JP2005511207A - 椎間板治療の方法、デバイス、及び調製物 - Google Patents

Abstract

哺乳動物の椎間板（３０）を治療するための療法的な方法。架橋結合コラーゲン（３９）の調製物を圧力下に椎間板内スペースへ注射する。この処置により、注射される椎間板の椎間距離が直ちに増加する。治療される脊柱の少なくともいくつかの力学特性が保存されるか又は一部回復される。本方法を使用して、患者の背痛を緩和し、患者の身長を高め、脊柱を安定化させることができる。本治療法は、髄核（３４）の少なくとも一部の再生、及び／又は軟骨性若しくは線維軟骨性の組織又は濃密な線維組織の発生をもたらし得る。

Description

発明の詳細な説明

発明の分野
本発明は、椎間板病理を治療するための方法、デバイス、及び調製物（preparation）に概して関し、そしてより特定すると、コラーゲン、及び架橋結合コラーゲンを含む調製物及びインプラントと、哺乳動物の椎間板へのその導入のための方法及びデバイスに関する。

背景技術
椎間板は、隣接する椎骨の堅い本体の間に存在する、半弾性の円板である。椎間板は、脊柱の長さの約１／４を形成する。

椎間板は、辺縁部分の線維輪（annulus fibrosus）と中央部分の髄核（nucleus pulposus）という、２つの主要な解剖帯より構成される。線維輪は、ゼラチン様の髄核の周りを包む、層状の線維組織より構成される。椎間板表面に接する椎骨の部分は、終板と呼ばれる。椎間板の髄核には血管が分布していないので、終板を通した栄養分の拡散に依存する。

線維輪は線維組織の層より構成され、ここではコラーゲン線維が層板（ラメラ）としても知られる同心円の層若しくはシートで配置されている。この輪の外側若しくは辺縁の層には、Ｉ型コラーゲンが含まれる。比較すると、髄核の隣にある線維輪の内側の層は遷移帯と呼ばれ、線維軟骨性の材料が含まれる。線維輪の層板中のコラーゲン束は、隣接する椎骨本体の間を斜めに通り、その傾きは、交互のシートで逆転する。コラーゲン線維が様々な角度をとることによって、この円板にかかり得るあらゆる角度の力へ順応する。髄核には軟骨細胞として知られる軟骨の細胞とムコタンパク質及びプロテオグリカンのような他の生化学物質を含有する高度に水和したゼラチン様の塊に埋め込まれた、格子状の枠組みのコラーゲンが含まれる。髄核は、ＩＩ型コラーゲンを含有する。

機能的には、椎間板は、２つの重要な、やや相反する役割を実行する。それらは、脊柱の安定性を維持する一方で、この柱に必要な柔軟性を提供する。椎間板がなければ、ヒトの脊椎は曲がることができず、その機能は著しく損なわれる。

脊柱の外には無数の神経が椎骨間の開口部分を介して、並びに、脊髄を直下して通過する。故に、椎間板は、小孔スペースを開いたままにして十分な脊柱安定性を提供するように、椎骨本体を離しておかねばならない。椎間板はまた、ショック吸収剤としても機能する。椎間板の物理特性により、脊柱に対する負荷が突然増加したときに、ショック吸収剤として役立つことが可能になる。髄核の半流体性により、この円板が形状を変えることが可能になり、脊柱の屈曲及び伸展のときのように、１つの椎骨が別の椎骨上を前方又は後方に揺れ動くことが可能になる。圧迫力に対する椎間板の抵抗性はたいしたものである。

それでも、椎間板は、特に脊柱が繰り返し曲げられるか、又はこの円板が変性の変化を受けている場合に、突然のショック、外傷、又は緊張を受けやすく、円板高さのゆるみや椎間板ヘルニアをもたらす場合がある。残念ながら、椎間板の弾性は加齢に伴って徐々に失われる。高齢者では、この円板が薄くなり、より弾性でなくなっている。希薄化と弾性損失の原因となる変化は、髄核だけでなく、線維輪でも起こる。加齢に伴って、線維輪のコラーゲン線維が変性し、この輪は、粗くて硝子化した線維と層板の亀裂形成を示し、髄核を閉じ込める輪の能力は低下する。並行して、髄核の水分含量は加齢に伴って減少し、水性ゲルが線維軟骨に徐々に置き換わる場合もある。これらの老化に関連した変化により、様々な形態の椎間板病理がもたらされる可能性がある。

椎間板ヘルニア（herniated discs）では、髄核を含んでなる軟質ゲル様の材料の一部又は全部が弱体化又は破裂した線維輪の部分により無理強いされるので、生じる神経根又は脊髄の圧迫により背痛や神経根刺激（神経根障害）を特にもたらす場合がある。

椎間板疾患（ＩＶＤ）又は椎間板ヘルニア（円板断裂）において最も一般的に影響を受ける円板は、脊柱の可動部分が相対的に不動な部分に結合している脊椎の領域、即ち、頚胸関節と腰仙関節にあるものである。

病んだ椎間板それ自身の疼痛発生体としての役割は、１９９０年代まで広く認知されておらず、多くの外科医は、神経根圧迫成分を外科治療により対処すべき主因として強調している。それでも、疼痛発生体としての椎間板は、徐々により広く受け入れられていて（Spine 20: 665-669, 1995, Spine 20: 1878-1883, 1995）、多くの人々がヘルニア形成や神経根圧迫があってもなくても椎間板を除去することを奨励している（Orthopaedics 14: 447-451, 1951, Spine 17: 831-833, 1992）。椎間板の疾患若しくは病理の主要な形態には、特に、環状薄板断裂、椎間板ヘルニア、後縦靭帯断裂、線維輪（円板材料の突出）、及び椎間板の変性が含まれる。

用語「椎間板の変性（degeneration of the intervertebral disc）」には、消耗関連状態を特徴とする不可避の進行が含意される場合がある。しかしながら、ヒト組織に関する現代の研究は、必ずしもそうではないことを示した。変性として記載される、顕微鏡的解剖学の破壊は、能動プロセスであり、これはおそらくは局所的に産生されるサイトカインにより調節されている。椎間板の変性においては、プロテオグリカン及びコラーゲンの比率及び種類の変化、軟骨細胞の数の低下、透過性の「スリット様」スペースの髄骨内形成を含む、髄骨の破壊が存在する。しばしば、線維輪中のコラーゲン線維アレイの破壊、椎間板終板への外傷的な傷害、そして血管及び神経の髄骨への内方成長も存在する。結合組織の生物学に関する我々の最近の理解からすると、これらのイベントには局所細胞の機能における改変が不可欠であるように思われる（Tony J. Freemont, Christine LeMaitre, Alex Watkins and Judith A. Hoyland「正常及び変性椎間板（ＩＶＤ）の組織切片（Histological sections of normal and degenerate intervertebral discs (IVDs)）」Expert Reviews in Molecular Medicine, 29 March 2001）。

コラーゲン様組織の組成は、個体の加齢とともに自然に変化する。（Erdal Coskun, Tuncer Suzer, Gulgun Oktay, Zeynep Tokgoz, Mehmet H. Koseoglu「腰椎間板突出症とフリー断片におけるコラーゲン含量（Collagen contents in lumbar intervertebral disc protrusions and free fragments）」Journal of Neurological Science (Turkish) ISSN 1302-1664, 17:3, 2000）。

ＩＶＤ変性の特徴となる軟骨細胞数の低下は、アポトーシスに帰されている（Gruber, H. E. and Hanley, E. N., Jr.,「ヒト椎間板の老化及び変性の分析：外科標本の正常対照との比較（Analysis of aging and degeneration of the human intervertebral disc. Comparison of surgical specimens with normal controls）」, Spine 23, 751-757, 1998）。円板変性にいくらか類似した障害である変形性関節症を有する患者の関節軟骨において、軟骨細胞のアポトーシスは、一酸化窒素の局所産生に関連付けられた。同じプロセスがＩＶＤで起こるかどうかはわかっていない。

軟骨細胞の変性ＩＶＤにおける細胞生物学は、年齢及び性別適合対照由来の軟骨細胞と比較すると、甚大に改変している。正常な円板の軟骨細胞は、ＩＩ型コラーゲンとプロテオグリカンの発現を特徴とする（Chelberg, M. K. et al.「正常なヒト椎間板における異種細胞集団の同定（Identification of heterogeneous cell populations in normal human intervertebral disc）」, J. Anat. 186, 43-53, 1995）。変性においては、マトリックス分解酵素の活性がそうした活性の天然の阻害剤に優って全体に増加していて、それが円板マトリックスの損失をもたらしている（Kanemoto, M. et al.「マトリックスメタロプロテイナーゼ−３とメタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤のヒト椎間板における免疫組織化学的研究（Immunohistochemical study of matrix metalloproteinase-3 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 human intervertebral discs）」, Spine 21, 1-8, 1990）。

正常な成人のＩＶＤは非血管性で非神経性であるが、病んだＩＶＤへは神経と血管が成長する（Yasuma, T., Arai, K. and Yamauchi, Y.,「腰椎間板ヘルニアの組織学：突出組織中の小血管の意義（The histology of lumbar intervertebral disc herniation - the significance of small blood vessels in the extruded tissue）」, Spine 18, 1761-1765, 1993）。１つの研究対象は、変性ＩＶＤ内にある脈管由来で神経原性の分子の局所産生である。強力な血管新生因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現（Tolonen, J. et al.,「血小板由来増殖因子と血管内皮増殖因子の椎間板ヘルニア組織における発現：免疫組織化学的研究（Platelet-derived growth factor and vascular endothelial growth factor expression in disc herniation tissue: an immunohistochemical study）」, Eur Spine J., 6, 63-69, 1997）。

腰椎減圧術（lumbar spine decompression）は、ヘルニア様髄骨に適応される、一般的に実施される手技である。現行の腰椎減圧の方法は、オープン手術及び経皮外科の技術へ分類することができる。オープン外科技術には、層板除去及び融合の技術が含まれる。経皮技術には、レーザー椎間板減圧術（ＰＬＤＤ）と電気外科脊椎治療が含まれる。基本的には、外科は、椎間板そのものを修復することができない。それができることは、椎間板ヘルニアがその中へ膨張するための余地を提供すること、それにより神経に対する圧力を低下させることであり、それが疼痛を抑える場合がある。

椎間板又はその一部の外科的除去は、脊椎骨の間に不安定性が存在する症例では、追加の外科手技が必要となる場合がある。このような症例では、椎骨融合術又は体内固定術が使用される場合がある。体内固定術の利点には、機能不全円板の直接除去と円板高さの保存若しくは回復が含まれる。円板の高さを維持することは、神経孔量における有意な増加を達成するのに重要である。

脊椎融合術（spinal fusion）と呼ばれる、脊椎を安定ささせる１つのアプローチは、体内移植片若しくはインプラントを変性円板により空いたスペースへ挿入することである。例えば、後腰体内融合術（ＰＬＩＦ）においては、罹患した円板を除去すること、そしてこの２つの椎体間で骨が増殖してこの円板除去により残された隙間に架橋することを可能にするインプラントを挿入することによって、２つの隣接椎体を融合する。臀部のような、身体の他の部分から少量の骨を移植し、インプラントへ詰め込む。このことにより、骨がインプラントを通してその周囲で成長することが可能になり、椎体を融合して疼痛を軽減する。

脊椎融合術の負の側面の１つは、２つの融合した椎骨間で動きがないことである。脊柱が曲がるとき、隣の体節には余分な負荷がかかる。この結果、隣接の円板がより速く変性してしまう。

人工板も使用されてきた。人工板は、線維輪の一部を残しても残さなくても円板全体に置き換わるように設計されている。ほとんどの人工板の設計には、終板の除去と、インプラントの上面及び下面の椎体への固定が必要とされる。円板全体を置き換えることの主たる利益は、必然的に、この円板が線維輪の完全性や変性の段階に依存しなくなることである。概念的には、人工板は、円板変性のある患者においてどの進行段階でも使用することができる。しかしながら、こうしたデバイスを埋め込むことに関連する追加のコストと高いリスクのために、現実には、重篤な円板変性のある患者にしかその使用は正当化され得ない。

柔軟性のためには、材料そのものが弾性でなければならないか、又は設計が少なくとも１つの方向において（好ましくは、多数の方向において）弾性のある特徴を有さなければならない。一方で、インプラントは、脊椎へのしっかりとした固定を維持しなければならないので、金属のような硬い材料をデバイスの上面及び下面に使用しなければならない。固定は、以下の機序の１つ又は組合せによってしばしば達成される：１）脊椎へ挿入する１つ又はいくつかの楔若しくは杭により固定すること；２）織込み表面による物理的な縫込み；３）有孔表面の手段による骨内方成長の促進；又は４）プレートより伸びる側翼を介したネジの固定。もう１つの選択肢は、髄核だけを置換することである。例えば、プロテーゼ円板核（ＰＤＮ）は、髄核を２つの小さな「枕」で置き換える。

米国特許５，１０８，４３８は、ヒト骨格中に埋め込むことができて、椎間板材料の再成長のための骨組みとして作用し得るプロテーゼ椎間板を開示する。このプロテーゼ円板には、グリコサミノグリカン分子が散在し得る、乾燥、有孔の生体適合性かつ生体再吸収性線維の大量マトリックスが含まれる。

椎弓切除術は、１以上の神経根への圧力を軽減するために実施される手術である。最も一般的な椎弓切除術は、腰椎弓切除術であり、下部脊椎に対して実施される。下部脊柱の神経根への圧力は、しばしば神経根圧縮と呼ばれ、背中や肢の疼痛を引き起こす。この手術において、外科医は、典型的には、小さな正中後部切開により腰の脊柱に到達する。層板の一部を除去して圧迫された神経根を曝露する。この病理に従って、椎弓切除術は、片側か又は両側で実施する。椎間板ヘルニアの一部、円板断片、腫瘍、又は骨棘のような圧迫の源の除去により圧力を軽減する。

