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JP2005536985A - 先天性免疫のエフェクター - Google Patents

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Abstract

１以上の敗血症または炎症誘導因子により調節され、ペプチドにより阻害されるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドパターンを同定する方法を記載する。炎症又は敗血症の応答の抑制についてのポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法を記載する。この方法は、細胞と、ＬＰＳ、ＬＴＡ、ＣｐＧ ＤＮＡ及び／又は微生物全体若しくは微生物成分とを、ペプチドの存在下又は不在下で接触させるステップ；該ペプチドの存在下及び不在下における細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップを含み、該ペプチドの存在下におけるパターンが炎症又は敗血症の応答の抑制を示すものである。また、本発明の方法により同定された化合物及び薬剤を包含する。別の態様において、本発明は、被験体における先天性免疫を増強するための方法及び化合物を提供する。

Description

本発明は、一般にペプチドに関し、詳しくは、微生物感染に起因する病理に関連する治療および医薬品の発見に有効であり、また先天性免疫または抗炎症活性の調節に有効なペプチドに関する。
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、米国特許出願第６０／３３６，６３２号（２００１年１２月３日出願）に基づく優先権を主張する。なお、前記出願の全文は参照により本明細書に組み入れるものとする。
感染性疾患は世界的に主要な死因である。１９９９年の世界保健機構の研究によれば、１３００万人以上が毎年感染性疾患で死亡している。感染性疾患は北アメリカでは死因の３番目であり、毎年死者の２０％を占め、１９８０年以来５０％増加している。また、多くの内科的および外科的治療の成功は、感染性疾患の制御にかかっている。抗生物質の発見とその使用は近代医療の偉大なる業績の１つであった。抗生物質がなければ、医師は、複雑な手術、化学療法、または大部分の医療介入（カテーテル法など）を実施することは不可能であろう。
抗生物質の経常販売高は世界的に見て２６０億ＵＳドルである。しかし、抗生物質の過剰使用と時折ある不適当な使用により、細菌の新規な抗生物質耐性株が進化してきた。抗生物質耐性は医療上の特徴の１つとなっている。バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）などの細菌株は、抗生物質では治療することが困難であり、かかる細菌に感染している患者は死亡することも多い。抗生物質の発見は新しい医薬品開発において最も困難な分野の１つであることが分かり、多くの大規模な製薬会社は、自社の抗生物質開発計画を縮小するか、あるいは完全に中止した。しかし、治療不可能な感染症の出現をはじめとする抗生物質耐性の劇的な増加に伴って、新しいタイプの抗微生物治療に対して明らかに未解決な医学上のニーズがあり、先天性免疫に影響を及ぼす薬剤がかかるクラスの薬剤の一例であろう。
先天性免疫系は効力が高く、かつ進化した全身的な防御系である。先天性免疫の成分は常時低濃度で存在し、刺激があった場合に非常に急速に活性化される。刺激には、身体細胞の表面上のパターン認識受容体と細菌性シグナル伝達分子との相互作用、または他の疾患の作用機構が含まれる。毎日、ヒトが摂取する食品および水、ヒトが呼吸する空気、ならびにヒトが触れる表面、ペットおよびヒトを介して、ヒトは何万もの潜在的病原微生物にさらされている。先天性免疫系はこれらの病原体から疾病が発生するのを予防するように作用する。先天性免疫系はいわゆる適応免疫（抗体ならびに抗原特異的Ｂリンパ球およびＴリンパ球が含まれる）とは異なる。その理由は、先天性免疫系は、常時存在し、即時に有効であり、かつ侵入したいかなる病原体に対しても相対的に非特異的であるからである。一方、適応免疫系は特異的な認識成分の増幅を必要とするので、したがって、応答までに数日から数週間かかる。ワクチン接種により適応免疫が予め刺激されている場合でさえ、病原体に応答するのに３日以上を要するが、先天性免疫は即時にまたは急速に（数時間）利用可能である。先天性免疫には、食細胞、捕体などをはじめとする種々のエフェクター機能が含まれているが、一般には未だに明らかではない。概して言えば、多くの先天性免疫反応は、宿主細胞の表面上にあるＴｏｌｌ様受容体と呼ばれるパターン認識受容体に微生物のシグナル伝達分子が結合することによって「誘発される」。これらのエフェクター機能の多くは炎症反応として一まとめにされている。しかし、あまりにも重篤な炎症反応は身体に有害な反応をもたらし、極端な場合には、敗血症が生じ、死に至る可能性がある。
感染時に感染因子から構造成分が放出されると炎症反応が生じ、チェックされない場合、潜在的致死症状の敗血症に至る可能性がある。毎年北アメリカでは約７８０，０００人の敗血症患者が発生している。敗血症は、肺炎などの群集（community）の中で感染した結果発症し得る。あるいは、外傷、癌または大手術の治療における併発症であり得る。身体が炎症反応に耐えられなくなり、身体器官が衰え始めると、重篤な敗血症が発症する。米国では、毎年敗血症により最高１２０，０００人が死亡している。また、敗血症では、血液中に病原微生物または毒素が含まれる可能性があり（例えば毒血症（septicemia））、それはヒトにおける主要な死因となっている。グラム陰性菌はかかる疾患に最も一般に関連している生物である。しかし、グラム陽性菌も感染の増加している原因である。グラム陰性菌およびグラム陽性菌、ならびにこれらの成分はすべて敗血症を引き起こす可能性がある。
微生物成分が存在すると、前炎症性サイトカインの放出が誘導されるが、そのうち、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）が極めて重要である。ＴＮＦ−αおよび他の前炎症性サイトカインは、次いで他の前炎症性媒介因子の放出を引き起こし、炎症カスケードをもたらす。グラム陰性菌敗血症は、通常、細菌外膜成分のリポ多糖類（ＬＰＳ；内毒素とも称する）の放出によって発症する。内毒素血と呼ばれる血液中の内毒素は、主として細菌感染が原因であり、抗生物質による治療の間、放出され得る。グラム陽性菌敗血症は、細菌細胞壁成分、例えば、ストレプトコッカス属菌によって産生されるリポタイコ酸（ＬＴＡ）、ペプチドグリカン（ＰＧ）、ラムノース−グルコースポリマー、またはスタフィロコッカス属菌によって産生される莢膜ポリサッカライドの放出によって発症し得る。また、哺乳動物ＤＮＡと異なり、メチル化されていないシトシン・グアノシン二量体（ＣｐＧ ＤＮＡ）を高頻度で含有する細菌ＤＮＡまたは他の哺乳動物以外のＤＮＡは、敗血症の症状（ＴＮＦ−αの産生を含む）を誘導することがわかっている。哺乳動物ＤＮＡは、非常に低い頻度でＣｐＧジヌクレオチドを含有するが、多くの場合メチル化形態である。細菌感染時におけるこれらの自然的な放出の他に、抗生物質による治療もまた細菌細胞壁成分のＬＰＳおよびＬＴＡ、ならびに恐らくは細菌ＤＮＡの放出を引き起こす。その結果、抗生物質治療は、感染からの回復を妨げるか、あるいは敗血症を発症させる可能性がある。
カチオン性ペプチドは、科学文献および特許文献で認識されている主な作用は抗菌作用であるが（Hancock, R. E. W.およびR. Lehrer、1998、Cationic peptides:a new source of antibiotics、Trends in Biotechnology 16:82〜88頁）、感染に対する防御形態が次第に認められてきている。抗菌活性を有しているカチオン性ペプチドは多種多様な生物から単離されている。自然界において、かかるペプチドは、微生物（例えば、細菌および酵母）に対する防御機構を付与している。一般に、これらのカチオン性ペプチドは、細胞膜と相互に作用することにより、またほとんどの場合、チャンネルまたは損傷を形成することにより、細菌に対してペプチドの持つ抗菌活性を発現すると考えられている。グラム陰性菌では、ペプチドはＬＰＳと相互作用して外膜の透過性を上昇させ、外膜を通過する自己促進型の取り込みを引き起こし、かつ細胞膜に接近する。カチオン性抗菌性ペプチドの例としては、インドリシジン、ディフェンシン、セクロピンおよびマガイニンが挙げられる。
抗生物質機能とエフェクター機能が無関係であるかどうかは知られていなかったが、最近、かかるペプチドが先天性免疫の他の局面におけるエフェクターであることが次第に認識されてきている（Hancock, R. E. W.およびG. Diamond、2000、The role of cationic peptides in innate host defenses、Trends in Microbiology 8:402〜410頁;Hancock, R. E. W.、2001、Cationic peptides:effectors in innate immunity and novel antimicrobials、Lancet Infectious Diseases 1:156〜164頁）。
あるカチオン性ペプチドは、細菌産生物、例えばＬＰＳおよびＬＴＡに結合する親和性を有している。かかるカチオン性ペプチドはＬＰＳに応答したサイトカイン産生を抑制することができ、程度を変化させることで致死ショックを防ぐことができる。しかし、かかる影響が、ペプチドがＬＰＳおよびＬＴＡに結合することに基づくかどうか、あるいはペプチドと宿主細胞との直接的な相互作用によるかどうかに関しては未だ証明されていない。カチオン性ペプチドは、微生物または微生物シグナル伝達分子、例えばＬＰＳによる攻撃に応答して、哺乳動物免疫系（Ｔｏｌｌ様受容体および転写因子であるＮＦκＢを含む）によって使用されている調節経路に似た調節経路により誘導される。したがって、カチオン性ペプチドは、先天性免疫における重要な機能を有すると思われる。抗菌性ペプチドの誘導に影響を及ぼす突然変異は、細菌性攻撃に応答して生存率を低減させる可能性がある。同様に、抗真菌ペプチド発現の低下をもたらすショウジョウバエのＴｏｌｌ経路の突然変異は、死に至る真菌感染の罹患性を高める。ヒトでは、α−ディフェンシンを完全に欠失している特定顆粒欠乏症候群に罹患している患者は、重篤な細菌感染にかかることが多い。他の証拠としては、感染因子によるいくつかのペプチドの誘導性と、炎症部位で記録された極めて高い濃度が挙げられる。また、カチオン性ペプチドは、細菌感染と戦う白血球の能力を促進するために、細胞遊走を調節することができる。例えば、２種類のヒトα−ディフェンシンペプチド（ＨＮＰ−１およびＨＮＰ−２）は、マウスおよびヒトのＴ細胞並びに単球の直接的な走化性活性を有し、ヒトβ−ディフェンシンは、ＣＣＲ６との相互作用を介して未熟な樹状細胞および記憶Ｔ細胞に対して化学走性誘因物質として作用すると考えられることが開示されている。同様に、ブタのカチオン性ペプチドであるＰＲ−３９は、好中球に対して走化性であることが分かっている。しかし、異なる構造および組成物のペプチドがこれらの特性を共有しているかどうかについては未だ明らかではない。
ヒト由来の１つの既知のカテリシジンＬＬ−３７は、骨髄系前駆細胞、精巣、炎症性疾患時のヒトケラチン細胞、および気道上皮により産生される。カテリシジンペプチドの特長は、カテリンドメインと称されるＮ末端プレプロ領域での高レベルの配列相同性である。カテリシジンペプチドは不活性プロペプチド前駆体として蓄積され、刺激されると活性ペプチドへとプロセシングされる。
米国特許出願第６０／３３６，６３２号 Hancock, R. E. W.およびR. Lehrer、1998、Cationic peptides:a new source of antibiotics、Trends in Biotechnology 16:82〜88頁 Hancock, R. E. W.およびG. Diamond、2000、The role of cationic peptides in innate host defenses、Trends in Microbiology 8:402〜410頁 Hancock, R. E. W.、2001、Cationic peptides:effectors in innate immunity and novel antimicrobials、Lancet Infectious Diseases 1:156〜164頁
本発明は、内毒素性リポ多糖、リポタイコ酸、ＣｐＧ ＤＮＡまたは他の細胞成分（例えば、微生物またはそれらの細胞成分）によって調節され、かつカチオン性ペプチドにより影響を受けるポリヌクレオチド発現パターンに基づいた独創性に富んだ発見に基づくものであり、被験体の敗血症および／または炎症を阻止または縮小する新規な化合物をスクリーニングすることができる。さらに、本発明はツールとしてのカチオン性ペプチドの使用に基づくものであり、敗血症反応を引き起こすことなく、炎症および／または敗血症の応答を遮断／抑制することができる先天性免疫の選択的エンハンサーを同定することができる。
したがって、一実施形態では、１以上の敗血症誘導因子または炎症誘導因子により調節され、かつカチオン性ペプチドにより阻害されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターンを同定する方法を提供する。本発明の方法は、１または複数の上記ポリヌクレオチドを１種以上の敗血症誘導因子または炎症誘導因子と接触させるステップ、それと同時にまたはその直後に、１または複数の上記ポリヌクレオチドをカチオン性ペプチドと接触させるステップを含む。発現の差はカチオン性ペプチドの存在下および不在下で検出され、発現の変化、すなわち、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、敗血症誘導因子または炎症誘導因子により調節され、かつカチオン性ペプチドにより阻害されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターンを示す。別の態様では、本発明は、上記の方法によって同定される１個のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを提供する。敗血症または炎症調節因子の例としては、ＬＰＳ、ＬＴＡもしくはＣｐＧ ＤＮＡ、または微生物成分（またはこれらの任意の組合せ）、あるいは関連の因子が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、敗血症または炎症を阻止する薬剤を同定する方法であって、上述した方法により同定されたポリヌクレオチドと薬剤とを組み合わせるステップを含み、薬剤の存在下におけるポリヌクレオチドの発現が、薬剤の不在下における発現と比較してモジュレートされ、かつ発現のモジュレーションが炎症または敗血症の応答に影響を及ぼすものである、上記方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、１）細胞と、ＬＰＳ、ＬＴＡおよび／またはＣｐＧ ＤＮＡとを、カチオン性ペプチドの存在下または不在下で接触させるステップ、２）前記ペプチドの存在下または不在下における細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップにより、炎症または敗血症の応答の抑制についてのポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法を提供する。ペプチドの存在下で得られるパターンは、炎症または敗血症の応答の抑制を示すものである。別の態様では、ペプチドの存在下で得られるパターンを試験化合物のパターンと比較して同様のパターンを提供する化合物を同定する。別の態様では、本発明は、前述の方法によって同定される化合物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、先天性免疫に関与するポリペプチドをコードする１または複数のポリヌクレオチドを対象の薬剤と接触させることによって、先天性免疫を増強する薬剤を同定する方法であって、薬剤の存在下におけるポリヌクレオチドの発現が、薬剤の不在下におけるポリヌクレオチドの発現と比較してモジュレートされ、かつ発現がモジュレートされると先天性免疫の増強が起こるものである、上記方法を提供する。好ましくは、薬剤は被験体の敗血症反応を刺激はしない。一態様では、薬剤は抗炎症性ポリヌクレオチドの発現を高める。具体的には、これらに限定されるものではないが、抗炎症性ポリヌクレオチドは、例えば、ＩＬ−１ Ｒアンタゴニストホモログ１（ＡＩ１６７８８７）、ＩＬ−１０ Ｒβ（ＡＡ４８６３９３）、ＩＬ−１０ Ｒα（Ｕ００６７２）、ＴＮＦ受容体メンバー１Ｂ（ＡＡ１５０４１６）、ＴＮＦ受容体メンバー５（Ｈ９８６３６）、ＴＮＦ受容体メンバー１１ｂ（ＡＡ１９４９８３）、ＨＬＡ ＩＩのＩＫサイトカインダウンレギュレーター（Ｒ３９２２７）、ＴＧＦ−Ｂ誘導性初期増殖応答２（ＡＩ４７３９３８）、ＣＤ２（ＡＡ９２７７１０）、ＩＬ−１９（ＮＭ＿０１３３７１）またはＩＬ−１０（Ｍ５７６２７）などのタンパク質をコードする。一態様においては、薬剤は、ＮＦ−κＢ活性化に関与するプロテアソームサブユニット（例えば、プロテアソームサブユニット２６Ｓ（ＮＭ＿０１３３７１））をコードするポリヌクレオチドの発現を低下させる。一態様では、薬剤は、プロテインキナーゼのアンタゴニストとして作用し得る。一態様では、薬剤は配列番号４〜５４から選択されるペプチドである。
別の実施形態では、本発明は、先天性免疫を選択的に増強する化合物を同定するためのポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法を提供する。本発明は、カチオン性ペプチドの存在下および不在下で接触された細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップであって、ペプチドの存在下におけるパターンが先天性免疫の刺激を表わすものであるステップ、試験化合物の存在下で接触された細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップであって、カチオン性ペプチドの存在下において確認されるパターンに類似している試験化合物を用いたパターンが先天性免疫を増強する化合物を示すものであるステップとを含む。この化合物は被験体における敗血症の反応を刺激しないことが好ましい。
別の実施形態では、本発明は、核酸サンプル中で、非感染の被験体と比較した場合の、表５０、５１および／または５２の少なくとも２個のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現の上昇により例示されるポリヌクレオチド発現パターンを同定することによって、哺乳動物被験体の感染の状態を被験体の核酸サンプルから推測する方法を提供する。さらに、上述のすべての方法によって得られるポリヌクレオチド発現パターンも含まれる。
別の態様では、ＣＸＣＲ−４のアンタゴニストであるカチオン性ペプチドを提供する。さらに、別の態様では、試験ペプチドの存在下または不在下においてＴ細胞をＳＤＦ−１と接触させるステップ、走化性を測定するステップによって、ＣＸＣＲ−４のアンタゴニストであるカチオン性ペプチドを同定する方法を提供する。試験ペプチドの存在下における走化性の低下は、ＣＸＣＲ−４のアンタゴニストであるペプチドを示している。また、カチオン性ペプチドはＳＤＦ−１受容体ポリヌクレオチド（ＮＭ＿０１３３７１）の発現を低下させるように作用する。
上述のすべての方法では、本発明の化合物または薬剤としては、これらに限定されるものではないが、ペプチド、カチオン性ペプチド、ペプチド擬似体、化学化合物、ポリペプチド、核酸分子等が挙げられる。
さらに別の態様では、本発明は単離されたカチオン性ペプチドを提供する。本発明の単離されたカチオン性ペプチドは、以下の一般式の１つと一文字アミノ酸コードによって表わされる：
一般式：Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＩＸ４ＰＸ４ＩＰＸ５Ｘ２Ｘ１（配列番号４）（式中、Ｘ１は１個または２個のＲ、ＬまたはＫであり、Ｘ２は１個のＣ、ＳまたはＡであり、Ｘ３は１個のＲまたはＰであり、Ｘ４は１個のＡまたはＶであり、Ｘ５は１個のＶまたはＷである）；
Ｘ１ＬＸ２Ｘ３ＫＸ４Ｘ２Ｘ５Ｘ３ＰＸ３Ｘ１（配列番号１１）（式中、Ｘ１は１個または２個のＤ、Ｅ、Ｓ、ＴまたはＮであり、Ｘ２は１個または２個のＰ、ＧまたはＤであり、Ｘ３は１個のＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＹであり、Ｘ４は１個のＲ、ＫまたはＨであり、Ｘ５は１個のＳ、Ｔ、Ｃ、ＭまたはＲである）；
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＷＸ４ＷＸ４Ｘ５Ｋ（配列番号１８）（式中、Ｘ１はＡ、ＰまたはＲから選択される１〜４個であり、Ｘ２は１個または２個の芳香族アミノ酸（Ｆ、ＹおよびＷ）であり、Ｘ３は１個のＰまたはＫであり、Ｘ４はＡ、Ｐ、ＹまたはＷから選択される１個もしくは２個、または０個であり、Ｘ５はＲまたはＰから選択される１〜３個である）；
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ１ＶＸ３Ｘ４ＲＧＸ４Ｘ３Ｘ４Ｘ１Ｘ３Ｘ１（配列番号２５）（式中、Ｘ１は１個または２個のＲまたはＫであり、Ｘ２は極性アミノ酸または荷電アミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＨ）であり、Ｘ３はＣ、Ｓ、Ｍ、ＤまたはＡであり、Ｘ４はＦ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＲである）；
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ１ＶＸ５Ｘ４ＲＧＸ４Ｘ５Ｘ４Ｘ１Ｘ３Ｘ１（配列番号３２）（式中、Ｘ１が１個または２個のＲまたはＫであり、Ｘ２は極性アミノ酸または荷電アミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＨ）であり、Ｘ３は１個のＣ、Ｓ、Ｍ、ＤまたはＡであり、Ｘ４は１個のＦ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＲであり、Ｘ５は１個のＡ、Ｉ、Ｓ、Ｍ、ＤまたはＲである）；
ＫＸ１ＫＸ２ＦＸ２ＫＭＬＭＸ２ＡＬＫＫＸ３（配列番号３９）（式中、Ｘ１は極性アミノ酸（Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ＮおよびＱ）であり、Ｘ２は１個のＡ、Ｌ、ＳまたはＫであり、Ｘ３はＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、ＫおよびＨから選択される１〜１７個のアミノ酸である）；
ＫＷＫＸ２Ｘ１Ｘ１Ｘ２Ｘ２Ｘ１Ｘ２Ｘ２Ｘ１Ｘ１Ｘ２Ｘ２ＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号４６）（式中、Ｘ１は疎水性アミノ酸であり、Ｘ２は親水性アミノ酸である）。
さらに別の態様では、本発明は、単離されたカチオン性ペプチド、ＫＷＫＳＦＬＲＴＦＫＳＰＶＲＴＶＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号５３）およびＫＷＫＳＹＡＨＴＩＭＳＰＶＲＬＶＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号５４）を提供する。
さらに、本発明のカチオン性ペプチドをコードする核酸配列、かかるポリヌクレオチドを含むベクター、およびベクターを含有する宿主細胞をも提供する。
本発明は、ポリヌクレオチド発現をモジュレート（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレート）する能力を有し、それによって敗血症および炎症の応答、ならびに／または先天性免疫を調節する、一連の一般式を特徴とする新規なカチオン性ペプチドを提供する。
本明細書で使用する「先天性免疫」は、生物が病原体による侵入から自己防衛する自然能力を意味する。本明細書で使用する病原体または微生物としては、これらに限定されるものではないが、細菌、真菌、寄生生物およびウィルスが挙げられる。先天性免疫は、生物が、特異性、増幅能力および自己対非自己の識別を特徴とする抗体および／または免疫リンパ球に実質的に基づいた防御機構を発現させる後天性免疫／適応免疫と対比される。先天性免疫では、広範な非特異的免疫が提供され、事前曝露による免疫記憶はない。先天性免疫の特徴は、多種多様の潜在的病原体に対する有効性、病原体への事前曝露の非依存性、および即時有効性（誘導されるまでに数日から数週間必要な特異的免疫反応とは対照的）である。さらに、先天性免疫には、他の疾患、例えば、癌、炎症性疾患、多発性硬化症、種々のウィルス感染等に影響を及ぼす免疫反応が含まれる。
本明細書では、「カチオン性ペプチド」という用語は、アミノ酸長が約５個から約５０個のアミノ酸配列を意味する。一態様では、本発明のカチオン性ペプチドは、約１０個から約３５個のアミノ酸長である。また、ｐＫａ値が９．０を越える十分に正に荷電したアミノ酸を含んでいる場合には、ペプチドは「カチオン性」である。典型的には、カチオン性ペプチドの少なくとも２個のアミノ酸残基は正電荷を帯びており、その例としてはリジンまたはアルギニンが挙げられる。「正に荷電した」とは、ｐＨ７．０の正味の正電荷を有しているアミノ酸残基の側鎖を意味する。本発明により組換え産生させうる天然のカチオン性抗菌性ペプチドの例としては、ディフェンシン、カテリシジン、マガイニン、メリチンおよびセクロピン、バクテネシン、インドリシジン、ポリフェムシン、タキプレシン、ならびにこれらの類似体が挙げられる。種々の生物はカチオン性ペプチド（微生物に対する非特異性の防御機構の一部として用いられる分子）を作る。単離された場合、これらのペプチドは、細菌、真菌およびある種の外膜ウィルスをはじめとする種々の微生物にとって有毒である。カチオン性ペプチドは多くの病原体に対して作用するが、注意すべき例外と毒性の様々な程度がある。しかし、本特許では、微生物に対する毒性はないが、先天性免疫の刺激を介して感染を防御する能力を有するさらに別のカチオン性ペプチドを明らかにする。また、本発明は、抗菌活性を有するカチオン性ペプチドに限定されるものではない。実際、本発明で有用な多数のペプチドは抗菌活性を有していない。
