JP2005509008A - Ｐｔｐ１ｂの阻害剤およびリガンド - Google Patents

Abstract

酵素のリガンドおよび阻害剤を発見するための方法を開示する。該方法は、活性部位を標的とする成分と、リンカー成分と、周辺部位を標的とする成分とを含むコンビナトリアルライブラリの創製および試験を含む。該方法はまた、化合物が酵素のリガンドであるかどうかを決定するための新規のアッセイを含む。このアッセイは、該酵素の基質に結合することはできるが、該基質との酵素反応を触媒することはできない酵素の突然変異体への該酵素の活性部位の既知のリガンドの結合を該化合物が阻害することができるかどうかを評価する。タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の種々のリガンドおよび阻害剤も開示する。これらのリガンドおよび阻害剤は、上記の方法を用いて発見された。本発明の方法を用いて発見された特定の阻害剤の１つは、現在までに発見されたいずれのＰＴＰ１Ｂの阻害剤のうちで最も高い特異性および親和性を有する。

Description

［連邦委託研究に関する記載］
本発明は、国立衛生研究所助成金番号ＧＭＳ５２４２のもとで米国政府の支援によりなされた。米国政府は本発明に所定の権利を有する。

［発明の背景］
［（１）発明の分野］
本発明は、酵素のリガンドおよび阻害剤に関する。さらに特には、本発明は、酵素のリガンドおよび阻害剤を発見し評価する方法、および上記方法を用いて見い出されたタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂの特異的阻害剤に関する。さらに、本発明は、肥満およびＩＩ型糖尿病に対する治療のための、これらの阻害剤の使用方法に関する。

［関連技術の記載］
膨大な数の酵素について、酵素の阻害剤が知られている。それらは、研究目的に関してと同様に、治療応用に関しても有用である（例えば、引用文献４２〜４４を参照のこと）。改善された酵素の阻害剤が有用であろう酵素の重要なグループは、タンパク質チロシンホスファターゼである。

多くの細胞プロセスを制御するシグナル伝達事象の開始、伝播および終了は、チロシンのリン酸化のレベルにより決定される。言い換えると、リン酸化チロシンのレベルは、タンパク質−チロシンキナーゼとタンパク質−チロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）との相互の活性により、絶妙な均衡で維持される。今までに、多数のＰＴＰアーゼが同定されている。均衡の取れたタンパク質チロシンのリン酸化が細胞の恒常性の維持に決定的なので、ＰＴＰアーゼの機能不全が多くのヒト疾患に結び付けられてきたのは驚くべきではない（１）。その結果、ＰＴＰアーゼ活性が不適当に高いそれらの例では、ＰＴＰアーゼの阻害剤が治療剤の価値ある新しいファミリーを提供してもよい。しかしながら、ＰＴＰアーゼを標的とした薬剤開発は、最近まで真剣には考慮されなかった。主な懸念は、１つのＰＴＰアーゼが複数のシグナル伝達経路を調節することがある一方で同時に、１つのシグナル伝達経路が数種のＰＴＰアーゼに支配されることがあるということである。したがって、ＰＴＰアーゼの阻害は、望ましくない副作用をおそらく生じると考えられていた。この懸念を軽減し始めている重要な進展がなされた。

ＰＴＰ１Ｂは、インスリン（２〜４）およびレプチン（４５、４６）のシグナル伝達の負の調節因子であることが示されている。ＰＴＰ１Ｂ^−／−マウスでは、インスリン受容体が増し、インスリン受容体基質−１のリン酸化が高まり、骨格筋および肝臓におけるインスリンへの感受性が高まることが示されている（５、６）。さらに、ＰＴＰ１Ｂ^−／−マウスは、脂肪過多が顕著に低く、餌に誘導される肥満から保護されている。おそらく、最も重要なことに、これらのマウスが正常かつ健康に見えたが、ＰＴＰ１Ｂによるインスリンのシグナル伝達の調節が組織および細胞の種類に特異的であることを示している。これらの観察は、ＰＴＰ１Ｂが至る所に発現している場合にさえ、特異的なＰＴＰ１Ｂ阻害剤は副作用がないかもしれず、ＰＴＰ１Ｂを標的にした（抗−糖尿病／肥満）選択的治療の有効性の可能性を強調するかもしれないことを示唆している。

しかしながら、明らかに、ＰＴＰアーゼ阻害剤による治療的介入が現実になる前に、強力かつ選択的なＰＴＰアーゼの阻害剤が必要である。したがって、生物学的研究および薬理学的開発のために特異的かつ強力なＰＴＰアーゼ阻害剤を得ることに強烈な関心がある。

構造的な検討および突然変異の検討によって、ｐＴｙｒ結合部位（活性部位）の触媒反応または形成に含まれるアミノ酸が保存されていること（７〜９）が示され、ＰＴＰアーゼが、リン酸モノエステルの加水分解およびｐＴｙｒの認識に関して類似するメカニズムを利用していることを示している。阻害剤開発のために、ＰＴＰアーゼの活性部位を標的にすることによって、特異性を達成することができるだろうか？ＡＴＰ結合部位が構造的に保存されているために、タンパク質キナーゼの分野においても同様の疑問が生じていた。後者をものともせずに、多数の、選択性の高い、ＡＰＴ結合部位を標的としたタンパク質キナーゼ阻害剤が記載されている（１０、１１）。数例において、構造的検討によって、特異性は、各阻害剤の一部しかＡＴＰに結合する残基と相互作用せず、一方該分子の残りの部分は、ＡＴＰ結合ポケットの外側に位置する残基と接触するという事実からもたらされることが明らかにされている（１１）。

［発明の簡単な概要］
本発明は、酵素のリガンドおよび阻害剤の発見に有用な方法、ならびにタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）のリガンドおよび阻害剤を発見するためのコンビナトリアルライブラリを含むそれらの方法から結果として生じる組成物を指向する。種々の新規なＰＴＰ１Ｂのリガンドおよび阻害剤も、開示される。

本発明の方法は、酵素、特にＰＴＰ１Ｂの活性部位および固有の周辺部位の双方を標的として設計されるコンビナトリアルアプローチを利用する。双方の部位に同時に会合することができる化合物は、高められた親和性および特異性を呈すると予想される。我々はまた、ＰＴＰアーゼ阻害剤のスクリーニングに使用することができる新規の親和性に基づいた高処理能力のアッセイ法も記載する。コンビナトリアルライブラリ／高処理能力のスクリーニングプロトコールによって、強力（Ｋ_ｉ＝２．４ｎＭ）かつ選択的な（イェルシニア（Yersinia）のＰＴＰアーゼ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、ＬＡＲ、ＨｅＰＴＰ、ＰＴＰａ、ＣＤ４５、ＶＨＲ、ＭＫＰ３、Ｃｄｃ２５Ａ、Ｓｔｐ１およびＰＰ２Ｃを包含するホスファターゼのパネルに対してほとんど活性がないか、またはまったく活性がない）１種を包含する数種の小分子ＰＴＰ１Ｂ阻害剤が提供された。これらの結果は、ＰＴＰアーゼの大きな酵素ファミリーの個々の一員に対する強力でさらに選択性の高い阻害剤を獲得することが可能であることを実証している。

したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、活性部位を標的とする成分と、リンカー成分と、周辺部位を標的とする成分とを含む化合物を指向する。これらの実施形態において、リンカー成分は活性部位を標的とする成分に共有結合し、周辺部位を標的とする成分はリンカー成分に共有結合する。さらに、活性部位を標的とする成分が図１の化合物３の場合のような式を有し、リンカー成分および周辺部位を標的とする成分が、５００ダルトン未満の任意の有機分子である。

他の実施形態において、本発明は、活性部位を標的とする成分と、リンカー成分と、周辺部位を標的とする成分とを有するタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）のリガンドであって、図１の化合物３の式を含むリガンドを指向する。これらの実施形態において、リンカー成分および周辺部位を標的とする成分はそれぞれ、図３および図２の以下の要素：４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｅ、４Ｆ、５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｆ、６Ａ、６Ｂ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｅ、７Ｆ、７Ｈ、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｆ、８Ｈ、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｆ、９Ｈ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｆ、１０Ｈ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ、１１Ｈ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｆ、１２Ｇ、１２Ｈ、１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｅ、１３Ｆ、１３Ｇ、１３Ｈ、１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｅ、１５Ｆ、１５Ｈ、１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｆ、１６Ｈ、１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｅ、１７Ｆ、１７Ｈ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｅ、１８Ｆ、１８Ｇ、１８Ｈ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｅ、１０Ｆ、２０Ｇ、２０Ｈ、２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ、２１Ｄ、２１Ｅ、２１Ｆ、２１Ｇ、２１Ｈ、２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄ、２２Ｅ、２２Ｆ、２２Ｇ、２３Ｈ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、２４Ｄ、２４Ｅ、２４Ｆ、２４Ｇ、２４Ｈ、２５Ｆ、２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃ、２６Ｅ、２６Ｆ、２６Ｇおよび２６Ｈより成る群から選択される。さらに、これらの実施形態のリガンドは、少なくとも１つのホスフェート基を含む。

本発明はまた、活性部位を標的とする成分と、リンカー成分と、周辺部位を標的とする成分とを有する、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の阻害剤を指向する。これらの実施形態において、阻害剤は上記リガンドのいずれかを含み、ここで任意のホスフェート基がジフルオロホスホネート基で置換される。

さらに、本発明は、薬学上許容可能な賦形剤において上記阻害剤のいずれかを含む組成物を指向する。

追加の実施形態では、本発明は、患者における肥満を予防または治療する方法を指向する。該方法は、上記組成物の１つを該患者に投与することを含む。

本発明はさらに、患者におけるＩＩ型糖尿病を予防または治療する方法を指向する。これらの方法も、上記組成物の１つを該患者に投与することを含む。

本発明はまた、化合物が酵素のリガンドであるかどうかを評価する方法を指向する。本方法は、（ａ）該酵素の既知の活性部位のリガンドを該化合物および該酵素の突然変異体と組み合わせる工程であって、ここで該突然変異体は該酵素の基質に結合することはできるが、該基質の化学変換を触媒することはできない工程、および（ｂ）該酵素の突然変異体へのこの既知のリガンドの結合に対して化合物が競合することが可能であるかどうかを決定する工程であって、ここで結合に対して競合する該化合物の能力によって、該化合物が該酵素のリガンドであることが示される工程を含む。

さらに、本発明は、タンパク質チロシンホスファターゼのリガンドを発見するためのコンビナトリアルライブラリを指向する。これらのライブラリは、図１の１つより多くの形態の化合物３を含み、ここでＸおよびＹは各々独立して、５００ダルトン未満の任意の有機分子である。

［発明の詳細な説明］
略語：Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸；Ｂｏｃ、第３級ブトキシルカルボニル；ＢＯＰ、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート；ＤＡＳＴ、（ジエチルアミノ）サルファートリフルオリド；ＤＩＣ、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＰＥＡ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＡ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；ＤＭＡＰ、４−（ジメチルアミノ）ピリジン；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＤＴＴ、ジチオスレイトール；ＥＤＴ、１，２−エタンジチオール；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着測定法；ＥＳＩ−ＭＳ、電子スプレーイオン化−質量分光光度計；Ｆｍｏｃ、９−フルオレニルメトキシカルボニル；Ｆｍｏｃ−Ｏｓｕ、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド；ＨＢＴＵ、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＨＭＰＡ、ヘキサメチルホスホルアミド；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィ；ＨＯＢｔ、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＬＨＭＤＳ、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド；ＭＯＬＤＩ−ＴＯＦ、マトリクス支援レーザ脱離イオン化法−飛行時間型；ＭＳ、質量分光光度計；ＮＭＭ、Ｎ−メチルモルホリン；ＮＭＲ、核磁気共鳴；ＰＴＰアーゼ、タンパク質チロシンホスファターゼ；ＰＴＰ１Ｂ、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ；ｐＴｙｒ、Ｏ−ホスホ−Ｌ−チロシン；ＰｙＢＯＰ、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＦＦＨ、テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート；ＴＨＦ、テトラヒドロフラン；ＴＩＳ、トリイソプロピルシラン；ＴＭＳＢｒ、ブロモトリメチルシラン；ＴＭＳＩ、ヨードトリメチルシラン；Ｔｒｉｓ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；ＴＳＴＵ、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート。

本発明は、酵素のリガンドおよび阻害剤を発見する方法、ならびにタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の、特異性の高い数種の高親和性リガンドおよび対応する阻害剤の発見におけるそれらの方法の使用を指向する。該方法は、周辺部位とともに酵素の活性部位を標的とするコンビナトリアルライブラリの創製に基づく。

本発明の方法で利用されるコンビナトリアルライブラリは、酵素のリガンドの発見を指向する。該ライブラリは、該酵素の既知の基質の活性部位を模倣する活性部位を標的とする成分と、該活性部位に連結するリンカー成分と、周辺部位を標的とする成分とを有する化合物を含む。例えば、ＰＴＰ１Ｂのコンビナトリアルライブラリの活性部位成分、リンカー成分および周辺部位成分を示す、図１に示される化合物３を参照のこと。

これらのライブラリのメンバーの活性部位を標的とした成分は、検討中の特定の酵素に対する基質として既知である任意の適当な化合物であり得る。そのような活性部位成分は、多量の酵素に関して知られており、好適な活性部位は、過度の実験なしで、熟練者であれば、任意の特定の酵素に関して選択し得るであろう。いかなるコンビナトリアルライブラリについても、１つより多くの既知の活性部位を標的とする成分を選択し得るであろう。しかしながら、好ましい実施形態では、ライブラリの全メンバーにおいて、唯一の活性部位を標的とする成分が存在する。最も好ましい実施形態においては、この活性部位を標的とする成分は、酵素に対し最も高い親和性を有する酵素の既知の基質に存在する活性部位の標的である。ライブラリの全メンバーについて唯一の活性部位成分を有するということは、それによって該ライブラリの複雑さが減り、検討の焦点をリンカー成分や周辺部位成分に向けることができるようにするため好ましく、その際、変化に富むことは、広く変化する酵素の親和性および特異性の特徴をこれらのライブラリメンバーに付与することが期待されるであろう。例示となるＰＴＰアーゼ酵素については、好ましい活性部位成分が、化合物３におけるｐＴｙｒとして図１に示されている。

リンカー成分は、これらのライブラリメンバーの活性部位成分と周辺部位成分との間にスペーサーおよび望ましい荷電特性を提供する役目を果たす。したがって、リンカーは、周辺部位を標的とする成分と活性部位を標的とする成分との双方に、好ましくは化合物３におけるようにアミド結合によって共有結合される。リンカーの有用なセットの一例を図３に示す。図３に示されるように、本明細書中で定義されるリンカーのセットには、該周辺部位成分が該活性部位成分に直接共有結合する、リンカーがないメンバーを含めることができる。好ましくは、リンカー成分は５００ダルトン未満である。他の好ましい実施形態では、リンカー成分は、炭素、酸素、窒素および／または水素から成る。しかしながら、他の原子元素の使用も可能である。