椎弓切開術は、より非侵襲性の手技であり、椎弓切除術の洗練されたバージョンとみなしてよい。椎弓切開術では、罹患した円板のすぐ回りにある層板のごく一部だけを除去する。椎弓切開術がより優れているという証拠が増えている。除去する骨が少なければ、それだけ残る構造がより強くて安定になると考えられている。これらの手技を実施すると、はじめは症状が軽減されるが、後続の合併症の発生率も高く、生じる脊椎の不安定性のために、しばしば元の問題よりひどくなる。椎弓切除術、並びに椎弓切開術には、椎骨間にスペース維持体を挿入することが含まれる場合がある。

米国特許６，２８３，９６８は、隣接椎骨間の椎間板内スペース内にプロテーゼを入れる背部の椎弓切除術手技アプローチを開示する。
椎弓形成術では、脊椎の背部を曝露するが、椎弓切除術や椎弓切開術でなされるように骨構造を除去するのではなく、それらを弱くして外側へ曲げることにより、管を開けてより多くの余地を脊髄に提供する。問題となるのは、この新たな位置で層板をいかに安定化させるかということである。

層板安定化にはいくつかの技術が使用されている。層板を安定化させる１つのやり方は、腸骨より骨移植片を四角い骨板の形態で取り、それを適所に埋め込んで層板をその新たな、より開いた形状で支えようとすることである。このことは概ね有効であるが、しっかりとした配置ではないために、滑りを生じ、脊椎管の反復狭窄をもたらす場合がある。それはまた、腸骨の領域に別個の創傷をつくり、骨移植片を取ることを伴う。別の技術は、外科用インプラントデバイスを使用する。

経皮的レーザー椎間板減圧術（ＰＬＤＤ）においては、局所麻酔用のノボカインとＸ線ガイダンスを使用して、椎間板ヘルニアへ４５℃の角度で細い針を挿入する。次いで、この針へ光ファイバーを挿入し、このファーバーを通してレーザービームを送り、髄核のごく一部を蒸発させる。これにより部分真空が生まれ、神経根よりヘルニア部分を引き出し、それにより疼痛を軽減する。この針を布置する領域には、脊柱にとって危険である、既存の神経又は血管のような生きた構造は存在しない。ＰＬＤＤがオープン式の腰椎間板手術と異なるのは、背筋への傷害がないこと、骨の除去がないこと、大きな皮膚切開がないことである。当初レーザーが脊椎手術に理想的とみなされたのは、レーザーが熱で組織を除去又は蒸発させ、それがまた組織中の小血管を焼灼して閉じるように作用するからである。

米国特許第５，８６５，８３３号は、腰椎間板ヘルニアのような人体の組織を、それを蒸発させるレーザー光をそれに照射することによって治療するためのレーザー療法用の装置を開示する。

残念ながら、レーザーは高価であるだけでなく、上記の手技において使用するのはやや面倒である。レーザーのもう１つの欠点は、組織除去の深さを判定することの難しさである。外科医は、一般に、組織に触れることなくレーザーを狙って照射するので、彼又は彼女が、どのくらい深くレーザーが切断しているのかを判定する触知可能なフィードバックを受け取ることはない。脊椎板のごく近傍内には健常な組織、骨、靭帯、及び脊髄神経がしばしば存在するので、最少の深さの組織傷害を維持することが不可欠であるが、それは必ずしもレーザーで保証し得ない。

電気外科的脊椎手術はＰＬＤＤに代わるものであり、エネルギーによる髄核除去をやはり目的にする。米国特許第６，２８３，９６１号は、十分に高い周波数の電気エネルギーを１以上の好適な電極より椎間板組織へ適用してこの円板の量を低下させることによって、脊髄神経上の圧力を軽減する、患者の脊椎内での椎間板ヘルニア療法を開示する。高周波エネルギーは、線維輪内の髄核の一部を除去するのに十分であり得る。電極端末を線維輪の中へ進め、十分な高周波電圧をかけて、髄核内のコラーゲン線維を収縮又は縮小させる。これにより髄核は縮小し、脊髄神経上の衝撃からのがれるようになる。

髄核除去の補足手技は、インプラント又は注射可能材料を使用して椎間板スペースを再生することである。現在使用されている注射可能スペーサーは、同種移植片をベースとしている。

米国特許第６，２８３，９６６号は、隣接椎骨間の椎間板スペース内に脊椎インプラントを位置づけるための装置及び方法を開示する。
米国特許第６，２５８，１２５号は、椎間同種移植片スペーサーを使用して椎間スペースを回復する方法を開示する。

米国特許第６，２４０，９２６号は、生物活性ガラス若しくはポリマーフォームのような生物分解性の合成材料と単離椎間板細胞より構成されるハイブリッド材料を使用して椎間スペースを回復する方法を開示する。

変性変化によるか又は脊椎減圧の外科手技により引き起こされる髄核の欠乏は、椎間板の内部又は周囲で続発性の悪化を生じる場合がある。
髄核は、チャンバ内に位置し、その壁は線維輪と椎骨板よりつくられる。髄骨が作られる材料は、そのチャンバ内の炎症と血管及び神経の増殖を阻害する。髄核材料の欠乏は、その阻害からの解放を高め、それが炎症と血管及び神経の増殖をもたらす場合がある。この反応は、空のチャンバの壁のマクロな運動によってさらに亢進される場合がある。

さらに、髄核の容量の縮小による力学的な安定性の不足は、線維輪の大きな運動と、ひいては線維輪中での裂け目又は亀裂の発生をもたらす場合がある。椎間スペースの狭窄は、脊椎間関節の非解剖学的な負荷を生み出し、ひいてはこれらの関節において骨関節炎の変化をもたらす場合がある。

発明の要約
故に、本発明の態様によれば、変性円板疾患を有する哺乳動物を治療する方法が提供され、本方法には、還元糖と架橋結合したコラーゲンを含む、ある容量の注射可能な流体を該哺乳動物の少なくとも１つの椎間板へ注射することが含まれる。

さらに、本発明の態様によれば、変性円板疾患を有する哺乳動物を治療する方法が提供される。本方法には、椎間板内で選択される圧力レベルに達するために、還元糖と架橋結合したコラーゲンを含む、ある容量の注射可能な流体を該哺乳動物の少なくとも１つの椎間板へ圧注射することが含まれる。

さらに、本発明の態様によれば、架橋結合コラーゲンを含有する流体を哺乳動物の椎間板へ治療的に注射する方法が提供される。本方法には、椎間板内圧を選択される圧力レベルへ高めるのに十分な注射圧を使用して、この円板の内部スペースへ該流体を注射することが含まれる。

さらに、本発明の態様によれば、in vivo で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物が提供される。この調製物には、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含有する注射可能な流体が含まれる場合がある。

さらに、本発明の態様によれば、少なくとも１つの椎間板に水力学的な円板不全症を有する患者の身長を高める方法が提供される。本方法には、椎間板へ付く２つの椎骨間の距離を増やすために、還元糖と架橋結合したコラーゲンを含む、ある容量の注射可能な流体を該患者の少なくとも１つの椎間板へ注射することが含まれる。

さらに、本発明の態様によれば、少なくとも１つの椎間板に水力学的円板不全症を有する患者の身長を高める方法が提供される。本方法には、注射される椎間板内で選択される板内圧力レベルに達するために、還元糖と架橋結合したコラーゲンを含む、ある容量の注射可能な流体を少なくとも１つの椎間板へ圧注射することが含まれる。

さらに、本発明の態様によれば、変性円板疾患より生じる背痛を患者において軽減する方法が提供される。本方法には、椎間板へ付く２つの椎骨間の距離を増やすために、生体適合性で生物耐久性の材料を含む、ある容量の注射可能な調製物を患者の少なくとも１つの椎間板へ注射することが含まれる。

さらに、本発明の態様によれば、少なくとも１つの変性円板の少なくとも１つの力学特性を患者において少なくとも一部回復するか又は保存する方法が提供される。本方法には、少なくとも１つの椎間板へ付く２つの椎骨間の距離を増やすために、生体適合性で生物耐久性の材料を含む、ある容量の注射可能な調製物を患者の少なくとも１つの椎間板へ注射することが含まれる。

さらに、本発明の態様によれば、変性円板疾患を有する哺乳動物を治療する方法が提供される。本方法には、椎間板内で選択される圧力レベルに達するために、コラーゲンを含む、ある容量の注射可能な調製物を該哺乳動物の少なくとも１つの椎間板へ圧注射することが含まれる。

さらに、本発明の態様によれば、髄核の少なくとも一部の再生、又は軟骨性組織又は線維軟骨性組織又は密線維組織の発生を変性した哺乳動物の椎間板において誘導する方法が提供される。本方法には、還元糖と架橋結合したコラーゲンを含む注射可能な調製物を椎間板へ注射することが含まれる。

発明の詳細な説明
本発明を、付帯の図面を参照にして、実施例のみにより記載するが、ここで類似の成分は、類似の参照番号によって明示する。

本発明は、髄核欠乏症を有する椎間板、又は他の種類の椎間板障害又は変性症を、長時間作用する生体適合性の架橋結合コラーゲンや、生体適合性であり、そして好ましくは生物耐久性でもある別の好適な注射可能材料を椎間板へ導入することによって治療する方法を開示する。好ましくは、注射される材料又は充填物は、水分保持能力を有する。架橋結合コラーゲンは、欠乏した髄核により占有された椎間板スペースへ導入することができる。架橋結合コラーゲンや他の注射可能な充填材料は、椎間板と隣接する椎骨を力学的に安定化させることができる。

さらに、導入した架橋結合コラーゲンは、軟骨様若しくは線維様の組織内に埋め込まれた原線維の架橋結合コラーゲン粒子を含み得る線維軟骨様の組織をその室内に形成することを誘導するか又は促進することができて、これが治療された椎間板の生体力学特性の長期安定化に貢献して椎間板の悪化プロセスを予防する場合がある。

架橋結合コラーゲン調製物は、空洞化した髄核スペースか又は変性椎間板の板内スペースへ（髄核の除去を伴わずに）導入することができる。この方法は、注射可能架橋結合コラーゲン調製物を使用して、疼痛のあるインタクトな線維輪の円板に適用してもよい。あるいは、又はさらに、本方法は、加圧乾燥架橋結合コラーゲン調製物を利用することによって、傷害されたか又は破裂した線維輪を有する椎間板ヘルニアに対して実施してよい。

さらに、本発明の注射法は、当該技術分野で知られているレーザー療法を使用して線維輪における亀裂又は割れ目を封鎖することや他の種類の加熱療法を限定せずに含む、他の既知の治療法と一緒に、又はそれと組み合わせて使用してよい。

本方法の非ヘルニア様変性椎間板に対する実施
本発明の１つの好ましい態様に従って、架橋結合コラーゲン調製物を非ヘルニア様変性椎間板へ注射する。変性した椎間板は、中空針によるか、又は線維輪への傷害を最小化するのに十分に小さい直径を有する別の好適な中空注射デバイス若しくはメンバーによって穿通することができる。髄核内の材料を洗い出し、生体適合性架橋結合コラーゲンを含んでなる注射可能調製物を洗浄したか又は部分洗浄したスペースへ注射する。注射するコラーゲンベース調製物の量は、椎間板の形状、椎間板サイズ、椎骨間のスペーシング、並びに、処置する椎間板と脊柱の他の生体力学特性及び機能を少なくとも一部回復させるのに十分であるべきである。

注射する材料は、スペースを維持するものとして、そして疼痛を低下させるものとして作用することができる。本方法は、疼痛性の椎間板にそれだけで実施することができるが、それはまた、椎間板吸引法や椎間板内電子波加温法への補助方法として適用してもよい。線維輪を横断するひびや亀裂があると、注射可能な液体懸濁物であり得る注射材料の漏れや流出が起こり得るので、線維輪の外側部分はインタクトでなければならない。

このように、本発明の椎間板修復法は、髄核の中身の一部若しくは全部の洗い出しか又は他の好適な方法による除去と、それに続き、追加の材料又は細胞を含むか又は含まない架橋結合コラーゲンを含んでなる注射可能調製物をそれまで髄核が占めていた領域へ導入することを含む場合がある。

フィージビリティ前臨床試験を実施した。２種類の変性モデルを確立した。第一の変性モデルは、髄核の穿刺洗浄を使用し、第二の変性モデルは、当該技術分野で知られているような輪穿刺を介した髄核除去を伴った。これらのモデルを以下の実験１及び３にそれぞれ詳しく記載する。

実験１
５０〜６０キログラムの重さがあるブタ（Sus domesticus）を麻酔した。フルオテン（fluoten）と気管内チューブを使用して、獣医により全身麻酔を確立する。胸椎への腹側アプローチ（特に、右後方胸膜アプローチ）を使用した。第６及び第７肋骨の間で無菌的に切開する。この肋骨を拡げて離し、肺をそのラッピングごと動かして、胸椎への直接アプローチを得る。腹側アプローチが完了したとき、開創器を適用して呼吸量を減少させる。開口部を通ってＴ６〜Ｔ９椎骨領域中へ２２ゲージ針（２２Ｇ）を導入し、椎間板（椎骨Ｔ６、Ｔ７、又はＴ８の円板より選択する）の線維輪を通って椎間板の髄核中へ挿入した。

この挿入は、椎間板の右側で実施した。高圧インジェクターを２２Ｇ針へつなげた。別の１８ゲージ針（１８Ｇ）を、正面の椎間板穿通部位を使用して、この円板の線維輪を通って同じ円板の髄核へ挿入した。１８Ｇ針は、髄核の中身を洗い出すための排液口として役立った。１０〜２０ミリリットルの無菌生理食塩水を、１８Ｇドレナージ針から出る生理食塩水が澄明であると目視観察されて髄核のほとんどの材料が除去されたことを示すまで、約１０気圧の圧力で２２Ｇ針を通して注射した。０．５〜２．０ミリリットル量の注射可能リボース架橋結合ブタコラーゲン調製物を加圧下に２２Ｇ針より注射すると、最後には非希釈コラーゲンが排液に使用する１８Ｇ針より外に出ることが目視観察された。