当技術分野で既知のカチオン性ペプチドは、例えば、ヒトカテリシジンＬＬ−３７、およびウシ好中球ペプチドインドリシジン、並びにバクテネシンのウシ変異体Ｂａｃ２Ａを含む
ＬＬ−３７ ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ（配列番号１）、
インドリシジン ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＲＲ−ＮＨ２（配列番号２）、
Ｂａｃ２Ａ ＲＬＡＲＩＶＶＩＲＶＡＲ−ＮＨ２（配列番号３）。
先天性免疫では、免疫反応は抗原に依存しない。先天性免疫過程には、上述の分泌分子および細胞成分の産生が含まれ得る。先天性免疫では、病原体は、生殖細胞系でコードされている受容体によって認識される。これらのＴｏｌｌ様受容体は広い特異性を有しており、多数の病原体を認識することができる。カチオン性ペプチドが免疫反応において存在する場合、それらは病原体に対する宿主反応を促進する。免疫反応におけるこの変化によってケモカインの放出が誘導され、それにより感染部位に対する免疫細胞のリクルートを促進する。
ケモカイン、すなわち化学走性誘因物質サイトカインは、走化性現象および他の前炎症現象を媒介する免疫因子のサブグループである（Schall、1991年、Cytokine 3:165〜183頁を参照されたい）。ケモカインは約７０〜８０残基長の小分子であり、一般に２つのサブグループに分けることができる。αは、単一のアミノ酸によって分離される２つのＮ末端システインを有するものであり（Ｃ×Ｃ）、βはＮ末端に隣接した２つのシステインを有するものである（ＣＣ）。ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βはβサブグループのメンバーである（Horuk, R.、1994年、Trends Pharmacol. Sci.、15:159〜165頁;Murphy, P. M.、1994年、Annu. Rev. Immunol.、12:593〜633頁を参照されたい）。βケモカインＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−３のアミノ末端は、これらのケモカインによって誘導される細胞遊走と炎症の仲介に関与している。この関与は、ＭＣＰ−１のアミノ末端８残基、ＭＣＰ−３のアミノ末端９残基およびＲＡＮＴＥＳのアミノ末端８残基の欠失と、ＲＡＮＴＥＳのアミノ末端へのメチオニンの付加が、それらの本来の対応物によって刺激された走化性、カルシウム動員および／または酵素放出に拮抗するという所見によって示唆されている（Gongら、1996年、J. Biol. Chem.、271:10521〜10527頁;Proudfootら、1996年、J. Biol. Chem.、271:2599〜2603頁）。さらに、αケモカイン様走化性活性が、Ｔｙｒ２８とＡｒｇ３０の各々ロイシンとバリンへの二重突然変異を介してＭＣＰ−１へ導入されたが、このことは、このタンパク質の内部領域もまた走化性活性を調節する機能を果たしていることを示唆している（Beallら、1992年、J.Biol. Chem.、267:3455〜3459頁）。
これまで特性決定されてきたすべてのケモカインのモノマー形態は、α群およびβ群の四次構造は異なるが、重要な構造上の相同性が共通している。βケモカインとαケモカインのモノマー構造は非常に類似しているが、２つの群の二量体構造は完全に異なる。唯一１個のＮ末端システインを有している、さらなるケモカイン（リンホタクチン）が同定されており、ケモカインのさらに別のサブグループ（γ）を表わすことができる（Yoshidaら、1995年、FEBS Lett.、360:155〜159頁;およびKelnerら、1994年、Science、266:1395〜1399頁）。
ケモカインの受容体は、Ｇタンパク質共役型７回膜貫通ドメイン受容体（ＧＣＲ）の大きなファミリーに属している（Horuk, R.、1994年、Trends Pharmacol. Sci.、15:159〜165頁;およびMurphy、P. M.、1994年、Annu. Rev. Immunol.、12:593〜633頁の概説を参照されたい）。競合結合および交差脱感作の研究では、ケモカイン受容体がリガンド結合においてかなりの無差別結合（promiscuity）を示すことが開示されている。βケモカイン受容体の中で無差別結合を示す例としては、ＣＣ ＣＫＲ−１（ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αと結合する）（Neoteら、1993年、Cell、72:415〜425頁)、CC CKR-4(RANTES、MIP-1αおよびMCP-1と結合する)(Powerら、1995年、J. Biol. Chem.、270:19495〜19500頁）、およびＣＣ ＣＫＲ−５（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βと結合する）（Alkhatibら、1996年、Science、近刊、およびDragicら、1996年、Nature、381:667〜674頁）が挙げられる。赤血球は、αケモカインおよびβケモカインの両方と結合する受容体（ダッフィ抗原として既知である）を有する(Horukら、1994年、J. Biol. Chem.、269:17730〜17733頁;Neoteら、1994年、Blood、84:44〜52頁;およびNeoteら、1993年、J. Biol. Chem.、268:12247〜12249頁）。したがって、ケモカインとそれらの受容体の中の明らかな配列と構造上の相同性により、受容体−リガンド相互作用に重複のある場合が多い。
一態様では、本発明は、宿主細胞に直接作用させて敗血症および炎症の応答を縮小することを目的として、本発明のカチオン性ペプチドを含有する化合物の使用を提供する。この態様では、１以上の敗血症または炎症誘導因子によって調節される１または複数のポリヌクレオチドの同定方法であって、前記調節がカチオン性ペプチドにより改変される方法を提供する。かかる敗血症または炎症誘導因子としては、これらに限定されるものではないが、内毒素性リポ多糖（ＬＰＳ）、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、および／またはＣｐＧ ＤＮＡ、あるいは細菌全体もしくは他の細菌性成分が挙げられる。この同定は、１または複数のポリヌクレオチドを敗血症または炎症誘導因子と接触させること、およびそれと同時にまたはその直後に、さらにカチオン性ペプチドと接触させることによって行われる。カチオン性ペプチドの存在下または不在下におけるポリヌクレオチドの発現が確認されると、発現の変化は、敗血症誘導因子または炎症誘導因子により調節され、かつカチオン性ペプチドにより阻害されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターンを示す。別の態様では、本発明は、本方法により同定されるポリヌクレオチドを提供する。
同定されたら、かかるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼすことにより敗血症または炎症を遮断し得る化合物をスクリーニングする方法において有用である。発現に対する影響は、発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかであってよい。敗血症反応を引き起こすことなく、炎症または敗血症の応答を遮断または抑制することができる化合物を同定することによって、本発明は、さらに先天性免疫の増強因子を同定する方法をも提供する。さらに、本発明は、上述の方法で使用または同定される化合物を提供する。
候補化合物は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む、種々の起源から得られる。例えば、無作為抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、種々の有機化合物および生体分子の無作為および指定した合成のために多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーも利用可能であり、あるいは容易に作製することができる。さらに、天然ライブラリーまたは合成により作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に改変され、コンビナトリアルライブラリーを得るために用いることができる。既知の薬理学的薬剤もまた指定したまたは無作為の化学的改変、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等を行い、構造上の類似体を得ることができる。また、候補薬剤は、生体分子（これらに限定されるものではないが、ペプチド、ペプチド模倣体、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、化学化合物、誘導体、構造上の類似体、またはこれらの組合せを含む）に見出される。
スクリーニングアッセイの成分のインキュベートには、試験化合物と対象のポリヌクレオチドの間で接触させる条件が含まれる。接触には、溶液、固相、または細胞中での接触が含まれる。試験化合物は、場合によっては、複数の化合物をスクリーニングするためのコンビナトリアルライブラリーであってもよい。本発明の方法で同定される化合物は、溶液中で、または固相担体に結合された後で、化合物の検出に通常適用される任意の方法によって、さらに評価、検出、クローニング、配列決定等を行うことができる。
一般に、本発明の方法では、敗血症または炎症の過程で不可欠のポリヌクレオチドを検出および発見するためにカチオン性ペプチドを利用する。一度同定されると、ポリヌクレオチド発現のパターンは、カチオン性ペプチドの存在下および不在下における発現を調べることにより得ることができる。カチオン性ペプチドの存在下で得られたパターンは、したがって、そのポリヌクレオチドの発現を抑制し、その結果、敗血症または炎症を阻止することができる新たな化合物を同定するのに有用である。非ペプチドの化学物質とペプチド擬似体は、受容体および酵素結合部位に結合するペプチドの能力を模倣することができるので、したがってそれらを用いて生体反応を遮断または刺激することができることは、当業者には周知である。対象のさらなる化合物がカチオン性ペプチドの存在下におけるポリヌクレオチド発現パターンと類似のパターンを提供する場合、その化合物もまた敗血症または先天性免疫反応のモジュレーションに有用である。このように、敗血症および炎症の既知の阻害因子ならびに先天性免疫の増強因子である本発明のカチオン性ペプチドは、敗血症および炎症を抑制し、先天性免疫を増強するさらなる化合物の同定におけるツールとして有用である。
下記の実施例で確認できるように、本発明のペプチドは、ＬＰＳによって調節されるポリヌクレオチドの発現を低下させる広範な能力を有している。血液中の高濃度の菌体内毒素は、重篤な感染または炎症時に見られる多数の徴候（例えば、熱および白血球数の増加）の原因である。菌体内毒素はグラム陰性菌の細胞壁の一成分であり、敗血症の病態生理の有望な誘導物質である。炎症および敗血症の基本的機序に関連している。実施例１では、ポリヌクレオチドアレイを利用して、上皮細胞の転写応答におけるカチオン性ペプチドの影響を検出した。具体的には、ＬＰＳによって誘導された１４，０００個以上の異なる特異的ポリヌクレオチドプローブに対する影響を調べた。対照細胞と比較したペプチドを用いて処理した細胞で確認された変化を表に示す。得られたデータは、複数のペプチドがＬＰＳによって誘導されたポリヌクレオチドの発現を低減する能力を有していることを示した。
同様に、実施例２では、グラム陽性およびグラム陰性菌の産物による免疫細胞の刺激を本発明のペプチドが中和しうることを示す。さらに、ある種の前炎症ポリヌクレオチドは、表２４に記載のカチオン性ペプチド、例えば、ＴＬＲ１（ＡＩ３３９１５５）、ＴＬＲ２（Ｔ５７７９１）、ＴＬＲ５（Ｎ４１０２１）、ＴＮＦ受容体関連因子２（Ｔ５５３５３）、ＴＮＦ受容体関連因子３（ＡＡ５０４２５９）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー、メンバー１２（Ｗ７１９８４）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー、メンバー１７（ＡＡ９８７６２７）、小さな誘導性サイトカインサブファミリーＢ、メンバー６（ＡＩ８８９５５４）、ＩＬ−１２Ｒβ２（ＡＡ９７７１９４）、ＩＬ−１８受容体１（ＡＡ４８２４８９）によってダウンレギュレートされ、一方、抗炎症ポリヌクレオチドは、表２５に記載のカチオン性ペプチド、例えば、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストホモログ１（ＡＩ１６７８８７）、ＩＬ−１０Ｒβ（ＡＡ４８６３９３）、ＴＮＦ受容体メンバー１Ｂ（ＡＡ１５０４１６）、ＴＮＦ受容体メンバー５（Ｈ９８６３６）、ＴＮＦ受容体メンバー１１ｂ（ＡＡ１９４９８３）、ＨＬＡ ＩＩのＩＫサイトカインダウンレギュレーター（Ｒ３９２２７）、ＴＧＦ−Ｂ誘導性初期増殖応答２（ＡＩ４７３９３８）、またはＣＤ２（ＡＡ９２７７１０）によってアップレギュレートされている。これらの結果の妥当性および用途は、マウスに対するｉｎ ｖｉｖｏ適用によって確認されている。実施例３は、かかるペプチドが、それらが接触する宿主細胞に対する毒性を一般に示さないことを示している。
実施例４では、本発明のカチオン性ペプチドがマクロファージおよび上皮細胞におけるポリヌクレオチド発現を改変することを理解することができる。この実施例の結果から、前炎症性ポリヌクレオチドはカチオン性ペプチドによりダウンレギュレートされるが（表２４）、抗炎症性ポリヌクレオチドはカチオン性ペプチドによりアップレギュレートされる（表２５）ことが示される。
別の態様では、本発明は、先天性免疫を増強する薬剤の同定方法を提供する。本方法では、先天性免疫に関与するポリペプチドをコードする宿主細胞の１または複数のポリヌクレオチドを対象の薬剤と接触させる。薬剤の存在下および不在下の両方でポリヌクレオチドの発現を測定する。その発現を比較したところ、特定の発現のモジュレーションが先天性免疫の増強を示した。別の態様では、薬剤は、前炎症性サイトカインＴＮＦ−αのアップレギュレーションの欠如から明らかであるように、敗血症の反応を刺激しない。さらに別の態様では、薬剤は、炎症または敗血症の応答を低減または遮断する。また、別の態様では、薬剤は、ＴＮＦ−αおよび／またはインターロイキン（これらに限定されるものではないが、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＩＬ−１２ ｐ７０およびＩＬ−８を含む）の発現を低減する。
別の態様では、本発明は、カチオン性ペプチドによる直接的なポリヌクレオチド調節の方法と、先天性免疫の成分を刺激するためのカチオン性ペプチドを含む化合物の使用を提供する。この態様では、本発明は、先天性免疫を増強する化合物を同定するためのポリヌクレオチド発現パターンの同定方法を提供する。本発明の方法では、カチオン性ペプチドの存在下および不在下で接触された細胞のポリヌクレオチド発現パターンが最初に検出される。ペプチドの存在下におけるポリヌクレオチド発現により得られるパターンは、先天性免疫の刺激を表わす。次いで、ポリヌクレオチド発現パターンを試験化合物の存在下において検出するが、この場合、カチオン性ペプチドの存在下で確認されたパターンに類似している試験化合物により得られたパターンは、先天性免疫を増強する化合物を示す。別の態様では、本発明は、上記方法で同定される化合物を提供する。別の態様では、本発明の化合物は、ケモカインまたはケモカイン受容体発現を刺激する。ケモカインまたはケモカイン受容体としては、これらに限定されるものではないが、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＭＩＰ−１α、ＭＤＣ、ＭＩＰ−３α、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５およびＲＡＮＴＥＳが挙げられる。さらに、別の態様では、化合物は、ペプチド、ペプチド擬似体、化学化合物または核酸分子である。
また、別の態様では、ポリヌクレオチド発現パターンは、前炎症性ポリヌクレオチドの発現を含む。かかる前炎症性ポリヌクレオチドとしては、これらに限定されるものではないが、リングフィンガータンパク質１０（Ｄ８７４５１）、セリン／スレオニンプロテインキナーゼＭＡＳＫ（ＡＢ０４００５７）、ＫＩＡＡ０９１２タンパク質（ＡＢ０２０７１９）、ＫＩＡＡ０２３９タンパク質（Ｄ８７０７６）、ＲＡＰ１、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（Ｍ６４７８８）、ＦＥＭ−１様デスレセプター結合タンパク質（ＡＢ００７８５６）、カテプシンＳ（Ｍ９０６９６）、推定タンパク質ＦＬＪ２０３０８（ＡＫ０００３１５）、ｐｉｍ−１癌遺伝子（Ｍ５４９１５）、プロテアソームサブユニットβタイプ５（Ｄ２９０１１）、ＫＩＡＡ０２３９タンパク質（Ｄ８７０７６）、気道ムチン５サブタイプＢ（ＡＪ００１４０３）、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質ＣＲＥＢＰａ、インテグリンαＭ（Ｊ０３９２５）、Ｒｈｏ関連キナーゼ２（ＮＭ＿００４８５０）、ＰＴＤ０１７タンパク質（ＡＬ０５０３６１）、未知遺伝子（ＡＫ００１１４３、ＡＫ０３４３４８、ＡＬ０４９２５０、ＡＬ１６１９９、ＡＬ０３１９８３）およびこれらの任意の組合せが挙げられる。さらに別の態様では、ポリヌクレオチド発現パターンは、細胞表面受容体の発現が含まれ、例えば、これらに限定されるものではないが、レチノイン酸受容体（Ｘ０６６１４）、Ｇタンパク質共役型受容体（Ｚ９４１５５、Ｘ８１８９２、Ｕ５２２１９、Ｕ２２４９１、ＡＦ０１５２５７、Ｕ６６５７９）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体７（Ｌ３１５８４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（Ｚ２９５７５）、インターフェロンγ受容体２（Ｕ０５８７５）、サイトカイン受容体様因子１（ＡＦ０５９２９３）、クラスＩサイトカイン受容体（ＡＦ０５３００４）、凝固因子ＩＩ（トロンビン）受容体様２（Ｕ９２９７１）、白血病抑制因子受容体（ＮＭ＿００２３１０）、インターフェロンγ受容体１（ＡＬ０５０３３７）が挙げられる。
例えば、表１〜１５では、カチオン性ペプチドは、主として前炎症性の応答をダウンレギュレートし、かつ／または抗炎症の応答をアップレギュレートすることにより、感染因子のシグナル伝達分子に対する宿主応答を中和し、さらに宿主細胞の転写応答を変化させることができることを示している。実施例５では、カチオン性ペプチドが、ケモカインの放出を誘導することにより、病原体に対する宿主応答を促進し、それによって、感染部位への免疫細胞のリクルートが促進されることが明らかである。これらの結果は、マウスへのｉｎ ｖｉｖｏ適用によって確認されている。
下記の実施例からは、カチオン性ペプチドは、例えば、感染部位への免疫細胞のリクルートを促進する選択的前炎症応答を誘導し、一方で潜在的に有害な前炎症サイトカインは誘導しないことにより、宿主免疫応答の調節を補助するという点で、病原体に対する宿主応答に本質的に影響を及ぼすということが明らかである。敗血症は、部分的には感染因子に対する過度の前炎症性応答によって起こると考えられる。カチオン性ペプチドは、抗炎症反応を誘導し、ある種の潜在的に有害な前炎症性応答を抑制することにより、病原体に対する「バランスのとれた」応答で宿主を助ける。
実施例７では、カチオン性ペプチドと細胞との相互作用効果にある作用機構を調べるために、選択したＭＡＰキナーゼの活性化を検討した。マクロファージは細菌感染に応じてＭＥＫ／ＥＲＫキナーゼを活性化する。ＭＥＫは、ＭＡＰキナーゼキナーゼの一種であり、前記キナーゼは、活性化された場合、下流のキナーゼＥＲＫ（細胞外調節性キナーゼ）をリン酸化し、次いで、それは二量化し、核に転位し、そこでＥｌｋ−１などの転写因子を活性化してポリヌクレオチド発現を改変する。ＭＥＫ／ＥＲＫキナーゼは、マクロファージ内でサルモネラ菌の複製を低下させることが明らかにされている。ＭＥＫキナーゼおよびＮＡＤＰＨオキシダーゼによるシグナル伝達は、細胞内病原体に対する先天性宿主防御に重要な機能を果たすことができる。下記に示すように、ＭＡＰキナーゼに作用することにより、カチオン性ペプチドは細菌感染に影響を及ぼす。カチオン性ペプチドは直接キナーゼに影響し得る。表２１は、これらに限定されるものではないが、ＭＡＰキナーゼポリヌクレオチド発現がペプチドに応答して変化することを実証している。これらのキナーゼには、ＭＡＰキナーゼキナーゼ６（Ｈ０７０９２０）、ＭＡＰキナーゼキナーゼ５（Ｗ６９６４９）、ＭＡＰキナーゼ７（Ｈ３９１９２）、ＭＡＰキナーゼ１２（ＡＩ９３６９０９）、およびＭＡＰキナーゼ活性化プロテインキナーゼ３（Ｗ６８２８１）が挙げられる。
別法では、複数の特性を有する薬剤、すなわち、抗炎症／抗敗血症の活性と、ケモカインを部分的にｉｎ ｖｉｖｏで誘導することにより先天性免疫を増強する能力とを有するペプチドを同定するために、本発明の方法を組み合わせて用いることができる。
別の態様では、本発明は、核酸サンプル中で、非感染の被験体と比較して、表５５に示す少なくとも２個のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現の上昇によって例示されたポリヌクレオチド発現パターンを同定することにより、被験体の核酸サンプルから哺乳動物被験体の感染状態を推測する方法を提供する。別の態様では、本発明は、核酸サンプル中で、非感染の被験体と比較して、表５６または表５７に示す少なくとも２個のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現の上昇によって例示されたポリヌクレオチド発現パターンを同定することにより、被験体の核酸サンプルから哺乳動物被験体の感染状態を推測する方法を提供する。本発明の一態様では、感染状態は、感染因子またはその因子に由来するシグナル伝達分子、例えば、これらに限定されるものではないが、グラム陰性菌およびグラム陽性菌、ウィルス、真菌または寄生生物の因子に起因する。さらに別の態様では、本発明は、上述の方法によって同定される感染状態を有する被験体のポリヌクレオチド発現パターンを提供する。一度同定されると、かかるポリヌクレオチドは、かかる感染因子またはシグナル伝達分子の活性または存在に関連する症状の診断方法において有用である。
下記の実施例１０は、本発明のこの態様を説明するものである。詳しくは、表６１は、ＭＥＫおよびＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害因子（インヒビター）が細菌の複製を制限することができる（ネズミチフス菌によりＩＦＮ−γ−初回刺激を受けたマクロファージの感染はＭＥＫキナーゼを誘発する）ことを説明している。これは、宿主細胞シグナル伝達分子を変化させることによって、どれだけ細菌の生存率に大きな影響を及ぼすことができるかを示す実施例である。
本発明の別の態様では、Ｔ細胞の走化性が誘導されるストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）を阻害する化合物を提供する。また、ＳＤＦ−１受容体の発現を低減する化合物も提供する。さらに、かかる化合物は、ＣＸＣＲ−４のアンタゴニストまたはインヒビターとして作用し得る。一態様では、本発明は、ＣＸＣＲ−４のアンタゴニストであるカチオン性ペプチドを提供する。別の態様では、本発明は、ＣＸＣＲ−４のアンタゴニストであるカチオン性ペプチドを同定する方法を提供する。本方法は、試験ペプチドの存在下または不在下において、Ｔ細胞をＳＤＦ−１と接触させるステップ、走化性を測定するステップを含む。試験ペプチドの存在下における走化性の低減は、したがって、ＣＸＣＲ−４のアンタゴニストであるペプチドを示す。かかる化合物と方法は、ＨＩＶ患者の治療用途において有用である。化合物のこれらのタイプとこれらの有用性については、例えば実施例１１で説明している（また表６２、６３も参照されたい）。その実施例では、カチオン性ペプチドが、細胞遊走と、それによる抗ウィルス活性を阻害することが示されている。
