (pH 5.5 (25 ° C.) containing 0.5 mM L-ascorbic acid, 0.45 mM ethylenediaminetetraacetic acid)) ) After pre-warming 1 ml in a quartz cell with a layer length of 1 cm for 5 minutes at 30 ° C., 0.1 ml of enzyme solution with 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.5 (25 ° C.)) containing 0.05% BSA To start an enzyme reaction, and the difference in absorbance of L-ascorbic acid at 245 nm from 1 minute to 5 minutes after the start of the reaction is measured (As). As a blind test, the difference in absorbance is measured by performing the same operation using an enzyme solution of the same concentration that has been heat-treated at 100 ° C. for 90 minutes (Ab). The enzyme activity is determined from the difference in absorbance (As-Ab) between the absorbance (As) using this enzyme solution and the absorbance (Ab) in the blind. 1 unit of enzyme activity (1 unit) is the amount of enzyme that changes 1 micromole of L-ascorbic acid per minute at 30 ° C., and the millimolar extinction coefficient of L-ascorbic acid in the above reaction solution is 10, As-Ab Determine enzyme activity.
An ascorbate oxidizing reagent containing a protein encoded by the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005224132A JP4743854B2 (en) | 2004-08-04 | 2005-08-02 | Oxidizing enzyme and oxidizing reagent containing the same |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004227826 | 2004-08-04 | ||
| JP2004227826 | 2004-08-04 | ||
| JP2005224132A JP4743854B2 (en) | 2004-08-04 | 2005-08-02 | Oxidizing enzyme and oxidizing reagent containing the same |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006068003A true JP2006068003A (en) | 2006-03-16 |
| JP2006068003A5 JP2006068003A5 (en) | 2008-06-19 |
| JP4743854B2 JP4743854B2 (en) | 2011-08-10 |
Family
ID=36149256
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005224132A Expired - Fee Related JP4743854B2 (en) | 2004-08-04 | 2005-08-02 | Oxidizing enzyme and oxidizing reagent containing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4743854B2 (en) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007228881A (en) * | 2006-03-01 | 2007-09-13 | Asahi Kasei Pharma Kk | Enzyme for determination of copper ion concentration in specimen |
| EP1953221A2 (en) | 2006-12-07 | 2008-08-06 | Sony Corporation | Bilirubin oxidase mutant having thermal stability |
| EP2093282A1 (en) | 2006-12-07 | 2009-08-26 | Sony Corporation | Bilirubin oxidase mutant having thermal stability |
| US8093029B2 (en) | 2006-12-07 | 2012-01-10 | Sony Corporation | Bilirubin oxidase mutant having thermal stability |
| JP5086494B1 (en) * | 2011-12-29 | 2012-11-28 | 天野エンザイム株式会社 | Dyeing of keratin fibers using indole analogues |
| WO2013099034A1 (en) * | 2011-12-29 | 2013-07-04 | 天野エンザイム株式会社 | Dye for keratin fibers using indole analogue |
| CN111455018A (en) * | 2020-03-03 | 2020-07-28 | 天津大学 | Direct bilirubin detection kit containing bacillus subtilis laccase |
| CN115786289A (en) * | 2022-09-27 | 2023-03-14 | 北京达成生物科技有限公司 | Ascorbic acid oxidase |
-
2005
- 2005-08-02 JP JP2005224132A patent/JP4743854B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| JPN6010073595, Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （２００２） ｖｏｌ．２７７， ｎｏ．２１， ｐ．１８８４９−１８８５９ * |
| JPN6010073596, Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９６） ｖｏｌ．４１２， ｎｏ．１１， ｐ．３０２７−３０３１ * |
| JPN6010073597, ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． （Ｊａｎ ２００４） ｖｏｌ．２３０， ｎｏ．２， ｐ．２０９−２１４ * |
| JPN6010073598, Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９６９） ｖｏｌ．２４４， ｎｏ．１５， ｐ．４２００−４２０７ * |
| JPN6010073599, Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９８７） ｖｏｌ．１９６， ｎｏ．１， ｐ．１−１０ * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007228881A (en) * | 2006-03-01 | 2007-09-13 | Asahi Kasei Pharma Kk | Enzyme for determination of copper ion concentration in specimen |
| EP1953221A2 (en) | 2006-12-07 | 2008-08-06 | Sony Corporation | Bilirubin oxidase mutant having thermal stability |
| EP2093282A1 (en) | 2006-12-07 | 2009-08-26 | Sony Corporation | Bilirubin oxidase mutant having thermal stability |
| US8093029B2 (en) | 2006-12-07 | 2012-01-10 | Sony Corporation | Bilirubin oxidase mutant having thermal stability |
