JP2005503177A - ヒト乳頭腫ウイルスの感染を診断するための遺伝子型同定キット - Google Patents
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Abstract
本発明はヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の感染を診断するための遺伝子型同定キット、ＨＰＶ遺伝子型同定のためのプローブ、及び該プローブを含むＤＮＡチップに関する。また、本発明はヒト乳頭腫ウイルスの感染を診断する方法にも関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
（ａ）発明の背景
本発明は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の感染を診断するための遺伝子型同定キット及び診断方法、そしてこれに利用されるプローブ及びＤＮＡチップに関する。より具体的には、本発明は、ＤＮＡチップを使用して感染患者の臨床サンプルからヒト乳頭腫ウイルスを検出するためのヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型同定キット、前記ＤＮＡチップの調製のための処理、及び前記遺伝子型同定キットを使用して患者の遺伝子型を同定することにより、ヒト乳頭腫ウイルスの感染を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（ｂ）関連技術の説明
子宮癌には子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫などがあるが、これらのうち子宮頸癌は、毎年、全世界で約４５万人、韓国で約６０００人の新たな患者が発生している。子宮頸癌は、韓国女性の癌の２２．１％に達し（子宮頚部上皮内腫瘍症を含む）、発生率の１位、死亡率の２位を占めているため、子宮頸癌の予防、診断、及び治療は女性保健において重要な問題とみなされている。
【０００３】
子宮頸癌は、子宮頸部上皮内腫瘍症（ＣＩＮ）という癌前段階を通じて進行するが、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の感染が子宮頸部腫瘍の発生に重要な役割を果たすことが知られている。特に、特定の遺伝子型ＨＰＶに感染した場合に腫瘍に進行する可能性はより高くなる。ヒト乳頭腫ウイルスが子宮頸癌の主な原因として知られてから現在まで、ＨＰＶは７０種類余りの遺伝子型が同定されており、病巣の位置と病変の進行程度とによって各々特異的なＨＰＶの遺伝子型が選択的に発見されているため、ＨＰＶの感染の生物学的特徴の多様性が認識されている。生殖器感染ＨＰＶの遺伝子型のうち、１０以上の遺伝子型が高リスク群に分類され、子宮頸癌と関連が知られている。これらの発見にもとづき、ＨＰＶ感染の生物学的特徴の多様性を特徴づけることは、子宮頸癌の診断及び予防に重要な意味を持つと考えられている。
【０００４】
子宮頸癌の最も簡易な早期診断法はパパニコロー塗抹標本法で、これは病理細胞学的検査であり、子宮表面から最外層の老化した細胞を採集、染色して、上皮細胞核の周囲に空胞化を示すコイロサイトーシス（ｋｏｉｌｏｃｙｔｏｓｉｓ）などのＨＰＶ感染の特徴的な病理所見で診断する方法である。しかしパパニコロー塗抹標本法の診断率が１〜１５％と低く、診断において他にも多くの制限があるため、これを補完しより信頼できる診断とするためには、膣鏡検査などが必要となる。膣鏡検査によりＨＰＶ感染の７０％までが検出できるが、設備が高価で、高度に熟練した判断者が必要であり、悪性化の危険度の面で異なるＨＰＶ遺伝子型を判定することができないという短所があった。このため、子宮頸癌または子宮頸癌前段階病変の診断のための、パパニコロー塗抹標本法のような従来のスクリーニング法の補助的手段または選別検査として、ＨＰＶの検出とＨＰＶ遺伝子型を同定する技術の開発に関する研究が、持続的に進められている。
【０００５】
前記ＨＰＶの検出及びＨＰＶ遺伝子型の同定方法は、大きく、ＨＰＶのＤＮＡを直接検出する方法と、ＨＰＶのＤＮＡの増幅を利用する方法とに分けられる。前記ＨＰＶのＤＮＡを直接検出する方法としては、液中ハイブリダイゼーション（ｌｉｑｕｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，米国メリーランド州、ｗｗｗ．ｄｉｇｅｎｅ．ｃｏｍによる、ハイブリッドキャプチャキット）、ＨＰＶ型特異的プローブを用いるサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）及びドットブロット（Ｄｏｔ ｂｌｏｔ）、フィルターインサイチュハイブリダイゼーション（Ｆｉｌｔｅｒ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）などがあり、ＨＰＶのＤＮＡの増幅を利用する方法としては、型特異的ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、及びゼネラルプライマーＰＣＲ（ｇｅｎｅｒａｌ−ｐｒｉｍｅｒ ＰＣＲ）などがある。特にゼネラルプライマーセットを利用して増幅したＨＰＶ ＤＮＡの遺伝子型分析は、ドットブロットハイブリダイゼーション、マイクロタイタープレートハイブリダイゼーション（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、またはラインプローブ分析（ｌｉｎｅ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ）などを用いる方法が一般に行われている。これらの方法のうち、ハイブリッドキャプチャによる液中ハイブリダイゼーション、及びゼネラルプライマーＰＣＲに続いてのラインプローブ分析は、診断に最も適していると見なされてきた。しかしニトロセルロース膜にオリゴヌクレオチドプローブを固定して約２０型を検出するラインプローブ分析は、感度が低くデータの解釈が困難であり、信頼性が低いという短所がある。商品化されているハイブリッドキャプチャキットは、ＨＰＶのＤＮＡを臨床試料から容易に分離してＰＣＲ増幅反応なしで検出することができ、当該ＨＰＶのＤＮＡが高リスク群に属しているか低リスク群に属しているかを識別できる。しかしハイブリッドキャプチャキットでは感染ＨＰＶの正確な遺伝子型を識別できないため、高リスク群の中でも癌発生率が非常に高い型を、他の高リスク群（中リスク群とも言える）と区別することができない。またＲＮＡプローブを利用するために安定性が低いので、汚染の可能性を排除できないという問題点がある。
【０００６】
これらの状況から、ＨＰＶ感染の検出、及び感染したＨＰＶの遺伝子型同定が、簡易で正確に行えるだけでなく、高い特異性及び感度を有するＨＰＶ感染の検出及び遺伝子型の同定のための方法及び遺伝子型同定キット、これに利用されるプローブ及びＤＮＡチップを開発する必要性が出てきた。また、前記遺伝子型同定キットとこれに利用されるプローブ及びＤＮＡチップは、可能な限り多様な型のＨＰＶを高い特異性及び感度で分析し、ＨＰＶ感染及び遺伝子型同定を、より正確に診断できなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本発明の目的は、高い特異性及び感度でより正確なＨＰＶ感染の検出、及びＨＰＶの遺伝子型同定のために、ＨＰＶのＤＮＡと相補的な塩基配列を持つ新規なプローブを提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、ＨＰＶのＤＮＡと相補的な塩基配列を持つプローブを含む、ＨＰＶ感染の検出及びＨＰＶ遺伝子型の同定のための、ＤＮＡチップを提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記ＨＰＶ感染の検出及びＨＰＶ遺伝子型の同定のための新規なＤＮＡチップを含む、ＨＰＶ遺伝子型同定キットを提供することにある。
【００１０】
本発明のさらなる他の目的は、ＨＰＶ感染の検出及びＨＰＶ遺伝子型の同定のための新規なＤＮＡチップを使用して、ＨＰＶ感染の診断及びＨＰＶ遺伝子型同定を行う方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、ＨＰＶの感染検出及び遺伝子型同定のための新規なＤＮＡチップを使用したＨＰＶの感染検出及び遺伝子型を診断する方法において、新規なＰＣＲ増幅反応で試料ＤＮＡを増幅させる方法を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
好ましい形態の詳細な説明
本発明のヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）感染を診断するための遺伝子型解析キットは、ＨＰＶのＤＮＡと相補的に結合することができる塩基配列を有するプローブを含むＤＮＡチップ、臨床試料から採取したＤＮＡをＰＣＲ増幅反応方法で増幅させるためのプライマー、及び前記ＤＮＡチップのプローブとハイブリダイズされる増幅ＤＮＡを標識するための標識手段を含む。
【００１３】
本発明の発明者は、簡易な方法で患者の遺伝子型を識別してＨＰＶ感染を検出し、感染したＨＰＶ型を正確に判別することができる方法を確立するために研究努力した結果、ＨＰＶのＤＮＡと相補的な塩基配列を持つプローブ、及びこれを含むＤＮＡチップを開発した。さらに、ＨＰＶのＤＮＡに相補的な塩基配列を持つプローブを含むＤＮＡチップ、臨床試料から採取したＤＮＡをＰＣＲで増幅させるためのプライマー、及び前記ＤＮＡチップとハイブリダイズされる増幅ＤＮＡを探知するための標識手段を含むＨＰＶの遺伝子型同定キットを製作し、前記遺伝子同定キットを使用して患者の試料から採取したＤＮＡの遺伝子型を識別することにより、簡易で正確な方法で、ＨＰＶの感染を検出し、かつ感染ＨＰＶの遺伝子型を識別しすることに成功した。
【００１４】
本発明は、ＨＰＶ ＤＮＡの塩基配列、好ましくはＨＰＶ ＤＮＡのＬ１領域に相補的な塩基配列をプローブとして提供する。本発明のプローブは、配列番号１〜３０に示された塩基配列を含む（表１ａ及び表１ｂ）。表１のうち、配列番号２５の下線部分は、プローブ機能のために適した立体配座を提供するために付加された配列である。
【表１ａ】
【表１ｂ】
【００１５】
本発明のプローブを利用すると、高い特異性及び感度でＨＰＶ感染の検出及び遺伝子型の同定ができ、特に本発明のプローブは、ＰＣＴ／ＫＲ／０１２１３号（２０００年１０月２６日付出願）に記載されたＨＰＶの遺伝子型同定用プローブと比較して、その高い特異性及び感度を特徴とする。本発明のプローブのうち配列番号１〜２０のプローブのＨＰＶ １３、２６、３０、４３、５３、５４、５５、５７、６１、６２、６４、６７、６８、６９、７０、７４、及びＪＣ９７１０は、前記出願に記載された遺伝子型同定キットには含まれないＨＰＶ型に対するプローブであり、したがって、本発明のプローブを利用してＨＰＶの遺伝子型を識別する場合、より多くのＨＰＶ型を探知することができるので、より正確さに貢献する。ＰＣＴ／ＫＲ／０１２１３号に記載されたＨＰＶの遺伝子型同定用プローブは、配列番号３１〜４１を含み、追加的にＨＰＶ１６、３４、３５、４０、５６、５８、５９、及び６６に対するプローブを含む。
【００１６】
本発明のＤＮＡチップは、配列番号１〜３０に示された塩基配列を有するプローブの中から選択された１種以上のＨＰＶプローブを含むことができる。また、追加的に、マーカーとしてβ−グロビン配列を含むことができ、好ましい配列は配列番号４２に示されている。本発明の一例として、前記ＤＮＡチップには、本発明の当業者が容易に組み合わせられる全てのプローブ配列セットを含むＤＮＡチップが含まれ、以下のような例も含まれる。
【００１７】
例１）
配列番号１〜３０に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びこれらオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より選択された１種以上のＨＰＶプローブを含むＤＮＡチップ。
【００１８】
例２）
i）配列番号１〜３０に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びこれらオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より択された１種以上のＨＰＶプローブ、及び
ii）配列番号３１〜４１に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された１種以上のＨＰＶプローブ
を含むＤＮＡチップ。
【００１９】
例３）
i）配列番号１〜２０に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された１種以上のＨＰＶプローブ、
ii）配列番号２１〜３０に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された８種のＨＰＶプローブ、及び
iii）配列番号３１〜４１に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有する１１種のＨＰＶプローブ
を含むＤＮＡチップ。
【００２０】