一実施形態では、本発明は、一般式（式Ａ）：Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＩＸ４ＰＸ４ＩＰＸ５Ｘ２Ｘ１（配列番号４）（式中、Ｘ１は１個または２個のＲ、ＬまたはＫであり、Ｘ２は１個のＣ、ＳまたはＡであり、Ｘ３は１個のＲまたはＰであり、Ｘ４は１個のＡまたはＶであり、Ｘ５は１個のＶまたはＷである）のアミノ酸配列を有する単離されたカチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、ＬＬＣＲＩＶＰＶＩＰＷＣＫ（配列番号５）、ＬＲＣＰＩＡＰＶＩＰＶＣＫＫ（配列番号６）、ＫＳＲＩＶＰＡＩＰＶＳＬＬ（配列番号７）、ＫＫＳＰＩＡＰＡＩＰＷＳＲ（配列番号８）、ＲＲＡＲＩＶＰＡＩＰＶＡＲＲ（配列番号９）およびＬＳＲＩＡＰＡＩＰＷＡＫＬ（配列番号１０）が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、一般式（式Ｂ）：Ｘ１ＬＸ２Ｘ３ＫＸ４Ｘ２Ｘ５Ｘ３ＰＸ３Ｘ１（配列番号１１）（式中、Ｘ１は１個または２個のＤ、Ｅ、Ｓ、ＴまたはＮであり、Ｘ２は１個または２個のＰ、ＧまたはＤであり、Ｘ３は１個のＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＹであり、Ｘ４は１個のＲ、ＫまたはＨであり、Ｘ５は１個のＳ、Ｔ、Ｃ、ＭまたはＲである）のアミノ酸配列を有する単離された直鎖状カチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、ＤＬＰＡＫＲＧＳＡＰＧＳＴ（配列番号１２）、ＳＥＬＰＧＬＫＨＰＣＶＰＧＳ（配列番号１３）、ＴＴＬＧＰＶＫＲＤＳＩＰＧＥ（配列番号１４）、ＳＬＰＩＫＨＤＲＬＰＡＴＳ（配列番号１５）、ＥＬＰＬＫＲＧＲＶＰＶＥ（配列番号１６）およびＮＬＰＤＬＫＫＰＲＶＰＡＴＳ（配列番号１７）が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、一般式（式Ｃ）：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＷＸ４ＷＸ４Ｘ５Ｋ（配列番号１８）（式中、Ｘ１はＡ、ＰまたはＲから選択される１〜４個であり、Ｘ２は１個または２個の芳香族アミノ酸（Ｆ、ＹおよびＷ）であり、Ｘ３は１個のＰまたはＫであり、Ｘ４はＡ、Ｐ、ＹまたはＷから選択される１個もしくは２個、または０個であり、Ｘ５はＲまたはＰから選択される１〜３個である）（この式にはＣＰ１２ａとＣＰ１２ｄが含まれる）のアミノ酸配列を有する単離された直鎖状カチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、ＲＰＲＹＰＷＷＰＷＷＰＹＲＰＲＫ（配列番号１９）、ＲＲＡＷＷＫＡＷＷＡＲＲＫ（配列番号２０）、ＲＡＰＹＷＰＷＡＷＡＲＰＲＫ（配列番号２１）、ＲＰＡＷＫＹＷＷＰＷＰＷＰＲＲＫ（配列番号２２）、ＲＡＡＦＫＷＡＷＡＷＷＲＲＫ（配列番号２３）およびＲＲＲＷＫＷＡＷＰＲＲＫ（配列番号２４）が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、一般式（式Ｄ）：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ１ＶＸ３Ｘ４ＲＧＸ４Ｘ３Ｘ４Ｘ１Ｘ３Ｘ１（配列番号２５）（式中、Ｘ１は１個または２個のＲまたはＫであり、Ｘ２は極性アミノ酸または荷電アミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＨ）であり、Ｘ３はＣ、Ｓ、Ｍ、ＤまたはＡであり、Ｘ４はＦ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＲである）のアミノ酸配列を有する単離されたヘキサデカマーのカチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、ＲＲＭＣＩＫＶＣＶＲＧＶＣＲＲＫＣＲＫ（配列番号２６）、ＫＲＳＣＦＫＶＳＭＲＧＶＳＲＲＲＣＫ（配列番号２７）、ＫＫＤＡＩＫＫＶＤＩＲＧＭＤＭＲＲＡＲ（配列番号２８）、ＲＫＭＶＫＶＤＶＲＧＩＭＩＲＫＤＲＲ（配列番号２９）、ＫＱＣＶＫＶＡＭＲＧＭＡＬＲＲＣＫ（配列番号３０）およびＲＲＥＡＩＲＲＶＡＭＲＧＲＤＭＫＲＭＲＲ（配列番号３１）が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、一般式（式Ｅ）：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ１ＶＸ５Ｘ４ＲＧＸ４Ｘ５Ｘ４Ｘ１Ｘ３Ｘ１（配列番号３２）（式中、Ｘ１が１個または２個のＲまたはＫであり、Ｘ２は極性アミノ酸または荷電アミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＨ）であり、Ｘ３は１個のＣ、Ｓ、Ｍ、ＤまたはＡであり、Ｘ４は１個のＦ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＲであり、Ｘ５は１個のＡ、Ｉ、Ｓ、Ｍ、ＤまたはＲである）のアミノ酸配列を有する単離されたヘキサデカマーのカチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、ＲＴＣＶＫＲＶＡＭＲＧＩＩＲＫＲＣＲ（配列番号３３）、ＫＫＱＭＭＫＲＶＤＶＲＧＩＳＶＫＲＫＲ（配列番号３４）、ＫＥＳＩＫＶＩＩＲＧＭＭＶＲＭＫＫ（配列番号３５）、ＲＲＤＣＲＲＶＭＶＲＧＩＤＩＫＡＫ（配列番号３６）、ＫＲＴＡＩＫＫＶＳＲＲＧＭＳＶＫＡＲＲ（配列番号３７）およびＲＨＣＩＲＲＶＳＭＲＧＩＩＭＲＲＣＫ（配列番号３８）が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、一般式（式Ｆ）：ＫＸ１ＫＸ２ＦＸ２ＫＭＬＭＸ２ＡＬＫＫＸ３（配列番号３９）（式中、Ｘ１は極性アミノ酸（Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ＮおよびＱ）であり、Ｘ２は１個のＡ、Ｌ、ＳまたはＫであり、Ｘ３はＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、ＫおよびＨから選択される１〜１７個のアミノ酸である）のアミノ酸配列を有する単離された長鎖カチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、ＫＣＫＬＦＫＫＭＬＭＬＡＬＫＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＫＬＴＫ（配列番号４０）、ＫＳＫＳＦＬＫＭＬＭＫＡＬＫＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳ（配列番号４１）、ＫＴＫＫＦＡＫＭＬＭＭＡＬＫＫＶＶＳＴＡＫＰＬＡＩＬＳ（配列番号４２）、ＫＭＫＳＦＡＫＭＬＭＬＡＬＫＫＶＬＫＶＬＴＴＡＬＴＬＫＡＧＬＰＳ（配列番号４３）、ＫＮＫＡＦＡＫＭＬＭＫＡＬＫＫＶＴＴＡＡＫＰＬＴＧ（配列番号４４）およびＫＱＫＬＦＡＫＭＬＭＳＡＬＫＫＫＴＬＶＴＴＰＬＡＧＫ（配列番号４５）が挙げられる。
さらに別の実施形態では、本発明は、一般式（式Ｇ）：ＫＷＫＸ２Ｘ１Ｘ１Ｘ２Ｘ２Ｘ１Ｘ２Ｘ２Ｘ１Ｘ１Ｘ２Ｘ２ＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号４６）（式中、Ｘ１は疎水性アミノ酸であり、Ｘ２は親水性アミノ酸である）のアミノ酸配列を有する単離された長鎖カチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、ＫＷＫＳＦＬＲＴＦＫＳＰＶＲＴＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号４７）、ＫＷＫＳＹＡＨＴＩＭＳＰＶＲＬＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号４８）、ＫＷＫＲＧＡＨＲＦＭＫＦＬＳＴＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号４９）、ＫＷＫＫＷＡＨＳＰＲＫＶＬＴＲＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号５０）、ＫＷＫＳＬＶＭＭＦＫＫＰＡＲＲＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号５１）およびＫＷＫＨＡＬＭＫＡＨＭＬＷＨＭＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号５２）が挙げられる。
さらに別の実施形態では、本発明は、次式：ＫＷＫＳＦＬＲＴＦＫＳＰＶＲＴＶＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号５３）またはＫＷＫＳＹＡＨＴＩＭＳＰＶＲＬＶＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号５４）のアミノ酸配列を有する単離されたカチオン性ペプチドを提供する。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、他のタンパク質、脂質および核酸（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで生成されるペプチドが天然に結合している細胞成分）を実質的に含んでいないペプチドを意味する。好ましくは、ペプチドは、少なくとも７０重量％、８０重量％、最も好ましくは９０重量％の純度である。
また、本発明は、もし、類似体、誘導体、保存的変化、または変異体が、先天性免疫を増強するか、あるいは抗炎症活性を有する検出可能な活性を有している場合、その列挙したポリペプチドの類似体、誘導体、保存的変化、およびカチオン性ペプチド変異体を含んでいる。類似体、誘導体、変化または変異体が、類似体、誘導体、保存的変異、または変異体が誘導されるペプチドの活性と同じ活性を有していることは必要ではない。
カチオン性ペプチド「変異体」は、基準とするカチオン性ペプチドの改変形態であるペプチドである。例えば、「変異体」という用語には、基準ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸を発現ライブラリーにおいて置換したカチオン性ペプチドが含まれる。「基準」ペプチドという用語は、変異体、誘導体、類似体または保存的変異が誘導される、本発明のカチオン性ペプチド（例えば上記の式で定義したもの）のすべてを意味する。「誘導体」という用語の中には、２個の各カチオン性ペプチドの少なくとも１つの部分（例えば、２個のカチオン性ペプチドそれぞれの３０〜８０％）を含むハイブリッドペプチドが含まれている。さらに、誘導体が、先天性免疫を増強するか、あるいは抗炎症活性を有する活性を有している限り、本明細書で列挙したペプチド配列から１個以上のアミノ酸が欠失したペプチドも含まれる。これにより、さらに有用性のある小型の活性分子が形成され得る。例えば、ペプチドの先天性免疫または抗炎症活性の増強に必要でないアミノ酸またはカルボキシ末端アミノ酸を除去することができる。同様に、ペプチドの活性を全く阻害することなく、カチオン性ペプチドに１個または数個の（例えば５個未満の）アミノ酸を付加することにより、新たな誘導体を得ることができる。さらに、Ｃ末端誘導体（例えばＣ末端メチルエステル）およびＮ末端誘導体を得ることもでき、これらも本発明に包含される。本発明のペプチドは、本明細書に記載されている生物学的活性が維持される限り、本発明で記載されているペプチドのすべての類似体、ホモログ、突然変異体、異性体または誘導体が含まれる。さらに、上述の一般式によって包含されるペプチドの逆配列も含まれる。また、「Ｄ」配置のアミノ酸を「Ｌ」配置のアミノ酸と置き換えることもできる。逆もまた同様である。あるいは、ペプチドは、化学的に、または配列内に２個以上のシステイン残基を付加し酸化してジスルフィド結合を形成することにより環化することができる。
また、本発明は、本明細書に例示されているペプチドの保存的変異体であるペプチドも含まれる。本明細書に使用されている「保存的変異体」という用語は、少なくとも１個のアミノ酸が別の生物学的に類似した残基と置換されているポリペプチドを意味する。保存的変異体の例としては、別の残基に対する１個の疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシンまたはメチオニン）の置換、あるいは別の残基に対する１個の極性残基の置換、例えば、アルギニンからリジン、グルタミン酸からアスパラギン酸、またはグルタミンからアスパラギンへ置換すること等が含まれる。互いに置換することができる中性の親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニンが含まれる。また、「保存的変異体」という用語は、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を有するペプチドを包含する。かかる置換アミノ酸は、メチル化されたアミノ酸、またはアミド化されたアミノ酸を含み得る。他の置換については、当業者には公知である。一態様では、置換ポリペプチドに対して産生させた抗体は非置換ポリペプチドにも特異的に結合する。
本発明のペプチドは、慣用の方法、例えば、α−アミノ基のｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣ保護をはじめとする方法によって合成することができる。両方法はいずれも、ペプチドのＣ末端から出発して単一のアミノ酸を各ステップで付加する段階的な合成を含む（Coliganら、Current Protocols in Immunology、Wiley Interscience、1991年、第9部を参照されたい）。また、本発明のペプチドは、周知の固相ペプチド合成法、例えば、ポリマー１ｇ当たり０．１〜１．０ｍＭｏｌのアミン類を含有するコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を用いて、Merrifieldによって記載されている方法（Merrifield J. Am. Chem. Soc.、85:2149頁、1962年）、ならびにStewartおよびYoungによって記載されている方法（StewarおよびYoung、Solid Phase Peptides Synthesis、Freeman、San Francisco、1969年、27〜62頁）により合成することができる。化学合成が終了したら、０℃で約１／４〜１時間、液体ＨＦ−１０％アニソールにより処理することによって、ペプチドの脱保護後、ポリマーからペプチドを切断することができる。試薬を留去した後、１％酢酸溶液を用いてポリマーからペプチドを抽出し、次いで、凍結乾燥して粗生成物を得る。ペプチドは、溶媒として５％酢酸を用いるセファデックスＧ−１５でのゲル濾過などの技術により精製することができる。カラム溶離液の適当な画分を凍結乾燥することにより均質なペプチドが得られ、次いで、標準技法、例えば、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外線吸収分光法、モル旋光度、または溶解度測定によって特徴決定することができる。所望により、ペプチドは固相エドマン分解により定量することができる。
また、本発明は、本発明のペプチドをコードする単離された核酸（例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。本明細書に記載されているペプチドの類似体、突然変異体、保存的変異体および変異体をコードする核酸も含まれる。本明細書で使用されている「単離された」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏで産生させる核酸が天然で結合しているタンパク質、脂質、および他の核酸を実質的に含んでいない核酸を意味する。好ましくは、核酸は、少なくとも７０重量％、８０重量％、または好ましくは９０重量％の純度であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸を合成するための慣用の方法をｉｎ ｖｉｖｏ法の代替として用いることができる。本明細書では、「核酸」は、分離した断片の形態で、あるいは（例えば、本発明のペプチドをコードする核酸にプロモーターを機能可能に結合することによる）大きな遺伝子構築物の成分として、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを意味する。多数の遺伝子構築物（例えば、プラスミドおよび他の発現ベクター）は当技術分野で公知であり、それらを用いて、無細胞系または原核生物もしくは真核生物（例えば、酵母、昆虫または哺乳動物）細胞において本発明のペプチドを得ることができる。当業者は、遺伝コードの縮重を考慮することによって、本発明のポリペプチドをコードする核酸を容易に合成することができる。本発明の核酸は、慣用の分子生物学的方法を用いて、本発明のペプチドを容易に得ることができる。
本発明のカチオン性ペプチドをコードしているＤＮＡは、「発現ベクター」に挿入することができる。「発現ベクター」という用語は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含有するように組換え可能な当技術分野で公知のプラスミド、ウィルスまたは他の運搬体などの遺伝子構築物を意味する。かかる発現ベクターは、宿主細胞中での挿入遺伝子配列の転写を促進するプロモーター配列を含有するプラスミドであるのが好ましい。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、ならびに形質転換細胞の表現型選択を可能とするポリヌクレオチド（例えば、抗生物質耐性ポリヌクレオチド）を含有する。本発明では、誘導プロモーターおよび構成プロモーターをはじめとする種々のプロモーターを利用することができる。典型的には、発現ベクターは、宿主細胞と適合する種に由来する複数の制御配列と１つのレプリコン部位を含有する。
本発明の核酸による受容体の形質転換またはトランスフェクションは、当業者に周知の慣用技術を用いて実施することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合、当技術分野で公知のＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌ法を用いて、ＤＮＡの取込可能なコンピテント細胞を調製することができる。あるいは、物理的手段（例えば、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクション）を用いることができる。エレクトロポレーションは、高電圧電気インパルスによって核酸を細胞へ導入することができる。さらに、当技術分野で周知の方法を用いるプロトプラスト融合により宿主細胞中へ核酸を導入することもできる。真核細胞の形質転換に好適な方法、例えば、エレクトロポレーションおよびリポフェクションもまた周知である。
本発明に包含される「宿主細胞」または「受容細胞」とは、本発明の核酸を用いて本発明のポリペプチドを発現させることができるすべての細胞である。また、この用語には、受容細胞または宿主細胞のすべての後代も含まれる。本発明の好ましい受容細胞または宿主細胞としては、大腸菌、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、あるいは他のグラム陰性菌およびグラム陽性菌、真菌細胞および哺乳動物細胞、ならびに発現ベクターが宿主での発現を可能とする複製起点を含有している限り用いることができる当技術分野で公知の生物、を挙げることができる。
本発明の方法により使用されるカチオン性ペプチドポリヌクレオチド配列は、生物から単離するか、または研究所で合成することができる。対象のカチオン性ペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列は、１）ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離；２）対象のカチオン性ペプチドに必要なコドンを供給するＤＮＡ配列の化学的製造；および３）ドナー細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成、によって得ることができる。後のケースでは、一般にｃＤＮＡと称される、ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補配列が最終的に形成される。
ＤＮＡ配列の合成は、所望のペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が既知である場合の最良の方法であることが多い。本発明では、ＤＮＡ配列の合成は、細菌宿主によって認識される可能性が高いコドンの組込みが可能であり、これにより翻訳に問題を伴わず、高レベルの発現が可能となるという利点を有する。さらに、天然のカチオン性ペプチド、その変異体、または合成ペプチドをはじめとする、すべてのペプチドも実際には合成することができる。
所望のペプチドの全配列が未知である場合、ＤＮＡ配列の直接合成は不可能であり、選択法としてはｃＤＮＡ配列の形成がある。対象のｃＤＮＡ配列を単離させる標準的な手順は、高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞で豊富なｍＲＮＡの逆転写に由来したｃＤＮＡライブラリーを含有するプラスミドまたはファージの作製がある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせて用いる場合、非常に稀な発現産物でさえもクローニングすることができる。カチオン性ペプチドのアミノ酸配列の重要な部分が既知である場合、標的ｃＤＮＡ中に推定上存在する配列を複製する標識一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの調製は、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法で行うことができる。前記方法は一本鎖形状に変性させたｃＤＮＡのクローニングコピーで実施される（Jayら、Nuc. Acid Res.、11:2325頁、1983年）。
本発明のペプチドは、注射によるか、または持続注入によって非経口的に投与することができる。ペプチドは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与することができる。ペプチドの好ましい送達方法は、ミクロスフェアまたはプロテイノイド中の封入による、肺へのエアロゾル送達による経口的送達、あるいはイオン導入法または経皮的エレクトロポレーションによる経皮的送達を含む。他の投与法は当業者には公知である。
本発明のペプチドの非経口投与用製剤には、無菌の水性または非水性の溶剤、懸濁剤および乳剤が含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）などが挙げられる。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液（食塩水および緩衝化媒体を含む）が挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム 、乳酸化リンガー、または不揮発性油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、流体性の栄養添加物、電解質添加物（例えば、リンガーデキストロースをベースとするもの）等が挙げられる。また、保存剤や他の添加物、例えば他の抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等を含んでいてもよい。
本発明は、以下の実施例（これらに限定されるものではない）を参照しながらより詳細に記載する。本発明はこれらのある特定の好ましい実施形態に関して詳載されているが、変更および改変は、記載され、特許請求の範囲に記載した精神および範囲内にあるものと理解されたい。
抗敗血症／抗炎症作用
上皮細胞の転写応答に対するカチオン性ペプチドの影響を検出するためにポリヌクレオチドアレイを用いた。１０％ウシ胎仔血清（FBS、Medicorp）を添加したＤＭＥＭ（Gibco）中でＡ５４９ヒト上皮細胞系を維持した。Ａ５４９細胞は、２．５×１０６細胞／皿にて１００ｍｍの組織培養皿中にプレーティングし、一晩培養し、次いで、４時間、１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（Sigma）、無添加（対照）、もしくは５０μｇ／ｍｌのペプチド、または培地のみのいずれかとインキュベートした。刺激後、ピロ炭酸ジエチルで処理したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて細胞を１回洗浄し、細胞スクレーパを用いて、皿から細胞を分離した。全ＲＮＡは、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（Ambion、Austin、テキサス州）を用いて単離した。ＲＮＡペレットをＳｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（ＲＮａｓｅ阻害剤；Ambion）を含むＲＮａｓｅ不含の水に再懸濁した。ＤＮＡ混入は、ＤＮＡフリーキット（Ambion）で除去した。１％アガロースゲルでのゲル電気泳動法によりＲＮＡの特性を判定した。
用いたポリヌクレオチドアレイは、重複してスポットされている約１４，０００個のヒトオリゴからなる、ヒトオペロンアレイ（Human Operon array）（ゲノム用識別番号はＰＲＨＵ０４−Ｓ１）とした。プローブは全ＲＮＡ１０μｇから調製し、Ｃｙ３またはＣｙ５標識ｄＵＴＰで標識した。そのプローブを精製し、４２℃にて一晩、転写したガラススライドにハイブリダイズさせ、洗浄した。洗浄後、Perkin Elmerアレイスキャナーを用いて画像を記録した。画像処理ソフトウェア（Imapolynucleotide 5.0、Marina Del Rey、カリフォルニア州）により、スポットの平均強度（mean intensity）、中央強度、およびバックグラウンド強度を検出する。また、「手製」プログラムを用いて、バックグラウンドを除いた。プログラムは、各サブグリッドについて最低値（bottom）１０％強度を計算し、各グリッドについてこれを差し引いた。分析はＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇソフトウェア（Redwood City、カリフォルニア州）を用いて行った。各スポットの強度は、スライド内のスポット値の群から中央スポット強度値を得て、この値を実験のすべてのスライドの値と比較することにより標準化した。対照細胞と比較した、ペプチドで処理した細胞で認められた相対変化を表１および表２で確認することができる。これらの表２は、改変された発現について試験した１４，０００個のポリヌクレオチドの発現で有意な変化を示したポリヌクレオチドのみを示している。このデータは、ペプチドが、ＬＰＳによって誘導されたポリヌクレオチドの発現を低減する広範な能力を有していることを示唆している。
表１では、ポリヌクレオチドマイクロアレイによって研究した結果、ペプチド（配列番号２７）が、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳによってアップレギュレートされる多くのポリヌクレオチドの発現を著しく低減することが示される。ペプチド（５０μｇ／ｍｌ）およびＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）、またはＬＰＳ単独をＡ５４９細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離した。５μｇの全ＲＮＡを用いてＣｙ３／Ｃｙ５標識ｃＤＮＡプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞の強度は表１の３番目の欄に示している。「比 ＬＰＳ／対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ＬＰＳで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を表している。「比 ＬＰＳ＋ＩＤ ２７／対照」の欄は、未刺激の細胞で割った、ＬＰＳおよびペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を表している。