| JP5086494B1 (en) * | 2011-12-29 | 2012-11-28 | 天野エンザイム株式会社 | Dyeing of keratin fibers using indole analogues |
| WO2013099034A1 (en) * | 2011-12-29 | 2013-07-04 | 天野エンザイム株式会社 | Dye for keratin fibers using indole analogue |
| WO2013099296A1 (en) * | 2011-12-29 | 2013-07-04 | 天野エンザイム株式会社 | Dye for keratin fibers using indole analogue |
| US9358198B2 (en) | 2011-12-29 | 2016-06-07 | Amano Enzyme Inc. | Dyeing of keratin fibers using indole analogue |
| CN111455018A (en) * | 2020-03-03 | 2020-07-28 | 天津大学 | Direct bilirubin detection kit containing bacillus subtilis laccase |
| CN115786289A (en) * | 2022-09-27 | 2023-03-14 | 北京达成生物科技有限公司 | Ascorbic acid oxidase |
| CN115786289B (en) * | 2022-09-27 | 2023-06-06 | 北京达成生物科技有限公司 | Ascorbate oxidase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4743854B2 (en) | 2011-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5169991B2 (en) | Modified flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase | |
| CN102292439B (en) | Flavin-bound glucose dehydrogenase | |
| WO2013022074A1 (en) | Novel glucose dehydrogenase | |
| JP4743854B2 (en) | Oxidizing enzyme and oxidizing reagent containing the same | |
| JP4332794B2 (en) | Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) -dependent glucose dehydrogenase excellent in substrate specificity or stability | |
| WO2005026340A1 (en) | Pyrroloquinoline quinone (pqq)-dependent glucose dehydrogenase modification having excellent substrate specificity | |
| JP5811521B2 (en) | Method for improving the specific activity of flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase | |
| JP5207430B2 (en) | NOVEL ENZYME AND COMPOSITION CONTAINING THE SAME | |
| JP5799534B2 (en) | Methods for improving the stability of flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase | |
| JP5114756B2 (en) | Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) -dependent glucose dehydrogenase excellent in substrate specificity or stability | |
| JP5089058B2 (en) | Enzyme for measuring copper ion concentration in sample | |
| JP4452988B2 (en) | Method for improving specific activity of pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase, and pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase with improved specific activity | |
| JP4069243B2 (en) | Aldohexose dehydrogenase | |
| JP4591074B2 (en) | Heat-treated dehydrogenase | |
| JP2007043983A (en) | Modified type pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase excellent in substrate specificity | |
| JP5162870B2 (en) | Stable NADH dehydrogenase | |
| JP2006217811A (en) | Modified product of pqq (pyrroloquinoline quinone)-dependent glucose dehydrogenase having excellent substrate specificity | |
| JP2006034165A (en) | Method for producing pqqgdh | |
| JP2005278597A (en) | Dehydrogenase and glucose assay using the same | |
| JP2006081407A (en) | Method for producing pqq-dependent glucose dehydrogenase | |
| JP2006217810A (en) | Modified product of pqq (pyrroloquinoline quinone)-dependent glucose dehydrogenase having excellent substrate specificity | |
| JP2009055919A (en) | Modified sarcosine oxidase | |
| JP2009072196A (en) | Modified sarcosine oxidase | |
| JP2005328793A (en) | Pyrroloquinoline quinone (pqq)-dependent glucose dehydrogenase modifier excellent in substrate specificity | |
| WO2006068170A1 (en) | Method for improvement of heat stability of glucose dehydrogenase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080501 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080501 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101221 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110217 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20110217 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20110218 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110317 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110401 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110506 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110509 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140520 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4743854 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |