JP2005502369A - 分画細胞計数方法ならびにそれを実行するための関連する装置およびソフトウェア - Google Patents
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Abstract
本発明は、細胞、特に血球を画像化する光学的方法、システムおよびソフトウェアを提供する。一実施形態では、血球を含む実験室サンプルをバイオディスク上に被着する。バイオディスクは、血球の種々のコンポーネントを結合するための特異抗原を含む混合チャンバーを有する特製のディスクである。ディスクは、光ドライブに入れられた後、回転され、サンプルおよび抗原が他の溶液と混合される。続いて電磁ビームが特定の捕捉ゾーンのサンプルと相互作用するようにバイオディスクに当てられ、結果として生じるビームが検出器により収集される。そして、ビームに含まれる情報がプロセッサに送られ、プロセッサはデジタル画像を生成する。２値化、バックグラウンド均一化、規格化およびフィルタリング等の種々の画像処理方法を実行して、調査データ内の細胞を増強し、計数の精度を高める。泡やぼやけた細胞のような不整部分を補正するために他の技法が設計される。
Description
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
１．発明の分野
本発明は、信号検出装置、データ処理方法、ならびに関連するコンピュータソフトウェアおよび検定法アルゴリズムに関する。特に、本発明は、細胞サンプル等の生物学的サンプルを画像化すること、および収集された画像を分析することに関する。より具体的には、以下で最良の実施の形態により記載される特定の実施形態には制限されないが、本発明は、白血球を含む分画細胞計数方法およびこのような細胞計数を実行するための光バイオディスク(optical bio-disc)の使用に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、以下の出願に基づく優先権の利益を主張する：２００１年９月１２日出願の米国仮特許出願第６０／３２２，８６３号；２００２年１月３１日出願の米国仮特許出願第６０／３５３，３００号；同じく２００２年１月３１日出願の米国仮特許出願第６０／３５３，９２１号；２００２年２月５日出願の米国仮特許出願第６０／３５５，６４４号；２００２年２月８日出願の米国仮特許出願第６０／３５５，３０４号；２００２年２月１９日出願の米国仮特許出願第６０／３５８，４７９号；２００２年３月１２日出願の米国仮特許出願第６０／３６３，９４９号；および２００２年８月２１日出願の米国仮特許出願第６０／４０４，９２１号。これらの出願およびそれらに提供されている開示は全体として参照により本明細書に援用される。
【０００３】
［著作権で保護された資料に関する陳述］
本特許文書の開示の一部は、著作権保護を受ける資料を含む。著作権者は、特許文書または特許開示の何人による複製に対しても、それが米国特許商標庁のファイルまたは記録にある通りである限り異議はないが、さもなければいかなるものであれすべての著作権を留保する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の説明
多くの研究および診断場面で、細胞の混合物から特定の細胞を単離し分析することが必要となる。このような混合物の出所としては、血液、髄液、骨髄、腫瘍ホモジェネート、リンパ系組織、およびその他の細胞物質を含むサンプルがあり得る。
【０００５】
全血球計数（ＣＢＣ）は、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球ヘモグロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均赤血球容積、血小板数、および白血球数を含む検査の全体である。最も一般的に用いられる臨床検査は、健康状態の評価ならびに臨床的な診断、治療、およびフォローアップのために日常的に使用される全ＣＢＣ計数である。
【０００６】
白血球（ＷＢＣ）は、感染と闘い異物を攻撃することによって体を保護する。分画白血球計数は、人の血液中の白血球数および各タイプの白血球の百分率を決定する。ＷＢＣすなわち白血球の数は、病気の存在についての手がかりを提供する。これらの検査は、一般の健康診断に含まれ、感染、アレルギー、および白血病等のさまざまな病気を調べるのに役立つ。追加の白血球が必要とされる時には、骨髄が産生を増大させる。
【０００７】
次の５つのタイプの白血球があり、それぞれ異なる機能を有する：好中球、リンパ球、単球、好酸球、および好塩基球。分画は、これらの細胞が通常の分布で存在するかどうか、またはある細胞タイプが増減しているかどうかを明らかにする。健常人では通常、ＷＢＣ数は１マイクロリットル（μｌ）当たり４，０００〜１０，８００個である。運動、ストレス、および疾病のような因子がこれらの値に影響を及ぼし得る。この情報は、特定のタイプの病気を診断するのに役立つ。ＷＢＣが高い場合、感染、白血病、または組織損傷の可能性がある。ＷＢＣが１マイクロリットル当たり１，０００個を下回る場合、感染のおそれが高い。ＡＩＤＳや化学療法のような免疫系を弱める条件や投薬が、白血球の減少を引き起こす。病気からの回復は、白血球数により監視することができる。数が異常レベルまで上昇または下降し続けることは、健康状態の悪化を示す。数が正常レベルに復帰することは増強を示す。
【０００８】
白血球分画検査は、白血球数自体から得られる以上の情報を集めるために不可欠である。白血球分画計数は、新たな感染や発熱の疑い（たとえＣＢＣが正常であっても）、異常に伴う障害の疑い、異常白血球数、白血病の疑い、その他、好酸球、単球、好塩基球等の異常を評価するために使用される。（例えば薬物療法に付随する）重篤な白血球減少がある場合には、白血球または白血球分画の検査が繰り返し実行されることもある。例えば化学療法や放射線療法の治療中には、治療が癌細胞以外に正常な血球を消耗させているかどうかを判定するために、血球数は非常に重要である。
【０００９】
分画白血球数は、コンピュータ化された細胞計数機器によって決定される。機械は、５つの主要な白血球タイプの総数および百分率を決定する。正常人では、大部分が好中球（５０〜６０％）であり、リンパ球（２０〜４０％）、単球（２〜９％）がそれに続き、好酸球（１〜４％）および好塩基球（０．５〜２％）は少数である。
【００１０】
リンパ球のカテゴリ内には、さらに細胞のサブタイプがある。例えば、リンパ球はＴ細胞（胸腺由来リンパ球）とＢ細胞（嚢相当リンパ球）に大別され、これらはそれぞれ主として細胞性および体液性免疫を受け持つ。白血球のグループを分類するためには形態的特徴が使用されているが、リンパ球サブタイプの多くの機能的能力を区別するには形態だけでは不十分であることが分かっている。さまざまな機能を有するリンパ球を区別するには、ロゼット法、免疫蛍光顕微鏡法、酵素組織化学法、および最近では固有の細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体による分析等の技法が開発されている。
【００１１】
好中球は感染と闘うために重要である。好中球数が１マイクロリットル当たり１，０００個を下回っている時、その状態を好中球減少症という。リンパ腫治療が好中球減少症を引き起こすことがある。肥満および喫煙は好中球数を増加させる。リンパ球はＢ（骨髄成熟）およびＴ（胸腺成熟）リンパ球に分けられる。リンパ球数が、成人で１マイクロリットル当たり１，５００個、または子供で１マイクロリットル当たり３，０００個を下回っている時、その状態をリンパ球減少症という。リンパ腫がリンパ球減少症を引き起こすことがある。
【００１２】
血小板（栓球）は、出血が起きている部位に集まることによって出血を止める細胞様粒子である。その場合、血小板は活性化し、互いに凝集して、出血を止め、凝固を促進する。激しい運動中、患者に感染、炎症、悪性腫瘍等の骨髄増殖性障害がある場合や、脾臓が除去されている場合、血小板数は増大する。血小板数の過剰を血小板血症という。
【００１３】
血液の標準サンプル中の血小板数は通常、１マイクロリットル（μｌ）当たり１３３，０００〜３３３，０００個である。血小板数の過剰を血小板血症という。標準以上の血小板数は、反応性応答または骨髄機能不全に起因している可能性がある。反応性応答は通常、出血、感染、腫瘍形成、および骨髄増殖性障害によって引き起こされる。骨髄機能不全は通常、汎血球減少症と呼ばれる血球の損失を伴う。他方、血小板数の減少は、免疫血小板減少症に起因する。血小板減少症は、血小板数が３０，０００を下回る結果、異常出血を生じる場合に起こる。数が５，０００を下回ると、生命にかかわるとみなされる。
【００１４】
ＣＢＣは、ヘモグロビンレベル、ヘマトクリット、全白血球数、および赤血球数を測定する市販の手動または電子機器によってなされ得る。変形として、血小板数、白血球分画数、および細胞指数があり得る。血液学分析装置は完全自動化され、ＣＳＦ、胸膜液、腹水、心膜液、および胃吸引等の体液中の細胞数、細胞タイプについて結果は正確である。
【００１５】
従来の方法およびシステムと比較して、本発明者らは、細胞およびそのコンポーネントを画像化し分析するための簡単で、小型で、超高感度で、安価なシステムを開発した。このシステムは、光バイオディスク、関連する検出アセンブリ、ならびに情報および信号処理の方法およびソフトウェアを使用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
［発明の概要］
本発明は、実験室サンプル中の細胞物質の画像化および計数のための方法、装置およびソフトウェアを対象とする。本発明の実施形態は、サンプル中の細胞のデジタル画像を作成し、その画像に対してコンピュータ分析を実行する。本発明は、血液等の生体液に感染する寄生虫や病原体を含めて、細胞、特に血球を画像化する。他の検定法では、画像化は、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターに対して実行される。このシステムは、光バイオディスク、関連する検出アセンブリ、ならびに情報および信号処理の方法およびソフトウェアを使用する。
【００１７】
本発明は、バイオディスク、バイオドライブ、および関連方法も対象とする。本発明またはそのさまざまな態様は、以下の同一譲受人に譲渡された同時係属中の特許出願に開示されているディスク、検定法、およびシステムにおいて容易に実施され、それらに適応し、またはそれらとともに使用され得る：「Methods and Apparatus for Analyzing Operational and Non-operational Data Acquired from Optical Discs」と題する１９９９年８月２３日出願の米国特許出願第０９／３７８，８７８号；「Methods and Apparatus for Optical Disc Data Acquisition Using Physical Synchronization Markers」と題する１９９９年８月２３日出願の米国仮特許出願第６０／１５０，２８８号；「Trackable Optical Discs with Concurrently Readable Analyte Material」と題する１９９９年１０月２６日出願の米国特許出願第０９／４２１，８７０号；「Methods and Apparatus for Optical Disc Data Acquisition Using Physical Synchronization Markers」と題する２０００年８月２１日出願の米国特許出願第０９／６４３，１０６号；「Optical Biodiscs with Reflective Layers」と題する２００１年１１月１５日出願の米国特許出願第０９／９９９，２７４号；「Methods and Apparatus for Detecting and Quantifying Lymphocytes with Optical Biodiscs」と題する２００１年１１月２０日出願の米国特許出願第０９／９８８，７２８号；「Methods and Apparatus for Blood Typing with Optical Bio-discs」と題する２００１年１１月１９日出願の米国特許出願第０９／９８８，８５０号；「Apparatus and Methods for Separating Agglutinants and Disperse Particles」と題する２００１年１１月２０日出願の米国特許出願第０９／９８９，６８４号；「Dual Bead Assays Including Optical Biodiscs and Methods Relating Thereto」と題する２００１年１１月２７日出願の米国特許出願第０９／９９７，７４１号；「Apparatus and Methods for Separating Components of Particulate Suspension」と題する２００１年１１月３０日出願の米国特許出願第０９／９９７，８９５号；「Optical Discs for Measuring Analytes」と題する２００１年１２月７日出願の米国特許出願第１０／００５，３１３号；「Methods for Detecting Analytes Using Optical Discs and Optical Disc Readers」と題する２００１年１２月１０日出願の米国特許出願第１０／００６，３７１号；「Multiple Data Layer Optical Discs for Detecting Analytes」と題する２００１年１２月１０日出願の米国特許出願第１０／００６，６２０号；「Optical Disc Assemblies for Performing Assays」と題する２００１年１２月１０日出願の米国特許出願第１０／００６，６１９号；「Detection System For Disk-Based Laboratory and Improved Optical Bio-Disc Including Same」と題する２００１年１２月１４日出願の米国特許出願第１０／０２０，１４０号；「Surface Assembly for Immobilizing DNA Capture Probes and Bead-Based Assay Including Optical Bio-Discs and Methods Relating Thereto」と題する２００１年１２月２１日出願の米国特許出願第１０／０３５，８３６号；「Dual Bead Assays Including Covalent Linkages for Improved Specificity and Related Optical Analysis