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表２では、ポリヌクレオチドマイクロアレイによって研究した結果、５０μｇ／ｍｌの濃度のカチオン性ペプチドが、１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳによってアップレギュレートされた多くのポリヌクレオチドの発現を著しく低減することが示された。ペプチドおよびＬＰＳ、またはＬＰＳ単独を４時間にわたってＡ５４９細胞とインキュベートし、ＲＮＡを単離した。５μｇの全ＲＮＡを用いてＣｙ３／Ｃｙ５標識ｃＤＮＡプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞の強度は表２の３番目の欄に示している。「比 ＬＰＳ／対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ＬＰＳで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を表している。他の欄は、未刺激の細胞で割った、ＬＰＳおよびペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を表している。
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免疫細胞の刺激の中和
グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌産物による免疫細胞の刺激を中和する化合物の能力を試験した。細菌産物が免疫系細胞を刺激して炎症性サイトカインを産生させており、チェックされない場合には、これにより敗血症が発生し得る。最初の実験では、マウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７（American Type Culture Collection(Manassas、ヴァージニア州)から取得）、ヒト上皮細胞系Ａ５４９、および、ＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄由来の一次マクロファージ（Charles River Laboratories、Wilmington、マサチューセッツ州）を用いた。マウス骨髄由来の細胞は、２０％ＦＢＳ（Sigma Chemical Co、St. Louis、ミズーリ州）およびＭ−ＣＳＦ源としての２０％のＬ細胞調整培地を添加したダルベッコ変形イーグル培地（ＤＭＥＭ；Life Technologies Burlington、オンタリオ州）を入れた１５０ｍｍプレートで培養した。マクロファージが６０〜８０％のコンフルエントになったら、１４〜１６時間かけてＬ細胞調整培地からそれらを除いて細胞を静止させ、次いで、２４時間かけて１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたは１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ＋２０μｇ／ｍｌペプチドで処理した。培養液上清中へのサイトカインの放出については、ＥＬＩＳＡ（R & D Systems、Minneapolis、ミネソタ州）によって検出した。細胞系ＲＡＷ２６４．７およびＡ５４９については、１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ中で保持した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＤＭＥＭ中、１ウェル当たり１０６個の細胞密度となるように２４ウェルプレートに播種した。またＡ５４９細胞は、ＤＭＥＭ中、１ウェル当たり１０５個の細胞密度となるように２４ウェルプレートに播種した。両方ともに５％のＣＯ２下、３７℃にて一晩インキュベートした。ＤＭＥＭを一晩増殖させた細胞から吸引し、新鮮な培地と交換した。ある実験では、ボランティアのヒトドナー由来の血液を１４．３ＵＳＰ単位ヘパリン／ｍｌ血液を含有するチューブ（Becton Dickinson、Franklin Lakes、ニュージャージー州）に静脈穿刺により採取した（UBC Clinical Research Ethics Board、認証COO-0537に従って行った）。この血液は、６時間、３７℃にて、ポリプロピレンチューブ内で、ペプチド含有または非含有のＬＰＳと混合した。サンプルを２０００×ｇで５分間遠心分離にかけ、血漿を回収し、次いで、−２０℃にて保存し、ＥＬＩＳＡ（R & D Systems）によってＩＬ−８について分析した。細胞の実験では、ＬＰＳまたは他の細菌産物を細胞とともに５％ＣＯ２下、３７℃にて６〜２４時間インキュベートした。ネズミチフス菌（S.typhimurium）ＬＰＳおよび大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳはＳｉｇｍａから購入した。黄色ブドウ球菌（S.aureus）由来のリポタイコ酸（ＬＴＡ）（Ｓｉｇｍａ）を内毒素不含の水（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。リムルス変形細胞溶解アッセイ（Ｓｉｇｍａ）をＬＴＡ調製物で実施し、ロットが菌体内毒素の有意な混入を含まないことを確認した。菌体内毒素混入は１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度であり、ＲＡＷ２６４．７細胞において有意なサイトカイン産生をもたらさない濃度であった。ノンキャップのリポアラビノマンナン（ＡｒａＬＡＭ）は、コロラド州立大学のJohn T. Belisle博士から寄贈されたものであった。マイコバクテリウム由来のＡｒａＬＡＭはフィルタ殺菌し、その菌体内毒素混入は、リムルス変形細胞アッセイにより検出した場合、ＬＡＭ１．０ｍｇ当たり３．７５ｎｇであることが分かった。ＬＰＳ添加と同時に（あるいは厳密に記載した場合には添加より遅れて）、カチオン性ペプチドを一連の濃度で添加した。上清を取り出し、ＥＬＩＳＡ（R & D Systems）によりサイトカイン産生について試験した。すべてのアッセイは、少なくとも３回実施し、同様の結果を得た。抗敗血症活性をｉｎ ｖｉｖｏで確認するために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）に溶解した大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳの２μｇまたは３μｇを腹腔内注射し、ガラクトサミン感作８〜１０週齢メスＣＤ−１またはＢＡＬＢ／ｃマウスに敗血症を誘発させた。ペプチドに関する実験では、ＬＰＳ注射の１０分以内に、滅菌水１００μｌに溶解したペプチド２００μｇを個々の腹腔内部位に注射した。別の実験では、ＣＤ−１マウスに４００μｇの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳを注射し、１０分後に、ペプチド（２００μｇ）を腹腔内注射により注入した。注射後４８時間にわたり生存についてモニターした。
ＴＮＦ−αの過剰産生は、典型的には敗血症の進行に関係がある。本実施例で使用したＬＰＳ、ＬＴＡまたはＡｒａＬＡＭの３つのタイプは、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両方から放出された産物を表わしている。ペプチド（配列番号１）は、ネズミチフス菌、セパシア菌および大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳにより刺激されたＴＮＦ−α産生を有意に低減することができたが、前者については幾分作用の程度が低くかった（表３）。ペプチド１μｇ／ｍｌの低濃度（０．２５ｎＭ）では、後者２つの事例においては、ＴＮＦ−α産生が本質的に低減することが認められた。異なるペプチドの配列番号３は、ＲＡＷマクロファージ細胞において、ＴＮＦ−αのＬＰＳ誘導産生を低減しなかったが、これは、カチオン性ペプチドが均一でなく、かつ予測可能な特性ではないことを示唆している。また、各式の代表的なペプチドについて、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳにより刺激されるＴＮＦ−α産生に対して影響を及ぼす能力を試験した（表４）。これらのペプチドは、大部分が少なくとも６０％までＴＮＦ−αを低下させたが、ＴＮＦ−α産生を低減する様々な能力を有していた。
また、ある特定の濃度では、配列番号１および配列番号２のペプチドは、細菌産物が上皮細胞系によるＩＬ−８産生を刺激する能力を低減させることができる。ＬＰＳは、上皮細胞によるＩＬ−８産生の既知の強力な刺激である。ペプチドは、低濃度（１〜２０μｇ／ｍｌ）で、ＬＰＳに対する上皮細胞のＩＬ−８誘導反応を中和した（表５〜７）。また、配列番号２のペプチドは、ヒト全血におけるＩＬ−８のＬＰＳ誘導産生を抑制した（表４）。反対に、高濃度（５０〜１００μｇ／ｍｌ）の配列番号１のペプチドは、実際に、ＩＬ−８の濃度を上昇させた（表５）。このことは、ペプチドは、異なる濃度で異なる作用を有することがあることを示唆している。
また、炎症刺激に対するペプチドの影響について、配列番号１のペプチドが、１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳで刺激されたＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄由来マクロファージによりＴＮＦ−α産生が有意に低減する（＞９０％）ことが一次マウス細胞で証明された（表８）。これらの実験は、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）（ＬＰＳがＣＤ１４へ迅速に結合することを媒介可能なタンパク質）を含有している血清の存在下で行った。また、１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳによる刺激後１時間遅れて配列番号１をマクロファージの上清に添加すると、ＴＮＦ−α産生の本質的な低減（７０％）がやはり生じた（表９）。
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α産生を防止する配列番号１の能力と一致して、ある種のペプチドは、高濃度のＬＰＳにより誘導される致死性ショックからマウスを保護した。ある実験では、ＣＤ−１マウスにガラクトサミンを先に注射した後、ＬＰＳを感作させた。大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳを３μｇ注射した、ガラクトサミン感作マウスは、４〜６時間以内にすべて死滅した。ＬＰＳの１５分後に２００μｇの配列番号１を注射すると、マウスの５０％が生存した（表１０）。他の実験では、高濃度のＬＰＳをＤ−ガラクトサミンで感作されていないＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した場合、生存なしの対照群と比較して、ペプチドにより１００％保護された（表１３）。また、選択した他のペプチドにおいても、これらのモデルで保護することが確認された（表１１、１２）。
さらに、カチオン性ペプチドは、グラム陽性細菌の産物（例えば、マイコバクテリウムのノンキャップのリポアラビノマンナン（ＡｒａＬＡＭ）および黄色ブドウ球菌ＬＴＡ）によるマクロファージの刺激を低下させることができた。例えば、配列番号１は、グラム陽性細菌産物のＬＴＡ（表１４）と、より少量のＡｒａＬＡＭ（表１５）によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＴＮＦ−αの誘導を阻害した。また、別のペプチドである配列番号２もＲＡＷ２６４．７細胞によるＬＴＡ誘導性ＴＮＦ−α産生を低減することが確認された。１μｇ／ｍｌの濃度では、配列番号１は、１μｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌ＬＴＡによるＴＮＦ−α産生の誘導を実質的に低減することができた（＞７５％）。２０μｇ／ｍｌの配列番号１では、ＡｒａＬＡＭ誘導性ＴＮＦ−αを＞６０％で阻害した。配列番号１によるＡｒａＬＡＭ誘導性ＴＮＦ−αの阻害において菌体内毒素の混入が有意な要因ではないことを示すために、対照としてポリミキシンＢ（ＰＭＢ）を入れた。これらの結果は、カチオン性ペプチドが、細菌産物に対する免疫系の前炎症性サイトカイン反応を低減することができることを示唆している。
表３：ＲＡＷ２６４．７細胞における配列番号１によるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α産生の低減
６時間にわたり示した濃度の配列番号１の存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのネズミチフス菌ＬＰＳ、１００ｎｇ／ｍｌのセパシア菌ＬＰＳ、および１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳによりＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞を刺激した。培養液上清へ放出されたＴＮＦ−αの濃度は、ＥＬＩＳＡによって検出した。１００％は、６時間にわたりＬＰＳ単独とインキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞から得られたＴＮＦ−αの量を表わす（ネズミチフス菌ＬＰＳ＝３４．５±３．２ｎｇ／ｍｌ、セパシア菌ＬＰＳ＝１１．６±２．９ｎｇ／ｍｌ、および大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳ＝３０．８±２．４ｎｇ／ｍｌ）。６時間無刺激で培養されたＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦ−α産生のバックグランドレベルは、０．０３７〜０．１９２ｎｇ／ｍｌの範囲のＴＮＦ−α濃度であった。データは二連のサンプルから取得し、３回の実験の平均＋標準誤差として示した。
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表４：ＲＡＷ２６４．７細胞におけるカチオン性ペプチドによる大腸菌ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α産生の低減
６時間にわたり提示した濃度のカチオン性ペプチドの存在下で、１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳを用いてＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞を刺激した。培養液上清へ放出されたＴＮＦ−αの濃度はＥＬＩＳＡによって検出した。６時間無刺激で培養されたＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦ−α産生のバックグランドレベルは、０．０３７〜０．１９２ｎｇ／ｍｌの範囲のＴＮＦ−α濃度であった。データは二連のサンプルから取得し、３回の実験の平均＋標準誤差として示した。
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表５：Ａ５４９細胞におけるＬＰＳ誘導性ＩＬ−８産生の配列番号１による低減
２４時間にわたりＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４）の存在下において、濃度を次第に高めた配列番号１を用いてＡ５４９細胞を刺激した。培養液上清中のＩＬ−８の濃度は、ＥＬＩＳＡによって検出した。細胞単独のＩＬ−８のバックグラウンドレベルは、０．１７２±０．０２９ｎｇ／ｍｌであった。データは３回の実験の平均＋標準誤差として示した。
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表６：Ａ５４９細胞における大腸菌ＬＰＳ誘導性ＩＬ−８産生の配列番号２による低減
２４時間にわたりＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４）の存在下において、濃度を次第に高めた配列番号２を用いてヒトＡ５４９上皮細胞を刺激した。培養液上清中のＩＬ−８の濃度はＥＬＩＳＡによって検出した。データは３回の実験の平均＋標準誤差として示した。
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表７：ヒト血液における大腸菌ＬＰＳ誘導性ＩＬ−８の配列番号２による低減
４時間にわたり濃度を次第に高めたペプチドと大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳを用いてヒト全血を刺激した。ヒト血液サンプルを遠心分離にかけ、血清を取り出し、ＩＬ−８をＥＬＩＳＡにより試験した。データは、２名のドナーの平均として示す。
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表８：マウス骨髄マクロファージにおける大腸菌ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α産生の配列番号１による低減
ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄由来のマクロファージを、２０μｇ／ｍｌのペプチドの存在下または不在下で、１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳとともに６時間または２４時間培養した。上清を回収し、ＴＮＦ−αの濃度についてＥＬＩＳＡで試験した。データは、６時間（１．１±０．０９ｎｇ／ｍｌ）または２４時間（１．７±０．２ｎｇ／ｍｌ）、単独のＬＰＳとインキュベートした骨髄由来マクロファージの二連ウェルから得られたＴＮＦ−αの量を示す。ＴＮＦ−αのバックグラウンドレベルは、６時間の場合０．０３８±０．００８ｎｇ／ｍｌであり、２４時間の場合０．０６±０．０１２ｎｇ／ｍｌであった。
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表９：Ａ５４９細胞への配列番号１の遅延添加による大腸菌ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α産生の阻害
Ａ５４９ヒト上皮細胞と１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳをすでに含有しているウェルに、ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を経時的に添加した。６時間後に上清を回収し、ＴＮＦ−αの濃度についてＥＬＩＳＡにより試験した。データは３回の実験の平均＋標準誤差として示した。
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表１０：ガラクトサミン感作ＣＤ−１マウスの致死性内毒素血症に対する配列番号１による防御
ＣＤ−１マウス（９週齢）にガラクトサミン（０．１ｍｌ滅菌ＰＢＳに２０ｍｇ溶解）を３回腹腔内注射して菌体内毒素を感作させた。次いで、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（０．１ｍｌＰＢＳに３μｇ）の腹腔内注射により内毒素性ショックを誘導した。ＬＰＳを注射してから１５分後に、それぞれの腹腔内部位に配列番号１のペプチド（２００μｇ／マウス＝８ｍｇ／ｋｇ）を注射した。４８時間マウスをモニターし、結果を記録した。
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表１１：ガラクトサミン感作ＣＤ−１マウスの致死性内毒素血症に対するカチオン性ペプチドによる防御
ＣＤ−１マウス（９週齢）にガラクトサミン（０．１ｍｌ滅菌ＰＢＳに２０ｍｇ溶解）を腹腔内注射して菌体内毒素を感作させた。次いで、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（０．１ｍｌＰＢＳに２μｇ）の腹腔内注射により内毒素性ショックを誘導した。ＬＰＳを注射してから１５分後に、それぞれの腹腔内部位にペプチド（２００μｇ／マウス＝８ｍｇ／ｋｇ）を注射した。４８時間マウスをモニターし、結果を記録した。
Figure 2005536985
表１２：ガラクトサミン感作ＢＡＬＢ／ｃマウスの致死性内毒素血症に対するカチオン性ペプチドによる防御
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢）にガラクトサミン（０．１ｍｌ滅菌ＰＢＳに２０ｍｇ溶解）を腹腔内注射して菌体内毒素を感作させた。次いで、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（０．１ｍｌＰＢＳに２μｇ）の腹腔内注射により内毒素性ショックを誘導した。ＬＰＳを注射してから１５分後に、それぞれの腹腔内部位にペプチド（２００μｇ／マウス＝８ｍｇ／ｋｇ）を注射した。４８時間マウスをモニターし、結果を記録した。
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表１３：ＢＡＬＢ／ｃマウスの致死性内毒素血症に対する配列番号１による防御
ＢＡＬＢ／ｃマウスに４００μｇの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳを腹腔内注射した。それぞれの腹腔内部位にペプチド（２００μｇ／マウス＝８ｍｇ／ｋｇ）を注射し、４８時間マウスをモニターして結果を記録した。
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表１４：黄色ブドウ球菌ＬＴＡにより誘導されるＴＮＦ−α産生のペプチド阻害
濃度を次第に高めたペプチドの存在下および不在下において、１μｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌ＬＴＡでＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞を刺激した。上清を回収し、ＴＮＦ−αの濃度をＥＬＩＳＡで試験した。６時間無刺激で培養されたＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦ−α産生のバックグランド濃度は、０．０３７〜０．１９２ｎｇ／ｍｌの範囲のＴＮＦ−α濃度であった。データは３回以上の実験の平均＋標準誤差として示した。
Figure 2005536985
表１５：マイコバクテリウムのノンキャップリポアラビノマンナンにより誘導されるＴＮＦ−α産生のペプチド阻害
２０μｇ／ｍｌペプチドまたはポリミキシンＢの不在下および存在下において、１μｇ／ｍｌのＡｒａＬＡＭでＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞を刺激した。上清を回収し、ＴＮＦ−αの濃度をＥＬＩＳＡで試験した。６時間無刺激で培養されたＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦ−α産生のバックグランド濃度は、０．０３７〜０．１９２ｎｇ／ｍｌの範囲のＴＮＦ−α濃度であった。データは３回以上の実験の平均阻害＋標準誤差として示した。
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カチオン性ペプチドの毒性の評価
本ペプチドの潜在的毒性について２種類の方法で測定した。第１に、細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）（乳酸デヒドロゲナーゼ−ＬＤＨ）アッセイを用いた。このアッセイは、損傷を受けた細胞の細胞質ゾルから上清へ放出されたＬＤＨ活性を測定することに基づいた、細胞死と細胞溶解を定量する比色定量アッセイである。ＬＤＨはすべての細胞中に存在する安定した細胞質酵素であり、細胞膜の損傷時に細胞培養上清に放出される。死滅細胞または細胞膜に損傷を受けた細胞の量が上昇すると、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＯＤ４９０ｎｍ）で測定した場合、培養液上清中のＬＤＨ酵素活性が上昇する（アッセイで形成された色素の量は、溶解した細胞数に比例する）。このアッセイでは、ヒト気管支上皮細胞（１６ＨＢＥｏｌ４、ＨＢＥ）を２４時間かけてペプチド１００μｇとインキュベートし、上清を取り出し、ＬＤＨについて分析した。カチオン性ペプチドの毒性の測定に用いた別のアッセイは、ＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ）であった。このアッセイは、生細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１の切断に基づいた、細胞増殖および細胞生存率を定量する比色定量のアッセイである（［３Ｈ］−チミジン取込み反応アッセイに代わる非放射性アッセイ）。このアッセイでは、ＨＢＥ細胞を２４時間かけてペプチド１００μｇとインキュベートし、次いで、１０μｌ／ウェルの細胞増殖試薬ＷＳＴ−１を添加した。細胞をこの試薬とインキュベートし、次いで、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＯＤ４９０ｎｍ）でプレートを測定した。
下記の表１６および表１７に示した結果は、大部分のペプチドが試験した細胞に対して無毒であることを証明している。しかし、式Ｆのペプチド４種類（配列番号４０、４１、４２および４３）は、両アッセイにより測定した結果、膜損傷を誘発した。
表１６：ＬＤＨ放出アッセイによって測定した場合のカチオン性ペプチドの毒性
ヒトＨＢＥ気管支上皮細胞を２４時間にわたり１００μｇ／ｍｌのペプチドまたはポリミキシンＢとインキュベートした。ＬＤＨ活性は細胞培養の上清中で分析した。１００％ＬＤＨ放出の対照として、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した。データは平均±標準偏差として示す。配列番号４０、４１、４２および４３のペプチドのみ、どれも有意な毒性を示した。
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表１７：ＷＳＴ−１アッセイにより測定した場合のカチオン性ペプチドの毒性
ＨＢＥ細胞を２４時間にわたり１００μｇ／ｍｌのペプチドまたはポリミキシンＢとインキュベートし、細胞生存率を分析した。データは平均±標準偏差として示す。１００％ＬＤＨ放出の対照として、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した。配列番号４０、４１、４２および４３のペプチドのみ、どれも有意な毒性を示した。
Figure 2005536985
カチオン性ペプチドによるポリヌクレオチド調節
