JP2005508864A

JP2005508864A - 糖尿病の治療、または移植術における使用、または免疫寛容の誘導のためのオキシダントスカベンジャー

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Publication number: JP2005508864A
Application number: JP2003501470A
Authority: JP
Inventors: ピガネッリ、ジョン・ディー; ハスキンス、キャスリン; フロレス、ソニア・シー; ジル、ロナルド・ジー; クラポ、ジェームス・ディー; デイ、ブライアン・ジェイ; ガンマンス、リチャード; パテル、マニシャ
Original assignee: Aeolus Sciences Inc
Current assignee: Aeolus Sciences Inc
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2002-06-03
Publication date: 2005-04-07
Also published as: US20080085883A1; CA2449024A1; EP1439842A4; US20030032634A1; AU2002312194B8; US20110105452A1; WO2002098431A1; EP1439842A1; AU2002312194B2; US8470808B2

Abstract

【課題】糖尿病の治療、または移植術における使用、または免疫寛容の誘導のためのオキシダントスカベンジャーを提供する。
【解決手段】本発明は、その一つの実施形態において、低分子量の抗酸化薬を使用した糖尿病の予防方法または治療方法に関する。さらに他の実施形態において、本発明は、細胞／組織／臓器の生存度を、分離（収集）、保存、増殖、および／または移植する間、保護および／または増強する方法に関する。さらに他の実施形態において、本発明は免疫寛容を誘導する方法に関する。本発明はまた、このような方法において使用するのに適した化合物および組成物に関する。

Description

本発明は、その一つの実施形態において、低分子量の抗酸化薬を使用した糖尿病の予防方法または治療方法に関する。さらに他の実施形態において、本発明は、細胞／組織／臓器の生存度を、分離（収集）、保存、増殖、および／または移植する間、保護および／または増強する方法に関する。さらに他の実施形態において、本発明は免疫寛容を誘導する方法に関する。本発明はまた、このような方法において使用するのに適した化合物および組成物に関する。

糖尿病は、慢性的な高血糖によって特徴付けられる。糖尿病には、インシュリン依存型（Ｉ型）とインシュリン非依存型（ＩＩ型）の２つの疾病形態がある。Ｉ型およびＩＩ型の両者に関する疾病過程には、例えば失明、腎不全、神経障害を引き起こし得る微小血管病態が含まれる。加えて、心臓、脳、および下肢に供給する動脈に、促進的なアテローム硬化型のマクロ血管病態が発症し得る（例えば、非特許文献１（Brownlee, Nature 414 : 813(2001)）参照）。

Ｉ型糖尿病は、インシュリンを産生する膵臓β細胞の自己免疫性破壊によって引き起こされる。多くの身体的な証拠は、抗原特異的なＴ細胞によって媒介される炎症細胞の膵臓への浸潤が、活性酸素種（ＲＯＳ）［スーパーオキシド（Ｏ₂ ^・-）、ヒドロキシルラジカル（^・ＯＨ）、一酸化窒素（ＮＯ^・）、過酸化亜硝酸（ＯＮＯＯ^-）］、および炎症誘発性のサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β（インターロイキン１β）およびＩＦＮ−γ（インターフェロン γ））（非特許文献２（Rabinovitch et al, Endocrinology 137 : 2093-2099 (1996)）、非特許文献３(Mandrup-Poulsen, Diabetologia 39 : 1005-1029 (1996))、非特許文献４（Eizirik et al, Diabetologia 39 : 875-890 (1996)）、非特許文献５（Mandrup-Poulsen et al, Eur.J.Endocrinol. 134 : 21-30 (1996)）を発生させるという概念を支持する。ＲＯＳ（活性酸素種）とこれらのサイトカインが相乗的に相互作用した結果、最終的に膵臓β細胞が破壊される。

局所的に生じたＲＯＳは、β細胞破壊のエフェクターメカニズムに関与している（非特許文献２、３、および４、非特許文献６（Grankvist et al, Biochem. J. 182 : 17-25 (1979)）、非特許文献７（Kroncke et al,Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 : 752-758 (1991)）、非特許文献８（Corbet et al, J. Clin. Invest. 90 : 2384-2391 (1992)）。インビトロにおいて、Ｔ細胞およびＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、およびＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）のようなマクロファージサイトカインは、β細胞によるＲＯＳの産生を誘導する。加えて、外因的に与えられたかまたはサイトカインによってβ細胞で誘発されたＲＯＳは、いずれもβ細胞の破壊をもたらす（非特許文献９（Lortz et al, Diabetes 49 : 1123-1130(2000)））。この破壊は、最終的にアポトーシスメカニズムによって引き起こされるように見える（非特許文献１０（Kurrer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 213-218 (1993)）、非特許文献１１（O’Brien et al, Diabetes 46 : 750-757 (1997)）、非特許文献１２（Cherovonski et al, Cell 89 : 17-24 (1997)）、非特許文献１３（Itoh et al, J. Exp. Med. 186 : 613-618 (1997)））。抗酸化タンパク質を過剰発現するように設計されたβ細胞は、ＲＯＳおよびＮＯ^・に耐性であることが示されている（非特許文献１４（Grankvist et al, Biochem. J. 199 : 393-398 (1981)）、非特許文献１５（Malaisse et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 927-930 (1982)）、非特許文献１６（Lenzen et al, Free Rsdic. Biol. Med. 20 : 463-466 (1996)）、非特許文献１７（Tiedge et al, Diabetes 46 : 1733-1742 (1997)）、非特許文献１８（Benhamou et al, Diabetologia 41 : 1093-1100 (1998)）、非特許文献１９（Tiedge et al, Diabetes 47 : 1578-1585 (1998)）、非特許文献２０（Tiedge et al, Diabetologia 42 : 849-855 (1999)））。さらにその上、インスリノーマ細胞におけるマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（Ｍｎ−ＳＯＤ）の安定的な発現は、ＩＬ−１β誘発性の細胞毒性を防ぎ、一酸化窒素の生成を減少させる（非特許文献２１（Hohmeier et al, J. Clin. Invest. 101 : 1811-1820 (1998)））。最後に、その他、β細胞をターゲットにした銅ＳＯＤ、亜鉛ＳＯＤまたはチオレドキシンの過剰発現の遺伝子導入マウスが、自己免疫性およびストレプトゾトチン誘発性糖尿病に耐性であることが示されている（非特許文献２２（Kubisch et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 9956-9959 (1994)）、非特許文献２３（Kubisch et al, Diabetes 46 : 1563-1566 (1997)）、非特許文献２４（Hotta et al, J. Exp. Med. 188 : 1445-1451 (1998)））。

ＳＯＤ擬似物は、Ｃｕ、Ｚｎ、またはＭｎを含む哺乳類のＳＯＤの活性金属サイトと類似した方法でＯ₂ ^-の不均化反応を触媒する、酸化還元活性金属中心を有して設計されている（非特許文献２５（Fridovich, J. Bilo. Chem. 264 : 7761-7764 (1989)）、非特許文献２６（Pasternack et al, J. Inorg. Biochem. 15 : 261 (1981)）、非特許文献２７（Faulkner et al, J. Biol. Chem. 269 : 23471-13476 (1994)）、非特許文献２８（Batinic-Haberle et al, J. Biol. Chem. 273 : 24521-24528 (1998)）、非特許文献２９（Patel et al, Trends Pharmacol. Sci. 20 : 359-364 (1999)）、非特許文献３０（Spasojevic et al, Inorg. Chem. 40 : 726 (2001)））。マンガンポルフィリンは、広い抗酸化特異性を有し、これにはＯ₂ ^-（非特許文献３１（Batinic-Haberle et al, Inorg. Chem. 38 : 4011 (1999)））、Ｈ₂Ｏ₂（非特許文献３２（Spasojevic et al, Inorg. Chem. 40 : 726 (2001)）、非特許文献３３（Day et al, Arch. Biochem. Biophys 347 : 256-262 (1997)））、ＯＮＯＯ^-（非特許文献３４（Ferrer-Sueta et al, Chem. Res. Toxicol. 12 : 442-449 (1999)））、ＮＯ^・（非特許文献３５（Spasojevic et al, Nitric Oxide : Biology and Chemistry 4 : 526 (2000)））および過酸化脂質ラジカル（非特許文献３６（Day et al, Free Radic. Biol. Med. 26 : 730-736 (1999)））を捕捉することが含まれる。近年、ＳＯＤ擬似物が内毒性のショックによる血管収縮性を救うことと（非特許文献３７（Zingarelli et al, Br. J. Pharmacol. 120 : 259-267 (1997)））、興奮毒性細胞死（非特許文献３８（Patel et al, Neuron 16 : 345-355(1996)））およびアポトーシス（非特許文献３９（Patel, J. Neurochem. 71 : 1068-1074 (1998)））から神経細胞を保護することと、過酸化脂質を阻害することと（非特許文献４０（Day et al, Free Radic. Biol. Med. 28 : 1017-1029 (2000)））、過酸化水素誘発性ミトコンドリアＤＮＡ損傷を妨げること（非特許文献４１（Milano et al, Nucleic Acid Res. 28 : 968-973 (2000)））、およびマンガンスーパーオキシドジスムターゼノックアウトマウスの致死表現型を部分的に救命する（非特許文献４２（Melov et al, Nat. Genet. 18 : 159-163 (1998)））ことが発見された。広範囲のＲＯＳを捕捉するＳＯＤ擬似物の能力によって、それらを炎症性疾患に利用することが可能である。

本発明は、金属ポルフィルンを基にした合成スーパーオキシドジスムターゼ擬似物を使用して、自己免疫性糖尿病と付随した、Ｔ細胞が媒介するＲＯＳおよびサイトカインによる破壊からβ細胞を保護するための薬理学的なアプローチを提供する。本発明はまた、移植後の膵臓β島細胞の生存率を改善する方法を提供する。
Brownlee, Nature 414 : 813(2001) Rabinovitch et al, Endocrinology 137 : 2093-2099 (1996) Mandrup-Poulsen, Diabetologia 39 : 1005-1029 (1996) Eizirik et al, Diabetologia 39 : 875-890(1996) Mandrup-Poulsen et al, Eur.J.Endocrinol. 134 : 21-30(1996) Grankvist et al, Biochem. J. 182 : 17-25 (1979) Kroncke et al,Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 : 752-758 (1991) Corbet et al, J. Clin. Invest. 90 : 2384-2391 (1992) Lortz et al, Diabetes 49 : 1123-1130(2000) Kurrer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 213-218 (1993) O’Brien et al, Diabetes 46 : 750-757 (1997) Cherovonski et al, Cell 89 : 17-24 (1997) Itoh et al, J. Exp. Med. 186 : 613-618 (1997) Grankvist et al, Biochem. J. 199 : 393-398 (1981) Malaisse et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 927-930 (1982) Lenzen et al, Free Rsdic. Biol. Med. 20 : 463-466 (1996) Tiedge et al, Diabetes 46 : 1733-1742 (1997) Benhamou et al, Diabetologia 41 : 1093-1100 (1998) Tiedge et al, Diabetes 47 : 1578-1585 (1998) Tiedge et al, Diabetologia 42 : 849-855 (1999) Hohmeier et al, J. Clin. Invest. 101 : 1811-1820 (1998) Kubisch et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 9956-9959 (1994) Kubisch et al, Diabetes 46 : 1563-1566 (1997) Hotta et al, J. Exp. Med. 188 : 1445-1451 (1998) Fridovich, J. Bilo. Chem. 264 : 7761-7764 (1989) Pasternack et al, J. Inorg. Biochem. 15 : 261 (1981) Faulkner et al, J. Biol. Chem. 269 : 23471-13476 (1994) Batinic-Haberle et al, J. Biol. Chem. 273 : 24521-24528 (1998) Patel et al, Trends Pharmacol. Sci. 20 : 359-364 (1999) Spasojevic et al, Inorg. Chem. 40 : 726 (2001) Batinic-Haberle et al, Inorg. Chem. 38 : 4011 (1999) Spasojevic et al, Inorg. Chem. 40 : 726 (2001) Day et al, Arch. Biochem. Biophys 347 : 256-262 (1997) Ferrer-Sueta et al, Chem. Res. Toxicol. 12 : 442-449 (1999) Spasojevic et al, Nitric Oxide : Biology and Chemistry 4 : 526 (2000) Day et al, Free Radic. Biol. Med. 26 : 730-736 (1999) Zingarelli et al, Br. J. Pharmacol. 120 : 259-267 (1997) Patel et al, Neuron 16 : 345-355(1996) Patel, J. Neurochem. 71 : 1068-1074 (1998) Day et al, Free Radic. Biol. Med. 28 : 1017-1029 (2000) Milano et al, Nucleic Acid Res. 28 : 968-973 (2000) Melov et al, Nat. Genet. 18 : 159-163 (1998)

