JP2005527190A - 核タンパク質「ｓｈｏｃａ」−ｗｎｔシグナル伝達経路の成分 - Google Patents
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Abstract
以下を含む単離されたShocaポリペプチド：(i) 配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列；または(ii) wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができるその変異体；または(iii) wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができる(i)または(ii)の断片、該ポリペプチドをコードするポリペプチド、該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用してwntシグナル伝達経路のモジュレーターを同定する方法、および癌の診断および治療法。
Description
本発明は、健常、新生物および発癌性組織に関連する新規シグナル伝達タンパク質に関する。本発明はまた、シグナル伝達タンパク質の活性および／または発現のモジュレーターの同定方法、および癌の診断、予後および治療の関連方法に関する。
ヒトの癌は、通常は細胞増殖と生存をモジュレートする転写プログラムに影響を与える、独立した遺伝的変化の蓄積により発生する。単一の臨床的範疇内の癌は、明らかに異質と思われる遺伝的欠陥を示すが、これは、一般的なシグナル伝達経路の一部である。wntシグナル伝達経路（図1に要約）の発見および／またはその独特の分子成分の構造／機能解析は、発癌における共通点を特定するための優れた例を提供している（Polakis (2000) Genes & Development 14:1837-1851; PeiferとPolakis (2000) Science 287:1606-1609）。
wntシグナル伝達は、その特異的細胞表面受容体（縮れている（frizzled）と指摘されている）の1つまたはいくつかに結合する、分泌されるwnt糖タンパク質ファミリーのメンバーにより開始される。この7回膜貫通受容体のファミリーは、各リガンドに結合すると、乱れたタンパク質を活性化する。axinに関連して、乱れはグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3βが、決定的に重要な基質（例えば、β-カテニン）をリン酸化することを妨害する。他の基質には、陰性制御物質であるaxin自体とAPCがある。非リン酸化β-カテニンは、ユビキチン経路を介して分解を逃れ、核に移動して、そこでＴ細胞因子（TCF）や白血球増強因子（LEF）のような転写因子に結合する。哺乳動物では、wntシグナル伝達により転写的に制御される同定される標的遺伝子の数は限定されているが、c-myc、サイクリンD1、c-jun、マトリックスメタロプロテイナーゼおよびCD44がある。
ヒト癌のwnt遺伝子の転写による過剰発現、および時に過少発現について無数の報告があるが、mRNA発現は単に相関的なものである。新生物形質転換へのwnt介在シグナルの関与のより説得力のある証拠は、wntシグナル伝達で機能する制御遺伝子の変異解析により得られる。例えば、β-カテニンのいくつかの変異は、このタンパク質をAPCによる阻害に対して抵抗性にし、従ってその分解を防いでいる。従って、β-カテニン／TCF制御遺伝子転写の構成的活性化が起きる。同様に、APCとaxinの変異性変化はβ-カテニンの正常な制御を破壊し、種々の型の腫瘍と関連がある。すなわち、wnt分子、そのシグナル伝達経路、およびその生物学的作用を解析することにより、発癌（結腸直腸癌、家族性腺腫様ポリープ症、散発性デスモイド（すなわち、攻撃的線維腫症）、胃癌、肝芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、黒色腫、膵臓腫瘍、未分化甲状腺腫瘍、髄芽細胞腫、子宮内膜卵巣癌、前立腺癌、および急性リンパ芽球性白血病の発生を含む）へのwntの関与を示す直接的および後成的証拠の解釈をさらに促進するであろう。
配列の簡単な説明
配列番号1は、マウスShoca-1のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
配列番号1は、マウスShoca-1のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
配列番号2は、ヒトShoca-1のアミノ酸配列を示す。
配列番号3は、ヒトShoca-1のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
配列番号4は、ヒトShoca-1のアミノ酸配列を示す。
配列番号5は、マウスShoca-2のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
配列番号6は、マウスShoca-2のアミノ酸配列を示す。
配列番号7は、ヒトShoca-2のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
配列番号8は、ヒトShoca-2のアミノ酸配列を示す。
配列番号9は、ヒトShoca-1のN末端アミノ酸配列を示す。
配列番号10は、マウスShoca-1のN末端アミノ酸配列を示す。
配列番号11は、ヒトShoca-2のN末端アミノ酸配列を示す。
配列番号12は、マウスShoca-2のN末端アミノ酸配列を示す。
配列番号13は、ゼブラフィッシュ同族体AのN末端アミノ酸配列を示す。
配列番号14は、ゼブラフィッシュ同族体BのN末端アミノ酸配列を示す。
配列番号15は、ヒトShoca-1のSH2ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号16は、マウスShoca-1のSH2ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号17は、ヒトShoca-2のSH2ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号18は、マウスShoca-2のSH2ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号19は、Shoca抗体を作成するために使用されるペプチドShoca#0のアミノ酸配列を示す。
配列番号20は、抗Shoca抗体を作成するために使用されるペプチドShoca#1のアミノ酸配列を示す。
配列番号21は、抗Shoca抗体を作成するために使用されるペプチドShoca#2のアミノ酸配列を示す。
配列番号22は、抗Shoca抗体を作成するために使用されるペプチドShoca#3のアミノ酸配列を示す。
配列番号23は、抗Shoca抗体を作成するために使用されるペプチドShoca#4のアミノ酸配列を示す。
配列番号24は、抗Shoca抗体を作成するために使用されるペプチドShoca#5のアミノ酸配列を示す。
本発明者らは、生成物がwnt介在シグナル伝達に直接関与する新規遺伝子を、マウスおよびヒト組織中に同定した。その遺伝子（配列番号1と配列番号3）は、52kDa（ウェスタンブロッティングにより証明）のSH2ドメイン含有するアダプタータンパク質（SH2-domain containing adaptor protein）をコードし、従ってShoca-1と命名した。次に、公のドメインのEST分析の使用により、第2のマウスShoca様遺伝子（Shoca-2）が同定された（配列番号5）。配列相同性に基づき、ヒトShoca-2同族体もまた同定されている（配列番号7）。
本発明者らは、Shocaの広範な分子解析を行い、ex vivoでその機能を解析し、正常組織でその発現が無いかまたは少ないこと、およびその発現が、種々の組織中の発癌性変化に相関することを証明した。Shoca-1の発現パターンとWntのシグナルのShoca介在モジュレートの機能的作用は、細胞の運命の決定プロセスにおけるこの分子ファミリーの中心的な役割を示唆する。Wntシグナル伝達に影響を与える他の分子との類似により、通常のShoca機能の障害が、異なる組織の細胞のホメオスタシスに影響を与え、これは生理学的細胞増殖および分化から異常細胞生存と機能に至るかも知れない。この点で、Shocaの機能的異常の検出は、疾患進行、治療応答および予後の予測における診断上の重要性を有する。さらに、Shoca機能をモジュレートする新規相互作用性分子は、無制限な細胞分化と増殖を妨ぐユニークな手段となるであろう。すなわち本発明者らは、細胞の正常な生理とホメオスタシスの制御においてShocaが重要であり、ヒトの悪性腫瘍の診断、リスク評価および治療に有用かも知れないことを証明した。
従って本発明は、以下を提供する：
− 以下を含む単離されたShocaポリペプチド：
(i) 配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列；または
(ii) wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができるその変異体；または
(iii) wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができる(i)または(ii)の断片；
− 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
− 以下を含む、wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができるShocaポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
(i) 配列番号1または配列番号3の核酸配列、および／またはこれに相補的な配列；
(ii) (i)に定義した配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
(iii) (i)または(ii)に定義した配列に対して、遺伝コードの結果として縮重である配列；または
(iv) (i)、(ii)、または(iii)に定義した配列と少なくとも85％の同一性を有する配列；
− 本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
− 本発明のベクターを含む宿主細胞；
− 本発明のポリペプチドに特異的な抗体；
− 以下を含む、wntシグナル伝達経路をモジュレートすることができる物質を同定する方法：
(i) 配列番号2または4のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその変異体、またはそのいずれかの断片（この変異体または断片は、wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができる）、または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および試験物質を提供する；
(ii) ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと試験物質とを接触させる；および
(iii) 試験物質が、該ポリペプチドの発現または該ポリペプチドの機能または性質に影響を与えるかどうかを測定し、こうして試験物質がShoca活性をモジュレートすることができるかどうかを決定する；
− ヒトまたは動物の体に行われる治療法またはヒトまたは動物の体に行われる診断法で使用される、本発明の方法により同定されるShoca活性をモジュレートすることができる物質；
− 癌の診断または治療に使用される診断物質または薬剤の製造における、本発明の方法により同定される物質の使用；
− 被験体からの組織サンプル中のShoca発現レベルを測定することを含む、癌の診断法；
− 被験体からの組織サンプル中のShoca発現レベルを測定することを含む、腫瘍の進行を予測する方法；
− 個体は本発明の方法を使用して癌を有すると診断されている、個体中の癌を治療するための薬剤の製造における、抗癌剤の使用；および
− 以下を含む、癌の治療法：
(i) Shoca活性をモジュレートすることができる物質を同定する；そして
(ii) 必要なヒトまたは動物被験体に該物質の治療的有効量を投与する。
− 以下を含む単離されたShocaポリペプチド：
(i) 配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列；または
(ii) wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができるその変異体；または
(iii) wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができる(i)または(ii)の断片；
− 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
− 以下を含む、wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができるShocaポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
(i) 配列番号1または配列番号3の核酸配列、および／またはこれに相補的な配列；