これらのライブラリメンバーの周辺部位を標的とする成分は、酵素リガンド／阻害剤相互作用の特異性および親和性を高めるように活性部位に近い領域を標的とする役目を果たす。本明細書中で使用する場合、「標的とする」は、酵素の活性部位または該活性部位近くの領域に可逆的に結合する成分またはライブラリメンバー自体の能力に関する。当業界においてよく知られているように、該成分／ライブラリメンバーと酵素活性部位との間の相補的な形状および荷電特性の存在によって、そのような結合は増強される。

周辺部位を標的とする成分は、好ましくは炭素、酸素、窒素、リン、および／または水素から成る。しかしながら、リンカー成分と同様に、他の原子元素の使用も想定される。周辺部位成分も、好ましくは約５００ダルトン未満である。周辺部位を標的とする成分の有用なセットを、図２に示す。

種々のライブラリメンバーの合成は、当業界において既知のいかなる適当な方法にもよることができる。好ましくは、これらのライブラリメンバーは、既知の固相法により樹脂上で合成される。一例は、Ｆｍｏｃ化学反応（chemistry）を用いたジスルフィド修飾テンタゲルＳ ＮＨ_２樹脂上での固相合成である。ＰＴＰ１Ｂのリガンドおよび阻害剤の発見に使用した種々のライブラリメンバーおよび阻害剤類似体の合成において使用した例示方法に関する実施例１および図４〜図６を参照のこと。

本明細書中において想定されるように、このライブラリの種々の成分、またはリガンド活性について試験されるべき任意の他の化合物を示す化合物は、新規のアッセイ法により、標的とする酵素のリガンドとしての活性について評価される。本方法は、以下の工程：
（ａ）酵素の既知の活性部位のリガンドを、該化合物および該酵素の突然変異体と組み合わせる工程であって、ここで該突然変異体は該酵素の基質に結合することはできるが、該基質の化学変換を触媒することはできない工程、および
（ｂ）該酵素の突然変異体への既知のリガンドの結合に対して該化合物が競合することが可能であるかどうかを決定する工程であって、ここで結合に対して競合する該化合物の能力によって、該化合物が該酵素のリガンドであることを示す工程を含む。

このアッセイは、該酵素の突然変異体への該酵素の既知の活性部位リガンドの結合に対して競合する候補リガンドの能力を評価することにより、標的とされた酵素に対するリガンドを検出するように設計される。この競合アッセイは、該酵素の既知の活性部位リガンドに取って代わる候補リガンドを必要とするので、この競合アッセイは、単なる酵素活性のアッセイ、または該酵素に結合する該候補の能力を評価するアッセイに比して好まれる。該酵素の既知の活性部位リガンドに取って代わることができるリガンドは、その部位からこの既知の活性部位リガンドに取って代わることができる活性部位に対する十分な親和性を必ず有さなければならない。したがって、該アッセイは高親和性の活性部位リガンドについて選択し、単に、有効な基質ではあるが必ずしも高親和性のリガンドではない化合物について選択するのではない。優れた阻害剤は活性部位に対して高親和性を有することが予想されるので、該酵素を阻害する化合物を発見するには、該競合アッセイは特に有用である。

本発明のアッセイ方法は、リガンドの親和性を測定するように設計されるのであって、酵素の基質として役立つ候補リガンドの能力を測定するように設計されるのではないので、該アッセイは、活性部位リガンドの結合活性を保持するが基質に対する活性を示さない酵素の突然変異体を利用する。そのような突然変異体は多数の酵素についてよく知られており、それら酵素のいずれかのリガンド活性を決定するためのこのアッセイの利用は、過度の実験を必要としないであろう。このアッセイ方法に有用な突然変異体酵素の一例は、ＰＴＰ１ＢのＣ２１５Ｓ突然変異体である（３３）。

上記で開示した競合アッセイは好ましくは、アッセイ化合物の１つが結合した固相を利用する。該固相はいかなる特定のマトリクスにも狭義に限定されず、ビーズ、マイクロタイタープレート、紙、膜、または例えば、米国特許第６，２２５，１３１号に記載されるマトリクスのような他の任意のマトリクス上で、該アッセイを行うことができるであろう。好ましくは、該マトリクスによって、候補リガンドの高処理能力のスクリーニングができる。

該アッセイの固相の実施形態において、まず突然変異体を該固相に結合させ、次いで既知のリガンドおよび候補リガンドを加えることによって、該アッセイを行うことができるであろう。次いで、多数のよく知られた方法のいずれか、例えば、既知のリガンドに対する抗体を利用することによって、または例えば、放射活性もしくは蛍光ラベルでタグを付けられている既知のリガンド、またはビオチン（例えば、標識したアビジンもしくは抗アビジン抗体と共にアビジンを用いて測定することができる）のような定量できるハプテン、またはジゴキシゲニン（digoxygenin、抗ジゴキシゲニン抗体を用いて測定することができる）を用いることによって、該突然変異体に結合するために既知のリガンドと競合する候補リガンドの能力を決定する。固相に結合した既知のリガンドを定量し、そのような結合した既知のリガンドの量を、候補リガンドなしで結合している既知のリガンドの量と比べることによって、活性部位への結合に関して既知のリガンドと競合する候補リガンドの能力が決定される。

代わりの固相の実施形態では、既知のリガンドが該固相に結合する。次いで候補リガンドおよび突然変異体を加える。これらの実施形態では、該固相に結合した該突然変異体を定量し、そのような結合した突然変異体の量を、候補リガンドなしで結合している突然変異体の量と比較することにより、活性部位への結合について既知のリガンドと競合する候補リガンドの能力を決定する。例えば、放射活性もしくは蛍光ラベルで、ハプテン（抗ハプテン抗体で定量することができる）で、または該突然変異体に対する抗体で標識した突然変異体を用いることにより、これらの結合した突然変異体を定量することができる。

本明細書中で使用する場合、用語「抗体」には、モノクローナルまたはポリクローナル起源のもの、少なくとも１つの結合部位を保持している断片、または効用において抗体全体と同等であると認識される他のいかなる変異体も包含される。上記方法において、当業者は、抗体によって定量される抗原またはハプテンは、抗原またはハプテンに結合する抗体を定量することによって、例えば、抗原またはハプテンに結合する抗体に特異的に結合する標識した抗体または標識した二次抗体を用いることによって定量されることを認識するであろう。

実施例１において、本発明のアッセイの説明が提供される。そのアッセイでは、ＰＴＰ１Ｂの既知のリガンド／基質、ＤＡＤＥｐＹＬをビオチン化し、アビジンをコーティングしたマイクロタイターのウエルに結合させる。次いで、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＰＴＰ１ＢのＣ２１５Ｓ突然変異体との組換え融合タンパク質（ＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓ）と共に、候補リガンドをマイクロタイターのウエルに加える。インキュベートし、洗浄した後、抗ＧＳＴ抗体、次いで西洋ワサビのペルオキシダーゼを結合したマウス抗ウサギ抗体を加えることによって、結合したＣ２１５Ｓを定量する。洗浄後、この結合したペルオキシダーゼを定量する。候補リガンドを添加しない場合の結合したＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓの決定と、その測定値を比較する。候補リガンドとウエル内で結合したペルオキシダーゼの値が、候補リガンドなしのウエル内における値よりも小さいということは、該候補リガンドがＰＴＰ１Ｂのリガンドであることを示している。

標的酵素のリガンドを同定する上記方法の利用によって、該酵素の阻害剤を開発することができる。多くの場合、該酵素が該リガンドを基質として利用できなければ、該リガンド自体は阻害剤として役立つことができる。また、該リガンドが該酵素の基質であれば、該リガンドが基質として使用されるのを阻止するように、活性部位に結合する該リガンドの領域を修飾することによって、一般に該リガンドを該標的酵素の阻害剤にすることができる。

上記方法を利用して、ＰＴＰ１Ｂのリガンドおよび阻害剤のためのコンビナトリアルライブラリを評価した。該ライブラリは、化合物３（図１）から成り、ここでリンカー成分は図３に説明される２３種のリンカー４〜２６から成り、周辺部位を標的とする成分は、図２のＡ〜Ｈの８化合物から成った。したがって、該ライブラリは、これらの２３種のリンカーと８種の周辺部位を標的とする成分のあらゆる組み合わせで置換された化合物３から成った（ライブラリメンバーの総数＝１８４）。

結合したＤＡＤＥｐＹＬからＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓを置き換える能力について、各ライブラリメンバーを調べた。この結果を図７に提供する。少なくとも３０％（リガンドの活性を示す）、ＤＡＤＥｐＹＬへのＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓの結合を阻害することが可能であった特定のライブラリ成分は、以下のリンカー成分および周辺部位を標的とする成分：４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｅ、４Ｆ、５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｆ、６Ａ、６Ｂ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｅ、７Ｆ、７Ｈ、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｆ、８Ｈ、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｆ、９Ｈ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｆ、１０Ｈ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ、１１Ｈ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｆ、１２Ｇ、１２Ｈ、１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｅ、１３Ｆ、１３Ｇ、１３Ｈ、１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｅ、１５Ｆ、１５Ｈ、１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｆ、１６Ｈ、１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｅ、１７Ｆ、１７Ｈ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｅ、１８Ｆ、１８Ｇ、１８Ｈ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｅ、１０Ｆ、２０Ｇ、２０Ｈ、２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ、２１Ｄ、２１Ｅ、２１Ｆ、２１Ｇ、２１Ｈ、２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄ、２２Ｅ、２２Ｆ、２２Ｇ、２３Ｈ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、２４Ｄ、２４Ｅ、２４Ｆ、２４Ｇ、２４Ｈ、２５Ｆ、２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃ、２６Ｅ、２６Ｆ、２６Ｇおよび２６Ｈから成る化合物３であった。特に有効なのは２１Ｂおよび２４Ｂであり；これらの試験化合物の内で最も有効なのは２１Ｂであった。当業者は、これらの結果から、幾つかのリンカー成分および周辺部位を標的とする成分は、化合物３に存在する場合、ＰＴＰ１Ｂリガンドの形成においてその他のそのような成分よりもさらに有効であることを認識するであろう。特には、リンカー１１、１３、２１、２２および２４、ならびに周辺部位を標的とする成分Ａ、Ｂ、Ｃ、ＦおよびＨ、特にＢは、ＰＴＰ１Ｂのリガンドの形成において、化合物３の最も有効な成分であった。

上記の情報に基づいて、当業者は、過度の実験をしないで、優れたリンカー１１、１３、２１、２２および２４と組み合わせた場合、ＰＴＰ１Ｂリガンドにおける成分である可能性の高い、Ａ〜Ｈ以外の周辺部位を標的とする成分を同定することができるであろう。特に、過度の実験をしないで、芳香環を有する、Ａ〜Ｈ以外のそのような周辺部位を標的とする成分を同定することができるであろう。また、当業者は、過度の実験をしないで、周辺部位を標的とする成分Ａ〜Ｈと組み合わせた場合、ＰＴＰ１Ｂリガンドにおける成分である可能性の高い、４〜２６以外のリンカー成分を同定することができるであろう。したがって、本発明の範囲内として想定されるＰＴＰ１Ｂリガンドは、成分４〜２６およびＡ〜Ｈを伴った化合物３を凌ぐ。

したがって、本発明は、活性部位を標的とする成分、リンカー成分および周辺部位を標的とする成分を含む化合物も指向し、その際、該リンカー成分は該活性部位を標的とする成分に共有結合し、該周辺部位を標的とする成分は該リンカー成分に共有結合し、およびここで該活性部位を標的とする成分は図１の化合物３におけるような式を有し、およびここで該リンカー成分および該周辺部位を標的とする成分は５００ダルトン未満の任意の有機分子である。そのような化合物は、例えば、ＰＴＰ１Ｂのリガンドを発見するためのコンビナトリアルライブラリにおいて有用である。好ましい実施形態では、上記化合物は図１の化合物３を含み、その際、ＸおよびＹは独立して５００ダルトン未満の任意の有機分子である。その他の好ましい実施形態では、該リンカー成分は炭素、酸素、窒素および／または水素から成り、該周辺部位を標的とする成分は芳香環を有し、炭素、酸素、窒素、リンおよび／または水素から成る。好ましくは、該化合物はＰＴＰ１Ｂのリガンドである。その他の好ましい実施形態では、該リンカー成分は図３の要素４〜２６の１つであり、さらに好ましくは図３の要素１１、１３、２１、２２または２４である。好ましい周辺部位を標的とする成分は図２の要素Ａ〜Ｈの１つであり、さらに好ましくは要素Ａ、Ｂ、Ｃ、ＦまたはＨである。

関連した実施形態において、本発明は図１の化合物３の式を含むＰＴＰ１Ｂリガンドを指向する。好ましくは、該リンカー成分および該周辺部位を標的とする成分がそれぞれ、図３および図２の以下の要素：４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｅ、４Ｆ、５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｆ、６Ａ、６Ｂ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｅ、７Ｆ、７Ｈ、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｆ、８Ｈ、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｆ、９Ｈ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｆ、１０Ｈ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ、１１Ｈ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｆ、１２Ｇ、１２Ｈ、１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｅ、１３Ｆ、１３Ｇ、１３Ｈ、１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｅ、１５Ｆ、１５Ｈ、１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｆ、１６Ｈ、１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｅ、１７Ｆ、１７Ｈ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｅ、１８Ｆ、１８Ｇ、１８Ｈ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｅ、１０Ｆ、２０Ｇ、２０Ｈ、２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ、２１Ｄ、２１Ｅ、２１Ｆ、２１Ｇ、２１Ｈ、２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄ、２２Ｅ、２２Ｆ、２２Ｇ、２３Ｈ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、２４Ｄ、２４Ｅ、２４Ｆ、２４Ｇ、２４Ｈ、２５Ｆ、２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃ、２６Ｅ、２６Ｆ、２６Ｇおよび２６Ｈである。さらに好ましくは、該リンカー成分は図３の要素２１または２４であり、最も好ましくは要素２１である。最も好ましい周辺部位を標的とする成分は、図２の要素Ｂである。

ＰＴＰ１Ｂリガンドの活性を示す化合物３を含むいかなる化合物も、活性部位を標的とする成分のホスフェート基をジフルオロホスホネート基で置換することにより、ＰＴＰ１Ｂの阻害剤に変換されるように予測されるだろう。また、最も高い親和性を持つＰＴＰ１Ｂのリガンド（前に記載した競合アッセイにおいて最大のリガンド活性により示されたような）が最も高いＰＴＰ１Ｂの阻害活性を有することも予測されるだろう。

特に好ましい阻害剤は、約２．４ｎＭのＫ_ｉ値を有する（実施例１を参照のこと）、今までに同定されたＰＴＰ１Ｂの最も特異的でかつ最も高い親和性の阻害剤である、図８の化合物４０である。

多数の帯電していないか、または正に帯電した部分、例えば、脂肪酸部分またはポリアルギニン部分のいずれかと、これらの化合物をさらに共役させることによって、上述の化合物、リガンドまたは阻害剤のいかなるものも、高められた膜透過性および細胞に入る優れた能力を有するようにすることができる。例えば、実施例２を参照のこと。したがって、さらに脂肪酸部分またはポリアルギニン部分を含む上述の化合物、リガンドまたは阻害剤のいかなるものも、本発明の範囲内として想定される。

