JP2006067889A - Ｐｅｏと二本鎖核酸のコンジュゲート - Google Patents

Abstract

【課題】 効果的な遺伝子の標的細胞へのデリバリー手段の提供
【解決手段】
ポリ（エチレンオキシド）修飾オリゴーもしくはポリヌクレオチドを含む二本鎖核酸とポリカチオン化合物を含んでなるポリイオンコンプレックス。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ポリ（エチレンオキシド）で修飾された二本鎖核酸のコンジュゲートおよび該コンジュゲートとポリアミンを含んでなるポリカチオン化合物のポリイオンコンプレックス（ＰＩＣともいう）に関する。かかるコンジュゲートおよびＰＩＣは生化学、化学療法、特に、多種多様な動物細胞において標的とする遺伝子の発現を抑制する方法において有利に使用される。

遺伝子特異的治療法に使用される遺伝子や標的ｍＲＮＡに使用できるオリゴデオキシリボヌクレオチドは、治療剤として注目を集めてきた。しかし、該遺伝子やオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）は、それらを標的部位にデリバリーする際の、例えばＯＤＮと血漿タンパク質との非特異的相互作用、ＯＤＮの優先的な肝および腎への取り込みに伴う標的細胞への取り込みの効率の低さ、遺伝子およびＯＤＮのヌクレアーゼによる分解に対する安定性の低さ、等の各種障害のために、治療において、必ずしも期待した効果をもたらさなかった。

このような障害を成功裏に除去できる手段として、アンチセンスＤＮＡとチオラート化（ｔｈｉｏｌａｔｅｄ）ポリ（エチレングリコール）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（Ｌ−リシン）から形成されたブロックコポリマーミセルまたはポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルが提案された（例えば、特許文献１、非特許文献１または非特許文献２、参照。）。また、酸分解性β−プロピオネート結合を介して形成されＯＤＮ−ポリ（エチレングリコール）コンジュゲート、該コンジュゲートと線状ポリ（エチレンイミン）のＰＩＣミセルも、上記の障害を除去できる有力な候補である（例えば、非特許文献３、参照。）。上記のブロックコポリマーを用いるＰＩＣミセルは、主としてプラスミドＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ（一本鎖）の安定化またはデリバリー用のキャリヤーとして、また、非特許文献３では、主としてアンチセンスＤＮＡの安定化がはかられている。

他方、細胞のインターフェロン誘導を起こさないとされるＳｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称される二本鎖のＲＮＡ分子は、培養細胞において効率的にＲＮＡｉ（配列特異的ＲＮＡ干渉または配列特異的遺伝子発現阻害）を引き起こし、ＲＮＡｉ活性がアンチセンスＤＮＡより有意に高いことから治療薬の候補物質として注目されている（例えば、非特許文献４および非特許文献５、参照。）。また、ｓｉＲＮＡのセンス鎖をＤＮＡに置き換えた二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡにおいてもＲＮＡｉが引き起こされることも報告されている（例えば、非特許文献６、参照。）。しかし、これらの二本鎖核酸もアンチセンスＤＮＡと同様に血中での分解や腎への吸収、排泄が起こることが報告されている（例えば、非特許文献７、参照。）。
特開２００１−１４６５５６号公報 Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００１，２，４９１〜４９７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．２００４，１２６，２３５５−２３６１ Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００３，４，１４２６−１４３２ Ｎａｔｕｒｅ ２００１，４１１，４９４−４９８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２００２，２９６（２００２），１０００−１００４ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００２，５２１，１９５−１９９ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒ ２００４，１４，１１３９−１１４３

本発明の目的は、特に上記二本鎖核酸の生物学的環境下での不安定性を改善し、さらに
動物細胞への効率的な取り組みを可能にする手段を提供することにある。二本鎖核酸のいずれか一方のオリゴ−もしくはポリヌクレオチドの末端にポリ（エチレンオキシド）鎖を有するセグメントを共有結合するように修飾し、こうして修飾した二本鎖核酸のコンジュゲートとポリカオチン化合物を水性媒体中で混合すると、自動的に会合してポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルを形成し、こうして得られたＰＩＣによって二本鎖核酸が生物学的環境下で安定化され、しかも動物細胞への取り込みも効率が高まることが見出された。