初期量のコラーゲンの注射が完了した後で、１８Ｇドレナージ針を線維輪より引き抜き、もう１回量のほぼ０．１〜０．２ミリリットルの注射可能架橋結合コラーゲンを２２Ｇ針より注射すると、このコラーゲンが１８Ｇ針の除去により生じた小穴より外に漏出する。次いで、２２Ｇ針を椎間板より引き抜き、この注射した椎間板を将来同定するために、処置した椎骨の隣に非吸収性のナイロン縫合を施した。以下に詳しく開示するように、同定と椎間スペーシング測定のために、好適な海綿質のネジもこの椎骨へ挿入した。

それぞれのブタにおいて、コラーゲン注射は、３つの椎骨のうち２つだけに実施する。第三の椎骨の髄核は、上記に開示するように、１０〜２０ミリリットルの無菌生理食塩水の注射により洗い出したが、コラーゲン注射は実施しなかった。この第三の椎骨を対照として使用した。

胸郭開口部を縫合し、空気を胸部から抜き、ブタを覚醒させた。
実験１の結果
肉眼検査
犠牲時に、注射した（実験）椎間板について、この円板からのリボース架橋結合コラーゲンの溢出と、腹水生成、炎症のような肉眼でわかる病理学的変化と線維輪の完全性を検査した。

組織学的検査
それぞれのブタより４つの椎間板を除去した：２つは実験の椎間板で、１つはシャム処置の椎間板（動物への手術時に置いた縫合又はネジにより同定した）、そして１つがこの３つの処置した椎間板の上又は下にある未処置（触れなかった）椎間板（基準対照）（即ち、Ｔ５〜Ｔ６又はＴ９〜Ｔ１０）である。この標本は、椎間板と隣接終板を包含するように脊椎を横断切開することによって切り取った。この標本を緩衝化ホルマリンに固定し、ギ酸中で脱塩した。組織切片を冠状面に沿って調製し、プロテオグリカンを可視化するために、当該技術分野で知られているヘマトキシリン及びエオジン染料（Ｈ＆Ｅ）、又は当該技術分野で知られているアルシアンブルー染料（ｐＨ＝１．０）で染色した。

以下の評点（ａ〜ｃ）を組織応答に関して組織学的レベルで決定して記録した：
ａ．炎症応答。
ｂ．リボース架橋結合コラーゲンが椎間板組織内に統合されている。

ｃ．リボース架橋結合コラーゲンが生物耐久性である。
以下の表１は、組織学的検査実験に使用した動物の詳細を収載する。

この試験には全部で９頭のブタ（ブタＶ１〜Ｖ９と標示）が参画した。手術後１、３、及び５ヶ月目に犠牲にした、５頭のうちの４頭（ブタＶ１、Ｖ４、Ｖ５、及びＶ７）より組織学的評価を入手した。追加のブタ（ブタＶ８）は、手術後１２ヶ月で犠牲にするために留保した（この動物については組織学の結果がまだ入手されていない）。残る４頭のブタ（ブタＶ２、Ｖ３、Ｖ６、及びＶ９）は、リボース架橋結合コラーゲンの投与には関連しない感染症や手術時の死亡のために却下した。

組織学の結果を以下の表２に要約する（また、図面の図１Ａ〜１Ｇに提示する）。

以下、実験１において入手したブタ椎間板より採取した組織学的切片を表す顕微鏡写真である、図１Ａ〜１Ｇを参照する。これには、対照の椎間板、シャム手術した椎間板、並びに、本発明の方法の態様に従ってリボース架橋結合コラーゲンを注射した椎間板が含まれる。

図１Ａは、未処置（非手術）椎間板（ブタＶ４より入手）からのＨ＆Ｅ染色組織断面（ｘ４０拡大図）を例示する。骨（１）、軟骨（２）、及び髄核（３）の領域が可視化されている。

図１Ｂは、術後１ヶ月目に採取した対照シャム手術した椎間板（ブタＶ１より入手）からのＨ＆Ｅ染色組織断面を例示する。この顕微鏡写真は、残滓をいくらか含有する未充填腔（４）の形成を明らかにする。

図１Ｃは、リボース架橋結合コラーゲンで注射して、術後１ヶ月目に採取した椎間板（ブタＶ５より入手）より撮影した２つの異なるＨ＆Ｅ染色組織断面の顕微鏡写真（上の顕微鏡写真はｘ４０拡大図で、下の顕微鏡写真はｘ２００拡大図）を例示する。この顕微鏡写真は、注射したリボース架橋結合コラーゲン（５）がヒアリン細胞組織により囲まれていることを明らかにする。リボース架橋結合コラーゲン（５）と髄核（３）のヒアリンマトリックスの間の緊密な接触を見ることができる。

図１Ｄは、リボース架橋結合コラーゲンで注射して、術後１ヶ月目に採取した椎間板からのアルシアンブルー染色組織断面（ｘ２００拡大図）を例示する。髄核（３）のネーティブ組織と注射したリボース架橋結合コラーゲン（５）との境界（６）は好塩基的に染色され、注射したリボース架橋結合コラーゲン（５）上へのプロテオグリカンの吸収又は in vivo 沈着の証拠となった。

術後１ヶ月目に採取したどの動物の標本でも、炎症反応はなく（炎症細胞の浸透なし）、顆粒形成組織も、血管の増殖も見られなかった。
図１Ｅは、術後３ヶ月目に採取した対照シャム手術椎間板（ブタＶ４より入手）からのＨ＆Ｅ染色組織断面（ｘ４０拡大図）を例示する。１ヶ月で観察された空のスペース又は腔は、この術後３ヶ月の断面において同定し得ず、この腔には、髄核（３）の高い細胞性ヒアリン組織が詰まっていた。

図１Ｆは、リボース架橋結合コラーゲンで注射して、術後３ヶ月目に採取した椎間板（ブタＶ４より入手）より撮影したＨ＆Ｅ染色組織断面の顕微鏡写真（ｘ４０拡大図）を例示する。髄核（３）の隣接ヒアリン組織とリボース架橋結合コラーゲン（５）の親密な相互作用が観察される。術後３ヶ月目に採取したどの標本でも、炎症反応はなく（炎症細胞の浸透なし）、顆粒形成組織も、血管の増殖も見られなかった。

図１Ｇは、リボース架橋結合コラーゲンで注射して、術後６ヶ月目に採取した椎間板（ブタＶ１より入手）より撮影したＨ＆Ｅ染色組織断面の顕微鏡写真（ｘ４０拡大図）を例示する。図１Ｆに例示される断面と同様に、髄核（３）の隣接ヒアリン組織とリボース架橋結合コラーゲン（５）の親密な相互作用が観察される。炎症反応は観察されなかった。この６ヶ月の実験期間の間、細胞はリボース架橋結合コラーゲン（５）に浸潤しなかった。顆粒形成組織も血管の増殖も見られなかった。定量的な測定は実施しなかったが、この期間の間に、リボース架橋結合コラーゲンの分解の兆候は観察されなかった。

実験１の組織学の結果をまとめると、椎間板注射後６ヶ月までのすべての時点で、椎間板組織とリボース架橋結合コラーゲンとの間で優れた組織応答を観察した。炎症細胞の非存在と血管の増殖の欠落により見ることができるように、炎症反応は起こらなかった。注射後１、３、及び６ヶ月目に採取した椎間板を表す組織断面は、リボース架橋結合コラーゲン（５）と髄核（３）の残存ヒアリン組織との、異物反応に特徴的な分離膜若しくは被膜の形成を伴わない、親密な相互作用を明示する。この隣接親和性は、髄核をリボース架橋結合コラーゲンで（たとえ一部でも）置換することが実現可能であるという考えを支持する。注射したリボース架橋結合コラーゲンの内部ではプロテオグリカンが同定された。プロテオグリカンの in vivo 吸収又は沈着は、リボース架橋結合コラーゲンの粘弾特性へ貢献するかもしれない。このフィージビリティ試験は、リボース架橋結合コラーゲンが脊椎髄核の優れた置換材料として作用するのに十分な生物物理特性を有することを示す。

実験２
本実験は、ブタ及びウシのリボース架橋結合不完全ペプチド（atelopeptide）コラーゲンによる軟骨形成の誘導を試験した。注射可能な架橋結合ウシコラーゲンと注射可能な架橋結合ブタコラーゲンを、ウサギ耳軟骨において軟骨形成を誘導する能力について試験した。

注射可能な架橋結合ウシコラーゲンと注射可能な架橋結合ブタコラーゲン（注射部位につき１００マイクロリットル）を、３０ゲージ（３０Ｇ）針を使用して、２０匹のニュージーランドウサギの耳へ皮内注射した。針は、耳の軟骨に穿刺した。注射後１ヶ月目に注射部位から生検を得て、組織学的検査用に処理した。

ブタ及びウシの注射可能架橋結合コラーゲンの両方について、すべての注射部位を、注射後１ヶ月、６ヶ月、及び１年目に物理的に同定することができた。注射可能な架橋結合ウシコラーゲンに対する組織応答は、注射可能な架橋結合ブタコラーゲンに対するそれと比べて違いを観察しなかった。注射したコラーゲンベースの材料の近くとその中には、線維軟骨組織が成長しているのが観察された。架橋結合コラーゲンをウサギ耳軟骨の中へか又はその隣りへ注射したとき、注射したコラーゲンマトリックスに軟骨芽細胞が密集し、架橋結合コラーゲン粒子の間に軟骨構造を形成するのが観察された。全般的な組織学的外観は、コラーゲン粒子で補強された軟骨からなる複合組織のものであった。これらの粒子の中には、軟骨芽細胞や線維芽細胞が密集しているものもあった。

上記に開示するようにウサギ耳軟骨の表面部分へ注射した架橋結合コラーゲンの粒子間での軟骨組織の形成を例示する顕微鏡写真である、図２Ａ〜２Ｄを以下参照する。図２Ａ〜２Ｄに見ることができるように、軟骨芽細胞は、注射した架橋結合コラーゲン材料の間を移動した。矢印で示したいくつかの部位では、軟骨芽細胞が軟骨組織の島へ発達した。図２Ａ〜２Ｄの生検は、注射後１ヶ月目に入手した。

図２Ａ〜２Ｄに例示する結果は、軟骨及び線維軟骨形成の in vivo 誘導を促進する、注射したコラーゲン調製物の能力を明示する。故に、ヒトにおいて椎間板内注射へ適用するとき、本発明の治療方法は、髄核の少なくとも一部の再生、及び／又は椎間板内スペースにおける軟骨様若しくは線維軟骨様の組織、又は密集線維組織の発達をもたらすかもしれない。

実験３
生体力学検査
リボース架橋結合コラーゲンで処置した変性椎間板の生体力学特性を特徴づけるために本実験を設計する。上記の特性を健常な椎間板と未処置の変性椎間板の生体力学特性に比較する。架橋結合コラーゲンで処置した変性椎間板の肉眼評価と組織学的検査を実施した。

動物において変性円板疾患（ＤＤＤ）のモデルを実験的に作製する手順は、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれるいくつかの論文（Habtemariam et al., 1998; Kanerva et al., 1997）に記載された。簡潔に言えば、ブタに麻酔をかけ、左後腹膜腔アプローチを使用した。外斜筋、内斜筋、及び腹横筋の線維を分離した。腹膜を同定し、筋肉より分離し、腰筋を同定した。ブタの解剖学により後方の解剖を実施し、エントリーは、腰筋と椎骨の間で、前方解剖ではなく、ヒトのように腰筋の前で行なった。腰筋を横突起より分離し、開創器を挿入して、腰椎柱を曝露した。

外側Ｘ線造影法（lateral X-ray imaging）を使用して、椎骨Ｌ１〜Ｌ４を同定した。Ｘ線造影は、可動性Ｃ Ａｒｍ，画像増強レントゲン機械（フィリップス、モデルＶ−３００）を使用して実施した。分節の血管を分離して穏やかに動かした後で、海綿質のＡ．Ｏ．ネジ（１２ミリメートルの長さ、４．０ミリメートルの外ネジ径）を（それぞれの椎体へ１つのネジを）挿入した。金属カリパスを使用して、ネジ間の距離を測定した。

１１号の外科用ブレードで、終板へ平行なＬ２−Ｌ３及びＬ３−Ｌ４椎間板の前外側線維輪へほぼ１．５ｃｍの穿刺切開を施し、髄核へ穿通した。髄核の一部を除去した。創傷部分を層状に閉じて、ブタを覚醒させた。

実験群：この群には、６頭のブタ（以下の表３のブタＶ１０、Ｖ１１、Ｖ１２、Ｖ１５、Ｖ１６、及びＶ１７）が含まれた。０の時点（初回手術から４ヵ月後）で、ブタを再び麻酔して、手術した変性椎間板に１．５±０．２ミリリットルの注射可能ブタリボース架橋結合コラーゲン調製物を（１ミリリットルのＰＢＳにつき３５ミリグラムの架橋結合コラーゲンの濃度で）注射した。この注射は、１０気圧までの気圧を生じることが可能な圧注射システムを使用して、２２Ｇ脊椎針により実施した。この圧注射システムについては以下に詳しく記載する（図３を参照のこと）。この注射は、上記に開示するような画像増強可動式レントゲン機械を使用して経皮的に行なった。針は、動物が右側を上にして寝ている間に、腰筋を通って脊椎の横突起に対して前方の隣へ、そして椎間板の中心に対して椎間板の横側へ挿入した。

対照群：この群には、ＤＤＤを定着するように手術した５頭のブタ（以下の表３のブタＶ１３、Ｖ１４、Ｖ１８、Ｖ１９、及びＶ２０）が含まれた。この群の動物には０の時点で架橋結合コラーゲンを注射せず、対照として役立てた。

脊椎管及び硬膜外注射群：５頭のブタ（以下の表３のブタＲ１０、Ｒ１１、Ｕ３、Ｕ４、及びＵ５）を試験して、リボース架橋結合コラーゲンの脊椎管への偶然漏出への反応を明らかにした。ブタＲ１０においては、後方オープンアプローチの下で、１．０ミリリットルのリボース架橋結合コラーゲンを、ブタのほぼＬ２−Ｌ３及びＬ３−Ｌ４レベルで、脊椎管の硬膜内（脊椎）スペースへ注射した。残る４頭のブタでは、ほぼ１．０ミリリットルのリボース架橋結合コラーゲンの硬膜外注射を実施した。これを行なったのは、線維輪の後壁における欠陥がこの材料の脊椎管への溢出をもたらす状況を模倣するためである。跛行や失禁のような神経学的徴候の発生について動物をモニターした。注射から６ヶ月目に動物を犠牲にし、注射の領域を組織学的に検査する。