該脂肪酸部分は、好ましくは少なくとも６炭素原子、さらに好ましくは少なくとも８、さらにいっそう好ましくは少なくとも１０、および最も好ましくは１５炭素原子の長さである。該ポリアルギニン部分は、好ましくは少なくとも４つのアルギニン、さらに好ましくは少なくとも６つのアルギニン、および最も好ましくは８つのアルギニンの長さを含む。

該化合物を、例えば該化合物で処理した細胞の顕微鏡写真で（図１０を参照のこと）、または細胞分画で目に見えるようにするために、検出可能な部分を、上述の化合物、リガンドまたは阻害剤のいずれかと有用に共役させることもできる。そのような有用な検出可能な部分の例として、放射活性のある原子（例えば、^３２Ｐ、^１４Ｃ、または^３Ｈ）、対応する結合相手または抗体（例えばビオチン、例えば放射性標識したアビジンで検出可能；ジゴキシゲニン、例えばペルオキシダーゼ標識した抗ジゴキシゲニン抗体で検出可能）、またはフルオレセイン、さらに好ましくはローダミンのような蛍光分子でさらに検出することができるリガンドまたはハプテンが包含される。

活性部位を標的とする成分のホスフェート基をジフルオロホスホネート基で置換することにより阻害剤に変換される場合、同定されるいかなるＰＴＰ１Ｂのリガンドも、肥満またはＩＩ型糖尿病を予防または治療する方法に有用であることが予測されるだろう。肥満を予防または治療する方法は、それぞれ、肥満のリスクがある患者または肥満症の患者に、上述の任意の阻害剤を投与することを含む。ＩＩ型糖尿病を予防または治療する方法は、それぞれ、ＩＩ型糖尿病のリスクがある患者またはＩＩ型糖尿病を有する患者に、上述の任意の阻害剤を投与することを含む。好ましくは、該阻害剤は、薬学上許容可能な賦形剤の中にある。そのような賦形剤は当業界においてよく知られ、所望する投与経路に基づいて一般に選択される（以下を参照のこと）。特に好ましい実施形態では、該阻害剤はリポソームに組み込まれ、それは該阻害剤が細胞膜を通過して細胞内に至る能力を高め、そこでは、ＰＴＰ１Ｂに遭遇し、治療上の利益を提供する可能性がより高いであろう。これらの方法のその他の好ましい実施形態では、該阻害剤は、前に説明したように細胞への侵入を容易化する部分、例えば、脂肪酸部分またはポリアルギニン部分をさらに含む。

投与されるべき阻害剤の投与経路および投与量は、過度に実験をすることなく、標準の用量応答試験と併せて、当業者により決定され得る。それらの決定を下すのに考慮されるべき関連する状況には、治療されるべき病状（単数または複数）、投与されるべき組成物の選択、年齢、体重、および個々の患者の応答、および該患者の症状の重症度が包含される。したがって、病状によって、経口的に、非経口的に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、舌上に、舌下に、頬側に、口腔内に、および経皮で、該阻害剤を該患者に投与することができる。

したがって、過度の実験をしないで、当業界においてよく知られた手段によって、例えば、不活性な希釈剤または食用のキャリアと共に、経口、舌上、舌下、頬側および口腔内投与のために設計される阻害剤組成物を作製することができる。該組成物は、ゼラチンカプセルに内包されてもよいし、錠剤に圧縮されてもよい。経口治療投与の目的では、本発明の医薬組成物は賦形剤に組み込まれ、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウエハース、チューイングガムなどの形態で使用されてもよい。

錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどはまた、結合剤、レシピエント（recipient）、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤および風味剤も含有してもよい。結合剤の幾つかの例には、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンが包含される。賦形剤の例には、デンプンまたは乳糖が包含される。崩壊剤の幾つかの例には、アルギン酸、コーンスターチなどが包含される。潤滑剤の例には、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カリウムが包含される。流動促進剤の一例には、コロイド状二酸化珪素である。甘味剤の幾つかの例には、スクロース、サッカリンなどが包含される。風味剤の例には、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ風味剤などが包含される。これら種々の組成物を調製するのに使用される材料は、使用される量において薬学上純粋であり、非毒性であるべきである。

本発明の阻害剤組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、くも膜下、または皮下注射によるような非経口的投与を容易にすることができる。本発明の阻害剤組成物を溶液または懸濁液に取り込むことにより、非経口投与を達成することができる。そのような溶液または懸濁液は、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒等のような無菌の希釈剤を包含してもよい。非経口の処方は、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン類のような抗菌剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤、およびＥＤＴＡのようなキレート剤を包含してもよい。酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩（ホスフェート）のような緩衝液、塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張調整剤も、添加してもよい。アンプル、使い捨てのシリンジまたはガラス製もしくはプラスチック製の複数用量のバイアル中に、これらの非経口調製物を入れることができる。

直腸投与は、これらの医薬組成物を直腸または大腸に投与することを包含する。座薬または浣腸剤を用いて、これを達成することができる。座薬製剤は、当業界において既知の方法によって容易に作製することができる。例えば、グリセリンを約１２０℃に加熱し、該グリセリンに前記阻害剤を溶解し、この加熱したグリセリンを混合し（その後精製水を加えてもよい）、この熱い混合物を座薬の流し込み型に注ぐことによって、座薬製剤を調製することができる。

経皮投与には、皮膚を介した前記阻害剤の経皮吸収が包含される。経皮製剤には、貼付剤（よく知られたニコチン貼付剤のような）、軟膏、クリーム、ジェル、塗剤（salves：軟膏剤）などが包含される。

本発明は、治療上有効量の前記阻害剤を哺乳類に経鼻的に投与することを包含する。本明細書中で使用する場合、経鼻的に投与すること、すなわち経鼻投与は、患者の鼻孔または鼻腔の粘膜に該阻害剤を投与することを包含する。本明細書中で使用する場合、阻害剤の経鼻投与のための医薬組成物は、例えば、スプレー式点鼻薬、点鼻薬、懸濁剤、ジェル、軟膏、クリームまたは粉末として投与されるべき、よく知られた方法により調製される、治療上有効量の作動薬を包含する。鼻腔用タンポンまたは鼻腔用スポンジを用いて、該阻害剤の投与が行われてもよい。

本発明はまた、ＰＴＰ１Ｂを上述の任意のＰＴＰ１Ｂの阻害剤に接触させることを含む、ＰＴＰ１Ｂの活性を阻害する方法を指向する。好ましい実施形態では、このＰＴＰ１Ｂの阻害剤は、化合物４０（図８）または類似体である。これらの方法のいくつかの実施形態では、該ＰＴＰ１Ｂは生存細胞の中にある。それらの実施形態では、化合物４０Ａ、４０Ｂまたは４０Ｃが特に好ましい。好ましくは、該細胞は生存脊椎動物の中にある。さらに好ましい実施形態では、該脊椎動物は哺乳類である。最も好ましい実施形態では、該脊椎動物はヒトである。

本発明の好ましい実施形態を、以下の実施例において記載する。本明細書中のクレームの範囲内にあるその他の実施形態は、本明細書中に開示されるような本発明の明細書または実施を考慮することから、当業者に明らかであろう。本明細書は実施例と共に、実施例の前の添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲および精神により、例示のみとみなされることが意図される。

［実施例１］新規のコンビナトリアルライブラリおよびスクリーニング法からの、特異的かつ強力なＰＴＰ１Ｂ阻害剤の獲得
ｐＴｙｒ−含有ペプチドによるＰＴＰアーゼの速度論的研究は、高親和性の結合にはｐＴｙｒ（例えば、図１における化合物３の活性部位を標的とする成分）だけでは十分ではなく、ｐＴｙｒを取り囲む残基が効率的な基質認識に寄与することを、以前に示した（１２、１３）。このことは、阻害剤の親和性および選択性を高めるために標的とすることができる活性部位に境を接してサブポケットがあることを示唆している。更に、ＰＴＰアーゼにおけるｐＴｙｒ結合部位は、タンパク質キナーゼ類におけるＡＴＰ部位より明らかに小さい。したがって、ＰＴＰアーゼ阻害剤の設計については、有効性および選択性を得るために、該活性部位の他に、隣接する周辺部位を考慮することが重要である。この実施例は、ＰＴＰ１Ｂにおいて該活性部位および隣接する周辺部位の双方を標的とするように設計された新規のコンビナトリアルライブラリの構築を記載する。また、強力なＰＴＰ１Ｂのリガンドをスクリーニングするのに用いたＥＬＩＳＡを基にした親和性選抜法の開発を記載する。ＰＴＰアーゼのパネルに対して数桁ＰＴＰ１Ｂを優先する程の選択性を示す、極めて強力なＰＴＰ１Ｂの阻害剤が同定される（２．４ｎＭのＫ_ｉ値を持つ）。以下の結果は、ＰＴＰアーゼの阻害についての有効性および選択性を達成することが実行可能であることを実証している。

［材料および方法］
［一般的な手順］
湿気に敏感な反応はすべて、乾燥したＮ_２またはＡｒの加圧のもと、オーブンで乾燥したガラス容器中で行った。湿気に敏感な反応のためのＤＭＡ、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＬＨＭＤＳ、ＣＨ_２Ｃｌ_２およびＴＨＦは、シュア／シール(Sure/Seal（商標）)瓶入りでアルドリッチ(Aldrich)から購入した。反応はすべて、その後にＥ．メルクのシリカゲル６０Ｆ−２５４を用いたＴＬＣを伴った。Ｊ．Ｔ．ベーカーのシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）を用いて、フラッシュカラムクロマトグラフィを行った。ペプチド合成用のＢＯＰ、ＤＩＣ、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ピペリジン、ＰｙＢＯＰ、ＴＦＦＨおよびＴＳＴＵは、アドバンストケムテック(Advanced ChemTech)から購入した。他に指示がない限り、２９９Ｋにて^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）、^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ）、^１９Ｆ−ＮＭＲ（２８２ＭＨｚ）および^３１Ｐ−ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ）によって、ならびにＥＳＩ−ＭＳ解析によって、新しい化合物の構造を特徴付けた。

［ペプチド合成］
Ｆｍｏｃ保護したアミノ酸誘導体（アドバンストケムテックまたはノババイオケム(Novabiochem)）のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＮＭＭ活性化に関する標準のプロトコールを用いて、リンク（Rink）のアミド樹脂（アドバンストケムテック）上で、ペプチド（ビオチン化−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドおよび７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミド）を合成した。ＤＭＦ中の１．５当量のＴＳＴＵおよび４当量のＤＩＰＥＡにより、７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸およびビオチン（アルドリッチ）を活性化した。第３級ブチルとして、ＡｓｐおよびＧｌｕの側鎖を保護し、モノ−ベンジルエステルとして、ｐＴｙｒのホスフェート基を保護した。樹脂に結合したアミンに対して３倍過剰の酸を用いて、１．５時間、ＤＭＦ中でこのカップリング反応を行った。ＤＭＦ中２０％のピペリジンによって、Ｆｍｏｃの除去を行った。水中９５％のＴＦＡおよび２．５％のＴＩＳによって２時間、最終的な開裂および側鎖の脱保護を達成した。ろ過により該樹脂を除き、残った溶液を濃縮した。乾燥（dry：無水）ジエチルエーテルを添加し、沈殿したペプチドを遠心により回収した。該ペプチドを再懸濁させ、エーテルで２回洗浄し、水に溶解して、半調製用の逆相ＨＰＬＣで精製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび分析用ＨＰＬＣで分析すると、ペプチドはすべて高い純度（＞９５％）で得られた。

［ＰＴＰ１Ｂリガンドのライブラリの合成］
Ｆｍｏｃ化学反応を用いて、シスタミン修飾したテンタゲルＳ ＮＨ_２樹脂１上で、該ライブラリを合成した（１４）（図４）。樹脂に結合したシスタミンのアミノ末端に、ｐＴｙｒを結合させた（８ｇ）。ＤＭＦ中３０％のピペリジンで５分間２回処理することによりＦｍｏｃを除いた後、該樹脂をＤＭＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、イソプロパノールおよびエーテルで洗浄し、次いで残りの溶媒を減圧して除いた。次の成分とのカップリングのために、２０ｍＬのポリプロピレンのろ過チューブ（スペルコ(Supelco)）に、２２０ｍｇの量で該樹脂を分配した。Ｆｍｏｃで保護した形態のライブラリにリンカーの多様性要素４〜２５（図３）を組み込んだが（リンカーがない多様性要素２６を除く）、これらは、市販されていたか、または市販のアミノ酸を１：１のＴＨＦ／１０％Ｎａ_２ＣＯ_３中にてＦｍｏｃ−Ｏｓｕで処理することにより調製された。４ｍＬのＤＭＦ中の６当量のアミノ酸、６当量のＰｙＢＯＰ、６当量のＨＯＢｔおよび１２当量のＮＭＭによる２時間の処理１回と１５時間の処理１回とによって、カップリングを達成した。該ライブラリ合成に用いたｐＴｙｒのホスフェート基はモノ−ベンジルエステルとして保護し、ＡｓｐおよびＧｌｕの酸性側鎖はｔ−ブチルエステルとして保護した。ＤＭＦ中３０％のピペリジンで５分間の処理を２回行うことで、Ｎ末端のＦｍｏｃ基を脱保護した。次いで、該樹脂をＤＭＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、イソプロパノールおよびエーテルで洗浄し、残りの溶媒を減圧して除いた。前記末端の多様性要素のカップリングまでの該ライブラリ合成の経過の間、無保護のアミンの置換レベルまたはＦｍｏｃの放出を調べることにより、カップリング工程および脱保護工程をモニターした。次いで、各ろ過チューブからの樹脂を、５．０ｍｇの量で、９６穴合成ブロックの一列中の８ウエル中に分配した。５００ｍＬのＤＭＦ中、６当量の前記酸、６当量のＴＦＦＨ、および１２当量のＤＩＰＥＡを用いた２時間のカップリング１回および１５時間のカップリング１回によって、前記末端の多様性要素Ａ〜Ｈ（図２）を該ライブラリに組み込んだ。フェニルホスフェート基を含有するそれらの酸は、ピリジン中での塩化ホスホリルによる処理を介した対応するフェノールのカルボキシルメチルエステルから調製され（１５）、その後の塩基性の加水分解を行った。２，２’−ビピリジン−４，４’−二酸は、２５％Ｈ_２ＳＯ_４中でのＫＭｎＯ_４による処理によって、４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン（ＧＦＳケミカル(Chemicals)）から調製された（１６）。固相による組み立てが完了する際に、水中の９０％ＴＦＡおよび５％フェノールによる１時間の処理を２回行うことによって、側鎖の脱保護を達成した。次いで、この得られた樹脂３（図１）をＣＨ_２Ｃｌ_２、ＤＭＦ、ＭｅＯＨおよびＨ_２Ｏで更に十分に洗浄し、その後５００ｍＬの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中の１０ｍＭのＤＴＴで３時間処理した。最後に、液相を９６穴のレシーブプレートにろ過し、濃度０．１ｍＭ（各メンバーが完全に変換されたと仮定して）で空間的に分離されたライブラリメンバー３を得た。ＨＰＬＣおよびＭＯＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析で評価して、高収率および高純度（約９０％）にて、同じ手順を用いて、より大規模に幾つかのライブラリメンバーを再合成した。これらのライブラリメンバーには、サブユニットＡと１７（ＭＯＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、計算値［Ｍ］６５３、観測値［Ｍ−Ｈ］⁻６５２．８）とに由来する構造３、およびサブユニットＣと６（ＭＯＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、計算値［Ｍ］６３３、観測値［Ｍ＋Ｈ］^＋６３４．２）とに由来する構造３が包含される。