したがって本発明によれば、
（Ａ） 相補性を有する２種のオリゴ−もしくはポリヌクレオチドからなる二本鎖核酸で
あって、少なくとも１種のオリゴ−もしくはポリヌクレオチドの末端にポリ（エチレンオ
キシド）鎖を有するセグメントが共有結合している二本鎖核酸（以下、成分Ａともいう。）、
および
（Ｂ） ポリアミンを含んでなるポリカオチン化合物（以下、成分Ｂともいう。）
を含んでなるポリイオンコンプレックスが提供される。

さらに、本発明のポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）は、水性媒体中でミセルの形態
で存在しうるが、該ＰＩＣを形成するポリカオチン化合物として少なくとも１個以上のメルカプト基（−ＳＨ）を側鎖に有する化合物を使用して形成したＰＩＣでは、これらの化合物間で少なくとも１個のジスルフィド結合（−ＳＳ−）で架橋したＰＩＣミセルを提供できる。かようなＰＩＣミセルは構造上の安定性が向上した態様のものとして提供される。

本発明のＰＩＣは水性媒体（例えば、生理食塩液、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
中でミセルを形成しうるものであれば、成分Ａと成分Ｂの含有率は限定されるものでないが、成分Ａの二本鎖核酸におけるホスフェートに由来するアニオンと成分Ｂのポリカオチン化合物におけるアミン残基に由来するカオチンの比が０．５／１〜１／１０であるＰＩＣが好ましい態様のものとして提供される。ＰＩＣミセル全体が少しポジティブに荷電していると、該ミセルの動物細胞への取り込みの効率が高まることがよくある。

二本鎖核酸は、それぞれ、相補性を有する２種のオリゴ−もしくはポリリボヌクレオチ
ドとオリゴ−もしくはポリリボヌクレオチドとの対合物（ＲＮＡ／ＲＮＡ）、オリゴ−もしくはポリデオキシリボヌクレオチドとオリゴ−もしくはポリリボヌクレオチドとの対合物（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ならびにオリゴ−もしくはポリデオキシリボヌクレオチドとオリゴ−もしくはポリデオキシリボヌクレオチドとの対合物（ＤＮＡ／ＤＮＡ）から選ばれる。

本発明に関して使用する核酸、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレ
オチド、ＲＮＡおよびＤＮＡの語は、当該技術分野で通常用いられている意味を有する。本明細書では、オリゴ−もしくはポリリボヌクレオチドの語はＲＮＡと互換可能に使用されており、そしてオリゴ−もしくはポリデオキシリボヌクレオチドの語はＤＮＡと互換可能に使用されている。

成分Ａのオリゴ−もしくはポリヌクレオチド末端にポリ（エチレンオキシド）鎖を有するセグメントが共有結合した化合物は、より具体的には下記の一般式（１）で表すことができる。

ＮＴ−Ｌ_１−Ｌ_２−ＰＥＯ （１）
式中、ＮＴはリボースの３’もしくは５’末端においてリン酸エステル結合を介してＬ_１−Ｌ_２−ＰＥＯに結合したオリゴ−もしくはポリヌクレオチド残基を表し、
Ｌ_１は酸素原子もしくは硫黄原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基を表し、
Ｌ_２は生理学的条件下で開裂しうる結合を有する連結基を表し、
ＰＥＯはＬ_２の未結合末端に連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、アラルキル基、官能基もしくはリガンド残基を担持するポリ（エチレンオキシド）基を表す。

より具体的な態様の成分Ａとしては、上記の一般式（１）における−ＰＥＯが式（２）：
−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｌ_３−Ｘ （２）
で表され、ここで、Ｌ_３は単結合、カルボニルもしくはＬ_１について定義したのと同様の連結基を表し、
ＸはＣ_１−Ｃ_６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、カルボキシ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アセタールもしくはケタール化ホルミル−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アミノ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、マレイミド−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、カルボニルイミノフェニル、アリルおよびこれらの官能基を介してリガントが結合した部分からなる群より選ばれ、そして
ｎが５〜５００の整数である、化合物を挙げることができる。