(ii) (i)に定義した配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
(iii) (i)または(ii)に定義した配列に対して、遺伝コードの結果として縮重である配列；または
(iv) (i)、(ii)、または(iii)に定義した配列と少なくとも85％の同一性を有する配列；
− 本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
− 本発明のベクターを含む宿主細胞；
− 本発明のポリペプチドに特異的な抗体；
− 以下を含む、wntシグナル伝達経路をモジュレートすることができる物質を同定する方法：
(i) 配列番号2または4のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその変異体、またはそのいずれかの断片（この変異体または断片は、wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができる）、または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および試験物質を提供する；
(ii) ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと試験物質とを接触させる；および
(iii) 試験物質が、該ポリペプチドの発現または該ポリペプチドの機能または性質に影響を与えるかどうかを測定し、こうして試験物質がShoca活性をモジュレートすることができるかどうかを決定する；
− ヒトまたは動物の体に行われる治療法またはヒトまたは動物の体に行われる診断法で使用される、本発明の方法により同定されるShoca活性をモジュレートすることができる物質；
− 癌の診断または治療に使用される診断物質または薬剤の製造における、本発明の方法により同定される物質の使用；
− 被験体からの組織サンプル中のShoca発現レベルを測定することを含む、癌の診断法；
− 被験体からの組織サンプル中のShoca発現レベルを測定することを含む、腫瘍の進行を予測する方法；
− 個体は本発明の方法を使用して癌を有すると診断されている、個体中の癌を治療するための薬剤の製造における、抗癌剤の使用；および
− 以下を含む、癌の治療法：
(i) Shoca活性をモジュレートすることができる物質を同定する；そして
(ii) 必要なヒトまたは動物被験体に該物質の治療的有効量を投与する。
タンパク質
本発明は、wntシグナル伝達経路の新規タンパク質（以後Shocaと呼ぶ）、その機能性変異体、およびShocaもしくはShocaの変異体の機能性断片に関する。マウスShoca-1の配列情報は、配列番号1（ヌクレオチドとアミノ酸）と配列番号2に記載され、ヒトShoca-1の配列情報は、配列番号3（ヌクレオチドとアミノ酸）と配列番号4に記載され、マウスShoca-2の配列情報は、配列番号5（ヌクレオチドとアミノ酸）と配列番号6に記載され、ヒトShoca-2の配列情報は、配列番号7（ヌクレオチドとアミノ酸）と配列番号8に記載されている。すなわち本発明のポリペプチドは基本的に、配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列、またはこれらの配列の任意の1つの変異体、またはこれらの配列もしくは変異体の任意の1つの断片からなる。
本発明は、wntシグナル伝達経路の新規タンパク質（以後Shocaと呼ぶ）、その機能性変異体、およびShocaもしくはShocaの変異体の機能性断片に関する。マウスShoca-1の配列情報は、配列番号1（ヌクレオチドとアミノ酸）と配列番号2に記載され、ヒトShoca-1の配列情報は、配列番号3（ヌクレオチドとアミノ酸）と配列番号4に記載され、マウスShoca-2の配列情報は、配列番号5（ヌクレオチドとアミノ酸）と配列番号6に記載され、ヒトShoca-2の配列情報は、配列番号7（ヌクレオチドとアミノ酸）と配列番号8に記載されている。すなわち本発明のポリペプチドは基本的に、配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列、またはこれらの配列の任意の1つの変異体、またはこれらの配列もしくは変異体の任意の1つの断片からなる。
本発明のポリペプチドは、実質的に単離された型でもよい。ポリペプチドは、そのポリペプチドの企図された目的を妨害しないであろう担体または希釈剤と混合してもよく、それでも実質的に単離されたとして見なされることを理解される。本発明のポリペプチドはまた、実質的に精製された型でもよく、この場合、これは一般的に、調製物中の50％を超える、例えば80、90、95、または99重量％のポリペプチドが本発明のポリペプチドである調製物中のポリペプチドを含む。本発明のタンパク質を精製および／または合成するのに、ルーチンの方法を使用することができる。そのような方法は、当業者に公知であり、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、CHSラボラトリープレス、1989年（この開示内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示のような方法がある。
「変異体」という用語は、Shoca-1の少なくとも1つの性質または機能を有するポリペプチドを意味する。本発明の「断片」はまた、Shoca-1の少なくとも1つの機能または性質を有する。Shoca-1は、wntシグナル伝達経路のシグナル伝達タンパク質である。Shoca-1はまた、細胞の生存、増殖または分化を制御する任意の他の経路のシグナル伝達タンパク質でもある。好ましくは変異体ポリペプチドは、wntシグナル伝達経路の分子、好ましくは核分子と相互作用することができるものである。好ましくは変異体ポリペプチドは、LEF、TGFおよび／またはβ-カテニンと相互作用することができる。変異体は、内因性Shocaタンパク質と相互作用してもよい。好ましくは変異体ポリペプチドは、β-カテニン-LEF/TCFに制御される転写をモジュレートすることができる。好ましくは本発明のポリペプチドによるβ-カテニン-LEF/TCF転写のモジュレートは組織特異的であり、例えば、胸腺上皮細胞では抑制が起き、繊維芽細胞では刺激が起きる。
本発明の変異体ポリペプチドは典型的には、Shocaの機能（例えばLEFおよび／またはTCFおよび／またはβ-カテニンへの結合、LEF/TCF応答性制御配列の制御下でのレポーター遺伝子の発現のモジュレート）についてモニターすることにより同定される。
Shoca-1のSH2ドメインは、胸腺上皮細胞中のLEF/TCF介在転写の抑制に必須である。従って、Shocaの変異体または断片は、機能性のSH2ドメインを含むことが好ましい。他の好適な断片および変異体は、Shoca-1の他の機能性ドメイン（例えば、コイルド−コイルドメインまたはリン酸化部位）を含んでよい。
Shocaは、ほとんど核でのみ発現される。好適な断片および変異体は、核局在化配列を含有する。N末端の最初の50アミノ酸が欠如したShoca-1の変異体は、細胞質から核へ移動できず、この配列内のモチーフが核局在化配列を含有することを示唆する。従って、本発明の変異体または断片は、核局在化配列を含むN末端ドメインを含むことが好ましい。さらに好ましくは、変異体または断片は、配列番号4の56位〜63位の配列を含有する。
本発明の別の態様において変異体は、Shocaと同じ活性は示さないがShocaの基本的な機能を阻害する（すなわち、優性−陰性活性を有する）ものである。例えば、変異体ポリペプチドは、ShocaによるLEF/TCF介在転写のモジュレートを阻害するものである。
アミノ酸レベルで異なるShocaタンパク質の間の同一性は以下の通りである：ヒトShoca-1は、マウスShoca-1と91％同一である；ヒトShoca-2はマウスShoca-2と72％同一である；ヒトShoca-1はヒトShoca-2と40％同一である；マウスShoca-1はマウスShoca-2と40％同一である。
典型的には、配列番号2または4と約40％以上、好ましくは少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％、および特に好ましくは少なくとも91％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の同一性を有するポリペプチドは、このタンパク質の変異体であると見なされる。そのような変異体は、ポリペプチドがShocaの少なくとも1つの機能または性質を保持する限り、アレル変異体、タンパク質配列内の単一のアミノ酸もしくはアミノ酸群の欠失、修飾または付加を含んでよい。好ましくは配列番号2または4の変異体は、Shoca-1と同じドメイン構造（すなわち、コイルド−コイルドメインおよび／またはC末端SH2ドメイン）を有するであろう。
アミノ酸置換、例えば1、2または3〜10、20、または30の置換があってもよい。修飾ポリペプチドは一般に、wntシグナル伝達分子としての活性を保持する。例えば表に従って、保存的置換を作成してもよい。2列目の同じブロック中、および好ましくは3列目の同じ行のアミノ酸は、互いに置換できる。
脂肪族 非極性 ＧＡＰ
ＩＬＶ
極性−非変化 ＣＳＴＭ
ＮＱ
極性−変化 ＤＥ
ＫＲ
芳香族 ＨＦＷＹ
本発明の範囲の変異体ポリペプチドは、任意の適当な方法、例えば遺伝子シャフリング（分子交雑）法により作成される。
より短いポリペプチド配列も本発明の範囲内である。例えば長さが少なくとも20アミノ酸、または50、60、70、80、100、150または200アミノ酸までの長さのペプチド断片も、Shocaの基本的な生物学的機能を示す限り、本発明の範囲内にあると考えられる。特に（しかし排他的ではない）本発明のこの面は、タンパク質が完全なタンパク質配列の断片であり、LEF/TCF結合領域である場合を、包含する。そのような断片は、キメラ分子を構築するのに使用することができる。そのようなShocaの断片またはその変異体もまた、抗Shoca抗体を作成するのに使用することができる。
WO01/54733は、配列番号7のアミノ酸配列の残基220〜454に対応する235アミノ酸の長さのアミノ酸配列を（特に）同定している。WO01/54733では、このペプチドに機能は割り当てられていない。このペプチドは、本発明の好適な断片ではない。WO01/53455は、特に配列番号931を同定し、第4の残基で始まるその配列は配列番号7のアミノ酸配列の残基266〜454に対応する。WO01/53455では、このペプチドに具体的な機能は割り当てられていない。このペプチドは、本発明の好適な断片ではない。
本発明のポリペプチドは、化学的に修飾（例えば、翻訳的に修飾）してもよい。例えばこれらは、グリコシル化されているかまたは修飾アミノ酸残基を含有してもよい。これらはまた、その精製を助けるためにヒスチジン残基の付加により、または核への移動を促進するために核局在化配列の付加により、修飾してもよい。そのような修飾ポリペプチドは、本発明の「ポリペプチド」という用語の範囲に含まれる。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、Shocaまたはその変異体もしくは断片をコードするヌクレオチド配列、ならびにこれに相補的なヌクレオチド配列を含む。このヌクレオチド配列は、DNAまたはRNA（ゲノムDNA、合成DNA、またはcDNAを含む）でもよい。好ましくはヌクレオチド配列はDNA配列であり、最も好ましくはcDNA配列である。マウスとヒトShoca-1のヌクレオチド配列情報は、それぞれ配列番号1と3に記載され、マウスとヒトShoca-2のヌクレオチド配列情報は、それぞれ配列番号5と7に記載されている。そのようなヌクレオチドは、例えばSambrookら、1989に記載のような当該分野で公知の方法に従って、細胞から単離されるかまたは合成される。
本発明はまた、Shocaまたはその変異体もしくは断片をコードするヌクレオチド配列、ならびにこれに相補的なヌクレオチド配列を含む。このヌクレオチド配列は、DNAまたはRNA（ゲノムDNA、合成DNA、またはcDNAを含む）でもよい。好ましくはヌクレオチド配列はDNA配列であり、最も好ましくはcDNA配列である。マウスとヒトShoca-1のヌクレオチド配列情報は、それぞれ配列番号1と3に記載され、マウスとヒトShoca-2のヌクレオチド配列情報は、それぞれ配列番号5と7に記載されている。そのようなヌクレオチドは、例えばSambrookら、1989に記載のような当該分野で公知の方法に従って、細胞から単離されるかまたは合成される。
典型的には本発明のポリヌクレオチドは、選択的条件下で配列番号1のコード配列またはコード配列の相補体にハイブリダイズすることができるヌクレオチドの連続的配列を含有する。そのような配列は、配列番号3、5および7に記載のような配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、バックグランドより有意に高いレベルで配列番号1のコード配列またはコード配列の相補体にハイブリダイズすることができる。バックグランドハイブリダイゼーションは、例えばcDNAライブラリー中に存在する他のcDNAにより起きるかも知れない。本発明のポリヌクレオチドと配列番号1のコード配列またはコード配列の相補体との間の相互作用により生成するシグナルレベルは、他のポリヌクレオチドと配列番号1のコード配列との間の相互作用より、典型的には少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍強い。相互作用の強さは、例えばプローブを例えば32Pで放射能標識して測定される。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には中〜高ストリンジェント条件下で行われる。しかしそのようなハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の任意の適当な条件下で行うことができる（Sambrookら、1989を参照。例えば高ストリンジェンシーが必要な場合は、適当な条件は60℃〜65℃で0.1〜0.2×SSCを含む。低いストリンジェンシーが必要な場合は、適当な条件は60℃で2×SSCを含む）。