［精選された高親和性のＰＴＰ１Ｂリガンドの再合成］
最初のＥＬＩＳＡによるスクリーニングの結果に基づいて、該ライブラリの幾つかの高親和性のメンバーを選択し、上記のペプチド合成法に従って、リンクの樹脂上にて、チオールの尾部を持たないそれらの類似体を合成した。これらの化合物を再びこのＥＬＩＳＡ評価に付し、要素２１とＢとを有する最も高い親和性の化合物を、大規模に合成した。
^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：ｄ７．４〜７．２（ｍ，８Ｈ）、４．７６（ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，７．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．６８（ｄｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，９．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．６６（ｓ，２Ｈ）、３．２７（ｄｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１４Ｈｚ，１Ｈ）、３．０４（ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１４Ｈｚ，１Ｈ）、２．９（ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１７Ｈｚ，１Ｈ）、２．７（ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１７Ｈｚ，１Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：ｄ１７５．８、１７４．９、１７４．３、１７２、１５１．２（ｄ）、１５０．９（ｄ）、１３２、１３０．８、１３０．７４、１３０．７２、１２１．０６（ｄ）、１２１．８６（ｄ）、５４、５０、４１、３６、３５；^３１Ｐ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：ｄ−３．０１、−３．０３；ＭＯＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ計算値［Ｍ］５８９、観測値［Ｍ＋Ｈ］^＋５９０。

［ベンジル４−（ブロモメチル）フェニルアセテート（２８）の合成（図５）］
４−（ブロモメチル）フェニル酢酸２７（１．５ｇ、６．５５ミリモル）のＣＨ_２Ｃｌ_２溶液３０ｍＬに、ベンジルアルコール（１０当量、６．８ｍＬ）およびＤＭＡＰ（０．０５当量、４０ｍｇ）を添加した。次いで、この溶液を０℃に冷却し、ＤＩＣ（５２０ｍＬ、０．５当量）を一滴ずつ添加した。室温にて６時間、この混合物を撹拌し、次いでロータリー・エバポレーターで容積を減らした。フラッシュカラムクロマトグラフィにより、白色の固形物２８（１．０ｇ、９６％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ７．４〜７．３（ｍ，７Ｈ）、７．２８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、５．１（ｓ，２Ｈ）、４．５（ｓ，２Ｈ）、３．７（ｓ，２Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ１７１、１３７、１３５、１３４、１３０、１２９、１２８．７、１２８．５、１２８．３、６７、４１、３３。

［ベンジル４−ホルミルフェニルアセテート（２９）の合成（図５）］
テトラフルオロホウ酸銀（１７）（２．３ｇ、１１．８ミリモル）を、乾燥ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解し、ベンジル４−（ブロモメチル）フェニルアセテート２８（３．０ｇ、９．４ミリモル）の乾燥ＤＭＳＯ溶液（１０ｍＬ）をゆっくり添加した。この混合物を室温にて１２時間撹拌し、次いでトリエチルアミン（２ｍＬ）を添加した。この混合物をさらに１５分間保ち、次いでＣＨ_２Ｃｌ_２／水による抽出に付した。ロータリー・エバポレーターにより有機相を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、白色の固形物２９（１．９６ｇ、８２％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ１０．０（ｓ，１Ｈ）、７．８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．３（ｍ，５Ｈ）、５．１（ｓ，２Ｈ）、３．８（ｓ，２Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ１９２、１７０、１４０、１３５．７、１３５．６、１３０．２、１３０．１、１２８．８、１２８．６、１２８．４、６７．４１。

［ベンジル４−［（ジエチルホスホノ）ヒドロキシメチル］フェニルアセテート（３０）の合成（図５）］
−２０℃にて、１０ｍＬのＴＨＦ中の水素化ナトリウム（７７ｍｇ、３．２ミリモル）に、亜リン酸ジエチル（４３０ｍＬ、３．３ミリモル）を一滴ずつ添加した。この溶液を２０分間撹拌した後、ベンジル４−ホルミルフェニルアセテート２９（７５０ｍｇ、３．０ミリモル）のＴＨＦ溶液８ｍＬを添加した。この溶液をさらに３０分間撹拌し、１０ｍＬの５％ＮＨ_４Ｃｌ溶液でこの反応を停止した。１５ｍＬの酢酸エチルで３回、この混合物を抽出し、有機相を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ロータリー・エバポレーターで濃縮した。続いてフラッシュカラムクロマトグラフィを行い、無色の油状物３０（８２０ｍｇ、収率７１％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ７．４（ｄｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，７．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．３〜７．２（ｍ，７Ｈ）、５．１（ｓ，２Ｈ）、５．０（ｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ，１Ｈ）、４．８（ｓ，ｂｒ、１Ｈ）、４．０（ｍ，４Ｈ）、３．６（ｓ，２Ｈ）、１．２３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）、１．１９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ１７１（ｄ）、１３６．９（ｄ）、１３５．８、１３３．６（ｄ）、１２９（ｄ）、１２８．６、１２８．２、１２８．１、１２７（ｄ）、７０（ｄ）、６７、６３（ｍ）、４１、１６（ｄ）；^３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ２２．６。

［ベンジル４−［（ジエチルホスホノ）ジフルオロメチル］フェニルアセテート（３１）の合成（図５）］
ベンジル４−［（ジエチルホスホノ）ヒドロキシメチル］フェニルアセテート３０（１００ｍｇ、０．２６ミリモル）の乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）溶液に、２６０ｍｇの活性化させたＭｎＯ_２（８５％、２．５ミリモル）を一度に添加した。この混合物を２４時間撹拌し、次いで酸で洗浄したシリカゲルを通してろ過した。得られたろ液をロータリー・エバポレーターで留去し、真空下で乾燥して、無色の油状物としてケトホスホネート中間体を得た。さらに精製することなく、該油状物を０℃に冷却し、１ｍＬのＤＡＳＴ（７．５ミリモル）を一滴ずつ添加した。室温にて、この溶液を６時間撹拌し、１０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈した。０℃にて、１５ｍＬの飽和したＮａ_２ＣＯ_３溶液に、得られた溶液をゆっくり添加した。１０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２で３回、この混合物を抽出し、有機層を合わせて、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ロータリー・エバポレーターで濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィで精製して、３１（４５ｍｇ、４３％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ７．５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．４〜７．２（ｍ，７Ｈ）、５．１（ｓ，２Ｈ）、４．２（ｍ，４Ｈ）、３．７（ｓ，２Ｈ）、１．３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ１７０、１３７、１３６、１３２（ｍ）、１２９、１２８．８、１２８．７、１２８．５、１２８．４、１２８．３、１２８．２、１２６（ｍ）、１１５（ｍ）、６７、６５（ｄ）、４１、１６（ｄ）；^３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ７．５（ｔ，Ｊ＝１１６Ｈｚ）。

［４−ホスホノジフルオロメチルフェニル酢酸（３２）の合成（図５）］
氷水浴槽により、ベンジル４−［（ジエチルホスホノ）ジフルオロメチル］フェニルアセテート３１（１２３ｍｇ、０．３ミリモル）を０℃に冷却し、この反応溶液に１ｍＬのＴＭＳＩ（７．０ミリモル）を添加し、その後、室温にて一晩撹拌した。ロータリー・エバポレーターにより、この溶液を油状残渣に濃縮し、１ｍＬのアセトニトリル、１ｍＬの水および０．５ｍＬのＴＦＡの混合溶液にそれを溶解し、２時間撹拌した。次いでこの溶液を乾燥するまでロータリー・エバポレーターで留去し、水に溶解してエーテルで洗浄した。この水溶液にＨＰＬＣ精製を施して、所望の生成物３２（２８ｍｇ、３５％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：ｄ７．６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、３．８（ｓ，２Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：ｄ１７６、１３６（ｄ）、１３３（ｄｔ）、１２９、１２６（ｄｔ）、１２０（ｄｔ）、４０；^３１Ｐ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：ｄ５．４（ｔ，Ｊ＝１０５Ｈｚ）。

［ベンジル（２Ｒ，３Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−（４−ヨードベンジル）−４−モルホリンカルボキシレート（３４）の合成（図６）］
−７８℃にて、ヨードベンジルブロミド３３（１４９ｍｇ、０．５０ミリモル）とラクトン３４（２１３ｍｇ、０．５５ミリモル）とＨＭＰＡ（１．５ｍＬ）とのＴＨＦ（１５ｍｌ）溶液に、ＴＨＦ（５５０ｍＬ、０．５５ミリモル）中１ＭのＬＨＭＤＳを一滴ずつ添加した（１８）。−７８℃にて２時間撹拌した後、この混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ロータリー・エバポレーターにより溶媒を除いた。フラッシュカラムクロマトグラフィにより、所望のアリールヨウ化物３３（２４２ｍｇ、８０％）を得た。２９９Ｋにて、１：２の比率で２つの配座異性体が観測された；^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ［主要な配座異性体］７．７１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．４３〜７．０３（ｍ，１１Ｈ、重複している）、６．８３（ｍ，２Ｈ、重複している）、６．６８〜６．６２（ｍ，２Ｈ、重複している）、６．５３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、５．３５〜５．２５（ｍ，２Ｈ、重複している）、５．２０〜５．０３（ｍ，２Ｈ、重複している）、４．９１（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．５１（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．６３（ｄｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１４Ｈｚ，１Ｈ）、３．４７〜３．３１（ｍ，１Ｈ、重複している）、［副次的な配座異性体］７．６３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．４３〜７．０３（ｍ，１１Ｈ、重複している）、６．８３（ｍ，２Ｈ、重複している）、６．７２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、６．６８〜６．６２（ｍ，２Ｈ、重複している）、５．３５〜５．２５（ｍ，１Ｈ、重複している）、５．２３（ｄｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，６．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．２０〜５．０３（ｍ，３Ｈ、重複している）、４．７１（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．４７〜３．３１（ｍ，２Ｈ、重複している）；ＥＳＩ−ＭＳ計算値［Ｍ］６０３、観測値［Ｍ＋Ｈ］^＋６０４。

［ベンジル（２Ｒ，３Ｓ）−６−オキソ−２，３−ジフェニル−５−［（４−（（ジエチルホスホノ）ジフルオロ−メチル）ベンジル）］−４−モルホリンカルボキシレート（３６）の合成（図６）］
ジエチルブロモジフルオロホスホネート（１．４２ｍＬ、８ミリモル）のＤＭＡ（４ｍＬ）溶液で処理するのに先立って、ＤＭＡ（４ｍＬ）中の亜鉛粉末（５２０ｍｇ、８ミリモル）を１時間超音波処理した（１９）。超音波処理をさらに３時間継続し、次いで臭化第一銅（１．１５ｇ、８ミリモル）を一度に添加した。３０分後、アリールヨウ化物３５（２．４０ｇ、４ミリモル）のＤＭＡ溶液（４ｍＬ）を一滴ずつ添加し、得られた混合物を２４時間撹拌し、ＥｔＯＡｃで希釈し、水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ロータリー・エバポレーターによって溶媒を除去した。フラッシュカラムクロマトグラフィにより、所望のアルキル化ラクトン３６（１．３８ｇ、５２％）を得た。２９９Ｋにて、３：７の比率で２つの配座異性体が観測された。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、２９９Ｋ）：ｄ［主要な配座異性体］７．８２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．６１〜７．２３（ｍ，１１Ｈ、重複している）、７．０１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、６．８３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、６．６８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、５．５５〜５．４３（ｍ，１Ｈ、重複している）、５．３３〜５．１７（ｍ，２Ｈ、重複している）、５．０８（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．６１（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．４３〜４．１９（ｍ，４Ｈ、重複している）、３．９３（ｄｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１４Ｈｚ，１Ｈ）、３．７５〜３．５５（ｍ，１Ｈ、重複している）、１．４４（ｍ，６Ｈ、重複している）、［副次的な配座異性体］７．７５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．６１〜７．２３（ｍ，１３Ｈ、重複している）、６．８８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、６．７８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、５．５５〜５．４３（ｍ，１Ｈ、重複している）、５．４３（ｄｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，６．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．３３〜５．１７（ｍ，２Ｈ、重複している）、４．８５（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．４３〜４．１９（ｍ，４Ｈ、重複している）、３．７５〜３．５５（ｍ，２Ｈ、重複している）、１．４４（ｍ，６Ｈ、重複している）；^１９Ｆ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、２９９Ｋ）：ｄ［主要な配座異性体］−１０８．５８（ｄ，Ｊ＝１１５Ｈｚ）、−１０８．７８（ｄ，Ｊ＝１１５Ｈｚ）、［副次的な配座異性体］−１０８．６７（ｄ，Ｊ＝１１５Ｈｚ）、−１０８．８３（ｄ，Ｊ＝１１５Ｈｚ）；^３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、２９９Ｋ）：ｄ７．２（ｔ，Ｊ＝１１５Ｈｚ）；３７３Ｋでは配座異性体は観測されず；^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、３７３Ｋ）：ｄ７．５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．３〜７．０（ｍ，１１Ｈ）、６．９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、６．６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、５．８（ｓ，１Ｈ）、５．２（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．１（ｄｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，８．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．０（ｓ，２Ｈ）、４．１（ｍ，４Ｈ）、３．５８（ｄｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１４Ｈｚ，１Ｈ）、３．４９（ｄｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１４Ｈｚ，１Ｈ）、１．２５６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）、１．２５０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、３７３Ｋ）ｄ１６７、１５３、１３８、１３５．６、１３５．４、１３４、１２９、１２７．６、１２７．５、１２７．１、１２６．９、１２６．８、１２５．８、１２５．５（ｍ）、１１５（ｍ）、７８、６７、６２（ｄ）、６０、５８、１５（ｄ）；^１９Ｆ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、３７３Ｋ）：ｄ−１０５．９（ｄ，Ｊ＝１１４Ｈｚ）、−１０６．２（ｄ，Ｊ＝１１４Ｈｚ）；^３１Ｐ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、３７３Ｋ）：ｄ６．８（ｔ，Ｊ＝１１４Ｈｚ）；ＥＳＩ−ＭＳ計算値［Ｍ］６６３、観測値［Ｍ＋Ｈ］^＋６６４。