他方、成分Ｂのポリアミンを含んでなるポリカチオン化合物は、限定されるものでないが、１または複数のＳＨ基が導入されたポリリジン、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸ジメチルアミノエチル、オリゴアルギニン、ｔａｔおよびＫＡＬＡからなる群より選ばれる。これらのポリアミンを含んでなるポリカチオン化合物の分子量は、成分Ａと一体となって、ＰＩＣミセルを形成するものであれば、制限されることなく使用できる。しかしながら、ポリリジンを例にとれば、一般的に、５００〜１０００００、好ましくは１０００〜５００００、より好ましくは、５０００〜２５０００であることができる。他のポリアミンを含んでなるポリカチオンについて好ましい分子量は、上記のポリリジンの例を参考に，必要により、小実験を行うことにより決定できる。１または複数のＳＨ基が側鎖に導入されたポリリジンでは、リジン単位１０、好ましくは５個当たりＳＨ基が１個となるように選定されたものを挙げることができる。

また、別の態様の本発明としては、
一般式（１）：
ＮＴ−Ｌ_１−Ｌ_２−ＰＥＯ （１）
（式中、ＮＴはリボースの３’もしくは５’末端においてリン酸エステル結合を介してＬ_１−Ｌ_２−ＰＥＯに結合したオリゴ−もしくはポリヌクレオチド残基を表し、
Ｌ_１は酸素原子もしくは硫黄原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基を表し、
Ｌ_２は生理学的条件下で開裂しうる結合を有する連結基を表し、
ＰＥＯはＬ_２の未結合末端に連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、アラルキル基、官能基もしくはリガンド残基を担持するポリ（エチレンオキシド）基を表す。）
で表される化合物のＮＴ部に相補性のオリゴ−もしくはポリヌクレオチドがハイブリダイズして二本鎖核酸部を形成している核酸コンジュゲートも提供される。

好ましい態様のコンジュゲートは、上記式中の−ＰＥＯが、上述したＰＩＣについて説明した式（２）
−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｌ_３−Ｘ （２）
で表されるものを挙げることができる。
＜発明のさらなる説明＞
オリゴ−もしくはポリヌクレオチドにおける「オリゴマー（もしくはオリゴ）もしくはポリ」の語は、ＰＩＣを形成し、そして水性媒体中でＰＩＣミセルを形成する鎖長を有するものをすべて包含する目的で使用している。したがって、限定されるものでないが、具体的には、ヌクレオチド単位が、１０〜５０００、好ましくは、１８〜５０、特に好ましくは、ｓｉＲＮＡのヌクレオチド単位に近似するように２１〜２２であり、これらの２種の鎖が形成する二本鎖においては、３′末端及び５′末端に１〜２個のヌクレオチドがオーバーハングされているような形態にあることが好ましい。

本発明にいう「相補性を有する」とは、二本鎖の全体にわたって、厳密に全てが相補性であること、具体的には、塩基対で表すと、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）もしくはグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）またはアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）およびグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）のいずれかの対合を形成していることまで必要とするものでなく、高ストリンジョント条件下で二本鎖核酸がハイブリダイズするものも包含する概念で使用している。

このようなオリゴ−もしくはポリヌクレオチドの末端に共有結合するポリ（エチレンオキシド）鎖を有するセグメントは、上記の一般式（１）における−Ｌ_１−Ｌ_２−ＰＥＯで表される部分が具体的なものである。ここで、Ｌ_１、Ｌ_２およびＰＥＯは、既に、一般式（１）について定義したとおりであり、また、−ＰＥＯの好ましい態様は、式（２）で表されるものである。これらの定義における「酸素原子もしくは硫黄原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基」には、例えば、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｓ−（ＣＨ_２）_６−、等が挙げられる。また、「生理的条件下で開裂しうる結合を有する連結基」における該結合は、例えば、エンドソームにおける低ｐＨ（６．０〜５．０）において開裂しうるいずれかのエステル結合または還元条件下もしくは還元性物質の存在下で開裂しうるジスルフィド結合を挙げることができる。このような結合を有する連結基は、連結基中のどの位置に該結合を有していてもよいが、例えば、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＯ−ＣＨ_２−、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＳＳＣＨ_２−、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＯ−ＣＨ_２−、−ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯ−ＣＨ_２−、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＨ_２ＣＯＯ−ＣＨ_２−等を挙げることができる。