配列番号1、3、5、または7のコード配列は、ヌクレオチド置換（例えば1、2または3から10、25、50または100の置換）により修飾してもよい。配列番号1、3、5、または7のポリヌクレオチド配列は、代替的にまたは追加的に、1つ以上の挿入および／または欠失および／または一端または両端での伸長により修飾されてよい。ポリヌクレオチドは1つ以上のイントロンを含有してもよく、例えばゲノムDNAを含有してもよい。修飾ポリヌクレオチドは一般的にShocaの活性を有するポリペプチドをコードする。あるいはポリヌクレオチドは、ポリペプチドのリガンド結合部分、またはShoca活性をモジュレートするポリペプチドをコードする。例えば上記表に示したように、縮重置換を作成してもよく、または修飾配列が翻訳される時、保存的アミノ酸置換を引き起こすような置換を作成してもよい（例えば、上記表に示すように）。
異なるShocaタンパク質間のDNAレベルでの同一性は以下の通りである：ヒトShoca-1はマウスShoca-1と80％同一である；ヒトShoca-2はマウスShoca-2と75％同一であり、ヒトShoca-1はヒトShoca-2と57％同一である；およびマウスShoca-1はマウスShoca-2と59％同一である。
配列番号1または3のDNAコード配列の相補体に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列は一般的に、配列番号1のコード配列と、少なくとも20、好ましくは少なくとも30、例えば少なくとも40、少なくとも60、さらに好ましくは少なくとも100の連続的ヌクレオチドの領域にわたって、または最も好ましくは配列番号1の完全長にわたって、少なくとも50％、少なくとも57％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するであろう。好ましくは、ヌクレオチド配列は、Shoca-1と同じドメイン構造（すなわち、コイルド−コイルドメインおよび／またはC末端SH2ドメイン）を有するポリペプチドをコードする。
例えばUWGCGパッケージは、相同性を計算するのに使用できるBESTFITプログラムを提供する（例えば、そのデファオルト設定に基づき使用される）（Devereuxら、(1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395）。例えばAltschul S.F.(1993) J. Mol. Evol. 36, 290-300；Altschul S.F.ら(1993) J. Mol. Biol. 215, 403-10に記載のように、相同性またはラインアップ配列を計算するの、PILEUPおよびBLASTアルゴリズムを（典型的には、そのデファオルト設定に基づき）使用することができる。
BLAST解析を行うためのソフトウェアは、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公に入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さの単語と並べた時、ある正の閾値スコアＴに一致するかまたは満足する問題の配列中の長さＷの短い単語を同定することにより、まず高スコア配列対（HSPs）を同定する。Ｔは、近隣単語スコア閾値と呼ばれる（Altschulら、1990）。これらの初期近隣単語ヒットは、それらを含むHSPsを見つけるための検索を開始するための元になる。単語ヒットは、累積整列スコアを増加することができる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向の単語ヒットの延長は、以下の時停止する：累積整列スコアが、その最大達成値から量Ｘだけ低下した時；1つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積により、累積スコアがゼロまたはそれ以下になった時；またはいずれかの配列の末端に到達した時。BLASTアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、整列の感度と速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルト値として、単語長さ（Ｗ）が11、BLOSUM62スコアリングマトリックス（HenikoffとHenikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919）整列（Ｂ）が50、予測（Ｅ）が10、Ｍ＝5、N＝4を使用し、および両方の鎖の比較を使用する。
BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性の統計解析を行う；例えば、KarlinとAltschul、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787、およびAltschulとGish (1996) Methods Enzymol. 266:460-480を参照。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの尺度は、最小和確率（Ｐ(N)）であり、これは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一致が偶然起きる確率を示す。例えば第1の配列と第2の配列との比較における最小和確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、さらに好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満なら、その配列はもう1つの配列と同様であると見なされる。
配列同一性と最小サイズの上記程度の組合せは、本発明のポリヌクレオチドを定義するのに使用され、よりストリンジェンシーの組合せ（すなわち、より長い長さにわたってより高い配列同一性）が好ましい。すなわち、例えば25、好ましくは30ヌクレオチドにわたって少なくとも90％の配列同一性を有するポリヌクレオチドは、本発明の1つの態様を形成し、40ヌクレオチドにわたって95％の配列同一性を有するポリヌクレオチドも同様である。
本発明のヌクレオチドは、本発明のタンパク質の産生において有用であり、これは、in vitro、in vivoまたはex vivoで起きる。ヌクレオチドは、組換えタンパク質合成またはそれ自体が遺伝子治療に使用される治療薬として、関与してもよい。Shocaをコードするヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、またはアンチセンス配列もまた、遺伝子治療で使用してもよい。
本発明はまた、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。そのような発現ベクターは、分子生物学の分野で一般的に構築され、例えばプラスミドDNAおよび適切な開始物質、プロモーター、エンハンサーおよび他の要素（例えば、必要であり、タンパク質発現を可能にする正しい配向で位置しているポリアデニル化シグナル）の使用を含む。他の適当なベクターは、当業者に公知であろう。この点のさらなる例は、Sambrookら、1989を参照されたい。
Shoca遺伝子のATG部位から上流のフランキング配列は、Shoca発現の制御に重要である。Shocaの正しい発現に必要なフランキング細胞は、本発明の発現ベクターに含まれる。
本発明のポリヌクレオチドはまた、アンチセンスRNAを産生するために、アンチセンス配向で上記ベクター中に挿入される。アンチセンスRNAまたは他のアンチセンスポリヌクレオチドはまた、合成手段によっても産生される。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは本発明のアッセイで試験化合物として使用されるか、またはヒトまたは動物の体の治療法で有用であろう。
好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を与えることができる制御配列に機能できる形で結合している（すなわち、ベクターは発現ベクターである）。「機能できる形で結合した」という用語は、記載の成分が目的とする方法で機能する関係にある並列関係にあることを意味する。コード配列に「機能できる形で結合した」プロモーターのような制御配列は、制御配列に適合する条件下で、コード配列の発現が行われるように、位置している。
ベクターは、複製開始点、場合により該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、および場合によりプロモーターの制御物質を有する、例えばプラスミド、ウイルスまたはファージベクターでもよい。ベクターは、1つ以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、または真菌ベクターの場合は耐性遺伝子を含有してもよい。ベクターはin vitroで、例えばDNAもしくはRNAの産生のために、または宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）をトランスフェクトまたは形質転換するのに使用される。ベクターはまた、in vivoで、例えば遺伝子治療法で使用できるように修飾される。
プロモーターおよび他の発現制御シグナルは、発現が計画される宿主細胞に適合性があるように選択される。例えば酵母プロモーターには、エス・セレビッシェ（S. cerevisiae）GAL4やADHプロモーター、エス・ポンベ（S. pombe）nmt1およびadhプロモーターがある。哺乳動物プロモーターには、重金属（例えば、カドミウム）に応答して誘導されるメタロチオネインプロモーターがある。SV40ラージＴ抗原プロモーター、またはアデノウイルスプロモーターのようなウイルスプロモーターも使用される。IRESプロモーター使用される。これらのすべてのプロモーターは当該分野で容易に利用できる。
β−アクチンのような哺乳動物プロモーターを使用してもよい。組織特異的プロモーターが特に好ましい。ウイルスプロモーターも使用され、例えばモロニーマウス白血病ウイルス末端繰返し配列（MMLV LTR）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）IEプロモーター、アデノウイルス、HSVプロモーター（例えば、HSV IEプロモーター）、またはおよびHPVプロモーター、特にHPV上流制御領域（URR）がある。ウイルスプロモーターは、当該分野で容易に利用できる。
ベクターは、さらに真核生物ゲノム配列、好ましくは哺乳動物ゲノム配列、またはウイルスゲノム配列と相同的な配列を含むポリヌクレオチドを与えるポリヌクレオチドを与える、ポリヌクレオチドの両側に位置する配列を含む。これは、相同的組換えによる真核生物細胞またはウイルスのゲノム内への本発明のそのようなポリヌクレオチドの導入を可能にする。特に、ウイルス配列が両側に位置する発現カセットを含むプラスミドベクターを使用して、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するのに適したウイルスベクターが調製される。適切なウイルスベクターの他の例には、単純ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルスがあり、例えばレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびHPVウイルスがある。これらのウイルスを使用する遺伝子トランスファー法は、当業者に公知である。例えばレトロウイルスベクターを使用して、ポリヌクレオチドを安定に組み込み、ポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に作成してもよい。これに対して複製欠損アデノウイルスベクターはエピソーム性であり、従って一過性発現を可能にする。
ベクターは、さらに真核生物ゲノム配列、好ましくは哺乳動物ゲノム配列、またはウイルスゲノム配列と相同的な配列を含むポリヌクレオチドを与えるポリヌクレオチドを与える、ポリヌクレオチドの両側に位置する配列を含む。これは、相同的組換えによる真核生物細胞またはウイルスのゲノム内への本発明のそのようなポリヌクレオチドの導入を可能にする。特に、ウイルス配列が両側に位置する発現カセットを含むプラスミドベクターを使用して、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するのに適したウイルスベクターが調製される。適切なウイルスベクターの他の例には、単純ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルスがあり、例えばレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびHPVウイルスがある。これらのウイルスを使用する遺伝子トランスファー法は、当業者に公知である。例えばレトロウイルスベクターを使用して、ポリヌクレオチドを安定に組み込み、ポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に作成してもよい。これに対して複製欠損アデノウイルスベクターはエピソーム性であり、従って一過性発現を可能にする。