本発明の態様に従って、リボース架橋結合コラーゲンの椎間板内注射に使用し、注射力と注射器アウトレット及び椎間板内スペースにおける圧力をモニタリングするために使用するシステムを例示する部分断面概略図である図３を以下参照にする。

このシステム（２０）には、架橋結合コラーゲンを注射するための注射デバイス（２２）、力を測定するためのフォースモニターユニット（２４）及びフォーストランスデューサー（２４Ａ）、及び２つの圧検出（pressure sensing）ユニット（２６）及び（２８）が含まれる。

椎間板（３０）を横断面図において概略的に例示して、線維輪（３２）と髄核（３４）を示す。注射針（３８）と圧検出針（４０）を、線維輪を通って、その開いた針の先端が椎間板（３０）の板内スペース中の髄核（３４）（又はＤＤＤモデル動物における変性髄核）内に配置されるように挿入した後のその位置で示す。

注射デバイス（２２）には、支持フレーム（２３）が含まれる。支持フレーム（２３）は、オートクレーブ可能な外科用スチールからできていて、ステンレススチールの背板（２５）へ付く。背板（２５）にはネジ穴があり、押込みネジ（２７）がこのネジ穴内に可動的に配置される。支持フレーム（２３）には金属スリーブ（３１）も付く。

標準の５ミリリットルプラスチックシリンジ（３３）をスリーブ（３１）の内側に入れることができる。ゴムピストン（３７）へ付いたステンレススチールのロッド（３５）をこのシリンジへ挿入することができて、シリンジ（３３）内に入れたリボース架橋結合コラーゲン調製物（３９）を押すためのプランジャーとして機能する。高圧Ｔ分岐（４１）をシリンジ（３３）の（Ｌｕｅｒ型）ロックへつなげる。Ｔ分岐（４１）の１つのアームは、強化高圧可撓管（４２）を通って、シリンジ（３３）の出口で圧力を測定するための圧検出ユニット（２６）へつなげる。Ｔ分岐（４１）の第二アームは、強化高圧可撓管（４３）を通って、標準ステンレススチール注射針へ接続する。本実験では、２２ゲージ（２２Ｇ）針を使用した。しかしながら、他の型及びゲージの針も使用してよいこと、そして注射針（３８）の内径及び外径は、使用する注射可能架橋結合コラーゲン調製物の粘度及び濃度に、注射針（３８）を椎間板（３０）へ挿入する方法に、そして他の実地上の考慮事項に特に依存して変更してよいことが注目される。

本発明の実験において、圧検出針（４０）は、標準ステンレススチールＬｕｅｒロック型の１８ゲージ（１８Ｇ）針であった。この圧検出針（４０）を、強化高圧可撓管（４３）を通って、リボース架橋結合コラーゲン調製物（３９）の注射の前、間、そして後で板内圧力（椎間板内部の圧力）を測定するための圧検出ユニット（２８）へ接続した。

本実験で使用した圧検出ユニット（２６）及び（２８）は、ガイダント・アドバンスト・カージオバスキュラー・システムズ（Guidant Advanced Cardiovascular systems）社、カリフォルニア州、アメリカより市販されている、ＩＮＤＥＦＬＡＴＯＲ ＰＬＵＳ ２０^ＴＭモデル、アナログ圧ゲージを含むインフレーション・デバイスであった。これらのデバイスは、２０気圧までの測定範囲を有する。他の好適な種類の圧検出デバイスも使用してよい。

本実験では、フォーストランスデューサー（２４Ａ）を、ロッド（３５）に作用する力を測定するために、押込みネジ（２７）とロッド（３５）の端の間に取り付けた。フォースモニターユニット（２４）とフォーストランスデューサー（２４Ａ）は、モデルＦＧ−１００ｋｇフォースゲージとしてＬＵＴＲＯＮ・エレクトロニック・エンタープライズ株式会社（台北、台湾）より市販されているフォースゲージユニットのパーツであった。このフォースゲージは、５０グラムの力の公称感度限界で１００キログラムの力までの範囲を有した。

本実験では、シリンジ（３３）に、１ミリリットルのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）につき３５ミリグラムの濃度でリボース架橋結合ブタコラーゲンを含有するリボース架橋結合コラーゲン調製物をロードした。押込みネジ（２７）を押込んで、ロッド（３６）の端に圧力を及ぼし、Ｔ分岐（４１）、管（４２）、及び注射針（３８）をこの注射可能コラーゲン調製物で満たした。注射針（３８）の挿入に先立って、ＰＢＳを使用することによって、Ｔ分岐（４１）、管（４２）、及び針（３８）より空気を追い出し、圧検出ユニット（２６）による圧力測定を可能にし、空気の椎間板スペースへの注射を回避した。

本明細書に詳しく開示するように、針（３８）及び（４０）を椎間板（３０）へ挿入した後で、ゴムピストン（３７）の先端位置を記録し、押込みネジ（２７）を使用して、ロッド（３５）の端に増加する力を及ぼした。圧検出ユニット（２６）によりモニターされるシリンジ出口で相対的に安定したほぼ６〜１１気圧の圧力レベルが発生するまで、このネジを進めた。シリンジ（３３）の出口での圧力と椎間板（３０）内部のスペースでの圧力を、架橋結合コラーゲン調製物の注射の前、間、そして後で、圧検出ユニット（２６）及び（２８）でそれぞれ可視的にモニターして、マニュアルで記録した。ロッド（３５）の端での力は、フォースモニターユニット（２４）のディスプレイより可視的に読み取り、マニュアルで記録した。

注射が完了した後で（圧力が６〜１１気圧レベルで安定してからほぼ１〜２分）、ゴムピストン（３７）の先端位置を再び記録して、椎間板（３０）へ注射した架橋結合コラーゲンの量を決定した。

好ましくは、現実に可能なほど高い濃度の架橋結合コラーゲンを有するリボース架橋結合コラーゲン調製物を椎間板内スペースへ療法的に注射して椎間板スペースの回復と力学特性を可能な限り正常値へ高めること、そして長く続く治療効果を確実にすること（注射した架橋コラーゲン材料の内因性コラゲナーゼによる in vivo のゆっくりとした生物分解の故に）が望ましい場合がある。

しかしながら、実際には、注射し得るコラーゲンの量は、過剰に高い圧力レベルを使用することなく、そして注射針（３８）をコラーゲン粒子により詰まらせることなく、使用する針を通って注射することができるリボース架橋結合コラーゲンの最高濃度によって制限される場合がある。さらに、線維輪における穿刺のサイズを最小化するために、針（３８）のゲージは減らしたいと考えるが、針の直径を小さくすること（針ゲージを大きくすること）は、架橋結合コラーゲンを針に流して通す能力によって、そして針の力学特性によって、特に制限される場合がある。例えば、ごく細い針の使用は、針を折ったり曲げたりせずに、細い針を制御可能的に組織へ貫通させて、線維輪を通して針を挿入する能力によって、実際には制限される場合がある。

様々な予備テストにおいて、注射システム（２０）は、１０気圧を超えないシリンジ（３３）の出口での圧力レベルを使用することによって、２２Ｇ−３１Ｇの範囲のゲージを有する針により、針を詰まらせることなく、１ミリリットルにつき５５ミリグラムまでの架橋結合コラーゲンの濃度を有するリボース架橋結合コラーゲン調製物をブタの椎間板内スペースへ注射するために成功裡に使用し得ると判明したことが注目される。

このように、ブタ及びヒトの椎間板の構造、サイズ、及び力学特性の間の知られた類似性に基づけば、本発明のリボース架橋結合コラーゲンを５５ミリグラム／ミリリットルまでの濃度範囲で哺乳動物（ブタ、イヌ、及びヒトの椎間板を限定せずに含む）の椎間板の板内スペースへ注射することができる。しかしながら、特に、注射針（３８）のサイズを変更すること、注射可能調製物のレオロジー特性を変化させることによって、又は本発明の方法及び調製物の他の改良物を使用することによって、３５ミリグラム／ミリリットルより低いか又は５５ミリグラム／ミリリットルより高い濃度でリボース架橋結合コラーゲンを哺乳動物の椎間板内スペースへ療法的に注射することが可能であることが注目される。

椎間板内圧（椎間板の椎間スペース内の圧力）の好ましい圧力範囲は、ほぼ０．５〜１０気圧の範囲内にあり得て、最も好ましい気圧範囲は、（注射の間に圧検出ユニット（２８）で測定されるように）ほぼ６〜８気圧であり得る。

好ましくは、椎間板内圧は、椎間板破裂の可能性を回避するために、１０気圧を超えてはならない。
ブタ及びヒトの椎間板では、椎間板内スペースへ安全に注射することができるリボース架橋結合コラーゲン調製物の容量は、ほぼ０．５〜２．０ミリリットルの範囲にあり得る。注射可能量は、動物又は患者の年齢及び体重、注射する椎間板のサイズと注射する椎間板の脊柱内の位置に、そして存在する椎間板変性の度合いに特に依存して、変動する場合がある。しかしながら、例えば、線維輪の力学変数における病理学的変化のような他の要因も、注射可能量に影響を及ぼす場合がある。

肉眼評価（Macro Assessments）
椎間板と脊椎間関節を関節炎や他の局所反応の徴候について肉眼視診することを実施する。椎間板の椎間スペースの量を測定するために、鋭い先細チップと制御孔のついたオートクレーブ可能な金属カリパスを使用した。脊椎へ挿入した海綿質のネジ間の距離をＤＤＤのイニシエーション時と動物を犠牲にした時点で測定した。手術のとき、線維輪を切断する前と後で測定値を取る。犠牲の時点で、我々は、最初の手術と同じように動物をその右側を下にして寝かせながら、同じ後方外側アプローチによりブタを手術し、この位置で測定値を取る。

カリパス（caliper）の先端をネジのヘッド中にある穴に入れ、先端がネジのヘッド中の穴の内壁を軽くつかむまで、カリパスを穏やかに閉じた。次いで、カリパスを動かし、数回再挿入し、再調整すると、カリパス金属アームの弾性効果により測定値間に変化がないことが明らかになった。次いで、カリパスの先端を穏やかに紙へ押し付けることによって１枚の紙に印をつけた。口径メーターを使用して、この印間の距離を０．０１ミリメートルの精度で測定した。

初回手術の間に得た測定結果を犠牲時に得た測定結果に比較することによって、椎間距離の変化量を評価する。触れていないＬ１−Ｌ２椎間板の測定値は、対照として、そして動物の成長による椎骨及び椎間板の寸法の変化を推定するための方法として役立てた。

組織学的検査
実験１で上記に記載のように、組織学的検査を実施した。
生体力学検査
特別設計付属品を接続した、Ｉｎｓｔｒｏｎ ４５０２ 自動材料検査システム（Automated Material Testing System）（Ｉｎｓｔｒｏｎ社、マサチューセッツ州、アメリカより市販されている）を使用して、屈曲、伸展、及び捻転における脊柱の硬直性を測定した。椎間板の機能性及び運動を生体力学的に測定するための基礎構造を確立した。これらの測定値を使用して、変性円板疾患を動物モデルにおいて治療するときの注射可能架橋結合コラーゲンの効力を評価した。

犠牲の後で、脊椎Ｌ１〜Ｌ５を含むインタクトな脊柱分節を犠牲にしたブタより回収した。採取した分節には、付着した筋肉及び皮膚のない、すべての椎骨の部分、関節、椎間板、及び靭帯が含まれた。この脊柱分節を−２０℃で急速冷凍した。試験の前に、脊柱分節を解凍し（Gleizes et al., 1998 は、新鮮な脊柱と凍結融解した脊柱の間の生体力学的な結果において違いがないことを明示した）、この脊柱分節をその末端で堅いプラスチックセメントにより以下に詳しく開示する試験デバイスへ接続することによって検査用に準備した。

測定システム
脊柱の分節に対する荷重モード（屈曲及び捻転）の効果を測定するために、２つの別々のシステムを設計した。両システムをＩｎｓｔｒｏｎ ４５０２マシーンへ接続した。Ｉｎｓｔｒｏｎ ４５０２ 自動材料検査システムは、Ｉｎｓｔｒｏｎ社（マサチューセッツ州、アメリカ）より市販されている荷重計の付いた動力計である。荷重と運動のデータを同調させ、パーソナル・コンピュータ（ＰＣ）へ連続フィードする。

対照動物と、本発明の方法の態様に従ってリボース架橋結合コラーゲンを注射した椎間板を有する動物に由来するブタ脊柱分節に対する曲げ、屈曲、及び捻転の実験を含む生体力学測定を実施するときに使用する改良ＩＮＳＴＲＯＮ自動材料検査システムの２つの配置を例示する写真である、図４Ａ〜４Ｄを以下参照する。

図４Ａ及び４Ｂは、脊柱の曲げ試験に使用するＩＮＳＴＲＯＮマシーンの配置におけるブタ脊柱分節の位置を例示する。図４Ｂは、図４Ａの一部を詳しく例示する。
この曲げモデルシステムは、文献（Chiba M. et al., 1996; Marmelstein LE. et al.,1998）に記載された、これまでの曲げ測定システムに基づく。このシステムを、図４Ａ〜４Ｄに見ることができるように、ＩＮＳＴＲＯＮマシーンベースへ機械的に接続する。２つの１４５ミリメートルのロングアーム（５３）及び（５４）を、それぞれ回転ヒンジによりＩＮＳＴＲＯＮマシーンへ接続する。

上方アーム（５３）には、第一パート（５３Ａ）と第二パート（５３Ｂ）が含まれる。第二パート（５３Ｂ）は、線状ボールベアリング（５２）へしっかりと固定されて付く。線状ボールベアリング（５２）は、ＩＮＳＴＲＯＮマシーンブリッジ（６０）へ付いた荷重計（５０）へ連結する。アーム（５３）の第一パート（５３Ａ）は軸（５６）によって第二パート（５３Ｂ）へ可動的に連結し、それは、パート（５３Ａ）と固定パート（５３Ｂ）の間の角度が変化し得るように、第一パート（５３Ａ）が（脊柱分節（５５）の長軸を含む面において）垂直方向だけに上下に動くことを可能にするようにヒンジとして機能する。