−ＰＥＯが式（２）：−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｌ_３−Ｘで表す場合の定義におけるＣ_１−Ｃ_６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル等にいうアルキルまたはアルキル部分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル等および、これらに由来する部分を意味する。Ｌ_３は上記のＬ_１について定義する連結基を包含し、それら以外としては、−Ｏ−Ｐｈ−ＮＨＣＯ−（Ｐｈはフェニルを表す。）、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＣＨ_２ＣＨ_２−等であることもできる。Ｘにいう、「アセタールもしくはケタール化ホルミル」は、ホルミルもしくはアルデヒドの保護された形態をも意味し、また、「カルボキシ」、「アミノ」は、ペプチド合成等で慣用されるような保護基で保護されていてもよい。また、これら官能基を介して（アミド、エステル、エーテル結合を形成して）結合したリガンドとしては、ある一定の細胞表面に結合しうる糖もしくはペプチドであることができ、さらには抗体、抗原、ハプテン、ホルモン等であることもできる。

以上によって特定されるＰＩＣもしくはＰＩＣミセルは、水性媒体中で成分Ａと成分Ｂを単に混合するだけで形成できる。また、成分Ａともなり得る本発明のコンジュゲートは、例えば、本発明者の一部が著者に含まれる非特許文献３記載の方法でポリ（エチレンオキシド）鎖含有セグメントで修飾した一本鎖核酸を調製した後、該核酸部に対する相補性鎖をハイブリダイズすることにより調製できる。

他方、成分Ｂのポリカチオンのうちポリアミンの側鎖にＳＨ基を導入するには、やはり、本発明者の一部が著者に含まれる非特許文献１および２に記載する方法に準じてポリアミンを処理することにより実施できる。

二本鎖核酸を形成するオリゴ−もしくはポリヌクレオチドは、動物、殊に哺乳動物のいずれかの遺伝子のセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれかあることができる。かかる遺伝子としては、既に各種疾患の治療目的で提供されてきたアンチセンスＤＮＡが対象としてきた遺伝子であることができる。かかる遺伝子としては、限定されるものでないが、非小細胞肺癌などに関係のあるＰＫＣα、悪性黒色腫などに関係のあるＢＣＬ−２、クローン病に関係のあるＩＣＡＭ−１、Ｃ型肝炎に関係のあるＨＣＶ、関節リウマチ、乾鮮に関係のあるＴＮＦα、喘息に関係のあるアデノシンＡ１受容体、卵巣癌などに関係のあるｃ−ｒａｆ ｋｉｎａｓｅ、膵臓癌などに関係のある Ｈ−ｒａｓ、冠動脈疾患癌に関係のあるｃ−ｍｙｃ、大腸癌に関係のあるＰＫＡ ＲＩα、エイズに関係のあるＨＩＶ、固形癌に関係のあるＤＮＡメチル−トランスフェラーゼ、癌に関係のあるＶＥＧＦ受容体、腎臓癌に関係のあるリボヌクレオチド還元酵素、ＣＭＶ性網膜炎に関係のあるＣＭＶ ＩＥ２、前立腺癌に関係のあるＭＭＰ−９、悪性グリオーマに関係のあるＴＧＦβ２、多発性硬化症に関係のあるＣＤ４９ｄ、糖尿病に関係のあるＰＴＰ−１Ｂ、癌に関係のあるｃ−ｍｙｂ、乳癌などに関係のあるＥＧＦＲ、癌に関係のあるｍｄｒ１、ａｕｔｏｔａｘｉｎおよびＧＬＵＴ−１の遺伝子を挙げることができる。

例えば、本発明のＰＩＣにおける二本鎖核酸の一方が、上記遺伝子のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖の一部である場合には、本発明のＰＩＣを用いてかかる遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。したがって本発明は、上記の遺伝子の発現に随伴する疾患の治療に有用である。

以下、具体的を挙げて、本発明をさらに説明する。

アリル−ＰＥＯ−ＯＨの製造
アルゴン下、ナスフラスコ中、室温において、開始剤アリルアルコール１．０ｍｍｏｌ（０．０７ｍｌ）を溶媒テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２５ｍｌにマイクロシリンジで加え、Ｋ−ナフタレン１．０ｍｍｏｌ（０．３２５ｍｏｌ／ｌ−ＴＨＦ溶液、３．１ｍｌ）を加えて１０分間メタル化を施した。次いで、エチレンオキシド（ＥＯ）１１０ｍｍｏｌ（５．５ｍｌ）を加えて水冷下で２日間攪拌し、アニオン開環重合を行った。ジエチルエーテル沈澱（２ｌ）、吸引濾過、ベンゼン凍結乾燥により精製を行った。この生成物の収量は４．４ｇ（９８％）であった。