本発明はまた、本発明のShocaポリペプチドを発現するように修飾された細胞を含む。そのような細胞は、一過性のまたは好ましくは安定な高等真核生物細胞株（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）を含み、例えば、バキュロウイルス発現系、下等真核細胞（例えば、酵母）または原核細胞（例えば、細菌細胞）の使用がある。本発明のポリペプチドをコードするベクターの挿入により修飾される細胞の具体的な例には、哺乳動物胸腺上皮細胞、繊維芽細胞、HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3およびCOS細胞がある。本発明のポリペプチドは、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスの細胞で発現される。本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物は、本発明の範囲に含まれる。
抗体
別の面において本発明はまた、本発明のポリペプチドに特異的な抗体に関する。そのような抗体は、例えば免疫沈降を含む精製、単離またはスクリーニング法に有用であるか、それ自体が治療薬として使用されている。抗体は、本発明のポリペプチドの特異的エピトープに対して作成される。
別の面において本発明はまた、本発明のポリペプチドに特異的な抗体に関する。そのような抗体は、例えば免疫沈降を含む精製、単離またはスクリーニング法に有用であるか、それ自体が治療薬として使用されている。抗体は、本発明のポリペプチドの特異的エピトープに対して作成される。
好適な抗体は、配列番号19、20および21に示すアミノ酸配列に対して作成される。
抗体は、Shoca機能を傷害するように使用してもよい。抗体または他の化合物は、特異的なタンパク質に対して優先的なまたは高親和性で結合するが、他のタンパク質に対して実質的に結合しないかまたは低い親和性で結合する時、タンパク質に「特異的に結合」する。抗体の特異的結合能力を測定するための競合的結合またはイムノラジオメトリックアッセイの種々のプロトコールは、当該分野で公知である（例えば、Maddoxら、J. Exp. Med. 158, 1211-226, 1993）。そのようなイムノアッセイは典型的には、特異的タンパク質とその抗体との複合体の形成および複合体形成の測定を含む。
本発明の抗体は、ヒトポリペプチドまたはその断片に対する抗体でもよい。本発明の目的における「抗体」という用語は、特に明記しない場合は、本発明のポリペプチドに結合する断片を含む。そのような断片にはFv、Ｆ(ab')およびＦ(ab')2断片、ならびに1本鎖抗体がある。さらに抗体およびその断片は、キメラ抗体、CDR移植抗体またはヒト化抗体でもよい。
抗体は、生物的サンプル中の本発明のポリペプチドを検出する方法において使用され、その方法は以下を含む：
Ｉ 本発明の抗体を提供する；
II 生物学的サンプルを該抗体とともに、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートする；および
III 該抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを測定する。
Ｉ 本発明の抗体を提供する；
II 生物学的サンプルを該抗体とともに、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートする；および
III 該抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを測定する。
サンプルは、例えば組織抽出物、血液、血清および唾液である。本発明の抗体は、固体支持体に結合するか、および／または適当な試薬、対照、説明書などとともに適当な容器中に、包装されてキットになる。抗体は、示現性標識物に結合してもよく、こうしてin vivoのShocaイメージング法での使用に適したものとなる。
本発明の抗体は、任意の適当な方法により産生することができる。抗体を調製し性状解析する方法は当該分野で公知であり、例えばHarlowとLane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual", コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州を参照されたい。例えば、抗体は、宿主動物中で、全ポリペプチドまたはその断片、例えばその抗原性エピトープ（本明細書において以後「免疫原」）に対して産生される。
ポリクローナル抗体の産生法は、適当な宿主動物（例えば、実験動物）を免疫原で免疫し、動物の血清から免疫グロブリンを単離することを含む。従って動物は、免疫原を接種され、次に動物から血液が採取され、IgG画分が精製される。
モノクローナル抗体の産生法は、所望の抗体を産生する細胞を不死化することを含む。接種した実験動物からの脾細胞を腫瘍細胞と融合することにより、ハイブリドーマ細胞を産生してもよい（KohlerとMilstein、Nature, (1975) 256:495-497)。
所望の抗体を産生する不死化した細胞は、従来法により選択される。ハイブリドーマを培養物中で増殖させるか、または腹腔内注入して腹水を形成させるか、または同種異系宿主または免疫無防備状態宿主の血流中に注入する。ヒトリンパ球のin vitro免疫と、次にリンパ球をエプスタインバーウイルスで形質転換し、ヒト抗体の産生を可能にするトランスジェニックマウス中で、ヒト抗体を調製してもよい。
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方の産生のために、実験動物はヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスが好ましい。所望であれば、免疫原は、例えばアミノ酸残基の1つの側鎖を介して免疫原が適当な担体に結合したコンジュゲートとして投与してもよい。担体分子は典型的には生物学的許容される担体である。得られる抗体は単離され、所望であれば精製される。
アッセイ
本発明の重要な態様は、スクリーニング法における本発明のポリペプチドの使用である。スクリーニング法は、ShocaポリペプチドまたはmRNAに結合する物質を同定するのに使用される。スクリーニング法はまた、Shoca活性のインヒビターまたはアクチベーターでもよいモジュレーター、またはShoca発現をアップレギュレートもしくはダウンレギュレートする物質を同定するのに使用される。一般的に、Shocaに結合することができ、Shoca活性をモジュレートすることができ、および／またはShoca発現をモジュレートすることができる物質は、wntシグナル伝達経路をモジュレートすることができるであろう。
本発明の重要な態様は、スクリーニング法における本発明のポリペプチドの使用である。スクリーニング法は、ShocaポリペプチドまたはmRNAに結合する物質を同定するのに使用される。スクリーニング法はまた、Shoca活性のインヒビターまたはアクチベーターでもよいモジュレーター、またはShoca発現をアップレギュレートもしくはダウンレギュレートする物質を同定するのに使用される。一般的に、Shocaに結合することができ、Shoca活性をモジュレートすることができ、および／またはShoca発現をモジュレートすることができる物質は、wntシグナル伝達経路をモジュレートすることができるであろう。
このアッセイには任意の適当なフォーマットが使用される。一般的に、そのようなスクリーニング法は、本発明のポリペプチドに試験物質を接触させ、試験物質のポリペプチドへの結合をモニターするかまたはShoca活性を測定することを含む。本発明のポリペプチドを試験物質とともにインキュベートしてもよい。Shoca活性のモジュレートを測定してもよい。好適な態様において、アッセイは細胞ベースのアッセイである。好ましくはアッセイは、マイクロタイタープレートの単一のウェル中で行われる。高処理能力スクリーニングを可能にするアッセイフォーマットが好ましい。
モジュレーター活性は、本発明のポリペプチドを発現する細胞に、検査する物質を接触させ、ポリペプチドにより仲介される作用をモニターすることにより測定できる。ポリペプチドを発現する細胞は、in vitroでもin vivoでもよい。本発明のポリペプチドは、天然のものでも組換え発現したものでもよい。好ましくはアッセイは、組換えポリペプチドを発現する細胞を使用してin vitroで行われる。好ましくは、観察された応答はポリペプチドの活性化の結果であるかどうかを確立するために、本発明のポリペプチドを発現しない細胞について対照実験が行われる。典型的には細胞は、wntシグナル伝達経路の他の分子（例えば、β-カテニン、LEFおよび／またはTCF）を発現するであろう。
wntシグナル伝達経路をモジュレートすることができる物質の同定法は、基本的に以下からなる：
(i) 本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドと試験物質とを提供する；
(ii) ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと試験物質とを接触させる；および
(iii) ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと試験物質との相互作用をモニターし、こうして試験物質がwntシグナル伝達経路をモジュレートすることができるかどうかを決定する。
(i) 本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドと試験物質とを提供する；
(ii) ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと試験物質とを接触させる；および
(iii) ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと試験物質との相互作用をモニターし、こうして試験物質がwntシグナル伝達経路をモジュレートすることができるかどうかを決定する。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと試験物質との相互作用は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの試験物質への結合をモニターすることにより、直接モニターすることができる。好ましくはポリペプチドまたはポリペプチドをコードするmRNAへの試験物質の直接的結合がモニターされる。例えば、放射能標識試験物質を本発明のポリペプチドとともにインキュベートし、試験物質のポリペプチドへの結合をモニターすることができる。
Shocaを発現する細胞を使用し、そのような細胞を試験物質とともにインキュベートすることにより、アッセイが行われる。アッセイの結果は、試験物質の非存在下で同じアッセイを使用して得られた結果と比較される。Shoca機能のためのアッセイで使用される、Shocaを構成的に発現する細胞が提供される。あるいは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと試験物質との相互作用が、本発明のShocaポリペプチドの活性をモニターすることにより、間接的にモニターされる。wntシグナル伝達経路をモジュレートすることができる物質は、Shoca活性のインヒビターであるか、またはShoca活性のアクチベーターでもよい。
Shoca活性は、例えば細胞増殖、分化、成長または生存をモニターすることにより、細胞へのShoca活性の刺激または阻害作用をモニターすることにより測定される。
Shoca活性は、本発明のポリペプチドのリン酸化をモニターし、試験物質がリン酸化を阻害するかまたは増強するかを測定することにより、測定される。
ShocaはLEF/TCF転写因子に直接または間接に結合するか、および／または核中でβ-カテニンと同時結合する。Shocaは、細胞状況に応じて、核中でβ-カテニン-LEF/TCF介在転写を抑制するかまたは活性化する。Shocaがそのような転写に対して作用を示すためには、核中に存在しなければならない。従ってShoca活性は、本発明のポリペプチドの細胞内の位置、特に核への移動をモニターすることにより測定される。
本発明の方法は、wntシグナル伝達経路の分子（例えば、β-カテニン、LEFおよび／またはTCF）へのShocaの結合を阻害または増強する物質を同定するのに使用してもよい。本発明のwntシグナル伝達経路をモジュレートすることができる物質の同定法は、Shocaと相互作用できるwntシグナル伝達経路の分子を提供することをさらに含む。次に、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび試験物質とwntシグナル伝達分子は、ポリペプチドとwntシグナル伝達分子との相互作用に適した条件下で接触させられ、その相互作用をモニターすることにより、ポリペプチドとwntシグナル伝達分子との相互作用への試験物質の作用が測定される。好ましくはwntシグナル伝達分子は、β-カテニン、TCF、LEF、またはβ-カテニン、TCFおよび／またはLEFの任意の組合せである。