例４）
i）配列番号４〜１０に示された塩基配列を有するプローブの中から選択された９種のＨＰＶプローブ、
ii）配列番号２１〜３０に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された８種のＨＰＶプローブ、及び
iii）配列番号３１〜４１に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有する１１種のＨＰＶプローブ
を含むＤＮＡチップ。
【００２１】
例５）
i）配列番号４、１５、及び１６に示された塩基配列を有する３種のＨＰＶプローブ、
ii）配列番号２１〜３０に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された８種のＨＰＶプローブ、及び
iii）配列番号３１〜４１に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有する１１種のＨＰＶプローブ
を含むＤＮＡチップ。
【００２２】
本発明の一例として、ＤＮＡチップは、プローブの位置を知らせる基準マーカーをさらに含むこともできる。マーカーとしては、β−グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素）遺伝子などを含むが、これに限定されない。好ましいマーカーはβ−グロビンであって、その配列を配列番号４２に示す。
【００２３】
また、本発明によって、ＨＰＶのＤＮＡと相補的に結合することができる塩基配列を有するプローブを提供する。本発明のプローブはＨＰＶ ＤＮＡと特異的にハイブリダイズされることを特徴とする。
【００２４】
一方、前記ＨＰＶの遺伝子型同定キットに含まれるＤＮＡチップの調製方法は、ＨＰＶ ＤＮＡと相補的に結合することができる塩基配列の５’末端にアミンが結合されたＤＮＡプローブを調製する工程；前記調製されたプローブをアルデヒドが結合された固体の表面に結合させる工程；及び前記ＤＮＡプローブが結合された固体の表面に存在するアミンと結合しないアルデヒドを還元させる工程；を含む。以下、本発明のＤＮＡチップ及びその調製方法を工程別に分けてより具体的に説明する。
【００２５】
第１工程：プローブの調製
ＨＰＶのＤＮＡと相補的に結合することができる塩基配列の５’末端にアミンが結合されたＤＮＡプローブを調製する。この時、プローブは、ＨＰＶのＤＮＡの塩基配列、好ましくはＨＰＶ ＤＮＡのＬ１領域と相補的に結合する塩基配列を有するように設計及び合成され、合成された塩基配列が固体の表面に結合することができるように塩基配列の５’末端にアミン基を結合させてプローブを調製する。
【００２６】
第２工程：プローブの固定化
前記調製されたプローブをアルデヒドが結合された固体の表面に結合させる。この時、固体は特に制限されないが、ガラスであるのが好ましく、固体の表面のアルデヒドは、この分野で知られた方法、つまりプローブの５’末端に結合されたアミンと３０〜４０℃の温度条件、７０〜１００％の湿度条件でシッフ塩基反応を行って、固体の表面にプローブを結合させる。この時、プローブの濃度は１００〜３００ｐｍｏｌ／μｌが好ましく、最も好ましくは２００ｐｍｏｌ／μｌである。また、前記固体の表面に全体的な位置マーカー及びハイブリダイゼーション反応に対する対照群の役割を果たすβ−グロビンを付着する。
【００２７】
第３工程：ＤＮＡチップの調製
前記プローブが結合された固体の表面に存在するアミンと結合しないアルデヒドを還元させてＤＮＡチップを調製する。この時、アルデヒドの還元条件は特に制限されないが、ＮａＢＨ４などの還元剤を用いるのが好ましい。
【００２８】
また、本発明は、前記ＤＮＡチップを含むＨＰＶ遺伝子型同定キット及びこれを使用したＨＰＶ感染の診断方法に関する。本発明は、
i）本発明によるＤＮＡチップ
ii）試料から採取したＤＮＡをＰＣＲ増幅反応方法で増幅させるためのプライマー、及び
iii）前記ＤＮＡチップとハイブリダイゼイズされた増幅ＤＮＡの標識手段
を含む、ＨＰＶ遺伝子型同定キットに関する。
【００２９】
本発明はまた、
i）前記ヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型同定キットのプライマー、例えば配列番号４３及び４４のプライマーを使用して、検査する試料から採取したＤＮＡを増幅させる段階、
ii）前記増幅ＤＮＡを前記遺伝子型同定キットのＤＮＡチップに適用して、増幅ＤＮＡとプローブとをハイブリダイズさせる段階、及び
iii）前記プローブとハイブリダイズされたＤＮＡを前記ＨＰＶの遺伝子型同定キットの標識手段で探知して、これを検出する段階
を含む、ＨＰＶ感染の診断のための方法に関する。
【００３０】
本発明の一例として、試料ＤＮＡの増幅は、通常のＰＣＲ増幅反応方法で行うことができ、好ましくは二段階ＰＣＲ増幅反応方法または２種以上のプライマーを使用して同時に増幅させる多重ＰＣＲ増幅反応方法を行ったり、より好ましくは２種以上のプライマーを使用して二段階で増幅させる多重二段階ＰＣＲ増幅反応方法を行うことができる。
【００３１】
また、ＨＰＶのＤＮＡの増幅のための最も適した条件を開発した結果、増幅方法論は二段階ＰＣＲ法または多重ＰＣＲ法である。
【００３２】
ＰＣＲ増幅反応法は、前変性、変性、プライマーアニーリング、及び鎖延長の段階から構成される。
【００３３】
従来は同一な反応条件下で反復して行う一段階ＰＣＲ増幅反応を行ったが、二段階ＰＣＲ増幅反応方法とは、異なる増幅反応、例えば変性段階、プライマーアニーリング段階、または鎖延長段階のうちの一つ以上の段階を異なる反応条件下で一部反復して行うことを言う。本発明では、第１増幅段階は通常の鎖延長段階に比べて短い時間行い、第２増幅段階は第１段階よりさらに短い時間行って、長時間（例えば１〜２分）鎖延長を行う場合に過度に長い産物が得られるのを防止することにより、プローブの特異性が高められるので好ましい。より好ましくは、ＰＣＲ増幅反応方法の鎖延長を第１増幅段階では２０〜３０秒間実施し、第２増幅段階では１０〜１５秒間実施することができる。
【００３４】
本発明において、ＨＰＶのプライマーを使用した試料と、マーカーであるβ−グロビン試料とを別個に増幅して分析することもできるが、配列番号４３及び４４のＨＰＶのプライマーと配列番号４５及び４６のβ−グロビンのプライマーとを共に使用して、一段階ＰＣＲ増幅反応を行うか、そうでなければ前記のように、二段階ＰＣＲ増幅反応を行うこともできる。
【００３５】
ＰＣＲ増幅は、ＨＰＶプライマー試料及びβ−グロビン試料のそれぞれを用いて実施するか、あるいは、配列番号４３及び４４に開示されるＨＰＶプライマーと配列番号４５及び４６に開示されるβ−グロビンプライマーを用いて、一段階または二段階で付随して実施しうる。
【００３６】
本発明の好ましい一例として、前記ＨＰＶのプライマー及びβ−グロビンのプライマー、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、標識物質、そしてＴａｑポリメラーゼを含み、場合によっては添加物としてＢＳＡ及びＤＭＳＯなどを使用してＰＣＲサーモサイクラーに入れ、９４℃で５分間変性した後、９４℃で１分間変性、４５〜５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で２０〜３０秒間鎖延長の過程を５回反復した後、９４℃で１分間変性、４５〜５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で１０〜１５秒間鎖延長の過程を３５回反復した後、７２℃で２分間さらに鎖延長して、標識物質が結合された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００３７】
以下、本発明のヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型同定キットを使用したヒト乳頭腫ウイルス感染の診断方法を段階別に分けてより具体的に説明する。
【００３８】
第１工程：試料ＤＮＡの増幅
臨床試料から採取したＤＮＡを、ＨＰＶ遺伝子型同定キットのプライマーを用いて増幅させるが、ここではビオチンを含有する増幅ＤＮＡを与える、ビオチン−１６−ｄＵＴＰを利用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実施される。増幅のための４つのプライマーを次の表２に示す。
【表２】
【００３９】
前記表１で、Ｒ（Ａ，ｇ）：Ｙ（Ｃ，Ｔ）：Ｍ（Ａ，Ｃ）：Ｋ（ｇ，Ｔ）：Ｓ（ｇ，Ｃ）：Ｗ（Ａ，Ｔ）、Ｖ（Ａ，Ｃ，ｇ）：Ｈ（Ａ，Ｔ，Ｃ）：Ｂ（ｇ，Ｔ，Ｃ）：Ｄ（ｇ，Ａ，Ｔ）：Ｎ（Ａ，ｇ，Ｃ，Ｔ）を意味し、これは当業者に広く知られている。
【００４０】
配列番号４３及び４４の塩基配列で構成されたＨＰＶの増幅用プライマーが提供され、また、配列番号４５及び４６の塩基配列で構成された新規なβ−グロビンのプライマーが提供される。
【００４１】
第２工程：ハイブリダイゼーション
前記増幅した試料をＤＮＡチップに適用して、プローブとハイブリダイゼーション反応を行う。
【００４２】
第３工程：検出
プローブとハイブリダイズされたＤＮＡを標識手段で探知して、これを検出してＨＰＶ感染を判断する。
【００４３】
標識手段は、Ｃｙ５、ビオチン結合化合物、Ｃｙ３、ＥＤＡＮＳ（５−（２’−アミノエチル）アミノ−１−ナフタレン硫酸）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミンイソシアネート（ＴＭＲＩＴＣ）、ｘ−ローダミン、またはテキサスレッドなどを含むが、これに限られない。好ましくは、Ｃｙ５及びビオチン結合物質である。標識物質の検出手段としては、コンフォーカルレーザースキャナー（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｅｒ）でスキャンして読み取る。
【００４４】
したがって、本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶの遺伝子型同定キットを使用して、ヒト乳頭腫ウイルスの感染を診断する場合、迅速かつ簡易で正確にＨＰＶの感染の検出及び遺伝子型の同定ができるので、子宮頸癌の早期診断、予防、及び治療に寄与することができる。
【００４５】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、当業界で通常の知識を有する者には自明なことである。特に、下記の実施例では２２または２８個のプローブが固定されたＤＮＡチップを調製したが、プローブの種類及び個数が特に制限されるわけではないので、ＨＰＶから誘導された塩基配列を有するプローブを利用したＤＮＡチップ及び前記ＤＮＡチップを使用した各種分析キットも、また本発明の範囲に属する。
【実施例】
【００４６】
実施例１：プローブの調製
ＨＰＶを１５種類の高リスク群（ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、６９）と７種類の低リスク群（ＨＰＶ型６、１１、３４、４０、４２、４３、４４）とに分類し、ＨＰＶの遺伝子型同定のために使用された各ＨＰＶの遺伝子型特異的プローブとβ−グロビン特異的プローブとは５’末端にアミン基が含まれるように調製した。各プローブの塩基配列は配列リストに示した。
【００４７】
実施例２：ＤＮＡチップの調製
前記実施例１で調製された各々のプローブを３×ＳＳＣ（４５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．４５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に２００ｐｍｏｌ／μｌになるように溶解させ、アルデヒド基が結合されたスライド（ｓｉｌｙｌａｔｅｄ ｓｌｉｄｅ、ＣＳＳ−１００、ＣＥＬ、Ｈｏｕｓｔｏｎ，米国テキサス州）表面にマイクロアレイ作製装置（ＧＭＳ ４１７ Ａｒｒａｙｅｒ、ＴａＫａＲＡ，日本）を利用して、大きさ１５０μｍ、間隔３００μｍにスポッティングした後、温度３７℃、湿度７０％以上の条件で４時間シッフ塩基反応を行った。次に、０．２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液でスライドを洗浄し、３次蒸溜水で洗浄した後、ＮａＢＨ４溶液（０．１ｇ ＮａＢＨ４、３０ｍｌ リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１０ｍｌ エタノール）に５分間浸漬して、アミンが結合されないアルデヒドを還元させた後、３次蒸溜水で洗浄してから空気乾燥させてＤＮＡチップを調製した。また、前記固体の表面に全体的な位置マーカー及びハイブリダイゼーション反応に対する対照群の役割を果たすβ−グロビンを付着した。
【００４８】
実施例３：最適なＰＣＲ増幅反応
臨床試料からＨＰＶのＤＮＡを増幅させる最適な多重ＰＣＲ増幅反応方法を確立するために、次のような条件で最適ＨＰＶ ＰＣＲを行った。
【００４９】
３−１：二段階ＰＣＲ増幅反応
方法１