カルボン酸−ＰＥＯ−ＯＨの製造
アリル−ＰＥＯ−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ（４．３ｇ，Ｍ_ｎ＝４３４０）、３−メルカプトプロパン酸１５ｍｍｏｌ（１．６ｇ、１５倍モル量）およびアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．７５ｍｏｌ（０．１２ｇ，０．７５倍モル量）をＴＨＦ３０ｍｌ中に溶解させ、凍結脱気を３回行った。次に、アルゴン下７０℃において２日間反応を行った。その後、２−プロパノール沈澱（２ｌ）、遠心分離（５０００×ｇ、４５分間）、純水に対する透析（区画分子量３５００，１，２，４，６，８，１２時間後に水を交換）、水凍結乾燥により精製を行った。この生成物の収量は３．６ｇ（８２％）であった。

カルボン酸−ＰＥＯ−アクリレートの製造
アルゴン下、ナスフラスコ中、室温において、アクリロイルクロライド４．５ｍｍｏｌ（０．３６ｍｌ，１０倍モル量）をＴＨＦ５ｍｌに溶解させた。次に、その溶液にカルボン酸−ＰＥＯ−ＯＨ ０．４５ｍｍｏｌ（２．０ｇ，Ｍ_ｎ＝４３８０）およびトリエチルアミン９．０ｍｍｏｌ（１．３ｍｌ，２０倍モル量）をＴＨＦ１５ｍｌに溶かした溶液を０℃にて１時間かけて滴下した。その後、遮光下０℃にて１日反応を行った後、２−プロパノール沈殿（１ｌ）、遠心分離（５０００×ｇ、４５分間）、純水に対する透析（区画分子量３５００，１，２，４，６，８，１２時間後に水を交換）、水凍結乾燥により精製を行った。この生成物の収量は１．６ｇ（７２％）であった。

ラクトース−ＰＥＯ−アクリレートの製造

ナスフラスコ中、室温において、カルボン酸−ＰＥＯ−アクリレート２２μｍｏｌ（０．１ｇ，Ｍ_ｎ＝４４５０）、４−アミノフェニルβ−Ｄ−ラクトピラノサイド１１１μｍｏｌ（４８ｍｇ，５倍モル量）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）２．８ｍｍｏｌ（０．５３ｇ，１２５倍モル量）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）０．５５ｍｍｏｌ（６４ｍｇ，２５倍モル量）を溶媒２５ｍＭ４−モルフォリノエタン硫酸緩衝溶液５ｍｌ（ｐＨ６．６）に溶解させ、室温において１日反応を行った。その後、２−プロパノール沈澱（２００ｍｌ）、遠心分離（５０００×ｇ、４５分間）、純水に対する透析（区画分子量３５００，１，２，４，６，８，１２時間後に水を交換）、水凍結乾燥により精製を行った。この生成物の収量は６９ｍｇ（６７％）であった。

ゲルパーミエーションクロマトグラフィーの測定により、得られたポリマーは単峰性であり、その数平均分子量は４６３０であり、理論分子量５４９０とほぼ一致していた。

さらに、得られたポリマーの重水（Ｄ_２Ｏ）中での^１Ｈ−ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）スペクトルより、このポリマーの平均分子量は５５３０と計算された。またこのポリマーはエチレンオキシド骨格を主鎖に有し、α−末端にラクトース基、ω−末端にアクリレート基を有するヘテロテレケリックポリエチレンオキシドであることが確認された（図２参照）。