Discs」と題する２００２年１月４日出願の米国特許出願第１０／０３８，２９７号；「Optical Disc Analysis System Including Related Methods for Biological and Medical Imaging」と題する２００２年１月１０日出願の米国特許出願第１０／０４３，６８８号；「Optical Disc Analysis System Including Related Signal Processing Methods and Software」と題する２００２年１月１４日出願の米国仮出願第６０／３４８，７６７号；「Methods for DNA Conjugation Onto Solid Phase Including Related Optical Biodiscs and Disc Drive Systems」と題する２００２年２月２６日出願の米国特許出願第１０／０８６，９４１号；「Methods for Decreasing Non-Specific Binding of Beads in Dual Bead Assays Including Related Optical Biodiscs and Disc Drive Systems」と題する２００２年２月２８日出願の米国特許出願第１０／０８７，５４９号；「Dual Bead Assays Using Cleavable Spacers and/or Ligation to Improve Specificity and Sensitivity Including Related Methods and Apparatus」と題する２００２年３月１４日出願の米国特許出願第１０／０９９，２５６号；「Use of Restriction Enzymes and Other Chemical Methods to Decrease Non-Specific Binding in Dual Bead Assays and Related Bio-Discs, Methods, and System Apparatus for Detecting Medical Targets」と題する同じく２００２年３月１４日出願の米国特許出願第１０／０９９，２６６号；「Multi-Parameter Assays Including Analysis Discs and Methods Relating Thereto」と題する２００２年４月１１日出願の米国特許出願第１０／１２１，２８１号；「Variable Sampling Control for Rendering Pixelization of Analysis Results in a Bio-Disc Assembly and Apparatus Relating Thereto」と題する２００２年５月１６日出願の米国特許出願第１０／１５０，５７５号；「Surface Assembly For Immobilizing DNA Capture Probes in Genetic Assays Using Enzymatic Reactions to Generate Signals in Optical Bio-Discs and Methods Relating Thereto」と題する２００２年５月１７日出願の米国特許出願第１０／１５０，７０２号；「Optical Disc System and Related Detecting and Decoding Methods for Analysis of Microscopic Structures」と題する２００２年７月１２日出願の米国特許出願第１０／１９４，４１８号；「Multi-Purpose Optical Analysis Disc for Conducting Assays and Various Reporting Agents for Use Therewith」と題する同じく２００２年７月１２日出願の米国特許出願第１０／１９４，３９６号；「Transmissive Optical Disc Assemblies for Performing Physical Measurements and Methods Relating Thereto」と題する２００２年７月１９日出願の米国特許出願第１０／１９９，９７３号；「Optical Analysis Disc and Related Drive Assembly for Performing Interactive Centrifugation」と題する２００２年７月２２日出願の米国特許出願第１０／２０１，５９１号；「Method and Apparatus for Bonded Fluidic Circuit for Optical Bio-Disc」と題する２００２年７月２４日出願の米国特許出願第１０／２０５，０１１号；「Magnetic Assisted Detection of Magnetic Beads Using Optical Disc Drives」と題する同じく２００２年７月２４日出願の米国特許出願第１０／２０５，００５号。これらのすべての出願は全体として参照により本明細書に援用される。したがってそれらは、本明細書において完全に繰り返されているかのごとく、本明細書の裏づけとして背景および関連する開示を提供する。
【００１８】
検定法を実行する本発明の一方法は、光バイオディスク上に配置された特別のチャネル内の血球の光画像化を行うという原理に基づく。約７マイクロリットルの全血をディスク上の特別に設計されたチャネルに注入する。これらの種々の白血球サブタイプを同定し白血球分画数を生成する細胞認識ソフトウェアで画像を分析する。本方法は、特定の細胞に対する細胞特異抗体（specific antibody)を用いた特異的な細胞（specific cell）捕捉に基づく。この具体的な場合に、抗体はリンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、好酸球（ＣＤ１５）等に対するものである。これらの白血球サブタイプ特異抗体は、フローチャンバーを含むバイオディスク内の固体表面に集められるか、または被着される。
【００１９】
バイオディスクドライブアセンブリが、ディスクを回転させ、ディスク上に格納されている符号化情報の読み出しおよび処理を行い、バイオディスクのフローチャンバー内の細胞捕捉ゾーンを分析するために使用される。バイオディスクドライブは、バイオディスクを回転させるモーターと、ディスクの回転速度を制御するコントローラと、ディスクからの戻り信号を処理するプロセッサと、処理された信号を分析する分析器とを備える。回転速度は可変であり、速さ、方向、および回転時間のいずれに関しても綿密に制御され得る。バイオディスクは、フローチャンバーおよびターゲットゾーン内の検査物質がドライブの読み出しビームによって問合せされ、分析器によって分析される前、最中、または後のいずれにおいても、バイオディスクに情報を書き込むために利用されてもよい。バイオディスクは、ディスクの回転を制御し、行われる免疫型判定検定法のタイプに固有の処理情報を提供し、およびバイオドライブに関連するモニタ上に所望の結果を表示するための、符号化された情報を含んでもよい。
【００２０】
包括的に分画細胞計数プロトコールが、そして特に分画白血球計数プロトコールが、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ、またはＤＶＤフォーマット、これらのフォーマットの修正バージョン、およびそれらの代替フォーマット用に開発される。ドライブの読み出しすなわち問合せビームは、分析サンプル中の種々の細胞を検出し、分画細胞計数ソフトウェアで分析可能な画像を生成する。
【００２１】
これらの面倒な細胞計数検定法を実行するためには、顕微鏡的方法または高性能の細胞計数器が不可欠である。本発明により行われる他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。
【００２２】
本方法は、光バイオディスクおよび関連するディスクアセンブリを使用する。分析チャンバー中で遊離している、または特異抗体法により捕捉された種々の白血球サブタイプの光画像が、血液等の体液中の種々の細胞要素をそれらの光散乱特性により同定する細胞認識ソフトウェアプログラムによって生成され分析される。本方法は、細胞染色、ＲＢＣ除去等の面倒なプロトコールのような、分析前のサンプルの処理を必要としない。これらの方法は、上部検出器、下部検出器、イベント計数器、または細胞計数器を用いたＣＤ型リーダ、ＤＶＤ型リーダ等の光ディスクリーダにおける顕微鏡分析または細胞検出を含む。
【００２３】
ＣＤ４／ＣＤ８比を求める等の表面抗原分析に関連する以下の概要は、本方法、装置、システム、およびディスクアセンブリの応用に適した関連検定法の一特定グループを表す。
【００２４】
ディスク準備：エアガンを用いて金製の反射ディスクまたは透過ディスクからちり粒子を除去して清浄にする。スピンコーターを用いてディスクをイソプロパノールで２回すすぐ。２％ポリスチレンをディスク上にスピンコートし、全面にわたり比較的厚いコーティングを形成する。
【００２５】
化学物質の被着：一実施形態は、以下のものを培養する３ステップ被着プロトコールを含む：ストレプトアビジン（３０分培養）；ビオチン化された第１の抗体（６０分培養）；および第２の捕捉抗体（３０分培養）。すべてのステップは、好ましくは、被着と被着の間に厳しい洗浄および乾燥ステップを用いて、湿潤チャンバー（humidity chamber）内で室温で実行する。
【００２６】
簡単に述べると、１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンを含むリン酸緩衝生理食塩水を１μｌずつ各ウィンドウ上に積層し、３０分培養する。蒸留水を用いて余分なストレプトアビジンをすすぎ落とし、ディスクを乾燥する。等量のビオチン化ＩｇＧ（ＰＢＳ中１２５μｇ／ｍｌ）とアルデヒド活性化デキストラン（２００μｇ／ｍｌ）を混合することによりビオチン化ＩｇＧデキストラン複合体を調製する。デキストラン−アルデヒド・ビオチン化ＩｇＧ複合体を各捕捉ウィンドウ内のストレプトアビジン上に積層し、６０分または一晩冷蔵庫で培養する。余分な試薬をすすぎ落とし、ディスクをスピン乾燥する。バイオディスクスロット上の指定スポットに捕捉抗体を積層することによって、特定のバーコード捕捉パターンを作成する。分画計数のため、抗好中球（ＣＤ１２８等）、抗リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ５６等）、抗好酸球（ＣＤ１５）、抗単球（ＣＤ１４）、抗好塩基球（ＣＤ６３）および抗血小板（ＣＤ３２およびＣＤ１５１）を各スロットの指定スポットに積層する。下記の表１に、捕捉層アセンブリのさまざまな捕捉パターンの例を掲げる。冷蔵庫で３０分または一晩培養する。２５μｍ、５０μｍまたは１００μｍ（５０μｍチャネルに必要なサンプル容積は２５μｍチャンバーに必要なサンプル容積の２倍である）の、直線形、Ｕ字形、または他のチャネルフォーマットを用いたディスクと、透明な（上部検出器用）または反射性のカバーディスク（下部検出器用）を組み立てる。
【００２７】
【表１】
【００２８】
ディスクの漏れチェック：通常、バイオハザード物質である血液が分析されるので、これらのディスクは、ｉｎ ｓｉｔｕサンプルを有するディスクのスピン中にどのチャンバーも漏れないことを確かめる漏れチェックがなされる。それぞれのチャネルに、ブロッキング剤であるＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄを満たし、１時間ブロッキングする。ディスクを５，０００ｒｐｍで５分回転させ、漏れおよびディスク安定性を検査する。漏れをチェックした後、ディスクを真空チャンバーに２４時間入れる。真空処理後、チャンバーを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液で満たし、または別法として空のまま放置してから、真空パウチに入れ、使用時まで冷蔵保存する。
【００２９】
全血からのバフィーコート層の単離：静脈血をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やクエン酸デキストラン（ＡＣＤ）のような抗凝固剤とともに遠心チューブに入れ、１，５００×ｇで１５分遠心することにより、バフィーコートを調製する。血漿と赤血球の界面に白血球がバフィーコート層と呼ばれる層を形成する。血漿を細いピペットで慎重に取り除いてから、バフィーコート層を採取する。遠心なしで血液からバフィーコートを得る別法として、血液をフィブリノーゲン、デキストラン、アラビアゴム、フィコールまたはメチルセルロースのような沈降促進剤で沈降させる方法がある。Ｂｏｙｕｍ試薬（メチルセルロースとメトリゾ酸ナトリウム）が、赤血球汚染のない白血球調製品を得るのに特に好適である。
【００３０】
ディスク上の検定法基礎技術の説明：分画白血球計数ディスク検査の好ましい一実施形態は、３つの個別のコンポーネント、すなわち（１）化学物質を含むベースディスク、（２）チャネル層、および（３）カバーディスクを含む。
【００３１】
バフィーコートまたは全血（７マイクロリットルのＰＢＳ溶液）をディスクチャンバーに注入し、チャンバーの入口および出口を密閉タブで密封し、ディスクを室温で１５分培養する。第１の方法では、上部または下部検出器を有する光ドライブの標準７８０ｎｍレーザを用いてディスク上の所与の領域（例えば面積１平方ミリメートル）を走査する。本発明による細胞認識ソフトウェアは、１平方ミリメートルに等しい捕捉画像から分画数を出力するように自動化されており、得られた値を補外して全血の１立方ミリメートル当たりの計数を決定する。また第２のバーコード法では、標準７８０ｎｍレーザを用いてディスクを走査して捕捉ゾーン（リンパ球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、および血小板）を画像化する。本発明の細胞認識ソフトウェアは、とりわけ、以下のルーチンを実行する：（ａ）ディスクを遠心して余分な結合していない細胞をスピン除去し、（ｂ）それぞれの特異的な細胞捕捉ゾーン内の画定領域を画像化し、（ｃ）各捕捉ゾーン内の特定して捕捉された細胞を計数する等のデータ処理を行い、（ｄ）異なる白血球のサブセットについて全血の１立方ミリメートル当たりの白血球数を導出する。
【００３２】