本発明のShocaポリペプチドとwntシグナル伝達分子（例えば、β-カテニン、LEFまたはTCF）との相互作用を阻害する物質はまた、哺乳動物2-ハイブリッドアッセイ、酵母2-ハイブリッドアッセイ、酵母3-ハイブリッドアッセイ（タンパク質−DNA相互作用アッセイ）、または他のタンパク質相互作用アッセイ（例えば、同時免疫沈降）、またはELISAベースの方法により同定される。
wntシグナル伝達経路をモジュレートすることができる物質は、試験物質が、本発明のShocaポリペプチドによる遺伝子転写のモジュレートを、阻害または増強するかどうかを測定することにより同定される。IE、遺伝子発現のShoca仲介抑制または活性化に及ぼす試験物質の作用は、本発明の方法でモニターされる。典型的には、LEFおよび／またはTCFの転写制御下でレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築体が提供され、本発明のポリペプチドおよび試験物質と、レポーター遺伝子の発現に適した条件下で接触させられる。レポーター遺伝子の発現がモニターされ、試験物質の無い対照実験中の発現と比較され、試験物質がShoca活性をモジュレートするかどうかを決定する。
また、Shoca発現を修飾する物質（例えば、発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする物質）を同定するためのアッセイが行われる。一般に、そのようなアッセイでは本発明のポリヌクレオチドは、試験物質と接触させられる。ポリヌクレオチドがmRNAであって、試験物質が翻訳をモジュレートしてもよい。好ましくはポリヌクレオチドはDNAであり、試験物質は好ましくは転写をモジュレートする。あるいはそのようなアッセイは、例えばShocaの抗体を使用してShoca発現レベルをモニターすることにより行われる。
追加の対照実験も行われる。
上記アッセイで試験される適当な試験物質には、コンビナトリアルライブラリー、特定された化学的物質および化合物、ペプチドおよびペプチド模倣物、オリゴヌクレオチドおよび天然物ライブラリー、例えばディスプレイ（例えば、ファージ表示（phage display）ライブラリー）および抗体生成物がある。
典型的には有機分子、好ましくは分子量が50〜2500ダルトンの小有機分子がスクリーニングされる。候補化合物は、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはこれらの組合せを含む生体分子でもよい。候補物質は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む広範囲の供給源から得られる。既知の薬剤は、指向性またはランダム化学修飾（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など）に付されて構造類似体を産生してもよい。
試験物質は、例えば1反応当たり10個の物質の初期スクリーニングが行われ、阻害または活性化を示すこれらのバッチの物質は個々に試験される。試験物質は、1nM〜1000μM、好ましくは1μM〜100μM、さらに好ましくは1μM〜10μMの濃度で使用される。好ましくは試験物質の存在下のShoca活性が、試験物質の非存在下の活性と比較される。インヒビターとして作用する試験物質は、Shoca活性の50％阻害を示す。あるいは、アクチベーターとして作用する試験物質は、50％だけShoca活性を上昇させる。
β-カテニン-LEF/TCF転写活性に及ぼすShocaの活性は、組織特異的である。例えば胸腺上皮細胞では、Shocaはそのような転写活性を抑制するように作用するが、繊維芽細胞ではShocaは、LEF/TCFの制御下で遺伝子配列の転写を刺激する。ある実施形態において本発明は、Shocaと相互作用する細胞成分を同定する方法であって、Shocaの組織特異的活性を測定する方法を提供する。そのような方法は典型的には、試験物質が細胞成分であるwntシグナル伝達経路のモジュレーターの同定のために本明細書に記載したアッセイを含む。適当な試験物質には、例えば粗細胞抽出物、細胞抽出物の一部、細胞抽出物から精製されるタンパク質、または目的の型の細胞もしくは組織から単離されるタンパク質がある。
本発明の別の態様は、ヒトの疾患、特に癌への罹り安さに関与するとされているShoca遺伝子の変異を同定するための、本発明のShocaポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用である。そのような変異の同定は、そのような疾患の診断もしくは罹り安さを助けるのに、およびそのような疾患の生理学を評価するのに使用される。ポリヌクレオチドはまた、Shoca発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションをモニターするためのハイブリダイゼーション試験で使用される。配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7のようなポリヌクレオチドまたはこれらの断片は、アレル変異体、ゲノムDNAおよび分子変異体を同定するのに使用される。
診断
本発明は、Shoca遺伝子によりコードされる発現生成物中の変化を検出するための方法を提供する。これは、細胞で発現されるShocaのレベルを測定するか、または発現される生成物中の特異的変化を測定することを含む。診断目的の目的の配列には、限定されないが、配列類似性およびイントロン／エキソン構造の保存により同定される保存部分がある。診断は、目的の変異が家族の疾患表現型とともに同時分離するかどうかを測定する家系試験とともに行われる。
本発明は、Shoca遺伝子によりコードされる発現生成物中の変化を検出するための方法を提供する。これは、細胞で発現されるShocaのレベルを測定するか、または発現される生成物中の特異的変化を測定することを含む。診断目的の目的の配列には、限定されないが、配列類似性およびイントロン／エキソン構造の保存により同定される保存部分がある。診断は、目的の変異が家族の疾患表現型とともに同時分離するかどうかを測定する家系試験とともに行われる。
本発明者らは、Shocaが多くの異なるタイプの細胞および新生物組織で発現されることを証明した。特にShocaは、乳癌、結腸癌および子宮頚癌を含む明確な腫瘍型に関与している。広範囲の臓器からの正常組織は、Shocaが陰性であり、低レベルのShocaを発現するが、これらの組織におけるShocaの発現は、あまり悪性ではない腫瘍型に関連することがわかった。さらに、癌性進行は、多くの腫瘍でShoca発現の喪失と一致することが証明された。従ってShocaは、腫瘍、特に乳癌、結腸癌および子宮頚癌の、臨床的に関連する予後マーカーである。Shocaはまた、良性の組織変化が関与する疾患、例えば乳腺症、アポクリン化生、腺管内過形成、パピローマおよび癌の診断マーカーとして使用される。
すなわちさらなる実施形態において本発明は、被験体からの組織サンプル中のShoca発現レベルを測定することにより、癌を診断する方法を提供する。本発明はまた、被験体からの組織サンプル中のShoca発現レベルを測定することにより、腫瘍の進行を予測する方法を提供する。また、被験体からの組織サンプル中のShoca発現レベルを測定することにより、良性の組織変化が関与する疾患、例えば乳腺症、アポクリン化生、腺管内過形成、パピローマおよび癌を診断する方法が提供される。Shoca発現レベルは、本発明のポリペプチドのレベルまたは本発明のポリペプチドをコードするmRNAのレベルをモニターすることにより測定される。任意の適当な組織サンプルが使用され、例えば生検または切除からのサンプルがある。好ましくは癌は、乳癌、結腸癌および子宮頚癌である。
Shocaタンパク質またはmRNAの発現は、Shocaと相互作用する物質を使用して測定される。適当な物質は、本発明のスクリーニングアッセイを使用して同定される。好ましくはこの物質は、Shocaタンパク質と特異的に結合することができる。さらに好ましくはこの物質は本発明の抗体である。
癌の診断法、または腫瘍の進行を予測する方法、または良性の組織変化が関与する疾患、例えば乳腺症、アポクリン化生、腺管内過形成、パピローマおよび癌の診断法は、以下の工程を含む：
(i) Shocaと相互作用することができる物質を同定する；
(ii) ヒトまたは動物被験体からのサンプルと物質とを接触させる；および
(iii) 物質のサンプルへの結合をモニターする：および
(iv) 該サンプル中のShoca発現レベルが、癌または上記疾患を持たないヒトもしくは動物被験体からのサンプル中のShoca発現レベルと比較して、上昇しているかまたは低下しているかを測定する。
(i) Shocaと相互作用することができる物質を同定する；
(ii) ヒトまたは動物被験体からのサンプルと物質とを接触させる；および
(iii) 物質のサンプルへの結合をモニターする：および
(iv) 該サンプル中のShoca発現レベルが、癌または上記疾患を持たないヒトもしくは動物被験体からのサンプル中のShoca発現レベルと比較して、上昇しているかまたは低下しているかを測定する。
診断法は、個体から単離されたポリヌクレオチドについて行われるか、または核酸精製が必要無いように、生検または切除から得られた患者組織の組織切片（固定および／または凍結）についてin situで直接行われる。適当な方法は、例えばNuovo, G.J., 1992, 「PCR in situハイブリダイゼーション：プロトコールと応用（PCR in situ Hybridization: Protocols And Applications）」、Raven press, ニューヨーク州に記載されている。そのような分析法には、DNAまたはRNAブロッティング分析、1本鎖コンフォメーション多型解析、in situハイブリダイゼーションアッセイ、およびポリメラーゼ連鎖反応分析がある。そのような分析は、Shocaの発現パターンの定量的側面と、Shoca発現および／または組成物の定性的側面を明らかにする。
Shoca核酸分子の検出のための代替診断法には、その増幅、例えばPCR（実験例はUS Patent No. 4,683,202に記載されている）、リガーゼ連鎖反応（Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193）、自立性配列複製（Guatelliら、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、転写増幅システム（Kwohら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Q-ベータレプリカーゼ（Lizardiら、1988, Bio/Technology 6:1197）、または他の任意の核酸増幅法（例えば、Hollandら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280）があり、次に当業者に公知の方法を使用して、増幅分子が検出される。これらの検出スキームは、そのような分子が非常に少量しか存在しない場合、核酸分子の検出に特に有用である。
特に適した診断法は、チップベースのDNA法、例えばHaciaら、1996, Nature Genetics 14:441-447、Shoemakerら、1996, Nature Genetics 14:450-456およびWelfordら、1998, Nucleic Acids Res. 26:3059-3065に記載のものがある。簡単に説明するとこれらの方法は、多数の核酸配列標的を迅速かつ正確に分析する定量的方法を含む。オリゴヌクレオチドで標識するかまたは固定プローブアッセイを使用して、チップ法を用いて、高密度アレイとして標的分子を分離し、ハイブリダイゼーションに基づいてこれらの分子をスクリーニングすることができる。
検出後、ある患者で見られた結果を、統計的に有意な正常な患者の参照群と癌を有する患者群と比較する。こうして、検出されたShocaにコードされる生成物の量または種類を、種々の癌または種々の癌に対する性向と関連付けることができる。一般に、腫瘍の無い個体からの組織には、非常に低レベルのShoca発現かまたはShoca発現が全く無く、そのような組織中での発現は癌性腫瘍の指標かも知れない。
腫瘍を有することがわかっている個体では、Shocaの発現は典型的には、腫瘍があまり攻撃的ではないことを示し、腫瘍細胞中のShocaの発現が無いことは、典型的には腫瘍が悪性であることを示す。
治療法
本発明はまた、個体の癌を治療する方法であって：
(i) 個体からの組織サンプルについて本発明の診断法を行い；および
(ii) 個体に抗癌剤を投与する、
ことを含む方法を提供する。
本発明はまた、個体の癌を治療する方法であって：
(i) 個体からの組織サンプルについて本発明の診断法を行い；および
(ii) 個体に抗癌剤を投与する、
ことを含む方法を提供する。
本発明の他の態様は、Shoca活性の制御に応答性の疾患（例えば癌）の治療における、上記のスクリーニング法により同定された物質の使用である。特にそのような物質は、結腸癌、乳癌および子宮頚癌の治療で使用される。治療は治療的でも予防的でもよい。