９４℃で５分間変性した後、９４℃で１分間変性、５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で３０秒間鎖延長の過程を５回反復した後、９４℃で１分間変性、５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で１５秒間鎖延長の過程を３５回反復した後、７２℃で２分間さらに鎖延長して、Ｃｙ５が結合された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００５０】
方法２
５０℃で３０秒間プライマーアニーリングを行うことを除いては、前記方法１と同一に行って、Ｃｙ５が結合された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００５１】
方法３：従来の一段階ＰＣＲ増幅反応
９４℃で５分間変性した後、９４℃で１分間変性、５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で３０秒間鎖延長の過程を４０回反復した後、７２℃で２分間さらに鎖延長して、Ｃｙ５が結合された増幅ＤＮＡ試料を調整して比較した。
【００５２】
図４のレーン４〜６、レーン８〜１０、レーン１１〜１３を各々比較した時、方法論２（レーン４、８、１１）による条件が最も特異で効率的な方法論であることを確認した。
【００５３】
３−２：多重ＰＣＲ増幅反応
ＨＰＶとβ−グロビンとの多重ＰＣＲ増幅反応方法の確立のための構成及び条件は、次の通りである。
【００５４】
前記実施例３−１で言及した二段階ＰＣＲ増幅反応を使用した多重ＰＣＲは、２×ＰＣＲ緩衝溶液（５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．３）、０．１μｇのＤＮＡ、２〜４ｍＭ ＭｇＣｌ２、配列番号４３及び配列番号４４の２５ｐｍｏｌのＨＰＶプライマー、配列番号４４及び配列番号４５の５ｐｍｏｌのβ−グロビンプライマー、各４０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、３０μＭのｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．０５μＭのＣｙ５−ｄＵＴＰ（ＮＥＮ，米国）、及び２ユニットＴａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲＡ，日本）を含み、場合によっては添加物としてＢＳＡ及びＤＭＳＯなどを使用して５０μｌの反応混合物をＰＣＲサーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ，米国カリフォルニア州）に入れ、９４℃で５分間変性した後、９４℃で１分間変性、４５〜５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で２０〜３０秒間鎖延長の過程を５回反復した後、９４℃で１分間変性、４５〜５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で１０〜１５秒間鎖延長の過程を３５回反復し、その後７２℃で２分間さらに鎖延長して、Ｃｙ５が結合された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００５５】
図５のレーン２〜５、レーン６〜９を各々比較した時、１×ＰＣＲ緩衝液一回ＰＣＲと２×ＰＣＲ緩衝液多重ＰＣＲの条件でのＨＰＶの増幅効率が類似しており、従って、２×ＰＣＲ緩衝液多重ＰＣＲの条件が最も特異で効率的な方法論であることを確認した。
【００５６】
実施例４：試料の調整
人間の子宮頸部組織がＨＰＶに感染したかどうかを診断するために、まず、前記組織からＤＮＡを抽出して精製した。前記精製されたＤＮＡを鋳型とし、配列番号４５及び４６を有するβ−グロビンのプライマーを使用してＰＣＲ増幅反応を行い、β−グロビン遺伝子が増幅ＤＮＡを選別して、検索試料として使用した。
【００５７】
また、プラスミドＤＮＡを検索試料の対照群として使用した。ＨＰＶ型６、１１、２６、４０、４５、５１、及び５７（Ｄｒ．Ｅｔｈｅｌ−Ｍｉｃｈｅｌｅ ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｔｕｍｏｒｖｉｒｏｌｏｇｉｅ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ，Ｉｍ Ｎｅｕｅｎｈｅｉｍｅｒ Ｆｅｌｄ ２４２，６９００９ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）；ＨＰＶ型３５、４４、及び５６（Ｄｒ．Ａｔｔｉｌａ Ｌｒｉｎｃｚ，Ｖｉｃｅ Ｐｒｅｓｉｄｅｎ Ｔ，Ｒ＆Ｄ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ，Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，２３０１−Ｂ Ｂｒｏａｄｂｉｒｃｈ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，米国メリーランド州 ２０９０４）；４２、５８、５９、６１、６４及び６７型（Ｄｒ．Ｔｏｓｈｉｈｉｋｏ Ｍａｔｓｕｋｕｒａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，東京 １６２，日本）；及び、３３、３４、３９、５２、５４、６６及び７０型（Ｄｒ．Ｇｒａｒｄ Ｏｒｔｈ，Ｕｎｉｔ Ｍｉｘｔｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ／ＩＮＳＥＲＭ（Ｕ．１９０）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ１５，フランス）のプラスミドＤＮＡを検索試料として使用した。
【００５８】
同時に、大韓民国ソウル市鍾路区蓮建洞２８番地に所在の韓国細胞株銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ、ＫＣＬＢ）で購入したＳｉＨａ細胞株（ＨＰＶ１６，ＫＣＬＢ３００３５，Ｈｕｍａｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｃｅｒｖｉｘ）から抽出及び精製されたＤＮＡを陽性対照群として使用した。
【００５９】
前記選別されたＤＮＡは、配列番号４３及び４４に示されたプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅反応を行い、増幅した試料を調整した。
【００６０】
実施例４−１：陽性対照群試料の調整
前記精製されたＨＰＶ１６とＨＰＶ１８とのＤＮＡを鋳型とし、配列番号４３及び４４をプライマーとして使用して次のようにＰＣＲ増幅反応を行った。１×ＰＣＲ緩衝溶液（５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．３）、０．１μｇのＤＮＡ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、各２５ｐｍｏｌのプライマー、４０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、３０μＭのｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．０５μＭのＣｙ５−ｄＵＴＰ（ＮＥＮ，米国）、及び２ユニットＴａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲＡ，日本）を含む５０μｌの反応混合物をＰＣＲサーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，米国カリフォルニア州）に入れ、９４℃で５分間変性した後、９４℃で１分間変性、５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で３０秒間鎖延長の過程を５回反復した後、９４℃で１分間変性、５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で１５秒間鎖延長の過程を３５回反復した後、７２℃で２分間さらに鎖延長して、Ｃｙ５標識された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００６１】
実施例４−２：ＨＰＶ試料の調整
前記調整した各種ＨＰＶのプラスミドＤＮＡを鋳型とすることを除いては、実施例４−１と同様な方法で、Ｃｙ５結合された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００６２】
実施例４−３：臨床試料からのＤＮＡ試料の調整
前記調整した子宮頸部組織のＤＮＡを鋳型とし、配列番号４３及び４４に示されるプライマーをプライマーとして使用し、実施例４−１と同様な方法で、Ｃｙ５が結合された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００６３】
実施例５：ＤＮＡチップを用いたＨＰＶ感染の診断
前記実施例２で調製したＤＮＡチップに実施例４で調整した増幅した試料を適用して、ハイブリダイゼーション反応を次のように行った。この時、ハイブリダイゼーション反応室として１００μｌ容量のカバースリップ（ＧＲＡＣＥ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ，米国，ＰＣ４Ｌ−１．０）を使用した。
【００６４】
陽性対照群とプラスミドＤＮＡの場合は１０μｌの増幅産物、子宮頸部組織のＤＮＡの場合はＨＰＶの増幅産物１０μｌとβ−グロビンの増幅産物５μｌとの混合物を反応試料として使用した。前記反応試料に３Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１０％ ｖ／ｖ）を添加して室温で５分間変性させ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を５％（ｖ／ｖ）添加して中和させた。その後、前記結果物に３Ｎの塩酸（１０％ ｖ／ｖ）を添加した後、氷上に５分間放置した。次に、ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＰＥ（生理食塩水−リン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ緩衝液，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，米国ミズーリ州）と０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を使用して、４０℃でシリル化されたスライドに固定されたプローブと２時間反応させ、３×ＳＳＰＥで２分、１×ＳＳＰＥで２分間ＤＮＡチップを洗浄して、室温で空気乾燥またはスピン乾燥器を用いて乾燥した。
【００６５】
これをコンフォーカルレーザースキャナー（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、ドイツ）を利用して蛍光信号を分析した（励起６５０ｎｍ、発光 ６６８ｎｍ）（図１、図２ａ〜図２ｌ、図３ａ〜図３ｊ）。
【００６６】
図１はＤＮＡチップに位置したプローブの種類と位置を示す模式図であって、番号は各々のプローブを示しており、（○）は試料と結合することができるプローブが結合された部位を示し、（●）は反応が起こったかどうかを確認するための背景マーカーで、同時にプローブの位置を示すための基準マーカーを示す。図２ａ〜図２ｅは高リスク群に分類されたＨＰＶを分析した結果を示す写真であり（ＨＰＶ１６、１８、３９、５８、及び６９）、図２ｇ〜図２ｉは低リスク群に分類されたＨＰＶを分析した結果を示す写真である（ＨＰＶ６、１１、及び４０）。図２ａ〜図２ｅ及び図２ｇ〜図２ｉに示されるように、ＨＰＶプラスミド標品及びＨＰＶ陽性対照（子宮頚癌細胞系）のそれぞれのＤＮＡの増幅産物に起因したハイブリダイゼーション信号は、顕著な交差ハイブリッド形成はなく、その位置のプローブでのみ明瞭に示されることが確認できた。
【００６７】
実施例６：ＤＮＡチップを使用した診断結果の確認
本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ感染の検出結果の正確さを確認するために、同一試料から調整したＤＮＡを対象として、前記ＤＮＡチップを使用した診断方法を行い、また、前記ＤＮＡを鋳型として使用し、配列番号４３〜４６の塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ増幅反応を行い、感染型を直接診断した。
【００６８】
まず、実施例４−３と同様な方法を使用して２１３個子宮頸部組織からの増幅ＤＮＡを分離した。次に、本発明のＤＮＡチップを使用して増幅ＤＮＡからＨＰＶの感染を診断し、感染したと診断されたＨＰＶ型を判別した。また、Ｄｉｇｅｎｅ社製品であるハイブリッドキャプチャＩＩ方法で前記２００個のＤＮＡの高リスク群に属するＨＰＶ感染を検出した。そして、前記２種類の方法の結果を比較した（参照：図２ａ〜図２ｌ、図３ａ〜図３ｊ、表３）。本発明の図２ａ〜図２ｌ及び図３ａ〜図３ｊは子宮頸部組織から調整したＤＮＡ試料を対象としてＨＰＶの感染を診断した結果を示す写真である。前記図面に示すように、本発明のＤＮＡチップを使用して各試料の感染したＨＰＶ型を具体的に判別することができた。ＤＮＡチップの診断結果とハイブリッドキャプチャＩＩによる診断結果とを表３で比較して示す。