本発明の一態様によれば、処理ステップ中に、認識ソフトウェアは各捕捉ゾーンを読み出し、遭遇した細胞をマーキングする。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。各捕捉ゾーンからのデータを処理した後、ソフトウェアは、容積１マイクロリットルすなわち１立方ミリメートルの血液当たりのリンパ球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、および血小板ゾーンの数を表示する。プロセス全体にかかる時間は、ディスクを光ドライブに挿入してから所望の計数または比を求めて表示するまで約１０〜１５分である。本発明のこの態様の別の実施形態では、捕捉ゾーンから電気的応答を読み出し、ディスクまたはメモリに格納してデータファイルを得る。これは、以下でさらに詳細に説明するように、認識目的で後処理してもよい。
【００３３】
ディスクの仕様：以下のサブセクションは、本発明とともに有利に使用可能ないくつかの光バイオディスクの特定の実施形態について概説することを目的とする。
【００３４】
（Ａ）トラッキング設計：本発明の好ましい一実施形態では、ディスクは、３００ｎｍの金で被覆したフォワードウォブルセット(forward Wobble Set)ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０である。この反射ディスク上に、サイズ２×１ｍｍの長円形データウィンドウをリソグラフィによりエッチングする。Ｕ字形チャネルを用いて、高さ２５〜１００マイクロメートルのチャンバーを作成する。入口および出口を含むチャンバー全体を満たすには約７μｌのサンプルを要する。４ウィンドウ／４チャネルのフォーマットを用いるのが好ましいであろう。しかし、透過ディスク上にはデータウィンドウはエッチングされず、ディスク全体が利用可能である。
【００３５】
（Ｂ）接着剤および接合：FraylockのＵ字形接着剤DBL 201 Rev C 3M94661または直線状チャネルを用いてチャンバーを作成する。
【００３６】
（Ｃ）カバーディスク：直径０．０４０インチのサンプルインレット４８個が半径２６ｍｍで等間隔に配置された完全反射性の透明ディスクを用いる。
【００３７】
データの捕捉および処理：データディスクは、本発明のソフトウェアにより、特定の細胞認識方法を用いて、４倍速、サンプルレート２．６７ＭＨｚで走査され読み出される。
【００３８】
ソフトウェア：本発明は、さらに、処理方法ならびに関連する細胞認識および画像化ソフトウェアを含む。このソフトウェアは、細胞計数および分画細胞計数を実行し表示することを対象とする。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。本ソフトウェアは、光バイオディスク上や光ディスクドライブリーダデバイス内に格納されてもよく、別法として安全なサーバから光リーダによってのみアクセス可能であってもよい。このサーバは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）のようなコンピューティングネットワークで実施されてもよく、または規定された条項のもとでインターネットを通じて利用可能とされてもよい。このような配布方法は、同一譲受人に譲渡された「Interactive Method and System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Medical Information Using Specially Prepared Bio-Optical Disc, Optical Disc Drive, and Internet Connections」と題する２０００年１１月８日出願の米国仮出願第６０／２４６，８２４号および対応する米国特許出願第０９／９８６，０７８号に開示されている。
【００３９】
本明細書に開示されるさまざまな好ましい実施形態を実施するために使用される資材には、フォワードウォブル金メタライズドフォトレジストディスク、透過性金メタライズドディスク、ピペットおよびチップ、スピンコーター、遠心機、スイングローター、クエン酸ナトリウムやエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような抗凝固剤を添加したＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）ＣＰＴチューブ、恒湿チャンバー、絞り機、接着剤、カバーディスク、透明カバーディスク、テープまたは同等品、真空装置、イエローチップ、および真空チャンバーがある。
【００４０】
本発明の一実施形態では、血球を含む実験室サンプルをバイオディスク上に、またはディスクアセンブリに形成された流体チャネル内に被着する。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。バイオディスクは、血球の成分を適所に結合させるための特異抗原を含む流体チャネルおよび／または混合チャンバーを有する特製のＣＤサイズのディスクである。バイオディスクは、慎重に積層した金属および基板からなるため、被着された検査サンプルと電磁ビームが相互作用することを可能にする特定の光学的性質を有する。バイオディスクを光ドライブに挿入すると、ドライブはディスクを回転させ、いくつかの実施形態では、他の必要な溶液とサンプルを混合してもよい。ドライブ内のバイオディスクに電磁ビームが当てられる。反射ディスクと称する一実施形態では、ビームはバイオディスクの反射面で反射し、光ドライブ内の検出器が反射ビームを収集する。透過ディスクと称する別の実施形態では、ビームの一部がバイオディスクを通過し、光ドライブ内のもう１つのタイプの検出器へと透過する。いずれの場合でも、検出器によって収集されるビームは、バイオディスク上の実験室サンプルに関する情報を含む。次にその情報はアナログ−デジタルプロセッサに送られ、そこで検出器からの電気信号を表すデジタルデータが生成される。このデジタルデータは、リアルタイムで処理され、メモリまたはディスクに格納されてから、全部または一部が生データとして処理されてもよく、または画像フォーマットを含む種々のフォーマットへとエクスポートされてもよい。これらのフォーマットのいずれも、意図する結果を生成するために他のアプリケーションまたは手段によってさらに処理されてよい。このデジタルデータは、自動式、電気式、コンピュータ制御式、および／または機械式の計数および分析に有用である。デジタルデータは、専門家による手計数、認識等の手作業の分析に好適な可視画像を生成するためにも使用可能である。本発明の別の実施形態では、画像を含み得る生データ、デジタルデータ、エクスポートされたデータがアーカイブに格納される。このように、本発明の方法は一般に「調査データ」に適用可能である。「調査データ」としては、本明細書で使用される場合、生の検出器出力データ、生の信号データ、デジタルデータ、エクスポートされたデータ、または画像もしくは画像データを含むエクスポートされたデータがあるが、これらには限定されない。アーカイブは、調査データが登録され、所望であれば、例えば人口統計的、地理的、医学的、歴史的、または個人的データのような他の識別情報と関連づけられ得る場所を提供する。その後、例えばさまざまな母集団グループの健康動向研究を行うために、調査データのグループを分析することができる。
【００４１】
本発明の一実施形態は、血球を計数するという要求に対処する。本発明は、処理方法ならびに関連する細胞認識および画像化ソフトウェアを含む。このソフトウェアは、細胞計数を実行し、対応する結果を表示することを対象とする。本発明の一実施形態では、２値化、バックグラウンド均一化、規格化およびフィルタリング等の種々の画像処理方法を実行して、調査データ内の細胞の外観を増強（enhance）し、細胞計数のプロセスを支援する。調査データ内の閉じ込められた泡、クラック、およびぼやけた細胞のような不整部分について細胞計数を補正するために、他の技法が実行される。
【００４２】
本発明の実施形態は、光バイオディスク上や光ディスクドライブリーダデバイス内にソフトウェアを格納し、または別法としてソフトウェアは安全なサーバから光リーダによってのみアクセス可能である。このサーバは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）のようなコンピュータネットワークで実施されてもよく、または規定された条項のもとでインターネットを通じて利用可能とされてもよい。このような配布方法は、同一譲受人に譲渡された「Interactive System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Information and the Use Thereof」と題する２００１年１１月７日出願の米国特許出願第０９／９８６，０７８号に開示されており、これは参照により本明細書に援用される。
【００４３】
より具体的には、本発明は、細胞等の調査特徴物を計数する方法に関する。この方法は、細胞のサンプルの調査データを取得するステップと、調査データ内で評価矩形を選択するステップと、評価矩形内で調査データを増強するステップと、評価矩形に示される細胞を計数するステップとを含む。この方法の特定の一実施形態では、細胞計数は、輝中心（bright center）、または別法として暗縁（dark rim）を認識することによって実行される。
【００４４】
本発明の別の態様は、評価矩形のカスタムサイズを選択する方法に関する。
【００４５】
さらに本発明の別の態様は、複数の評価矩形を選択する方法に関する。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、調査データに対してバックグラウンド照度均一化を実行するステップと、調査データに対して規格化を実行するステップと、調査データをフィルタリングするステップを通じて評価矩形内の調査データを増強することに関する。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、調査データに対して近傍矩形のサイズを選択するステップと、調査データ内の点を選ぶステップと、水平走査を実行するステップであって、それによって、点を中心とする近傍矩形内に配置されたすべての隣接点に対する第１スライド平均を計算するステップと、垂直走査を実行するステップであって、それによって、点を中心とする近傍矩形内に配置されたすべての隣接点に対する第２スライド平均を計算する、垂直走査を実行するステップと、第１スライド平均および第２スライド平均を組み合わせるステップであって、それによって、全平均を生成するステップと、全平均と点のもとの値の差を求めて該差をバックグラウンド値に加算することにより計算される結果値に、点のもとの値を再割当てするステップと、調査データ内のすべての点について、水平走査を実行するステップ、垂直走査を実行するステップ、２つの平均を組み合わせるステップおよびもとの値を再割当てするステップを繰り返すステップを通してバックグラウンド照度均一化を実施することに関する。
【００４８】
本発明の別の態様において、調査データに規格化を実行するステップは、調査データ内のすべての点の値の平均および標準偏差を計算するステップと、平均および標準偏差を用いて調査データ内のすべての点の値を規格化するステップと、必要であればいくつかの点の値を切り詰めるステップとをさらに含む。
【００４９】
本発明のさらなる別の態様において、調査データをフィルタリングする方法がさらに提供され、該方法は、近傍矩形のサイズを選択するステップと、調査データ内の点を選ぶステップと、点を中心とする近傍矩形内に配置されたすべての十分に異なる点を見つけるステップと、十分に異なる点の数が所定のフィルタリング基準より大きい場合に点の値を再割当てするステップと、調査データ内のすべての点について、すべての十分に異なる点を見つけるステップおよび値を再割当てするステップを繰り返すステップとをさらに含む。
【００５０】
本発明のさらに別の態様において、処理方法が提供され、該方法は、調査データから不要なコンポーネントを除去するステップを含み、不要なコンポーネントを除去するステップは、しきい値を選択するステップと、しきい値を用いて調査データに対して２値化を実行するステップと、調査データに対して規格化を実行するステップと、連結コンポーネントを抽出するステップと、サイズしきい値を選択するステップと、サイズしきい値を満たさないコンポーネントを除去するステップとをさらに含む。
【００５１】
本発明のもう１つの追加的態様は、輝中心によって調査データ内の細胞を計数する方法に関する。この方法は、調査データに対して畳込みを実行するステップと、複数の局所最大値を探索するステップと、複数の局所最大値から冗長な局所最大値を除去するステップと、残りの最大を細胞の中心であると宣言するステップと、細胞の中心を計数するステップとを含む。
【００５２】
本発明の別の態様によれば、輝中心によって調査データ内の細胞を計数する方法が提供される。この代替的な方法は、上記調査データに対して反転を実行するステップと、シフトした円環との複数の畳込みを実行するステップと、複数の畳込みからの結果の和をとるステップと、局所最大値を見つけるステップと、最大を細胞の中心であると宣言するステップと、細胞の中心を計数するステップとをさらに含む。
【００５３】
さらに、本発明のもう１つの態様は、輝中心により計数された細胞を調査データから除去するステップと、細胞をそれらの暗縁により計数するステップと、輝中心を認識することにより細胞を計数するステップからの合計を暗縁を認識することにより計数するステップからの合計に加算するステップとを含む方法に関する。
【００５４】
本発明のさらに別の態様は、調査データ内の暗縁により細胞を計数する方法を含む。本方法は、調査データに対して反転を実行するステップと、シフトした円環との複数の畳込みを実行するステップと、複数の畳込みからの結果の和をとるステップと、最大を細胞の中心であると宣言するステップと、細胞の中心を計数するステップとを含む。
【００５５】
本発明の別の態様において、細胞を計数増強する方法は、調査データに対して規格化を実行するステップと、調査データをフィルタリングするステップと、しきい値数を選択するステップと、調査データが上記しきい値数だけ所定バックグラウンド値と異なっているかどうかを判断することにより調査データに対して２値化を実行するステップと、調査データに対して規格化を実行するステップと、調査データ内の１ピクセル幅境界を抽出するステップと、１ピクセル幅境界により画定される領域を塗りつぶすステップと塗りつぶされた領域に畳込みを適用するステップとをさらに含む。
【００５６】
本発明のもう１つの態様は、細胞のサンプルのデジタルデータを取得する方法に関する。この方法は、（１）光ディスク表面上に血液サンプルを用意するステップと、（２）光ディスクを光リーダに装填するステップと、（３）光ディスクを回転させるステップと、（４）光ディスク上の捕捉ゾーンの１つに電磁放射の入射ビームを当てるステップとを含む。表面は、１種または数種の捕捉剤を有する１つまたは複数の捕捉ゾーンを備える。この方法は、続いて、（５）捕捉ゾーンでディスクと相互作用した後に形成される電磁放射のビームを検出器で検出するステップと、（６）検出されたビームをアナログ出力信号に変換するステップと、（７）アナログ出力信号を、捕捉ゾーンに捕捉された細胞を含むデジタルデータに変換するステップとを含む。