［４−［（ジエチルホスホノ）ジフルオロメチル］−Ｌ−フェニルアラニン（３７）の合成（図６）］
１０％Ｐｄ／Ｃ（２００ｍｇ）のＥｔＯＨ（４ｍＬ）とＴＨＦ（２ｍＬ）との懸濁液に、少量のＭｅＯＨ中のアルキル化ラクトン３６（２０）（４７８ｍｇ、０．７２ミリモル）を加えた。Ｈ_２の雰囲気下で２４時間、この混合物を撹拌し、次いでセライトを通してろ過した。乾燥するまで、ろ液をロータリー・エバポレーターで留去し、エーテルで３回粉砕し、次いで残渣を真空下に置き、所望のアミノ酸３７（２５２ｍｇ、１００％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）：ｄ７．６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ）、４．２（ｍ，５Ｈ）、３．３（ｄｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１４Ｈｚ，１Ｈ）、３．２（ｄｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１４Ｈｚ，１Ｈ）、１．３２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）、１．３２１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）：ｄ１７１、１３９、１３３（ｍ）、１３１、１２８、１１７（ｍ）、６６（ｄ）、５５、３７、１６（ｄ）；^３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）：ｄ７．１（ｔ，Ｊ＝１１８Ｈｚ）。

［Ｎ−ａ−Ｆｍｏｃ−４−（ホスホノジフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン（３８）の合成（図６）］
氷浴槽にて、アミノ酸３７（５３５ｍｇ、１．５ミリモル）とＮａＨＣＯ_３（１２８ｍｇ、１．５ミリモル）との水（５ｍＬ）およびジオキサン（５ｍＬ）溶液を冷却し、次いで少量のジオキサン中のＦｍｏｃ−ＯＳｕ（７２０ｍｇ、２．１ミリモル）で処理した（２０）。室温にて３時間撹拌した後、ＮａＨＣＯ_３（３０ｍＬ）でこの混合物を希釈し、次いでエーテルで洗浄した。水相を６ＮのＨＣｌでｐＨ２に酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出した。この抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、溶媒を除いて、白色固形物（８７０ｍｇ、１００％）としてＦｍｏｃアミノ酸３８を得た。比旋光度［ａ］_Ｄ ^２４＝４４°（クロロホルム中でｃ＝０．１）は、以前報告された値（２０，２１）と一致している。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：ｄ７．９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．７〜７．３（ｍ，１０Ｈ）、４．２〜４．０（ｍ，８Ｈ）、３．１（ｄｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１４Ｈｚ，１Ｈ）、２．９（ｄｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ，１４Ｈｚ，１Ｈ）、１．１８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）、１．１７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ１７３、１５６、１４４、１４２、１３９、１３１（ｍ）、１３０、１２８、１２７、１２６、１２５、１２０、１１５（ｍ）、６７、６５（ｄ）、５４、４７、３８、１６（ｄ）；^１９Ｆ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ−１０９（ｄ，Ｊ＝１１８Ｈｚ）；^３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ７．１（ｔ，Ｊ＝１１８Ｈｚ）。

［ＰＴＰ１Ｂの阻害剤、化合物４０の合成（図８）］
酸のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＮＭＭ活性化のための標準プロトコールを用いて、リンクのアミド樹脂上にて合成を行った。樹脂に結合したアミンに比べて３倍過剰の酸を用いて、ＤＭＦ中にて１．５時間、このカップリング反応を行った。このリンクのアミド樹脂に、完全に保護されたＦｍｏｃアミノ酸３８と、Ｆｍｏｃで保護したＡｓｐ（側鎖は第３級ブチルで保護されている）と、無保護の酸３２とを順にカップリングさせた。各カップリングの後、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンでＦｍｏｃの除去を達成した。５％ＥＤＴおよび１％ｍ−クレゾールを伴ったＴＦＡ中１ＭのＴＭＳＢｒ−チオアニソールによる、０℃での５時間および次いで室温での１６時間の処理によって、最終の開裂および側鎖の脱保護を達成した。ろ過により該樹脂を除き、残りの溶液を濃縮した。残渣をエーテルで粉砕し、水に溶解し、半調製用の逆相ＨＰＬＣにより精製して、所望の化合物４０を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：ｄ７．６（ｍ，４Ｈ）、７．４（ｍ，４Ｈ）、４．７（ｍ，２Ｈ）、３．７（ｓ，２Ｈ）、３．３（ｄｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１４Ｈｚ，１Ｈ）、３．１（ｄｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１４Ｈｚ，１Ｈ）、２．９（ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１７Ｈｚ，１Ｈ）、２．７（ｄｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１７Ｈｚ，１Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：ｄ１７５、１７４．５、１７４．４、１７２、１３９、１３７、１３３（ｍ）、１２９．６９、１２９．６３、１２６（ｍ）、１１５（ｍ）、５４、５０、４２、３７、３５；^１９Ｆ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：ｄ−１０８．５８（ｄ，Ｊ＝１０５Ｈｚ）、−１０８．６６（ｄ，Ｊ＝１０５Ｈｚ）；^３１Ｐ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：ｄ５．３６（ｔ，Ｊ＝１０５Ｈｚ）、５．３５（ｔ，Ｊ＝１０５Ｈｚ）；ＥＳＩ−ＭＳ計算値［Ｍ］６５７、観測値［Ｍ−Ｈ］⁻６５６、［Ｍ＋Ｈ］^＋６５８。

［ｐＧｅＸ−ＫＧへのＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓのサブクローニング］
ヒトの胎児の脳のｃＤＮＡライブラリ（ストラタジーン(Stratagene)）のＰＣＲを用いて、ヒトＰＴＰ１Ｂ（アミノ酸１〜３２１）の触媒ドメインをコードするｃＤＮＡを得た。用いたＰＣＲのプライマーは、５’−ＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＴＴ（ＢａｍＨＩ部位およびＮｄｅＩ部位の双方をコードする）および３’−ＡＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＴＴＣＧ（ＥｃｏＲＩ部位をコードする）であった。このＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとで消化し、ｐＵＣ１１８ベクター中へとサブクローニングした。Ｃｙｓ２１５をＳｅｒに変換するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧ−３’であり、ここで下線を施された塩基が、天然のヌクレオチドからの塩基の変化を示した。ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓ突然変異体のコード領域を、ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩとによってｐＵＣ１１８−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓから切り出し、プラスミドｐＴ７−７（２２）の相当する部位に連結した。制限酵素ＮｄｅＩにより、ｐＴ７−７／ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５ＳからＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓのコード領域を開裂させ、それに続いてＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理して、平滑末端を持つ分子を生成させた。この線状化したＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩで再び消化した。制限酵素ＳｍａＩ（平滑末端）およびＥｃｏＲＩ（付着末端）によって、ベクターｐＧＥＸ−ＫＧを開裂させた。ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓの遺伝子を含有するｐＴ７−７／ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５ＳのＮｄｅＩ（平滑）〜ＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片、およびアンピシリン耐性をコードするｐＧＥＸ−ＫＧのＳｍａＩ（平滑）〜ＥｃｏＲＩの断片を単離し、一緒に連結した。

［ＧＳＴ−ＰＴＰ１ＢおよびＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓのタンパク質の発現および精製］
ｐＧＥＸ−ＫＧ／ＰＴＰ１Ｂ（またはＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓ）を用いて、常法によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させた。単一のコロニーを選択し、１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１０ｍＬの２ｘＹＴ培地で、３７℃にて振盪しながら一晩増殖させた。１０ｍＬの一晩培養を、１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１リットルの２ｘＹＴ培地に移し、６００ｎｍでの吸収が０．６〜０．８になるまで、３７℃にて振盪した。最終濃度０．２ｍＭまでイソプロピル−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドを添加したのに続いて、３７℃にてさらに４時間、振盪しながら該培養をインキュベートした。５，０００ｒｐｍにて５分間遠心することによって細胞を回収し、１ｍＭのジチオスレイトールと１％トリトンＸ−１００を含む３０ｍＬのＰＢＳ緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４）中に、バクテリア細胞のペレットを再懸濁させた。１２００ｐ．ｓ．ｉ．にて２回、フレンチ圧力細胞プレス(French pressure cell press)を通すことによって該細胞を溶解した。１５，０００ｒｐｍにて３０分間の遠心によって細胞の残骸を除き、上清を５０ｍＬの円錐型試験管に移し、ＰＢＳ緩衝液で平衡化した２ｍＬのグルタチオン−セファロース４Ｂ（アマシャムファルマシアバイオテック(Amersham Pharmacia Biotech)）の５０％スラリーをそこに添加した。緩やかに撹拌しながら４℃にて１時間インキュベートした後、マトリクスをカラムに移し、１ｍＭのジチオスレイトールと０．１％トリトンＸ−１００とを含む総容積の１０倍のＰＢＳ緩衝液、および総容積の５倍の５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）と１ｍＭのジチオスレイトールとで洗浄した。室温にて該カラムを１０分間静置した後、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中の総容積と同量の１０ｍＭの還元グルタチオンを添加することにより、この融合タンパク質を溶出させた。この溶出工程と回収工程とを５回繰り返した。この溶出液をプールし、セントリプレップ−３０ろ過ユニット（アミコン(Amicon)）により濃縮し、５０ｍＭの３’，３’−ジメチルグルタレート、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオスレイトールおよびＩ＝０．１５Ｍを含有するｐＨ７．０の緩衝液に変更した。この精製したタンパク質を、３０％グリセロールにして−２０℃にて保存した。

［その他の組換えＰＴＰアーゼ］
前に記載したように、ＰＴＰ１Ｂ（残基１〜３２１）（２２）、イェルシニアＰＴＰアーゼ（２３）、Ｓｔｐ１（２４）、ＶＨＲ（２５）およびＭＫＰ３（２６）を大腸菌中で発現させ、精製した。ヒトＴ細胞のＰＴＰアーゼ（ＴＣＰＴＰ）の触媒ドメイン（アミノ酸残基１〜２８８）のコード配列は、ハリー・シャルボノー博士(Dr. Harry Charbonneau)によって供与され、記載されたようにＴＣＰＴＰを発現させ、精製した（２７）。組換えＨｅＰＴＰならびにＳＨＰ１およびＳＨＰ２の触媒ドメインを（Ｈｉｓ）_６融合タンパク質として発現させ、精製した。組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として、ＰＴＰａ、ＬＡＲおよびＣＤ４５の触媒ドメインを発現させ、精製した（２８）。ＰＴＰアーゼドメインを両方含有するＰＴＰａ、ＬＡＲおよびＣＤ４５の細胞内断片を、トロンビンを用いて、記載された融合タンパク質から開裂された。

［ＥＬＩＳＡを基にしたＰＴＰ１Ｂリガンドのスクリーニング法］
ニュートルアビジンをコーティングした９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに、５０ｍＭの３，３−ジメチルグルタレート、ｐＨ７．０、Ｉ＝０．１５Ｍ（ＤＭＧ緩衝液）中の１０ｎＭのビオチン化カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドを１００μＬ添加した。４℃にて一晩インキュベートした後、該ＤＭＧ緩衝液（各２００μＬ）で３回、該プレートをすすいだ。２％のＢＳＡと０．２％のＴｗｅｅｎ２０とを含有するＤＭＧ緩衝液溶液１００μＬで各ウエルをブロックし、室温にて２時間振盪した。次いで、０．２％のＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０とを含有するＤＭＧ緩衝液（ｐＨ７．０）（ＢＳＡ−Ｔ−ＤＭＧ）溶液２００μＬで、これらのウエルを４回すすいだ。別個のコーティングしていない９６穴プレートの各ウエルにて、６０μＬのライブラリ成分溶液（ＢＳＡ−Ｔ−ＤＭＧ中で５００ｎＭ）および６０μＬのＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓ融合タンパク質溶液（ＢＳＡ−Ｔ−ＤＭＧ中で０．４ｎＭ）を混合し、室温で１時間インキュベートした。次いで、この混合物１００μＬを、ブロックした、ビオチン化カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミド処理した９６穴プレートの各ウエルに添加し、室温にて２時間、該プレートを振盪した。２００μＬのＢＳＡ−Ｔ−ＤＭＧで、これらのウエルを４回すすいだ。次いで、ポリクローナルのウサギ抗ＧＳＴ抗体（１００μＬ、ＢＳＡ−Ｔ−ＤＭＧ中で１００ｎｇ／ｍＬ）を各ウエルに加え、室温で１時間振盪した（または、４℃にて一晩インキュベートした）。２００μＬのＢＳＡ−Ｔ−ＤＭＧ溶液で４回、これらのウエルを洗浄した。これらのウエルに残されたＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓの量を検出するために、西洋ワサビのペルオキシダーゼを結合したマウス抗ウサギ抗体（１００μＬ、ＢＳＡ−Ｔ−ＤＭＧ中で２００ｎｇ／ｍＬ）を各ウエルに加え、室温で１時間振盪した。２００μＬのＢＳＡ−Ｔ−ＤＭＧで４回、これらのウエルをすすぎ、次いで３００ｍＬのＤＭＧ緩衝液で２回すすいだ。１００μＬのペルオキシダーゼ基質（ＩステップターボＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、トリメチルベンジジン）を各ウエルに加え、５〜３０分間インキュベートした。このペルオキシダーゼの反応を停止するために、１００μＬの１Ｍ硫酸溶液を各ウエルに添加し、スペクトラマックス(SpectraMax)３４０プレートリーダーにより４５０ｎｍにてその吸収を測定した。

［Ｋ_ｄ値の決定］
クマリン標識されたｐＴｙｒを含有するペプチド７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドは、高度に蛍光を発し、ＰＴＰ１Ｂ結合に際して蛍光において有意な変化を示さない。したがって、前述したように（１４）、平衡透析を介して７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドペプチドのＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓへの結合に関するＫ_ｄ値を決定した。測定はすべて、５０ｍＭの３，３−ジメチルグルタレート（ｐＨ７．０、Ｉ＝０．１５Ｍ）緩衝液中で４℃にて行った。簡単に言えば、１００ｎＭのＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓおよび１００ｎＭの７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドを含有するスライドＡライザー透析スライドカセット（ピアース、分子量１０ｋＤａで切断、許容量０．１〜０．５ｍＬ）を用いた。同一緩衝液中の１００ｎＭの７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミド１００ｍＬを含有するビーカー中にこれらのカセット（最終容量４００μＬ）を置いた。結果として、この透析実験を行っている間に亘って（１６時間）、ＰＴＰ１Ｂに結合していないペプチドの濃度は、この透析スライドカセット内で一定に保たれた。このスライドカセット内の溶液と該ビーカー内の溶液との間の蛍光の差異を決定した。このクマリンペプチドの励起波長は３２５ｎｍであり、４６０ｎｍにてその放射をモニターした。Ｋ_ｄ値は方程式１から算出された：
Ｋ_ｐ＝（［Ｅ］−［Ｅ・Ｐ］）［Ｐ］／［Ｅ・Ｐ］ （方程式１）
式中、Ｋｐ＝ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓに対する７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドのＫ_ｄ、［Ｅ］＝ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓの総濃度、［Ｐ］＝７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドの総濃度、および［Ｅ・Ｐ］＝ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓに結合した７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドの濃度。