従って本発明は、ヒトまたは動物の体の治療法、またはヒトまたは動物の体に行われる診断法で使用される、本発明の方法により同定されるwntシグナル伝達経路をモジュレートすることができる物質を提供する。癌の診断または治療に使用される薬剤の製造における本発明の方法により同定される物質の使用もまた、提供される。
本発明の癌の治療法は、基本的に以下の工程からなる：
(i) Shoca活性をモジュレートすることができる物質を同定する；そして
(ii) 必要なヒトまたは動物被験体に物質の治療的有効量を投与する。
(i) Shoca活性をモジュレートすることができる物質を同定する；そして
(ii) 必要なヒトまたは動物被験体に物質の治療的有効量を投与する。
治療の必要なヒトまたは動物は、本発明の診断法により同定される。
物質の治療的有効量は、癌を有する患者に投与した時、患者の症状を改善する量である。癌の1つ以上の症状が緩和されているなら、患者の症状は改善されている。この物質は、例えば腫瘍細胞を死滅させるかまたは腫瘍の進行を阻害してもよい。
上記で概説したスクリーニング法に従って同定される物質は、薬剤学の分野でルーチンに行われるように、標準的な薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤で調製される。例えば適当な物質が、生理食塩水または注射用水に溶解される。製剤の正確な性質は、投与される特定の物質および所望の投与経路を含むいくつかの要因に依存する。適当な型の製剤は、レミントンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）、マックパブリッシング社（Mack Publishing Company）、イースタンペンシルバニア、第17版に記載されている（この開示内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
物質は、経腸または非経口経路（例えば、経口、頬、肛門、肺、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、局所的投与を含む）または他の適切な投与経路により投与される。
モジュレーターの治療的有効量が、患者に投与される。モジュレーターの用量は、種々のパラメータ、特に使用される物質、治療される患者の年齢、体重、および症状、投与経路、および必要な処方に従って決定される。医師は、必要な投与経路と特定の患者の投与量を決定できるであろう。1日の投与量は、具体的なモジュレーターの活性、治療される被験体の年齢、体重および症状、変性の種類と重症度、および投与の頻度と経路により、約0.1〜50mg/kg体重である。好ましくは1日の投与量は5mg〜2ｇである。
Shoca活性またはアンチセンス核酸を阻害または増強する本発明のShocaポリペプチドをコードする核酸は、哺乳動物に投与してもよい。核酸（例えば、RNAまたはDNA）、および好ましくはDNAは、ベクターの形で提供され、例えば哺乳動物の細胞で発現される上記ポリヌクレオチドで提供される。
遺伝子治療のための哺乳動物に投与される核酸は、内因性Shocaの機能を破壊するドミナントネガティブ変異体のような機能が障害されたShocaの変異体をコードするか、または内因性Shocaの機能を増強する構成的に活性なShocaの変異体をコードする。
ポリペプチドをコードする核酸は、任意の利用できる方法により投与される。例えば、核酸は、針の注射、好ましくは皮内、皮下または筋肉内に導入される。あるいは、核酸は、粒子介在遺伝子送達のような核酸送達装置を使用して、皮膚を介して直接送達される。核酸は、皮膚に局所的に投与されるか、または鼻内、経口、膣内、または直腸内投与により、粘膜表面に投与される。
核酸構築体の取り込みは、いくつかの公知のトランスフェクション法（例えばトランスフェクション物質の使用を含むもの）により増強される。これらの物質の例には、陽イオン性物質、例えばリン酸カルシウムおよびDEAEデキストランおよびリポフェクタント（例えば、リポフェクタムとトランスフェクタム）がある。投与される核酸の用量は変化してもよい。典型的には核酸は、粒子介在遺伝子送達について1pg〜1mg、好ましくは1pg〜10μgの核酸、他の経路には10μg〜1mgが投与される。
Shoca-1、Wnt介在シグナル伝達に関与する新規遺伝子
我々は最近、マウスとヒト組織中に、その生成物がwnt介在シグナル伝達に直接関与している新規遺伝子を同定した。この遺伝子（配列番号1と配列番号3）は、52kDa（ウェスタンブロッティングにより証明）のSH2ドメイン含有するアダプタータンパク質（SH2-domain containing adaptor protein）をコードし、従ってShoca-1と命名した。次に、公のドメインのEST分析の使用により、第2のマウスShoca様遺伝子（Shoca-2）が同定された（配列番号5）。これらの遺伝子の存在も機能も、どの種でも報告されていない。
我々は最近、マウスとヒト組織中に、その生成物がwnt介在シグナル伝達に直接関与している新規遺伝子を同定した。この遺伝子（配列番号1と配列番号3）は、52kDa（ウェスタンブロッティングにより証明）のSH2ドメイン含有するアダプタータンパク質（SH2-domain containing adaptor protein）をコードし、従ってShoca-1と命名した。次に、公のドメインのEST分析の使用により、第2のマウスShoca様遺伝子（Shoca-2）が同定された（配列番号5）。これらの遺伝子の存在も機能も、どの種でも報告されていない。
マウスShoca-1 cDNA配列を使用してESTデータベース中でblast検索を行うことにより、マウスShoca-2が発見された。部分的EST配列を使用して、完全なコード配列を得るために、5'および3'RACEを行った。それ以来完全長cDNAは、マウスShoca-2と同一の配列で公のデータベースに提出されている（受け入れコードAK008803）。同様に、ヒトESTとヒトゲノムデータベースのBLAST検索により、ヒトShoca-2が見つかった。ヒトShoca-2はESTデータベース中に見いだされる（受け入れコードAK024799）。ヒトShoca-2配列は、完全にESTデータベースから取られた。
ヒトでの染色体性局在は、ヒトShoca-1について10q22-q23.1であり、ヒトShoca-2について8pter-p23.3である。さらにマウスShoca-1のN末端部分に対応する断片化されたDNA配列は、公のドメイン中に見いだされた。しかし、この配列のオープンリーディングフレーム中のエラーにより、翻訳エラーが導入された。このエラー（1塩基対）を直すことにより、214残基のアミノ酸配列を正しく翻訳することができるであろう。
マウスShoca-1にはスプライス変異体があり、これは選択的エキソン1を有し、従ってタンパク質のN末端に異なるアミノ酸配列を有する。これまでのところ、この変異体がヒトに存在する（Shoca-1領域のゲノム配列に基づき）証拠は無く、これが何らかの生物学的機能を有するかどうかも不明である。マウスとヒトShoca-2は、単一のエキソンにコードされると考えられる（ヒトゲノム配列に基づき）数個のアミノ酸残基のストレッチが異なる。この配列は、いくつかの興味深いPrositeモチーフを有する。これまでのところ、このエキソンがあるマウス転写体に含まれるかどうか、またはいくつかのヒト転写体で欠如しているかどうかは不明である。
Shocaファミリーは、マウスとヒトで全配列にわたってよく保存されており、マウスとヒトの配列相同性がShoca-1について約90％であり、Shoca-2について70％であることを明らかにしている。マウスとヒトのオルソログの間のアミノ酸配列は、91％の相同性と95％の類似性を示す（図4）。我々はまた、ゼブラフィッシュ（D. rerio）中で2つのShocaファミリーメンバーを検出した（これについて現在、それぞれ受け入れコードAW419549とBE016614のEST配列のみが知られている）。マウス、ヒトおよびゼブラフィッシュのN末端とC末端配列（存在するなら）は驚くべほど類似しており、こうして、おそらく明確な機能の充分保存されたドメインを明らかにしている（図2と図3）。SH2モチーフを有するが、Shoca-1はほとんど核でのみ発現される。最初のN末端50アミノ酸が欠如したShoca-1の変異体は、細胞質から核に移動せず、この配列内のモチーフが核局在化についての情報を含むことを示唆している。予測により、56〜63位（PPKTKRAA）がヒトShoca-1中にNLSを含有するすることが明らかになった。
Shoca特異抗体の作成
抗体調製物A
細胞下局在化を測定するのに使用される抗Shoca-1抗体（ウサギポリクローナル血清）を、我々の研究所で作製した。異なるバッチを使用して、繰り返し追加免疫した後、異なる時間に動物を出血させた。免疫原は、担体タンパク質KLHに結合したマウスShoca-1由来ペプチドである。
抗体調製物A
細胞下局在化を測定するのに使用される抗Shoca-1抗体（ウサギポリクローナル血清）を、我々の研究所で作製した。異なるバッチを使用して、繰り返し追加免疫した後、異なる時間に動物を出血させた。免疫原は、担体タンパク質KLHに結合したマウスShoca-1由来ペプチドである。
ペプチドShoca#0：NH2-CLPDTSPPSPLTGPDRTWERPLRC-CONH2
このペプチドは、マウスShoca-1残基272位〜293位に対応する22アミノ酸のストレッチである。N末端およびC末端システインを導入して、免疫を増強するためにタンパク質担体上のループ形成を可能にした。
このペプチドは、マウスShoca-1残基272位〜293位に対応する22アミノ酸のストレッチである。N末端およびC末端システインを導入して、免疫を増強するためにタンパク質担体上のループ形成を可能にした。
抗体調製物B
実施例5の染色実験で使用されている抗Shoca-1抗体は、Eurogentecにより2羽のウサギで作成され、これもポリクローナル調製物である。染色で使用したすべての調製物は、ペプチド充填カラムを使用してアフィニティー精製された。精製された血清は、4回目の追加免疫後に、一匹の動物から得られた。免疫原は、担体タンパク質KLHに結合した2匹のマウスShoca-1由来ペプチドの混合物であり、同時に注入した。
実施例5の染色実験で使用されている抗Shoca-1抗体は、Eurogentecにより2羽のウサギで作成され、これもポリクローナル調製物である。染色で使用したすべての調製物は、ペプチド充填カラムを使用してアフィニティー精製された。精製された血清は、4回目の追加免疫後に、一匹の動物から得られた。免疫原は、担体タンパク質KLHに結合した2匹のマウスShoca-1由来ペプチドの混合物であり、同時に注入した。
ペプチドShoca#1：NHCOCH3-CGEGPGDKPYEEISEEC-COOH
ペプチドShoca#2：NHCOCH3-ADEERSRRAQRARDEYRRC-CONH2
ペプチド#1は、マウスShoca-1タンパク質配列のストレッチ83〜97の15アミノ酸残基であり、ペプチド#2は、マウスShoca-1タンパク質配列のストレッチ220〜237の18アミノ酸残基である。N末端（ペプチド#1）とC末端（両方のペプチド）システインを導入して、免疫（ペプチド#1）のために、またはペプチド#2中のC末端アンカリング残基を導入するために、タンパク質担体上のループ形成を可能にした。両方のペプチドを担体タンパク質に結合させ、ウサギに同時に注射した。
ペプチドShoca#2：NHCOCH3-ADEERSRRAQRARDEYRRC-CONH2
ペプチド#1は、マウスShoca-1タンパク質配列のストレッチ83〜97の15アミノ酸残基であり、ペプチド#2は、マウスShoca-1タンパク質配列のストレッチ220〜237の18アミノ酸残基である。N末端（ペプチド#1）とC末端（両方のペプチド）システインを導入して、免疫（ペプチド#1）のために、またはペプチド#2中のC末端アンカリング残基を導入するために、タンパク質担体上のループ形成を可能にした。両方のペプチドを担体タンパク質に結合させ、ウサギに同時に注射した。
抗体調製物C
ヒト特異的抗Shoca-1抗体は、Eurogentecがウサギで作成し、これもポリクローナル調製物である。免疫原は、担体タンパク質KLHに結合したヒトShoca-1由来ペプチドであり、N末端またはC末端に加えたシステインを利用し、およびヘテロ2官能性架橋剤MBSを利用した。ペプチド−KLHコンジュゲートを、皮下注射した。
ヒト特異的抗Shoca-1抗体は、Eurogentecがウサギで作成し、これもポリクローナル調製物である。免疫原は、担体タンパク質KLHに結合したヒトShoca-1由来ペプチドであり、N末端またはC末端に加えたシステインを利用し、およびヘテロ2官能性架橋剤MBSを利用した。ペプチド−KLHコンジュゲートを、皮下注射した。
ペプチド#3：NHCOCH3-CGLRPPKTRAASDKHIQC-COOH
ペプチド#3は、ヒトShoca-1タンパク質配列の53位〜69位の17アミノ酸残基である。染色実験で使用される調製物を、後述のようにペプチド充填カラムを使用してアフィニティー精製した。精製した血清は、4回目の追加免疫後に一匹の動物から得られた。
ペプチド#3は、ヒトShoca-1タンパク質配列の53位〜69位の17アミノ酸残基である。染色実験で使用される調製物を、後述のようにペプチド充填カラムを使用してアフィニティー精製した。精製した血清は、4回目の追加免疫後に一匹の動物から得られた。