【００５７】
本発明の別の態様によれば、アナログ出力をデジタルデータに変換する方法が提供される。この変換方法は、一定間隔でアナログ信号の振幅をサンプリングするステップと、サンプリング振幅を一次元配列に記録するステップと、サンプリングするステップおよび記録するステップを用いて複数の一次元配列を作成するステップと、複数の一次元配列を組み合わせるステップであって、それによって、サンプルのデジタルデータを含む２次元配列を作成するステップとを含む。
【００５８】
本発明のさらにもう１つの態様は、細胞のサンプルのデジタルデータを取得する方法に関する。この方法は、光ディスク表面（この表面は１種または数種の捕捉剤を有する１つまたは複数の捕捉ゾーンを含む）上に血液サンプルを用意するステップと、光ディスクを光リーダに装填するステップと、光ディスクを回転させるステップと、光ディスク上の捕捉ゾーンの１つに電磁放射の入射ビームを当てるステップと、捕捉ゾーンでディスクと相互作用した後に形成される電磁放射のビームを検出器で検出するステップと、検出されたビームをアナログ出力信号に変換するステップとを含む。本方法のこの特定の実施形態は、アナログ出力信号を、捕捉ゾーンに捕捉された細胞を含むデジタルデータに変換するステップで終わる。捕捉ゾーンに当てられる光が検出器へ反射されるように、光ディスクは反射層を備えて構成され、検出器は下部検出器である。本発明のもう１つの態様では、上部検出器または分割検出器が使用される。
【００５９】
本発明のもう１つの態様は、評価矩形を選択する方法に関する。この方法は、（１）調査データ内で複数のウィンドウの１つを見つけるステップと、（２）ウィンドウ内で標準サイズの評価矩形をクロッピングするステップとを含む。この方法の特定の一実施形態では、複数のウィンドウの１つを見つけるステップは、（ａ）調査データに対して圧縮を実行するステップと、（ｂ）画像に対してしきい値評価を実行するステップと、（ｃ）調査データに対して２値化を実行するステップと、（ｄ）調査データに対して規格化を実行するステップと、（ｅ）調査データから連結コンポーネントを抽出するステップと、（ｆ）連結コンポーネントからウィンドウに対応するコンポーネントを見つけるステップとを含む。
【００６０】
本発明のさらにもう１つの態様は、調査データから連結コンポーネントを抽出する方法に関する。この方法は、調査データのすべての黒点のコンポーネントに初期コンポーネント番号を割り当てるステップと、初期走査方向を設定するステップと、調査データを走査して連結黒点のコンポーネント番号が同一になるようにコンポーネント番号を再割当てするステップとを含む。
【００６１】
本発明のさらに追加的な態様は、ダークスポットを有する光ディスク実施形態からの調査データ内で評価矩形を選択する方法に関する。この方法は、調査データ内で少なくとも１つのダークスポットを見つけるステップと、ダークスポットから所定距離シフトすることによって求められる点を中心とする標準サイズの評価矩形を作成するステップとを含む。
【００６２】
本発明の表示態様によれば、調査データの画像の表示を増強する方法が提供される。この方法は、調査データに対して高速フーリエ変換を実行するステップと、周波数領域でデータのスペクトルの一部を除去するステップと、逆変換を実行して調査データの修正バージョンを回復するステップとを含む。
【００６３】
本発明の表示態様によれば、調査データの画像の表示を増強する別の方法が提供される。本方法は、画像が歪んでいるかどうかを判断するステップと、歪みの方向を求めるステップと、画像の歪みを補正するステップとを含む。
【００６４】
本発明のもう１つの態様は、以前に格納された調査データをアーカイブから取り出し、調査データに対して分析を実行する方法に関する。このようなアーカイブは、検査サンプルを提供した患者の特徴に従って、格納される調査データを登録することができる。本発明の一態様では、患者の特徴から選択された複数の基準に適合するサンプルが、母集団健康動向研究を行うために選択される。
【００６５】
本発明のもう１つの態様は、白血球計数においてさまざまなコンポーネントを計数し、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の計数、ならびにＣＤ４細胞数のＣＤ８細胞数に対する比を表示することに関する。
【００６６】
本発明のさらなる目的、態様、および方法は、それらに寄与する追加的特徴およびそれらから生じる利点とともに、添付図面に示される本発明の好ましい実施形態の以下の説明から明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００６７】
［発明の詳細な説明］
本発明は、実験室サンプル中の細胞物質の画像化および計数のための方法および装置を対象とする。これらの方法および方法は、光ディスクの上または内部にある、対象とするいかなるタイプの調査特徴物を画像化し計数することに適用されてもよい。本発明の実施形態は、サンプル中の調査特徴物すなわち細胞の調査データを作成し、その調査データに対してコンピュータ分析を実行する。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。
【００６８】
以下の説明では、本発明の実施形態をさらに詳細に説明するために、数多くの具体的な詳細が記載される。しかし、当業者には明らかなはずであるが、本発明はこれらの具体的な詳細なしに実施され得る。他の場合には、本発明を不明瞭にしないために、既知の特徴については詳述しない。
【００６９】
本明細書では、光ディスクデータを用いた白血球計数のためのいくつかの実施形態がさらに詳細に説明される。これらの実施形態は、白血球のみを画像化し計数することに限定されず、いかなるタイプの細胞物質の計数を行うことにも容易に適用され得る。これには、以下のものには限定されないが、赤血球、白血球、ビーズ、および光リーダによって検出可能な類似の光シグネチャ(signature)を生成する、生物学的か非生物学的かを問わずいかなる他の物体も含まれ得る。他の検定法では、対象となる調査特徴物は、細胞である代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。白血球以外の物質に対して本発明を使用するのに必要ないくつかの変更については、以下で細胞計数の議論においてさらに詳細に説明する。
【００７０】
以下の議論では、本発明のデータ収集およびデータ分析の態様を説明するために、２つの主要なセクションが提示される。第１セクションは、実験室サンプルから調査データを収集し、当該調査データを配列型のストレージに変換するために用いられる装置、方法、およびアルゴリズムの詳細な説明を提示する。第２セクションは、調査データの分析に関する方法およびアルゴリズムの詳細な説明を提示する。その２つのセクションに続いて、白血球計数検定法を実行する方法に関するセクションが与えられる。
【００７１】
Ｉ．データ収集
本発明の実施形態は、実験室サンプル中の細胞物質からの調査データの取得を含む。図１は本発明による光バイオディスク１１０の斜視図である。この光バイオディスク１１０は、光ディスクドライブ１１２およびディスプレイモニタ１１４とともに示されている。検査サンプルがバイオディスク１１０上の指定領域に被着される。バイオディスクが光ディスクドライブ１１２に挿入されると、ディスクドライブは、検査サンプルとの相互作用により修正または変調された電磁放射ビームを用いることによりサンプルから情報を収集することを受け持つ。情報が分析され処理された後、コンピュータモニタ１１４がその結果を表示する。
【００７２】
本発明で使用可能な光バイオディスク１１０の２つの主要な実施形態がある。図２、図３および図４は光バイオディスク１１０の反射実施形態を示す一方、図５、図６および図７は光バイオディスク１１０の透過実施形態を示している。
【００７３】
Ａ．反射実施形態
図２は、光バイオディスク１１０の一実施形態の構造要素の分解斜視図である。図２は、本発明において使用可能な反射ゾーン光バイオディスク１１０（以下「反射ディスク」）の一例である。構造要素は、キャップ部分１１６、接着すなわちチャネル部材１１８、および基板１２０を含む。キャップ部分１１６は、１つまたは複数の入口１２２および１つまたは複数の通気口１２４を含む。キャップ部分１１６は、ポリカーボネートから形成されてもよく、好ましくは、図２の斜視図で見た場合の下部が反射面１４６（図４にさらに分かりやすく示されている）で被覆される。好ましい実施形態では、トリガマーキング１２６が反射層１４２（図４）の表面上に含まれる。トリガマーキング１２６は、情報が符号化された、バイオディスクの３層すべてで透明なウィンドウ、不透明領域、または反射もしくは半反射領域を含んでもよい。符号化情報は、データをプロセッサ１６６（図１０Ａに示す）に送るために使用され、プロセッサ１６６は図８および図１０Ａに示す問合せすなわち入射ビーム１５２の作用機能と相互作用する。図２に示す第２の要素は、流体回路１２８すなわちＵ字形チャネルが形成された接着すなわちチャネル部材１１８である。流体回路１２８は、好ましくは、メンブレンを打ち抜きまたは切削してプラスチックフィルムを除去し、図示のような形状を形成することによって形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フローチャネル１３０および戻りチャネル１３２を含む。図２に示す流体回路１２８のいくつかは、混合チャンバー１３４を含む。２つの異なるタイプの混合チャンバー１３４が例示されている。第１のものは、対称混合チャンバー１３６であり、フローチャネル１３０に関して対称的に形成される。第２のものはオフセット混合チャンバー１３８である。オフセット混合チャンバー１３８は、図示のようにフローチャネル１３０の片側に形成される。図２に示す第３の要素は、ターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０を含む基板１２０である。基板１２０は、好ましくはポリカーボネートからなり、その上部に反射層１４２が被着される（図４）。ターゲットゾーン１４０は、反射層１４２を図示の形状に、または別法として、除去することによって所望の形状に形成される。別法として、ターゲットゾーン１４０は、反射層１４２を付ける前にターゲットゾーン１４０領域をマスキングすることを含むマスキング技法によって形成されてもよい。反射層１４２は、アルミニウムまたは金のような金属から形成されてもよい。
【００７４】
図３は、図２に示す光バイオディスク１１０の上面図である。ディスク内に位置する流体回路１２８、ターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０およびトリガマーキング１２６が見えるように、キャップ部分１１６の上の反射層１４２が透明に示されている。各捕捉ゾーンは、サンプル中の異なるコンポーネント（または異なる細胞）を結合するための１種または数種の特異抗原を有するので、検定法処理後、チャンバー内の各捕捉ゾーンはあるタイプの細胞または細胞コンポーネントを含む。結合すなわち捕捉は、血球の特定コンポーネントに「結合」(lock)することによりその特異的な細胞を捕捉する化学構造を有する１種または数種の抗原を有することによって達成される。細胞コンポーネントの分離は、血球、例えば白血球の分画計数を実行するために極めて重要である。他の検定法では、調査特徴物は、細胞である代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。ターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０は、電磁問合せビームが検査サンプルと相互作用する場所を画定する。
【００７５】
図４は、本発明の一実施形態による反射ゾーン型光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。この図は、それぞれの層、基板、コーティング、またはメンブレンの部分断面図を示すように切り取られた、その種々の層の一部を含む。図４は、反射層１４２で被覆された基板１２０を示している。活性層１４４が反射層１４２を覆う。好ましい実施形態では、活性層１４４はポリスチレンから形成されてもよい。別法として、ポリカーボネート、金、活性ガラス、改質ガラス、または改質ポリスチレン、例えばポリスチレン−無水マレイン酸共重合体を使用してもよい。さらに、ヒドロゲルを使用可能である。この特定の実施形態に示されているように、プラスチック接着部材１１８が活性層１４４を覆う。プラスチック接着部材１１８の露出部分は、流体回路１２８を作り出す切削または打ち抜きされたＵ字形状を示している。本バイオディスクのこの反射ゾーン実施形態における最後の構造層はキャップ部分１１６である。キャップ部分１１６は、その下部に反射面１４６を含む。反射面１４６は、アルミニウムまたは金のような金属からなってもよい。
【００７６】
Ｂ．透過実施形態
図５は、本発明による透過型の光バイオディスク１１０の構造要素の分解斜視図である。透過型の光バイオディスク１１０の構造要素は、同様に、キャップ部分１１６、接着すなわちチャネル部材１１８、および基板１２０層を含む。キャップ部分１１６は、１つまたは複数の入口１２２および１つまたは複数の通気口１２４を含む。キャップ部分１１６は、ポリカーボネート層から形成されてもよい。図７および図８に最も分かりやすく示されているように、任意のトリガマーキング１２６が、薄い半反射層１４３の表面に含まれてもよい。トリガマーキング１２６は、情報が符号化された、バイオディスクの３層すべてで透明なウィンドウ、不透明領域、または反射もしくは半反射領域を含んでもよい。符号化情報は、データをプロセッサ１６６（図１０Ａに示す）に送るために使用され、プロセッサ１６６は図８および図１０Ａに示す問合せすなわち入射ビーム１５２の作用機能と相互作用する。
【００７７】
図５に示す第２の要素は、流体回路１２８すなわちＵ字形チャネルが形成された接着すなわちチャネル部材１１８である。流体回路１２８は、メンブレンを打ち抜きまたは切削してプラスチックフィルムを除去し、図示のような形状を形成することによって形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フローチャネル１３０および戻りチャネル１３２を含む。図５に示す流体回路１２８のいくつかは、混合チャンバー１３４を含む。２つの異なるタイプの混合チャンバー１３４が例示されている。第１のものは、対称混合チャンバー１３６であり、フローチャネル１３０に関して対称的に形成される。第２のものはオフセット混合チャンバー１３８である。オフセット混合チャンバー１３８は、図示のようにフローチャネル１３０の片側に形成される。