発明の概要

本出願は、２００１年６月１日に出願の仮出願番号６０／２９４，６０４および２００１年１０月１２日に出願の仮出願番号６０／３２８，３９８の優先権を主張し、その両者の内容を本明細書の一部として援用する。

本発明は、その一つの実施形態において、低分子量の抗酸化薬を使用した糖尿病の予防方法または治療方法に関する。この実施形態に従って、低分子量の抗酸化薬は、糖尿病に特異的な微小血管疾病、例えば網膜、腎糸球体、および末梢性神経（例えば、網膜における浮腫、虚血、および低酸素誘発性新血管新生、腎臓におけるタンパク尿、糸球体間質のマトリックスの拡張、および糸球体硬化症、末梢神経における多病巣性軸索変性を起こす）を治療しまたは予防するために使用することができる。加えて、低分子量抗酸化薬は、心臓、脳、および下肢に供給する動脈に発症する促進的なアテローム硬化型マクロ血管疾病の治療または予防に使用することができる。さらなる実施形態において、本発明は、細胞／組織／臓器の生存度を、分離（収集）、保存、増殖、および／または移植する間、保護および／または増強する方法に関する。さらに他の実施形態において、本発明は免疫寛容を誘導する方法に関する。本発明はまた、このような方法において使用するのに適した化合物および組成物に関する。

本発明の目的および利点は、下記の記載から明らかとなるであろう。

発明の詳細な説明

本発明は、低分子量の抗酸化薬（例えば、ＳＯＤ、カタラーゼ、およびペルオキシダーゼの擬似物を含む、活性酸素種のスカベンジャーの擬似物）を使用した、糖尿病の予防方法または治療方法に関する。本発明に従って、本擬似物は、例えば自己免疫性疾患または遊離ラジカル誘発性の毒性、或いは遊離ラジカル障害によってその効果が媒介される毒または薬物などによる膵臓島細胞死に起因する糖尿病の予防、その発症の遅延、および／またはその重症度を抑えるために使用することができる。低分子量抗酸化薬は、糖尿病特異性の微小血管疾病、例えば網膜、腎臓糸状体および末梢神経の微小血管疾病（例えば、網膜における浮腫、虚血、および低酸素誘発性新血管新生、腎臓におけるタンパク尿、糸状体間質マトリックスの拡張、および糸球体硬化症、或いは末梢神経における多巣性軸索変性）の治療または予防に使用することができる。加えて、低分子量抗酸化薬は、心臓、脳、および下肢に供給する動脈に発症する促進的なアテローム硬化型マクロ血管疾病の治療または予防に使用することができる。

本発明はさらに、移植後の細胞生存率（例えば、β島細胞の生存率）を増強する方法に関する。本発明はさらに、そのような方法において使用するのに適した製剤形態に関する。

本発明の方法において使用するのに適した活性酸素種スカベンジャーの擬似物は、メチン（即ち、メソ）置換ポルフィンおよび置換テトラピロール、または薬剤的に許容されるそれらの塩（例えば、塩化物塩または臭化物塩）を含む。本発明は、金属非結合および金属結合のポルフィンおよびテトラピロールの両者を含む。金属結合したポルフィンおよびテトラピロールの場合、マンガン誘導体が好ましいが、しかし、鉄（ＩＩまたはＩＩＩ）、銅（ＩまたはＩＩ）、コバルト（ＩＩまたはＩＩＩ）、またはニッケル（ＩまたはＩＩ）のようなマンガン以外の金属も使用することができる。例えばマンガンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶが使用できるように、選択された金属が様々な価電子状態を持ち得ることが認められる。亜鉛（ＩＩ）も、その原子価が変化せず、それゆえにスーパーオキシドを直接捕捉しないが、用いることができる。金属の選択は、捕捉する酸素種の選択性に影響を与えることができる。そのような擬似物の例は、図９、図１８に示され、および／またはＵＳＰ５，９９４，３３９、６，１０３，７１４、およびＵＳＰ６，１２７，３５６、並びに米国特許番号０９／１８４，９８２、同０９／２９６，６１５、同０９／４９０，５３７、同０９／８８０，０７５、および同６０／２１１，８５７に開示されている（これらの出願は、その内容を本明細書の一部として援用する）。合成の適切な方法は、これらの特許および出願に開示されている。

上記した特許および出願において開示された擬似物に加えて、マンガンサレン（manganese salen）化合物（Baudry et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 : 964 (1993)）、例えばRiley他（Inorg. Chem. 35 : 5213 (1996)）、Deune他（Plastic Reconstr. Surg. 98 : 712 (1996)）、Lowe他（Eur. J.Pharmacol. 304 : 81 (1996)）、およびWeiss他（J. Biol. Chem. 271 : 26149 (1996)）によって開示されているようなマンガン大環状錯体、窒素酸化物（Zamir et al, Free Radic. Biol. Med. 27 : 7-15 (1999)）、フラーレン（Lai et al, J. Autonomic Pharmacol. 17 : 229-235 (1997) ; Huang et al, Free Radic. Biol. Med. 30 : 643-649 (2001) ; Bensasson et al, Free Radic. Biol. Med. 29 : 26-33 (2000)）、ＣｕＰＵＰＹ（Steinkkuhler et al, Biochem. Pharmacol. 39 : 1473-1479 (1990)）、およびＣｕＤＩＰＳ（Steinkuhler et al, Biochem. Pharmacol. 39 : 1473-1479 (1990)）を含む他の非タンパク質触媒抗酸化薬を使用することもできる（ＵＳＰ６，０８４，０９３、同５，８７４，４２１、同５，６３７，５７８、同５，６１０，２９３、同６，１７７，４１９、同６，０４６，１８８、同５，８３４，５０９、同５，８２７，８８０、同５，６９６，１０９、および同５，４０３，８３４も参照のこと）。

本発明の化合物は、免疫寛容を誘導するために、単独でも他の薬剤と組み合わせても使用することができる。下記の実施例で示されるように、本発明の擬似物は、免疫寛容の状態を作成させるためにリンパ球に抗原呈示する際、その間に起こる事象を変化させるために使用することができる。この方法は、外来抗原（例えば、移植）または自己抗原（糖尿病、多発性硬化症、糸球体腎炎、リウマチ様動脈炎、および膠原血管病のような自己免疫性疾患）に対する反応を含む、疾病の治療において使用することができる。

本発明の擬似物（本明細書に引用されている公報で開示されているものの他に、図９および図１８のものも含む）は、幹細胞、膵臓β細胞、肝臓前駆細胞、および死体から収集した成人組織から単離した前駆細胞を含む、細胞／組織／臓器、例えば哺乳類の細胞／組織／臓器の生存度を保護または増強するために使用することもできる。擬似物は、分離（収集）、保存（例えば、凍結および解凍（または、凍結と解凍を包含する「凍結保存」））、増殖、および／または移植の過程において使用することができる。

本発明の擬似物を用いた細胞／組織／臓器の処置は、移植治療における可能性を増強する。具体的には、該擬似物によって処置された細胞／組織／臓器は、例えば糖尿病、肝不全、および遺伝的代謝条件（inherited metabolic conditions）を治療するための移植治療において使用することができる。そのような治療（特に、代謝障害の治療）において使用される細胞／組織／臓器は、遺伝子的に操作されることができる。例として、ＡＥＯＬ１０１１２（図９参照）が肝臓前駆体と関連して用いられていることが述べられている。これに関して、凍結保存バッファーに微量元素（セレン（１０^-9Ｍ）、銅（１０^-7Ｍ）、亜鉛（５×１０^-11Ｍ）、および抗酸化薬（例えば、ポルフィリンＳＯＤ擬似物１０ｍｃｇ／ｍｌ；約０．１ｍｇ／ｍｌで使用されるアスコルビン酸））を補うことができる。

さらに、本発明の擬似物（本明細書に引用されている公報に開示されたものの他、図９および図１８のものを含む）は、細胞／組織／臓器を収集、保存、および輸送する間に、毒性を誘発する遊離ラジカルを含めた毒性から保護するために使用することができる。例えば、移植のための肝臓、心臓、および腎臓を本発明の擬似物で処置することができる。

上述した金属結合形態および金属非結合形態の化合物は、本発明の方法において使用されるのに適した薬剤的な組成物中に処方されることができる。そのような組成物は、薬剤的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と共に活性薬剤（擬似物）を含む。この組成物は、例えば錠剤、カプセル、または坐薬などの投薬単位形態で存在できる。この組成物は、例えば注射（例えば皮下、即ち腹腔内または静脈）または噴霧に適した溶液である、滅菌溶液形態であることができる。組成物は、眼動脈に使用するために適した形態であることもできる。本発明はまた、例えばローション、クリーム、ジェル、または軟膏等の形態である組成物のような、局所的投薬のために処方された組成物を含む。組成物中に含まれるべき活性薬剤の濃度は、その薬剤の性質、投与療法、および求める結果に基づいて選択され得る。化合物はリソソームに包み、それによって運搬を増強することを狙ってもよい。

本発明の組成物の投与量は、過度の実験をすることなく決定することができ、また、これは、活性薬剤（金属結合または金属非結合のいずれにせよ）の性質、投与経路、患者、および達成することが求められる結果を含む種々の要因に依存する。静脈内（ＩＶ）または局所的に投与される擬似物の適切な投与量は、約０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに好ましくは０．１〜６ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあることが予期される。煙霧剤投与のための投与量は、０．００１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあることが予期される。適切な投与量は、例えば化合物によって、また、求める結果によって変動する。本発明の方法に従って、細胞／組織／臓器を処置するために使用する溶液中における擬似物の呈示濃度も容易に決定することができ、これは擬似物、細胞／組織／臓器、および求める効果によって変動する。

本発明のある側面は、以下の実施例において極めて詳細に説明されるが、これに限定されるものではない。

[実施例１]
メタロポルフィリンに基づくスーパーオキシドジスムターゼによる、自己免疫性疾患の抑制
（実験の詳細）
マウス
ＮＯＤ．ｓｃｉｄ繁殖ペアを、The Jackson Laboratory（Bar Harbor , ME）から、またはBarbara Davis Centerの繁殖コロニーから得た。コロラド大学健康科学センターの動物看護中央研究所（Center for Laboratory Animal Care(CLAC)）において、ＮＯＤ、ＮＯＤ.ｓｃｉｄ、およびＢＤＣ-２.５-ＴＣＲ-Ｔｇ／ＮＯＤ（２．５ＴＣＲＴｇ／ＮＯＤ）マウスを、特異的な病原性が存在しない条件下で飼育した。