下方アーム（５４）は、ＩＮＳＴＲＯＮマシーンのシャシーへしっかりと付く。このように、アーム（５３）及び（５４）は、脊柱分節（５５）の長軸の中心から離れて力を及ぼすことができる（図４Ａを参照のこと）。アーム（５３）の第一パート（５３Ａ）は、水平面に対してある角度で回転して、脊柱分節（５５）が曲がることを可能にすることができる。

脊柱分節（spinal column segment）（５５）の終椎（end vertebrae）を、３つのネジ（示さず）と以下に詳しく開示する硬ポリエチレン鋳型材料を使用して、プラスチックカップ（５７）及び（５９）へ固定する。このプラスチックカップ（５７）及び（５９）のそれぞれへ直径１０ミリメートルのネジ（示さず）を固定して、脊柱分節（５５）を機械負荷システムへ取り付けた。試験する脊柱分節（５５）の両端で椎骨をポリエチレン鋳型内に埋め込み、それにより、カップ（５７）及び（５９）の中心領域へ固定する一方で、ネジ（示さず）は、椎骨の動きの軸（脊柱分節（５５）の椎間板のほぼ中央にある）にあるように位置づける。

脊柱分節（５５）を、カップ（５７）及び（５９）の１０ミリメートルネジによりアーム（５３）及び（５４）に対して９０°の角度で固定し、ＩＮＳＴＲＯＮブリッジ（６０）に対して中心外に位置付ける。ＩＮＳＴＲＯＮブリッジ（６０）が下降するとき、アーム（５３）及び（５４）は、一方が他方に向かって動いてモーメントを生じ、これが脊柱分節（５５）の脊柱を１つの方向に、ブリッジ（６０）の方へ曲げる。

ＩＮＳＴＲＯＮブリッジ（６０）が上昇するとき、アーム（５３）及び（５４）は、一方が他方から離れて動いてモーメントを生じ、これが脊柱分節（５５）の脊柱を別の方向に、ブリッジ（６０）から離れて曲げる。

２つの曲がり方向（屈曲及び伸展）を得ることができる。荷重計（５０）により作動力を直接測定する。
脊柱分節（５５）における動きの測定は、伸び計（ｅｘｔｅｎｓｉｏｍｅｔｅｒ）（６２）（Ｉｎｓｔｒｏｎ社、マサチューセッツ州、アメリカより型式番号２６２０−６０１として市販されている）を使用して実施する。伸び計（６２）のアームを運動方向において試験する椎骨（Ｌ２及びＬ４）へ付ける。伸び計（６２）の上方アームを椎骨Ｌ２へ付け、伸び計（６２）の下方アームを椎骨Ｌ４へ付ける。得られたデータを処理して、作動力対伸展の測定値を表す応力−ひずみ曲線を作成する（以下の図６Ａ〜６Ｃの例示グラフを参照のこと）。

図４Ｃ及び４Ｄは、脊柱の捻転試験に使用する改良ＩＮＳＴＲＯＮマシーンの配置におけるブタ脊柱分節の位置を例示する。図４Ｄは、図４Ｃの一部を詳しく例示する。
捻転モデルは、脊柱分節（５５）を固定して付けた回転可能軸（６７）へ接続したアーム（６５）に基づく。２つのネジ（示さず）により脊柱分節の端をポリエチレンセメント鋳型へ固定し、以下に詳しく開示するように、プラスチックカップ（５７）及び（５９）内に配列する。カップ（５９）は、チャックをその端に有する固定式回転不能ホルダー（７０）へ固定して付けてよく、また、カップ（５７）は、回転可能軸（６７）の端でチャックへ接続してよい。可動アーム（６５）は、軸（６７）へしっかりと付く。ＩＮＳＴＲＯＮマシーンは、荷重計（５０）を介してアーム（６５）の一端へ連結することによって、アーム（６５）の動きを制御する。このマシーンに力をかけると、回転可能軸（６７）の上とそれへ付いた脊柱分節（５５）の上で捻りモーメントを生じる。このモーメントは、荷重計（５０）により直接測定されるような作動力にアーム長さを掛けることによって計算することができる。度数で示される回転運動は、ＩＮＳＴＲＯＮブリッジ（６０）の運動とアーム（６５）の長さより計算する。次いで、モーメントと回転運動のデータに基づいて、応力−ひずみ曲線を計算することができる。

本試験における作動力は、検査する脊柱分節を傷害しない範囲にある（Chiba M, al., 1996; Marmelstein LE, 1998; Dick JC, 1997）。
力学検査プロトコール
調製法：腰脊柱を室温で１５時間融かした。靭帯、被膜、及び椎間板を傷害せずに、筋肉を除去した。３つのネジと硬ポリエチレン鋳型（Ｓｙｎａｉｒ社、アメリカよりＰｏｒ−Ａ−Ｋａｓｔ Ｍａｒｋ ２として市販されている）を使用して、終椎をプラスチックカップ中へ固定した。各プラスチックカップへ直径１０ミリメートルのネジを固定し、脊柱を機械負荷システムへ取り付けた。試験する脊柱の両側で椎骨をカップの中心領域へ固定し、一方、ネジは、椎間板の中心にある、脊椎の動きの軸にあるように位置づける。

捻り検査：準備した脊柱を、上記に開示されて図４Ｃ及び４Ｄに例示されるようにＩＮＳＴＲＯＮマシーンへ接続した。アーム（６５）は、チャックをその端に有する回転可能軸（６７）へしっかりと接続する。チャックは、プラスチックカップ（５７）へ付いた１０ミリメートルのネジへ接続してよい。このようにして、軸（６７）を腰脊髄分節（５５）の長軸の周りで回転させることができる。アーム（６５）の一端は、荷重計（５０）を介してＩＮＳＴＲＯＮブリッジ（６０）へ接続する。アーム（６５）が荷重計（５０）へ付く点とアーム（６５）が軸（６７）へ付く点の間のアーム（６５）の部分の長さは、２５０ミリメートルである。アーム（６５）の他方の（反対の）端に、それへ付ける適切な分銅（図４Ｃに示さず）により２０ニュートンの荷重を負荷する（この分銅は、軸（６７）がアーム（６５）へ付く点より２５０ミリメートルの距離でアーム（６５）の他端へ付く）。

各試験のはじめに、ブリッジ（６０）を水平配向にあるアーム（６５）の位置へ動かす。腰脊柱分節（５５）を、軸（６７）のチャックと固定式回転不能ホルダー（７０）のチャックの間に位置づけ、カップ（５７）及び（５９）へ付けた直径１０ミリメートルのネジを、それぞれ軸（６７）の端にあるチャックとホルダー（７０）の内部できつくロックする。ロッキングの時点でのブリッジ（６０）の位置を（任意に）ゼロと設定する。

荷重計（５０）へつなげたアーム（６５）の部分に４０ニュートンまでの負荷をかけて、ブリッジ（６０）を１８０ミリメートル／分の速度で動かすように、ＩＮＳＴＲＯＮマシーンをプログラムした（図４Ｃ）。アーム（６５）の他の反対部分は、それへ付いた分銅によりそれに作用する一定の２０ニュートンの負荷を有する。故に、このモーメントは、５ニュートンｘメートルであった。４０ニュートンの最大負荷レベルが発生したならば（荷重計（５０）により検出されるように）、ＩＮＳＴＲＯＮマシーンは、ブリッジ（６０）の運動の方向を逆転し、モーメントは、同じブリッジ運動速度（１８０ミリメートル／分）で放出されて０．１２５ニュートンｘメートルのモーメントに達し、この時点でブリッジ（６０）の運動の方向は再び逆転する。

各試験について５回の連続サイクルを実施し、データを同調的に入手してＰＣによりプールし、その結果を応力−ひずみグラフに提示した。
折り曲げ（屈曲及び伸展）検査：準備した脊柱分節（例えば、図４Ａの脊柱分節（５５）のような）をＩＮＳＴＲＯＮマシーンへ接続し、脊柱分節（５５）の矢状面がアーム（５３）及び（５４）の運動面にあるようにする（図４Ｂに例示される配置を参照のこと）。このようにして、脊柱の屈曲−伸展運動に対応する脊柱分節（５５）の折り曲げを得た。伸び計（６２）の２つのアームを運動の方向で椎骨へ固定した。３５ニュートンの負荷で試験を開始した。Ｉｎｓｔｒｏｎのブリッジ（６０）を牽引力を発生させるために１８０ミリメートル／分の速度で上昇するようにプログラムし、３５ニュートンの力を得た。次いで、ブリッジ（６０）が再び同じ速度で下降すると、３５ニュートンの圧縮負荷力に達した。５回の連続サイクルを実施し、データを同調的に入手してＰＣによりプールした。その結果を応力−ひずみ曲線として提示した。

アームの長さが１４５ミリメートルであるので、３５ニュートンの負荷力は、５ニュートンｘメートルのモーメントを生じる。しかしながら、これは純粋なモーメントではなく、曲げモーメントであるので、モーメント値ではなく力の数値を提示する。

試験した脊柱分節のそれぞれで、５ニュートンｘメートルの最大モーメントでの折り曲げ及び捻転において５サイクルの負荷及び無負荷を実施した。
実験３の結果
本試験には１６頭のブタを登録した。実験３に参画した動物の上記の３群への割り当てを以下の表３に示す。実験群及び対照群のそれぞれを２つの亜群Ａ及びＢへ細分した。亜群Ａより得た標本を組織学的検査に供し、亜群Ｂの標本を生体力学検査に供する。

Ｖ、ＲまたはＵは、ブタのグループ名を表す。
ブタＶ１０を使用して画像増強可動式レントゲン機械の下で架橋結合コラーゲンを注射することのフィージビリティを検査した。上記に開示するように、４つの変性椎間板のうち２つにリボース架橋結合コラーゲンを注射した。

本発明の方法の態様に従ったリボース架橋結合コラーゲンの椎間板内注射の前と後での椎間スペーシングを例示する、ブタＶ１０の脊柱の各部分のＸ線像である図５Ａ〜５Ｄを以下参照する。

ブタＶ１０において、図３に例示する注射システムを使用して、Ｌ２−Ｌ３レベルとＬ３−Ｌ４レベルで椎間板のそれぞれへ１．５ミリリットルのブタリボース架橋結合コラーゲン調製物を注射した。Ｌ２−Ｌ３レベル及びＬ３−Ｌ４レベルでの注射の最後にシリンジ（３８）の出口で（図３の圧検出ユニット（２６）により）測定した気圧は、ほぼ９気圧であった。

図５Ａ及び５Ｂは、リボース架橋結合コラーゲンの椎間板内スペースへの注射の前と直後での椎骨Ｌ２及びＬ３の領域におけるＸ線造影図をそれぞれ表す。椎骨Ｌ２及びＬ３の間の円板の椎間板スペースへの注射針の挿入後、但し架橋結合コラーゲンの注射前に撮った図５Ａにおいて、注射針（３８）の一部が上より椎間板内スペースへ入るのを見ることができる。ネジ（６０Ａ）及び（６０Ｂ）は、上記に詳しく開示するように、Ｌ２及びＬ３の椎骨へそれぞれ挿入した海綿質のネジである。

図５Ｂに例示するＸ線写真は、全体の注射及び造影手順の間にブタや造影機を動かさずに、３５ミリリットルのブタリボース架橋結合コラーゲンの濃度を有するリボース架橋結合コラーゲンのほぼ１．５ミリリットルをＬ２−Ｌ３椎間板スペースへ注射した直後に撮影した。同じネジ（６０Ａ）及び（６０Ｂ）を図５Ｂに見ることができる。

図５Ｃ及び５Ｄは、脊椎Ｌ３及びＬ４の領域におけるＸ線造影図をリボース架橋結合コラーゲンの椎間板内スペースへの注射の前と直後でそれぞれ表す。椎骨Ｌ３及びＬ４の間の円板の椎間板スペースへの注射針の挿入後、但し架橋結合コラーゲンの注射前に撮った図５Ｃにおいて、注射針（３８）の一部が上より椎間板内スペースに入るのを見ることができる。ネジ（６２Ａ）及び（６２Ｂ）は、上記に詳しく開示するように、Ｌ３及びＬ４の椎骨へそれぞれ挿入した海綿質のネジである。

図５Ｄに例示するＸ線写真は、全体の注射及び造影手順の間にブタや造影機を動かさずに、３５ミリリットルのブタリボース架橋結合コラーゲンの濃度を有するリボース架橋結合コラーゲンのほぼ１．５ミリリットルをＬ３−Ｌ４椎間板スペースへ注射した直後に撮影した。図５Ｄには、ネジ（６２Ａ）及び（６２Ｂ）が見える。

Ｌ２及びＬ３椎骨とＬ３及びＬ４椎骨の椎間分離（椎間スペーシング）に比例した示度を得るために、対する椎骨間の距離をＸ線フィルムで直接測定し、測定値より差異（％）を計算した。ブタＶ１０についてのＸ線フィルム測定の結果を以下の表4に（ミリメートルで）示す。

上記の表４における数値はブタ内の椎間分離の実際値を表さず、これらの値に比例することが注意される。
上記の図５Ａ〜５Ｄと表４に例示する結果は、Ｌ２−Ｌ３とＬ３−Ｌ４レベルの両方における椎間スペースがリボース架橋結合コラーゲン注射の後で実質的に増加したことを明らかに示す。

リボース架橋結合コラーゲン投与後４日目に、ブタＶ１０を犠牲にした。４つの変性椎間板とその脊椎間関節を上記に開示するように組織学的検査用に処理した。
ブタＶ１１〜Ｖ２０を２つの亜群へ群分けした。ブタＶ１１〜Ｖ１４を組織病理評価に供し、ブタＶ１５〜Ｖ２０を生体力学評価に供した。Ｖ１１〜Ｖ１４ブタ亜群の３つの椎間板とＶ１５〜Ｖ２０ブタ亜群の２つの椎間板に変性モデルを創出した。