【表３】
【００６９】
前記表で「−」は当該項目にＨＰＶ感染試料がないことを意味し、パーセントは｛（単一感染試料数または感染試料数総計）／１４９｝×１００で計算される。
【表４】
【００７０】
前記表４に示されるように、ハイブリッドキャプチャ方法と比較した時、１００％の相対感度及び９８％の相対特異性を示した。感染したＨＰＶ型まで同時に把握できる本発明のＤＮＡの遺伝子型同定キットを使用したＨＰＶ感染の診断方法が、従来の診断方法より非常に優れていることが分かった。
【００７１】
前記表３及び４で、ハイブリッドキャプチャ方法で陽性であると判別された試料は、全てＤＮＡチップを使用する診断方法で診断し、陰性であると判別された試料のうちの一つからＨＰＶ１８型が検出された。これが偽陽性であるかどうかを確認するために配列分析した結果、確かにＨＰＶ１８型であることが確認された。ハイブリッドキャプチャ方法がＨＰＶ感染のみを診断することができるのに比べて、ＤＮＡチップを使用する診断方法を使用すれば、一回で迅速で正確にどの型であるかまで判別することができる。また、ハイブリッドキャプチャ方法で偽陰性と判別された試料まで検出されるほど、本発明のＤＮＡチップは感度が高い。当業者によく知られているように、ＨＩＶの感染頻度を見ると、ＨＩＶ１６型が最も多く、その次はＨＰＶ１８型が多い西洋での結果とは異なって、ＨＩＶ５６、５８、５２型などが多かった。
【００７２】
以上で詳細に説明及び証明したように、本発明はＤＮＡチップを使用してＨＰＶ感染患者の臨床試料からのＨＰＶ遺伝子型を分析する前記プローブ（配列番号１〜３０）が含まれたＨＰＶ遺伝子型同定キット、及び前記遺伝子型同定キットを使用して感染ウィルスの遺伝子型を同定することにより、ＨＰＶ感染を診断する方法を提供する。
【００７３】
比較例１
図６に示されるように、ＨＰＶ１６、３４、５６、及び５９に対する既存のプローブと本発明のプローブとの効果を比較し、新たに追加されたＨＰＶ型であるＨＰＶ４３、６８、及び６９のプローブの効果を確認するためのＤＮＡチップを示す。上記ＤＮＡチップを使用したことを除いては、実施例６と同様に行った。
【００７４】
図７〜図８で、各型に対する対照群ＤＮＡを分析した結果、前記出願されたプローブの非特異的反応（偽陽性）及び低感度（偽陰性）を確認した。
【００７５】
比較例２：ＤＮＡチップテスト
配列番号３１〜４２及び配列番号４７〜５４のプローブを含む従来プローブと、図１ａに示した本発明のＤＮＡチップとを使用することを除いては、実施例６と同様に行った。配列分析は通常の配列分析方法を利用して行った。
【００７６】
既存のＤＮＡチップと本発明のＤＮＡチップとで行った結果と、これを確認するためにＰＣＲ増幅反応を行って確認した配列分析の結果と、既存のプローブとＰＣＲ増幅反応方法で得られた結果とを、表５ａ及び５ｂに示す。従来のＤＮＡチップを使用した遺伝子型同定キットは、本発明のＤＮＡチップを使用した遺伝子型同定キットより、偽陰性と偽陽性との頻度が高かった。
【００７７】
本発明はＤＮＡチップを使用してヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）に感染した患者のウイルスの遺伝子型を分析する前記プローブ（配列番号１〜３０）が含まれたＨＰＶの遺伝子型同定キット、及び前記分析キットを使用して患者から単離されたＨＰＶ ＤＮＡの遺伝子型をより正確で迅速に同定する方法を提供する。
【表５ａ】
【表５ｂ】
【００７８】
本発明のＨＰＶ遺伝子型同定キットは、簡易かつ正確な方法でＨＰＶ感染を検出が可能で、のみならず感染ＨＰＶ型を識別が可能であり、かつそれにより子宮頸癌の早期診断、予防、及び治療に寄与する手段である。
【００７９】
以上で、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者には、このような具体的記述は単なる好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるわけではないことは明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とそれらの等価物とによって定義されると言える。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１ａ及び図１ｂは、本発明の一例によるＤＮＡチップに位置したプローブの種類と位置を示す模式図である。
【図２ａ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ１６ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｂ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ１８ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｃ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ３９ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｄ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ５８ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｅ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ６８ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｆ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ６９ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｇ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ６ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｈ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ１１ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｉ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ４３ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｊ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ４４ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｋ】図１ｂに示したＤＮＡチップでＨＰＶ６１ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｌ】図１ｂに示したＤＮＡチップでＨＰＶ６７ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図３ａ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ１６型に感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｂ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ３１型に感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｃ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ５１型に感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｄ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ５２型に感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｅ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ５６型に感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｆ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ１６及びＨＰＶ６８型に二重感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｇ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ１６及びＨＰＶ５８型に二重感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｈ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ３３及びＨＰＶ５６型に二重感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｉ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ１６、ＨＰＶ５２、及びＨＰＶ５９型に三重感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｊ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５、及びＨＰＶ５９型に三重感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図４】本発明の好ましい一実施例によって二段階ＰＣＲ増幅反応を使用したＤＮＡ増幅結果を示す写真である。
【図５】本発明の好ましい一実施例によって多重ＰＣＲ増幅反応を使用したＤＮＡ増幅結果を示す写真である。
【図６】ＤＮＡチップに位置した本発明のプローブと従来のプローブとの種類及び位置を示す模式図である。
【図７ａ】図６に示されたＤＮＡチップでＨＰＶ１６ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図７ｂ】図６に示されたＤＮＡチップでＨＰＶ１８ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図７ｃ】図６に示されたＤＮＡチップでＨＰＶ５６ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図７ｄ】図６に示されたＤＮＡチップでＨＰＶ４３ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図７ｅ】図６に示されたＤＮＡチップでＨＰＶ６８ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図８】従来のＨＰＶ６６プローブと本発明のＨＰＶ６６プローブを利用してＨＰＶ６６ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【０００１】
（ａ）発明の背景
本発明は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の感染を診断するための遺伝子型同定キット及び診断方法、そしてこれに利用されるプローブ及びＤＮＡチップに関する。より具体的には、本発明は、ＤＮＡチップを使用して感染患者の臨床サンプルからヒト乳頭腫ウイルスを検出するためのヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型同定キット、前記ＤＮＡチップの調製のための処理、及び前記遺伝子型同定キットを使用して患者の遺伝子型を同定することにより、ヒト乳頭腫ウイルスの感染を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（ｂ）関連技術の説明
子宮癌には子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫などがあるが、これらのうち子宮頸癌は、毎年、全世界で約４５万人、韓国で約６０００人の新たな患者が発生している。子宮頸癌は、韓国女性の癌の２２．１％に達し（子宮頚部上皮内腫瘍症を含む）、発生率の１位、死亡率の２位を占めているため、子宮頸癌の予防、診断、及び治療は女性保健において重要な問題とみなされている。
【０００３】
子宮頸癌は、子宮頸部上皮内腫瘍症（ＣＩＮ）という癌前段階を通じて進行するが、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の感染が子宮頸部腫瘍の発生に重要な役割を果たすことが知られている。特に、特定の遺伝子型ＨＰＶに感染した場合に腫瘍に進行する可能性はより高くなる。ヒト乳頭腫ウイルスが子宮頸癌の主な原因として知られてから現在まで、ＨＰＶは７０種類余りの遺伝子型が同定されており、病巣の位置と病変の進行程度とによって各々特異的なＨＰＶの遺伝子型が選択的に発見されているため、ＨＰＶの感染の生物学的特徴の多様性が認識されている。生殖器感染ＨＰＶの遺伝子型のうち、１０以上の遺伝子型が高リスク群に分類され、子宮頸癌と関連が知られている。これらの発見にもとづき、ＨＰＶ感染の生物学的特徴の多様性を特徴づけることは、子宮頸癌の診断及び予防に重要な意味を持つと考えられている。