競合に基づいたアッセイを用いて、ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓへの非蛍光化合物２１Ｂの結合に関するＫ_ｄ値を決定した。これらのカセット（最終容量４００μＬ）は、３９０ｎＭのＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓ、２４８ｎＭの非蛍光高親和性ＰＴＰ１Ｂリガンド２１Ｂ、および３．９７μＭの７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドを含有した。２４８ｎＭの非蛍光高親和性ＰＴＰ１Ｂリガンド２１Ｂおよび３．９７μＭの７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドの１００ｍＬを含有するビーカーに、これらのカセットを置いた。方程式２（１４）を用い、クマリン誘導体の競合置換によって、化合物２１Ｂに関するＫ_ｄ値が得られた：
Ｋ_Ｌ＝Ｋ_ｐ［Ｌ］［Ｅ・Ｐ］／［Ｐ］／｛［Ｅ］−Ｋ_ｐ（［Ｅ・Ｐ］／［Ｐ］）−［Ｅ・Ｐ］｝ （方程式２）
式中、Ｋ_Ｌ＝ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓに対する２１ＢのＫ_ｄ、Ｋ_ｐ＝ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓに対する７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドのＫ_ｄ、［Ｅ］＝ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓの総濃度、［Ｐ］＝７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドの総濃度、［Ｌ］＝２１Ｂの総濃度、および［Ｅ・Ｐ］＝ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓに結合した７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−アミドの濃度。

［阻害定数（Ｋ_ｉ）およびＩＣ_５０値の決定］
ＮａＣｌの添加によりイオン強度を０．１５Ｍに調整した、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する５０ｍＭの３，３−ジメチルグルタレート緩衝液（ｐＨ７．０）中、２５℃にてｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を基質として用いて、ＰＴＰアーゼの活性をアッセイした。種々の濃度のｐＮＰＰを含有する反応混合物（０．２ｍＬ）にこの酵素を添加することにより該反応を開始し、２、３分後、５ＮのＮａＯＨ０．０５ｍＬを添加することにより停止させた。用いた基質濃度の範囲は０．２〜５Ｋ_ｍであった。酵素を添加せずに対照を測定することにより、該基質の非酵素的加水分解を補正した。反応停止後、１８，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１のモル励起係数を用いたスペクトラＭＡＸ３４０マイクロプレート用分光光度計（モレキュラーデバイス(Molecular Devices)）により検出された４０５ｎｍでの吸収から、生成物であるｐ−ニトロフェノールの量を決定した。非線形回帰プログラムＫｉｎｅｔＡｓｙｓｔ（ペンシルベニア州、州立大学、Intellikinetics）を用いて、ミカエリス・メンテン式に、基質濃度のデータに対する速度を直接当てはめることから、ミカエリス・メンテンの動態パラメータを決定した。以下の方式で、ＰＴＰ１ＢおよびＴＣＰＴＰに対するＰＴＰアーゼ阻害剤の阻害定数を決定した。８つの異なった基質濃度（０．２Ｋ_ｍ〜５Ｋ_ｍ）での初速を、３つの異なって固定した阻害剤濃度にて測定した（１５）。曲線の直接当てはめのプログラム、ＫＩＮＥＴＡＳＹＳＴ（ペンシルベニア州、州立大学、Intellikinetics）を用いて阻害定数を得て、阻害パターンを評価した。２ｍＭのｐＮＰＰ濃度にて、種々のホスファターゼに対するＩＣ_５０値を決定した。

［結果および考察］
序論で述べたように、生化学的検討および遺伝子的検討により、ＰＴＰ１Ｂはインスリン感受性および燃料代謝の主要な調節因子であることが示唆されている。したがって、ＰＴＰ１Ｂは、ＩＩ型糖尿病および肥満の治療について潜在的な治療上の標的を代表している。その結果、ＰＴＰ１Ｂを阻害するように設計された小分子は、医薬剤として期待できるだけでなく、正常な細胞プロセスに関与する特異的な細胞内経路においてＰＴＰ１Ｂの役割を解明するためのプローブとして機能する可能性もあるであろう。しかしながら、大きな懸念の１つは、活性部位（すなわち、ｐＴｙｒ結合部位）が多数のＰＴＰアーゼの間で高度に保存されているので、１つのＰＴＰアーゼを選択的に標的とする阻害剤を得る可能性が極めて低いと思われることである。にもかかわらず、ＰＴＰアーゼ阻害剤の設計に対する最も有効なアプローチは、該活性部位を標的としている。

ｐＴｙｒを含有するペプチドによる速度論的検討は、ＰＴＰアーゼによる高親和性の結合にはｐＴｙｒだけでは不十分であり、ｐＴｙｒを取り囲む残基が十分な基質認識に寄与することを示した（１３、２９、３０）。このことは、阻害剤の親和性および選択性を高めるように狙うことができる、活性部位に境を接するサブポケットがあることを示唆している。さらに、活性部位の特異性の検討は、異なった官能基を持つ各種アリールホスフェートを、触媒的／ｐＴｙｒ結合ポケットの内部に収容することができるように、ＰＴＰアーゼの活性部位が十分な可塑性を有することを示している（１５、３１）。我々は、非ペプチド性のアリールホスフェートはｐＴｙｒを含有するペプチドには一般にはるかに劣る基質であるが、適宜官能化した芳香族ホスフェートは低いμＭの範囲でＫ_ｍ値を示すことができ、この酵素について報告されている（３１）最良のペプチド基質と同じくらい効率的にＰＴＰ１Ｂにより加水分解されることを見い出した。例えば、ビス−（パラ−ホスホフェニル）メタン（ＢＰＰＭ）は、ＰＴＰ１Ｂについて同定された最も良い低分子量の非ペプチド性基質の１つである（ｋ_ｃａｔ＝６．９ｓ^−１、Ｋ_ｍ＝１６μＭ）。

ＢＰＰＭと錯体形成したＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓの結晶構造は、予想どおり、ＢＰＰＭが活性部位にて結合することを示し、ｐＴｙｒに比べて高いＢＰＰＭの親和性に対する構造的説明を提供した（２２）。まったく予期に反したことに、該結晶構造は、該活性部位に隣接して位置する第２のアリールホスフェート結合部位の存在を明らかにした。この第２の部位は、ＰＴＰアーゼの間で保存されていない領域内に位置する。結果として、この予期しなかった観測は、強力かつ特異的なＰＴＰ１Ｂ阻害剤の設計に対する代替的パラダイム、すなわち、該活性部位と固有の隣接周辺部位との双方に結合する二座リガンドを示唆した。該第２のアリールホスフェート結合ポケットに加えて、阻害剤の設計には、該活性部位の局所近傍内に位置するその他のサブ部位も徴集してもよい。例えば、ｐＴｙｒを含有するペプチドと錯体形成したＰＴＰアーゼの構造およびＰＴＰアーゼの配列配置は、ａ１〜ｂ１ループ、ｂ５〜ｂ６ループ、ａ５〜ａ６ループおよびＷＰＤループが、基質の特異性に寄与することがある可変残基を含有することを示唆した。したがって、ＰＴＰアーゼファミリーの個々のメンバーに対する強力かつＰＴＰアーゼ選択的な阻害剤を開発する我々の戦略は、該活性部位および近傍にある固有の非触媒部位を別々に標的とする２つ小さなリガンドを一緒につなぐことである。二座阻害剤の高められた親和性に対する理論的根拠は、結合の自由エネルギーの相加性の原理に基づく。その他のＰＴＰアーゼは同一の第２の部位との相互作用を持たないことがあるので、１つのＰＴＰアーゼにおける阻害剤と２つの別々の部位（例えば、ｐＴｙｒ部位および固有の周辺部位）との相互作用は、非常に強い特異性を与えることが期待されるであろう。以下において、我々は、ＰＴＰ１Ｂ上で該活性部位と固有の第２の部位との双方を同時に占有することができる極めて強力かつ選択性の高いＰＴＰ１Ｂ阻害剤の同定のためのコンビナトリアル的アプローチを記載する。

［ライブラリの設計および構築］
一方がｐＴｙｒを結合する触媒部位を標的とし、他方がＰＴＰ１Ｂにおいて隣接する固有の非触媒部位を標的とする、２つの連結したモチーフを含有するように、我々の第一世代のライブラリを設計した。加水分解可能ではないホスホネート類似体（下記参照）の調製に関連する合成上の必要事項が要求されるので、我々は、合成的に入手しやすいホスフェート系誘導体のライブラリを調製することが賢明であると感じた。後者からの高親和性の手がかり（リード）がいったん同定されると、次いでこのホスフェート部分をジフルオロホスホネート基で置換することにより、それを阻害剤に変換することができる。ｐＴｙｒはＰＴＰアーゼの活性部位に対する規範的なリガンドなので、ライブラリメンバーを該活性部位に向けるために我々は、ｐＴｙｒで該ライブラリを構造的に偏向させることに決めた。該活性部位から移した結合相互作用に近づくために、構造的に異なるアリール酸（Ａ〜Ｈ）（図２）の小さな一団を選択し、ｐＴｙｒに連結した。これらのアリール酸には、３つのフェニルホスフェート含有種（Ａ〜Ｃ）、３つのフェノール含有種（Ｄ〜Ｆ）、および２つの追加の芳香族種（Ｇ〜Ｈ）が包含される。この一団のアリール酸のメンバーは、別々に、直接（２６）、または２２の異なったアミノ酸（４〜２５）（図３）を介してｐＴｙｒに連結されるが、９つの直鎖脂肪族種（４〜１０、１５、２３）、１１の環を含有する種（１１〜１４、１６〜２０、２４〜２５）、および２つの天然の酸性アミノ酸（２１〜２２）が包含される。リンカーとしての疎水性アミノ酸および荷電アミノ酸の包含が、追加の相互作用を潜在的に提供して、ＰＴＰ１Ｂの結合を高める。確立されたアプローチ（材料および方法、ならびにその中の引用文献を参照のこと）を用いて、これらの構造物を用いて、固相並行合成（図４、スキームＩ）により、我々は、１８４種のメンバー［（ｐＴｙｒ）１×（リンカー）２３×（多様性要素）８］の合成ライブラリを構築した。

Ｆｍｏｃ化学反応（１４）を用いて、ジスルフィド修飾したテンタゲルＳ ＮＨ_２樹脂１上で該ライブラリを合成した。ペプチドと該テンタゲル樹脂との間のジスルフィド結合は、Ｆｍｏｃに基づいた固相のペプチド合成の条件に対して安定である。さらに、このジスルフィド部分は、ＰＴＰ１Ｂ用のＥＬＩＳＡ系スクリーニング（以下を参照のこと）を含む標準の酵素アッセイに適合する条件（すなわち、緩衝液中のＤＴＴ）によって、本質的に定量的な収率で開裂される。出発構築ブロックとしてのシスタミンのアミン末端に、ｐＴｙｒを結合した。次いで、これらのリンカー４〜２６を別々にカップリングするために、該樹脂を等量の部分に分割した。各リンカーに基づいた反応からの樹脂を、９６穴マイクロプレートの単一列の８ウエルに、５．０ｍｇの量で引き続いて分配した。次いで、これらの末端の多様性要素Ａ〜Ｈを、該ライブラリに組み込んだ。樹脂に連結された得られたライブラリメンバー２を更に十分に洗浄し、次いで引き続き、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）５００ｍＬ中の１０ｍＭのＤＴＴで３時間開裂させた。液相を９６穴のレシーブプレートに真空ろ過し、濃度０．１ｍＭ（各メンバーが完全に変換されたと仮定して）で、３の空間的に分離されたライブラリを得た。ＨＰＬＣおよびＭＯＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析で評価して、高収率および高純度（約９０％）にて、同じ手順を用いてより大規模に幾つかのライブラリメンバーを再合成した。

［アッセイの開発］
この合成ライブラリのメンバーはアリールホスフェートなので、潜在的にＰＴＰアーゼの基質として役目を果たす可能性がある。ホスファターゼ活性に基づいたアッセイにより、有効なＰＴＰアーゼ基質を同定することができる（１３、３１）。しかしながら、最も高いｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値を特徴とする最も有効な基質は、必ずしもこの酵素に対する最も高い親和性を有するわけではない。我々の目標は、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤としての加水分解可能ではない類似体に引き続き変換することができる高親和性のＰＴＰ１Ｂ結合リガンドを同定することであった。したがって、我々は、化合物の適当なサイズのライブラリの高処理能力スクリーニングに採用しやすい親和性に基づいたアッセイを必要としていた。この目的で、我々は、ＰＴＰ１Ｂによるライブラリメンバーのホスフェートの加水分解を回避する高親和性のＰＴＰ１Ｂの基質をスクリーニングするために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発した。このアッセイは、野生型の結合親和性を保持する、触媒的に不全な突然変異体のＰＴＰ１Ｂの使用を必要とする。我々は以前、活性部位Ｃｙｓ〜ＳｅｒのＰＴＰアーゼ突然変異体が測定可能なホスファターゼ活性を有さず（３２）、ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓ突然変異体が野生型酵素と同様の、基質に対する親和性を示すこと（３３）を示している。我々はまた、六量体のｐＴｙｒを含有するペプチドＤＡＤＥｐＹＬ−アミドが、高親和性のＰＴＰ１Ｂの基質であることも示している（３０、３３）。我々は、ビオチン化−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２ペプチドを調製したが、それは、野生型ＰＴＰ１Ｂと共にＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２ペプチドについて報告されている動態パラメータと同様の動態パラメータを示す（データは示さず）ことを見出した。したがって、このアッセイでは、ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓへの結合に対してビオチン化ホスホペプチドと競合するそれらの能力によって、これらのライブラリメンバーの結合親和性を評価した。

ＥＬＩＳＡ系アッセイ（詳細については、材料および方法を参照のこと）では、１０ｎＭのビオチン化−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２ペプチドでまず、ニュートルアビジン（またはストレプトアビジン）をコーティングした９６穴マイクロタイタープレートを処理した。次いで、２％のＢＳＡと０．２％のＴｗｅｅｎ２０とを含有する溶液でこのプレートをブロックし、緩衝液溶液ですすいだ。それに続いて、ＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓ（０．２ｎＭ）と共に個々にインキュベートした前記合成ライブラリ（２５０ｎＭ）のメンバーを、ビオチン化−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２ペプチドで処理したこのプレートの各ウエルに導入した。更に十分な洗浄工程の後、ポリクローナルウサギ抗ＧＳＴ一次抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合マウス抗ウサギＩｇＧ二次抗体によって、このビオチン化ペプチドに結合したＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓの量を検出した。

ＥＬＩＳＡ系アッセイに関しては、注意すべき要点が幾つかある。第１に、対照リガンド（ビオチン化ＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２）はＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓの活性部位に結合することが判っているので（７）、ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓから該対照リガンドを置き換える化合物も、十中八九同様に該活性部位に結合する。第２に、触媒的に不活性のＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓは、野生型酵素と同等の有効性でリガンドに結合するので、このアッセイは、これらのライブラリメンバーのＰＴＰ１Ｂ結合能力の真の評価を提供する。第３に、変異していない活性部位のＣｙｓ残基は、ＰＴＰアーゼの触媒活性に必須であることが知られている（８）。その結果、ＰＴＰアーゼは、酸化剤およびアルキル化化合物によって不活化される傾向がある。このことは、ＰＴＰアーゼ活性を低下させるこれらの化合物の能力に基づいてヒットが同定される、ＰＴＰアーゼ活性に基づいた阻害剤のスクリーニングのプロジェクトにとって深刻な問題を提示してきた。活性部位ＣｙｓのＳｅｒによる置換（例えば、ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓ）は、突然変異体のＰＴＰアーゼを、酸化やアルキル化に対して反応しにくくするので、ホスファターゼ活性を破壊する活性部位Ｃｙｓとの相互作用による「偽」陽性はたぶん除かれるだろう。最後に、該アッセイがＥＬＩＳＡに基づいているので、高処理能力ＰＴＰアーゼ阻害剤の発見のために容易にそれを実施することができる。