ポリヌクレオチドアレイを利用してマクロファージと上皮細胞の転写応答に対するカチオン性ペプチドそれ自体の影響を検出した。マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７、ヒト気管支細胞（ＨＢＥ）、またはＡ５４９ヒト上皮細胞を５．６×１０６細胞／皿にて１５０ｍｍ組織培養皿に播種し、一晩培養し、次いで、４時間にわたり５０ｇ／ｍｌのペプチドと一緒にまたは培地のみでインキュベートした。刺激後、ピロ炭酸ジエチル処理ＰＢＳで細胞を一回洗浄し、細胞スクレーパを用いて皿から取り出した。全ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ（Gibco Life Technologies）を用いて単離した。このＲＮＡペレットをＲＮａｓｅ阻害剤（Ambion、Austin、テキサス州）を含有するＲＮａｓｅ不含の水に再懸濁した。３７℃で１時間、ＤＮａｓｅＩ（Clontech、Palo Alto、カリフォルニア州）によりＲＮＡを処理した。終結混合物（０．１ＭのＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］、１ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン）を添加した後、サンプルをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１回、クロロホルムで１回抽出した。次いで、ＲＮＡに２．５容量の１００％エタノールと１／１０容量の酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を添加して沈殿させた。ＲＮＡをＲＮａｓｅ阻害剤（Ambion）を含むＲＮａｓｅ不含の水に再懸濁し、−７０℃で保存した。ＲＮＡの特性については、１％アガロースゲルでのゲル電気泳動法によって評価した。ゲノムＤＮＡ混入がないことについては、β−アクチン−特異的プライマー（５’−ＧＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＣＴＧＧＴＣ−３’（配列番号５５）および５’−ＧＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣ−３’（配列番号５６））を用いたＰＣＲ増幅に鋳型として単離したＲＮＡを用いて評価した。３５サイクル後に、アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムブロミド染色によりアンプリコンが存在しないことを確認した。
初期ポリヌクレオチドアレイ試験（表１８、１９）のため、正荷電膜上に重複してスポットした５８８個の選択マウスｃＤＮＡからなるＡｔｌａｓ ｃＤＮＡ発現アレイ（Clontech, Palo Alto、カリフォルニア州）を用いた。５μｇの全ＲＮＡから調製された３２Ｐ放射標識ｃＤＮＡプローブを７１℃にて一晩アレイとともにインキュベートした。フィルタを十分に洗浄し、次いで、４℃にて３日間、ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒスクリーン（Molecular Dynamics、Sunnyvale、カリフォルニア州）に暴露した。画像はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰＳＩ ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒを用いて記録した。ハイブリダイゼーションシグナルは、ＡｔｌａｓＩｍａｇｅ １．０ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエア（Clontech）およびＥｘｃｅｌ（Microsoft、Redmond、WA）を用いて分析した。各スポットの強度はバックグラウンドレベルに対して調整し、刺激条件：β−アクチン、ユビキチン、リボソームタンパク質Ｓ２９、グリセリンアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ））と、Ｃａ２＋結合タンパク質との間でほとんど変化がないことが確認された５個のポリヌクレオチドに対する平均値を用いてプローブ標識の差異を標準化した。所与のｃＤＮＡに対して標準化されたハイブリダイゼーション強度が２０未満であった場合、値として２０を代入して比および相対発現を算出した。
使用したポリヌクレオチドアレイ（表２１〜２６）は、重複してスポットされている７，４５８個のヒトｃＤＮＡからなる、ＲｅｓｇｅｎヒトｃＤＮＡアレイ（ゲノムの識別番号はＰＲＨＵ０３−Ｓ３である）であった。プローブは１５〜２０μｇの全ＲＮＡから調製し、Ｃｙ３標識化ｄＵＴＰで標識した。プローブは精製し、４２℃で転写したガラススライドに一晩ハイブリダイズさせ、洗浄した。洗浄後、Ｖｉｒｔｅｋスライドリーダーを用いて画像を記録した。画像処理ソフトウェア（Imagene 4.1、Marina Del Rey、カリフォルニア州）により、スポット平均強度、中央強度およびバックグラウンド強度を検出する。標準化と分析は、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇソフトウエア（Redwood City、カリフォルニア州）により行った。強度値は、Ｉｍａｇｅｎｅによって検出された平均強度値から平均バックグラウンド強度を引いて算出した。各スポットの強度は、スライド内のスポット値の群から中央スポット強度値を取得し、この値を実験のすべてのスライドの値と比較することによって標準化した。対照細胞と比較したペプチド処理細胞で観察された相対変化は、下記の表で確認することができる。
使用した他のポリヌクレオチドアレイ（表２７〜３５）は、重複してスポットされた約１４，０００個のヒトオリゴからなる、ヒトオペロンアレイ（ゲノムに対する識別番号はＰＲＨＵ０４−Ｓ１）であった。プローブは全ＲＮＡ１０μｇから調製し、Ｃｙ３またはＣｙ５標識ｄＵＴＰで標識した。これらの実験では、Ａ５４９上皮細胞を２．５×１０６細胞／皿で１００ｍｍの組織培養皿に播種した。全ＲＮＡはＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（Ambion）を用いて単離した。ＤＮＡ混入は、ＤＮＡフリーキット（Ambion）で除去した。全ＲＮＡから調製したプローブは精製し、４２℃にて転写されたガラススライドに一晩ハイブリダイズさせ、洗浄した。洗浄後、Perkin Elmerアレイスキャナーを用いて画像を記録した。画像処理ソフトウェア（Imagene5.0、Marina Del Rey、カリフォルニア州）により、スポット平均強度、中央強度およびバックグラウンド強度を検出する。「自家製」プログラムを用いて、バックグラウンドを除いた。プログラムにより各サブグリッドの最低値１０％の強度を計算し、各グリッドについてこれを差し引く。分析は、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇソフトウエア（Redwood City、カリフォルニア州）で行った。各スポットの強度は、スライド内のスポット値の群から中央スポット強度値を取得し、この値を実験のすべてのスライドの値と比較することによって標準化した。対照細胞と比較したペプチド処理細胞で観察された相対変化は、下記の表で確認することができる。
半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ポリヌクレオチドアレイ結果を確認するために実施した。１μｇのＲＮＡサンプルを、１μｌのオリゴｄＴ（５００μｇ／ｍｌ）と１μｌの１ｍＭ混合ｄＮＴＰストックと共に、ＤＥＰＣ処理水中で１２μｌ容量とサーモサイクラーにおいて６５℃にて５分間インキュベートした。４μｌの５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、および１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴ組換えリボヌクレアーゼ阻害剤（４０単位／μｌ）を添加し、４２℃で２分間インキュベートし、次いで、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Invitrogen, Burlington、オンタリオ州）１μｌ（２００単位）を添加した。各ＲＮＡ供与源の陰性対照は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩの不在下における並行反応を用いて生成した。５’プライマーおよび３’プライマー（１．０μＭ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合物、１．５ｍＭのＭｇＣｌ、１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs、Missisauga、オンタリオ州）、および１×ＰＣＲバッファーの存在下でｃＤＮＡを増幅させた。各ＰＣＲは、９４℃における３０秒の変性、５２℃または５５℃における３０秒のアニーリング、７２℃における４０秒の伸長からなるサイクルを３０〜４０回用いてサーマルサイクラーにより実施した。ＰＣＲのサイクル数は、各プライマーとＲＮＡサンプルのセットの反応の直線位相に位置するように最適化した。抽出方法を評価し、かつＲＮＡの量を推定するために、ハウスキーピングポリヌクレオチドβ−アクチンを各実験で増幅した。反応産物を電気泳動により視覚化し、濃度計測によって分析した。相対出発ＲＮＡ濃度はβ−アクチン増幅を参照して算出した。
表１８は、ＲＡＷ２６４．７細胞を配列番号１で処置すると、選択した既知のポリヌクレオチドによる小型Ａｔｌａｓマイクロアレイにおいて、３０を越える異なるポリヌクレオチドの発現をアップレギュレートしたことを示している。ペプチド（配列番号１）によってアップレギュレートされたポリヌクレオチドは、主として２つのカテゴリー、すなわち、受容体（増殖、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、ホルモン、神経伝達物質）、細胞表面抗原、および細胞接着を含むものと、細胞間コミュニケーション（増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、ホルモン）、細胞骨格、運動性、およびタンパク質ターンオーバーを含むものであった。アップレギュレートされた特定のポリヌクレオチドには、ケモカインＭＣＰ−３、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、マクロファージコロニー刺激因子、および受容体、例えば、ＩＬ−１Ｒ−２（ＩＬ−１Ｒ１に結合する生産性ＩＬ−１の推定上アンタゴニスト）、ＰＤＧＦ受容体Ｂ、ＮＯＴＣＨ４、ＬＩＦ受容体、ＬＦＡ−１、ＴＧＦβ受容体１、Ｇ−ＣＳＦ受容体、およびＩＦＮγ受容体をコードするものが含まれていた。また、ペプチドは、いくつかのメタロプロテイナーゼ、およびこれらのインヒビター、例えば、骨形成タンパク質ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−８ａ、ＴＩＭＰ２およびＴＩＭＰ３をコードするポリヌクレオチドをアップレギュレートした。さらに、ペプチドは、特定の転写因子、例えば、ＪｕｎＤ、ならびにＹＹおよびＬＩＭ−１転写因子と、キナーゼ、例えば、その広範な効果を示すＥｔｋ１およびＣｓｋをアップレギュレートした。さらに、ポリヌクレオチドアレイ研究からは、配列番号１が、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞の少なくとも２０個のポリヌクレオチドをダウンレギュレートしたことが明らかになった（表１９）。ペプチドによってダウンレギュレートされたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ修復タンパク質といくつかの炎症媒介因子、例えば、ＭＩＰ−１α、オンコスタチンＭ、およびＩＬ−１２を含んでいた。ポリヌクレオチド発現に対するペプチドの数多くの影響はＲＴ−ＰＣＲによって確認した（表２０）。また、ペプチド（配列番号２、配列番号３、配列番号１９および配列番号１）、ならびに各式の代表的なペプチドは主に、中型マイクロアレイ（７８３５個のポリヌクレオチド）を用いて、ヒト上皮細胞系の転写応答を改変した。ポリヌクレオチド発現に対する配列番号１の影響は、２種類のヒト上皮細胞系、Ａ５４９およびＨＢＥで比較した。未刺激細胞に比べて２倍以上の比で２個以上のペプチドによりアップレギュレートされた宿主免疫反応に関係しているポリヌクレオチドは、表２１に記載されている。未刺激細胞に比べて２倍以上の比で２個以上のペプチドによりダウンレギュレートされたポリヌクレオチドは、表２２に記載されている。表２３および表２４には、それぞれアップレギュレートおよびダウンレギュレートされたヒト上皮前炎症性ポリヌクレオチドを示している。表２５および表２６には、カチオン性ペプチドによって影響を受けた抗炎症性ポリヌクレオチドを示している。カチオン性ペプチドは、抗炎症の応答をアップレギュレートし、前炎症の応答をダウンレギュレートするという傾向が明らかになった。ポリヌクレオチドが、ダウンレギュレートされた抗炎症の応答に関連していることを確認するのは非常に困難であった（表２６）。カチオン性ペプチドによりアップレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチドは、主として遊走と接着に関係するポリヌクレオチドであった。ダウンレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチドのうち、カチオン性ペプチドのすべてがいくつかのトール様受容体（ＴＬＲ）ポリヌクレオチド（感染因子に対する宿主反応のシグナル伝達において非常に重要である）に影響を及ぼしたことに注目すべきである。これらのペプチドのすべてによってアップレギュレートされた重要な抗炎症性ポリヌクレオチドは、ＩＬ−１０受容体である。ＩＬ−１０は、前炎症性サイトカインの調節に関与する重要なサイトカインである。また、表２７および表２８の配列番号６のペプチドについて確認した結果、これらのポリヌクレオチド発現作用は、一次ヒトマクロファージを用いて確認された。選択したポリヌクレオチド（試験した１４，０００のうち）のヒト上皮細胞発現における各式の代表的なペプチドの影響は下記の表３１〜３７に示している。各式の少なくとも６個のペプチドは、ヒト上皮のポリヌクレオチド発現を改変する能力に関して試験し、実際にこれらのペプチドは広範囲の刺激性の影響があった。各式においては、その群内の各ペプチドにより一般にアップレギュレートされる少なくとも５０個のポリヌクレオチドが存在した。
表１８：ＲＡＷマクロファージ細胞のペプチド（配列番号１）処理によりアップレギュレートされたポリヌクレオチドａ
５０μｇ／ｍｌ濃度のカチオン性ペプチドは、数個のポリヌクレオチドの発現を顕著に誘導することがわかった。ペプチドをＲＡＷ細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、Ａｔｌａｓアレイにハイブリダイズさせた。未刺激の細胞の強度は第３番目の欄に示している。「比 ペプチド：未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
ハウスキーピングポリヌクレオチドの標準化した強度の変化は０．８〜１．２倍であり、標準化にこれらのポリヌクレオチドを使用することが有効であった。所与のｃＤＮＡに対して標準化されたハイブリダイゼーション強度が２０未満であった場合、値として２０を代入して比および相対発現を算出した。アレイの試験は異なるＲＮＡ調製物で３回繰り返し、その平均の倍率変化は上に示している。相対発現レベルの２倍以上の変化を有するポリヌクレオチドを示す。
Figure 2005536985
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表１９：ＲＡＷマクロファージ細胞の配列番号１処理によりダウンレギュレートされたポリヌクレオチドａ
５０μｇ／ｍｌ濃度のカチオン性ペプチドは、いくらかのポリヌクレオチドの発現を低減することが示された。ペプチドをＲＡＷ細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、Ａｔｌａｓアレイにハイブリダイズさせた。未刺激の細胞の強度は第３番目の欄に示している。「比 ペプチド：未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。アレイの試験は異なる細胞で３回繰り返し、その平均の倍率変化は下に示している。相対発現レベルの２倍以上の変化を有するポリヌクレオチドを示す。
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表２０：ペプチド（配列番号１）に反応したポリヌクレオチド発現変化はＲＴ−ＰＣＲにより確認することができる
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞は、ペプチド５０μ／ｍｌと共にまたは培地のみで、４時間インキュベートし、全ＲＮＡを単離し、半定量的ＲＴ−ＰＣＲに供した。各ポリヌクレオチドに対する特異的プライマーペアをＲＮＡの増幅に用いた。陽性対照として、および標準化のために、β−アクチンの増幅を用いた。ＲＴ−ＰＣＲ産物について濃度測定分析を用いた。これらの結果は、培地のみでインキュベートした細胞に比べて、ペプチドで処理した細胞のポリヌクレオチド発現の相対的な倍率変化を意味する。データは３回の実験の平均±標準誤差として示す。
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表２１：Ａ５４９上皮細胞のペプチド処理によりアップレギュレートされたポリヌクレオチドａ
５０μｇ／ｍｌ濃度のカチオン性ペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトｃＤＮＡアレイＩＤ＃ＰＲＨＵ０３−Ｓ３にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２の欄に示している。「比 ペプチド：未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
Figure 2005536985
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表２２：Ａ５４９上皮細胞のペプチド処理によりダウンレギュレートされたポリヌクレオチドａ
５０μｇ／ｍｌ濃度のカチオン性ペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を低下させることを示した。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトｃＤＮＡアレイＩＤ＃ＰＲＨＵ０３−Ｓ３にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２の欄に示している。「比 ペプチド：未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
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表２３：Ａ５４９細胞のペプチド処理によりアップレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチド
５０μｇ／ｍｌ濃度のカチオン性ペプチドは、ある種の前炎症性ポリヌクレオチドの発現を高めることが示された（データは表２１の一部である）。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトｃＤＮＡアレイＩＤ＃ＰＲＨＵ０３−Ｓ３にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２の欄に示している。「比 ペプチド：未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
Figure 2005536985
表２４：Ａ５４９細胞のペプチド処理によりダウンレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチド
５０μｇ／ｍｌ濃度のカチオン性ペプチドは、ある種の前炎症性ポリヌクレオチドの発現を低下させることが示された（データは表２２の一部である）。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトｃＤＮＡアレイＩＤ＃ＰＲＨＵ０３−Ｓ３にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２の欄に示している。「比 ペプチド：未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
Figure 2005536985
表２５：Ａ５４９細胞のペプチド処理によりアップレギュレートされた抗炎症性ポリヌクレオチド
５０μｇ／ｍｌ濃度のカチオン性ペプチドは、ある種の前炎症性ポリヌクレオチドの発現を高めることが示された（データは表２１の一部である）。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトｃＤＮＡアレイＩＤ＃ＰＲＨＵ０３−Ｓ３にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２の欄に示している。「比 ペプチド：未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
Figure 2005536985
表２６：Ａ５４９細胞のペプチド処理によりダウンレギュレートされた抗炎症性ポリヌクレオチド
５０μｇ／ｍｌ濃度のカチオン性ペプチドは、ある種の前炎症性ポリヌクレオチドの発現を高めることが示された（データは表２１の一部である）。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトｃＤＮＡアレイＩＤ＃ＰＲＨＵ０３−Ｓ３にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２の欄に示している。「比 ペプチド：未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
Figure 2005536985
表２７：一次ヒトマクロファージにおいて配列番号６によりアップレギュレートされたポリヌクレオチド
５０μｇ／ｍｌ濃度の配列番号６のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトマクロファージと４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２の欄に示している。「比 ペプチド処理：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
Figure 2005536985
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表２８：一次ヒトマクロファージにおいて配列番号６によりダウンレギュレートされたポリヌクレオチド
５０μｇ／ｍｌ濃度の配列番号６のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトマクロファージと４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２の欄に示している。「比 ペプチド処理：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
Figure 2005536985
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表２９：ＨＢＥ細胞において配列番号１によりアップレギュレートされたポリヌクレオチド
５０μｇ／ｍｌ濃度の配列番号１のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトＨＢＥ上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２の欄に示している。「比 ペプチド：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
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表３０：ＨＢＥ細胞においてペプチド（５０μｇ／ｍｌ：配列番号１）によりダウンレギュレートされたポリヌクレオチド
５０μｇ／ｍｌ濃度の配列番号１のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を低下させることが示された。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第３の欄に示している。「比 ペプチド：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
Figure 2005536985
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表３１：式Ａのペプチドにより誘導されるＡ５４９細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
５０μｇ／ｍｌ濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２欄および第３欄に、色素Ｃｙ３およびＣｙ５で各々標識したｃＤＮＡについて示している。「ＩＤ＃：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
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表３２：式Ｂのペプチドにより誘導されるＡ５４９細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
５０μｇ／ｍｌ濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２欄および第３欄に、色素Ｃｙ３およびＣｙ５で各々標識したｃＤＮＡについて示している。「ＩＤ＃：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
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Figure 2005536985
表３３：式Ｃのペプチドにより誘導されるＡ５４９細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
５０μｇ／ｍｌ濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２欄および第３欄に、色素Ｃｙ３およびＣｙ５で各々標識したｃＤＮＡについて示している。「ＩＤ＃：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