【００７８】
図５に示す第３の要素は基板１２０であり、これはターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０を含んでもよい。基板１２０は、好ましくはポリカーボネートからなり、その上部に薄い半反射層１４３が被着される（図８）。図５および図８に示すディスク１１０の基板１２０に関連する半反射層１４３は、図２、図３および図４に示す反射ディスク１１０の基板１２０上の反射層１４２よりも大幅に薄い。半反射層１４３がより薄いため、図１１に示すように、問合せビーム１５２の一部が透過ディスクの構造層を透過することができる。薄い半反射層１４３は、アルミニウムまたは金のような金属から形成されてもよい。
【００７９】
図６は、図４の透過型光バイオディスク１１０の上面図である。キャップ部分１１６が透明なので、ディスク内に位置する流体回路、トリガマーキング１２６およびターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０が見えている。ターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０は、電磁ビームが検査サンプルと相互作用する場所である。ディスクの回転後、サンプル中の細胞の特定コンポーネントが、チャンバー内にあらかじめ装填された種々の捕捉剤または抗原によって、異なる捕捉ゾーンに捕捉される。
【００８０】
図７は、本発明の透過ディスク実施形態による光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。ディスク１１０は、その種々の層の一部が、それぞれの層、基板、コーティング、またはメンブレンの部分断面図を示すように切り取られて示されている。図７は、透明なキャップ部分１１６、基板１２０上の薄い半反射層１４３、およびトリガマーキング１２６を有する透過ディスクフォーマットを示している。トリガマーキング１２６は、キャップの上部に配置される不透明材料を含む。別法として、トリガマーキング１２６は、ディスクの薄い反射層１４３上にエッチングされた透明な非反射性ウィンドウによって、またはトリガ検出器１６０（図１０Ａ）から来る信号を吸収し、もしくは反射しないいかなるマークによって形成されてもよい。また、図７は、図示の形状、または別法として所望の形状の指定領域をマーキングすることによって形成されるターゲットゾーン１４０も示している。ターゲットゾーン１４０を指示するためのマーキングは、基板１２０上の薄い半反射層１４３上に、または基板１２０の下部（ディスクの下）に形成されてもよい。別法として、ターゲットゾーン１４０は、ターゲットゾーン１４０を除く薄い半反射層１４３全体をマスキングすることを含むマスキング技法によって形成されてもよい。この実施形態では、ターゲットゾーン１４０は、薄い半反射層１４３上にインクをシルクスクリーン加工することによって作成してもよい。活性層１４４が薄い半反射層１４３を覆う。好ましい実施形態では、活性層１４４は厚さ４０〜２００μｍの２％ポリスチレン層である。別法として、ポリカーボネート、金、活性ガラス、改質ガラス、または改質ポリスチレン、例えばポリスチレン−無水マレイン酸共重合体を使用してもよい。さらに、ヒドロゲルを使用可能である。この実施形態に示されているように、プラスチック接着部材１１８が活性層１４４を覆う。プラスチック接着部材１１８の露出部分は、流体回路１２８を作り出す切削または打ち抜きされたＵ字形状を示している。本バイオディスク１１０のこの透過実施形態における最後の構造層は、入口１２２および通気口１２４を含む透明な非反射性のキャップ部分１１６である。
【００８１】
Ｃ．ディスク実施形態の光学的性質
２つのディスク実施形態の主な相違点の１つは、光ディスクの上部層のコーティングの厚さである。透過ディスクの場合、薄い半反射層１４３が基板層１２０の上に被着される。反射ディスクの場合、実質的により厚い反射層が基板層１２０の上に被着される。図８に示す好ましい実施形態では、透過ディスクの薄い半反射層１４３は厚さ約１００〜３００Åであり、４００Åを超えない。この理由は、金被膜層は８００Å以上の厚さでは完全反射性であり、光はおよそ４００Å以下の厚さの金被膜を透過することができるからである。下記の表２に、被膜の厚さに関して、金被膜の反射および透過特性を示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
金被膜の光の透過に対するしきい値密度は約４００Åである。表２に加えて、図９は、金の厚さに基づく薄い半反射層１４３の反射性と透過性の逆比例関係のグラフィカル表示を提供している。図９のグラフで用いられている反射性および透過性の値は絶対値である。図８に示すように、より薄い半反射層１４３のために、入射すなわち問合せビーム１５２の一部が侵入し通り抜けることができる。こうして、入射すなわち問合せビーム１５２は、図１０Ａに示すような上部検出器１５８によって検出され得る。同時に、光の一部は入射路に沿って反射すなわち逆戻りする。
【００８４】
反射光バイオディスクの場合、戻りビーム１５４が、生物学的サンプルに関する情報を伝達する。上記のように、生物学的サンプルに関するこのような情報は、入射ビームがフローチャネル１３０またはターゲット（すなわち捕捉）ゾーン１４０内にあるためにサンプルと接触する時に実質的に限って、戻りビームに含まれる。戻りビーム１５４は、反射層１４２の中または上に符号化された、さもなければ図１３および図１４に示すウォブル溝１７０に符号化された情報を伝達してもよい。当業者には明らかなように、対応する入射ビームが反射層１４２と接触する時にのみ、あらかじめ記録された情報が、ターゲットすなわち捕捉ゾーンを有する反射ディスクの戻りビーム１５４に含まれる。情報を含む反射層１４２が除去されたか、さもなければ存在しない領域に入射ビーム１５２がある時には、このような情報は戻りビーム１５４に含まれない。
【００８５】
本発明の方法は、同一の譲受人に譲渡された「Optical Discs Including Equi-Radial and/or Spiral Analysis Zones and Related Disc Drive Systems and Methods」と題する２００２年１月２９日出願の米国仮出願第６０／３５３，０１４号（これは参照により本明細書に援用される）に開示されているような等半径(equi-radial)チャネルを含むバイオディスクにも容易に適用され得る。
【００８６】
Ｄ．システム装置
図１０Ａは、斜視ブロック図によりシステム装置の動作を説明する表示である。これは、光アセンブリ１４８、入射すなわち問合せビーム１５２を生成する光源１５０、戻りビーム１５４、および透過ビーム１５６を含む。反射バイオディスク実施形態の場合、戻りビーム１５４は、光バイオディスク１１０のキャップ部分１１６の反射面１４６で反射される。本光バイオディスク１１０のこの反射実施形態では、戻りビーム１５４が下部検出器１５７によって検出され、信号作用物質が存在するかどうかが分析される。透過バイオディスク実施形態では、透過ビーム１５６が上部検出器１５８によって検出され、同じく信号作用物質が存在するかどうかが分析される。透過実施形態では、上部検出器１５８として光検出器を用いてもよい。
【００８７】
図１０Ａは、ディスク上のトリガマーキング１２６およびトリガ検出器１６０を含むハードウェアトリガ機構も示している。ハードウェアトリガ機構は、反射バイオディスクおよび透過バイオディスクの両方で使用される。トリガ機構により、プロセッサ１６６は、問合せビーム１５２がそれぞれのターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０上にある時にのみデータを収集することができる。さらに、透過バイオディスクシステムでは、ソフトウェアトリガを使用してもよい。ソフトウェアトリガは、下部検出器を用いて、問合せビーム１５２がそれぞれのターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０の端に当たったらすぐにデータを収集するようにプロセッサ１６６に通知する。図１０Ａは、光バイオディスク１１０の回転を制御するドライブモーター１６２およびコントローラ１６４も示している。図１０Ａはさらに、透過光バイオディスクに関連する戻りビーム１５４および透過ビーム１５６を処理するために別法として実施されるプロセッサ１６６および分析器１６８も示している。透過光バイオディスクの場合、透過ビーム１５６が生物学的サンプルに関する情報を伝達する。この実施形態では、あらかじめ記録された情報がディスク上にある。検出器１５８がビームを収集する。
【００８８】
本発明の別の実施形態では、分割上部検出器を用いて透過ビーム１５６を収集する。図１０Ｂに、本発明の一実施形態による分割検出器を示す。検出器１７０は、２個の検出器コンポーネント１７２および１７４を有する。２個の検出器コンポーネントは、物体１８６（例えば細胞）で屈折した透過ビーム１５６を集め、２つの信号ＡおよびＢを生成する。物体１８６は、例えば赤血球や白血球等の生物細胞のような調査特徴物であり得る。一方の信号を他方から減算する（すなわちＡ−ＢまたはＢ−Ａ）ことによって差分信号を得ることができる。検出器コンポーネントが、入射ビーム１５２を散乱する物体を有する領域の上方にある時、それらは信号の変化を検出する。各検出器には、他方の検出器とは逆の変化が見える。すなわち、光が一方の検出器のほうへ曲がると、その検出器には信号が増大して見える一方、他方の検出器には信号が減少して見える。この性質のため、２つの検出器のそれぞれによって生成される信号の差である信号を生成することによって、信号対雑音比を大幅に増大させることができる。この差信号は２つの利点を有する。第１に、両方の検出器に等しく生じるシステム内の雑音（光学的または電気的）が、差信号では消去される。第２に、光を単に吸収するのではなく屈折するディスク上の対象物体により、差信号において大きく、容易に検出される変化が生じる。これは、対象物体によって生成された信号をバックグラウンド雑音から分離しなければならない分析作業の助けとなる。
【００８９】
分割検出器についてのさらに詳細な議論は、同一出願人の「Segmented Area Detector for BioDrive and Methods Relating Thereto」と題する２００２年２月１４日出願の米国仮特許出願第６０／３５５，０９０号、ならびに同一名称のそれぞれ２００１年１０月１０日、２００２年１月２８日、２００２年１月３０日、および２００２年２月７日出願の関連する仮出願第６０／３３５，１２３号、第６０／３５２，６４９号、第６０／３５３，７３９号、および第６０／３５５，０９０号に提示されており、これらはすべて参照により本明細書に援用される。本発明とともに使用可能な異なるタイプの検出器についてのさらに詳細な議論は、同一出願人の「Optical Disc Analysis System Including Related Methods for Biological and Medical Imaging」と題する２００２年１月１０日出願の米国特許出願第１０／０４３，６８８号に提示されており、これも参照により本明細書に援用される。
【００９０】
図１１〜図１６は、ディスクの光学的性質および検出器がディスクからの情報伝達ビームを収集するためにどのようにして使用されるかを説明するための、反射および透過の両方の実施形態の断面図を示している。
【００９１】
ここで特に図１１を参照すると、本発明による光バイオディスク１１０の反射ディスク実施形態の部分断面図が示されている。図１１は、基板１２０および反射層１４２を示している。上記のように、反射層１４２は、アルミニウム、金または他の好適な反射材料のような材料から形成することができる。この実施形態では、基板１２０の上面は滑らかである。図１１は、反射層１４２を覆う活性層１４４も示している。図１１に示されているように、ターゲットゾーン１４０が、所望の位置で反射層１４２の一領域すなわち一部を除去することによって、または別法として、反射層１４２を施す前に所望の領域をマスキングすることによって、形成される。さらに図１１に示すように、プラスチックチャネル部材１１８が活性層１４４を覆う。図１１は、キャップ部分１１６およびそれに関連する反射面１４６も示している。このように、キャップ部分１１６が、所望の切り抜き形状を含むプラスチックチャネル部材１１８に施されると、それによってフローチャネル１３０が形成される。図１１に示す矢印によって指示されているように、入射ビーム１５２の経路は最初はディスク１１０の下から基板１２０へ向かっている。次いで入射ビームは反射層１４２に近い点に集束する。この集束は、ターゲットゾーン１４０における反射層１４２の一部が存在しない場所で起こるので、入射は活性層１４４を通りフローチャネル１３０に入る経路に沿って続く。続いて入射ビーム１５２はフローチャネルを通って上方へ進み、最終的に反射面１４６に入射する。この点で、入射ビーム１５２は、入射経路に沿って逆戻りすなわち反射することにより、戻りビーム１５４を形成する。
【００９２】
図１２は、本発明によるバイオディスク１１０の透過実施形態の部分断面図である。図１２は、基板１２０上に透明なキャップ部分１１６および薄い半反射層１４３のある透過ディスクフォーマットを示している。図１２は、薄い半反射層１４３を覆う活性層１４４も示している。好ましい実施形態では、透過ディスクは、厚さ約１００〜３００オングストロームのアルミニウムまたは金のような金属からなる薄い半反射層１４３を有し、好ましくは４００オングストロームを超えない。この薄い半反射層１４３により、光源１５０（図１０Ａ）からの入射すなわち問合せビーム１５２の一部がディスクに侵入しそれを上方へ通り抜けて上部検出器１５８により検出されることができる一方、光の一部は入射ビームと同じであるが逆方向の経路に沿って反射される。この配置では、戻りすなわち反射ビーム１５４は半反射層１４３で反射される。このように、戻りビーム１５４はフローチャネル１３０に入らない。反射光すなわち戻りビーム１５４は、図１３および図１４に関連してさらに詳細に説明するように、半反射層１４３の中または上に形成されたあらかじめ記録された情報トラック上で入射ビーム１５２をトラッキングするために使用可能である。図１２に示すディスク実施形態では、画定したターゲットゾーン１４０があってもなくてもよい。ターゲットゾーン１４０が、基板１２０上の薄い半反射層１４３上に形成された直接マーキングにより作成されてもよい。これらのマーキングは、シルクスクリーン加工またはいかなる同等の方法を用いてなされてもよい。ターゲットゾーンを画定するためにいかなる物理的印も使用しない代替実施形態では、フローチャネル１３０は事実上、調査特徴物の検査が行われる限定されたターゲット領域として利用される。
【００９３】