【０００４】
子宮頸癌の最も簡易な早期診断法はパパニコロー塗抹標本法で、これは病理細胞学的検査であり、子宮表面から最外層の老化した細胞を採集、染色して、上皮細胞核の周囲に空胞化を示すコイロサイトーシス（ｋｏｉｌｏｃｙｔｏｓｉｓ）などのＨＰＶ感染の特徴的な病理所見で診断する方法である。しかしパパニコロー塗抹標本法の診断率が１〜１５％と低く、診断において他にも多くの制限があるため、これを補完しより信頼できる診断とするためには、膣鏡検査などが必要となる。膣鏡検査によりＨＰＶ感染の７０％までが検出できるが、設備が高価で、高度に熟練した判断者が必要であり、悪性化の危険度の面で異なるＨＰＶ遺伝子型を判定することができないという短所があった。このため、子宮頸癌または子宮頸癌前段階病変の診断のための、パパニコロー塗抹標本法のような従来のスクリーニング法の補助的手段または選別検査として、ＨＰＶの検出とＨＰＶ遺伝子型を同定する技術の開発に関する研究が、持続的に進められている。
【０００５】
前記ＨＰＶの検出及びＨＰＶ遺伝子型の同定方法は、大きく、ＨＰＶのＤＮＡを直接検出する方法と、ＨＰＶのＤＮＡの増幅を利用する方法とに分けられる。前記ＨＰＶのＤＮＡを直接検出する方法としては、液中ハイブリダイゼーション（ｌｉｑｕｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，米国メリーランド州、ｗｗｗ．ｄｉｇｅｎｅ．ｃｏｍによる、ハイブリッドキャプチャキット）、ＨＰＶ型特異的プローブを用いるサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）及びドットブロット（Ｄｏｔ ｂｌｏｔ）、フィルターインサイチュハイブリダイゼーション（Ｆｉｌｔｅｒ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）などがあり、ＨＰＶのＤＮＡの増幅を利用する方法としては、型特異的ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、及びゼネラルプライマーＰＣＲ（ｇｅｎｅｒａｌ−ｐｒｉｍｅｒ ＰＣＲ）などがある。特にゼネラルプライマーセットを利用して増幅したＨＰＶ ＤＮＡの遺伝子型分析は、ドットブロットハイブリダイゼーション、マイクロタイタープレートハイブリダイゼーション（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、またはラインプローブ分析（ｌｉｎｅ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ）などを用いる方法が一般に行われている。これらの方法のうち、ハイブリッドキャプチャによる液中ハイブリダイゼーション、及びゼネラルプライマーＰＣＲに続いてのラインプローブ分析は、診断に最も適していると見なされてきた。しかしニトロセルロース膜にオリゴヌクレオチドプローブを固定して約２０型を検出するラインプローブ分析は、感度が低くデータの解釈が困難であり、信頼性が低いという短所がある。商品化されているハイブリッドキャプチャキットは、ＨＰＶのＤＮＡを臨床試料から容易に分離してＰＣＲ増幅反応なしで検出することができ、当該ＨＰＶのＤＮＡが高リスク群に属しているか低リスク群に属しているかを識別できる。しかしハイブリッドキャプチャキットでは感染ＨＰＶの正確な遺伝子型を識別できないため、高リスク群の中でも癌発生率が非常に高い型を、他の高リスク群（中リスク群とも言える）と区別することができない。またＲＮＡプローブを利用するために安定性が低いので、汚染の可能性を排除できないという問題点がある。
【０００６】
これらの状況から、ＨＰＶ感染の検出、及び感染したＨＰＶの遺伝子型同定が、簡易で正確に行えるだけでなく、高い特異性及び感度を有するＨＰＶ感染の検出及び遺伝子型の同定のための方法及び遺伝子型同定キット、これに利用されるプローブ及びＤＮＡチップを開発する必要性が出てきた。また、前記遺伝子型同定キットとこれに利用されるプローブ及びＤＮＡチップは、可能な限り多様な型のＨＰＶを高い特異性及び感度で分析し、ＨＰＶ感染及び遺伝子型同定を、より正確に診断できなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本発明の目的は、高い特異性及び感度でより正確なＨＰＶ感染の検出、及びＨＰＶの遺伝子型同定のために、ＨＰＶのＤＮＡと相補的な塩基配列を持つ新規なプローブを提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、ＨＰＶのＤＮＡと相補的な塩基配列を持つプローブを含む、ＨＰＶ感染の検出及びＨＰＶ遺伝子型の同定のための、ＤＮＡチップを提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記ＨＰＶ感染の検出及びＨＰＶ遺伝子型の同定のための新規なＤＮＡチップを含む、ＨＰＶ遺伝子型同定キットを提供することにある。
【００１０】
本発明のさらなる他の目的は、ＨＰＶ感染の検出及びＨＰＶ遺伝子型の同定のための新規なＤＮＡチップを使用して、ＨＰＶ感染の診断及びＨＰＶ遺伝子型同定を行う方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、ＨＰＶの感染検出及び遺伝子型同定のための新規なＤＮＡチップを使用したＨＰＶの感染検出及び遺伝子型を診断する方法において、新規なＰＣＲ増幅反応で試料ＤＮＡを増幅させる方法を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
好ましい形態の詳細な説明
本発明のヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）感染を診断するための遺伝子型解析キットは、ＨＰＶのＤＮＡと相補的に結合することができる塩基配列を有するプローブを含むＤＮＡチップ、臨床試料から採取したＤＮＡをＰＣＲ増幅反応方法で増幅させるためのプライマー、及び前記ＤＮＡチップのプローブとハイブリダイズされる増幅ＤＮＡを標識するための標識手段を含む。
【００１３】
本発明の発明者は、簡易な方法で患者の遺伝子型を識別してＨＰＶ感染を検出し、感染したＨＰＶ型を正確に判別することができる方法を確立するために研究努力した結果、ＨＰＶのＤＮＡと相補的な塩基配列を持つプローブ、及びこれを含むＤＮＡチップを開発した。さらに、ＨＰＶのＤＮＡに相補的な塩基配列を持つプローブを含むＤＮＡチップ、臨床試料から採取したＤＮＡをＰＣＲで増幅させるためのプライマー、及び前記ＤＮＡチップとハイブリダイズされる増幅ＤＮＡを探知するための標識手段を含むＨＰＶの遺伝子型同定キットを製作し、前記遺伝子同定キットを使用して患者の試料から採取したＤＮＡの遺伝子型を識別することにより、簡易で正確な方法で、ＨＰＶの感染を検出し、かつ感染ＨＰＶの遺伝子型を識別しすることに成功した。
【００１４】
本発明は、ＨＰＶ ＤＮＡの塩基配列、好ましくはＨＰＶ ＤＮＡのＬ１領域に相補的な塩基配列をプローブとして提供する。本発明のプローブは、配列番号１〜３０に示された塩基配列を含む（表１ａ及び表１ｂ）。表１のうち、配列番号２５の下線部分は、プローブ機能のために適した立体配座を提供するために付加された配列である。
【表１ａ】
本発明のプローブを利用すると、高い特異性及び感度でＨＰＶ感染の検出及び遺伝子型の同定ができ、特に本発明のプローブは、ＰＣＴ／ＫＲ／０１２１３号（２０００年１０月２６日付出願）に記載されたＨＰＶの遺伝子型同定用プローブと比較して、その高い特異性及び感度を特徴とする。本発明のプローブのうち配列番号１〜２０のプローブのＨＰＶ １３、２６、３０、４３、５３、５４、５５、５７、６１、６２、６４、６７、６８、６９、７０、７４、及びＪＣ９７１０は、前記出願に記載された遺伝子型同定キットには含まれないＨＰＶ型に対するプローブであり、したがって、本発明のプローブを利用してＨＰＶの遺伝子型を識別する場合、より多くのＨＰＶ型を探知することができるので、より正確さに貢献する。ＰＣＴ／ＫＲ／０１２１３号に記載されたＨＰＶの遺伝子型同定用プローブは、配列番号３１〜４１を含み、追加的にＨＰＶ１６、３４、３５、４０、５６、５８、５９、及び６６に対するプローブを含む。
【００１６】
本発明のＤＮＡチップは、配列番号１〜３０に示された塩基配列を有するプローブの中から選択された１種以上のＨＰＶプローブを含むことができる。また、追加的に、マーカーとしてβ−グロビン配列を含むことができ、好ましい配列は配列番号４２に示されている。本発明の一例として、前記ＤＮＡチップには、本発明の当業者が容易に組み合わせられる全てのプローブ配列セットを含むＤＮＡチップが含まれ、以下のような例も含まれる。
【００１７】
例１）
配列番号１〜３０に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びこれらオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より選択された１種以上のＨＰＶプローブを含むＤＮＡチップ。
【００１８】
例２）
i）配列番号１〜３０に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びこれらオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より択された１種以上のＨＰＶプローブ、及び
ii）配列番号３１〜４１に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された１種以上のＨＰＶプローブ
を含むＤＮＡチップ。
【００１９】
例３）
i）配列番号１〜２０に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された１種以上のＨＰＶプローブ、
ii）配列番号２１〜３０に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された８種のＨＰＶプローブ、及び
iii）配列番号３１〜４１に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有する１１種のＨＰＶプローブ
を含むＤＮＡチップ。
【００２０】
例４）
i）配列番号４〜１０に示された塩基配列を有するプローブの中から選択された９種のＨＰＶプローブ、
ii）配列番号２１〜３０に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された８種のＨＰＶプローブ、及び
iii）配列番号３１〜４１に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有する１１種のＨＰＶプローブ
を含むＤＮＡチップ。
【００２１】
例５）
i）配列番号４、１５、及び１６に示された塩基配列を有する３種のＨＰＶプローブ、
ii）配列番号２１〜３０に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された８種のＨＰＶプローブ、及び
iii）配列番号３１〜４１に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有する１１種のＨＰＶプローブ
を含むＤＮＡチップ。
【００２２】
本発明の一例として、ＤＮＡチップは、プローブの位置を知らせる基準マーカーをさらに含むこともできる。マーカーとしては、β−グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素）遺伝子などを含むが、これに限定されない。好ましいマーカーはβ−グロビンであって、その配列を配列番号４２に示す。
【００２３】
また、本発明によって、ＨＰＶのＤＮＡと相補的に結合することができる塩基配列を有するプローブを提供する。本発明のプローブはＨＰＶ ＤＮＡと特異的にハイブリダイズされることを特徴とする。
【００２４】
一方、前記ＨＰＶの遺伝子型同定キットに含まれるＤＮＡチップの調製方法は、ＨＰＶ ＤＮＡと相補的に結合することができる塩基配列の５’末端にアミンが結合されたＤＮＡプローブを調製する工程；前記調製されたプローブをアルデヒドが結合された固体の表面に結合させる工程；及び前記ＤＮＡプローブが結合された固体の表面に存在するアミンと結合しないアルデヒドを還元させる工程；を含む。以下、本発明のＤＮＡチップ及びその調製方法を工程別に分けてより具体的に説明する。
【００２５】
第１工程：プローブの調製
ＨＰＶのＤＮＡと相補的に結合することができる塩基配列の５’末端にアミンが結合されたＤＮＡプローブを調製する。この時、プローブは、ＨＰＶのＤＮＡの塩基配列、好ましくはＨＰＶ ＤＮＡのＬ１領域と相補的に結合する塩基配列を有するように設計及び合成され、合成された塩基配列が固体の表面に結合することができるように塩基配列の５’末端にアミン基を結合させてプローブを調製する。