Figure 2005536985
Figure 2005536985
表３４：式Ｄのペプチドにより誘導されるＡ５４９細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
５０μｇ／ｍｌ濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２欄および第３欄に、色素Ｃｙ３およびＣｙ５で各々標識したｃＤＮＡについてそれぞれ示している。「ＩＤ＃：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
Figure 2005536985
Figure 2005536985
Figure 2005536985
表３５：式Ｅのペプチドにより誘導されるＡ５４９細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
５０μｇ／ｍｌ濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２欄および第３欄に、色素Ｃｙ３およびＣｙ５で各々標識したｃＤＮＡについてそれぞれ示している。「ＩＤ＃：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
Figure 2005536985
Figure 2005536985
Figure 2005536985
表３６：式Ｆのペプチドにより誘導されるＡ５４９細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
５０μｇ／ｍｌ濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２欄および第３欄に、色素Ｃｙ３およびＣｙ５で各々標識したｃＤＮＡについてそれぞれ示している。「ＩＤ＃：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
Figure 2005536985
Figure 2005536985
Figure 2005536985
表３７：式Ｇおよび別のペプチドにより誘導されるＡ５４９細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
５０μｇ／ｍｌ濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識ｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第２欄および第３欄に、色素Ｃｙ３およびＣｙ５で標識したｃＤＮＡについてそれぞれ示している。「ＩＤ＃：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。登録番号および遺伝子記号表示は、Ｕ００１１５（ジンクフィンガータンパク質）；Ｍ９１０３６（ヘモグロビンガンマＧ）；Ｋ００００７０（推定タンパク質）；ＡＦ０５５８８９（溶質キャリアーファミリー２７）；ＡＫ００１４９０（推定タンパク質）；Ｘ９７６７４（核受容体コアクチベーター２）；ＡＢ０２２８４７（未知）；ＡＪ２７５９８６（転写因子）；Ｄ１０４９５（プロテインキナーゼＣ、δ）；Ｌ３６６４２（ＥｐｈＡ７）；Ｍ３１１６６（ペンタキシン関連遺伝子）；ＡＦ１７６０１２（未知）；ＡＦ０７２７５６（キナーゼアンカータンパク質４）；ＮＭ０１４４３９（ＩＬ−１スーパーファミリーｚ）；ＡＪ２７１３５１（推定上の転写制御因子）；ＡＫ０００５７６（推定タンパク質）；ＡＪ２７２２６５（分泌型リンタンパク質２）；ＡＬ１２２０３８（推定タンパク質）；ＡＫ０００３０７（推定タンパク質）；ＡＢ０２９００１（Ｋ１ＡＡ１０７８タンパク質）；Ｕ６２４３７（コリン作動性受容体）；ＡＦ０６４８５４（未知）；ＡＬ０３１５８８（推定タンパク質）；Ｘ８９３９９（ＲＡＳｐ２１タンパク質アクチベーター）；Ｄ４５３９９（ホスホジエステラーゼ）；ＡＢ０３７７１６（推定タンパク質）；Ｘ７９９８１（カドヘリン５）；ＡＦ０３４２０８（ＲＩＧ様７−１）；ＡＬ１３３３５５（２１番染色体オープンリーディングフレーム５３）；ＮＭ＿０１６２８１（ＳＴＥ様キナーゼ）；ＡＦ０２３６１４（膜貫通アクチベーターおよびＣＡＭＬインターアクター）；ＡＦ０５６７１７（ａｓｈ２様）；ＡＢ０２９０３９（ＫＩＡＡ１１１６タンパク質）；Ｊ０３６３４（インヒビン、βＡ）；Ｕ８０７６４（未知）；ＡＢ０３２９６３（未知）；Ｘ８２８３５（ナトリウムチャンネル、電位作動型、ＩＸ型）である。
Figure 2005536985
各種ペプチドによる、細胞系、ヒト全血における、およびマウスにおけるケモカインの誘導
マウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７、ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球）、ヒト上皮細胞系（Ａ５４９）、ヒト気管支上皮細胞（１６ＨＢＥｏ１４）、およびヒト全血を用いた。ＨＢＥ細胞はＥａｒｌｅを添加したＭＥＭで増殖させた。ＴＨＰ−１細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地で増殖、維持した。ＲＡＷおよびＡ５４９細胞系は、１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ中で維持した。ＤＭＥＭ（上記参照）の１ウェル当たり１０６個の細胞密度にて、これらの細胞を２４ウェルプレートに播種した。また、Ａ５４９細胞は、ＤＭＥＭ（上記参照）の１ウェル当たり１０５個の細胞密度にて、２４ウェルプレートに播種した。両細胞は一晩５％ＣＯ２下で３７℃にてインキュベートした。ＤＭＥＭを一晩増殖させた細胞から吸引し、新しい培地と交換した。これらの細胞をペプチドとインキュベーションした後、培養液上清中へのケモカインの放出についてＥＬＩＳＡ（R & D Systems、Minneapolis、ミネソタ州）によって検出した。
動物試験は、UBC Animal Care Committee（UBC ACC#A01-0008）により承認されている。ＢＡＬＢ／ｃマウスはCharles River Laboratoriesから購入し、標準の動物施設内で飼育した。年齢、性別および重量一致の成体マウスにアベルチンの腹腔内注射（蒸留水中、４．４ｍＭ ２−２−２−トリブロモエタノール、２．５％２−メチル−２−ブタノール、体重１０ｇ当たり２００μｌを使用）により麻酔をかけた。点滴注入は、ＨｏおよびＦｕｒｓｔの方法（１９７３）を改良した非外科的な気管内点滴注入方法を用いて行った。簡単に説明すると、麻酔をかけられたマウスは、支持フレームの上端に、上部の歯をワイヤーにひっかけながら、あごを開けたまま、咽頭、喉頭および気管を垂直に直線に並ぶような位置を決めるために、胸部を前にそらせて押して置いた。気道を外部から照らし、挿管カテーテルを気管内腔内に挿入した。ペプチド懸濁液２０μｌまたは滅菌水をカテーテルの近位端のウェル内に入れ、２００μｌの空気とともに気管内にゆるやかに注入した。点滴注入後２分間、動物を直立位置で保持し、液体が呼吸樹へ流れるようにした。４時間後、ペントバルビタール３００ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射してマウスを安楽死させた。気管を露出させ、静脈内カテーテルを近位の気管に入れ、縫合糸でそのまま結んだ。洗浄は、気管カニューレを通して肺へ０．７５ｍｌの滅菌ＰＢＳを導入し、数秒後にその液体を取り出すことによって行った。ＰＢＳの同一サンプルでこれを３回繰り返した。氷上のチューブに洗浄液体を入れ、マウス１匹当たりの全回収容量は約０．５ｍｌであった。この気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液体を１０分間、１２００ｒｐｍで遠心分離し、透明な上清を取り出し、ＴＮＦ−αおよびＭＣＰ−１についてＥＬＩＳＡにより分析した。
カチオン性ペプチドによるケモカインのアップレギュレーションはいくつかの異なる系で確認された。マウスＭＣＰ−１（ヒトＭＣＰ−１の相同体）は、β（Ｃ−Ｃ）ケモカインファミリーのメンバーである。ＭＣＰ−１は、単球、ナチュラルキラー細胞およびいくつかのＴリンパ球をリクルートすることが実証されている。３名のドナー由来のヒト全血とＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を濃度を次第に高めたペプチド（配列番号１）で刺激すると、ＥＬＩＳＡで判定した場合、それらは上清中に有意なレベルのＭＣＰ−１を産生した（表３６）。２４時間、２０〜５０μｇ／ｍｌの範囲のペプチド濃度で刺激したＲＡＷ２６４．７細胞は、有意なレベルのＭＣＰ−１を産生した（バックグラウンドより２００〜４００ｐｇ／ｍｌ高い）。細胞（２４時間）および全血（４時間）を１００μｇ／ｍｌのＬＬ−３７で刺激した場合、高濃度のＭＣＰ−１が産生された。
また、ケモカイン誘導に対するカチオン性ペプチドの影響については、完全に異なる細胞系（Ａ５４９ヒト上皮細胞）でも試験した。興味深いことに、これらの細胞はＬＰＳに応じてＭＣＰ−１を産生し、この応答はペプチドにより拮抗され得るが、ペプチド（配列番号１）に対する直接応答ではＡ５４９細胞によるＭＣＰ−１の産生はなかった。しかし、高濃度のペプチド（配列番号１）は、ＩＬ−８（好中球特異的ケモカイン）の産生を誘導した（表３７）。したがって、配列番号１は、異なる細胞型からの、また異なる濃度の、異なる範囲の応答を誘導し得る。式群の各々からの多数のペプチドについて、Ａ５４９細胞におけるＩＬ−８の誘導能力を試験した（表３８）。これらのペプチドの多くは、低濃度（１０μｇ／ｍｌ）において、バックグラウンドレベル以上のＩＬ−８を誘導した。また、高濃度（１００μｇ／ｍｌ）の配列番号１３は、ヒト全血においてＩＬ−８を誘導することが確認された（表３９）。さらに、ペプチド（配列番号２）は、有意にＨＢＥ細胞（表４０）および未分化ＴＨＰ−１細胞（表４１）においてＩＬ−８を誘導した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスには、気管内点滴注入により配列番号１または菌体内毒素非含有水が与えられ、３〜４時間後、ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−αの濃度を気管支肺胞洗浄液体で試験した。５０μｇ／ｍｌのペプチド（配列番号１）で処理したマウスは、水または麻酔薬のみを与えられたマウスよりも有意に上昇した濃度のＭＣＰ−１を産生することを確認した（表４２）。ペプチドが、水または麻酔薬のみを与えられたマウスよりもＴＮＦ−αを有意に誘導しなかったので、これはペプチド（配列番号１）に対する前炎症性反応ではなかった。また、ペプチド（配列番号１）では、ペプチド（配列番号１）（最高１００μｇ／ｍｌ）で処理したＲＡＷ２６４．７細胞および骨髄由来マクロファージによってＴＮＦ−αの産生が有意に誘導されなかったことを確認した（表４３）。したがって、ペプチド（配列番号１）は、ＴＮＦ−αなどの炎症伝達物質の産生は誘導せず、ケモカインの産生を選択的に誘導する。これは、感染を排除可能な食細胞をリクルートするのを促進しながら、細菌産物で誘導された炎症を遮断することができる要素としてのペプチド（配列番号１）の２重の機能を示すものである。
表３８：ＲＡＷ２６４．７細胞およびヒト全血におけるＭＣＰ−１の誘導
ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞またはヒト全血は、４時間にわたり濃度を次第に高めたＬＬ−３７で刺激した。ヒト血液サンプルを遠心分離にかけ、血清を取り出し、ＲＡＷ２６４．７細胞由来の上清とともにＥＬＩＳＡによりＭＣＰ−１について分析した。ＲＡＷ細胞データは３回以上の実験の平均±標準誤差を示し、ヒト血液データは３名の個別のドナーから得られた平均±標準誤差を表わす。
Figure 2005536985
表３９：Ａ５４９細胞およびヒト全血におけるＩＬ−８の誘導
Ａ５４９細胞またはヒト全血は、２４時間および４時間、それぞれ濃度を次第に高めたペプチドで刺激した。ヒト血液サンプルを遠心分離にかけ、血清を取り出し、Ａ５４９細胞由来の上清とともにＥＬＩＳＡによりＩＬ−８について分析した。Ａ５４９細胞データは３回以上の実験の平均±標準誤差を示し、ヒト血液データは平均±３名の個別のドナーの標準誤差を表わす。
Figure 2005536985
表４０：カチオン性ペプチドによるＡ５４９細胞におけるＩＬ−８の誘導
Ａ５４９ヒト上皮細胞を２４時間にわたりペプチド１０μｇで刺激した。上清を取り出し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−８について分析した。
Figure 2005536985
表４１：ヒト血液におけるＩＬ−８のペプチドによる誘導
ヒト全血は、４時間にわたり濃度を次第に高めたペプチドで刺激した。ヒト血液サンプルを遠心分離にかけ、血清を取り出し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−８について分析した。示したデータは、２名のドナーの平均である。
Figure 2005536985
表４２：ＨＢＥ細胞におけるＩＬ−８の誘導
濃度を次第に高めたペプチドを８時間かけてＨＢＥ細胞とインキュベートし、上清を取り出し、ＩＬ−８について試験した。データは、３回以上の実験平均±標準誤差として示す。
Figure 2005536985
表４３：未分化ＴＨＰ−１細胞のＩＬ−８の誘導
ヒト単球ＴＨＰ−１細胞は、８時間かけて濃度を次第に高めたペプチドとインキュベートした。上清を取り出し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−８について試験した。
Figure 2005536985
表４４：マウス気道におけるペプチド（配列番号１）によるＭＣＰ−１の誘導
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、アベルチンで麻酔をかけ、ペプチドまたは水を気管内点滴注入するか、点滴注入は行わなかった（未処置）。マウスを４時間モニターし、麻酔をかけ、ＢＡＬ液体を単離し、ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−α濃度についてＥＬＩＳＡにより分析した。示したデータは、各条件におけるマウス４匹または５匹の平均±標準誤差である。
Figure 2005536985
表４５：カチオン性ペプチドによる有意なＴＮＦ−α誘導の欠如
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を６時間かけて示したペプチド（４０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。上清を回収し、ＴＮＦ−αの濃度についてＥＬＩＳＡにより試験した。データは、３回以上の実験の平均＋標準誤差として示す。
Figure 2005536985
カチオン性ペプチドはケモカイン受容体の表面発現を増加させる
ＩＬ−８ＲＢ、ＣＸＣＲ−４、ＣＣＲ２およびＬＦＡ−１の細胞表面発現の分析をするために、１０μｇ／ｍｌの適当な一次抗体（Santa Cruz Biotechnology）、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ［ＩＬ−８ＲＢおよびＣＸＣＲ−４（Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove、ペンシルベニア州）］またはＦＩＴＣ結合ロバ抗ヤギＩｇＧ（Santa Cruz）によりＲＡＷマクロファージ細胞を染色した。これらの細胞は、ＦＡＣｓｃａｎを用いて、１０，０００の事象についてカウントし、細胞残屑を除去するために、前方および側方の散乱をゲート制御することによって分析した。
ポリヌクレオチドアレイのデータは、それぞれ何種類かのペプチドが、ケモカイン受容体ＩＬ−８ＲＢ、ＣＸＣＲ−４およびＣＣＲ２の発現をそれぞれ未刺激細胞よりも１０倍、４倍および１．４倍までアップレギュレートすることを示唆した。このポリヌクレオチドアレイのデータを確認するために、表面発現について、ペプチドで４時間刺激したＲＡＷ細胞上のこれらの受容体のフローサイトメトリーにより分析した。５０μｇ／ｍｌのペプチドを４時間ＲＡＷ細胞と共にインキュベートした場合、ＩＬ−８ＲＢは未刺激細胞よりも平均して２．４倍高くアップレギュレートされ、ＣＸＣＲ−４は未刺激細胞よりも平均して１．６倍アップレギュレートされ、ＣＣＲ２は未刺激細胞よりも１．８倍アップレギュレートされた（表４６）。対照では、ＣＥＭＡに同様のアップレギュレーションが生じることが確認された。Ｂａｃ２ＡはＬＦＡ−１の有意なアップレギュレーションを示すただ１つのペプチドであった（対照細胞の３．８倍超）。
表４６：ペプチドに応答して増大したＣＸＣＲ−４、ＩＬ−８ＲＢおよびＣＣＲ２の表面発現
ＲＡＷマクロファージ細胞を４時間ペプチドで刺激した。細胞を洗浄し、適当な一次抗体およびＦＩＴＣ標識二次抗体で染色した。示したデータは、平均（ペプチドで刺激したＲＡＷ細胞の培地からの倍率変化）±標準誤差を表わす。
Figure 2005536985
カチオン性ペプチドによるＭＡＰキナーゼのリン酸化
細胞を２．５×１０５〜５×１０５個／ｍｌにて播種し、一晩放置した。これらの細胞を朝に血清飢餓培地で一度洗浄した（血清非含有培地−４時間）。培地を除去し、ＰＢＳと交換し、次いで、３７℃で１５分間置き、その後１５分間で室温にした。ペプチドあるいはＨ２Ｏを添加し（濃度：０．１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ）、１０分間インキュベートした。ＰＢＳを迅速に除去し、阻害剤（ＮａＦ、Ｂ−グリセロリン酸塩、ＭＯＬ、バナジン酸塩、ＰＭＳＦ、ロイペプチンアプロチニン）を含有する氷冷の放射性免疫沈降法（ＲＩＰＡ）バッファーと交換した。１０〜１５分間、あるいは細胞が溶解するまでプレートを氷上で振盪し、溶解物を回収した。ＴＨＰ−１細胞のための方法はわずかに異なっており、より多数の細胞（２×１０６個）を用いた。これらの細胞を一晩血清飢餓状態とし、反応を停止させるために１ｍｌの氷冷ＰＢＳを添加し、次いで、それを氷上に５〜１０分間置き、遠沈させ、次いで、ＲＩＰＡ中に再懸濁させた。タンパク質濃度はタンパク質アッセイ（Pierce, Rockford、イリノイ州）を用いて検出した。細胞溶解物（タンパク質２０μｇ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースフィルターに移した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）／５％脱脂粉乳で１時間このフィルタをブロックし、次いで、ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０に溶解した一次抗体を用いて一晩冷却しながらインキュベートした。ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３０分間洗浄した後、ＴＢＳに溶解した１μｇ／ｍｌの二次抗体を用いて室温で１時間このフィルタをインキュベートした。ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３０分間フィルタを洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（１：１０，０００、ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎン２０に溶解）を用いて室温にて１時間インキュベートした。ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３０分間フィルタを洗浄した後、高感度化学発光（ＥＣＬ）検出により免疫反応バンドを可視化した。末梢血液単核細胞の実験では、末梢血（５０〜１００ｍｌ）をすべての被験体から採取した。単核細胞は、フィコール・ハイパックを用いた密度勾配遠心法により末梢血から単離した。静止期細胞（単核細胞）を回収し、洗浄し、次いで、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と１％のＬ−グルタミンを含む細胞培地（ＲＰＭＩ−１６４０）の推奨一次培地中に再懸濁した。細胞を４×１０６個／ウェルにて６枚のウェル培養プレートに細胞を添加し、１時間５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて固着させた。上清培地および非接着細胞を洗い流し、ペプチドを含む適当な培地を添加した。回収された新鮮な細胞は、細胞のトリパンブルー排除能力によって判断した結果、一貫して＞９９％の生存であった。ペプチドで刺激した後、種々のホスファターゼ阻害剤およびキナーゼ阻害剤の存在下でＲＩＰＡバッファー中の細胞を溶解することにより、溶解物を回収した。タンパク質含有量を分析し、約３０μｇの各サンプルを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルをニトロセルロース膜上にブロッティングし、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００含有Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）に溶解した５％脱脂粉乳で１時間ブロッキングした。リン酸化は、リン酸化特異的抗体を用いて検出した。
ペプチド誘導によるリン酸化の結果を表４６にまとめてある。配列番号２は、マウスマクロファージＲＡＷ細胞系およびＨＢＥ細胞中のｐ３８およびＥＲＫ１／２に投与量依存的にリン酸化をもたらすことが分かった。配列番号３は、ＴＨＰ−１のヒト単球細胞系中のＭＡＰキナーゼのリン酸化と、マウスＲＡＷ細胞系中のＥＲＫ１／２のリン酸化をもたらした。
表４７：ペプチドに応答したＭＡＰキナーゼのリン酸化
Figure 2005536985
表４８：ヒト血液単球におけるＭＡＰキナーゼのペプチドリン酸化
リン酸化を促進するために５０μｇ／ｍｌの配列番号１を用いた。
Figure 2005536985
カチオン性ペプチドは免疫反応を増強することにより細菌感染に対して防御する
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、腹腔内注射により１×１０５個のサルモネラ菌とカチオン性ペプチド（２００μｇ）を注入した。マウスを２４時間モニターし、その時点でマウスを安楽死させ、脾臓を取り出し、ホモジナイズし、ＰＢＳ中へ再懸濁し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）含有のルリアブロス寒天プレート上に播種した。これらのプレートを３７℃にて一晩インキュベートし、生存細菌をカウントした（表４９および表５０）。また、ＣＤ−１マウスに、腹腔内注射により５％ブタムチンに溶解した１×１０８個の黄色ブドウ球菌とカチオン性ペプチド（２００μｇ）を注入した（表５１）。３日間マウスをモニターし、その時点でマウスを安楽死させ、血液を採取し、生存数をカウントするためにプレートに播種した。また、ＣＤ−１オスマウスに、腹腔内注射（ＩＰ）により５．８×１０６ＣＦＵのＥＨＥＣ細菌とカチオン性ペプチド（２００μｇ）を注入し、３日間モニターした（表５２）。これらの各動物モデルでは、ペプチドのサブセットが感染を防御することが示された。表５０および表５１の防御アッセイの結果を表３１〜表３７の遺伝子発現の結果と比較した場合、サルモネラ菌モデルで最も防御力のあるペプチドは上皮細胞の遺伝子の共通サブセットを誘導する能力を示した（表５３）。これは、明らかに、ペプチドの防御能力と一致する遺伝子発現のパターンが存在することを示している。カチオン性ペプチドの多くは、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）アッセイにより試験した場合、直接的に抗菌性ではないことが明らかであった（表５４）。これは、ペプチドの感染からの防御能力が、直接的な抗菌活性によるものではなく、ペプチドが宿主先天性免疫を刺激する能力に依存していることを示している。
表４９：ＢＡＬＢ／ｃマウスのサルモネラ菌感染に対するカチオン性ペプチドの効果
サルモネラ菌とペプチドとをＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射し、２４時間後に動物を安楽死させ、脾臓を取り出し、ホモジナイズし、ＰＢＳで希釈し、細菌生存率を測定するためにプレートによるカウントを行った。
Figure 2005536985
表５０：ＢＡＬＢ／ｃマウスのサルモネラ菌感染に対するカチオン性ペプチドの効果
サルモネラ菌とペプチドとをＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射し、２４時間後に動物を安楽死させ、脾臓を取り出し、ホモジナイズし、ＰＢＳで希釈し、細菌生存率を測定するためにプレートによるカウントを行った。
Figure 2005536985
表５１：マウス黄色ブドウ球菌感染モデルにおけるカチオン性ペプチドの効果
ＣＤ−１マウスに、腹腔内（ＩＰ）注射により５％ブタムチンに溶解した１×１０８個の細菌を注入した。また別の腹腔内注射によりカチオン性ペプチド（２００μｇ）を注入した。３日間マウスをモニターし、その時点でマウスを安楽死させ、血液を採取し、生存数カウントのためにプレートに播種した。以下のペプチド、すなわち、配列番号４８、配列番号２６は、黄色ブドウ球菌感染の制御に有効ではなかった。
Figure 2005536985
表５２：マウスＥＨＥＣ感染モデルにおけるペプチドの効果
ＣＤ−１オスマウス（５週齢）に、腹腔内（ＩＰ）注射により５．８×１０６ＣＦＵのＥＨＥＣ細菌を注入した。また別の腹腔内注射によりカチオン性ペプチド（２００μｇ）を注入した。３日間マウスをモニターした。
Figure 2005536985
表５３：ｉｎ ｖｉｖｏで活性であるペプチドにより誘導されたＡ５４９上皮細胞の遺伝子発現パターンのアップレギュレーション
５０μｇ／ｍｌ濃度の配列番号３０、配列番号７および配列番号１３のペプチドは、それぞれ４時間処理した後、遺伝子のパターン発現を高めることが示された。ペプチドをヒトＡ５４９上皮細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識したｃＤＮＡプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞のポリヌクレオチドの強度を、ｃＤＮＡの標識（Ｃｙ３とＣｙ５の平均）について第２欄に示す。アップレギュレーション倍率の欄は、未刺激細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を表している。マウス感染モデルで活性のなかった陰性対照として、配列番号３７のペプチドが含まれていた。