図１３は、本発明によるバイオディスク１１０の反射ディスク実施形態のトラックを横切る断面図である。この図は、ディスクの半径およびフローチャネルに沿って縦断した図である。図１３は、基板１２０および反射層１４２を含む。この実施形態では、基板１２０は一連の溝１７０を含む。溝１７０は、ディスクの中心付近から外縁に向かって延びるらせんの形態である。溝１７０は、問合せビーム１５２がディスク上でらせん溝１７０に沿ってトラッキングすることができるように実施される。このタイプの溝１７０は「ウォブル溝」として知られている。波状すなわち波形の側壁を有する下部が溝１７０を形成する一方、隆起したすなわち高い部分が、らせんの隣接する溝１７０を分離する。この実施形態で溝１７０を覆う反射層１４２は、図示のように、本質的にコンフォーマルである。図１３は、反射層１４２を覆う活性層１４４も示している。図１３に示されているように、ターゲットゾーン１４０が、所望の位置で反射層１４２の一領域すなわち一部を除去することによって、または別法として、反射層１４２を施す前に所望の領域をマスキングすることによって、形成される。さらに図１３に示すように、プラスチック接着すなわちチャネル部材１１８が活性層１４４を覆う。図１３は、キャップ部分１１６およびそれに関連する反射面１４６も示している。このように、キャップ部分１１６が、所望の切り抜き形状を含むプラスチック接着部材１１８に施されると、それによってフローチャネル１３０が形成される。
【００９４】
図１４は、図１２に記載した本発明によるバイオディスク１１０の透過ディスク実施形態のトラックを横切る断面図である。この図は、ディスクの半径およびフローチャネルに沿って縦断した図である。図１４は、基板１２０および薄い半反射層１４３を示している。この薄い半反射層１４３により、光源１５０からの入射すなわち問合せビーム１５２がディスクに侵入しそれを通り抜けて上部検出器１５８により検出されることができる一方、光の一部は戻りビーム１５４の形式で反射される。薄い半反射層１４３の厚さは、ディスクリーダがそのトラッキング能力を維持するのに必要な反射光の最小量によって決定される。この実施形態における基板１２０は、図１３で説明したものと同様に、一連の溝１７０を含む。この実施形態における溝１７０もまた、好ましくは、ディスクの中心付近から外縁に向かって延びるらせんの形態である。溝１７０は、問合せビーム１５２がらせんに沿ってトラッキングすることができるように実施される。図１４は、薄い半反射層１４３を覆う活性層１４４も示している。さらに図１４に示すように、プラスチック接着すなわちチャネル部材１１８が活性層１４４を覆う。図１４は、反射面１４６なしのキャップ部分１１６も示している。このように、キャップが、所望の切り抜き形状を含むプラスチックチャネル部材１１８に施されると、それによってフローチャネル１３０が形成され、入射ビーム１５２の一部が実質的に反射されずにそれを通ることができる。
【００９５】
図１５は、反射ディスクの全厚およびその初期屈折特性を示す、図１１に類似の図である。図１６は、透過ディスクの全厚およびその初期屈折特性を示す、図１２に類似の図である。図１５および図１６では、断面が溝１７０に沿って切ってあるため、溝１７０は見えない。図１５および図１６は、これらの実施形態で溝１７０に垂直に位置する狭いフローチャネル１３０の存在を示している。図１３、図１４、図１５、および図１６は、それぞれの反射および透過ディスクの全厚を示している。これらの図で、入射ビーム１５２は最初に基板１２０と相互作用するように示されている。基板１２０は、図示のように入射ビームの経路を変える屈折特性を有し、反射層１４２または薄い半反射層１４３上でビーム１５２を集束させる。
【００９６】
Ｅ．アナログ−デジタル変換処理
反射ディスクの戻りビーム１５４または透過ディスクの透過ビーム１５６のいずれから得られるかを問わず、生体検査サンプルに関する情報は信号処理のためにプロセッサ１６６（図１０Ａ参照）に送られる。この処理は、下部検出器１５７（反射ディスク）または上部検出器１５８（透過ディスク）によって検出されたアナログ信号から離散デジタル形式への変換を含む。
【００９７】
図１７は、図１０Ｂに示した装置に関連する情報取り出しプロセスの概要フローチャートである。ステップ２７０で、実施形態が透過バイオディスクである場合、生物学的サンプルに関する情報を伝達する透過ビームが検出器１５８によって検出される。ステップ２７２で、実施形態が反射バイオディスクである場合、反射ビーム１５４が検出器１５７によって検出される。いずれの場合でも、ステップ２７４で、情報はアナログ−デジタル変換に送られる。ステップ２７６で、結果として得られるデジタルデータは配列である。
【００９８】
図１８に、プロセッサ１６６によって実行されるアナログ−デジタル変換を示す。変換は、一定時間間隔２１２でアナログ信号２１０をサンプリングすること、および、信号の対応する瞬間アナログ振幅２１４を離散２進整数２１６として符号化することを含む。サンプリングはある開始時刻２１８に開始され、ある終了時刻２２０に終了する。いかなるアナログ−デジタル変換プロセスにも関連する２つの一般的な値は、サンプリング周波数およびビット深度である。サンプリング周波数は、サンプリングレートとも呼ばれるが、単位時間当たりに取られるサンプルの数である。サンプリング周波数が高いほど、連続するサンプル間の時間間隔２１２は短くなり、その結果、もとのアナログ信号２１０と比べてデジタル信号２２２の忠実度が高くなる。ビット深度は、アナログ信号２１０のサンプリングされた振幅２１４を符号化するために各サンプル点で使用されるビット数である。ビット深度が大きいほど、２進整数２１６によるもとのアナログ振幅２１４の近似が良くなる。本発明の一実施形態では、サンプリングレートは８ＭＨｚ、ビット深度はサンプル当たり１２ビットであり、０〜４，０９５（０〜２ｎ−１、ここでｎはビット深度）の整数サンプル範囲が可能となる。
【００９９】
ビット深度およびサンプリング周波数の組合せは、他の実施形態では必要な特定の精度に対応するようにカスタマイズすることができる。例として、限定ではないが、一般に細胞より小さいビーズを計数する方法に関わる実施形態では、サンプリング周波数を高くするのが望ましいかもしれない。アナログ−デジタル変換中に、レーザー経路に沿ったそれぞれの連続するサンプル点２２４が連続的にディスク上に、またはメモリ内に一次元配列２２６として格納される。それぞれの連続するトラックが、独立の一次元配列を与える。すべての一次元配列が組み合わされて、一般的な画像表現に類似する２次元配列２２８（図２１Ｂに示す）を形成する。
【０１００】
ここで、バイオディスクからのデータ収集に関与する詳細をさらに説明するために、データ収集例を提供する。図１９は、本発明の光バイオディスク１１０の斜視図を示している。図１９は、光バイオディスクのトラック２３２を基準として配置されている捕捉された白血球２３０を示すために、指示部分の拡大詳細斜視図を含む。図示のように、入射ビーム１５２と白血球２３０との相互作用により、反射ディスクの戻りビーム１５４または透過ディスクの透過ビーム１５６のいずれかの形式で信号含有ビームが得られ、これが下部検出器１５７または上部検出器１５８のいずれかによって検出される。
【０１０１】
図２０Ａ、図２０Ｂおよび図２１Ａ〜図２１Ｄは、細胞がどのようにしてデジタルデータへと捕捉されるかを示している。他の検定法では、対象となる調査特徴物は、細胞の代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。図２０Ａは、光バイオディスク１１０のトラック２３２を基準として位置決めされている白血球２３０のグラフィカル表示である。細胞２３０は、図１９に示したディスクに類似のディスク上に配置される。図２０Ｂは、本発明による図２０Ａの白血球２３０から導出される一連のシグネチャトレースである。図２０Ｂは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤとラベル付けされた対応するトレースを示している。次に、アナログシグネチャトレース（信号）２１０は、対応するデジタル信号２２２に変換（図２１Ａ〜図２１Ｄに示す）するためにプロセッサ１６６に送られる。図２０Ｂはさらに、白血球２３０全体の走査が、検出され処理されることが可能な入射ビームの摂動２３１を生じることも明らかにしている。
【０１０２】
図２１は、図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ、および図２１Ｄの間の配置関係を示すグラフィカル表示であり、これらの図が全体として、図２０Ｂの４個のトレースＡ、Ｂ、ＣおよびＤがどのようにして単一の２次元デジタルデータ配列２２８に変換されるかを示している。
【０１０３】
ここで具体的に図２１Ａを参照すると、図２０Ａに示した光バイオディスクのトラックＡおよびＢからサンプリングされたアナログ信号２１０が示されている。プロセッサ１６６は、アナログ信号２１０の対応する瞬間アナログ振幅２１４を離散２進整数２１６（図１２）として符号化する。結果として得られる一連のデータ点は、サンプリングされたアナログ信号２１０に類似するデジタル信号２２２である。
【０１０４】
次に図２１Ｂに進むと、トラックＡおよびＢからのデジタル信号２２２（図２１Ａ）が、独立の一次元メモリ配列２２６として格納される。それぞれの連続するトラックが対応する一次元配列を与え、前の一次元配列と組み合わされると、デジタルデータの２次元配列２２８を生じる。次にデジタルデータは、サンプル領域内の特定の点における戻りビーム１５４または透過ビーム１５６（図１９）の相対強度を表すサンプル点２２４（図１８）の２次元配列２２８として、メモリ内またはディスク上に格納される。そして２次元配列は、生ファイル、データファイル、または画像ファイル２４０の形式でメモリ内またはディスク上に格納される。その後、ファイル２４０に格納されたデータは、メモリ２４２から取り出され、分析器１６８（図１０Ａ）へのデータ入力２４４として使用される。
【０１０５】
図２１Ｃは、図２０Ａに示した光バイオディスクのトラックＣおよびＤからサンプリングされたアナログ信号２１０を示している。プロセッサ１６６は、アナログ信号２１０の対応する瞬間アナログ振幅２１４を離散２進整数２１６（図１８）として符号化する。結果として得られる一連のデータ点は、サンプリングされたアナログ信号２１０に類似するデジタル信号２２２である。
【０１０６】
次に図２１Ｄを参照すると、トラックＣおよびＤからのデジタル信号２２２（図２１Ｃ）が、独立の一次元メモリ配列２２６として格納される。それぞれの連続するトラックが対応する一次元配列を与え、前の一次元配列と組み合わされると、画像に類似する２次元配列２２８（図２１Ｂ）を生じる。次に、上記と同様、デジタルデータは、サンプル領域内の特定の点における戻りビーム１５４または透過ビーム１５６（図１９）の相対強度を表すサンプル点２２４（図１８）の２次元配列２２８として、メモリ内またはディスク上に格納される。そして２次元配列は、生ファイル、データファイル、または画像ファイル２４０の形式でメモリ内またはディスク上に格納される。その後、ファイル２４０に格納されたデータは、メモリ２４２から取り出され、分析器１６８（図１０Ａ）へのデータ入力２４４として使用される。
【０１０７】
光バイオディスクからデータを捕捉し、このデータを整数の２次元配列に変換するさらなる方法およびアルゴリズムは、一般的適用可能性を有し、同一譲受人に譲渡された「Variable Sampling Control for Rendering Pixelation of Analysis Results in Optical Bio-Disc Assembly and Apparatus Relating Thereto」と題する２００１年５月１６日出願の米国仮出願第６０／２９１，２３３号（これは参照により本明細書に援用される）に開示されている。
【０１０８】
本発明の別の実施形態は、調査データをアーカイブに格納する。アーカイブは、調査データを登録することができる場所を提供する。その後、さまざまな母集団グループの健康動向研究を行うために、データのグループを分析することができる。例えば、調査データと患者情報との相関をとり、患者の属性によって分類され得る調査データのカタログを作成することができる。例えば年齢、性別、人種、および血液型のような情報を用いて調査データを分類することができる。アーカイブは、検索可能な関係データベースの機能を利用することができる。このようなアーカイブが構築された後、あるカテゴリの調査データについて分析を行うことができる。例えば、ある都市の患者から提供されたサンプルから抽出された調査データを検索し、これらの調査データを分析することによって、母集団健康動向研究を行うことができる。利益として、母集団の人々自身の参加がなくても研究を実行することができる。長期にわたり歴史的アーカイブを構築することが可能であり、長期間にわたり特定の母集団について研究を行い、長期動向を分析することができる。
【０１０９】
ＩＩ．データ分析
以下のセクションは、本発明のデータ分析態様に関する。これらは、具体的には図２２〜図７１Ｄに関連して議論され、一般的には前の図１〜図２１を参照する。
【０１１０】
Ａ．データの収集および処理
一実施形態では、デジタルデータの配列の形式で格納されているバイオディスクからの調査データが、細胞計数のために分析される。別の実施形態では、他の形式の調査データが分析のために使用される。他の検定法では、調査データは、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターを計数するための情報を含んでもよい。本発明の一実施形態は、調査データをリアルタイムでデータ分析器へ送る。別の実施形態では、調査データは格納され、後で分析のために取り出される。両方の実施形態で、本発明の計算および処理アルゴリズムは分析器１６８（図１０Ａ）に格納され、入力調査データ２４４に適用されて、ディスプレイモニタ１１４（図１０Ａ）に表示され得る有益な出力結果２６２（図２２）を生成する。例として、限定ではないが、以下では、デジタルデータ配列の形式の調査データに対する分析方法を説明する。本開示を考慮して、当業者は、本発明の方法がデジタルデータ配列のフォーマット以外のさまざまな形式の調査データに適用可能であることを認識するであろう。
【０１１１】
ここで図２２に進むと、本発明の処理方法および計算アルゴリズムによるデータ分析のステップの全般的概観を提示するフローチャートが示されている。本処理方法の第１ステップは、入力調査データ２４４を受け取ることに関わる。上記のように、データ分析は、０〜４，０９５の範囲内の整数の２次元配列から開始される。次のステップ２４６は、計数のためにディスクの評価矩形を選択することである。この矩形が画定された後、目的は、矩形内部に含まれる全白血球の実際の計数を行うことが目的となる。この領域を「調査データ領域」という。ステップ２４６の実施態様は、ディスクの構成に左右される。２つの可能なディスク構成として、ウィンドウ付きディスクおよびウィンドウなしディスクがある。