【００２６】
第２工程：プローブの固定化
前記調製されたプローブをアルデヒドが結合された固体の表面に結合させる。この時、固体は特に制限されないが、ガラスであるのが好ましく、固体の表面のアルデヒドは、この分野で知られた方法、つまりプローブの５’末端に結合されたアミンと３０〜４０℃の温度条件、７０〜１００％の湿度条件でシッフ塩基反応を行って、固体の表面にプローブを結合させる。この時、プローブの濃度は１００〜３００ｐｍｏｌ／μｌが好ましく、最も好ましくは２００ｐｍｏｌ／μｌである。また、前記固体の表面に全体的な位置マーカー及びハイブリダイゼーション反応に対する対照群の役割を果たすβ−グロビンを付着する。
【００２７】
第３工程：ＤＮＡチップの調製
前記プローブが結合された固体の表面に存在するアミンと結合しないアルデヒドを還元させてＤＮＡチップを調製する。この時、アルデヒドの還元条件は特に制限されないが、ＮａＢＨ４などの還元剤を用いるのが好ましい。
【００２８】
また、本発明は、前記ＤＮＡチップを含むＨＰＶ遺伝子型同定キット及びこれを使用したＨＰＶ感染の診断方法に関する。本発明は、
i）本発明によるＤＮＡチップ
ii）試料から採取したＤＮＡをＰＣＲ増幅反応方法で増幅させるためのプライマー、及び
iii）前記ＤＮＡチップとハイブリダイゼイズされた増幅ＤＮＡの標識手段
を含む、ＨＰＶ遺伝子型同定キットに関する。
【００２９】
本発明はまた、
i）前記ヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型同定キットのプライマー、例えば配列番号４３及び４４のプライマーを使用して、検査する試料から採取したＤＮＡを増幅させる段階、
ii）前記増幅ＤＮＡを前記遺伝子型同定キットのＤＮＡチップに適用して、増幅ＤＮＡとプローブとをハイブリダイズさせる段階、及び
iii）前記プローブとハイブリダイズされたＤＮＡを前記ＨＰＶの遺伝子型同定キットの標識手段で探知して、これを検出する段階
を含む、ＨＰＶ感染の診断のための方法に関する。
【００３０】
本発明の一例として、試料ＤＮＡの増幅は、通常のＰＣＲ増幅反応方法で行うことができ、好ましくは二段階ＰＣＲ増幅反応方法または２種以上のプライマーを使用して同時に増幅させる多重ＰＣＲ増幅反応方法を行ったり、より好ましくは２種以上のプライマーを使用して二段階で増幅させる多重二段階ＰＣＲ増幅反応方法を行うことができる。
【００３１】
また、ＨＰＶのＤＮＡの増幅のための最も適した条件を開発した結果、増幅方法論は二段階ＰＣＲ法または多重ＰＣＲ法である。
【００３２】
ＰＣＲ増幅反応法は、前変性、変性、プライマーアニーリング、及び鎖延長の段階から構成される。
【００３３】
従来は同一な反応条件下で反復して行う一段階ＰＣＲ増幅反応を行ったが、二段階ＰＣＲ増幅反応方法とは、異なる増幅反応、例えば変性段階、プライマーアニーリング段階、または鎖延長段階のうちの一つ以上の段階を異なる反応条件下で一部反復して行うことを言う。本発明では、第１増幅段階は通常の鎖延長段階に比べて短い時間行い、第２増幅段階は第１段階よりさらに短い時間行って、長時間（例えば１〜２分）鎖延長を行う場合に過度に長い産物が得られるのを防止することにより、プローブの特異性が高められるので好ましい。より好ましくは、ＰＣＲ増幅反応方法の鎖延長を第１増幅段階では２０〜３０秒間実施し、第２増幅段階では１０〜１５秒間実施することができる。
【００３４】
本発明において、ＨＰＶのプライマーを使用した試料と、マーカーであるβ−グロビン試料とを別個に増幅して分析することもできるが、配列番号４３及び４４のＨＰＶのプライマーと配列番号４５及び４６のβ−グロビンのプライマーとを共に使用して、一段階ＰＣＲ増幅反応を行うか、そうでなければ前記のように、二段階ＰＣＲ増幅反応を行うこともできる。
【００３５】
ＰＣＲ増幅は、ＨＰＶプライマー試料及びβ−グロビン試料のそれぞれを用いて実施するか、あるいは、配列番号４３及び４４に開示されるＨＰＶプライマーと配列番号４５及び４６に開示されるβ−グロビンプライマーを用いて、一段階または二段階で付随して実施しうる。
【００３６】
本発明の好ましい一例として、前記ＨＰＶのプライマー及びβ−グロビンのプライマー、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、標識物質、そしてＴａｑポリメラーゼを含み、場合によっては添加物としてＢＳＡ及びＤＭＳＯなどを使用してＰＣＲサーモサイクラーに入れ、９４℃で５分間変性した後、９４℃で１分間変性、４５〜５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で２０〜３０秒間鎖延長の過程を５回反復した後、９４℃で１分間変性、４５〜５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で１０〜１５秒間鎖延長の過程を３５回反復した後、７２℃で２分間さらに鎖延長して、標識物質が結合された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００３７】
以下、本発明のヒト乳頭腫ウイルスの遺伝子型同定キットを使用したヒト乳頭腫ウイルス感染の診断方法を段階別に分けてより具体的に説明する。
【００３８】
第１工程：試料ＤＮＡの増幅
臨床試料から採取したＤＮＡを、ＨＰＶ遺伝子型同定キットのプライマーを用いて増幅させるが、ここではビオチンを含有する増幅ＤＮＡを与える、ビオチン−１６−ｄＵＴＰを利用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実施される。増幅のための４つのプライマーを次の表２に示す。
【表２】
前記表１で、Ｒ（Ａ，ｇ）：Ｙ（Ｃ，Ｔ）：Ｍ（Ａ，Ｃ）：Ｋ（ｇ，Ｔ）：Ｓ（ｇ，Ｃ）：Ｗ（Ａ，Ｔ）、Ｖ（Ａ，Ｃ，ｇ）：Ｈ（Ａ，Ｔ，Ｃ）：Ｂ（ｇ，Ｔ，Ｃ）：Ｄ（ｇ，Ａ，Ｔ）：Ｎ（Ａ，ｇ，Ｃ，Ｔ）を意味し、これは当業者に広く知られている。
【００４０】
配列番号４３及び４４の塩基配列で構成されたＨＰＶの増幅用プライマーが提供され、また、配列番号４５及び４６の塩基配列で構成された新規なβ−グロビンのプライマーが提供される。
【００４１】
第２工程：ハイブリダイゼーション
前記増幅した試料をＤＮＡチップに適用して、プローブとハイブリダイゼーション反応を行う。
【００４２】
第３工程：検出
プローブとハイブリダイズされたＤＮＡを標識手段で探知して、これを検出してＨＰＶ感染を判断する。
【００４３】
標識手段は、Ｃｙ５、ビオチン結合化合物、Ｃｙ３、ＥＤＡＮＳ（５−（２’−アミノエチル）アミノ−１−ナフタレン硫酸）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミンイソシアネート（ＴＭＲＩＴＣ）、ｘ−ローダミン、またはテキサスレッドなどを含むが、これに限られない。好ましくは、Ｃｙ５及びビオチン結合物質である。標識物質の検出手段としては、コンフォーカルレーザースキャナー（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｅｒ）でスキャンして読み取る。
【００４４】
したがって、本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶの遺伝子型同定キットを使用して、ヒト乳頭腫ウイルスの感染を診断する場合、迅速かつ簡易で正確にＨＰＶの感染の検出及び遺伝子型の同定ができるので、子宮頸癌の早期診断、予防、及び治療に寄与することができる。
【００４５】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、当業界で通常の知識を有する者には自明なことである。特に、下記の実施例では２２または２８個のプローブが固定されたＤＮＡチップを調製したが、プローブの種類及び個数が特に制限されるわけではないので、ＨＰＶから誘導された塩基配列を有するプローブを利用したＤＮＡチップ及び前記ＤＮＡチップを使用した各種分析キットも、また本発明の範囲に属する。
【実施例】
【００４６】
実施例１：プローブの調製
ＨＰＶを１５種類の高リスク群（ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、６９）と７種類の低リスク群（ＨＰＶ型６、１１、３４、４０、４２、４３、４４）とに分類し、ＨＰＶの遺伝子型同定のために使用された各ＨＰＶの遺伝子型特異的プローブとβ−グロビン特異的プローブとは５’末端にアミン基が含まれるように調製した。各プローブの塩基配列は配列リストに示した。
【００４７】
実施例２：ＤＮＡチップの調製
前記実施例１で調製された各々のプローブを３×ＳＳＣ（４５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．４５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に２００ｐｍｏｌ／μｌになるように溶解させ、アルデヒド基が結合されたスライド（ｓｉｌｙｌａｔｅｄ ｓｌｉｄｅ、ＣＳＳ−１００、ＣＥＬ、Ｈｏｕｓｔｏｎ，米国テキサス州）表面にマイクロアレイ作製装置（ＧＭＳ ４１７ Ａｒｒａｙｅｒ、ＴａＫａＲＡ，日本）を利用して、大きさ１５０μｍ、間隔３００μｍにスポッティングした後、温度３７℃、湿度７０％以上の条件で４時間シッフ塩基反応を行った。次に、０．２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液でスライドを洗浄し、３次蒸溜水で洗浄した後、ＮａＢＨ４溶液（０．１ｇ ＮａＢＨ４、３０ｍｌ リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１０ｍｌ エタノール）に５分間浸漬して、アミンが結合されないアルデヒドを還元させた後、３次蒸溜水で洗浄してから空気乾燥させてＤＮＡチップを調製した。また、前記固体の表面に全体的な位置マーカー及びハイブリダイゼーション反応に対する対照群の役割を果たすβ−グロビンを付着した。
【００４８】
実施例３：最適なＰＣＲ増幅反応
臨床試料からＨＰＶのＤＮＡを増幅させる最適な多重ＰＣＲ増幅反応方法を確立するために、次のような条件で最適ＨＰＶ ＰＣＲを行った。
【００４９】
３−１：二段階ＰＣＲ増幅反応
方法１
９４℃で５分間変性した後、９４℃で１分間変性、５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で３０秒間鎖延長の過程を５回反復した後、９４℃で１分間変性、５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で１５秒間鎖延長の過程を３５回反復した後、７２℃で２分間さらに鎖延長して、Ｃｙ５が結合された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００５０】
方法２
５０℃で３０秒間プライマーアニーリングを行うことを除いては、前記方法１と同一に行って、Ｃｙ５が結合された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００５１】
方法３：従来の一段階ＰＣＲ増幅反応
９４℃で５分間変性した後、９４℃で１分間変性、５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で３０秒間鎖延長の過程を４０回反復した後、７２℃で２分間さらに鎖延長して、Ｃｙ５が結合された増幅ＤＮＡ試料を調整して比較した。
【００５２】
図４のレーン４〜６、レーン８〜１０、レーン１１〜１３を各々比較した時、方法論２（レーン４、８、１１）による条件が最も特異で効率的な方法論であることを確認した。
【００５３】
３−２：多重ＰＣＲ増幅反応
ＨＰＶとβ−グロビンとの多重ＰＣＲ増幅反応方法の確立のための構成及び条件は、次の通りである。
【００５４】
前記実施例３−１で言及した二段階ＰＣＲ増幅反応を使用した多重ＰＣＲは、２×ＰＣＲ緩衝溶液（５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．３）、０．１μｇのＤＮＡ、２〜４ｍＭ ＭｇＣｌ２、配列番号４３及び配列番号４４の２５ｐｍｏｌのＨＰＶプライマー、配列番号４４及び配列番号４５の５ｐｍｏｌのβ−グロビンプライマー、各４０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、３０μＭのｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．０５μＭのＣｙ５−ｄＵＴＰ（ＮＥＮ，米国）、及び２ユニットＴａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲＡ，日本）を含み、場合によっては添加物としてＢＳＡ及びＤＭＳＯなどを使用して５０μｌの反応混合物をＰＣＲサーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ，米国カリフォルニア州）に入れ、９４℃で５分間変性した後、９４℃で１分間変性、４５〜５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で２０〜３０秒間鎖延長の過程を５回反復した後、９４℃で１分間変性、４５〜５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で１０〜１５秒間鎖延長の過程を３５回反復し、その後７２℃で２分間さらに鎖延長して、Ｃｙ５が結合された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００５５】