Figure 2005536985
表５４：ここで研究した大部分のカチオン性ペプチドと特に感染モデルで有効なカチオン性ペプチドは有意に抗菌性ではない。ペプチドの希釈系列を９６ウェルプレートにおいて表示している細菌と一晩インキュベートした。細菌を死滅させたペプチドの最低濃度をＭＩＣとして用いた。＞の記号は、ＭＩＣが測定するには大きすぎることを示す。８μ／ｍｌ以下のＭＩＣは、臨床的に有効な活性であると考えられた。略語：大腸菌、Escherichia coli；黄色ブドウ球菌、Staphylococcus aureus；緑膿菌、Pseudomonas aeruginosa；ネズミチフス菌、Salmonella enteritidis ssp. typhimurium；Ｃ．ローデンシス、Citobacter rhodensis；ＥＨＥＣ、Enterohaemorrhagic E. coli。
Figure 2005536985
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細菌性シグナル伝達分子により誘導されたポリヌクレオチドの診断薬／スクリーニングにおける使用
ネズミチフス菌ＬＰＳおよび大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳをSigma Chemical Co.（St. Louis、ミズーリ州）から購入した。黄色ブドウ球菌由来のＬＴＡ（Sigma）を内毒素不含の水（Sigma）に再懸濁した。ロットが内毒素で顕著に汚染されていないこと（すなわち＜１ｎｇ／ｍｌ、ＲＡＷ細胞アッセイにおいて有意なサイトカイン産生が起こらなかった濃度）を確認するために、ＬＴＡ製剤についてリムルス試薬（カブトガニ血球抽出物）アッセイ（Sigma）を行った。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、Applied Biosystems Inc.のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー３９２モデル（Mississauga、オンタリオ州）で合成し、精製後、内毒素不含の水（Sigma）に再懸濁した。以下の配列、ＣｐＧ：５’−ＴＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号５７）と非ＣｐＧ：５’−ＴＴＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＣＡＧＧＴＴ−３’（配列番号５８）を用いた。非ＣｐＧオリゴは、サイトカインの産生を刺激する能力について試験しＴＮＦ−αまたはＩＬ−６の有意な産生をもたらすことがないことを確認した。したがって、非ＣｐＧオリゴは陰性対照とみなした。ＲＮＡは、培地のみ、１００ｎｇ／ｍｌのネズミチフス菌ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌ＬＴＡ、または１μＭのＣｐＧ（ＲＡＷ細胞の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）を最適に誘導した濃度）と４時間インキュベートされたＲＡＷ２６４．７細胞から単離した。ＲＮＡは、ｃＤＮＡプローブをポリヌクレオチド形成するために用い、これは上述のようにＣｌｏｎｔｅｃｈ Ａｔｌａｓポリヌクレオチドアレイフィルタにハイブリダイズさせた。各固定化ＤＮＡへのｃＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィーによって可視化し、ホスフォイメージャーにより定量した。少なくとも２〜３の独立した実験から得られた結果を表５５〜表５９にまとめている。ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳ処理すると、炎症性タンパク質（例えば、ＩＬ−１β、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２α、ＣＤ４０、および種々の転写因子）をコードするポリヌクレオチドを含む６０種類を超えるポリヌクレオチドの発現が高まることが分かった。ＬＰＳ、ＬＴＡおよびＣｐＧ ＤＮＡにより誘導されたポリヌクレオチド発現の変化を比較した場合、これら３種類すべての細菌産物は、前炎症性ポリヌクレオチド（例えば、ｉＮＯＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−２α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１５、ＴＮＦＲ１およびＮＦ−κＢなど）の発現を同程度まで高めることが分かった（表５７）。表５７は、それらの刺激比が３種類の細菌産物の間で１．５倍未満で異なる、細菌産生物により同程度までアップレギュレートされた１９種類のポリヌクレオチドを記載している。また、同程度までＬＰＳ、ＬＴＡおよびＣｐＧによりダウンレギュレートされた数種類のポリヌクレオチドもあった。３つの細菌産物に応じて異なって調節された多数のポリヌクレオチドがあり（表５８）、それには、１以上の細菌産物間で１．５倍を超える発現レベルで異なった多くのポリヌクレオチドが含まれることが確認された。ＬＴＡ処理は、ＬＰＳまたはＣｐＧと比較して、Ｊｕｎ−Ｄ、Ｊｕｎ−Ｂ、Ｅｌｋ−１、ならびにサイクリンＧ２およびＡ１の発現の超刺激をはじめとして、ポリヌクレオチドの最大のサブセットの発現に示差的に影響を及ぼした。ＬＰＳまたはＣｐＧ処理によりその発現がさらに改変されたポリヌクレオチドもわずかにあった。ＬＴＡまたはＣｐＧ処理と比較して、ＬＰＳ処理に基づいて発現が選択的に高まったポリヌクレオチドには、ｃＡＭＰ応答エレメントＤＮＡ結合タンパク質１（ＣＲＥ−ＢＰ１）、インターフェロン誘導性タンパク質１、およびＣＡＣＣＣボックス結合タンパク質ＢＫＬＦが含まれていた。ＬＰＳまたはＬＴＡ処理と比較して、ＣｐＧ処理後に発現を選択的に高めたポリヌクレオチドには、白血病抑制因子（ＬＩＦ）およびプロテアーゼネキシン１（ＰＮ−１）が含まれていた。これらの結果は、ＬＰＳ、ＬＴＡおよびＣｐＧ ＤＮＡは大きく重複してポリヌクレオチド発現応答を刺激するが、それらはまたポリヌクレオチドのある種のサブセットを調節する異なる能力を示すことを示唆している。
使用した他のポリヌクレオチドアレイは、重複してスポットされた約１４，０００個のヒトオリゴからなる、ヒトオペロンアレイ（ゲノムに対する識別番号はＰＲＨＵ０４−Ｓ１）である。プローブは全ＲＮＡ５μから調製し、Ｃｙ３またはＣｙ５標識ｄＵＴＰで標識した。これらの実験では、Ａ５４９上皮細胞を２．５×１０６個／皿にて１００ｍｍの組織培養皿に播種し、一晩インキュベートし、次いで、１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳで４時間刺激した。全ＲＮＡはＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（Ambion）を使用して単離した。ＤＮＡ混入はＤＮＡ不含キット（Ambion）を用いて除去した。全ＲＮＡから調製したプローブを精製し、４２℃にて転写されたガラススライドに一晩ハイブリダイズさせ、洗浄した。洗浄後、Perkin Elmerアレイスキャナーを用いて画像を記録した。画像処理ソフトウェア（Imapolynucleotide 5.0、Marina Del Rey、カリフォルニア州）は、スポット平均強度、中央強度、およびバックグラウンド強度を検出する。「自家」プログラムは、バックグラウンドを取り除くために使用した。プログラムは、各サブグリッドについて最低値１０％の強度を計算し、各グリッドに対してこれを差し引く。分析は、Polynucleotidespringソフトウェア（Redwood City、カリフォルニア州）により行った。各スポットの強度は、スライド内のスポット値の群から中央スポット強度値を取得し、この値を実験のすべての値と比較することによって標準化した。対照細胞と比較してＬＰＳで処理した細胞で見られた相対変化は、下の表で確認することができる。表６０には、感染の診断に有用なこれまでに報告されていない多数の変化が記載されている。
これらの変化の機能的重要性を確認し評価するために、選択したｍＲＮＡおよびタンパク質の濃度を濃度計測によって評価し定量した。ＣＤ１４、ビメンチンおよびトリステトラプロリン特異的プローブを使用するノーザンブロットでは、３つのすべての細菌産物で刺激した後に同様の発現が確認された（表６０）。同様に、炎症媒介因子ＮＯの濃度を算定するためにグリース試薬を用いる一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の酵素活性を測定したところ、２４時間後に産生された匹敵する濃度のＮＯが示され、これはｉＮＯＳ発現の同様のアップレギュレーションと一致していていた（表５９）。ウェスタンブロット解析では、ＣｐＧによる白血病抑制因子（ＬＩＦ、サイトカインのＩＬ−６ファミリーのメンバー）の選択的な刺激が確認された（表５９）。他の確認試験では、ＬＰＳは、ＥＬＩＳＡにより評価した場合、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の発現をアップレギュレートし、ノーザンブロット解析によって評価した場合に、ＭＩＰ−２αおよびＩＬ−１β ｍＲＮＡの発現をアップレギュレートし、かつＤＰ−１およびサイクリンＤ ｍＲＮＡをダウンレギュレートすることが示された。この分析は、ヒト全血中の前炎症性サイトカイン産生を細菌成分が刺激する能力を試験することにより、より臨床的に関連するｅｘ ｖｉｖｏ系に広げた。大腸菌ＬＰＳ、ネズミチフス菌ＬＰＳおよび黄色ブドウ球菌ＬＴＡはすべて、同量の血清ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βを刺激することがわかった。また、ＣｐＧは、一部の細胞系データを確認すると、はるかに低い濃度にもかかわらず、これらのサイトカインの産生を刺激した。
表５５：Ａ５４９上皮細胞において大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳによりアップレギュレートされたポリヌクレオチド
大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、ポリヌクレオチドマイクロアレイにより研究した場合、Ａ５４９細胞の多くのポリヌクレオチド発現を高めた。ＬＰＳをＡ５４９細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離した。５μｇの全ＲＮＡを用いてＣｙ３／Ｃｙ５標識ｃＤＮＡプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。未刺激細胞の強度を表５５の第２欄に示す。「比 ＬＰＳ／対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ＬＰＳで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
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表５６：Ａ５４９上皮細胞において大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳによりダウンレギュレートされたポリヌクレオチド
大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、ポリヌクレオチドマイクロアレイにより研究した場合、Ａ５４９細胞の多くのポリヌクレオチド発現を低下させた。ＬＰＳをＡ５４９細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離した。５μｇの全ＲＮＡを用いてＣｙ３／Ｃｙ５標識ｃＤＮＡプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。未刺激細胞の強度は表の第２欄に示す。「比：ＬＰＳ／対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ＬＰＳで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
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表５７：細菌産生物ＬＰＳ、ＬＴＡおよびＣｐＧ ＤＮＡによる刺激後に同程度まで発現されたポリヌクレオチド
細菌産物（１００ｎｇ／ｍｌのネズミチフス菌ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌ＬＴＡ、または１μＭのＣｐＧ）は、数種類のポリヌクレオチドの発現を強く誘導することが示された。ペプチドをＲＡＷ細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識したｃＤＮＡプローブに変換し、Ａｔｌａｓアレイにハイブリダイズさせた。対照である未刺激細胞の強度は第２欄に示す。「比 ＬＰＳ／ＬＴＡ／ＣｐＧ：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、細菌産物で刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
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表５８：細菌産物ＬＰＳ、ＬＴＡおよびＣｐＧ ＤＮＡにより示差的に調節されたポリヌクレオチド
細菌産物（１００ｎｇ／ｍｌのネズミチフス菌ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌ＬＴＡ、または１μＭのＣｐＧ）は、数種類のポリヌクレオチドの発現を強く誘導することが示された。ペプチドをＲＡＷ細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離し、標識したｃＤＮＡプローブに変換し、Ａｔｌａｓアレイにハイブリダイズさせた。対照である未刺激細胞の強度は第２欄に示す。「比 ＬＰＳ／ＬＴＡ／ＣｐＧ：対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、細菌産物で刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
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表５９：表５７および表５８のアレイデータの確認
ａ）全ＲＮＡを未刺激のＲＡＷマクロファージ細胞から単離し、１００ｎｇ／ｍｌのネズミチフス菌ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌ＬＴＡ、１μＭ ＣｐＧ ＤＮＡまたは培地のみで４時間細胞を処理し、ノーザンブロットを実施し、前述［Scottら］のようにして、ＧＡＰＤＨ、ＣＤ１４、ビメンチンおよびトリステトラプロリンについてその膜を調べた。添加時の不整合性を調べるためにノーザンブロットのハイブリダイゼーション強度をＧＡＰＤＨと比較した。これらの実験は少なくとも３回繰り返し、示したデータは、培地と比較した各条件の平均相対濃度（濃度計測により測定した場合）±標準誤差である。
ｂ）ＲＡＷ２６４．７細胞を１００ｎｇ／ｍｌのネズミチフス菌ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌ＬＴＡ、１μＭのＣｐＧ ＤＮＡまたは培地のみで２４時間刺激した。タンパク質溶解物を調製し、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで泳動し、ウェスタンブロットを実施してＬＩＦを検出した（R & D Systems）。これらの実験は少なくとも３回繰り返し、示したデータは、培地と比較したＬＩＦの相対濃度（濃度計測により測定した場合）±標準誤差である。
ｃ）１００ｎｇ／ｍｌのネズミチフス菌ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌ＬＴＡ、１μＭのＣｐＧ ＤＮＡまたは培地のみで２４時間処理したＲＡＷマクロファージ細胞から上清を回収し、前述［Scottら］のようにして、グリース試薬により安定したＮＯ代謝産物亜硝酸塩の蓄積から推定される上清中に形成されたＮＯの量について調べた。これらのデータは３回行った実験の平均±標準誤差である。
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表６０：細菌シグナル伝達分子（ＬＰＳ）によりアップレギュレートされたＡ５４９ヒト上皮細胞における遺伝子発現のパターン
大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、ポリヌクレオチドマイクロアレイにより調べた場合、Ａ５４９細胞で多数のポリヌクレオチド発現が増大した。ＬＰＳをＡ５４９細胞と４時間インキュベートし、ＲＮＡを単離した。５μｇの全ＲＮＡを用いてＣｙ３／Ｃｙ５標識ｃＤＮＡプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ（ＰＲＨＵ０４）にハイブリダイズさせた。ＬＰＳで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の変化の例は、ＬＰＳで処理した細胞の強度レベル変化は未処理の細胞の２倍を超えていることを示している。
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細菌感染に対して防御するためのシグナル伝達の改変
ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）ＳＬ１３４４株をAmerican Type Culture Collection（ATCC;Manassas、ヴァージニア州）から入手し、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス中で増殖させた。マクロファージ感染については、１２５ｍＬ容フラスコに入れた１０ｍｌのＬＢに凍結グリセロールストックを接種し、定常期まで３７℃にて一晩振盪培養した。ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０５個／ウェル）を２４ウェルのプレートに播種した。細菌を培地で希釈し、約１００の感染多重度（ＭＯＩ）を得た。１０分間１０００ｒｐｍにて単層上に細菌を遠心して感染を同調させ、２０分間、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で感染を進行させた。ＰＢＳで細胞を３回洗浄して細胞外の細菌を除去し、次いで、１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Sigma、St. Louis、ミズーリ州）含有ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中でインキュベートして残存するすべての細胞外細菌を死滅させるとともに再感染を予防した。２時間後、ゲンタマイシン濃度を１０μｇ／ｍｌまで低下させ、アッセイ中保持した。感染前３０分間、細胞は以下の濃度の阻害剤で処理した：５０μＭのＰＤ ９８０５９（Calbiochem）、５０μＭのＵ０１２６（Promega）、２ｍＭのジフェニルヨードニウム（ＤＰＩ）、２５０μＭのアセトバニロン（アポシニン、Aldrich）、１ｍＭのアスコルビン酸（Sigma）、３０ｍＭのＮ−アセチルシステイン（Sigma）、および２ｍＭのＮＧ−Ｌ−モノメチルアルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ、Molecular Probes）または２ｍＭのＮＧ−Ｄ−モノメチルアルギニン（Ｄ−ＮＭＭＡ、Molecular Probes）。効力を確実にするために、感染直後、感染後２時間、および６〜８時間に新しい阻害剤を添加した。培地の１ｍＬに対して等量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で対照細胞を処理した。ネズミチフス菌ＳＬ１３４４株の細胞内生存／複製については、前に記載したようにして、ゲンタマイシン耐性アッセイを用いて検出した。簡単に説明すると、ＰＢＳで２回細胞を洗浄し、ゲンタマイシンを除去し、感染後２時間および２４時間に、ＰＢＳに溶解した１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／０．１％ＳＤＳに溶解させ、ＬＢ寒天平板上のコロニー数から細胞内細菌の数を算出した。これらの感染条件下では、感染後２４時間のマクロファージを分析が可能である標準の平板カウントにより判断した場合、マクロファージは細胞当たり平均１株の細菌を含んでいた。細菌の繊維化（filiamentation）は細菌のストレスと関係がある。ＮＡＤＰＨオキシダーゼとｉＮＯＳは、ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達により活性化され得る。結果（表６１）によれば、細胞シグナル伝達の改変は、細胞内のサルモネラ菌感染を解消することができる方法であることが明らかである。したがって、ヒト細胞の多数の遺伝子をアップレギュレートすることにより、シグナル伝達を遮断するこの方法は、感染に対する治療の一般的な方法を意味する。
表６１：ＩＦＮ−γにより初回抗原刺激を受けたＲＡＷ細胞の細胞内細菌に対するシグナル伝達分子ＭＥＫの影響
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抗ウィルス活性
Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインの１種であるＳＤＦ−１は、ＨＩＶ−１コレセプター−ＣＸＣＲ４の天然リガンドである。ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５は、ＨＩＶ−１複製の阻害に関する可能性ある標的と考えられる。ＳＤＦ−１の結晶構造は、逆行性のβシートと正荷電表面を示し、ＣＸＣＲ４の負荷電細胞外ループに結合していることが大きな特徴である。これらの知見は、ケモカイン誘導体、小型ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、またはケモカインの構造またはイオン特性を模倣するアゴニストが、Ｘ４ ＨＩＶ−１感染の治療に有用な薬剤となり得ることを示唆している。ＳＤＦ−１を阻害したカチオン性ペプチドは、ペプチドがＣＸＣＲ４アンタゴニストとして作用し得ることを示すＴ細胞遊走を誘導することが確認された。遊走アッセイは以下のようにして行った。ヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞を走化性培地（ＲＰＭＩ １６４０／１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／０．５％ＢＳＡ）中に５×１０６／ｍｌまで懸濁した。遊走アッセイは、５μｍポリカーボネートＴｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓ（Costar）を用いて２４ウェルプレートで実施した。簡単に説明すると、ペプチドまたは対照を走化性培地で希釈し、下方チャンバーに入れ、一方、０．１ｍｌの細胞（５×１０６／ｍｌ）を上部チャンバーに添加した。３７℃で３時間後、フローサイトメトリーを用いて、下方チャンバーに移動した細胞の数を検出した。下方チャンバーからの培地は、細胞残屑を除去するために前方および側方の散乱光をゲート調節しながら、３０秒間でＦＡＣｓｃａｎを通って通過させた。生存細胞の数は、５×１０５／ｍｌ細胞が下方チャンバーへ直接ピペットで移し、次いで３０秒間ＦＡＣｓｃａｎでカウントした「１００％遊走対照」と比較した。結果は、ペプチドの添加はＣＸＣＲ４発現に影響を及ぼし（表６３および表６４）、ヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞の遊走を阻害する（表６２）ことを示している。
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現時点の好ましい実施形態に関して本発明を説明したが、本発明の精神から逸脱することなく種々の変更をなすことができることが理解されるだろう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (88)

  1. １以上の敗血症誘導因子または炎症誘導因子により調節され、かつカチオン性ペプチドにより阻害されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターンを同定する方法であって、
    １または複数の前記ポリヌクレオチドを１以上の敗血症誘導因子または炎症誘導因子と接触させるステップ、
    それと同時にまたはその直後に、１または複数の前記ポリヌクレオチドをカチオン性ペプチドと接触させるステップ、
    発現の変化を測定するステップ
    を含み、該変化が、敗血症誘導因子または炎症誘導因子によって調節され、かつカチオン性ペプチドによって低減されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターンを示すものである、上記方法。
  2. 前記敗血症誘導因子または炎症誘導因子が、ＬＰＳ、ＬＴＡもしくはＣｐＧ ＤＮＡ、細菌の成分もしくは全細胞、または関連する因子である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記敗血症誘導因子または炎症誘導因子との接触の前後に、ポリヌクレオチドの発現レベルを測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 請求項１に記載の方法によって同定されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターン。
  5. 炎症または敗血症の応答に関与しているポリペプチドをコードする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  6. 敗血症または炎症を阻止する薬剤を同定する方法であって、請求項５に記載のポリヌクレオチドと薬剤とを組み合わせるステップを含み、薬剤の存在下におけるポリヌクレオチドの発現が、薬剤の不在下における発現と比較してモジュレートされ、かつ発現のモジュレーションが炎症または敗血症の応答に影響を及ぼすものである、上記方法。