組織病理評価と生体力学評価は、２００３年第一四半期までに完了する。
亜群Ｂの６頭のブタ（Ｖ１５〜Ｖ２０）に加えて、ほとんど同じ体重及び年齢を有する、手術をしない、２つの追加のブタの腰椎柱の分節を生体力学について検査し、変性円板モデルの第二の対照群（非手術、非注射）として使用した。

５頭のブタ（上記の表３のブタＲ１０〜Ｒ１１とＵ３〜Ｕ５）を安全性評価に使用する。硬膜内（脊椎）スペースに注射したブタＲ１０を除き、他のブタは、いずれも硬膜外注射を受けた。実験３に参画したブタは、いずれも全般に非常に良好な状態にあり、完全な神経学的機能を表示した。跛行や排尿の問題は犠牲前のどの動物にも観察されなかった。

実験３からの例示的な結果
表３のブタＶ１９及びブタＶ１６において円板変性のモデルを創出した後の１０ヶ月目に採取したインタクトなＬ１〜Ｌ５脊柱分節で力学試験を実施した。ブタＶ１６では、モデルＤＤＤの誘導後４ヶ月目に、椎間板Ｌ２〜Ｌ３と椎間板Ｌ３〜Ｌ４にリボース架橋結合ブタコラーゲンを注射した。対照１と呼称するブタ（試験するブタと同じ年齢及び体重を有する非手術ブタ）の非手術の未処置脊柱について同じ力学試験を実施した。上記に詳しく開示するように、ＩＮＳＴＲＯＮマシーンを使用して３つの脊柱を試験した。３つの採取した脊柱のそれぞれについて屈曲及び伸展と捻転での４０ニュートンＸメートルの生理学的範囲で５サイクルの負荷及び無負荷を実施した。

力学測定値の結果を以下の図６Ａ〜６Ｆと表６〜表８に要約する。
対照（対照１）と、本発明の方法の態様に従ってリボース架橋結合コラーゲンを注射した椎間板を有する実験処理ブタ（ブタＶ１６及びＶ１９）、ブタＶ１６に由来する、切開したブタ腰脊柱分節に対して実施した屈曲実験の結果の例を表す曲線を例示する例示の概略グラフである、図６Ａ〜６Ｆを以下参照にする。

図６Ａ〜６Ｃに例示のグラフは、「力対変位」のグラフである。図６Ａ〜６Ｃのグラフにおいて、縦軸はアーム（５３）に作用する力を（ニュートンで）表し、横軸は、伸び計（６２）のアームの変位を表す。

図６Ｄ〜６Ｆに例示のグラフも、「力対変位」のグラフである。図６Ｄ〜６Ｆのグラフにおいて、縦軸はブリッジ（６０）の動きによりアーム（６５）に作用する力を（ニュートンで）表し、横軸は、ブリッジ（６０）の変位を表す（ここで、ゼロの変位は、試験サイクルの開始でのブリッジ（６０）の位置を任意に示す。

図６Ａにおいて、曲線（８０）は、対照１のブタからの脊柱において実施した５サイクルの屈曲測定値についての「力対変位」のデータを表す。図６Ｂにおいて、曲線（９０）は、ブタＶ１６からの脊柱において実施した５サイクルの屈曲測定についての「力対変位」のデータを表す。図６Ｃにおいて、曲線（１００）は、ブタＶ１９からの脊柱において実施した５サイクルの屈曲測定についての「力対変位」のデータを表す。変位の数値はセンチメートルで示す。

図６Ａに注目すると、曲線（８０）には３つの部分がある。曲線（８０）の中央部分（８０Ａ）は、典型的には、ほとんど水平であるか、又は相対的に浅い傾斜を有し、これは、相対的に小さな力をかけると相対的に大きな椎骨変位をもたらす折り曲げ（屈曲又は伸展）の領域を表し、試験される脊柱分節の相対的に大きな屈曲又は伸展を表す。曲線（８０）の両側部分（８０Ｂ）及び（８０Ｃ）は、相対的に大きな傾斜を有する動きの領域を表し、この領域では、変位を引き起こすには、曲線（８０）の中央領域（８０Ａ）におけるよりも大きな力をかけることが必要になる。

典型的には、変性した椎間板において、変位曲線に対する力の（直線又はほぼ直線の）中央部分に含まれる変位の範囲は、比較可能な非変性椎間板に比べて増加する。
図６Ｄにおいて、曲線（１１０）は、対照１ブタからの脊柱において実施した５サイクルの捻転測定の「力対変位」データを表す。図６Ｅにおいて、曲線（１１２）は、ブタＶ１６からの脊柱において実施した５サイクルの捻転測定の「力対変位」データを表す。図６Ｆにおいて、曲線（１１４）は、ブタＶ１９からの脊柱において実施した５サイクルの捻転測定の「力対変位」データを表す。変位値は、上記に詳しく開示されるように、試験の開始時でのブリッジ（６０）の位置を表す任意０点からのブリッジ（６０）の変位をセンチメートルで表す。

図６Ｆに注目すると、曲線（１１０）は、上記に詳しく開示するように、試験する腰脊柱分節において捻転を引き起こすためにアーム（６５）に負荷する力に対するブリッジ（６０）の変位を表す（図６Ｄにおいて、脊柱分節は、対照１ブタからのものである）。

表６に示す捻転試験の結果の測定は、図６Ｄ、６Ｅ、及び６Ｆにそれぞれ例示する曲線（１１０）、（１１２）、及び（１１４）の部分で実施した。
曲線（１１０）、（１１２）、及び（１１４）のそれぞれについて、３回目の捻転サイクルの開始時と終了時でのブリッジ運動の逆転を表す曲線上の２点を曲線上で確定してマークした。これら２点（この点は、例示を明確にするために曲線上に示していない）についてのブリッジ（６０）の変位値を変位軸上で決定し、第三の捻転サイクルの開始に対応する点での変位の数値から、第三の捻転サイクルの終了に対応する点での変位値を差し引くことによって決定した。

表７に示す屈曲及び進展試験の結果の測定は、図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃにそれぞれ例示する曲線（８０）、（９０）、及び（１００）で実施した。
曲線（８０）、（９０）、及び（１００）のそれぞれについて、以下の手順を使用して全体の伸び計変位範囲を決定した。この手順を図６Ａの曲線（８０）の特別な例で説明する。図６Ａに注目すると、点（８５）は、図６Ａに例示するグラフの左上の象限における、５つのサイクルの各サイクルについての伸び計（６２）のアームの運動方向の逆転を表す５つの点の平均位置を表す。同様に、点（８７）は、図６Ａに例示するグラフの右下の象限における、５つのサイクルの各サイクルについての伸び計（６２）のアームの運動方向の逆転を表す５つの点の平均位置を表す。点（８５）及び（８７）の位置を目視で評価した。点（８５）及び（８７）のそれぞれの水平軸座標に対応する変位値を決定し、点（８５）についての変位値を点（８７）の変位値より差し引いて、図６Ａの曲線（８０）についての全体の伸び計変位範囲（total extensiometer displacement range）の値を得た。この値は、使用する実験の力の下での変位の全（非線形）範囲を表す。

図６Ｂの曲線（９０）と図６Ｃの曲線（１００）では、図６Ａの曲線（８０）について詳しく開示したのと同じ測定手順を使用し、全体の伸び計変位範囲の数値を表７に得る。
以下の表８において、ブタ対照１、Ｖ１６及びＶ１９、それぞれの最高及び最低の屈曲曲線の中央にあるほぼ直線部分の測定の結果を示す。変位の範囲は、センチメートルで示す。

表８に示す屈曲及び伸展試験の結果の測定は、図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃにそれぞれ例示する曲線（８０）、（９０）、及び（１００）で実施した。
曲線（８０）、（９０）、及び（１００）のそれぞれについて、以下の手順を使用して、実験曲線（８０）、（９０）、及び（１００）のほぼ直線の部分の上方及び下方の中央部分について伸び計変位範囲を決定した。この手順を図６Ａの曲線（８０）の特別な例で説明する。図６Ａに注目すると、力／変位曲線がほとんど直線である変位範囲を曲線（８０）の上方部分中の全部で５つの曲線部分（８０ＡＵ）より目視で評価した。同様に、力／変位曲線がほとんど直線である変位範囲を曲線（８０）の下方部分中の４つの曲線部分（８０ＡＬ）より目視で評価した。第一サイクル部分（８７）を無視したのは、曲線（８０）のヒステレシス挙動がまだ安定しなかった曲線（８０）の第一サイクルの一部を表すためである。

上方のほぼ直線部分群（８０ＡＵ）の群の平均終点（示さず）に対応する水平軸座標に対応する変位値を目視で決定し、上方のサイクル部分に及ぶほぼ直線の伸び計変位の範囲を、１つの終点変位値の値を残る終点の値から差し引くことによって決定した。同様に、下方のほぼ直線部分群（８０ＡＬ）の群の平均終点（示さず）に対応する水平軸座標に対応する変位値を決定し、上方のサイクル部分に及ぶほぼ直線の伸び計変位の範囲を、上記に開示するように、１つの終点変位値の値を差し引くことによって決定した。

このようにして得た値は、使用する実験の力の下での脊柱運動のほぼ直線の中央領域についての変位の範囲を表す。
図６Ｂの曲線（９０）と図６Ｃの曲線（１００）では、図６Ａの曲線（８０）について詳しく開示したのと同じ測定手順を使用し、曲線部分の上方及び下方の群について、伸び計変位範囲のほぼ直線の中央領域の変位範囲の値を上記の曲線（８０）について開示するように決定し、得た値を上記の表８に示す。

ブタＶ１６及びＶ１９の捻転結果の間には有意差がないと見ることができる。ブタＶ１６及びＶ１９の脊柱の動きの範囲は、対照ブタ（ブタ対照１）のそれより小さい。
屈曲及び伸展試験では、ブタＶ１６の脊柱の変位範囲は、対照ブタ（ブタ対照１）のそれよりやや大きく、ブタＶ１９の脊柱分節の変位範囲は、ブタ対照１及びブタＶ１６の変位範囲より大きい。曲線の直線中央部分の長さにより測定される不安定性の範囲は、ブタＶ１６において対照１ブタより大きく、ブタＶ１９においてブタＶ１６よりずっと大きい。

臨床上の視点からみると、これらの結果は、モデル変性円板の椎間板内スペースへ架橋結合コラーゲンの療法注射を受けたブタの脊柱の屈曲及び捻転の力学特性の保存を示す。
上記に示し、図６Ａ〜６Ｆに例示する屈曲及び捻転の結果は、本発明の態様に従って、リボース架橋結合コラーゲンの注射可能調製物の椎間板内注射によって哺乳動物中の変性円板の力学特性の少なくともいくらかを療法的に保存することが可能であり得ることを示す。

実験４
本実験を実施して、架橋結合コラーゲンの注射の終了時でのシリンジ（３３）（図３）の出口での圧力と椎間板（３０）の板内スペース内の圧力との関連を決定した。

実験３のブタＶ１０とほぼ同じ体重を有する３頭の未処置ブタ（ブタ１、ブタ２、及びブタ３と番号付ける）を犠牲にした。３頭全部の腰脊柱を上記に開示するように採取し、それぞれの腰椎柱分節のＬ２−Ｌ３及びＬ３−Ｌ４にある椎間板に、３５ミリグラム／ミリリットルのＰＢＳの濃度を有する１．５ミリリットルのブタリボース架橋結合コラーゲン注射可能調製物を注射した。上記に詳しく開示するような注射と圧力測定を実施するのに、システム（２０）（図３に例示する）を使用した。

シリンジ（３３）の出口での圧力は、注射の終了時に圧検出ユニット（２６）（図３）により、上記に開示するように測定した。椎間板内スペースの圧力は、注射の終了時に圧検出ユニット（２８）（図３）により上記に開示するように測定した。

この圧力測定の結果を以下の表９に要約する。

上記の表９の結果は、９〜１２気圧の範囲の出口圧力が本発明の注射システム（２０）において椎間板の破裂を引き起こさずに使用し得ることを示す。シリンジ（３３）の出口でそのような圧力をかけると、５．５〜７．５気圧の範囲内の椎間板内圧力レベルの発生をもたらした。

実験３及び実験４において実施した注射では、椎間板に注射するのに２２Ｇ針を使用したとき、シリンジ（３３）のロッド（３５）へかけた力が４５０ニュートンを超えなかったことが注目される。上記のすべての実験において、２２Ｄ針のエントリーの点から注射した椎間板の線維輪まで、注射した架橋結合コラーゲン材料の観察される漏出はなかった。さらに、（コラーゲン調製物の圧注射の最後に）椎間板から注射針を引き抜いた後でも、線維輪の穿刺領域からコラーゲン調製物の漏出は観察されず、注射針によりなされる穿刺が良好にシールされ、椎間板内に注射された材料の漏出を防ぐことを示した。

上記に開示して図版に例示した実験の結果は、架橋結合コラーゲン調製物、そして好ましくは、Ｄ（−）リボース（又は他の好適な還元糖）により架橋結合した注射可能な再構成不完全ペプチド原線維Ｉ型コラーゲンを含有する調製物を脊柱の１以上の椎間板へ板内注射することは、変性円板疾患（ＤＤＤ）症状を提示するヒト患者を治療するための療法手段として、又はＤＤＤに罹患しやすいと予測され得る患者の予防的処置としてヒト患者に使用することができることを示す。本注射法は、特に、注射される椎間板に隣接する椎骨間の距離若しくはスペーシング、脊柱の屈曲及び／又は捻転の力学特性、又は患者の注射された椎間板又は脊柱の他の力学特性を限定せずに含む、脊柱の１以上の力学特性を改善するか又は回復するために使用することができる。本明細書に開示するような療法は、特に、注射される椎間板に隣接する椎骨間の距離を増やすことによって患者の身長を高くするために使用することができる。