ＢＤＣ−２．５の増殖培養
インビボに移転するための増殖培養物は、４日目の再刺激培養物（Haskins et al, Diabetes 37 : 1444-1448 (1988), Haskins et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 8000-8004 (1989)）から３〜６×１０⁶のＴ細胞を、６０ｍｌの完全培地（ＣＭ）と１４Ｕ／ｍｌのＩＬ−２中で培養して生産した。ＣＭは、４４ｍＭの炭酸水素ナトリウム、０．５５ｍＭのＬ−アルギニン、０．２７ｍＭのＬ−アスパラギン、１．５ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン硫酸塩、５０μＭの２−ＭＥ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１０％のＦＣＳを補充したＤＭＥＭである。細胞は、７５ｃｍ²のフラスコで４日間、３７℃、１０％のＣＯ₂で培養した。Ｔ細胞を収集し、３回洗浄し、ＨＢＳＳに再懸濁し、若い（１５日齢未満）ＮＯＤ.ｓｃｉｄレシピエントに注射した。

メタロポルフィリンスーパーオキシドジスムターゼ擬似物（ＭｎＴＥ２ＰｙＰ５⁺）
ＳＯＤ擬似物Ｍｎ（III）テトラキス（Ｎ−エチルピリジニウム−２−イル）ポルフィリン（ＭｎＴＥ２ＰｙＰ５⁺）（ＡＥＯＬ１０１１３）（ＳＯＤ擬似物）を、Incara Pharmaceuticalsから得た。インビボで使用するために滅菌ＨＢＳＳ中に６００μｇ／ｍｌの保存溶液を、また、インビトロでの実験用に滅菌ＣＭ中に６８０μＭの保存溶液を調製した。

ＢＤＣ−２．５Ｔ細胞クローンの養子移入
実験マウスは、３〜１４日齢の若いＮＯＤ.ｓｃｉｄマウスであった。レシピエントマウスは、ＳＯＤ擬似物か、または対照としてＨＢＳＳを投与された１日後に、ＢＤＣ−２．５（１×１０⁷細胞）を１回、腹腔内に注射された。擬似物またはＨＢＳＳは、１日おきに投与され、合計で５回処置された。尿糖を毎日監察し、動物が糖尿病になったら血糖を測定した。顕性の糖尿病は、尿糖が陽性（＞１％）であり、次に血糖試験＞２５０ｍｇ／ｄｌ（１４ｍＭ）が陽性であることで決定した。レシピエントは、血糖値が３２０ｍｇ／ｄｌ（１８ｍＭ）以上で屠殺した。屠殺時に、組織学的分析のために膵臓を取り出した。

組織学
屠殺時に膵臓を取り出し、ホルマリン中に少なくとも２４時間おいた。引き続いて、膵臓をパラフィンで包埋し、薄片に切り分け、インシュリンを検出するために、ヘマトキシリンエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色して単核細胞浸潤またはアルデヒドフクシン（Ａ／Ｆ）を検出した。

２．５ＴＣＲ−Ｔｇ／ＮＯＤマウスからの精製ＣＤ４＋Ｔ細胞の調製
２．５ＴＣＲ−Ｔｇ／ＮＯＤマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＳＯＤ擬似物またはＨＢＳＳを７日間、毎日腹腔内に注射した。８日目に動物を屠殺し、脾臓を取り出し、製造元のプロトコールに従ってＭＡＣｓ磁気細胞分離キット（Miltenyl Biltec, Auburn CA）を使用し、免疫磁気陽性選択によってＣＤ４⁺Ｔ細胞を分離した。精製したＴ細胞は、ＢＤＣ−２．５ペプチドミモトープ（peptide mimotope）、ＨＲＰＩ−ＲＭの１μＭ溶液５０μｌを抗原として予めコーティングした９６穴丸底プレートに蒔いた。ＳＯＤ擬似物またはＨＢＳＳのいずれかで処置された抗原呈示細胞（ＡＰＣ）を、交差方法（crisscross fashion）によってＴ細胞に加えた。分析プレートは４日間インキュベートし、収集する前に１μＣｉの³Ｈ−ＴｄＲで６時間パルス（pulsed）した。

Ｔ細胞およびマクロファージの機能分析
ＢＤＣ２．５によるＩＦＮ−γの生成を、α−ＣＤ３およびα−ＣＤ２８、Ｃｏｎ−Ａ、または膵島抗原で刺激された応答Ｔ細胞をサンドイッチＥＬＩＳＡ分析することによって評価した。α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８による刺激のために、０．１２５μｇ／ｍｌのα−ＣＤ３および１μｇ／ｍｌのα−ＣＤ２８で９６穴丸底プレートを予め、１時間、３７℃でコーティングした。このプレートを滅菌ＨＢＳＳで洗浄し、ＣＭで３７℃、１時間ブロッキングした後、このブロッキング溶液を取り除き、ＳＯＤ擬似物が１７および３４μＭの濃度で存在するウェル、または存在しないウェルに、ＢＤＣ−２．５Ｔ細胞クローン（２×１０⁴ 細胞）を添加した。陰性対照は、α−ＣＤ３およびα−ＣＤ２８がなく、ＢＤＣ−２．５のみである。Ｃｏｎ−Ａによる刺激のために、ＳＯＤ擬似物が１７および３４μＭの濃度で存在する、または存在しない９６穴平底プレートに、ＡＰＣとして５×１０⁵の照射された同質遺伝的脾臓細胞、およびＣｏｎＡ（２．５μｇ／ｍｌ最終濃度）と共に、或いはなしで、２×１０⁴細胞／ウェルのＢＤＣ−２．５Ｔ細胞を蒔いた。培養物を３７℃で２４時間インキュベートし、上清を集めてＩＦＮ−γ生成物をサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。抗原特異的免疫復活分析のために、９６穴平底プレートを用い、２×１０⁴細胞／ウェルの密度のＢＤＣ−２．５Ｔ細胞を、抗原として５０００の島と、２．５×１０⁴のＡＰＣと共に、１７および３４μＭ濃度のＳＯＤ擬似物存在下、または非存在下で培養した。培養物を３７℃で４８時間インキュベートし、上清を集めてＩＦＮ−γを分析した。マクロファージ分析のために、初回刺激を受けていないＮＯＤマウスを洗浄して腹膜マクロファージ（ＰＣ）を収集し、滅菌ＨＢＳＳで２回洗浄し、２４穴プレートを用いて、２００ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳ（０５５：Ｂ５）を含むＣＭ中に、１７および３４μＭの濃度のＳＯＤ擬似物の存在下、または非存在下で、５×１０⁵細胞／ウェルに調節した。培養物を３７℃で４８時間インキュベートし、上清を集めて、ＴＮＦ−α生成物を、製造元のプロトコール（Ｒ＆Ｄシステム）に従って特異的サンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。残った細胞は、トリプシン処理して集め、滅菌ＰＢＳおよび４％ＦＣＳで３回洗浄した。

腹膜マクロファージの呼吸器バースト
腹膜マクロファージ（ＰＣ）は、上述と同様に収集し、滅菌ＨＢＳＳで２回洗浄し、次いで、２４穴プレートに入れられた、２００ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳ（０５５：Ｂ５）を含むＣＭ培地に、３４または３．４μＭのＳＯＤ擬似物が存在するまたは存在しない条件下で蒔かれた（５×１０⁵細胞／ウェル）。培養物は、３７℃で４８時間インキュベートした。細胞はトリプシン処理し、洗浄してトリプシンを取り除き、続いて遠心チューブに移した。ＰＭＡを、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌで加えた。３７℃で２０分インキュベートした後、フェリチトクロムＣの減少をε＝２０,０００Ｍ^-1ｃｍ^-1を用いて１０分間以上モニタリングし、スーパーオキシド産生を分光光度的に測定した。

ベータ細胞のアポトーシスの測定
インビトロにおけるアポトーシスの実験を、β細胞アデノ−マ系ＮＩＴ−１を用いて行った（Hamaguchi et al, Diabetes 40 : 842-849 (1991)）。腫瘍細胞は、７５ｃｍ²フラスコを用い、ＣＭ、３７℃で増殖させた。細胞系には１日おきに新しい培地を供給し、７５ｃｍ²の組織培養フラスコで増殖させて集密させたが、非酵素的細胞解離バッファー（Gibco, BRL ; Grand Island, NY）を用いて収集し、そして増殖または記述した実験のいずれかに適した培養皿に移した。アロキサン一水和物（Sigma）を、ＰＢＳで０．５Ｍのストック溶液として新しく調製し、塩酸でｐＨ２に調整した。ＩＬ−１βは、Ｒ＆Ｄシステム（Minneapokis MN）から購入した。ＮＩＴ−１細胞は、１２穴組織培養皿で増殖させて集密させた。培地を取り除き、単独のＰＢＳまたは３４μＭの擬似物を含むＰＢＳに交換した。全ての溶液には、４％ＨＣＳを補充した。１時間インキュベーションした後、１０ｍＭのアロキサンを適切なウェルに添加し、細胞をさらに２時間インキュベーションした。サイトカインの細胞毒性を分析するために、ＮＩＴ−１細胞を１２穴プラスチック組織培養皿で増殖させて８０％集密させた。増殖培地を取り除き、５００μｌ／ウェルの培地のみ、または培地＋３４μＭの擬似物に交換した。１時間インキュベーションした後、培地のみ、または２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ最終濃度）＋／−３４μＭのＳＯＤ擬似物を５００μｌ／ウェルで添加した。細胞は、さらに４８時間インキュベーションして処理した。アロキサンまたはサイトカイン処理したＮＩＴ−１細胞は、短時間のトリプシン処理（１２穴皿の２００μｌ／ウェル）によって収集し、続いて、５０μｌのＦＣＳを加えてトリプシンを阻害する。細胞を遠心チューブに移し、２００×ｇで５分間遠心分離した。上清を注意深く吸引して、約２５μｌを残し、チューブを穏やかに振って細胞ペレットを再懸濁させる。１.３μｌのダイミックス（ＰＢＳ中、１００μｇ／ｍｌのアクリジンオレンジ＋１００μｇ／ｍｌのＥｔＢｒ）を加えた後、１０μｌの細胞懸濁液をきれいな顕微鏡スライドに移し、カバーガラスを懸濁液の上に置いた。（Squier et al, Assays of Apoptosis. Humana Press, Totowa）に記述されているようなアポトーシスの形態学的証拠を、蛍光顕微鏡を用い、４５０〜４９０ｎｍで励起して細胞を採点した。

統計学的分析
実験内の統計学的有意性は、ＪＭＰ分析ソフトウェア（ＳＡＳ研究所、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて決定した。生存分析は、生成物限定（Kaplan−Meier）法（product-limit method）を用いて行った。実験の終点は糖尿病を以て決定した。実験の終点までに糖尿病に罹らなかった動物のデータは削除した。ｐ値は、Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ試験によって測定した。他の全ての統計学的分析は、一元の分散分析（Anova）（Wilcoxon／Kruskal−Wallis Rank Sums）によって行った。ｐ値が０．０５以下であれば、有意であると見なした。