ラクトース−ＰＥＯ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの製造

５’未満ＳＨ修飾センス鎖ＲＮＡ３０ｎｍｏｌ（１９３μｇ，グライナージャパンより購入）とラクトース−ＰＥＯ−アクリレート０．３μｍｏｌ（１．６ｍｇ，１０倍モル量）を試験管に加え、アルゴン置換を行った。次いで、１０ｎＭ トリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８）３００μｌおよび１ｍＭのトリフェニルフォスフィン−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液６０μｌ（２倍モル量）をマイクロシリンジで加え、室温にて２日間マイケル付加反応を行った。また、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、ＲＮＡの消費とＲＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートの生成を確認した。その後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ １０／１０）による分取、純水に対する透析（区画分子量３５００、１，２，４，６，８，１２時間後に水を交換）を１日行うことで精製を行った。このＵＶ測定による生成物の収量は８９％であった。さらに、得られたＲＮＡ−ＰＥＯコンジュゲート２７ｎｍｏｌとアンチセンス鎖ＲＮＡ２７ｎｍｏｌ（グライナージャパンより購入）を１０ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４，アニーリングｂｕｆｆｅｒ）２７０μｌに溶解させ、９５℃において３分間アニーリングさせることで、ラクトース−ＰＥＯ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを定量的に得た。

ＳＨ化ポリリジンの製造。
平均重合度４０のＬ−ポリジン臭酸塩５．１μｍｏｌ（４２ｍｇ）、トラウト試薬５１μｍｏｌ（７．０ｍｇ，ポリリジンのアミノ基に対して０．２５倍モル量）およびトリエチルアミン４．５ｍｍｏｌ（０．６５ｍｌ）を純水４ｍｌに溶解させ、室温にて２日間反応を行った。次に、純水に対する透析（区画分子量３５００，１，２，４，６，８，１２時間後に水を交換）、水凍結乾燥により精製を行った。この生成物の収量は４０ｍｇ（８２％）であった。

さらに、得られたポリマーの重水（Ｄ_２Ｏ）中での^１Ｈ−ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）スペクトルより、このポリマーへのＳＨ基（トラウト試薬）の修飾数は、平均重合度４０当りに９つのＳＨ基が導入されていることが確認された。

ラクトース−ＰＥＯ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートとポリリジンからなるポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルの製造。

ラクトース−ＰＥＯ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート１０ｎｍｏｌおよびポリリジン（平均重合度＝４０）１２ｎｍｏｌを、それぞれ１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に溶解させた後、０．１μｍのフィルターで濾過しゴミを取り除いた。次に、これらの溶液をポリリジンの正電荷とラクトース−ＰＥＯ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの負電荷の比が１（Ｎ／Ｐ＝１）となるように混合した。さらに、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４，０．３Ｍ ＮａＣｌ）を混合液と同量加え、１２時間静置しＰＩＣミセルを形成させた。

ラクトース−ＰＥＯ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートとＳＨ化ポリリジンからなるＳ−Ｓ架橋ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルの製造。

ラクトース−ＰＥＯ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート１０ｎｍｏｌおよびＳＨ化ポリリジン（平均重合度＝４０）１２ｎｍｏｌを、それぞれ１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に溶解させた後、０．１μｍのフィルターで濾過しゴミを取り除いた。このＳＨ化ポリリジン溶液に、０．１μＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）の１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）１２．５μｌ（ＳＨ基の３倍モル当量）を加え、室温にて３０分間還元反応を行った。次に、ポリリジンの正電荷とラクトース−ＰＥＯ−ＳｉＲＮＡコンジュゲートの負荷電の比が１（Ｎ／Ｐ＝１）となるように混合し、０．５％ ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含んでいる１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に対して透析（区画分子量３５００）を２日間行った。さらに、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含んでいる１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に対して透析（区画分子量３５００）１日間行うことにより、Ｓ−Ｓ架橋ＰＩＣミセルを形成させた。

ラクトース−ＰＥＯ−ＲＮＡコンジュゲート、ラクトース−ＰＥＯ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート、ＰＩＣミセルおよびＳ−Ｓ架橋ＰＩＣミセルの調製の確認は１２％アクリルアミド電気泳動により行った（図３参照）。その結果、ラクトース−ＰＥＯ−ＲＮＡコンジュゲートおよびラクトース−ＰＥＯ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの電気泳動バンドは、対応する１本鎖ＲＮＡおよび２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のバンドよりも遅れていることから、コンジュゲートの調製が確認された（レーン１と３、レーン２と４の比較）。また、ＰＩＣミセルおよびＳ−Ｓ架橋ＰＩＣミセルの電気泳動バンドは、原点付近に確認されたことから、ＰＩＣミセルおよびＳ−Ｓ架橋ＰＩＣミセルの調製が確認された（レーン４と５、レーン４と６の比較）。