［高親和性のＰＴＰ１Ｂ基質の同定］
このＥＬＩＳＡ系スクリーニングのプロトコールは、２５０ｎＭの濃度で固定したライブラリメンバーを使用し、二連一組で行った。この親和性に基づいたスクリーニングによって、我々は、ビオチン化ＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２ペプチドからＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓを効果的に置き換える幾つかのリード化合物を同定することができた。図７にグラフで描かれた結果から、幾つかの要点が明らかである。第１に、天然のアミノ酸１１、１３、２１、２２および２４は、最も効果的なリンカーとして役目を果たす。例えば、Ａｓｐを含有するライブラリメンバー（図７Ｃにおける２１Ａ〜２１Ｈ）は、すべて有意な阻害有効性を示している。興味深いことに、これらのリードリンカーは、疎水性残基（１１、１３、２４）と負に荷電した残基（１３、２１、２２）の混合物である。このリンカーの位置は、活性部位に向いたＰＴＰアーゼペプチド／タンパク質基質におけるＰ−１位（すなわち、ｐＴｙｒのアミノ側）と等しい。我々は以前、ＰＴＰ１Ｂが、疎水性残基または負に荷電した残基を該Ｐ−１部位に収容できるような、異なった構造変化を受けることを明らかにした（９）。第２に、最も効果的なＰＴＰ１Ｂリガンドの内の２つ（２１Ｂおよび２４Ｂ）は、同一のＮ−末端要素、リン酸化されたフェニル酢酸部分Ｂを含有する。最後に、単一のメチレン基だけが異なる密接に関係した要素（ＡおよびＣ）がリードＢより効果が低いという事実を考えると、ＰＴＰ１Ｂは、該Ｎ−末端要素の構造的性質に明らかに非常に敏感である。

ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓに対するこれら化合物の親和性のさらに正確な評価を得るために、我々は、対照として３９（図８）を用いて、リード化合物（２１Ｂおよび２４Ｂ）のＩＣ_５０値（４５０ｎｍでのＥＬＩＳＡの読み取りの５０％を阻止する化合物の濃度）を測定した。比較のために、我々は、ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓからのビオチン化ＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２を置き換えることにおいて２１Ｂおよび２４Ｂよりも効果的ではなかった化合物４Ａおよび４Ｂ（図７）のＩＣ_５０値も測定した。これらのライブラリ化合物におけるチオール尾部の酸化の可能性に関係する問題の潜在性を回避するために、我々は、該チオール尾部のない化合物４Ａ、２１Ｂおよび２４Ｂを再合成した。表１は、対照化合物３９のそれと比べた試験化合物のＩＣ_５０値の比を記載している。３９は、１ｍＭのＫ_ｉ値を持つ、ＰＴＰ１Ｂの確立された競合阻害剤なので（２８）、このＩＣ_５０の比は、ＰＴＰ１Ｂ（ｍＭの単位で）に対するこれらの試験化合物の真の親和性を反映するはずである。表１から判るように、これらの化合物におけるチオール尾部の存在は、ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓに対するこれら化合物の親和性には影響を与えない。化合物２１Ｂおよび２４Ｂは、３９のそれよりも有意に高い結合親和性を示すと結論付けることができる。さらに、化合物２１Ｂおよび２４Ｂはまた、４Ａおよび４Ｂのそれよりも、ＰＴＰ１Ｂに対する高い親和性を示すということは、単一の化合物の濃度（２５０ｎｍ）で得られたＥＬＩＳＡの結果（図７）と一致する。最後に、ＰＴＰ１Ｂは、Ｔｙｒ（２４）およびＡｓｐ（２１）の双方を前記Ｐ−１位に収容することができるが（９、１３）、前記末端要素Ｂの関連では、リンカーＡｓｐ（２１）の方が、Ｔｙｒ（２４）よりもやや好ましいと思われる。

［Ｋ_ｄ値の決定］
７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２ペプチドにおけるＮ末端に付加されたクマリン部分に関係する固有の蛍光は、ＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓの存在下で有意に変化しなかった。この特性によって、我々は、スライド−Ａ−ライザーカセット（材料および方法を参照のこと）を用い、平衡透析を介してこのクマリン誘導体に関する解離定数を決定することができた。ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓへの７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２の結合に関するＫ_ｄ値は、ｐＨ７．０および４℃にて４２０±２０ｎＭである。これは、ｐＨ７．０および２５℃にて等温滴定熱量測定により決定されたＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓに対するＡｃ−ＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２の結合に関するＫ_ｄ値（８００±１００ｎＭ）に似ている。同じ手順を用いて、この透析実験において、７−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−ＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２ペプチドを置き換えるその能力から、リード化合物２１Ｂに関するＫ_ｄ値を決定することができる。平衡透析により得られた化合物２１Ｂに関するＫ_ｄ値は３２±５ｎＭであり、それは該ＥＬＩＳＡアッセイにより決定された親和性（表１、〜３０ｎＭ）に一致している。

［２１Ｂの加水分解できない誘導体である化合物４０の獲得］
上記のように、我々は、１８４メンバーの空間的に分離したライブラリから、最も強力なＰＴＰ１Ｂ結合リガンドとして、要素２１Ｂを有する化合物を同定した。次に、我々は、２１Ｂの加水分解できない類似体が、強力でかつ選択的なＰＴＰ１Ｂ阻害剤として役立つことができるかどうかを評価した。Burkeおよびその共同研究者らは、ＰＴＰアーゼの基質においてアリールホスフェート基を加水分解に耐性のジフルオロホスホネート部分で置き換え、有効なＰＴＰアーゼ阻害剤を生産することができることを示した（３４、３５）。例えば、ヘキサペプチドＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２において、ホスホノジフルオロメチルフェニルアラニン（Ｆ_２Ｐｍｐ）がｐＴｙｒに取って代わると、Ｆ_２Ｐｍｐ（ＰＴＰ１Ｂに対して２００ｎＭ）を持つ得られたペプチドに関するＫ_ｉは、ホスホノメチルフェニルアラニン（Ｐｍｐ）を含有する同じペプチドよりも１０００倍以上強力である（３３、３４、３６）。これは、これらのフッ素原子とＰＴＰ１Ｂの活性部位の残基との間での直接的な相互作用によるものと考えられてきた（３６）。したがって、我々は、２１Ｂにおけるエステル酸素をこのジフルオロメチレン基で置き換えることを決定した。

ジフルオロホスホネートを含有する誘導体３２および３８を用い、固相合成によって、高親和性のホスホモノエステル（２１Ｂ）の、対応する加水分解できない類似体（図８、４０）を調製した。スキームＩＩ（図５）で概説したように、４−（ブロモメチル）フェニル酢酸から、Ｂのこの加水分解に耐性のジフルオロホスホネート類似体（３２）を調製した（２８）。天然ではないアミノ酸３８は、スキームＩＩＩ（図６）で説明したように合成した。ジフェニルオキシアジノン中間体３６は、市販のα−ブロモ−ｐ−トルイル酸から５工程で、全体では２８％の収率にて以前に調製した（２０）。我々は、［（ジエトキシホスフィニル）ジフルオロメチル］臭化亜鉛（１９）の、アリールヨウ化物３５とのＣｕＢｒが介在するカップリングを利用して、幾分さらに効率的な合成（２工程、収率４２％）を開発した。３４のエノラートと市販のヨードベンジルブロミド３３とのジアステレオ選択的アルキル化によって後者を得た。３６のＮＭＲ（Ｔ＝１００℃）は単一のジアステレオマーのみを示し、この方法について以前報告された（１８）高いｅｅに一致していた。次いで、水素化分解およびそれに続くＦｍｏｃ保護（２０）によって、化合物３６を所望のＦｍｏｃ保護アミノ酸３８に変換した。３８の標準旋光度（［ａ］_Ｄ＝４４°；ＣＨＣｌ_３中でｃ＝０．１）が、この化合物について以前報告された値に密接に対応しているということは、３４のアルキル化が高い立体選択性で進行したことを裏付けている。その後、標準的な固相Ｆｍｏｃ条件下にて、３８、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）および３２を前記リンクのアミド樹脂に順に添加することにより、化合物４０を組み立てた。

［化合物４０は、現在までに同定された最も強力でかつＰＴＰ１Ｂに特異的な阻害剤である］
２５℃にて、１ｍＭのＥＤＴＡを含有し、イオン強度が０．１５ＭであるｐＨ７．０の５０ｍＭの３，３−ジメチルグルタレート緩衝液中で（詳細は材料および方法を参照のこと）、ＰＴＰ１Ｂが触媒するｐＮＰＰの加水分解反応における、加水分解に耐性の化合物４０の効果を調べた。化合物４０は、ＰＴＰ１Ｂの反応を可逆的に阻害し、この阻害の様式は、その基質に関して競合的である（データは示さず）。４０によるＰＴＰ１Ｂの阻害に関するＫ_ｉ値は、２．４±０．２ｎＭである。低いｎＭの範囲にＫ_ｉまたはＩＣ_５０値を持つＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、以前から報告されていた（３７、３８）。しかしながら、それらの測定は、低い、したがって生理的でないイオン強度で行われた。該阻害剤とＰＴＰ１Ｂの活性部位との間の相互作用の静電気的性質によって、低いイオン強度での測定は、これらの化合物の結合親和性を過大評価することがあることが起こりうる。これを支援して、我々は、酵素阻害および等温滴定熱量測定によって、我々の生理的に関連した条件（０．１５Ｍのイオン強度）下にて測定したＰＴＰ１Ｂに関するヘキサペプチドＤＡＤＥ（Ｆ_２Ｐｍｐ）Ｌ−ＮＨ_２のＫ_ｉ値およびＫ_ｄ値がそれぞれ、２５０ｎＭおよび２４０ｎＭであることを言及する（３３）。それに対して、以前報告された低いイオン強度の条件（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ヘペス）、５ｍＭのＤＴＴおよび１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ緩衝液中にてｐＨ７．３）で得られた、同一ペプチドに関するＫ_ｉ値は２６ｎＭである（３７）。さらに、類似の低いイオン強度条件下（５０ｍＭビス−トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および５ｍＭ ＤＴＴ緩衝液中にてｐＨ６．３）での同一ペプチドのＩＣ_５０値は３０ｎＭである（３８）。双方の場合におけるイオン強度は０．１５Ｍよりもはるかに低いので、該ヘキサペプチドの報告されたＰＴＰ１Ｂとの親和性において何故矛盾が存在するのかは理解可能である。この見かけの結合親和性における塩濃度の重要性をさらに実証するために、我々は、その他のグループが用いたのと同一の低い塩条件下でも、化合物４０のＫ_ｉ値を測定した。我々は、ＰＴＰ１Ｂに関する４０のＫ_ｉが、５０ｍＭヘペス、５ｍＭ ＤＴＴおよび１０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ緩衝液中にてｐＨ７．３にて測定した場合、０．１４±０．０１ｎＭであることを見い出した。同様に、５０ｍＭビス−トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および５ｍＭ ＤＴＴ緩衝液中でｐＨ６．３にて測定した場合、ＰＴＰ１Ｂに関する４０のＫ_ｉは０．６３±０．０９ｎＭである。これらの結果は、ＰＴＰアーゼのリガンドの阻害特性の意味のある比較を確実に行うには、アッセイのイオン強度を制御することが重要であることを強調している。まとめると、我々の結果は、化合物４０が現在までに同定されている最も強力なＰＴＰ１Ｂ阻害剤であることを示している。

化合物４０がＰＴＰ１Ｂに関して特異的であるかどうかを確定するために、タンパク質ホスファターゼのパネルに対する４０の阻害活性を評価した。これらには、非受容体様の細胞質内可溶性のＰＴＰアーゼ：イェルシニアＰＴＰアーゼ、ＴＣＰＴＰ、ＨｅＰＴＰ、ＳＨＰ１およびＳＨＰ２、受容体様ＰＴＰアーゼ：ＬＡＲ、ＰＴＰａ、およびＣＤ４５、二重に特異的なホスファターゼ：ＶＨＲ、ＭＫＰ３、およびＣｄｃ２５Ａ、低分子量ホスファターゼＳｔｐ１ならびにＳｅｒ／Ｔｈｒタンパク質ホスファターゼＰＰ２Ｃが包含された。多数の強力なＰＴＰ１Ｂ阻害剤が報告されてきたが（２８、３７〜４１）、特にＰＴＰ１ＢとＴＣＰＴＰとの間の選択性を達成することが、重大な難問であった。表２に示すように、化合物４０は、ＰＴＰ１Ｂに関して高度に選択的であり、調べたほとんどすべてのホスファターゼと対比して３桁を超える程大きな優先傾向を、ＰＴＰ１Ｂに関して示している。さらに重要なことに、化合物４０はまた、ＰＴＰ１Ｂの最も近接した構造的同族体であるＴＣＰＴＰ（ＰＴＰ１Ｂの触媒ドメイン［残基１〜２７９］は、ＴＣＰＴＰのそれに６９％同一であり、８５％相同である）よりも＞１０倍ＰＴＰ１Ｂを優先する選択性を示している。如何なるさらなる最適化をも行わずに化合物４０に関して見られる高い選択性は、ＰＴＰアーゼファミリーメンバーの阻害剤に関して見られてきた選択性の一般的な欠如を考えれば、非常に印象的である。これらの結果は、ＰＴＰアーゼの阻害剤の開発において有効性と選択性との双方を達成することが可能であることを実証している。

［結論］
要約すると、我々は、ＰＴＰアーゼの活性部位および隣接する保存されていない周辺部位の双方を同時に占有するように設計されたアリールホスフェート類のライブラリの並行合成を記載してきた。触媒的に不活性のＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓ突然変異体を用いた、親和性に基づいたＥＬＩＳＡスクリーニング法によって、ＰＴＰ１Ｂに結合する強力なリガンド、化合物２１Ｂを同定するに至った。２１Ｂの加水分解できないジフルオロホスホネート類似体４０への変換によって、現在までに報告されている最も強力でかつ選択的なＰＴＰ１Ｂ阻害剤を生産した。この結果は、それが強力で、なお高度に選択的なＰＴＰアーゼ阻害剤を獲得することの実行可能性を実証しているので、ＰＴＰアーゼ阻害剤の開発において概念実証として役立つ。４０のようなＰＴＰアーゼ阻害剤は、シグナル伝達経路において特定のＰＴＰアーゼが演じる正確な役割を分析するのに有用であることが分かるだけでなく、治療上有用な物質の基となるであろう分子上の基礎を提供するはずである。