（結果）
インビボで、若いＮＯＤ.ｓｃｉｄマウスにＳＯＤ擬似物を処置したところ、Ｔ細胞の養子移入によって媒介される糖尿病が予防された。

ＳＯＤ擬似物は非経口的にＮＯＤ.ｓｃｉｄレシピエントに送達し、２４時間後に、マウスに糖尿病誘発性のＴ細胞クローンＢＤＣ−２．５を養子移入した。ＳＯＤ擬似物またはＨＢＳＳを１日おきに与え、合計で５回処置した。ＳＯＤ擬似物による処置は、糖尿病の発症を有意に遅らせ（ｐ＜0.0002）（図１Ａ）、組織学的実験のために全ての動物を屠殺した２８日後においても、処置したマウスの５０％が正常血糖のままであった。陽性対照動物（ＢＤＣ−２．５、ＳＯＤ擬似物無投与）の膵臓組織は、膵炎に類似する散在性の浸潤を示し、膵臓構築物はほとんど存在しなかった（図１Ｂ（ａ））。反対に、ＳＯＤ擬似物を処置した動物は、健康で良好に顆粒化した島（図１Ｂ（ｄ））と同様に、浸潤単核細胞がほとんど、或いは全くない、無傷の膵臓構築物を示した（図１Ｂ（ｂ）および（ｃ））。これらのデータは、ＳＯＤ擬似物がＢＤＣ−２．５Ｔ細胞および単核細胞の膵臓への浸潤を阻害することを明らかに示している。驚くべきことに、これらの実験において、９日目にＳＯＤ擬似物を停止したにも関わらず、動物は２１日目でも保護されており、この化合物が初回抗原刺激およびそれに続くＡＰＣ、Ｔ細胞、またはその両者の活性化を防ぐことを示唆している。ＳＯＤ擬似物を長期投与することによって、さらなる保護性が証明されるであろう。

ＢＤＣ−２．５によるインターフェロンγの産生は、インビトロにおいてＳＯＤ擬似物によって阻害される：ＡＰＣに対する間接的な作用がＴ細胞の初回刺激の阻害を導く。

インビボにおいて、ＢＤＣ−２.５が活性化してＩＦＮ−γを生産するためには、ＡＰＣによって呈示されるその抗原によって初回刺激を受けなければならない。それゆえに、ＳＯＤ擬似物はＴ細胞の活性化を直接阻害すること、またはＡＰＣとＴ細胞の相互作用を阻害することができ、或いはその両者を阻害することもできる。疾患の伝達を阻害する機構を解明するために、ＢＤＣ−２.５の初回刺激がインビトロにおいてＡＰＣの存在下または非存在下で研究された。Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生に、ＳＯＤ擬似物が直接効果を有するかどうかを決定するために、α−ＣＤ３およびα−ＣＤ２８を結合したプレートでＢＤＣ−２.５を培養した。このタイプの活性化は、Ｔ細胞活性化のシグナル１および２の両者の代わりをし（Mueller et al, J. Immunol. 142 : 2617-2628 (1989), Mueller et al, Annu. Rev. Immunol. 7 : 445-480 (1989), Schwartz et al, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 54 : 605-610 (1989), June et al. Immunology Today 15 (1994)）、従って、ＡＰＣの貢献を除外する。図２Ａは、ＳＯＤ擬似物が存在する、存在しないに関わらず、α−ＣＤ３およびα−ＣＤ２８の刺激作用の結果として、ＢＤＣ−２.５によるＩＦＮ−γの産生に有意な差異がなかったことを示す。これらの結果は、プレートに結合した抗原がシグナル１および２に代わるとき、ＳＯＤ擬似物は、ＢＤＣ−２.５のエフェクター作用を刺激する能力、およびＩＦＮ−γを産生する能力に直接影響しないことを証明している。初回刺激を受けたＴ細胞はＣｏｎＡに直接反応できるにも関わらず、最適なＣｏｎＡ誘導性Ｔ細胞サイトカイン産物は、補助細胞（例えばマクロファージ）の関与を要求する（Ahmann et al, J. Immunol. 121 : 1981-1989 (1978）、Hunig et al, Eur. J. Immuol. 13 : 1-6 (1983)、Hunig, Eur. J. Immunol. 13 : 586-601 (1983)、Hunig, Eur. J. Immunol. 14 : 483-489 (1984)、Bekoff et al, J. Immunol. 134 : 1337-1342 (1985)、Roosnek et al, Eur. J. Immunol. 15 : 652-656 (1985)、Hoffmann et al, Lymphokine Res. 5 : 1-9 (1986))。ＳＯＤ擬似物が、ＡＰＣが媒介するＴ細胞のＣｏｎＡ刺激を阻害し得るかどうかを判定するために、ＢＤＣ−２.５細胞を、ＳＯＤ擬似物の存在下、または非存在下で、ＣｏｎＡおよびＡＰＣと共にインキュベートした。図２Ｂは、３４または１７μＭのＳＯＤ擬似物が、ＩＦＮ−γの産生をそれぞれ４７％または３０％阻害していることを示す。ＳＯＤ擬似物の存在下において産生されたＩＦＮ−γのレベルは、ＢＤＣ−２.５をＣｏｎＡのみと共にインキュベーションしたときに見られるレベルと類似した。これらの結果は、ＣｏｎＡに依存するＴ細胞の活性化およびＩＦＮ−γの産生を至適に刺激するＡＰＣの能力をＳＯＤ擬似物が阻害することを表している。ＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用に及ぼすＳＯＤ擬似物の影響を更に研究するために、ＡＰＣとしてマクロファージが、抗原源として膵島が存在する中で、ＩＦＮ−γの産生を測定した。図２ｃは、このインビトロにおけるさらなる生理学的分析が行われたとき、ＢＤＣ−２.５のＩＦＮ−γ産生能力が減少したことを示している。すなわち、１７μＭ濃度のＳＯＤ擬似物は４６％まで（ｐ＜０．０５）阻害し、一方３４μＭ濃度は６６％まで（ｐ＜０．０５）阻害した。

インビボにおける２．５ＴＣＲＴｇ／ＮＯＤマウスのＳＯＤ擬似物処置は、ＡＰＣ機能を阻害することによってＴ細胞の増殖に影響を及ぼした。

ＳＯＤ擬似物が、インビボでＴ細胞の初回刺激に影響し得るかどうかを判定するために、２．５ＴＣＲ−Ｔｇ／ＮＯＤマウス、これはＢＤＣ−２.５Ｔ細胞クローンの再構成されたＴＣＲ遺伝子（Katz et al, Cell 74 : 1089-1100 (1993)）を保有するものであるが、このマウスにＳＯＤ擬似物（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＨＢＳＳを７日間毎日処置した。ＳＯＤ擬似物を処置したマウスおよび対照マウスからＴ細胞およびＡＰＣを精製し、そして２.５ＴＣＲ−Ｔｇ細胞を刺激する抗原として作用するペプチドミモトープ（mimotope）ＨＲＰＩ−ＲＭを用いた交差増殖分析において培養した。図３は、ＳＯＤ擬似物を処置したマウスからのＡＰＣは、ＳＯＤ擬似物で処置し、または処置していないＴ細胞のいずれにペプチドを呈示するにせよ、Ｔ細胞の増殖を補助する能力が減少していることを示している。特に、対照ＡＰＣが呈示物として使用された場合、ＳＯＤ擬似物を処置したＴ細胞における増殖性応答は、対照ＡＰＣおよびＴ細胞で達成されるレベルに近づいた。これらのデータは、初回刺激されたＴＣＲ−Ｔｇマウスにおいて、インビボでのＳＯＤ擬似物処置が、特異的な自己ペプチドへの応答を阻害することを示し、また、ＳＯＤ擬似物を自己抗原候補と組み合わせて使用することによって、抗原特異的耐性の形態が提供され得ることを表している。

腹膜マクロファージによるＬＰＳ誘導性呼吸器バーストおよびサイトカイン産生は、
ＳＯＤ擬似物によって阻害される。

マクロファージは、初回刺激およびトリガリング（triggering）の２段階反応において活性化される（Meltzer, J. Immunol. 127 : 179-183 (1981)）。この過程における、ＳＯＤ擬似物の阻害効果を評価するために、腹膜マクロファージ（ＰＣ）をＬＰＳと共に、擬似物の存在下または非存在下で培養した。上清を集め、ＰＣ（腹膜マクロファージ）を洗浄し、ＰＭＡでもってトリガリングして、ＮＡＤＰＨオキシダーゼが媒介するそれらの呼吸器バースト、およびスーパーオキシドの産生を測定した。図４Ａは、結果として、３.４μＭのＳＯＤ擬似物がスーパーオキシドの産生を７５％減少させ、そして、ＳＯＤ擬似物の濃度を３４μＭまで上昇させても、スーパーオキシドの産生をさらに有意に減少するものではないことを表している。さらに、図４Ｂは、ＬＰＳ初回刺激されたＰＣによるＴＮＦ−αの産生が、１７μＭの擬似物によって３４％阻害された一方、３４μＭの擬似物によって５１％阻害されたことを示している。これらのデータは、ＬＰＳ初回刺激されたマクロファージを予めＳＯＤと共にインキュベーションすることによって、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化およびＴＮＦ−αの産生の両者が阻害されることを明らかに示している。ここで、ＳＯＤ擬似物は分析より前に洗い落とされていること、従ってスーパーオキシドの産生を測定する細胞外スペースには存在していないことは、留意されるべきである。それ故、スーパーオキシド産生の減少は、ＳＯＤ擬似物が細胞外スーパーオキシドを捕捉したことによるものではなく、オキシダーゼ依存性のスーパーオキシドが減少したことによるものである。活性化したマクロファージによるスーパーオキシドの産生（図４Ａ）が３.４μＭのＳＯＤによって阻害される一方、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γの産生を阻害するためにはより高い濃度のＳＯＤ擬似物が要求される（図４Ｂ、２Ｃ）という事実は、マクロファージのＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化するために必要なオキシダント濃度が、サイトカイン産生のために要求されるシグナル伝達経路を活性化するために必要なオキシダント濃度より低いことを示している。これらの結果は、オキシダントに対する生物学的な応答は、「有るか無いか」ではなく、関与する経路に特異的なものであるという、魅力的な見通しを指し示している。

ＳＯＤ擬似物を処置したＮＩＴ−１インスリノーマ細胞は、アロキサンおよびサイトカインが媒介する細胞毒性から保護される。

アロキサンおよび前炎症性サイトカインのいずれも、インビトロでβ細胞に対する細胞毒性を示した。この実験系は、よく確立されたＮＩＴ−１インスリノーマ細胞系を用い、ＳＯＤ擬似物がアロキサンおよびサイトカインが媒介する細胞毒性から膵島を保護するかどうかを判定するために設計された。図５Ａは、１０ｍＭのアロキサンと共にインキュベートされたＮＩＴ−１細胞が、未処理の対照またはＳＯＤ擬似物を加えた対照の５％と比較して５０％のアポトーシスを誘導したことを示している。しかしながら、アロキサンに曝露され、ＳＯＤ擬似物を処置されたＮＩＴ−１細胞は、７０％の生存率を示している。