【０１１２】
例として、限定ではないが、図２および図４に示したターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０のようなウィンドウ付きのディスクを用いた本発明の実施形態では、ソフトウェアがウィンドウを認識し、分析および計数のためにその一部をクロッピングする。図２に示したような好ましい一実施形態では、各ウィンドウ（すなわち捕捉ゾーン）は１×２ｍｍの矩形の形状であり、その両端に半円形部分を有する。この実施形態では、ソフトウェアは、それぞれのウィンドウ内の１×２ｍｍ領域の標準サイズの評価矩形をクロッピングする。この実施形態の一態様では、リーダが、数個の異なるウィンドウ内の細胞数を比較するために数個の連続するサンプル値を取ってもよい。
【０１１３】
図４に示したようなウィンドウなし透過ディスクを用いる本発明の実施形態では、ステップ２４６は、２つの異なる方法のうちの１つで実行される。標準矩形の位置が、固定座標を有する点を基準としてその中心を位置決めすること、または較正ドット（これは好ましくは、固有の特徴を有する濃い色素のスポットである）を見つけることのいずれかによって選択される。較正ドットを使用する場合、所望のコントラストを有する色素を、細胞の２つのクラスタに関してディスク上の特異的な位置に沈着させる。そして、光ディスクリーダが、一方の細胞クラスタの中心へスキップするように指示されてから、標準サイズ（１×２ｍｍ）の評価矩形が、選択されたクラスタを中心として位置決めされる。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。
【０１１４】
両方のタイプのディスクに対応する以外に、ステップ２４６は、ユーザの選択の余地も見込んでいる。ユーザは、細胞計数のために、マウス選択等による直接対話によって、矩形領域のような所望のサンプル領域形状を指定してもよい。ソフトウェアの本実施形態では、これは、マウスを用いて、モニタ１１４（図１）に表示されている調査データのグラフィカル表示の所望の部分の上をクリック・アンド・ドラッグすることを含む。評価領域選択方法の如何に関わらず、それぞれの矩形領域が次のステップ２４８で計数のために評価される。
【０１１５】
図２２における第３ステップはステップ２４８であり、これはバックグラウンド照度均一化に関する。このプロセスは、いくつかのハードウェア構成によって引き起こされる可能性のあるバックグラウンド一様性変動を補正する。バックグラウンド照度均一化は、バックグラウンド全体、または調査データのうち細胞でない部分が、任意のバックグラウンド値Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを有する平面に近づくように、各サンプル点の強度レベルをずらす。Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは、標準矩形サンプル領域にわたる平均値をとる等の多くの方法で決定することができるが、本実施形態ではＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは２，０００に設定される。選択された矩形サンプル領域の各点Ｐにおける値Ｖは、数（Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ＋（Ｖ−Ｐの近傍にわたる平均値））で置き換えられる。必要であれば、結果として得られるＶを、実際の可能な値の範囲（これは本発明の好ましい一実施形態では０〜４，０９５である）に合うように切り詰めてもよい。近傍矩形の寸法は、細胞のサイズより十分に大きく、標準矩形のサイズより十分小さくなるように選択される。他の検定法では、近傍矩形は、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターに合わせて選択される。
【０１１６】
図２２のフローチャートにおける次のステップは規格化ステップ２５０である。規格化ステップ２５０を実行する際に、標準矩形サンプル領域内のデータについて、平均が２，０００、標準偏差が６００となるように線形変換が実行される。必要であれば、値は、範囲０〜４，０９５に合うように切り詰められる。このステップ２５０は、バックグラウンド照度均一化ステップ２４８とともに、ソフトウェアがハードウェアの変更および調整から影響を受けにくいようにする。例として、限定ではないが、上部検出器１５８（図１３）のような検出回路における信号利得は、結果として得られる細胞計数に大幅に影響を及ぼさずに変更可能である。
【０１１７】
図２２に示すように、フィルタリングステップ２５２が次に実行される。標準矩形内の各点Ｐについて、Ｐの近傍（その寸法はステップ２４８で指示されるものより小さい）内の点で、その値がＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄとは十分に異なるものの個数を計算する。計算された点の個数は、調査データ内の細胞のサイズを近似するはずである。他の検定法では、計算される点の個数は、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーター等の対象物体を近似するはずである。求められた異なる点の個数が十分に大きい場合、Ｐにおける値はそのままにされるが、そうでない場合、その値にはＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄが割り当てられる。このフィルタリング操作は、雑音を除去するために実行され、最適な場合には、細胞のみが調査データにとどまる一方、バックグラウンドは一様にＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに等しくなる。
【０１１８】
図２２に示すように、不良なコンポーネントを除去するための任意のステップ２５４を実行してもよい。きず、泡、汚れ、およびその他の同様の不整部分のような欠陥がフィルタリングステップ２５２を通過するかもしれない。これらの欠陥は、直接的に、または調査データのヒストグラムにおける全体の分布に影響を及ぼすことによって間接的に、細胞計数エラーを引き起こし得る。このステップは、これらの欠陥が細胞に比べてサイズが十分に大きいという事実を利用して、適当なアルゴリズムを用いてそれらを除去する。他の検定法では、これは、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターのような他の調査特徴物に容易に適用され得る。それらのサイズは、欠陥を除去するにはどうするのが最善かを判断する際に考慮される。任意ステップ２５４の後、好ましくは、ステップ２４８、２５０、および２５２が繰り返される。
【０１１９】
図２２に示す次の処理ステップはステップ２５６であり、輝中心によって細胞を計数することに関する。計数ステップ２５６はいくつかのサブステップからなる。それらは（１）畳込みを用いることであって細胞の中心をより良く見えるようにする、畳み込みを用いること、（２）これらの中心をマーキングすること、および（３）細胞の実際の計数を実行すること、に関する。ハードウェア構成によっては、一部の細胞は輝中心がないように見えるかもしれない。このような場合、暗縁のみが見えるので、以下の２つの任意ステップ２５８および２６０が有益である。
【０１２０】
ステップ２５８は、見つかった細胞を画像から除去することに関する。ステップ２５８で、見つかった各細胞の中心の周りの円形領域を値２，０００（バックグラウンドデフォルト）で満たし、輝中心および暗縁の両方を有する細胞が２度見つからないようにする。ステップ２６０は、暗縁を認識することによりさらなる細胞を計数することに関する。ステップ２５８の後、調査データに対して２つの変換が実行される。その目標は、暗縁をよりはっきりさせ、ステップ２５６で輝中心法によって計数されなかった細胞を計数できるようにすることである。別の実施形態では、輝中心によって細胞を計数する方法の代わりに、暗縁によって細胞を計数する方法を使用することができる。
【０１２１】
計数ステップ２５６の後、または計数ステップ２６０が任意に使用された場合にはその後、図２２に示す最終ステップは、結果出力ステップ２６２である。標準矩形内に見つかった細胞の数が図１に示したモニタ１１４に表示される。同定された各細胞は、表示されている光バイオディスクから導出された調査データ上で十字印を用いてマーキングされる。
【０１２２】
図２２に示した各ステップのさらに詳細な説明は、サブステップを詳細に記載した対応するブロック図とともに、以下で与えられる。
【０１２３】
ステップ１：データ入力
ステップ２４４は、０から４，０９５までの範囲の２次元配列に格納されているデータを取り出す。黒セグメントは定数値０で埋められる一方、光が検出された領域は１から４，０９５までの範囲にある。結果のデータ評価において、０は無視される。
【０１２４】
ステップ２ａ：ウィンドウ付きディスクにおける評価矩形の選択
図２３に、評価矩形を選択するプロセス（図２２のステップ２４６）の詳細を示す。ステップ３００で、選択のタイプを判断する。第１の選択肢３０２は、図２および図４に示したターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０のような物理的に埋め込まれたウィンドウを有するバイオディスクから評価矩形を選択することを含む。図２４に、本発明の一実施形態によるソフトウェアによって表示された、ウィンドウ３２６および３２８を有するディスクの調査データ例のグラフィカル表示を示す。
【０１２５】
一実施形態によるステップ３０４の詳細なプロセスを図２５に示す。ステップ３３０（図２５）で、調査データ配列を、ｎ行につき１行およびｎ列につき１列が考慮されるように圧縮する。次にステップ３３２で、圧縮された調査データを１行ずつ走査して、２値化ステップで使用されることになるしきい値を決定する。図２６は、説明のための一例を提供している。例示的行３４２で、各セルは調査データ上の点を表し、各セル内の値はその点で検出された光強度を表す。走査は、調査データ配列の各行について長さＬのすべての可能なセグメントを選択することによって開始される。そこで図２６は、調査データ配列からのこの例示的行についての長さＬのすべての可能なセグメントを示している。実際の配列は多くのこのような例示的行を有するであろう。Ｌは、ディスク上のウィンドウの幅よりわずかに小さく選択される。次に、各セグメントについて、当該セグメント内のすべての整数値を用いて平均値を計算する。セグメントは行に沿って「スライド」されるので、このプロセスは「スライド平均」を求めると呼ばれる。すべての行の長さＬの全セグメントについて平均を求めた後、平均の最小および最大を求める。しきい値Ｔを、（ｍｉｎ（平均）＋ｍａｘ（平均））／２として計算する。このプロセスは、検索ウィンドウを、ウィンドウ領域を覆うセグメントに狭める。ウィンドウ領域は非ウィンドウ領域より明るいので、これらのセグメントの平均はしきい値Ｔより高くなり、後のステップで、より容易に同定することができる。
【０１２６】
一実施形態は、以下のようにして、セグメントＬの平均値の計算を加速する。セグメントｎ内のＫ＋１からＫ＋Ｌまでのすべての値の和ａ（ｎ）を計算する場合（Ｋ＋１はセグメントの開始点である）、ａ（Ｋ＋Ｌ）を和ａ（ｎ）に加算し、ａ（Ｋ）を和ａ（ｎ）から減算する。これをＫのすべての値について繰り返す。これにより、アルゴリズムは、セグメントが行を１ユニット移動するたびにセグメントのすべての値の和を初めから足し上げずに済む。しきい値を求めるこのプロセス全体を、すべての行がこのように走査されるまで各行について繰り返す。
【０１２７】
図２５に戻って、ステップ３３４で２値化を実行する。このステップで、しきい値Ｔを超える値を有する点が黒と宣言される一方、残りは白と宣言される。これで、調査データは、白黒画像であるかのように扱うことができる。２値化の後、ステップ３３６で、調査データに対して規格化を実行する。規格化は、侵食および膨張という２つのステップからなる。侵食は以下のように実行される。画像Ｐに対して、対応する画像Ｐ’を構成する。Ｐ’内の点Ｘ’は、（１）Ｐ内の対応する点Ｘが白である場合、または（２）Ｘのいずれかの隣接点が白である場合、に白と宣言される。いずれの条件も満たされない場合、Ｘ’は黒と宣言される。Ｐ’は、侵食の結果得られる画像である。膨張は逆の形で作用する。画像Ｒに対して、対応する画像Ｒ’を構成する。Ｒ’内の点Ｙ’は、（１）Ｒ内の対応する点Ｙが黒である場合、または（２）Ｙのいずれかの隣接点が黒である場合、に黒と宣言される。いずれの条件も満たされない場合、Ｙ’は白と宣言される。Ｒ’は、膨張の結果得られる画像である。数回の侵食および膨張の合成によって、２値画像はより規則的になる（単一の黒点および単一の白点が消失する）。
【０１２８】
規格化を実行した後、結果として得られる調査データを、連結コンポーネントの抽出を行うステップ３３８に渡す。このステップで、調査データは、連結コンポーネントが画定されるように走査される。調査データ内の所与の黒点の対に対して、その対は、その２点の間を黒点の連鎖によって連結することができる場合に同一コンポーネントに属すると定義される。このステップの主な目的は、調査データを、白い空間で互いに分離された連結した黒コンポーネントの集まりに分解することである。
【０１２９】
図２７に、連結コンポーネントの抽出におけるサブステップを示す。第１ステップ３５０は、初期コンポーネント番号を割り当てることを含む。調査データは、走査中に遭遇した最初の黒点に「０」を割り当て、次に「１」を割り当て、というように走査される。白点にはすべて「−１」を割り当てる。ステップ３５２で、初期走査方向が設定される。次の４つの方向がある：
（１）「＋＋」は、上から下、左から右を表す。
（２）「＋−」は、上から下、右から左を表す。
（３）「−＋」は、下から上、左から右を表す。
（４）「−−」は、下から上、右から左を表す。
最初に、走査方向は「＋＋」に設定される。これは、上から下、左から右を意味する。ステップ３５４で、調査データを以下のように走査する。黒点Ｐについて、その隣接黒点Ｐ’の（ステップ３５０で割り当てられた）割当て番号がＰの割当て番号より小さいようなあらゆる黒点Ｐが、Ｐ’の割当て番号をとる。例えば、Ｐの番号が７であり、その隣接点Ｐ’に番号６を有するものがある場合、Ｐの新たな番号は６である。
【０１３０】
次に、変更判断ステップ３５６に進む。アルゴリズムは、ステップ３５４で調査データ内のいずれかの黒点に新しい番号が割り当てられたかどうかをチェックする。その通りである場合、ステップ３５８で、走査方向が変更される。方向の変更は以下のルールに従う：