本発明の方法の利点は、椎間板内へ注射する容量、注射に使用する特定の圧力範囲、そして注射する材料のレオロジー特性により、椎間スペースの増加と脊椎の生体力学特性の改善若しくは回復が椎間板への注射の直後にもたらされ、（少なくとも注射の短期効果としては）プロテオグリカンの in vivo 誘導若しくは構築にも、髄核組織の成長若しくは回復にも依存しないことである。しかしながら、本明細書に開示する治療法の長期効果には、椎間板内スペースの内側、又は処置される椎間板中へ注射される注射架橋結合コラーゲン材料の内側でのプロテオグリカンの in situ 沈着若しくは産生も含まれる場合があり、そして椎間板内スペースの内側での髄核組織のより長期の成長若しくは回復による貢献も含まる場合があることが注目される。

本療法をヒト患者に適用するとき、注射する架橋結合コラーゲン調製物の容量及び濃度は、ブタにおいて使用した実験値に類似してよい。注射されるヒト椎間板内の板内圧力レベルは、好ましくは０．５〜１２気圧の範囲、より好ましくは５〜８気圧の範囲にあってよく、使用する注射容量は、０．５〜２．５ミリリットルの範囲にあってよく、そしてコラーゲン濃度は、注射可能調製物の１ミリリットルにつき５５ミリグラムまでの架橋結合コラーゲンであってよい。

しかしながら、上記の好ましい数値は、特に、患者の年齢、注射される椎間板のサイズ及びタイプ、治療される哺乳動物の種に依って、変更又は調整してよい。例えば、イヌのＤＤＤを治療するために本方法を使用するならば、特に、注射するコラーゲンの量、所望量の架橋結合コラーゲンを妥当に実践的な時間内で注射するのに必要とされる注射圧、針のゲージといった治療変数のいくらか又は全部を適切に調整する必要があり得る。

注射可能リボース架橋結合コラーゲンの調製
実験１において使用する注射可能架橋結合コラーゲンは、１ミリリットルの注射可能調製物につき３５ミリグラムのリボースにより架橋結合した再構成不完全ペプチドブタコラーゲンを含んでなる、注射可能な無菌のリボース架橋結合ブタコラーゲン調製物であった。架橋結合コラーゲンはＰＢＳに懸濁した。様々な形態のリボース架橋結合コラーゲンの調製法は、本明細書において参照によりそのまますべての目的で援用される、国際特許出願、ＰＣＴ／ＩＬ０１／００３５１（国際特許公開公報番号ＷＯ０１／７９３４２ Ａ２として公開）にも詳しく開示される。

簡潔に言えば、分子精製ペプシン処理不完全ペプチドのブタＩ型コラーゲン溶液（１〜１０ミリグラム／ミリリットル）を、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ（登録商標）、アーカンソー ＬＬＣ，アリゾナ州、アメリカより市販されているブタ（子豚）の腱より、当該技術分野で知られている（Pitaru et al. への米国特許第５，９５５，４３８号と Brodsky et al. への米国特許第４，９７１，９５４号も参照のこと）酢酸の存在下でのペプシン処理と反復の塩沈殿による精製により調製した。生じた分子精製ペプシン処理不完全ペプチドのブタＩ型コラーゲンを０．０１Ｍ ＨＣｌに溶かし、４℃で維持した。この冷たい酸性のペプシン処理コラーゲン溶液（ｐＨ３で３ｍｇ／ｍｌのコラーゲン濃度）をアルカリリン酸緩衝液（１リットルの緩衝液につき１．６ｇの水酸化ナトリウムと３５．６グラムのリン酸水素二ナトリウム二水和物を含んでなり、ほぼ１１．２のｐＨを有する）でｐＨ７．２〜７．４へ中和し、３７℃まで温め、シェーカー上で１８〜２４時間の間激しく撹拌して振り混ぜた。

この連続撹拌は、ほぼ３０〜３００ミクロンの範囲の小粒子の生成をもたらす。３７℃で２４時間のインキュベーションの後で得た原線維コラーゲン粒子状マトリックスを遠心分離してコラーゲン粒子を沈殿させる（典型的には、このインキュベーションは、ほぼ４℃〜３７℃の範囲の温度で実施してよい）。上清を除去し、粒子状コラーゲンのペレットを反復の遠心分離及び再懸濁によりリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）において数回洗浄した。

最後の洗浄においてスピンダウンさせたペレットは、ＰＢＳ中の０．５〜８０％（ｗ／ｖ）Ｄ（−）リボース溶液に再懸濁してよい。使用するリボース溶液の容量は、スピンダウンさせた粒子状コラーゲンペレットの容量のほぼ２倍である。生じた懸濁液を注入デバイス（中空のステンレススチール管若しくは針のような）により圧力下で強制的に１００％エタノールへ注入する。

ステンレススチール管は、１４ゲージ〜３４ゲージの範囲であり得るが、他の好適な管のサイズも使用してよい。
好ましくは、上記のコラーゲン／リボース／ＰＢＳ混合物を注入するエタノールの容量と、ＰＢＳ中のＤ（−）リボースの正確な濃度は、この注入液が完成した後で最終混合物中のＤ（−）リボースの最終濃度がほぼ１％（ｗ／ｖ）になり、最終混合物中のエタノールの濃度が７０％（ｖ／ｖ）となるように選択する。これらの濃度は例示のためにのみ示すのであって、国際特許公開公報番号ＷＯ０１／７９３４２ Ａ２に詳しく開示されるように、他の濃度のＤ（−）リボース及び／又はエタノールも使用してよいことが注目される。さらに、国際特許公開公報番号ＷＯ０１／７９３４２ Ａ２に詳しく開示されるように、コラーゲンを架橋結合するのに、他の糖の種類を使用することも可能であり得る。

圧力下での注入は、小さな再構成された原線維コラーゲン粒子の架橋結合溶液中での適切な分散を達成して、エタノールの脱水作用によるコラーゲン粒子の凝集を防ぐために実施する。次いで、コラーゲンの架橋結合が起こることを可能にするために、コラーゲン懸濁液を４℃〜４５℃の範囲の温度でほぼ３〜１４日の間混合する、及び／又は振り混ぜる（他の温度も使用してよい）。

生じた架橋結合コラーゲン懸濁液を反復の遠心分離及び再懸濁によりリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で数回洗浄し、未反応のリボースとエタノールを除去する。次いで、ペレットをＰＢＳに再懸濁し、３７℃での再水和のために一晩平衡化する（この平衡工程は、典型的には、ほぼ４℃〜３７℃の範囲の温度で実施することができるが、他の温度を使用してもよい）。次いで、コラーゲンを、上記に開示するようにＰＢＳ中で２回以上洗浄し、ＰＢＳに再懸濁して１ミリリットルの懸濁液につき１５〜６０ミリグラムの架橋結合コラーゲンの範囲の最終濃度とする。このブタの調製物は、実験１、実験３、及び実験４において上記に開示するようにブタの椎間板へ注射するために、そして実験２において上記に開示するようにウサギの耳へ注射するために使用した。典型的には、１ミリリットルの懸濁液につきほぼ２５〜３５ミリグラムの架橋結合コラーゲンの濃度をウサギの耳への注射に使用し、１ミリリットルにつき３５〜５５ミリグラムの範囲の架橋結合コラーゲンを椎間板内注射の実験に使用した。しかしながら、他の濃度のコラーゲンも使用してよい。

例えば、種々の実験は、１ミリリットルの懸濁液（ＰＢＳ中）につきほぼ９０ミリグラムまでのリボース架橋結合コラーゲンの濃度のリボース架橋結合ブタコラーゲン調製物を２２Ｇ又はそれよりさらに低いゲージを有する針により定型的に注射することができることを示す。このように、上記に開示する注射法は、１ミリリットルの懸濁液につき９０ミリグラムまでのコラーゲン濃度でも実施することができる。

さらに、コラーゲン調製物を懸濁させる液体はＰＢＳに限定されず、当該技術分野で知られているどの好適な種類の生物学的に忍容されて製剤的に許容される緩衝液、又は注射可能な流体であってもよいことが注目される。

ブタの腱の代わりにウシの腱を使用すること以外は、ブタ調製物について上記に開示するようにして、注射可能な無菌のリボース架橋結合ウシコラーゲン調製物を調製した。ウシの腱は、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ（登録商標）、アーカンソー ＬＬＣ，ロジャース、アリゾナ州、アメリカより市販されている。使用した架橋結合ウシコラーゲンの濃度は、１ミリリットルの懸濁液につき２５〜３５ｍｇの架橋結合ウシコラーゲンであった。

本発明の方法及び調製物は、骨形成、線維症、又は軟骨形成の誘導、又は他の組織型の形成に限定されないような治療効果を有し得る特定の物質（局所増殖因子のような、但しそれに限定されない）、又は生細胞（軟骨細胞のような、但しそれに限定されない）を治療される椎間板へ搬送するためにも使用することができる。

本発明の他の態様に従って、椎間板を治療するために使用する注射可能架橋結合コラーゲン調製物を修飾することができる。例えば、注射可能架橋結合コラーゲン調製物には、追加の物質、生細胞、薬物、治療用の材料又は化合物又は薬剤、及び遺伝子治療用の遺伝物質が含まれる場合がある。

本発明の注射可能架橋結合コラーゲン調製物へ加えてよい生細胞には、特に、脊椎動物の軟骨細胞、脊椎動物の幹細胞、脊椎動物の前駆細胞、脊椎動物の線維芽細胞、マトリックスタンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、形態形成タンパク質、増殖因子、転写因子、タンパク質のような抗炎症剤、ホルモン、又はペプチドを分泌するように工学処理された遺伝子工学処理細胞、又はタンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、形態形成タンパク質、増殖因子、転写因子、タンパク質のような抗炎症剤、ホルモン、ペプチド、様々な異なる転写因子のような分子に対する受容体を発現するように工学処理された細胞、又は上記の分泌物質、及び／又は上記の受容体のあらゆる組合せを発現する細胞が含まれる場合がある。

本発明の注射可能架橋結合コラーゲン調製物に含めてよい他の物質又は化合物には、特に、麻酔性の化合物若しくは薬剤、抗炎症性の化合物、薬剤、又は薬物、脊椎動物の増殖因子タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、形態形成タンパク質、タンパク質のような抗炎症剤、ホルモン、ペプチド、及び様々な転写因子が含まれる場合がある。

本発明の注射可能架橋結合コラーゲン調製物に含めてよい他の物質又は化合物には、特に、核酸、オリゴヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸、キメラＤＮＡ／ＲＮＡ構築体、ＤＮＡ若しくはＲＮＡプローブ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、遺伝子、遺伝子の一部、天然又は人工的に産生されるオリゴヌクレオチドを含む組成物、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、又は核酸又は化学修飾核酸を含有する他の物質若しくは化合物、又は上記に開示する物質、化合物、及び遺伝子構築体の様々な組合せ若しくは混合物が含まれる場合があり、当該技術分野で知られている様々なウイルス性若しくは非ウイルス性ベクターに限定されないような、細胞の取込み及び転写を促進するのに必要とされるベクターも含まれる場合がある。

さらに、本発明の注射可能架橋結合コラーゲン調製物に含めてよい他の物質又は化合物には、特に、様々なタンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、ムコ多糖、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヒアルロナンに限定されないようなグリコサミノグリカン、レシチンリッチ腸プロテオグリカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、アグレカン、シンデカン、β−グリカン、バーシカン、セントログリカン、及びセルグリシンのようなプロテオグリカン、フィブロネクチン、フィブログリカン、コンドロアドヘリン、フィブリン（fibulins）、及びトロンボスポジン−５が含まれる場合がある。

本発明のコラーゲン調製物に含めてもよい追加の物質及び化合物は、特に、様々な異なる酵素、様々な異なる酵素阻害剤、及び抗体であり得る。
本架橋結合コラーゲン調製物へ様々な異なる物質、治療薬剤、化合物、又は細胞を加えることは、異なる方法を使用して達成することができる。本発明の１つの態様に従って、上記に開示する物質又は化合物の１つ以上を、コラーゲン及びＤ（−）リボース混合物のエタノールへの注入に先立って、コラーゲン懸濁液若しくは溶液へ加えることができる。この態様において、架橋結合は、加える物質、化合物、又は治療薬剤の存在下で実施され、これは生じる架橋結合コラーゲンをベースとするマトリックスの内部で捕捉又は封鎖される場合がある。

本発明の別の態様に従って、上記の物質、治療薬剤、化合物、又は細胞を、物理的な混合によって、架橋結合コラーゲンマトリックスの懸濁液へ加えるか、又はそれと混合することができる。

好ましくは、注射可能架橋結合コラーゲン調製物へ生細胞を加えるとき、それらは、洗浄済みのリボース架橋結合コラーゲン注射可能調製物（上記に開示するような追加の物質を伴うか又は伴わずに調製した）の適切に穏やかな混合によって加えて、生細胞の濃縮エタノールとの接触を回避する。

注射可能架橋結合コラーゲン調製物を使用する利点はいくつかある。天然に存在するコラーゲン分解酵素による in vivo 分解に対するリボース架橋結合コラーゲンの抵抗性は、ネーティブコラーゲンにおけるよりずっと高い。故に、架橋結合コラーゲン調製物を注射した椎間板は、きわめて生体適合性でありながら、そのような生物分解によりさほど影響を受けないことが期待される。

別の利点は、コラーゲン（架橋結合又は非架橋結合）が、椎間板中での軟骨若しくは線維軟骨の形成を誘導する、及び／又は促進するためのマトリックスとして役立ち得ることである。このことは、実験２の結果により支持される。

椎間板修復に使用するリボース架橋結合コラーゲンは精製したウシ及びブタの不完全ペプチドコラーゲンに由来したが、本発明の椎間板修復及び安定化の方法においては他の多くの種類のコラーゲンを使用してよく、それには、ヒトコラーゲンを含む他の脊椎動物種より得られる架橋結合及び非架橋結合コラーゲン調製物、組換えコラーゲンに由来する架橋結合及び非架橋結合コラーゲン調製物、又は他のあらゆる好適な種類の遺伝子工学処理又は修飾コラーゲンが限定せずに含まれることが注目される。

in situ での生物学的分解に対するその優れた抵抗性により椎間板修復における使用のためにリボース架橋結合コラーゲン調製物を選択したが、開示するのと同じやり方で非架橋結合コラーゲン調製物を使用することも（但し、それらはより速く分解される可能性があるが）可能であり得ることがさらに注目される。