図５Ｂは、培養中にＩＬ−１βに曝露されたＮＩＴ−１細胞におけるＳＯＤ擬似物の保護効果を表す。１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βの添加は、対照またはＳＯＤ擬似物を加えた対照と比較して、ＮＩＴ−１細胞に細胞毒性であった（〜５０％の細胞がアポトーシスを起こした）。ＩＬ−１βに曝露されたＮＩＴ−１細胞をＳＯＤ擬似物で処置した場合、明らかな保護効果が見られた。ＳＯＤ擬似物の保護効果は、他の報告−インスリノーマ細胞において、免疫学的障害に対して耐性を与える抗酸化タンパク質の報告（Grankvist et al, Biochem. J. 199 : 393-398 (1981)、Malaisse et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 927-930 (1982)、Lenzen et al, Free Radic. Biol. Med. 20 : 463-466 (1996)、Tiedge et al, Diabetes 46 : 1733-1742 (1997)、Benhamou et al, Diabetologia 41 : 1093-1100 (1998)、Tiedge et al, Diabetes 47 : 1578-1585 (1998)、Tiedge et al, Diabetologia 42 : 849-855 (1999)）と一致している。

[実施例２]
ＳＯＤ擬似物処置によるストレプトゾトチン誘発性糖尿病からの保護と膵島移植の容易化
１：インビボでのＳＯＤ擬似物処置による、ストレプトゾトチン誘発性糖尿病からの保護。

（実験）Ｃ５７Ｂ１／６のオスのマウスに、１６０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトチン（ＳＺ）を静脈注射して糖尿病を誘発させた。レシピエントはその他に、ＳＺ処置の−１日目から＋５日目まで毎日、１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＳＯＤ擬似物を腹腔内大量瞬時投与する処置を受けているか、または処置を受けていない。

（結果）１ｍｇ／ｋｇの擬似物は、ＳＺ誘発性糖尿病からの保護をある程度示した。結果から、１０ｍｇ／ｋｇの投与は、２／５の動物で保護を導くことが示された（未処置の動物では０／９であるのに対して）（図６を参照）。

２：インビトロにおいてＳＯＤ擬似物とともに培養することによる、ストレプトゾトチン誘発性糖尿病からの膵島移植片の保護。

（実験）同質遺伝子的Ｃ５７Ｂ１／６膵島移植片を、インビトロにおいて２時間、ＳＯＤ擬似物（３４μＭ）で予め処置し、上述したように１６０ｍｇ／ｋｇのＳＺに曝露したＣ５７Ｂ１／６に移植した。

（結果）移植に先立った膵島移植片の前処理によって、２／３の移植片に保護作用がもたらされた（図７参照）。

３：インビトロでのＳＯＤ擬似物を用いた前処理による、自然発症糖尿病ＮＯＤマウスにおける膵島移植の容易化。

（実験）自己免疫性疾患ＮＯＤマウスにおける病気の再発は非常に激しいために、膵島の移植はしばしば失敗する（即ち、移植片は、正常血糖を一時的でさえ復活させることができない）。この実験では、移植の前にインビトロでＮＯＤ膵島をＳＯＤ擬似物を用いて処置することによって、同質遺伝子的ＮＯＤ膵島移植片に対する初期の炎症性障害が減弱され得るかどうかを決定した。同質遺伝子的ＮＯＤ膵島移植片は、予めインビトロで２時間、ＳＯＤ擬似物（３４μＭ）を処置し、それから自然発症糖尿病（自己免疫）ＮＯＤレシピエントに移植した。

（結果）未処理の対照ＮＯＤ移植片が、初期の５日間の観察期間中に移植に失敗したのに対して、処置されたＮＯＤ膵島移植片は、２４時間以内に正常血糖を回復させた（図８参照）。

[実施例３]
ヒト膵島の分離
膵島は、死体ドナーの膵臓から得られる（膵島は、膵臓の約１〜２％を構成する）。供与膵臓を収集し、ＵＷで保存する（ウィスコンシン大学溶液、DuPont Pharma, Wilmington, Delaware）。供与膵臓からの島の単離には、自動化方法を用いた（Ricordi et al, Diabetes 37 : 413-420 (1988)、Tzakis et al, Lancet 336 : 402-405 (1990)）。全ての手順は、第２分類のバイオハザードフードまたはクリーンルームで滅菌成分を含む溶液を用い、無菌条件下で行う。

膵臓を輸送容器から取り出し、５００ｍｌの冷却保存溶液の入った滅菌トレイに置く。保存用液のサンプルを、微生物学的分析に供する。このトレイは、より大きなトレイにおき、冷却槽または１Ｌの冷却滅菌氷（２Ｌの冷凍滅菌水から）を用いて冷却維持する；組織は、脂肪および非膵臓組織を切り取り、重量を測定する。洗浄した後、膵臓をベータディン（betadine）および抗生物質中に浸漬し、拡張処理（distension procedure）のために膵臓が入っているトレイを氷から取り出す。

膵管をカテーテルでカニューレ処置して、膵臓を滅菌濾過したコラゲナーゼ溶液で拡張する。コラゲナーゼ溶液は、１５ｍｌのハンクス平衡塩類溶液に溶解され、最大総容積３５０ｍｌに希釈されたリベラーゼ−ＨＩ（Roche Molecular, Indianapolis, IN）から構成される。リベラーゼ−ＨＩは、ヒト膵島の分離手順において使用するために特異的に配合されている（Linetsky, Diabetes 46 : 1120-1123 (1997)）。

拡張された膵臓は、滅菌ステンレス鋼チャンバーに置き（Ricordi et al, Diabetes 37 : 413-420 (1988)、Tzakis et al, Lancet 336 : 402-405 (1990)）、追加のコラゲナーゼ溶液を加える。そしてチャンバーを機械的に攪拌しながら、コラゲナーゼ溶液を再循環し、３７℃にする（Ricordi et al, Diabetes 37 : 413-420 (1988)、Tzakis et al, Lancet 336 : 402-405 (1990)）。この消化手順の間、間隔をおいてサンプルを採取し、膵臓の崩壊を顕微鏡で観察する。消化の長さは異なるが、一般に、一度チャンバー内の温度が３７℃に達し、ほとんどの島が周囲の腺房組織から遊離すれば（１５〜２５分）、崩壊手順は停止できる。

一旦遊離した島が検出されれば、再循環シリンダーおよび加熱回路はバイパスされ、温度が漸次降下するシステム中で膵島の分離が行われ、コラゲナーゼ溶液が溶液で希釈される。遊離した膵島を含んでいる消化物は、過剰な酵素的消化を防ぐために４℃の滅菌容器に集める。消化物の一部（内分泌腺および腺房組織で構成される）を採取し、ジチゾン（dithizone）で染色する；遊離した膵島のパーセント、膵島の断片化の程度、および腺房組織の状態を記録する。組織を遠心分離して再混合し、上清を取り除く。ペレットを集め、ＵＷを含むチューブに再懸濁し、精製工程の手順の前に３０分間氷上に保持する。ＵＷは腺房細胞に、浸透圧的平衡状態を再確立させ、従って細胞の膨張を防ぐ。この手順は、膵島と腺房組織の間の密度の差を増大させることを目的としており、効果的な精製のための鍵となるパラメーターは、密度の相違に基づいている（Robertson, Br. J. Surg. 79 : 899-902 (1992)）。

外分泌組織からの膵島の分離は、ＣＯＢＥ２９９１血液細胞プロセッサーによる密度勾配遠心分離によって行われる（Ricordi et al, Diabetes 37 : 413-420 (1988), Tzakis et al, Lancet 336 : 402-405 (1990)2）。勾配は、規定のプロトコールを用いてユーロコリン溶液（Eurocollins solution）に溶解した溶解糖勾配（Ｆｉｃｏｌｌ）で構成する。ＣＯＢＥ２９９１から得られた断片を収集した後、膵島に富んだ画分（純度＝膵島対非膵島〜６０〜９０％）を広く洗浄してフィコールを除去し、ＣＭＲＬプラス１０％ＦＣＳ、抗生物質およびＬグルタミンからなる培養培地に再懸濁する。

膵島細胞懸濁液は、移植の前に培養しても良い。膵島の群は、１０％ＦＣＳ、１％ＨＥＰＥＳ、１％グルタミン、および１％抗生物質溶液を補充したＭＣＲＬ１０６６培地中、２２℃のインキュベーターにおき（９５％空気、５％ＣＯ₂）、０．２ｍのフィルターで濾過する。培養培地に懸濁させた後、およびインキュベーターに配置する直前に、細菌学的および菌類学的評価のため、計数のため、および生存度、内毒素含有量、および機能的能力の評価のために、膵島を代表する一部分を取り出す。

移植の前に、膵島を組織培養フラスコ／バッグから収集してチューブに入れ、培養培地のサンプルをマイコプラスマ試験のためにとり、懸濁液を遠心分離する。膵島は、移植培地（ＴＸ培地：ＨＢＳＳ、２.５％ヒト血清アルブミン、ＨＡＳ）に再懸濁し、遠心分離して細胞細片、組織、培養培地（ＦＣＳ）、および可溶性タンパク分解活性を洗い落とす。膵島は、もう一度ＴＸ培地に再懸濁し、膵島の計数のため、および微生物学のために一部分を取り除き、細胞を再び遠心分離する。微生物学的分析のためにサンプルを上清から採取し、移植のために膵島を２００ｍｌのＴＸ培地に懸濁する。

標本の機能的能力を測定するために、培養膵島を新しく分離した２分取を、３７℃で一晩インキュベートする。翌朝、標準的な静置インキュベーション方法および標準的なインシュリン放出評価方法、ＤＮＡ含量、およびインシュリン含量を利用して、膵島の機能的能力を判定する（Ricordi et al, Diabetes 37 : 413-420 (1988)、Tzakis et al, Lancet 336 : 402-405 (1990)）。手短にいうと、2.8ｍＭのグルコースを含む基本培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）でサンプルを２回洗浄し、続いて基本培地で２時間インキュベーションし、さらに２回洗浄する。一分取は基本培地でインキュベートし、一分取は、グルコースが媒介するインシュリン放出を分析するために、16.7ｍＭのグルコースを含む培地でインキュベートする。インキュベーション期間が終了したとき、培地を収集し、免疫反応性インシュリンを分析するまでの間−２０℃で冷凍する。膵島を基本培地で２回洗浄し、膵島インシュリン含量を分析する１８時間の期間のために、酸アルコールを添加する。標準的なＲＩＡ手順を用いてインシュリン含量を測定する。

[実施例４]
メタロポルフィリンに基づくスーパーオキシドジスムターゼ擬似物を用いた、分離後のヒト膵島の保存
膵島移植は、Ｉ型糖尿病の正常血糖を回復するための長期にわたるインシュリン投与に代わるものとして魅力的である。しかしながら、一つの死体ドナーでは、障害に直面しているレシピエントにおいてインシュリン非依存性を達成するために十分な数の膵島は提供されない。分離後に得られる膵島の数が限られる理由の一つは、分離中および分離後におけるアポトーシスによって細胞が減少するためである。この調査において、死体ドナーからのヒト膵島（ｎ＝５）を、遊離ラジカルを補足するメタロポルフィリンに基づくスーパーオキシドジスムターゼ擬似物Ｍｎ（ＩＩＩ）テトラキス（Ｎ−エチルピリジウム−２−イル）ポルフィリン（ＳＯＤ擬似物）中で６日間インキュベーションすることによって、ＤＮＡ含量で測定したとき、ベータ細胞量が対照の膵島と比較して３倍の上昇を示すことが証明された。ベータ細胞量の増加は、全体的な細胞の生存度の上昇と相関した。６日間のインキュベーション期間を通して、ジチゾン染色は、全ての標本で少なくとも７５％の膵島量が維持されたことを明らかにした。静的グルコース刺激性インシュリン放出によって測定した場合、ＳＯＤ擬似物を処置した膵島におけるベータ細胞機能の損失は検出されなかった。ＳＯＤ擬似物が有する遊離ラジカルを効率的に補足する能力、および細胞を酸化ストレスおよびアポトーシスから保護する能力は、膵島を分離する手順の間、それらがベータ細胞を保存するために使用できることを保証する（図１０および図１１）。