［実施例２］
［ＰＴＰ１Ｂ阻害剤の生物学的効果］
実施例１は、高度に強力なＰＴＰ１Ｂ阻害剤、化合物４０を記載している。化合物４０は、ＰＴＰ１Ｂに関して２．４ｎＭのＫ_ｉ値を示し、ＰＴＰ類のパネルに対して数桁ＰＴＰ１Ｂを優先させる程の選択性を示す。生体内での化合物４０の効果を評価するために、我々は、４０の膜透過性を高めるために、化合物４０の類似体４０Ａ、４０Ｂ、および４０Ｃを調製した（図９）。化合物４０Ａおよび４０Ｂには、脂肪酸への化合物４０の共役が関与し、一方、化合物４０Ｃには、ポリＡｒｇペプチドへの化合物４０の結合が関与する。我々は、このステアリン酸部分またはこのポリＡｒｇペプチドが化合物４０の有効性および選択性に影響を与えないことを見い出した。さらに、化合物４０Ｂおよび４０Ｃは、例えば、細胞の中において、それらの化合物の視覚化を可能にするために共有結合したローダミン分子を包含する。

化合物４０Ａ、４０Ｂおよび４０Ｃは、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅｐＧ２およびＬ６細胞を包含する数タイプの細胞中に、容易に浸透する。図１０は、４０Ｂが細胞透過性であることを示すローダミン蛍光画像（パネルＡ）を示す。

これらの化合物の細胞性の影響を、数種の細胞株で評価した。化合物４０Ａは、ＣＨＯ／Ｈｉｒ細胞においてインスリンと相乗的に、インスリン受容体（ＩＲ）βサブユニットとインスリン受容体基質１（ＩＲＳ１）との双方のチロシンのリン酸化を高める（図１１）。さらに、化合物４０Ａは、同じ細胞株において、Ａｋｔ（図１２）およびＥＲＫ１／２のキナーゼ活性の、インスリンが刺激する活性化を更に高める（図１３）。同様の結果が、Ｌ６管状筋細胞において得られている。化合物４０Ａはまた、ＣＨＯ／Ｈｉｒ細胞とＬ６細胞との双方において（図１４および図１５）、インスリン刺激性のグルコース取り込みを高める。まとめて言えば、これらの結果は、強力でかつ選択的なＰＴＰ１Ｂ阻害剤はインスリンのシグナル伝達を増強するであろうし、ＩＩ型糖尿病および肥満の治療に関しての有効な治療剤として役立つかも知れないことを立証している。

上記に鑑みて、本発明の幾つかの利点が達成され、その他の利点が成し遂げられることが判るであろう。

本発明の範囲から逸脱することなく、上記の方法および組成物において種々の変更を行うことができるため、上の記載に含まれ添付の図面に示されるあらゆる事項は説明として解釈され、限定する意味で解釈されはしないことが意図される。

本明細書中で引用した参考文献はすべて本願に援用される。本明細書中でのこれらの参考文献の議論は、著者による主張を要約することを単に意図するものであって、如何なる参考文献もが従来技術を構成することを認めるものではない。出願人は引用したこれらの参考文献の正確さおよび適切性を問題にする権利を保有する。

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図１は、構造３または化合物３と表される、コンビナトリアルライブラリのための化合物である。該ライブラリは、タンパク質チロシンホスファターゼのリガンドおよび阻害剤の発見を指向する。 図２は、固有の周辺部位を標的とする、一般構造３のライブラリで使用される末端多様性要素または周辺部位を標的とする成分を表す。 図３は、Ｎ−末端多様性要素およびｐＴｙｒに接続するのに使用されるリンカーを表す。２６の場合、この末端要素は直接ｐＴｙｒに連結される。 図４は、ＰＴＰ１Ｂの活性部位と固有の隣接部位との双方を標的とする化合物のライブラリの並行合成に利用されるスキームＩを表す。 図５は、Ｂの加水分解に耐性のジフルオロホスホネート類似体（３２）の合成に利用されるスキームＩＩを表す。 図６は、このジフルオロホスホネートを含有する非天然アミノ酸３８の合成に利用されるスキームＩＩＩを表す。 図７は、２５０ｎＭ濃度でのライブラリメンバーのＥＬＩＳＡ系スクリーニングの結果を表す。ＰＴＰ１Ｂに対するこれらのライブラリメンバーの有効性は、アビジン（avidin）をコーティングしたマイクロタイタープレートのウェルに固定化されたビオチン化ＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ_２ペプチドに対するＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ／Ｃ２１５Ｓの結合を阻害する化合物の能力（パーセント阻害で表現される）で表される。 図８は、対照化合物３９、および２１Ｂの加水分解できない類似体、化合物４０の化学構造を表す。 図９は、化合物４０ならびにその類似体４０Ａ、４０Ｂおよび４０Ｃの化学構造を表す。 図１０は、化合物が細胞内に入ることを実証する、化合物４０Ｂで処理したＣＨＯ／ＨＩＲｃ細胞の共焦点顕微鏡写真である。パネル（Ａ）は蛍光顕微鏡写真であり、パネル（Ｂ）は光学顕微鏡写真である。 図１１は、ＣＨＯ／Ｈｉｒ細胞の電気泳動した抽出物のＰＡＧＥゲルのブロットへの抗ホスホチロシン抗体の結合を評価するウエスタンブロットを示し、インスリン受容体（Ｉｒβ）およびインスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）のチロシンリン酸化に対する化合物４０Ａおよびインスリンの効果を示す。 図１２は、ＣＨＯ／Ｈｉｒ細胞の電気泳動した抽出物のＰＡＧＥゲルのブロットへの抗ホスホ−ＡＫＴ−１（α−ホスホ−Ａｋｔ１）および抗Ａｋｔ１（α−Ａｋｔ１）抗体の結合を評価するウエスタンブロットを示し、ＣＨＯ／Ｈｉｒ細胞におけるＡｋｔのリン酸化に対する化合物４０Ａおよびインスリンによる処理の効果を示す。 図１３は、ＣＨＯ／Ｈｉｒ細胞の電気泳動した抽出物のＰＡＧＥゲルのブロットへの抗ホスホ−ＥＲＫ（α−ホスホＥＲＫ４４／４２）および抗ＥＲＫ（α−ＥＲＫ）抗体の結合を評価するウエスタンブロットを示し、ＣＨＯ／Ｈｉｒ細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化に対する化合物４０Ａおよびインスリンによる処理の効果を示す。 図１４は、化合物４０Ａで処理したＣＨＯ／Ｈｉｒ細胞において上昇したグルコースの取り込みを示す棒グラフである。 図１５は、化合物４０Ａで処理したＬ６管状筋細胞において上昇したグルコースの取り込みを示すグラフである。丸は未処理の管状筋細胞；四角は１２５ｎＭの化合物４０Ａで処理した管状筋細胞。

Claims (49)

1. 活性部位を標的とする成分と、リンカー成分と、周辺部位を標的とする成分とを含む化合物であって、前記リンカー成分は前記活性部位を標的とする成分に共有結合し、前記周辺部位を標的とする成分は前記リンカー成分に共有結合し、ここで前記活性部位を標的とする成分は図１の化合物３の場合のような式を有し、およびここで前記リンカー成分および前記周辺部位を標的とする成分は各々、５００ダルトン未満の任意の有機分子である化合物。
2. 図１の化合物３を含み、ここでＸおよびＹが独立して５００ダルトン未満の任意の有機分子であり、およびここで該化合物は少なくとも１つのホスフェート基（Ｈ_２ＰＯ_４）をさらに含む、請求項１に記載の化合物。
3. 前記リンカー成分は炭素、酸素、窒素および／または水素から成り、前記周辺部位を標的とする成分は芳香環を有して炭素、酸素、窒素、リンおよび／または水素から成る、請求項１または２に記載の化合物。
4. 前記化合物はタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）のリガンドである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物。
5. 前記リンカー成分が図３の要素４〜２６より成る群から選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の化合物。
6. 前記リンカー成分は、図３の要素１１、１３、２１、２２および２４より成る群から選択される、請求項５に記載の化合物。
7. 前記周辺部位を標的とする成分は、図２の要素Ａ〜Ｈより成る群から選択される、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の化合物。
8. 前記周辺部位を標的とする成分は、図２の要素Ａ、Ｂ、Ｃ、ＦおよびＨより成る群から選択される、請求項７に記載の化合物。
9. 前記化合物はさらに脂肪酸部分を含む、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の化合物。
10. 前記脂肪酸部分は少なくとも６炭素を含む、請求項９に記載の化合物。
11. 前記脂肪酸部分は少なくとも１０炭素を含む、請求項９に記載の化合物。
12. 前記脂肪酸部分は１５炭素を含む、請求項９に記載の化合物。
13. 前記化合物はさらにポリアルギニン部分を含む、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の化合物。
14. 前記ポリアルギニン部分は少なくとも４つのアルギニンを含む、請求項１３に記載の化合物。
15. 前記ポリアルギニン部分は８つのアルギニンを含む、請求項１３に記載の化合物。
16. 前記化合物は検出可能な部分をさらに含む、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の化合物。
17. 前記検出可能な部分は蛍光部分である、請求項１６に記載の化合物。
18. 前記検出可能な部分はローダミンである、請求項１６に記載の化合物。
19. 活性部位を標的とする成分と、リンカー成分と、周辺部位を標的とする成分とを有する、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）のリガンドであって、該リガンドは図１の化合物３の式を含み、前記リンカー成分および前記周辺部位を標的とする成分はそれぞれ、図３および図２の以下の要素：４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｅ、４Ｆ、５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｆ、６Ａ、６Ｂ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｈ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｅ、７Ｆ、７Ｈ、８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｆ、８Ｈ、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｆ、９Ｈ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｆ、１０Ｈ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ、１１Ｈ、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｆ、１２Ｇ、１２Ｈ、１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｅ、１３Ｆ、１３Ｇ、１３Ｈ、１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｅ、１５Ｆ、１５Ｈ、１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｆ、１６Ｈ、１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｅ、１７Ｆ、１７Ｈ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｅ、１８Ｆ、１８Ｇ、１８Ｈ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｆ、２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｅ、１０Ｆ、２０Ｇ、２０Ｈ、２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ、２１Ｄ、２１Ｅ、２１Ｆ、２１Ｇ、２１Ｈ、２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄ、２２Ｅ、２２Ｆ、２２Ｇ、２３Ｈ、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、２４Ｄ、２４Ｅ、２４Ｆ、２４Ｇ、２４Ｈ、２５Ｆ、２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃ、２６Ｅ、２６Ｆ、２６Ｇおよび２６Ｈより成る群から選択され、該リガンドは少なくとも１つのホスフェート基を含むリガンド。
20. 前記リンカー成分は図３の要素２１および２４より成る群から選択され、前記周辺部位を標的とする成分は図２のＢである、請求項１９に記載のリガンド。
21. 前記リンカー成分は図３の要素２１であり、前記周辺部位を標的とする成分は図２のＢである、請求項１９に記載のリガンド。
22. さらに脂肪酸部分を含む、請求項１９ないし２１のいずれか１項に記載のリガンド。
23. さらにポリアルギニン部分を含む、請求項１９ないし２１のいずれか１項に記載のリガンド。
24. 検出可能な部分をさらに含む、請求項１９ないし２１のいずれか１項に記載のリガンド。
25. 活性部位を標的とする成分と、リンカー成分と、周辺部位を標的とする成分とを有するタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の阻害剤であって、該阻害剤は請求項１９ないし２４のいずれか１項のリガンドを含み、前記少なくとも１つのホスフェート基はジフルオロホスホネート基で置換される阻害剤。
26. 図９の４０、４０Ａ、４０Ｂおよび４０Ｃより成る群から選択される化合物より成る、請求項２５に記載の阻害剤。
27. 薬学上許容可能な賦形剤中に、請求項２５または２６のＰＴＰ１Ｂ阻害剤を含む組成物。
28. 患者における肥満を治療する方法であって、請求項２７の組成物を該患者に投与することを含む方法。
29. 患者における肥満を予防する方法であって、請求項２７の組成物を該患者に投与することを含む方法。
30. 患者におけるＩＩ型糖尿病を治療する方法であって、請求項２７の組成物を該患者に投与することを含む方法。
31. 患者におけるＩＩ型糖尿病を予防する方法であって、請求項２７の組成物を該患者に投与することを含む方法。
32. 前記賦形剤はリポソームを含む、請求項２８ないし３１のいずれか１項に記載の方法。
33. ＰＴＰ１Ｂの活性を阻害する方法であって、ＰＴＰ１Ｂを請求項２５または２６の阻害剤に接触させることを含む方法。
34. 前記ＰＴＰ１Ｂは生存細胞の中にある、請求項３３に記載の方法。
35. 前記細胞は生存脊椎動物の中にある、請求項３４に記載の方法。
36. 前記脊椎動物は哺乳類である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記哺乳類はヒトである、請求項３６に記載の方法。
38. 化合物が酵素のリガンドであるかどうかを評価する方法であって、
    （ａ）該酵素の既知の活性部位のリガンドを、該化合物および該酵素の突然変異体と組み合わせ、ここで該突然変異体は該酵素の基質に結合できるが、該基質の化学変換を触媒することはできない工程、および
    （ｂ）該酵素の該突然変異体への既知のリガンドの結合に対して、該化合物が競合することができるかどうかを決定し、ここで結合に対して競合する該化合物の能力が、該化合物が該酵素のリガンドであることを示す工程を含む方法。
39. 前記工程（ａ）は、
    （ｉ）固体表面に前記既知のリガンドを結合する工程、および
    （ｉｉ）前記化合物および前記突然変異体を該固体表面に結合した該既知のリガンドと組み合わせる工程を含む、請求項３８に記載の方法。
40. 前記固体表面は、化合物がリガンドであるかどうかを評価するための１つより多くの領域を含む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記固体表面はマイクロタイタープレートのウエルである、請求項４０に記載の方法。
42. 前記基質に対する前記突然変異体の結合量を定量することによって、結合に対して競合する前記化合物の能力を決定し、ここで該突然変異体が標識されている、請求項３８に記載の方法。
43. 前記標識は抗原、放射活性のある原子、または蛍光分子より成る群から選択される、請求項４２に記載の方法。
44. 前記標識は抗原であり、ここで該抗原は該抗原に特異的な抗体を用いて定量される、請求項４３に記載の方法。
45. 前記酵素はタンパク質チロシンホスファターゼである、請求項３８ないし４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記酵素はタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）である、請求項４５に記載の方法。
47. 前記酵素はヒトＰＴＰ１Ｂである、請求項４６に記載の方法。
48. タンパク質チロシンホスファターゼのリガンドを発見するためのコンビナトリアルライブラリであって、１つより多くの形態の図１の化合物３を含み、ここでＸおよびＹは各々独立して５００ダルトン未満の任意の有機分子である、コンビナトリアルライブラリ。
49. Ｘは炭素、酸素、窒素および／または水素から成り、Ｙは芳香環を有して炭素、酸素、窒素、リンおよび／または水素から成る、請求項４８に記載のコンビナトリアルライブラリ。

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