  7. 前記影響が炎症または敗血症の応答の抑制である、請求項６に記載の方法。
  8. 請求項６に記載の方法によって同定される薬剤。
  9. ペプチド、ペプチド擬似体、化学化合物、核酸分子またはポリペプチドである、請求項８に記載の薬剤。
  10. 前記ペプチドが配列番号４〜５４から選択されるものである、請求項８に記載の薬剤。
  11. 炎症または敗血症の応答の抑制についてのポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法であって、
    細胞と、ＬＰＳ、ＬＴＡ、ＣｐＧ ＤＮＡおよび／または細菌全体もしくは細菌成分とをカチオン性ペプチドの存在下または不在下で接触させるステップ、
    前記ペプチドの存在下および不在下における細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップ
    を含み、前記ペプチドの存在下におけるパターンが炎症または敗血症の応答の抑制を示すものである、上記方法。
  12. 細胞と、炎症または敗血症の応答を抑制すると考えられる１種または複数の化合物とを接触させるステップ、
    炎症または敗血症の応答を抑制するカチオン性ペプチドを用いて得られたパターンと類似するポリヌクレオチド発現パターンを提供する化合物を同定するステップ
    をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 請求項１１に記載の方法により同定される化合物。
  14. 先天性免疫を増強する薬剤を同定する方法であって、先天性免疫に関与するポリペプチドをコードする１または複数のポリヌクレオチドと対象の薬剤とを接触させるステップを含み、前記薬剤の存在下におけるポリヌクレオチドの発現が、薬剤の不在下におけるポリヌクレオチドの発現と比較してモジュレートされ、かつ発現がモジュレートされると先天性免疫の増強が起こるものである、上記方法。
  15. 前記薬剤が敗血症の反応を刺激するものではない、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記薬剤が炎症または敗血症の応答を抑制するものである、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記薬剤が炎症または敗血症の応答を遮断するものである、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記薬剤が抗炎症因子をコードするポリヌクレオチドの発現を増大させるものである、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 抗炎症遺伝子が、ＩＬ−１ Ｒアンタゴニストホモログ１（ＡＩ１６７８８７）、ＩＬ−１０ Ｒβ（ＡＡ４８６３９３）、ＩＬ−１０ Ｒα（Ｕ００６７２）、ＴＮＦ受容体メンバー１Ｂ（ＡＡ１５０４１６）、ＴＮＦ受容体メンバー５（Ｈ９８６３６）、ＴＮＦ受容体メンバー１１ｂ（ＡＡ１９４９８３）、ＨＬＡ ＩＩのＩＫサイトカインダウンレギュレーター（Ｒ３９２２７）、ＴＧＦＢ誘導性初期増殖応答２（ＡＩ４７３９３８）、ＣＤ２（ＡＡ９２７７１０）、グルココルチコイド関連ポリヌクレオチド（ＡＫ０００８９２）、またはＩＬ−１０（Ｍ５７６２７２０）を含むサブセットから選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記薬剤がＴＮＦ−αの発現を抑制するものである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記薬剤がインターロイキンの発現を抑制するものである、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記インターロイキンがＩＬ−８である、請求項２３に記載の方法。
  23. 前記薬剤がペプチドである、請求項１６に記載の方法。
  24. 前記ペプチドが配列番号４〜５４から選択されるものである、請求項２３に記載の方法。
  25. 請求項１４に記載の方法により同定される薬剤。
  26. ペプチド、ペプチド擬似体、化学化合物または核酸分子である、請求項２５に記載の薬剤。
  27. 先天性免疫を選択的に増強する化合物を同定するためのポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法であって、
    カチオン性ペプチドの存在下および不在下において接触させた細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップであって、ペプチドの存在下におけるパターンが先天性免疫の刺激を表わすものである上記ステップ、
    試験化合物の存在下において接触させた細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップであって、カチオン性ペプチドの存在下において確認されるパターンに類似している試験化合物を用いたパターンが先天性免疫を増強する化合物を示すものである上記ステップ
    を含む、上記方法。
  28. 請求項２７に記載の方法により同定される化合物。
  29. 前記化合物が敗血症の反応を刺激するものではない、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記ポリヌクレオチド発現パターンが前炎症性ポリヌクレオチドの発現を含む、請求項２７に記載の方法。
  31. 前炎症性ポリヌクレオチドが、リングフィンガータンパク質１０（Ｄ８７４５１）、セリン／スレオニンプロテインキナーゼＭＡＳＫ（ＡＢ０４００５７）、ＫＩＡＡ０９１２タンパク質（ＡＢ０２０７１９）、ＫＩＡＡ０２３９タンパク質（Ｄ８７０７６）、ＲＡＰ１、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（Ｍ６４７８８）、ＦＥＭ−１様デスレセプター結合タンパク質（ＡＢ００７８５６）、カテプシンＳ（Ｍ９０６９６）、推定タンパク質ＦＬＪ２０３０８（ＡＫ０００３１５）、ｐｉｍ−１発癌遺伝子（Ｍ５４９１５）、プロテアソームサブユニットβタイプ５（Ｄ２９０１１）、ＫＩＡＡ０２３９タンパク質（Ｄ８７０７６）、気道ムチン５サブタイプＢ（ＡＪ００１４０３）、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質ＣＲＥＢＰａ、インテグリンαＭ（Ｊ０３９２５）、Ｒｈｏ関連キナーゼ２（ＮＭ＿００４８５０）、ＰＴＤ０１７タンパク質（ＡＬ０５０３６１）、未知遺伝子（ＡＫ００１１４３、ＡＫ０３４３４８、ＡＬ０４９２５０、ＡＬ１６１９９、ＡＬ０３１９８３）、レチノイン酸受容体（Ｘ０６６１４）、Ｇタンパク質共役型受容体（Ｚ９４１５５、Ｘ８１８９２、Ｕ５２２１９、Ｕ２２４９１、ＡＦ０１５２５７、Ｕ６６５７９）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体７（Ｌ３１５８４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（Ｚ２９５７５）、インターフェロンγ受容体２（Ｕ０５８７５）、サイトカイン受容体様因子１（ＡＦ０５９２９３）、クラスＩサイトカイン受容体（ＡＦ０５３００４）、凝固因子ＩＩ（トロンビン）受容体様２（Ｕ９２９７１）、白血病抑制因子受容体（ＮＭ＿００２３１０）、インターフェロンγ受容体１（ＡＬ０５０３３７）、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記発現パターンがケモカインをコードするポリヌクレオチドの発現を含む、請求項２７に記載の方法。
  33. 前記発現パターンが細胞分化因子の発現を含む、請求項２７に記載の方法。
  34. 前記ポリヌクレオチド発現パターンが細胞表面受容体の発現を含む、請求項２７に記載の方法。
  35. 前記細胞表面受容体がケモカイン受容体またはインテグリン受容体を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 先天性免疫を選択的に増強することが可能な薬剤を同定する方法であって、先天性免疫に関与するポリペプチドをコードする１または複数のポリヌクレオチドを含有する細胞を対象の薬剤と接触させるステップを含み、薬剤の存在下における１または複数のポリヌクレオチドの発現が、薬剤の不在下における発現と比較してモジュレートされ、かつ発現がモジュレートされると先天性免疫の増強が起こる、上記方法。
  37. 前記発現パターンが先天性免疫を増強する化合物のスクリーニングに利用される、請求項２６に記載の方法。
  38. ケモカインまたはケモカイン受容体の発現を刺激する、請求項２８に記載の化合物。
  39. ケモカインまたはケモカイン受容体が、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２、ＣＣＲ６、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４またはＭＣＰ−５である、請求項３８に記載の化合物。
  40. 前記化合物が、ペプチド、ペプチド擬似体、化学化合物または核酸分子である、請求項２８に記載の化合物。
  41. 敗血症または炎症の応答を抑制または遮断し、かつ先天性免疫を増強することが可能な薬剤を同定する方法であって、
    ｉ）炎症または敗血症の応答を抑制することが可能なポリペプチドをコードする１または複数のポリヌクレオチド、およびｉｉ）先天性免疫に関与するポリペプチドをコードする１または複数のポリヌクレオチドを含有する細胞と、対象の薬剤とを接触させるステップ
    を含み、前記薬剤の存在下における発現が、薬剤の不在下における１または複数のポリヌクレオチドの発現と比較してモジュレートされ、かつ発現がモジュレートされると、炎症または敗血症の応答の抑制、および先天性免疫の増強が起こる、上記方法。
  42. 哺乳動物被験体の感染の状態を被験体の核酸サンプルから推測する方法であって、前記核酸サンプル中で、非感染の被験体と比較した場合の、表５５に示す少なくとも２個のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現の上昇により例示されるポリヌクレオチド発現パターンを同定するステップを含む、上記方法。
  43. 哺乳動物被験体の感染の状態を被験体の核酸サンプルから推測する方法であって、前記核酸サンプル中で、非感染の被験体と比較した場合の、表５６に示す少なくとも２個のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現の低下により例示されるポリヌクレオチド発現パターンを同定するステップを含む、上記方法。
  44. 哺乳動物被験体の感染の状態を被験体の核酸サンプルから推測する方法であって、前記核酸サンプル中で、非感染の被験体と比較した場合の、表５７に示す少なくとも２個のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現により例示されるポリヌクレオチド発現パターンを同定するステップを含む、上記方法。
  45. 感染状態が、細菌、ウィルス、真菌、または寄生生物の因子によるものである、請求項３０、３１または３２のいずれかに記載の方法。
  46. 感染状態がグラム陽性菌またはグラム陰性菌によるものである、請求項３０、３１または３２のいずれかに記載の方法。
  47. 請求項３１に記載の方法により同定された感染状態を有する被験体のポリヌクレオチド発現パターン。
  48. ＣＸＣＲ−４のアンタゴニストであるカチオン性ペプチド。
  49. ＣＸＣＲ−４のアンタゴニストであるカチオン性ペプチドを同定する方法であって、
    試験ペプチドの存在下または不在下においてＴ細胞とＳＤＦ−１とを接触させるステップ、
    走化性を測定するステップ
    を含み、試験ペプチドの存在下における走化性の低下が、ＣＸＣＲ−４のアンタゴニストであるペプチドを示すものである、上記方法。
  50. 一般式：Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＩＸ４ＰＸ４ＩＰＸ５Ｘ２Ｘ１（配列番号４）（式中、Ｘ１は１個または２個のＲ、ＬまたはＫであり、Ｘ２は１個のＣ、ＳまたはＡであり、Ｘ３は１個のＲまたはＰであり、Ｘ４は１個のＡまたはＶであり、Ｘ５は１個のＶまたはＷである）を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
  51. ＬＬＣＲＩＶＰＶＩＰＷＣＫ（配列番号５）、ＬＲＣＰＩＡＰＶＩＰＶＣＫＫ（配列番号６）、ＫＳＲＩＶＰＡＩＰＶＳＬＬ（配列番号７）、ＫＫＳＰＩＡＰＡＩＰＷＳＲ（配列番号８）、ＲＲＡＲＩＶＰＡＩＰＶＡＲＲ（配列番号９）およびＬＳＲＩＡＰＡＩＰＷＡＫＬ（配列番号１０）からなる群から選択される、請求項３８に記載のカチオン性ペプチド。
  52. 抗炎症活性を有するものである、請求項３８に記載のペプチド。
  53. 抗敗血症活性を有するものである、請求項３８に記載のペプチド。
  54. 一般式：Ｘ１ＬＸ２Ｘ３ＫＸ４Ｘ２Ｘ５Ｘ３ＰＸ３Ｘ１（配列番号１１）（式中、Ｘ１は１個または２個のＤ、Ｅ、Ｓ、ＴまたはＮであり、Ｘ２は１個または２個のＰ、ＧまたはＤであり、Ｘ３は１個のＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＹであり、Ｘ４は１個のＲ、ＫまたはＨであり、Ｘ５は１個のＳ、Ｔ、Ｃ、ＭまたはＲである）を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
  55. ＤＬＰＡＫＲＧＳＡＰＧＳＴ（配列番号１２）、ＳＥＬＰＧＬＫＨＰＣＶＰＧＳ（配列番号１３）、ＴＴＬＧＰＶＫＲＤＳＩＰＧＥ（配列番号１４）、ＳＬＰＩＫＨＤＲＬＰＡＴＳ（配列番号１５）、ＥＬＰＬＫＲＧＲＶＰＶＥ（配列番号１６）およびＮＬＰＤＬＫＫＰＲＶＰＡＴＳ（配列番号１７）からなる群から選択される、請求項４２に記載のカチオン性ペプチド。
  56. 抗炎症活性を有するものである、請求項４２に記載のペプチド。
  57. 抗敗血症活性を有するものである、請求項４２に記載のペプチド。
  58. 一般式：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＷＸ４ＷＸ４Ｘ５Ｋ（配列番号１８）（式中、Ｘ１はＡ、ＰまたはＲから選択される１〜４個であり、Ｘ２は１個または２個の芳香族アミノ酸（Ｆ、ＹおよびＷ）であり、Ｘ３は１個のＰまたはＫであり、Ｘ４はＡ、Ｐ、ＹまたはＷから選択される１個もしくは２個、または０個であり、Ｘ５はＲまたはＰから選択される１〜３個である）を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
  59. ＲＰＲＹＰＷＷＰＷＷＰＹＲＰＲＫ（配列番号１９）、ＲＲＡＷＷＫＡＷＷＡＲＲＫ（配列番号２０）、ＲＡＰＹＷＰＷＡＷＡＲＰＲＫ（配列番号２１）、ＲＰＡＷＫＹＷＷＰＷＰＷＰＲＲＫ（配列番号２２）、ＲＡＡＦＫＷＡＷＡＷＷＲＲＫ（配列番号２３）およびＲＲＲＷＫＷＡＷＰＲＲＫ（配列番号２４）からなる群から選択される、請求項４６に記載のカチオン性ペプチド。
  60. 抗炎症活性を有するものである、請求項４６に記載のペプチド。
  61. 抗敗血症活性を有するものである、請求項４６に記載のペプチド。
  62. 一般式：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ１ＶＸ３Ｘ４ＲＧＸ４Ｘ３Ｘ４Ｘ１Ｘ３Ｘ１（配列番号２５）（式中、Ｘ１は１個または２個のＲまたはＫであり、Ｘ２は極性アミノ酸または荷電アミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＨ）であり、Ｘ３はＣ、Ｓ、Ｍ、ＤまたはＡであり、Ｘ４はＦ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＲである）を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
  63. ＲＲＭＣＩＫＶＣＶＲＧＶＣＲＲＫＣＲＫ（配列番号２６）、ＫＲＳＣＦＫＶＳＭＲＧＶＳＲＲＲＣＫ（配列番号２７）、ＫＫＤＡＩＫＫＶＤＩＲＧＭＤＭＲＲＡＲ（配列番号２８）、ＲＫＭＶＫＶＤＶＲＧＩＭＩＲＫＤＲＲ（配列番号２９）、ＫＱＣＶＫＶＡＭＲＧＭＡＬＲＲＣＫ（配列番号３０）およびＲＲＥＡＩＲＲＶＡＭＲＧＲＤＭＫＲＭＲＲ（配列番号３１）からなる群から選択される、請求項５０に記載のカチオン性ペプチド。
  64. 抗炎症活性を有するものである、請求項５０に記載のペプチド。
  65. 抗敗血症活性を有するものである、請求項５０に記載のペプチド。
  66. 一般式：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ１ＶＸ５Ｘ４ＲＧＸ４Ｘ５Ｘ４Ｘ１Ｘ３Ｘ１（配列番号３２）（式中、Ｘ１が１個または２個のＲまたはＫであり、Ｘ２は極性アミノ酸または荷電アミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＨ）であり、Ｘ３は１個のＣ、Ｓ、Ｍ、ＤまたはＡであり、Ｘ４は１個のＦ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＲであり、Ｘ５は１個のＡ、Ｉ、Ｓ、Ｍ、ＤまたはＲである）を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
  67. ＲＴＣＶＫＲＶＡＭＲＧＩＩＲＫＲＣＲ（配列番号３３）、ＫＫＱＭＭＫＲＶＤＶＲＧＩＳＶＫＲＫＲ（配列番号３４）、ＫＥＳＩＫＶＩＩＲＧＭＭＶＲＭＫＫ（配列番号３５）、ＲＲＤＣＲＲＶＭＶＲＧＩＤＩＫＡＫ（配列番号３６）、ＫＲＴＡＩＫＫＶＳＲＲＧＭＳＶＫＡＲＲ（配列番号３７）およびＲＨＣＩＲＲＶＳＭＲＧＩＩＭＲＲＣＫ（配列番号３８）からなる群から選択される、請求項５４に記載のカチオン性ペプチド。
  68. 抗炎症活性を有するものである、請求項５４に記載のペプチド。
  69. 抗敗血症活性を有するものである、請求項５４に記載のペプチド。
  70. 一般式：ＫＸ１ＫＸ２ＦＸ２ＫＭＬＭＸ２ＡＬＫＫＸ３（配列番号３９）（式中、Ｘ１は極性アミノ酸（Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ＮおよびＱ）であり、Ｘ２は１個のＡ、Ｌ、ＳまたはＫであり、Ｘ３はＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、ＫおよびＨから選択される１〜１７個のアミノ酸である）を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
  71. ＫＣＫＬＦＫＫＭＬＭＬＡＬＫＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＫＬＴＫ（配列番号４０）、ＫＳＫＳＦＬＫＭＬＭＫＡＬＫＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳ（配列番号４１）、ＫＴＫＫＦＡＫＭＬＭＭＡＬＫＫＶＶＳＴＡＫＰＬＡＩＬＳ（配列番号４２）、ＫＭＫＳＦＡＫＭＬＭＬＡＬＫＫＶＬＫＶＬＴＴＡＬＴＬＫＡＧＬＰＳ（配列番号４３）、ＫＮＫＡＦＡＫＭＬＭＫＡＬＫＫＶＴＴＡＡＫＰＬＴＧ（配列番号４４）およびＫＱＫＬＦＡＫＭＬＭＳＡＬＫＫＫＴＬＶＴＴＰＬＡＧＫ（配列番号４５）からなる群から選択される、請求項５８に記載のカチオン性ペプチド。
  72. 抗炎症活性を有するものである、請求項５８に記載のペプチド。
  73. 抗敗血症活性を有するものである、請求項５８に記載のペプチド。
  74. 一般式：ＫＷＫＸ２Ｘ１Ｘ１Ｘ２Ｘ２Ｘ１Ｘ２Ｘ２Ｘ１Ｘ１Ｘ２Ｘ２ＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号４６）（式中、Ｘ１は疎水性アミノ酸であり、Ｘ２は親水性アミノ酸である）を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
  75. ＫＷＫＳＦＬＲＴＦＫＳＰＶＲＴＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号４７）、ＫＷＫＳＹＡＨＴＩＭＳＰＶＲＬＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号４８）、ＫＷＫＲＧＡＨＲＦＭＫＦＬＳＴＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号４９）、ＫＷＫＫＷＡＨＳＰＲＫＶＬＴＲＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号５０）、ＫＷＫＳＬＶＭＭＦＫＫＰＡＲＲＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号５１）およびＫＷＫＨＡＬＭＫＡＨＭＬＷＨＭＩＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号５２）からなる群から選択される、請求項６２に記載のカチオン性ペプチド。
  76. 抗炎症活性を有するものである、請求項６２に記載のペプチド。
  77. 抗敗血症活性を有するものである、請求項６２に記載のペプチド。
  78. ＫＷＫＳＦＬＲＴＦＫＳＰＶＲＴＶＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号５３）の配列を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
  79. ＫＷＫＳＹＡＨＴＩＭＳＰＶＲＬＶＦＨＴＡＬＫＰＩＳＳ（配列番号５４）の配列を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
  80. 前記薬剤が、ジンクフィンガータンパク質（ＡＦ０６１２６１）；細胞周期遺伝子（Ｓ７０６２２）；ＩＬ−１０受容体（Ｕ００６７２）；トランスフェラーゼ（ＡＦ０３８６６４）；ホメオボックスタンパク質（ＡＣ００４７７４）；フォークヘッドタンパク質（ＡＦ０４２８３２）；未知（ＡＬ０９６８０３）；ＫＩＡＡ０２８４タンパク質（ＡＢ００６６２２）；推定タンパク質（ＡＬ０２２３９３）；受容体（ＡＦ１１２４６１）；推定タンパク質（ＡＫ００２１０４）；タンパク質（ＡＬ０５０２６１）；ポリペプチド（ＡＦ１０５４２４）；ＳＰＲ１タンパク質（ＡＢ０３１４８０）；デヒドロゲナーゼ（Ｄ１７７９３）；トランスフェラーゼ（Ｍ６３５０９）；およびペルオキシソーム因子（ＡＢ０１３８１８）である、請求項２８に記載の方法。
  81. アップレギュレートされた遺伝子が、登録番号Ｄ８７４５１（リングフィンガータンパク質１０）；登録番号ＡＬ０４９９７５（未知）；登録番号Ｕ３９０６７（真核生物の翻訳開始因子３サブユニット２）；登録番号ＡＫ０００９４２（未知）；登録番号ＡＢ０４００５７（セリン／スレオニンプロテインキナーゼＭＡＳＫ）；登録番号ＡＢ０２０７１９（ＫＩＡＡ０９１２タンパク質）；登録番号ＡＢ００７８５６（ＦＥＭ−１様デスレセプター結合タンパク質）；登録番号ＡＬ１３７３７６（未知）；登録番号ＡＬ１３７７３０（未知）；登録番号Ｍ９０６９６（カテプシンＳ）；登録番号ＡＫ００１１４３（未知）；登録番号ＡＦ０３８４０６（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ）；登録番号ＡＫ０００３１５（推定タンパク質ＦＬＪ２０３０８）；登録番号Ｍ５４９１５（ｐｉｍ−１癌遺伝子）；登録番号Ｄ２９０１１（プロテアソームサブユニットβ型５）；登録番号ＡＬ０３４３４８（未知）；登録番号Ｄ８７０７６（ＫＩＡＡ０２３９タンパク質）；登録番号ＡＪ００１４０３（気道ムチン５サブタイプＢ）；登録番号Ｊ０３９２５（インテグリンαＭ）；Ｒｈｏ関連キナーゼ２（ＮＭ＿００４８５０）；ＰＴＤ０１７タンパク質（ＡＬ０５０３６１）；未知遺伝子（ＡＫ００１１４３、ＡＫ０３４３４８、ＡＬ０４９２５０、ＡＬ１６１９９、ＡＬ０３１９８３）；レチノイン酸受容体（Ｘ０６６１４）；Ｇタンパク質共役型受容体（Ｚ９４１５５、Ｘ８１８９２、Ｕ５２２１９、Ｕ２２４９１、ＡＦ０１５２５７、Ｕ６６５７９）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体７（Ｌ３１５８４）；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（Ｚ２９５７５）；インターフェロンγ受容体２（Ｕ０５８７５）；サイトカイン受容体様因子１（ＡＦ０５９２９３）；クラスＩサイトカイン受容体（ＡＦ０５３００４）；凝固因子ＩＩ（トロンビン）受容体様２（Ｕ９２９７１）；白血病抑制因子受容体（ＮＭ＿００２３１０）；インターフェロンγ受容体１（ＡＬ０５０３３７）；またはこれらの任意の組合せである、請求項５６により同定された感染状態を有する被験体のポリヌクレオチド発現パターン。
  82. 前記ケモカインが、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＭＩＰ−１α、ＭＤＣ、ＭＩＰ−３α、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５およびＲＡＮＴＥＳを含む、請求項３２に記載の方法。
  83. 前記細胞分化因子が、ＴＧＦβ誘導性初期増殖応答２（ＡＩ４７３９３８）、ジンクフィンガータンパク質（ＡＦ０６１２６１、Ｕ００１１５、Ｘ７８９２４）、および転写因子（Ｕ３１５５６、ＡＬ１３７６８１、Ｘ６８５６０）を含む、請求項３３に記載の方法。
  84. キナーゼ活性を変化させる、請求項３８に記載の化合物。
  85. 前記キナーゼが、ＭＡＰキナーゼキナーゼ３（Ｄ８７１１６）、ＭＡＰキナーゼキナーゼ６（Ｈ０７９２０）、ＭＡＰキナーゼキナーゼ５（Ｗ６９６４９）、ＭＡＰキナーゼ７（Ｈ３９１９２）、ＭＡＰキナーゼ１２（ＡＩ９３６９０９）、ＭＡＰキナーゼ活性化プロテインキナーゼ３（Ｗ６８２８１）、またはＭＡＰキナーゼキナーゼ１（Ｌ１１２８４）から選択されるものである、請求項８４に記載の化合物。
  86. プロテアソームサブユニット発現を低下させる、請求項２１に記載の化合物。
  87. 前記プロテアソームサブユニットが、登録番号Ｄ１１０９４、Ｌ０２４２６、Ｄ００７６３、ＡＢ００９３９８、ＡＦ０５４１８５、Ｍ３４０７９、Ｍ３４０７９またはＡＬ０３１１７７のポリヌクレオチドを含む、請求項８６に記載の化合物。
  88. ＳＤＦ−１受容体のポリヌクレオチド発現を低下させる、単離されたカチオン性ペプチド。
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