ラクトース−ＰＥＯ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートおよびラクトース−ＰＥＯ−ＤＮＡ／ＲＮＡコンジュゲートＰＩＣミセルのＲＮＡｉ効果。

２４穴ポリスチレン製細胞培養プレート（ファルコン社製）に、人肝癌細胞（Ｈｕｈ７
ｃｅｌｌ）を５Ｘ１０^４ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ 播種し、２４時間培養した後、市販の遺伝子導入試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔ ＡＭＩＮＥ（１．２２μＬ／ｗｅｌｌ，インビィトロジェン社製）を用い、ホタルルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３，０．０８４μｇ／ｗｅｌｌ，プロメガ社製）とウミシイタケルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＲＬ−ＴＫ，０．７５μｇ／ｗｅｌｌ，プロメガ社製）のレポーター遺伝子を細胞にトランスフェクションした。次に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する配列を有するＰＩＣミセル溶液（実施例７で調製した）、Ｓ−Ｓ架橋ＰＩＣミセル溶液（実施例８で調製した）およびコンジュゲート単独の溶液を所定量加え（培地濃度換算１００ｎＭ）、２４時間細胞と接触させた。培地交換後、さらに２４時間培養した後、細胞を回収し両レポーター遺伝子の発現量をＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）により測定しアンチセンス効果を評価した（ｎ＝３）。

以上の結果を図４に示した。ＤＮＡ／ＲＮＡ単独、ｓｉＲＮＡ単独およびラクトース−ＰＥＯ−ＤＮＡ／ＲＮＡコンジュゲート単独では、ＲＮＡｉ効果を全く示さないことが確認された。一方、ラクトース−ＰＥＯ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートにおいては、ＲＮＡｉ効果を示すことが確認された。

ＰＩＣミセルおよびＳ−Ｓ架橋ＰＩＣミセルでは、全てにおいてＲＮＡｉ効果を示すことが確認された。また、ｓｉＲＮＡを有するＰＥＯコンジュゲートのＰＩＣミセルは、ＤＮＡ／ＲＮＡを有するＰＥＯコンジュゲートＰＩＣミセルよりも、高いＲＮＡｉ効果を示すことが確認された。さらに、ｓｉＲＮＡを有するＰＥＯコンジュゲートのＳ−Ｓ架橋ＰＩＣミセルも同様にも高いＲＮＡｉ効果を示すことが確認された。

図１はラクトース−ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成スキームである。 図２はラクトース−ＰＥＧ−アクリレートのＨ−ＮＭＲによる測定結果である。 図３はラクトース−ＰＥＧ−ＲＮＡコンジュゲート、ラクトース−ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート、ＰＩＣミセルおよびＳ−Ｓ架橋ＰＩＣミセルの１２％アクリルアミドゲル電気泳動の結果を表す図に代わる写真である。 図４は１００ｎＭにおけるラクトース−ＰＥＧ−ＤＮＡ／ＲＮＡコンジュゲート、ラクトース−ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート、ＰＩＣミセルおよびＳ−Ｓ架橋ＰＩＣミセルのＲＮＡｉ効果の結果である。

Claims (14)