[実施例５]
ＡＥＯＬ１０１１３およびＭｎＴＢＡＰ（ＡＥＯＬ１０２０１）による、無血清培地における培養ニューロンの生存率の改善
初代培養における正常またはＳＯＤ２欠損大脳皮質ニューロンの生存率を改善する、ＡＥＯＬ１０２０１およびＡＥＯＬ１０１１３の能力を調査した。ニューロン培養物は、胎生１４〜１６日のＳＯＤ２ノックアウト（ホモ接合−／−、ヘテロ接合−／＋、または野生型＋／＋遺伝子型）マウスの大脳皮質から調製した。ニューロン培養物は最初に、最小基本培地（アール塩を含むＭＥＭ）を含む血清に、低酸素環境（５％Ｏ₂、９５％アルゴン）で１８時間プレーティングした。この初期の期間、血清の存在によってニューロンの基質への付着が促進され、低レベルの酸素によって環境中の酸素レベルからＳＯＤ２欠損ニューロンが保護される。このプレーティング手順に続いて、培養培地を溶媒または異なる濃度のＡＥＯＬ化合物を含む無血清ＭＥＭと置換して、通常の酸素環境においた。培養物の損傷を観察し、薬物を添加してから２，３および５日後に、上清培地の乳酸脱水素酵素の放出を分析した。ＳＯＤ２−／−培養物は、無血清条件で、環境酸素の下、加速度的な細胞死を示した（図１２Ａ）。ＳＯＤ２＋／＋および野生型（通常）マウスからのニューロン培養物は、培地交換後５日目で血清欠乏によって死んだ。ＡＥＯＬ１０２０１および１０１１３は、ＳＯＤ２−／−培養物の２，３および５日目における生存率を改善した（図１２Ｂ、１２Ｃおよび図１３Ａ）。ＡＥＯＬ１０２０１および１０１１３は、培地を無血清条件に交換してから５日後の野生型（通常）およびＳＯＤ２＋／−培養物の生存率を劇的に改善した。これらの結果は、ＡＥＯＬ１０１１３および１０２０１が、血清中に存在している細胞生存を促進する保護要因の代わりをし得ることを示している。それらはさらに、触媒的抗酸化薬が無血清培地において培養された細胞を維持するために使用され得ることを示している。

[実施例６]
ヒト膵島細胞機能量の保存
（実験の詳細）
ヒト膵島
ヒトの膵臓は、ＣＯＲＥ（ピッツバーグの回復および養成機関センター（Center for Organ Recovery and Education − Pittsburgh））およびＮＤＲＩ（フィラデルフィアの国立疾病研究インターチェンジ（National Disease Research Interchange − Philadelphia））から入手した。膵臓全体または膵島の移植に使用するための標準的な判定基準に落ちた１２の膵臓を調査した（表１）。化合物をさらに包括的に試験するために、何れかの排除基準に当てはまるものを除く全ての利用可能な臓器が利用された。冷却性虚血時間は５〜１５時間の範囲にわたり、９±２時間であった。年齢は４９±４歳（１７〜６８歳の範囲）および体重指標は２６±２（平均値±ＳＥＭ）であった。準自動化方法で得られた膵臓標本（ｎ＝９）の最終的な島収量（ＩＥＱ／ｇ）は、純度６０〜８０％で構成され、１７９０〜７６３１の範囲にわたり、４６２８±７４９ＩＥＱ／ｇ、中央値４５４２であった。

全標本にわたる島の割合を、ジチゾン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）染色（Latif et al, Transplantation. 45 : 827-830 (1988)）によって、分離直後に測定した。これは、９つの膵島標本からなる第一のグループで６０〜８０％であり、残る３つの標本でそれぞれ６０％、６０％、および３０％であった。第２の実験系（静的消化）に使用されるために得られた収量は、１７４４±６７６ＩＥＱ／ｇであった。

ＳＯＤ擬似物存在下における精製ヒト膵島の培養
第一の実験系は、ＳＯＤ擬似物を、膵島分離後に培養液を補充するものとして添加することに関する。メタロポルフィリンＳＯＤ擬似物ＡＥＯＬ１０１１３、ＡＥＯＬ１０１５０は、ＩｎｃａｒａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって提供された。Ricordi et al (Ricordi et al, Diabetes 38 Suppl 1 : 140-142 (1989))によって開示された方法をわずかに変更して使用し、膵島を分離した。精製の前に、消化物を冷却ＵＷ溶液中で４５分間インキュベートした。この膵島に富んだ画分を、不連続Ｅｕｒｏ−ｆｉｃｏｌｌ密度勾配を用いて精製し、ＣＯＢＥ２９９１細胞分離器（Gambro, Lakewood, CO）に供した。ＣＭＲＬ−１０６６培養培地に１０％熱不活性化ウシ胎児血清、１００unit／ｍｌペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍｍｏｌ／ｌＬ−グルタミン（Life Technologies, Grand Island, NY）を補充し、膵島を７日間（３７℃、５％ＣＯ₂）、最終濃度３４μｍｏｌ／ｌのＳＯＤ擬似物とともに、或いはＳＯＤ擬似物なしで培養した。新鮮な培養培地（ＳＯＤ擬似物を含む、または含まない）に、週に３回交換し、ＤＮＡ含量を評価するため、および機能調査のために、膵島サンプルを選択された時点で採取した。

膵島細胞量および生存度の測定
非内分泌性の混入物とともにクラスターを形成する膵島の性質のために、直接計測が不適当であるため、ＤＮＡ含量が細胞量の間接的な測定に使用される（Ling et al, J Clin Invest 98 : 2805-2812 (1996)）。ＤＮＡ含量は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＫｉｔを製造元のプロトコール（Molecular Probes, Eugene, OR）に従って使用し、対照グループとＳＯＤ処置グループの両者からの島標本サンプルで測定した。島の生存度は、２色蛍光分析（Calcein-AM and Propidium Iodide, Molecular Probes）（Lorenzo et al, Nature 36 : 756-760 (1994)）を使用して、生細胞および死細胞の同時染色によって測定した。生存細胞および死細胞の割合を、対照グループおよびＳＯＤ処置グループの両者で概算した。

静的グルコース曝露およびインシュリン含量の測定
対照グループおよびＳＯＤ処置グループから手で摘んだ膵島を、１０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳおよび０．５％のウシ血清アルブミン（Sigma）を含むクレブスリンガー炭酸水素塩緩衝溶液（ＫＲＥＢＢ）（ｐＨ７.３５）中で、静的なグルコース曝露に供した。条件付けの後、膵島を低濃度（２.８ｍｍｏｌ／ｌ）および高濃度（２０ｍｍｏｌ／ｌ）のグルコースを含むＫＲＢＢ中で１時間インキュベートした。グルコース曝露の終わりに、島のインシュリン含量を測定するためにインシュリンを抽出した（Pipeleers et al, Diabetes 40 : 908-919 (1991)）。インシュリンレベルはＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ，ＷｉｎｄｈａｍＮＨ）で測定した。

免疫細胞化学
精製膵島標本のサンプルをボーインズ溶液で１時間固定し、１０％の緩衝ホルマリンに移した。標準的な方法を用いて、膵島サンプルの免疫反応性前インシュリン、グルカゴン、ＣＫ１９（Scytek Laboratories, Logan, UT）、およびアミラーゼ（Biogenex, San Ramon, CA）を染色し、対照グループおよびＳＯＤ処置グループの両者で陽性細胞の割合を計数した。

膵島インシュリン放出の洗い流しプロトコール
ＳＯＤ擬似物を島培地に添加することによって非制御的なインシュリン放出が誘導されるかどうかが、３つの異なるヒト膵島標本を用い、一定の生理学的グルコース濃度の下で、洗い流し方法によって測定された。制御条件下で４〜７日間培養した、手摘みの島１００のグループ（直径１００〜１５０μｍ）を、５．６ｍｍｏｌ／ｌのグルコースを含むＫＲＥＢＢで洗い流した。９０分間の洗い流し期間の３０分から６０分の間にＳＯＤ擬似物を添加した。溶出したサンプルのインシュリン濃度は、ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ）によって測定した。

膵島分離の際のＳＯＤ擬似物投与
第二の実験系では、ＳＯＤ擬似物を培養中と同様に分離段階で投与した。膵臓葉を、同じようなサイズ（２７±３グラム）の２つの部分（体部および尾部）に分割し、無作為に対照条件と実験条件に割り当てた。分離の間、ＳＯＤ擬似物（濃度３４μｍｏｌ／ｌ）は、Ｌｉｂｅｒａｓｅ^TMと共に膵臓組織の半分へ、内管注射によって輸送した。対照グループでは、Ｌｉｂｅｒａｓｅ^TMのみを注入した。分割された組織は、自動処理できないため、定常の消化を２つの組織部分で平行して行った。サンプルを３７℃で周期的に振盪させ、３０分間消化した。細胞解離は、組織を手動で試験することによって終了した。細胞および集合体は、５００μｍのメッシュを通して濾過し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含む冷却ＲＰＭＩ−１６４０培養培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に収集した。ＣＯＢＥ処理の前に、膵臓消化物を冷却ＵＷ溶液中、ＳＯＤ擬似物（３４μｍｏｌ／ｌ）の存在下、または非存在下で４５分間インキュベートした。続けて、精製および培養を第一の実験系に記載したように行った。

糖尿病マウスの腎臓皮膜下への膵島移植
４つの異なる組織からの２００〜１０００ＩＥＱ（島当量）の膵島移植片を、移植前の少なくとも２時間、ＳＯＤ擬似物存在下で培養するか、または対照条件下で維持した。ストレプトゾトチン誘発性糖尿病（Sigma, ２５０ｍｇ／ｋｇ体重）ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウス、または非空腹時の血糖レベルが３００ｍｇ／ｄｌより高いＲａｇ１マウス（Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME）をレシピエントとして使用した。動物の腹腔内にアベルティン（Ａｖｅｒｔｉｎ）（０.３０〜０.４０ｍｇ／グラム体重）を注射して麻酔した。対照またはＳＯＤ処置した膵島を、マウス腎臓皮膜下に移植した（Alexander et al, Diabetes 51 : 356-365 (2002)）。成功した移植は、移植後の糖レベルが２００ｍｇ／ｄｌ未満に減少していることによって判定した。移植から４〜７週間後、正常化したレシピエントに、膵島移植片を取り除くための腎摘出を施術した。高血糖の回復が、膵島移植片の機能を間接的に証明すると解釈された。

統計学的方法
スチューデントのｔ‐検定、マン−ホイットニー非母数検定法、および、カプランおよびメイヤー分析法（Kaplan and Meier analysis）によって、統計学的分析を行った。Ｐ値が０．０５未満で統計学的に有意であるとした。

（結果）
ＳＯＤ擬似物の存在は、膵島細胞量を保護する。

９つのドナー膵臓から分離した膵島を２グループに分割し、ＣＭＲＬ−１０６６単独で、またはＳＯＤ擬似物を補充して培養した。図１４の結果は、全ての実験グループ（ｎ＝９）で、対照と比較したとき、細胞量の平均３倍の上昇が観察されたことが示されている（ｐ＝０．０２）。対照グループと実験グループの間のＤＮＡ含量の差異が、明らかに２日目（分離後２４時間）から始まり、残りの培養期間にわたって着実に観察されたことに留意すべきである。しかしながら培養初期の２４時間に、初期細胞量の２０〜４０％を占める、対照およびＳＯＤ処置した膵島標本において、細胞量の類似した減少が観察された。これらのデータは、分離から２４時間以内の極めて早い時期に死ぬ細胞に対する保護作用を持たないにも関わらず、ＳＯＤ擬似物の添加によって細胞損失が長期間、有意に減少することを示している。