粗抗血清を0.45μmフィルターでろ過し、ペプチドカラムでアイニティー精製した。動物を免疫した遊離のペプチドを、スルフヒドリル基を介してヨードアセチル結合架橋アガロースに共有結合させた（FulfoLink Coupling Gel, Pierce "20401）。非結合の反応性ヨードアセチル基を、システインで消滅させた。各反応性の抗血清を、ペプチドカラムに結合させた。カラム結合画分を0.1Ｍグリシン（pH3.0）で溶出した。溶出液を、1Ｍトリス−塩酸で直ちに中和してpH7.0を達成した。精製した抗体を、PBS（pH7.3）に対して平衡化させ、50kD MWCOカラム（Vivascience #VS0131）で濃縮した。タンパク質濃度は、購入したウサギIgGを濃度標準物質（Peprotech #500-P00）として使用して、BCA法（Pierce #23223/23224）を使用して測定した。最終調製物は、0.02％NaN3を加えることにより安定化させた。4回目の追加免疫後に一匹の動物から得られた血清を精製した。
抗体調製物D
SH2ドメイン特異的抗Shoca-1抗体を作成し、抗体調製物Cについて記載したように親和性精製したが、アンカリング残基としてC末端システインを導入した。
SH2ドメイン特異的抗Shoca-1抗体を作成し、抗体調製物Cについて記載したように親和性精製したが、アンカリング残基としてC末端システインを導入した。
ペプチドShoca#4：NHCOCH3-DASGDFYSELGVDPNRHC-CONH2
ペプチド#4は、ヒトShoca-1タンパク質配列の376位〜392位の17アミノ酸残基である。この配列ストレッチは、ヒトおよびマウスShoca-1と同一である。上記したようにペプチドを担体タンパク質に結合させ、ウサギに注射した。
ペプチド#4は、ヒトShoca-1タンパク質配列の376位〜392位の17アミノ酸残基である。この配列ストレッチは、ヒトおよびマウスShoca-1と同一である。上記したようにペプチドを担体タンパク質に結合させ、ウサギに注射した。
抗体調製物E
ヒト特異的抗Shoca-2抗体を作成し、抗体調製物Dについて記載したように親和性精製した。
ヒト特異的抗Shoca-2抗体を作成し、抗体調製物Dについて記載したように親和性精製した。
ペプチドShoca#5：NHCOCH3-QQMLADSINRMKC-CONH2
ペプチド#5は、ヒトShoca-2タンパク質配列の181位〜192位の12アミノ酸残基である。この配列は、ヒトShoca-1ともマウスShoca-1もしくは-2とも同一ではない。このペプチドを担体タンパク質に結合させ、ウサギに注射した。
ペプチド#5は、ヒトShoca-2タンパク質配列の181位〜192位の12アミノ酸残基である。この配列は、ヒトShoca-1ともマウスShoca-1もしくは-2とも同一ではない。このペプチドを担体タンパク質に結合させ、ウサギに注射した。
抗体調製物の証明
抗体調製物の特異性を証明するために、種々の細胞とタンパク質物質についてウェスタンブロット解析を行った。特にブロットを抗体調製物Bで分析した。種々のマウスShoca-1構築体でトランスフェクトしたHEK293細胞、すなわち 1. 対照プラスミドを用いたHEK293；2. 非標識マウスShoca-1でトランスフェクトしたHEK293；マウスShoca-1 C末端HA-標識でトランスフェクトしたHEK293；および4. トランスフェクトしていないHEK293。
抗体調製物の特異性を証明するために、種々の細胞とタンパク質物質についてウェスタンブロット解析を行った。特にブロットを抗体調製物Bで分析した。種々のマウスShoca-1構築体でトランスフェクトしたHEK293細胞、すなわち 1. 対照プラスミドを用いたHEK293；2. 非標識マウスShoca-1でトランスフェクトしたHEK293；マウスShoca-1 C末端HA-標識でトランスフェクトしたHEK293；および4. トランスフェクトしていないHEK293。
抗体調製物B：非標識およびHA標識Shoca-1に対応する単一のバンドが、マウスShoca-1でトランスフェクトしたHEK293細胞で見られた（データは示していない）。
抗体調製物C：ヒト腫瘍細胞株NCI-H520の核画分に正しい分子量で単一バンドが見られる。マウスTEC細胞を染色してもバンドは検出されなかったため、この調製物はヒト特異的であることが証明された。
抗体調製物D：抗体調製物Dによりブロットを使用して、マウスTEC細胞中のShoca-1の核検出を行った。マウス胸腺上皮細胞の細胞質画分と核画分を使用した：1. TEC1-2、細胞質；2. TEC1-2核（データは示していない）。組換え発現したマウスShoca-1 SH2ドメインの染色。それぞれ抗ペンタHis抗体と抗体調製物Dによるブロットを行った。マウスShoca-1 SH2ドメイン（His標識物を14.5kDa）の細菌発現を同定し、上清中で誘導の5時間後により高いレベルが検出された：1. 誘導3時間後に採取した上清；2. 誘導5時間後に採取した上清；3. 誘導5時間後に採取したペレット（データは示していない）。他のSH2ドメインタンパク質の特異性は試験されている。GSTが融合したGrb2-SH2は抗体調製物Dで染色せず、対照抗GSTは良いバンドを示した。
以下のプロトコールに従ってウェスタンブロット解析を行った。総溶解物について、細胞を溶解バッファー（75mM トリスpH8.0；100mM NaCl、1％ NP-40、0.1mM AEBSFおよびプロテアーゼインヒビターミックス）に溶解し、遠心分離して破片を除去した。上清を採取し、同じタンパク質量を、還元条件下で10％ビス／トリスゲルでSDS-PAGEに付したセミドライブロッティング（バッファー：25mMトリス、0.2M グリシン、20％エタノール）により、タンパク質をPVDF膜に移した。膜をTBST中の5％ミルク粉末でブロックした後、親和性精製した抗Shoca抗体（100〜200ng/ml）でインキュベートした。TBSTで3回洗浄後、膜を1:2000希釈のHRP結合抗ウサギIg抗体（Amersham/Pharmacia）とインキュベートした。最後に、膜を洗浄し、ECL-プラス（Amersham/Pharmacia）化学発光により発色させた。サイトゾル対核溶解物について、細胞を氷上で溶解バッファーA（10mM ヘペス、10mM KCl、0.1mM EDTA、1mM EGTA、1mM DTT、プロテアーゼインヒビターミックス）で15分間膨潤させた。次にNP-40を最終濃度0.6％になるように加え、次に直ちに10秒間ボルテックス混合し、30秒間遠心分離した。上清をサイトゾル抽出物と見なした。ペレットをバッファーAで1回洗浄し、バッファーB（20mM ヘペス、0.4mM NaCl、１mM EDTA、1mM EGTA、1mM DTT、プロテアーゼインヒビターミックス）に再懸濁し、4℃で30分間ボルテックス混合した。5分間遠心分離後、上清を核抽出物として回収した。
Shoca-1とShoca-2発現プロフィール
すでに胸腺原基の最初の検出でマウスの胸腺上皮細胞にShoca-1が発現され、ヌードマウスの胸腺にも存在する。すなわち、Shoca-1発現は、胸腺リンパ球新生、特に胸腺細胞と胸腺上皮細胞の間の構造クロストークに依存しない。Shoca-1発現も、骨髄と、特に造血を支持することが知られている間質細胞中とに検出されている。脳、腎臓、および肺は、PCRで分析するとShoca-1発現が低い他の部位を構成するが（図6）、ノーザンブロッティングは特異的トランスフェクトを検出するのに感受性は不充分であった。これに対して、Shoca-2発現は異なる組織でより一般的に発現される（図6）。
すでに胸腺原基の最初の検出でマウスの胸腺上皮細胞にShoca-1が発現され、ヌードマウスの胸腺にも存在する。すなわち、Shoca-1発現は、胸腺リンパ球新生、特に胸腺細胞と胸腺上皮細胞の間の構造クロストークに依存しない。Shoca-1発現も、骨髄と、特に造血を支持することが知られている間質細胞中とに検出されている。脳、腎臓、および肺は、PCRで分析するとShoca-1発現が低い他の部位を構成するが（図6）、ノーザンブロッティングは特異的トランスフェクトを検出するのに感受性は不充分であった。これに対して、Shoca-2発現は異なる組織でより一般的に発現される（図6）。
機能性試験は、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路におけるShoca-1の上位性を証明する
Shoca-1の機能性in vitro分析は、胸腺上皮細胞におけるその発現が、レポーター遺伝子のβ-カテニン-LEF/TCFに制御された活性化の転写活性化を抑制することを明らかにした。機能性SH2ドメイン中の点突然変異は抑制機能を排除するため、この抑制は、機能性SH2ドメインに依存する（図7）。SH2ドメイン中のArg350（マウスShoca-1の）をリジン残基に変化させた。このアルギニンはpTyrポケットに位置し、SH2ドメイン機能に決定的に重要である（Sawyer, 1998, Biopolymers 47:243-261）。これは、SH2ドメインに対するpTyr含有リガンドのpTyr側鎖のリン酸塩酸素と重要な接触を形成する。Shoca-1のR/K変異体の過剰発現はさらに、細胞増殖の低下に関連している。Shoca-1特異的抗体を使用する電気的移動度シフトアッセイは、Shoca-1がLEF/TCFと複合体を形成することを明らかにした。
Shoca-1の機能性in vitro分析は、胸腺上皮細胞におけるその発現が、レポーター遺伝子のβ-カテニン-LEF/TCFに制御された活性化の転写活性化を抑制することを明らかにした。機能性SH2ドメイン中の点突然変異は抑制機能を排除するため、この抑制は、機能性SH2ドメインに依存する（図7）。SH2ドメイン中のArg350（マウスShoca-1の）をリジン残基に変化させた。このアルギニンはpTyrポケットに位置し、SH2ドメイン機能に決定的に重要である（Sawyer, 1998, Biopolymers 47:243-261）。これは、SH2ドメインに対するpTyr含有リガンドのpTyr側鎖のリン酸塩酸素と重要な接触を形成する。Shoca-1のR/K変異体の過剰発現はさらに、細胞増殖の低下に関連している。Shoca-1特異的抗体を使用する電気的移動度シフトアッセイは、Shoca-1がLEF/TCFと複合体を形成することを明らかにした。
TCF結合配列をコードするDNA配列が核抽出物からのShoca-1を捕捉できた独立の実験で、この知見はさらに確認された。これらの実験において、TCF結合部位を含有するビオチン化dsDNAアダプターを、マウスTEC1-2細胞からの核抽出物とインキュベートした。アダプター（および従って、TCF結合部位と複合体形成したタンパク質）を、常磁性ストレプトアビジンビーズを使用して捕捉した。ビーズを洗浄し、タンパク質サンプルバッファーを混合し、PAGEゲルにのせ、ニトロセルロース膜にブロットした。次に、1次抗体としてポリクローナルウサギ抗Shoca抗体を使用して、ウェスタン解析を行った。
LEF/TCFのみでなくβ-カテニンも含有する転写的に活性な複合体との相互作用は、Shocaが核中でβ-カテニンと同時局在化することを示す共焦点顕微鏡によりさらに確認される。さらに、Li刺激後のShoca-1について、リン酸化の上昇が観察される。これは、マウスTEC1-2細胞を20mMリチウムを含有する培地と異なる時点でインキュベートし、ポリクローナルウサギ抗Shoca抗体を使用してShoca-1を免疫沈降させ、PAGEゲルでタンパク質を分離し、ウェスタン解析でホスホチロシン特異的抗体とプローブ結合させた。
まとめるとこれらはデータは、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路におけるShocaタンパク質の非常に中心的なかつ上位の位置にいることを支持する。TEC中の観察結果と比較して、繊維芽細胞中のShoca-1過剰発現は、レポーター遺伝子のLEF/TCF依存性転写を刺激し、こうして、Shoca-1と機能的および／または物理的に相互作用するさらなる組織特異的分子であることを主張する。すなわち、Shoca-1は、2次分子との可能な組合せで組織特異的リプレッサー機能に影響を与えるかも知れない。
発癌におけるShocaの組織制限発現と役割
成体組織中のWntシグナル伝達の主要な役割は、細胞増殖の制御である。APCまたはβ-カテニンの構成的変異により、過増殖と発癌が起きる。異なるヒト臓器からの正常および悪性組織を含有するスクリーニングアレイからの結果は、主に上皮細胞起源の多くの腫瘍がShoca-1を発現することを明らかにした（表1）。
成体組織中のWntシグナル伝達の主要な役割は、細胞増殖の制御である。APCまたはβ-カテニンの構成的変異により、過増殖と発癌が起きる。異なるヒト臓器からの正常および悪性組織を含有するスクリーニングアレイからの結果は、主に上皮細胞起源の多くの腫瘍がShoca-1を発現することを明らかにした（表1）。
組織マイクロアレイのセット（各7スライド）をShoca発現について分析した。このセットは、129の異なる腫瘍分類からの約3000の腫瘍を含有した。まず試験スライドで免疫染色を最適化した。下記の条件が最適であるとみなされた。次に、この試験に使用したすべてTMAスライドを、1つの実験で免疫染色した。陰性対照反応のみを、後で行った（試薬が供給された時）。以下のプロトコールに従って免疫染色を行った：