1. （Ａ） 相補性を有する２種のオリゴ−もしくはポリヌクレオチドからなる二本鎖核酸であって、少なくとも１種のオリゴ−もしくはポリヌクレオチドの末端にポリ（エチレンオキシド）鎖を有するセグメントが共有結合している二本鎖核酸、および
   （Ｂ） ポリアミンを含んでなるポリカチオン化合物
   を含んでなるポリイオンコンプレックス。
2. ポリアミンを含んでなるポリカチオン化合物が、分子間で少なくとも１個のジスルフィド結合により架橋している請求項１記載のポリイオンコンプレックス。
3. 二本鎖核酸におけるホスフェートに由来するアニオンとポリアミンを含んでなるポリカチオン化合物におけるアミン残基に由来するカオチンの比が０．５／１〜１／１０である請求項１記載のポリイオンコンプレックス。
4. ポリイオンコンプレックスが水性 媒体中でミセルの形態で存在する請求項１記載のポリイオンコンプレックス。
5. 二本鎖核酸が、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＤＮＡからなる群より選ばれる対合物である請求項１記載のポリイオンコンプレックス。
6. 二本鎖核酸がｓｉＲＮＡである請求項５記載のポリイオンコンプレックス。
7. オリゴ−もしくはポリヌクレオチドの末端にポリ（エチレンオキシド）鎖を有するセグメントが共有結合した化合物が、一般式（１）：
   ＮＴ−Ｌ_１−Ｌ_２−ＰＥＯ （１）
   （式中、ＮＴはリボースの３’もしくは５’末端においてリン酸エステル結合を介してＬ_１−Ｌ_２−ＰＥＯに結合したオリゴ−もしくはポリヌクレオチド残基を表し、
   Ｌ_１はＮＨ、酸素原子もしくは硫黄原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基を表し、
   Ｌ_２は生理学的条件下で開裂しうる結合を有する連結基を表し、
   ＰＥＯはＬ_２の未結合末端に連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、アラルキル基、官能基もしくはリガンド残基を担持するポリ（エチレンオキシド）基を表す。）
   で表される請求項１記載のポリイオンコンプレックス。
8. −ＰＥＯが式（２）
   −（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｌ_３−Ｘ （２）
   （式中、Ｌ_３は単結合、カルボニルもしくはＬ_１について定義したのと同義の連結基を表し、
   Ｘは水素原子、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、カルボキシ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アセタールもしくはケタール化ホルミル−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アミノ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、マレイミド−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、カルボニルイミノフェニル、アリルおよびこれらの官能基を介してリガンドが結合した部分からなる群より選ばれ、そして
   ｎが５〜５００の整数である）
   で表される請求項７記載のポリイオンコンプレックス。
9. オリゴ−もしくはポリヌクレオチド残基が１０〜５０のヌクレオチドからなるＲＮＡまたはＤＮＡに由来する請求項７記載のポリイオンコンプレックス。
10. ポリアミンを含んでなるポリカチオン化合物が、１または複数のＳＨ基が側鎖に導入されたポリリジン、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸ジメチルアミノエチル、オリゴアルギニン、ｔａｔおよびＫＡＬＡからなる群より選ばれる請求項１記載のポリイオンコンプレックス。
11. 一般式（１）
    ＮＴ−Ｌ_１−Ｌ_２−ＰＥＯ （１）
    （式中、ＮＴはリボースの３’もしくは５’末端においてリン酸エステル結合を介してＬ_１−Ｌ_２−ＰＥＯに結合したオリゴ−もしくはポリヌクレオチド残基を表し、
    Ｌ_１は酸素原子もしくは硫黄原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基を表し、
    Ｌ_２は生理学的条件下で開裂しうる結合を有する連結基を表し、
    ＰＥＯはＬ_２の未結合末端に連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、アラルキル基、官能基もしくはリガンド残基を担持するポリ（エチレンオキシド）基を表す。）
    で表される化合物のＮＴ部に相補性のオリゴ−もしくはポリヌクレオチドがハイブリダイズして二本鎖核酸部を形成している核酸コンジュゲート。
12. −ＰＥＯが式（２）
    −（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｌ_３−Ｘ （２）
    （式中、Ｌ_３は単結合、カルボニルもしくはＬ_１について定義したのと同義の連結基を表し、
    Ｘは水素原子、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、カルボキシ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アセタールもしくはケタール化ホルミル−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アミノ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、マレイミド−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、およびカルボニルイミノフェニル基ならびにこれらの基における官能基を介してリガンドが結合した部分からなる群より選ばれ、
    ｎが５〜５００の整数である）
    で表される請求項１１記載の核酸コンジュゲート。
13. ＮＴが１５〜３０のリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドからなる核酸からなる群より選ばれ、該ＮＴ部に相補性のオリゴヌクレオチドが１５〜３０のリボヌクレオチドであり、そしてＬ_２が−Ｏ（ＣＨ_２）_ａ−ＯＣＯ（ＣＨ_２）_ｂＳ（ＣＨ_２）_Ｃ−または−Ｏ（ＣＨ_２）_ａ−Ｓ−Ｓ（ＣＨ_２）_Ｃ−の連結基であって、ａ、ｂおよびｃは、相互に独立して２〜８の整数である請求項１１記載の核酸コンジュゲート。
14. ＮＴとそれに相補性のオリゴヌクレオチドからなる二本鎖核酸部分がｓｉＲＮＡに相当する請求項１１記載の核酸コンジュゲート。