さらに、本発明の椎間板修復の方法において架橋結合コラーゲンと非架橋結合コラーゲンの様々な混合物を使用することが可能であり得て、それによりこの混合物の分解抵抗特性や他の物理的又は化学的な特性をより制御することが可能になるかもしれない。このことが特に有用になり得るのは、軟骨細胞のような生細胞や他の細胞を本コラーゲン調製物へ加えて in situ で組織形成を促進するときである（例えば、軟骨若しくは線維軟骨組織の形成のような）。異なるコラーゲン種類の混合は、コラーゲン混合組成物の好適な修飾により細胞増殖と組織形成のよりよい制御を可能にするかもしれない。

追加的に、コラーゲンのＩ、ＩＩ、及びＩＸ型に限定されないような様々な異なるコラーゲン種類の混合物、又は当該技術分野で知られている他のあらゆる種類のコラーゲンの他のあらゆる好適な混合物を使用することも可能であり得る。

さらに、当該技術分野で知られているように、本発明の方法は、遺伝的に修飾した真核若しくは原核細胞によるか、又は遺伝的に修飾した生物により製造される人工産生コラーゲン種を利用してよいか、又は本発明の調製物はそれを含んでよい。

その上、本発明に開示する実験において、椎間板内注射に使用するのに好ましい材料は、上記に詳しく開示するように、リボースと架橋結合した再構築原線維不完全ペプチドブタコラーゲンの注射可能懸濁液であるが、本発明の哺乳動物の非椎間板ヘルニアに注射する方法はまた、他の異なる注射可能調製物を使用することによって実施してもよい。例えば、好適な注射可能調製物には、当該技術分野で知られるような、架橋結合ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体、又はそれに由来するヒアルロン酸の塩若しくはゲル、又はそれらの架橋結合形態、又はヒアルロナンとその誘導体の粒子の懸濁液を含んでなる注射可能調製物が限定せずに含まれる場合がある。こうした材料と類似の材料は、椎間板を治療するための本方法において望ましい、保水特性、並びに他の生体適合性、非アレルギー特性、及び流体力学特性を有する場合がある。故に、こうした材料と類似の材料は、有利にも、本発明の椎間板内注射法に使用することができる。

例えば、注射可能なヒアルロン酸ゲルは、柔組織の強化に使用することができる（Friedman PM, Mafong EA, Kauvar AN, Geronemus RG. による「柔組織を強化するための注射可能な非動物の安定化ヒアルロン酸ゲルの安全性データ（Safety Data of Injectable Nonanimal Stabilized Hyaluronic Acid Gel For Soft Tissue Augumentation）」という表題の論文、Dermatol. Surg. 2002 Jun; 28 (6): 491-4 を参照のこと）。

椎間板の傷害又はヘルニアへの架橋結合コラーゲンインプラント
生体適合性コラーゲン材料の利点は、椎間板の障害、ヘルニア、又は破裂にも利用し得ることが注目される。本発明の別の好ましい態様に従って、コラーゲンベースのインプラントを、髄核の材料の一部又は髄核全体の外科的除去の後で外科的に椎間板へ導入する。髄核の除去は、髄核の一部又は全体の除去について当該技術分野で知られているどの外科的方法を使用して実施してもよい。

インプラントは、乾燥コラーゲン材料を含んでなる１以上の切片を含む場合がある。好ましくは、コラーゲンのインプラント（類）は、その in vivo での優れた生物分解抵抗性によりリボース架橋結合コラーゲンを含み得るが、他の種類のコラーゲン材料も使用してよい。コラーゲンのインプラントは、傷害された椎間板の安定化のためのスペース保持剤として作用する場合があり、線維軟骨組織の in situ 形成を促進する場合もあり、それが治療される椎間板の長期の生体力学的な安定化にさらに貢献する場合がある。

治療する椎間板の髄核がそれまで占めていたチャンバへ乾燥コラーゲンベースのインプラント（類）を導入した後で、乾燥インプラントは、再水和により膨張する。インプラントの大きさ及び形状は、脱水と膨張の後で、髄核の外科的除去の後の治療された椎間板の内側にあるほとんどのスペースをそれが満たすように適合させ、脊柱の安定化へ貢献してさらなる椎骨傷害を予防する椎間板形状の力学的な支援及び安定化を提供することができる。

乾燥した膨張可能なコラーゲンベースのインプラントの相対的に小さなサイズのために、このインプラントを、膨張に先立って、線維輪中に外科的に作製した小さな開口部より治療する椎間板へ導入することが可能であり得る。材料の除去及び／又は導入のために椎間板の内部にアクセスするためのこうした方法は、当該技術分野で知られている。例えば、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、Sharkey への米国特許第６，０９９，５１４号は、椎間板の内側より材料を搬送するか又は除去するための方法及び装置を開示する。すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる、Stoy への米国特許第６，２６４，６９５号は、生体模倣性キセロゲルプラスチックより作られる脊髄核インプラントと椎間板へのその導入の方法を開示する。

本発明の膨張可能架橋結合コラーゲンインプラントは、Sharkey 又は Stoy により開示される方法、又は椎間板インプラントの導入について当該技術分野で知られている他の方法若しくはデバイスを適切に修飾することによって、乾燥又は部分水和の形態で椎間板へ導入することができる。

架橋結合コラーゲンベースのインプラントは、再水和誘導した in situ 膨張の後で様々な形状を有するように適合させることができる。例えば、インプラントは、円板様の形状や、Stoy（米国特許第６，２６４，６９５号）により開示されるインプラント形状に限定されないような、当該技術分野で知られている円板インプラントに適した他のあらゆる形状を有してよい。

膨張可能な円板インプラントに含まれる架橋結合コラーゲン材料は、Pitaru et al. への米国特許第５，９５５，４３８号、Brodsky et al. への米国特許第４，９７１，９５４号、及び国際特許公開公報番号ＷＯ０１／７９３４２ Ａ２に開示されるように調製することができて、上記の特許及び公開公報はいずれもすべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる。

本発明のインプラントには、注射可能架橋結合コラーゲンベースの調製物について上記に詳しく開示されるような様々な異なる化合物、及び／又は物質、及び／又は添加剤、及び／又は医薬組成物、又は治療薬剤が含まれる場合がある。

生細胞は、典型的には、乾燥した膨張可能インプラントに含まれないが、それらは半乾燥又は部分水和インプラントには含まれる場合があることが注目される。それでも、そうした生細胞は、好適な生理学的溶液、又は注射可能コラーゲン調製物に関連して上記に開示される種類の生細胞を含有する液体培地でインプラントを洗浄することによる一部若しくは完全な水和の後でインプラントへ導入することができる。

膨張可能コラーゲンインプラントの利点は、それらが生体適合性であり、その小さな量のために相対的に小さな開口部より、乾燥又は部分水和の状態でそれらを椎間板へ挿入し得ることである。さらに、リボース架橋結合コラーゲンを含むインプラントの場合、追加の利点は、in vivo での生物分解に対する高い抵抗性である。

本発明のコラーゲンベースのインプラントのさらなる利点は、上記に開示するように、そして上記の実験２の結果により明示されるように、単離されて生きている軟骨細胞を添加しなくても、それらが椎間板中に局所的に存在する軟骨細胞の遊走を引き起こすことができて、椎間板の内側で線維軟骨形成を促進して誘発し得ることである。

椎間板を治療するための本方法及び調製物は、ヒトを治療するように適合させることが可能であり、本方法と調製物の組成物は、同様に、又は好適な修飾で適用して、他の哺乳動物、またさらに他の脊椎動物における椎間板疾患を治療することができる。例えば、イヌのＩＶＤはイヌのある品種に知られた問題である。従って、開示される本方法と注射可能調製物は、上記に開示するように、イヌや他のペット、又は飼育動物若しくは家畜化動物に適用することができる。

本発明を限られた数の態様に関して記載したが、本発明の多くの変更、修飾、及び他の応用が本発明の範囲及び精神の範囲内でなし得ると理解されよう。
注目の参考文献
１．Chiba M, McLain RF, Yerby SA et al. (1996)「短分節突起の器具使用−追加の鉤固定の生体力学分析（Short segment pedicle instrumentation - Biomechanical analysis of supplemental hook fixation）」, Spine; 21: 288-294．
２．Dick JC, Zdeblick TA, Bartel BD et al. (1997)「堅い突起ネジシステムにおける架橋結合設計の力学的評価（Mechanical evaluation of cross-link designs in rigid pedicle screw systems）」, Spine 22; 370-375．
３．Gleizes V, Viguier E, Feron JM, Canivet S, Lavaste F (1998)「椎間板の生体力学に及ぼす凍結の効果（Effects of freezing on the biomechanics of the intervertebral disc）」, Surgical Radiologic Anatomy; 20: 403-407．
４．Habtemariam A, Virri J, Gronblad M, Holms S, Kaigle A, Karaharju E. (1998)「ブタの全厚輪損傷における炎症細胞（Inflammatory cell in full-thickness annulus injury in pig）」, Spine 23: 524-29．
５．Kanerva A, Kommonen B, Tolonen J, Habtemariam A, Virri J, Gronblad M, Karaharju E. (1997)「実験椎間板損傷における炎症細胞（Inflammatory cell in experimental intervertebral disc injury）」 Spine; 22: 2711-15．
６．Marmelstein LE, McLain RF, Yerby SA (1998)「リン酸カルシウムセメントでの胸腰椎破裂骨折の補強（Reinforcement of thoracolumbar burst fracture with calcium phosphate cement）」. Spine; 23: 664-670．

図１Ａ〜１Ｇは、実験１において入手したブタ椎間板より採取した組織学的切片を表す顕微鏡写真であり、対照の椎間板、シャム手術した椎間板、並びに、本発明の方法の態様に従ってリボース架橋結合コラーゲンを注射した椎間板が含まれる。 図２Ａ〜２Ｄは、ウサギ耳軟骨の表面部分へ注射した架橋結合コラーゲン粒子の間での軟骨組織の形成を例示する顕微鏡写真である。 図３は、本発明の態様に従って、リボース架橋結合コラーゲンの椎間板内注射に使用し、注射に使用する力と注射器アウトレットと椎間板内スペースにおける圧力をモニタリングするために使用するシステムを例示する部分断面概略図である。 図４Ａ〜４Ｄは、対照動物と、本発明の方法の態様に従ってリボース架橋結合コラーゲンを注射した椎間板を有する動物に由来するブタ脊柱分節に対する伸展及び屈曲と捻転の実験を含む生体力学測定を実施するときに使用する改良ＩＮＳＴＲＯＮデバイスの様々な配置を例示する写真である。 図５Ａは、本発明の方法の態様に従ったリボース架橋結合コラーゲンの椎間板内注射の前と後での椎間スペーシングを例示する、ブタの脊柱の各部分のＸ線像である。 図５Ｂは、本発明の方法の態様に従ったリボース架橋結合コラーゲンの椎間板内注射の前と後での椎間スペーシングを例示する、ブタの脊柱の各部分のＸ線像である。 図５Ｃは、本発明の方法の態様に従ったリボース架橋結合コラーゲンの椎間板内注射の前と後での椎間スペーシングを例示する、ブタの脊柱の各部分のＸ線像である。 図５Ｄは、本発明の方法の態様に従ったリボース架橋結合コラーゲンの椎間板内注射の前と後での椎間スペーシングを例示する、ブタの脊柱の各部分のＸ線像である。 図６Ａは、対照と、本発明の方法の態様に従ってリボース架橋結合コラーゲンを注射した椎間板を有する実験処理ブタに由来する、切開したブタ脊柱分節に対して実施した伸展、屈曲、及び捻転実験の結果の代表曲線例を例示する概略グラフである。 図６Ｂは、対照と、本発明の方法の態様に従ってリボース架橋結合コラーゲンを注射した椎間板を有する実験処理ブタに由来する、切開したブタ脊柱分節に対して実施した伸展、屈曲、及び捻転実験の結果の代表曲線例を例示する概略グラフである。 図６Ｃは、対照と、本発明の方法の態様に従ってリボース架橋結合コラーゲンを注射した椎間板を有する実験処理ブタに由来する、切開したブタ脊柱分節に対して実施した伸展、屈曲、及び捻転実験の結果の代表曲線例を例示する概略グラフである。 図６Ｄは、対照と、本発明の方法の態様に従ってリボース架橋結合コラーゲンを注射した椎間板を有する実験処理ブタに由来する、切開したブタ脊柱分節に対して実施した伸展、屈曲、及び捻転実験の結果の代表曲線例を例示する概略グラフである。 図６Ｅは、対照と、本発明の方法の態様に従ってリボース架橋結合コラーゲンを注射した椎間板を有する実験処理ブタに由来する、切開したブタ脊柱分節に対して実施した伸展、屈曲、及び捻転実験の結果の代表曲線例を例示する概略グラフである。 図６Ｆは、対照と、本発明の方法の態様に従ってリボース架橋結合コラーゲンを注射した椎間板を有する実験処理ブタに由来する、切開したブタ脊柱分節に対して実施した伸展、屈曲、及び捻転実験の結果の代表曲線例を例示する概略グラフである。

Claims (87)

1. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
2. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
3. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
4. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
5. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
6. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
7. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
8. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
9. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
10. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
11. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
12. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
13. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
14. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
15. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
16. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
17. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
18. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
19. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
20. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
21. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
22. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
23. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
24. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
25. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
26. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
27. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
28. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
29. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
30. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
31. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
32. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
33. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
34. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
35. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
36. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
37. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
38. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
39. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
40. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
41. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
42. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
43. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
44. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
45. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
46. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
47. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
48. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
49. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
50. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
51. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
52. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
53. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
54. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
55. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
56. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
57. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
58. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
59. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
60. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
61. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
62. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
63. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
64. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
65. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
66. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
67. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
68. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
69. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
70. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
71. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
72. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
73. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
74. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
75. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
76. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
77. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
78. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
79. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
80. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
81. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
82. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
83. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
84. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
85. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
86. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。
87. インビボ（in vivo）で線維軟骨形成を誘導するために椎間板へ注射するための注射可能な調製物であって、還元糖と架橋結合したコラーゲンの粒子を含んでなる注射可能な流体を含んでなる前記調製物。

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