細胞生存度
ＳＯＤ擬似物処置標本の内に、死んだ非分解細胞が高い割合で存在することによって、ＤＮＡ含量が影響されているかどうかを評価するために、二重蛍光生死判別（double fluorescence viability）を行った。その結果、対照およびＳＯＤ処置集合体の両者において、類似した数の生細胞と死細胞が存在し、しかし、膵島の数は対照グループよりＳＯＤ処置グループの方が高かった。培養期間後期の段階で、対照標本は、より高い死細胞含量を示したが、その差異は統計学的有意にまで届かなかった（表２ａ）。

静的グルコース曝露およびインビトロにおける膵島機能
膵島のグルコース応答性を、静的グルコース曝露方法によって分離から３〜５日目の間に分析した（表２ｂ）。絶対値として、またはインシュリン含量の割合として表現される、グルコース刺激によるインシュリン放出および刺激指数は、培養処置にかかわらず類似した。基本的なインシュリン放出もグループによって異ならなかった。

ＳＯＤ擬似物の添加が、分離されたヒト膵島（ｎ＝３）の９０分の洗い流し手順の間にインシュリン放出に及ぼす影響も、一定のグルコース濃度の下で調査された。その結果、ＳＯＤ擬似物の追加は、インシュリン分泌に影響しないことが示された。基本的な放出は、ＳＯＤ擬似物の培地への添加にかかわらず、全てのグループで類似した。

全細胞量の性質決定
ＳＯＤ処置標本における高ＤＮＡ含量が、非膵島組織が選択的に生存したことによる可能性を排除するために、免疫細胞化学によって膵島標本（ｎ＝５）の性質を決定した。前インシュリン（ベータ細胞）、グルカゴン（アルファ細胞）、アミラーゼ（外分泌）、およびＣＫ１９（管細胞）の相対的な割合を測定した（図１５Ａ）。全ての場合で、ＳＯＤ擬似物処置グループと対照グループとの細胞組成の差異は最小限であった。両者のグループで、アミラーゼ免疫応答細胞が培養処置にかかわらず減少し（ｐ＜０．０１）、開始時の２０％程度から、培養後のごく小さい値に変化した。前インシュリン陽性細胞の割合（ベータ細胞の％）を、細胞数の指標として用いられるＤＮＡ含量の画分として表したとき、その結果から、ＳＯＤ擬似物処置によってベータ細胞量が最小で１．３から最大で４．５倍増加することが示された（図１５Ｂ）。これらのデータは、ＳＯＤによる膵島の処置が、膵島の機能に明らかな調節不全をおこすことなく全体的なベータ細胞量を増加させることを示している。

ＳＯＤ擬似物の初期投与が細胞損失を減じる
さらなる第三の実験の目的は、ＳＯＤ擬似物を消化期間中に投与することが、分離後の培養中に添加するのに比べて、細胞の生存により保護的な役割を果たすかどうかを測定することである。分離された膵島の品質におけるドナーの変数の影響を避けるために、臓器を二つの部分に分割する技術的アプローチを採用した。Ｌｉｂｅｒａｓｅ^TM溶液をＳＯＤ擬似物と共に、またはＳＯＤ擬似物なしで注入した後、全てのグループで任意のインキュベーション時間３０分を維持した。重要なことに、ＳＯＤ擬似物が存在しても消化期間が影響を受けるようには見えない。各ドナー臓器の処置標本および対照標本からは、類似した純度の膵島画分が得られた。図１６は、分離後の対照膵島標本および実験膵島標本における、ＤＮＡ含量の相対的な変化を示す。このデータは、３つの全ての場合において、分離から２４時間後にはＳＯＤ処置臓器における膵島細胞量の有意な（ｐ＝0.0001）上昇が明らかであり、この相違は時間が経過しても維持されることを示している。処置膵島および対照膵島のインビトロにおける生存度および機能的容量を試験した。両方の場合で、処置に関連した相違がなく、膵島標本サンプル中に８０％以上の生細胞が計数された。インシュリン含量値、膵島あたりの基本インシュリン放出および刺激されたインシュリン放出もまた、二つのグループで相違なかった。これは、消化期間にＳＯＤ擬似物を添加したことによって、機能的な膵島の数が対照に対してより大きくなったことを示している。

糖尿病マウスの正常化
糖尿病レシピエントマウスは、対照およびＳＯＤ擬似物処置グループから膵島移植を受けるように無作為に割り当てられた（図１７）。各グループの第一の３レシピエントは、７００〜１０００ＩＥＱの膵島量を受けとった。６レシピエントは全て、移植期間後の最初の週にグルコースレベルが正常化した。移植した膵島の数が移植片あたり４００ＩＥＱより少ない場合、ＳＯＤ処置した膵島のレシピエントは全て（ｎ＝９）正常化されるが、対照グループでは、３つの膵島移植片（それぞれ、２００、２２０および、４００）のレシピエントは、血糖レベルが一度も正常化しなかった。成功した全ての移植において、動物は正常血糖を３０日以上維持した。この移植片が腎摘出によって取り除かれた場合、全てのマウスは高血糖状態に戻った。