図５のレーン２〜５、レーン６〜９を各々比較した時、１×ＰＣＲ緩衝液一回ＰＣＲと２×ＰＣＲ緩衝液多重ＰＣＲの条件でのＨＰＶの増幅効率が類似しており、従って、２×ＰＣＲ緩衝液多重ＰＣＲの条件が最も特異で効率的な方法論であることを確認した。
【００５６】
実施例４：試料の調整
人間の子宮頸部組織がＨＰＶに感染したかどうかを診断するために、まず、前記組織からＤＮＡを抽出して精製した。前記精製されたＤＮＡを鋳型とし、配列番号４５及び４６を有するβ−グロビンのプライマーを使用してＰＣＲ増幅反応を行い、β−グロビン遺伝子が増幅ＤＮＡを選別して、検索試料として使用した。
【００５７】
また、プラスミドＤＮＡを検索試料の対照群として使用した。ＨＰＶ型６、１１、２６、４０、４５、５１、及び５７（Ｄｒ．Ｅｔｈｅｌ−Ｍｉｃｈｅｌｅ ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｔｕｍｏｒｖｉｒｏｌｏｇｉｅ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ，Ｉｍ Ｎｅｕｅｎｈｅｉｍｅｒ Ｆｅｌｄ ２４２，６９００９ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）；ＨＰＶ型３５、４４、及び５６（Ｄｒ．Ａｔｔｉｌａ Ｌｒｉｎｃｚ，Ｖｉｃｅ Ｐｒｅｓｉｄｅｎ Ｔ，Ｒ＆Ｄ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ，Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，２３０１−Ｂ Ｂｒｏａｄｂｉｒｃｈ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，米国メリーランド州 ２０９０４）；４２、５８、５９、６１、６４及び６７型（Ｄｒ．Ｔｏｓｈｉｈｉｋｏ Ｍａｔｓｕｋｕｒａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，東京 １６２，日本）；及び、３３、３４、３９、５２、５４、６６及び７０型（Ｄｒ．Ｇｒａｒｄ Ｏｒｔｈ，Ｕｎｉｔ Ｍｉｘｔｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ／ＩＮＳＥＲＭ（Ｕ．１９０）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ１５，フランス）のプラスミドＤＮＡを検索試料として使用した。
【００５８】
同時に、大韓民国ソウル市鍾路区蓮建洞２８番地に所在の韓国細胞株銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ、ＫＣＬＢ）で購入したＳｉＨａ細胞株（ＨＰＶ１６，ＫＣＬＢ３００３５，Ｈｕｍａｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｃｅｒｖｉｘ）から抽出及び精製されたＤＮＡを陽性対照群として使用した。
【００５９】
前記選別されたＤＮＡは、配列番号４３及び４４に示されたプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅反応を行い、増幅した試料を調整した。
【００６０】
実施例４−１：陽性対照群試料の調整
前記精製されたＨＰＶ１６とＨＰＶ１８とのＤＮＡを鋳型とし、配列番号４３及び４４をプライマーとして使用して次のようにＰＣＲ増幅反応を行った。１×ＰＣＲ緩衝溶液（５０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．３）、０．１μｇのＤＮＡ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、各２５ｐｍｏｌのプライマー、４０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、３０μＭのｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．０５μＭのＣｙ５−ｄＵＴＰ（ＮＥＮ，米国）、及び２ユニットＴａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲＡ，日本）を含む５０μｌの反応混合物をＰＣＲサーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，米国カリフォルニア州）に入れ、９４℃で５分間変性した後、９４℃で１分間変性、５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で３０秒間鎖延長の過程を５回反復した後、９４℃で１分間変性、５０℃で２分間プライマーアニーリング、７２℃で１５秒間鎖延長の過程を３５回反復した後、７２℃で２分間さらに鎖延長して、Ｃｙ５標識された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００６１】
実施例４−２：ＨＰＶ試料の調整
前記調整した各種ＨＰＶのプラスミドＤＮＡを鋳型とすることを除いては、実施例４−１と同様な方法で、Ｃｙ５結合された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００６２】
実施例４−３：臨床試料からのＤＮＡ試料の調整
前記調整した子宮頸部組織のＤＮＡを鋳型とし、配列番号４３及び４４に示されるプライマーをプライマーとして使用し、実施例４−１と同様な方法で、Ｃｙ５が結合された増幅ＤＮＡ試料を調整した。
【００６３】
実施例５：ＤＮＡチップを用いたＨＰＶ感染の診断
前記実施例２で調製したＤＮＡチップに実施例４で調整した増幅した試料を適用して、ハイブリダイゼーション反応を次のように行った。この時、ハイブリダイゼーション反応室として１００μｌ容量のカバースリップ（ＧＲＡＣＥ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ，米国，ＰＣ４Ｌ−１．０）を使用した。
【００６４】
陽性対照群とプラスミドＤＮＡの場合は１０μｌの増幅産物、子宮頸部組織のＤＮＡの場合はＨＰＶの増幅産物１０μｌとβ−グロビンの増幅産物５μｌとの混合物を反応試料として使用した。前記反応試料に３Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１０％ ｖ／ｖ）を添加して室温で５分間変性させ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を５％（ｖ／ｖ）添加して中和させた。その後、前記結果物に３Ｎの塩酸（１０％ ｖ／ｖ）を添加した後、氷上に５分間放置した。次に、ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＰＥ（生理食塩水−リン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ緩衝液，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，米国ミズーリ州）と０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を使用して、４０℃でシリル化されたスライドに固定されたプローブと２時間反応させ、３×ＳＳＰＥで２分、１×ＳＳＰＥで２分間ＤＮＡチップを洗浄して、室温で空気乾燥またはスピン乾燥器を用いて乾燥した。
【００６５】
これをコンフォーカルレーザースキャナー（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、ドイツ）を利用して蛍光信号を分析した（励起６５０ｎｍ、発光 ６６８ｎｍ）（図１、図２ａ〜図２ｌ、図３ａ〜図３ｊ）。
【００６６】
図１はＤＮＡチップに位置したプローブの種類と位置を示す模式図であって、番号は各々のプローブを示しており、（○）は試料と結合することができるプローブが結合された部位を示し、（●）は反応が起こったかどうかを確認するための背景マーカーで、同時にプローブの位置を示すための基準マーカーを示す。図２ａ〜図２ｅは高リスク群に分類されたＨＰＶを分析した結果を示す写真であり（ＨＰＶ１６、１８、３９、５８、及び６９）、図２ｇ〜図２ｉは低リスク群に分類されたＨＰＶを分析した結果を示す写真である（ＨＰＶ６、１１、及び４０）。図２ａ〜図２ｅ及び図２ｇ〜図２ｉに示されるように、ＨＰＶプラスミド標品及びＨＰＶ陽性対照（子宮頚癌細胞系）のそれぞれのＤＮＡの増幅産物に起因したハイブリダイゼーション信号は、顕著な交差ハイブリッド形成はなく、その位置のプローブでのみ明瞭に示されることが確認できた。
【００６７】
実施例６：ＤＮＡチップを使用した診断結果の確認
本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ感染の検出結果の正確さを確認するために、同一試料から調整したＤＮＡを対象として、前記ＤＮＡチップを使用した診断方法を行い、また、前記ＤＮＡを鋳型として使用し、配列番号４３〜４６の塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ増幅反応を行い、感染型を直接診断した。
【００６８】
まず、実施例４−３と同様な方法を使用して２１３個子宮頸部組織からの増幅ＤＮＡを分離した。次に、本発明のＤＮＡチップを使用して増幅ＤＮＡからＨＰＶの感染を診断し、感染したと診断されたＨＰＶ型を判別した。また、Ｄｉｇｅｎｅ社製品であるハイブリッドキャプチャＩＩ方法で前記２００個のＤＮＡの高リスク群に属するＨＰＶ感染を検出した。そして、前記２種類の方法の結果を比較した（参照：図２ａ〜図２ｌ、図３ａ〜図３ｊ、表３）。本発明の図２ａ〜図２ｌ及び図３ａ〜図３ｊは子宮頸部組織から調整したＤＮＡ試料を対象としてＨＰＶの感染を診断した結果を示す写真である。前記図面に示すように、本発明のＤＮＡチップを使用して各試料の感染したＨＰＶ型を具体的に判別することができた。ＤＮＡチップの診断結果とハイブリッドキャプチャＩＩによる診断結果とを表３で比較して示す。
【表３】
前記表で「−」は当該項目にＨＰＶ感染試料がないことを意味し、パーセントは｛（単一感染試料数または感染試料数総計）／１４９｝×１００で計算される。
【表４】
前記表４に示されるように、ハイブリッドキャプチャ方法と比較した時、１００％の相対感度及び９８％の相対特異性を示した。感染したＨＰＶ型まで同時に把握できる本発明のＤＮＡの遺伝子型同定キットを使用したＨＰＶ感染の診断方法が、従来の診断方法より非常に優れていることが分かった。
【００７１】
前記表３及び４で、ハイブリッドキャプチャ方法で陽性であると判別された試料は、全てＤＮＡチップを使用する診断方法で診断し、陰性であると判別された試料のうちの一つからＨＰＶ１８型が検出された。これが偽陽性であるかどうかを確認するために配列分析した結果、確かにＨＰＶ１８型であることが確認された。ハイブリッドキャプチャ方法がＨＰＶ感染のみを診断することができるのに比べて、ＤＮＡチップを使用する診断方法を使用すれば、一回で迅速で正確にどの型であるかまで判別することができる。また、ハイブリッドキャプチャ方法で偽陰性と判別された試料まで検出されるほど、本発明のＤＮＡチップは感度が高い。当業者によく知られているように、ＨＩＶの感染頻度を見ると、ＨＩＶ１６型が最も多く、その次はＨＰＶ１８型が多い西洋での結果とは異なって、ＨＩＶ５６、５８、５２型などが多かった。
【００７２】
以上で詳細に説明及び証明したように、本発明はＤＮＡチップを使用してＨＰＶ感染患者の臨床試料からのＨＰＶ遺伝子型を分析する前記プローブ（配列番号１〜３０）が含まれたＨＰＶ遺伝子型同定キット、及び前記遺伝子型同定キットを使用して感染ウィルスの遺伝子型を同定することにより、ＨＰＶ感染を診断する方法を提供する。
【００７３】
比較例１
図６に示されるように、ＨＰＶ１６、３４、５６、及び５９に対する既存のプローブと本発明のプローブとの効果を比較し、新たに追加されたＨＰＶ型であるＨＰＶ４３、６８、及び６９のプローブの効果を確認するためのＤＮＡチップを示す。上記ＤＮＡチップを使用したことを除いては、実施例６と同様に行った。
【００７４】
図７〜図８で、各型に対する対照群ＤＮＡを分析した結果、前記出願されたプローブの非特異的反応（偽陽性）及び低感度（偽陰性）を確認した。
【００７５】
比較例２：ＤＮＡチップテスト
配列番号３１〜４２及び配列番号４７〜５４のプローブを含む従来プローブと、図１ａに示した本発明のＤＮＡチップとを使用することを除いては、実施例６と同様に行った。配列分析は通常の配列分析方法を利用して行った。
【００７６】
既存のＤＮＡチップと本発明のＤＮＡチップとで行った結果と、これを確認するためにＰＣＲ増幅反応を行って確認した配列分析の結果と、既存のプローブとＰＣＲ増幅反応方法で得られた結果とを、表５ａ及び５ｂに示す。従来のＤＮＡチップを使用した遺伝子型同定キットは、本発明のＤＮＡチップを使用した遺伝子型同定キットより、偽陰性と偽陽性との頻度が高かった。