抗体：Shoca-1特異的B型
スライド前処理：プロナーゼ、15分、37℃
ペルオキシダーゼブロッキング：0.3％ H2O2／メタノール、30分
抗体希釈率：1:32,000
インキュベーション：一晩（4℃）
検出系：ABC；DAB
陽性対照：胸腺上皮細胞
陰性対照：抗体を産生する動物の血清（抗体抽出物後）
上記条件を使用して、陰性対照反応は完全に陰性であり、多くの腫瘍と正常組織でShoca-1抗体について種々の強度の染色が観察された。内部的一貫性を最大にするために、すべての切片（染色切片と対照切片）は1日に一人の病理医が観察した。すべての腫瘍サンプルについて、陽性細胞の比率を推定し、染色強度を4段階スケール（0〜3+）で記録した。腫瘍を分類するために、任意の選択したシステムを使用した（表2）。
抗体：Shoca-1特異的B型
スライド前処理：プロナーゼ、15分、37℃
ペルオキシダーゼブロッキング：0.3％ H2O2／メタノール、30分
抗体希釈率：1:32,000
インキュベーション：一晩（4℃）
検出系：ABC；DAB
陽性対照：胸腺上皮細胞
陰性対照：抗体を産生する動物の血清（抗体抽出物後）
上記条件を使用して、陰性対照反応は完全に陰性であり、多くの腫瘍と正常組織でShoca-1抗体について種々の強度の染色が観察された。内部的一貫性を最大にするために、すべての切片（染色切片と対照切片）は1日に一人の病理医が観察した。すべての腫瘍サンプルについて、陽性細胞の比率を推定し、染色強度を4段階スケール（0〜3+）で記録した。腫瘍を分類するために、任意の選択したシステムを使用した（表2）。
このタンパク質は、多くの異なる型の細胞と新生物組織で発現されているようである。タンパク質はまた、選択された免疫組織化学条件で陰性であることが観察された組織中で発現される（低レベルで）ことが可能である。免疫組織化学のすべて内因性欠点にもかかわらず、組織マイクロアレイで測定された異なる染色レベルが、Shoca-1の発現レベルの少なくとも真の差を示していると予測される。これは、3+のスコアの腫瘍が一般的に2+腫瘍より高い発現レベルを有し、2+腫瘍は1+腫瘍よりＴ細胞破壊発現レベルを有し、1+腫瘍が陰性スコアの腫瘍より多くのShoca-1を発現することを意味する。
これらのデータは、顕著なタイプの癌（乳癌、結腸癌および子宮頚癌を含む）におけるShoca-1の関与を証明している。異なる組織および腫瘍の総合的分析は、広範囲の臓器からの正常組織はShoca-1が低陽性から陰性であり、これらの組織ではこの分子の発現が、より悪性の低い腫瘍型に関連していることを示した。さらに、多くの腫瘍で癌の進行はShoca-1発現の喪失に一致した（表3）。我々の知る限り、乳癌、結腸癌および子宮頚癌の腫瘍の進行ででダウンレギュレートされているかまたは失われている臨床関連予測マーカーは現在ほとんど無いため、この知見は特に興味深い。
ヒト悪性腫瘍におけるShoca遺伝子発現
悪性腫瘍におけるShoca-1とShoca-2の役割を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により、種々の悪性腫瘍と異なる段階の癌の進展を示す、50を超えるヒト癌細胞株で調べた。
悪性腫瘍におけるShoca-1とShoca-2の役割を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により、種々の悪性腫瘍と異なる段階の癌の進展を示す、50を超えるヒト癌細胞株で調べた。
出発物質は、Qiagen Rneasy Total RNA 単離キットを使用して培養細胞株から単離した総RNAである。1μgの総RNAから出発して、ランダムヘキサマー（ロシュ（Roche））を使用して、逆転写反応をプライムした（Titan One Tube RT-PCR (ロシュ（Roche））。Shoca-1とShoca-2について2ラウンドでcDNAを増幅した。両方の1次PCR反応で、完全長アンプリコンを作成し、この一部を2次PCR反応で増幅した。使用したプライマーは以下の通りである：
PCR生成物を0.8％アガロースゲルの電気泳動で一晩分離し、0.5μg/ml臭化エチジウムで染色後UV光で観察した。以下の表はその知見の詳細である。結果はPos（ここでは、正しい分子量のバンドが検出された）とNeg（ここではPCR産物は検出されなかった）として示す。
Shoca-1の知見は、これがヒト癌細胞株ではまれにしか発現されず、1つのみ（NCI H520）が明らかに陽性であることを示す。Shoca-2は、Shoca-1よりはるかに広範にヒト腫瘍で発現されていた。試験した54のうち7つの細胞株は明らかに陰性であった。これらは、PAN02、KLE、U251MG、NCIH128、N417、U105MGおよびColo320であった。これらの腫瘍は6つの異なる型の腫瘍を含み、神経膠腫のみ2回あった。別の神経膠腫（U87）はShoca-2が陽性であった。
【配列表】
Claims (38)
- 以下を含む単離されたShocaポリペプチド：
(i) 配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列；または
(ii) wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができるその変異体；または
(iii) wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができる(i)または(ii)の断片。 - 変異体(ii)は配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも85％の同一性を有する、請求項１記載のポリペプチド。
- 機能性SH2ドメインを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
- コイルド−コイルドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 核局在化配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 以下を含む、wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができるShocaポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
(i) 配列番号1または配列番号3の核酸配列、および／またはこれに相補的な配列；
(ii) (i)に定義した配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
(iii) (i)または(ii)に定義した配列に対して、遺伝コードの結果として縮重である配列；または
(iv) (i)、(ii)、または(iii)に定義した配列と少なくとも85％の同一性を有する配列。 - cDNAまたはmRNAである請求項６または７に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項６〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項９記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドに特異的な抗体。
- 配列番号１９、２０または２１に記載のアミノ酸配列に特異的な請求項１１記載の抗体。
- 以下を含む、wntシグナル伝達経路をモジュレートすることができる物質を同定する方法：
(i) 配列番号2または4のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその変異体、またはそのいずれかの断片（この変異体または断片は、wntシグナル伝達経路のポリペプチドと相互作用することができる）、または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および試験物質を提供する；
(ii) ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと試験物質とを接触させる；および
(iii) 試験物質が、該ポリペプチドの発現または該ポリペプチドの機能または性質に影響を与えるかどうかを測定し、こうして試験物質がShoca活性をモジュレートすることができるかどうかを決定する。 - 物質はShoca活性を阻害することができる、請求項１３記載の方法。
- 物質はShoca活性を模倣または増強することができる、請求項１３記載の方法。
- 工程(iii)は、該試験物質と該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドとの物理的相互作用をモニターすることを含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
- 該ポリヌクレオチドはmRNAである、請求項１６記載の方法。
- 工程(iii)は、細胞増殖、分化、成長または生存をモニターすることを含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
- 工程(iii)は、Shocaの細胞内局在化をモニターすることを含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
- 工程(ii)は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに試験物質を接触させることを含み、工程(iii)は、該ポリペプチドの発現をモニターすることを含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
- 該ポリヌクレオチドはDNAである、請求項２０記載の方法。
- 請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、工程(i)は、Shocaと相互作用することができるwntシグナル伝達経路の分子を提供することをさらに含み、工程(ii)は、ポリペプチドとwntシグナル伝達分子の相互作用に適した条件下で、ポリペプチド、試験物質およびwntシグナル伝達分子とを接触させることを含み、工程(iii)は、ポリペプチドとwntシグナル伝達分子との相互作用をモニターすることを含む、上記方法。
- wntシグナル伝達分子は核分子である、請求項２２記載の方法。
- 核分子は、β-カテニン、Ｔ細胞因子（TCF）、白血球増強因子（LEF）、またはβ-カテニンとＴ細胞因子および／またはLEFの組合せである、請求項２３記載の方法。
- 請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、工程(i)は、レポーター遺伝子はLEFおよび／またはTCFの転写制御下にある、レポーター構築体を提供することをさらに含み、工程(ii)は、レポーター遺伝子の発現に適した条件下で、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、試験物質およびレポーター構築体とを接触させることを含み、工程(iii)は、レポーター遺伝子の発現をモニターすることを含む、上記方法。
- Shoca活性の組織特異的モジュレーターを同定する方法であって、該試験物質は該組織の細胞からの細胞成分であり、該方法は該組織からの細胞で行われる方法である、請求項１３〜２５のいずれか１項に記載の方法を含む方法。
- ヒトまたは動物の体に行われる治療法またはヒトまたは動物の体に行われる診断法で使用される、請求項１３〜２６のいずれか１項に記載の方法により同定されるShoca活性をモジュレートすることができる物質。
- 癌の診断または治療に使用される診断物質または薬剤の製造における、請求項１３〜２６のいずれか１項に記載の方法により同定される物質の使用。
- 癌は、結腸癌、乳癌および子宮頚癌である、請求項２８記載の使用。
- 方法は、被験体からの組織サンプル中のShoca発現レベルを測定することを含む、癌の診断法。
- 方法は、被験体からの組織サンプル中のShoca発現レベルを測定することを含む、腫瘍の進行を予測する方法。
- Shocaタンパク質またはmRNAの量が測定される、請求項３０または３１に記載の方法。
- 組織サンプルは、結腸、乳房または子宮頸部から選択される組織からの生検サンプルである、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
- サンプルに、Shocaタンパク質またはmRNAと相互作用する物質とを接触させ、該物質のタンパク質またはmRNAとの結合をモニターすることを含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
- 物質は抗体である、請求項３４記載の方法。
- 物質は、請求項１３〜２６のいずれか１項に記載の方法により同定可能である、請求項３４記載の方法。
- 請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の方法を使用して個体は癌を有すると診断されている、個体中の癌を治療するための薬剤の製造における、抗癌剤の使用。
- 以下を含む、癌の治療法：
(i) Shoca活性をモジュレートすることができる物質を同定する；そして
(ii) 必要なヒトまたは動物被験体に該物質の治療的有効量を投与する。
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