上記で引用された文献はすべて、その全ての内容を本明細書の一部として援用する。

ＳＯＤ擬似物の投与は、糖尿病誘発性Ｔ細胞クローンＢＤＣ−２．５を移植した後の若いＮＯＤ（非肥満性糖尿病）．ｓｃｉｄ（重症複合免疫不全）レシピエントにおいて、Ｔ細胞が媒介する糖尿病を遅延または予防する。図１Ａは、９−１４日齢のＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスに１×１０⁷のＢＤＣ−２.５Ｔ細胞クローンを養子移入する１日前に、１０ｍｇ／ｋｇのＳＯＤ擬似物（丸）またはＨＢＳＳ対照（四角）を腹腔内に注入した。ＳＯＤ擬似物はその後、一日おきに計５日与えた。図１Ａに示したデータは、３つの別々の実験を組み合わせたものである。図１Ｂは、Ｔ細胞クローンＢＤＣ−２.５を養子移植した後の、ＳＯＤ擬似物処置または対照の若いＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスの膵臓組織学を表す。（ａ）は、ＢＤＣ−２.５を養子移入した後の、陽性対照、即ち若いＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスの、重度に浸潤した膵臓のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。（ｂ）および（ｃ）は、ＢＤＣ−２.５を養子移入した後の、ＳＯＤ擬似物（１０ｍｇ／ｋｇ）を処置した若いＮＯＤ．ｓｃｉｄの膵臓のＨ＆Ｅ染色。（ｄ）は、ＳＯＤ擬似物処置ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスの膵臓のアルデヒド−フクシン（Ａ／Ｆ）染色。図２Ａ〜Ｃは、３種のＴ細胞刺激を用いた、ＳＯＤ擬似物で処置したＢＤＣ−２.５処置細胞によるインビトロでのＩＦＮ−γの産生。図２Ａでは、９６穴丸底プレートを予め、０．１２５μｇ／ｍｌのα−ＣＤ３および１μｇ／ｍｌのα−ＣＤ２８で１時間、３７℃でコーティングした。そのプレートは、滅菌ＨＢＳＳで２回洗浄し、それから完全培地（ＣＭ）で３７℃、１時間ブロックした。ブロッキング溶液を取り除き、ＳＯＤ擬似物が３４および１７μＭで存在している、または存在しないウェルに２×１０⁴のＢＤＣ−２.５クローンを加えた；陰性対照は、α−ＣＤ３およびα−ＣＤ２８なしのＢＤＣ−２.５である。培養物は、３７℃で４８時間インキュベートし、上清を集め、サンドウィッチＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γ産生を分析した。データは、３つの別々の実験の平均値およびＳＥＭである；ｐ値は、統計学的有意性が認められた条件に示した。図２Ｂは、ＳＯＤ擬似物が３４μＭおよび１７μＭの濃度で存在する、または存在しない９６穴平底プレートに、ＡＰＣ（抗原呈示細胞／ｓ）として５×１０⁵の照射された同質遺伝的脾臓細胞、およびＣｏｎＡ（２．５μｇ／ｍｌ最終濃度）と共に、或いはなしで、２×１０⁴細胞／ウェルのＢＤＣ−２．５Ｔ細胞を蒔いた。培養物を３７℃で２４時間インキュベートし、上清を集めてＩＦＮ−γ産生をサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。データは、３つの別々の実験の平均値およびＳＥＭである。図２Ｃは、９６穴平底プレートを用い、２×１０⁴細胞／ウェルの密度のＢＤＣ−２．５Ｔ細胞クローンを、抗原として５０００の膵島細胞と、２．５×１０⁴のＡＰＣと共に、１７および３４μＭのＳＯＤ擬似物存在下、または非存在下で培養した。培養物は３７℃で４８時間インキュベートし、上清を集めてＩＦＮ−γ産生をサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。データは、３つの別々の実験の平均値およびＳＥＭである。ＳＯＤ擬似物による、２．５ＴＣＲＴｇ（遺伝子組み替え）／ＮＯＤマウスのインビボでの処置。２．５ＴＣＲ−Ｔｇ／ＮＯＤマウスに、１０ｍｇ／ｍｌのＳＯＤ擬似物またはＨＢＳＳを７日間処置した。８日目に動物から脾臓細胞を集め、ＳＯＤ擬似物マウスまたは対照マウスからＴ細胞を精製し、ＳＯＤ擬似物マウスまたは対照マウスの何れからも、交差方法でＡＰＣ（３×１０⁵細胞／ウェル）と共に蒔いた（６×１０⁴細胞／ウェル）。培養物は、１μＭのＨＲＰＩ−ＲＭペプチドでパルスして、培養４日目に収集する前に、プレートを（１μＣｉ ³Ｈ−ＴｄＲ）で６時間パルスした。値は、三重のウェルの平均値およびＳＥＭである。データは、二重の実験の代表である。図４は、腹膜マクロファージによるＬＰＳ（リポポリサッカリド）−誘導性呼吸器バーストおよびサイトカイン産生。図４Ａでは、腹膜マクロファージ（ＰＣ）を、初回刺激を受けていないＮＯＤマウスから集め、大腸菌ＬＰＳ（０５５：Ｂ５）を２００ｎｇ／ｍｌ含むＣＭが入った２４ウェルプレートに、最終濃度３４μＭまたは３．４μＭのＳＯＤ擬似物が存在するまたは存在しない条件下で蒔いた（５×１０⁵ 細胞／ウェル）。培養物は３７℃で４８時間インキュベートした；細胞は、トリプシン処理し、洗浄してトリプシンを除き、続いて遠心チューブに移した。ＰＭＡは最終濃度５０ｎｇ／ｍｌで加えた。３７℃、２０分のインキュベーション後、フェリチトクロムＣの減少を、ε＝２０,０００Ｍ^-1ｃｍ^-1を用いて分光光度的に測定し、スーパーオキシドの産生を分析した。この減少は、１０分間以上観察した。データは三重のウェルの平均値およびＳＥＭであり、二重実験の代表である。図４Ｂでは、初回刺激を受けていないＮＯＤマウスの腔を、各動物につき７ｍｌのＨＢＳＳで洗浄して、腹膜マクロファージを集めた。その細胞を滅菌ＨＢＳＳで２回洗浄し、２４穴プレートを用いて、２００ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳ（０５：Ｂ５）を含むＣＭ中に、３４および１７μＭの濃度のＳＯＤ擬似物の存在下、または非存在下で、５×１０⁵細胞／ウェルに調節した。培養物は、３７℃で４８時間インキュベートし、上清を集めて、ＴＮＦ−α産生を特異的サンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。データは、３つの別々の実験の平均値およびＳＥＭである。ＳＯＤ擬似物処置したＮＩＴ−１細胞のアロキサンおよびサイトカイン細胞毒性。図５Ａでは、ＮＩＴ−１細胞は、１２ウェル組織培養皿で増殖して集密させた。培地を取り除き、ＰＢＳのみ、または３４μＭのＳＯＤ擬似物を含むＰＢＳに交換した。全ての溶液に４％ＦＣＳを補充した。１時間のインキュベーション後、適切なウェルに１０ｍＭのアロキサンを加え、細胞をさらに２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、トリプシン処理によって収集し、エチジウムブロミド／アクリジンオレンジ蛍光によって生存度を測定した（白抜き：生細胞、黒塗り：生細胞アポトーシス）。データは、二重実験の代表である。ＮＩＴ−１細胞は、１２穴プラスチック組織培養皿で増殖させ、８０％集密させた。増殖培地を取り除き、５００μｌ／ウェルの培地のみ、または培地＋３４μＭＳＯＤ擬似物のいずれかと交換した。１時間のインキュベーション後、５００μｌ／ウェルの培地のみ、培地または２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）＋／− ３４μＭのＳＯＤ擬似物を加えた。細胞をさらに４８時間インキュベートし、エチジウムブロミド／アクリジンオレンジ蛍光によって生存度を測定した（白抜き：生細胞、黒塗り：生細胞アポトーシス）。値は、各処理につき、３つのウェルの平均値およびＳＥＭである。ＳＯＤ擬似物（ＡＥＯＬ１０１１３）のインビボでの処置による、ストレプトゾトチン誘導性糖尿病からの保護。ＳＯＤ擬似物と共にインビトロで培養することによる、ストレプトゾトチン誘導性糖尿病からの膵島移植片の保護。ＳＯＤ擬似物を用いたインビトロでの事前処置による、自然発症性糖尿病ＮＯＤマウスにおける膵島移植の促進。特異的なポルフィリン擬似物の構造。特異的なポルフィリン擬似物の構造。特異的なポルフィリン擬似物の構造。特異的なポルフィリン擬似物の構造。特異的なポルフィリン擬似物の構造。特異的なポルフィリン擬似物の構造。膵島細胞量の保存割合を、ＡＥＯＬ１０１１３の存在下または非存在下で、２日目から７日目のＤＮＡ含量によって測定した。消化手順中に、リベラーゼ（liberase）にＳＯＤ擬似物ＡＥＯＬ１０１５０を添加することによって、ヒト膵島細胞量が対照と比較して増加する。図１２は、ＳＯＤ２ノックアウトマウスの大脳皮質培養物の促進的なニューロンの死を表す。図１２Ａは、環境酸素レベルにおいて、血清離脱症状後の、ＳＯＤ２ノックアウト（＋／＋、＋／−または−／−）マウスの皮質性培養物における細胞死の時間経過。ｎ＝１６〜２０、*ｐ＜０．０１。ＳＯＤ２−／−培養物における血清離脱症状後２日目の、ＡＥＯＬ化合物の細胞死の阻害効果。ｎ＝１０〜１６培養物。ＳＯＤ２−／−培養物における血清離脱症状後３日目の、ＡＥＯＬ化合物の細胞死の阻害効果。ｎ＝１０〜１６培養物。ＳＯＤ２欠損または正常ニューロンの５日目の生存。ＡＥＯＬ化合物は、培地を無血清条件に変化させてから５日目の、＋／−および＋／＋（正常）ニューロンのニューロン生存度を上昇させた。ＳＯＤ２欠損または正常ニューロンの５日目の生存。ＡＥＯＬ化合物は、培地を無血清条件に変化させてから５日目の、＋／−および＋／＋（正常）ニューロンのニューロン生存度を上昇させた。ＳＯＤ２欠損または正常ニューロンの５日目の生存。ＡＥＯＬ化合物は、培地を無血清条件に変化させてから５日目の、＋／−および＋／＋（正常）ニューロンのニューロン生存度を上昇させた。培養期間２〜７日目の間における、膵島細胞量の保存されたパーセント、対照グループ（斜線）およびＳＯＤ擬似物処置グループ（白抜き）（ｎ＝９）。２日目に（分離から２４時間後）測定したＤＮＡ含量は任意に、開始時の参考値とみなした。グループ間の差異は、統計学的に有意であった（ｐ＝０．０２；マン−ホイットニー試験）。５つのヒト膵臓からの膵島標本の、培養前後の免疫細胞化学的特性。陽性細胞の数を計数し、総計のパーセントとして表した。前インシュリン陽性細胞のパーセントは、培養期間中、処置とは無関係に全ての標本で維持された。培養後、対照標本およびＳＯＤ擬似物処置標本の両者で、アミラーゼ陽性細胞の統計学的に有意な（*ｐ＜０．０１；ｔ試験）減少が観察された。棒グラフは、培養期間において、ＳＯＤ擬似物処置標本の保存されたベータ細胞量が対照と比較して倍増したことを示す。ベータ細胞量は、細胞数の指標としてＤＮＡ含量と、免疫細胞化学的分析（Keymeulen et al, Diabetologia 41 : 452-459 (1998)）を組み合わせて算出した。ＳＯＤ擬似物グループ（点線）および対照グループ（実線）の膵島標本の生存率。ドナー膵臓（ｎ＝３）は二つの断片に分割し、分離の間、ＳＯＤ擬似物で処置し、または処置しなかった。カプランおよびメイヤー分析から、ＳＯＤ処置した膵臓組織において、対照組織と比較して膵島細胞損失が減少していることが推論される（対数ランク、ｐ＝０．０００１）。驚くべきことに、この相違は２４時間後に見られた。図１７は、インビボでの膵島移植片の代謝能力。種々の膵島量の膵島移植に続く、血糖症正常化時間。対照：四角、ＳＯＤ擬似物：白丸。

図１７Ａは、膵島移植片：２００〜２２０ＩＥＱ、対照ｎ＝４、ＳＯＤ擬似物ｎ＝４。
膵島移植片：〜４００ＩＥＱ、対照ｎ＝４、ＳＯＤ擬似物ｎ＝４。膵島移植片：７００〜１０００ＩＥＱ、対照ｎ＝３、ＳＯＤ擬似物ｎ＝３。図１８は、本発明において使用されるのに適した化合物の一般的な構造および特異的な構造（遊離または金属結合形態）。図１８は、本発明において使用されるのに適した化合物の一般的な構造および特異的な構造（遊離または金属結合形態）。図１８は、本発明において使用されるのに適した化合物の一般的な構造および特異的な構造（遊離または金属結合形態）。本発明の擬似物は式ＩまたはＩＩであることができる。図１８は、本発明において使用されるのに適した化合物の一般的な構造および特異的な構造（遊離または金属結合形態）。本発明の擬似物は、例えば図１８Ｃに示された式ＩまたはＩＩの二量体であることができる。図１８は、本発明において使用されるのに適した化合物の一般的な構造および特異的な構造（遊離または金属結合形態）。図１８は、本発明において使用されるのに適した化合物の一般的な構造および特異的な構造（遊離または金属結合形態）。図１８は、本発明において使用されるのに適した化合物の一般的な構造および特異的な構造（遊離または金属結合形態）。図１８は、本発明において使用されるのに適した化合物の一般的な構造および特異的な構造（遊離または金属結合形態）。図１８は、本発明において使用されるのに適した化合物の一般的な構造および特異的な構造（遊離または金属結合形態）。図１８は、本発明において使用されるのに適した化合物の一般的な構造および特異的な構造（遊離または金属結合形態）。図１８は、本発明において使用されるのに適した化合物の一般的な構造および特異的な構造（遊離または金属結合形態）。

Claims

糖尿病の予防方法または治療方法であって、そのような予防または治療を必要とする患者に、該予防または治療を行うために十分な量の低分子量抗酸化薬を投与することを含む方法。
前記抗酸化薬は、ポルフィンまたはテトラピロール、あるいは薬剤的に許容されるそれらの塩である、請求項１に記載の方法。
前記ポルフィンまたはテトラピロールは、マンガン、鉄、銅、コバルト、またはニッケルからなる群から選択される金属に結合される、請求項２に記載の方法。
前記金属はマンガンである、請求項３に記載の方法。
前記化合物は、マンガンが置換したＡＥＯＬ１０１１３または１０１５０である、請求項４に記載の方法。
前記糖尿病は、自己免疫性疾患による膵臓島細胞死に起因した糖尿病である、請求項１に記載の方法。
前記糖尿病は、フリーラジカルが誘導する毒性による膵臓島細胞死に起因した糖尿病である、請求項１に記載の方法。
糖尿病特異的微小血管疾病を予防または治療する方法であって、そのような予防および治療を必要とする患者に、該予防または治療を行うのに十分な量の低分子量抗酸化薬を投与することを含み、前記抗酸化薬はポルフィンまたはテトラピロール、あるいは薬剤的に許容されるそれらの塩である方法。
前記ポルフィンまたはテトラピロールは、マンガン、鉄、銅、コバルト、またはニッケルからなる群から選択される金属に結合される、請求項８に記載の方法。
前記金属はマンガンである、請求項９に記載の方法。
糖尿病で促進されるマクロ血管アテローム性動脈硬化症の予防方法または治療方法であって、そのような予防または治療を必要とする患者に、該予防または治療を行うために十分な量の低分子量抗酸化薬を投与することを含み、前記抗酸化薬はポルフィンまたはテトラピロール、あるいは薬剤的に許容されるそれらの塩である方法。
前記ポルフィンまたはテトラピロールは、マンガン、鉄、銅、コバルト、またはニッケルからなる群から選択される金属に結合される、請求項１１に記載の方法。
前記金属はマンガンである、請求項１２に記載の方法。
免疫寛容を誘導する方法であって、そのような誘導を必要とする患者に、該誘導をもたらすために十分な量の低分子量抗酸化薬を投与することを含む方法。
前記抗酸化薬は、ポルフィンまたはテトラピロール、あるいは、薬剤的に許容されるそれらの塩である、請求項１４に記載の方法。
前記ポルフィンまたはテトラピロールは、マンガン、鉄、銅、コバルト、またはニッケルからなる群から選択される金属に結合される、請求項１５に記載の方法。
前記金属はマンガンである、請求項１６に記載の方法。
前記患者は移植のレシピエントであり、前記抗酸化薬は該患者に該移植に対する耐性を与える、請求項１４に記載の方法。
細胞、組織、または臓器の生存度を高める方法であって、該生存度が高められるような条件下で、前記細胞、組織、または臓器を、低分子量抗酸化薬と接触させることを含む方法。
請求項１９に記載の方法であって、前記細胞、組織、または臓器は宿主に移植され、該移植された細胞、組織、または臓器の生存度が高められる方法。
前記抗酸化薬はポルフィンまたはテトラピロールである、請求項１９に記載の方法。
前記ポルフィンまたはテトラピロールは、マンガン、鉄、銅、コバルト、またはニッケルから成る群から選択される金属と結合される、請求項２１に記載の方法。
前記金属はマンガンである、請求項２２に記載の方法。
前記細胞はニューロンの細胞である、請求項１９に記載の方法。