【００７７】
本発明はＤＮＡチップを使用してヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）に感染した患者のウイルスの遺伝子型を分析する前記プローブ（配列番号１〜３０）が含まれたＨＰＶの遺伝子型同定キット、及び前記分析キットを使用して患者から単離されたＨＰＶ ＤＮＡの遺伝子型をより正確で迅速に同定する方法を提供する。
【表５ａ】
本発明のＨＰＶ遺伝子型同定キットは、簡易かつ正確な方法でＨＰＶ感染を検出が可能で、のみならず感染ＨＰＶ型を識別が可能であり、かつそれにより子宮頸癌の早期診断、予防、及び治療に寄与する手段である。
【００７９】
以上で、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者には、このような具体的記述は単なる好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるわけではないことは明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とそれらの等価物とによって定義されると言える。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１ａ及び図１ｂは、本発明の一例によるＤＮＡチップに位置したプローブの種類と位置を示す模式図である。
【図２ａ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ１６ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｂ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ１８ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｃ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ３９ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｄ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ５８ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｅ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ６８ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｆ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ６９ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｇ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ６ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｈ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ１１ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｉ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ４３ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｊ】図１ａに示したＤＮＡチップでＨＰＶ４４ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｋ】図１ｂに示したＤＮＡチップでＨＰＶ６１ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図２ｌ】図１ｂに示したＤＮＡチップでＨＰＶ６７ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図３ａ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ１６型に感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｂ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ３１型に感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｃ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ５１型に感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｄ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ５２型に感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｅ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ５６型に感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｆ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ１６及びＨＰＶ６８型に二重感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｇ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ１６及びＨＰＶ５８型に二重感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｈ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ３３及びＨＰＶ５６型に二重感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｉ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ１６、ＨＰＶ５２、及びＨＰＶ５９型に三重感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図３ｊ】本発明のＤＮＡチップを使用したＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５、及びＨＰＶ５９型に三重感染した試料の分析結果を示す写真である。
【図４】本発明の好ましい一実施例によって二段階ＰＣＲ増幅反応を使用したＤＮＡ増幅結果を示す写真である。
【図５】本発明の好ましい一実施例によって多重ＰＣＲ増幅反応を使用したＤＮＡ増幅結果を示す写真である。
【図６】ＤＮＡチップに位置した本発明のプローブと従来のプローブとの種類及び位置を示す模式図である。
【図７ａ】図６に示されたＤＮＡチップでＨＰＶ１６ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図７ｂ】図６に示されたＤＮＡチップでＨＰＶ１８ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図７ｃ】図６に示されたＤＮＡチップでＨＰＶ５６ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図７ｄ】図６に示されたＤＮＡチップでＨＰＶ４３ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図７ｅ】図６に示されたＤＮＡチップでＨＰＶ６８ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
【図８】従来のＨＰＶ６６プローブと本発明のＨＰＶ６６プローブを利用してＨＰＶ６６ＤＮＡを分析した結果を示す写真である。
Claims (14)
- 配列番号１〜３０に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及びこれらオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より選択され、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のＤＮＡと相補的に結合可能な配列を含むことを特徴とするプローブ。
- 請求項１によるプローブからなる群より選択された、少なくとも１種のＨＰＶプローブを含むことを特徴とする、ＨＰＶの遺伝子型同定用ＤＮＡチップ。
- 前記ＤＮＡチップが、配列番号３１〜４１に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された１種以上のＨＰＶプローブをさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡチップ。
- 前記ＤＮＡチップは、
（i）配列番号１〜２０に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された１種以上のＨＰＶプローブ、
（ii）配列番号２１〜３０に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された、８種のＨＰＶプローブ、及び
（iii）配列番号３１〜４１に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有する、１１種のＨＰＶプローブ
を含むことを特徴とする、請求項３に記載のＤＮＡチップ。 - 前記ＤＮＡチップは、
（i）配列番号４〜１０に示された塩基配列を有するプローブの中から選択された、９種のＨＰＶプローブ、
（ii）配列番号２１〜３０に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された、８種のＨＰＶプローブ、及び
（iii）配列番号３１〜４１に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有する、１１種のＨＰＶプローブ
を含むことを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡチップ。 - 前記ＤＮＡチップは、
（i）配列番号４、１５、及び１６に示された塩基配列を有する、３種のＨＰＶプローブ、
（ii）配列番号２１〜３０に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された、８種のＨＰＶプローブ、及び
（iii）配列番号３１〜４１に示された塩基配列、及びこれらに相補的な塩基配列を有する、１１種のＨＰＶプローブ
を含むことを特徴とする、請求項５に記載のＤＮＡチップ。 - （i）請求項２〜６のうちのいずれか一項による、ＨＰＶ遺伝子型同定用のＤＮＡチップ、
（ii）試料ＤＮＡをＰＣＲ増幅反応方法で増幅させるためのプライマー、及び
（iii）前記ＤＮＡチップとハイブリダイズされる増幅ＤＮＡを探知するための標識手段
を含む、ＨＰＶ遺伝子型同定キット。 - 前記ＤＮＡチップは、プローブの位置を知らせる基準マーカーをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載のＨＰＶ遺伝子型同定キット。
- 前記基準マーカーは、β−グロビン、アクチン、及びグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする、請求項８に記載のＨＰＶ遺伝子型同定キット。
- 前記標識手段は、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ビオチン結合物質、ＥＤＡＮＳ（５−（２’−アミノエチル）アミノ−１−ナフタレン硫酸）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミンイソシアネート（ＴＭＲＩＴＣ）、ｘ−ローダミン、及びテキサスレッドからなる群より選択されることを特徴とする、請求項７に記載のＨＰＶ遺伝子型同定キット。
- 前記試料ＤＮＡのＰＣＲ増幅反応は、鎖延長段階がそれぞれ第１増幅段階では２０〜３０秒間、第２増幅段階では１０〜１５秒間行われる、二段階ＰＣＲ増幅反応方法であることを特徴とする、請求項７に記載のＨＰＶ遺伝子型同定キット。
- ＨＰＶ増幅用プライマーとβ−グロビン増幅用プライマーとを同時に添加して、前記試料ＤＮＡをＰＣＲで増幅させることを特徴とする、請求項９または１１に記載のＨＰＶ遺伝子型同定キット。
- 前記プライマーは、配列番号４５または４６に示された塩基配列を有するβ−グロビン増幅用のプライマーを含むことを特徴とする、請求項７に記載のＨＰＶ遺伝子型同定キット。
- 配列番号４５または４６に示された塩基配列を有する、β−グロビン増幅用のプライマー。
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