（１）現在の方向が「＋＋」である場合、新しい方向は「＋−」である。
（２）現在の方向が「＋−」である場合、新しい方向は「−＋」である。
（３）現在の方向が「−＋」である場合、新しい方向は「−−」である。
（４）現在の方向が「−−」である場合、新しい方向は「＋＋」である。
ステップ３５４で、新しい方向を用いて走査が再び開始される。このサイクルは、コンポーネント番号の変化を検出せずに走査を完了することができるまで継続する。コンポーネント番号変化時に走査方向を変えることにより、プロセスに必要な走査パス数が少なくなる。
【０１３１】
ステップ３５６の後、連結コンポーネント内のすべての点は同じ番号を有するはずである。ステップ３６０で、コンポーネント内の点の番号を再割当てする。このステップが必要であるのは、いくつかの番号が消失しているかもしれないからである。例えば、初期調査データ中に２０個の黒点があった場合、各点は０から１９までの番号を取っていたであろう。走査後に５個のコンポーネントがあることが分かった場合、２０個の初期番号のうちの５個は消失しているであろう。これにより、例えば番号１、４、９、１６、および１８を有する５個のコンポーネント内の黒点が残る。再付番(re-enumeration)ステップは、これらの５個のコンポーネント内の点に０から４までの番号を再割当てする。一般に、調査データ内にＮ個のコンポーネントがある場合、０からＮ−１までの付番が行われる。これにより、連結コンポーネント抽出のプロセスが完了する。
【０１３２】
図２５に戻って、連結コンポーネントの抽出（ステップ３３８）の後、ウィンドウ内に入るコンポーネントを見つけるステップ（ステップ３４０）に進む。ある一定の論理的制限を満たす最大の黒コンポーネントが選択される。論理的制限としては、ディスク上に存在し得るウィンドウ数およびウィンドウ間の近似的距離がある。これにより、ウィンドウを見つけるプロセスが完了し、（図２３における）矩形選択の全プロセスは、次のステップであるウィンドウ内で標準矩形をクロッピングするステップ（ステップ３０６）に移る。
【０１３３】
（１）最大合計照度を有し、（２）ウィンドウに対応するコンポーネントの点の１つを中心とする、標準矩形を見つけるために、このコンポーネントを含む領域を以下のように走査する。まず、アルゴリズムは水平方向に走査を行い、図２６に示したようなスライド平均を計算する。次にアルゴリズムは垂直方向に走査を行いスライド平均を計算する。これは、調査データ配列内のいくつかの行にわたり垂直に連なるセグメントを作成することを含む。セグメントは、ウィンドウの高さにほぼ等しい長さを有するであろう。水平スライド平均および垂直スライド平均のうちの最大平均の交点を、評価矩形の中心と宣言する。この点は、ウィンドウ内の最も明るいスポットであるので、最大値を有する。その点が評価矩形の中心として選択される。中心を画定した後、ステップ３１２で、中心点から測ることによって、１×２ｍｍ（標準サイズ）の評価矩形を作成する。図２８に、本発明の一実施形態によるソフトウェアディスプレイ上で、ウィンドウを見つけた後の評価矩形のクロッピングの結果を示す。
【０１３４】
中心点を見つける他の技法としては、エッジ追跡を用いてウィンドウを見つける技法、ウィンドウの（点の値を用いた）重心を見つける技法、および調査データを表す画像を調べることによって手動で点を選択する技法がある。
【０１３５】
ステップ２ｂ：ウィンドウなしディスクにおける評価矩形の選択
評価矩形を選択する際の第２の選択肢は、図２３のウィンドウなしバイオディスクのステップ３０８の場合である。一実施形態は、評価矩形のための所望の位置を見つけるために、ディスク上のダークスポットを使用する。アルゴリズムはステップ３１０（図２３）から開始され、ディスク上のサンプルのさまざまな領域をインデックス付けするためのインデックスマーカーとして働くダークスポットを見つける。ダークスポットは、図２６に関連して説明したウィンドウを見つける際に使用されるスライド平均を用いたプロセスと同様に見つけることができる。今度はターゲットが（ウィンドウではなく）はるかに小さいダークスポットであるので、ダークスポットを見つける際に使用されるセグメントははるかに短い。それらの長さはダークスポットのサイズにほぼ等しい。しかし、スライド平均を求める動作原理は同じままである。最小のスライド平均を有するセグメントがダークスポットとして同定される。
【０１３６】
図２９に、ダークスポット３６６の一例を示す。ステップ３１２（図２３）で、ダークスポットが見つかった後、アルゴリズムは、ダークスポットからシフトして評価矩形を作成する。標準サイズの評価矩形をクロッピングする。ここで矩形の中心は、見つかったダークスポットから所定距離シフトすることによって見出される点に位置する。図３０に、見つかったダークスポット３６６から所定距離シフトした後にクロッピングされた評価矩形３６８の一例を示す。破線の楕円３６８、３７０、および３７２は、他の細胞領域を同定している。本発明の好ましい一実施形態では、評価矩形の位置情報をディスクに埋め込むことができる。ダークスポットを見つける代わりに、システムはディスクから位置情報を読み出し、評価矩形を配置するための領域を見つけることができる。
【０１３７】
ステップ２ｃ：ユーザ選択オプションを含む評価矩形の選択
最後に、評価矩形の選択における第３の選択肢は、図２３のステップ３１６に示すように、ソフトウェアユーザインタフェースを通じてのユーザからの入力を含む。画面上に、調査データに基づいて作成されたバイオディスクの画像がユーザに対して示され、ユーザは画像上で矩形を画定することによって評価矩形を選択する。ステップ３１６で、ユーザが選択した矩形が標準サイズより大きいかどうかを判断する。大きくない場合、ユーザの矩形が標準サイズより小さいことを意味する（ステップ３１８、図２３）。この場合、ユーザが選択した矩形をステップ３２２での計数のために使用する。ユーザの矩形が標準サイズより大きい場合（ステップ３２０、図２３）、ステップ３２４で、ユーザが選択した矩形から標準サイズ評価矩形をクロッピングする。
【０１３８】
ステップ３：バックグラウンド照度均一化
図３１は、図２２のステップ２４８のさらに詳細な説明を与えている。評価矩形が選択された後、評価矩形を境界とする領域（「調査データ領域」という）でバックグラウンド照度均一化を実行する。このステップの主な目的は、バックグラウンド雑音を除去することにより、バックグラウンドをより一様にすることである。これを達成するため、バックグラウンド照度均一化は、ソフトウェアアルゴリズムを用いて、電気的実施態様における利得制御の効果をシミュレートする。
【０１３９】
図３１のステップ３８０で、（評価矩形内の）近傍矩形の標準サイズを選択する。なお、近傍矩形を評価矩形と混同しないように注意されたい。近傍矩形は、単一の評価点の周りにあるように形成される。そのサイズは、細胞よりは十分に大きいが、バックグラウンド照度の非一様性によって影響を受ける程度には小さいように選択される。他の検定法では、調査特徴物は、細胞である代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。したがって、近傍矩形のサイズは、行われる検定法のタイプに基づいて選択される。近傍矩形のサイズは、所与の点Ｐに対して、Ｐの近くのいくつの点がバックグラウンド照度均一化のプロセスのために評価されるかを決定する。
【０１４０】
ステップ３８２および３８４でそれぞれ垂直走査および水平走査を実行して、調査領域内の各点に対する平均Ｋを計算する。
【０１４１】
Ｋは以下のように導出される。まず、垂直走査を実行する。一実施形態では、調査データ領域内のすべての点に対する垂直平均をまず計算する。点（ｘ，ｙ）に対する垂直平均Ｋｖｅｒｔは、（ｘ，ｙ−ｄｙ）から（ｘ，ｙ＋ｄｙ）までの範囲内のすべての点の平均値である。結局、すべての列が垂直方向に走査される。項ｄｙは、ステップ３８０で決定したサイズを有する近傍矩形の高さの半分である。図２６で説明したスライド平均計算技法をここで適用する。ただし、今の場合以外、プロセスは垂直方向に進む。
【０１４２】
すべての点に対してＫｖｅｒｔが求められた後、水平走査を以下のように実行する。点（ｘ，ｙ）に対して、その点に対する最終平均Ｋは、（ｘ−ｄｘ，ｙ）から（ｘ＋ｄｘ，ｙ）までの範囲内の点に対するすべてのＫｖｅｒｔの平均を取ることによって与えられる。結局、行が水平方向に走査される。項ｄｘは、ステップ３８０で決定したサイズを有する近傍矩形の幅の半分である。全体の効果は、特定の点Ｐに対して、Ｐと同じ行にありＰの近傍矩形内にあるすべての事前に計算されたＫｖｅｒｔの値を平均してＰに対する最終平均を得ることである。Ｋｖｅｒｔの値の事前計算は計算時間を短縮する。計算時間は、調査データ領域内のサイズに近傍矩形のサイズを乗じたものに比例するのではなく、調査データ領域にのみ比例する。
【０１４３】
引き続き図３１を参照すると、ステップ３８６で、各点Ｐの値ＶをＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ＋（Ｖ−Ｋｎｅｉｇｈｂｏｒ）に再割当てすることによって均一化を実行する。ここでＫｎｅｉｇｈｂｏｒは、Ｐの近傍矩形の境界内のすべての点にわたる平均値である。一実施形態では、バックグラウンド値Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは、調査データ領域全体にわたる平均値であるように設定される。別の実施形態では、Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは２，０００に設定される。Ｐの新しい値が４，０００より大きい場合、４，０００が使用される。Ｐの新しい値が１より小さい場合、１が使用される。前に０であったＰの値は２，０００で置き換えられる。このステップの後、調査データのいかなる大きい領域内の平均値も約２，０００となる。すなわち、バックグラウンド全体が任意のバックグラウンド値Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを有する平面に近づく。図３２はバックグラウンド照度均一化前にソフトウェアによって表示された調査データを示し、図３３はバックグラウンド照度均一化後にソフトウェアによって表示される調査データを示している。画像化された調査データ５７２は、ある画像フォーマットでレンダリングされた調査データであるが、調査対象のデータを示している。図３２および図３３の両方において、画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞をマーキングし、またはそれに対応している。スライド平均を使用する代わりに、別の実施形態は、バックグラウンド照度均一化のステップでフーリエ変換（ＦＴ）を使用する。フーリエ変換を実行する際には、まず調査データを周波数領域に変換する。次に、周波数領域におけるスペクトルの一部を除去する。これは、バイオディスクおよび回路における電気的雑音およびその他の不整動作によって発生するバックグラウンド雑音の一部を除去する。一実施形態では、非常に短い、または非常に長い波長のスペクトルを除去する（周波数は波長分の１である）。これらの除去される波長のしきい値は実験的に決定される。最後に、逆変換を実行してデータを空間領域に戻す。
【０１４４】
ステップ４：規格化
図３４に、図２２のステップ２５０に関わるステップを詳細に示す。本明細書において上記の概要で述べたように、標準偏差の値を約６００に等しくし、調査データの平均の値を約２，０００に等しくするために、規格化が必要である。規格化はまた、ソフトウェアがハードウェアの変更および調整から影響を受けにくいようにする。例えば、図１０Ａの上部検出器１５８のような検出回路における信号利得は、結果として得られる細胞計数に実質的に影響を及ぼさずに変更可能である。
【０１４５】
これを達成するため、一実施形態では、ステップ３９０でプロセスが開始され、前のステップ（バックグラウンド照度均一化）の結果として得られた調査データに対する平均Ａおよび標準偏差Ｓの計算を行う。値が０の点は無視される。ステップ３９２（図３４）で、調査データ内の各点に対して規格化を以下のように実行する。一実施形態では、あらゆる点Ｐに対して、Ｐの値ｖを２，０００＋（ｖ−Ａ）×６００／（Ｓ）で置き換える。（ｖ−Ａ）のコンポーネントは各点を中心に移す一方、コンポーネント（６００／Ｓ）は振幅を調節する。その結果をバックグラウンド値２，０００に加算する。６００という値は、所望の振幅範囲を得るように調節することができる。図３６の値グラフ４００に、規格化後のグラフの一例を示す。なお、値グラフは２，０００前後を推移し、変動の振幅は６００付近にとどまっていることに留意されたい。
【０１４６】
Ｐの値が規格化された後、以下のように切り詰め（ステップ３９４）を実行する。１）Ｐの新しい値が４，０００を超える場合、値を４，０００に切り詰める。２）Ｐの新しい値が１を下回る場合、値を１に切り詰める。
【０１４７】
一実施形態では、ソフトウェアのグラフィカルユーザインタフェースが、調査データ内のすべての点のヒストグラムを表示して、ユーザに規格化のプロセスを見せる。図３５に、規格化ステップ中にソフトウェアによって表示される調査データ例の一部を示す。画像化された調査データ５７２は調査対象のデータを示している。図３５で、画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞を表し、またはそれに対応している。入力ボックスは、規格化の範囲を尋ねている。表示されているように、１〜４，０００の値が使用されている。所望に応じていかなる値範囲も使用可能であることは理解されよう。
【０１４８】
図３６に、規格化ステップ後のソフトウェアディスプレイを示す。上側ウィンドウ３９６は調査データ例の一部の拡大図を示している。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞を表している。下側グラフ４００は、ウィンドウ３９６内の水平点線３９８によってたどられる点の対応する値を示している。下側グラフ４００は、調査データのバックグラウンド領域が規格化されている（すなわち、小さい雑音を伴う定常値）一方、細胞の領域はグラフ内で顕著な「スパイク」を有することを示している。例えば、下側グラフ４００において、スパイク信号４０２はその特定位置における特異的な細胞例４０４に対応する。スパイク信号４０２は、バックグラウンド雑音４０６とは明瞭に異なる。これが細胞認識のプロセスを容易にする。
【０１４９】
ステップ５：フィルタリング
図３７に、図２２のステップ２５２に関わるステップを詳細に示す。図３７のステップ４１０で、近傍矩形のサイズを選択する。これらの近傍矩形は、概念的には、バックグラウンド照度均一化のステップ（図２２のステップ２４８）で使用されるものと類似している。しかし、このステップで使用される近傍矩形はおよそ細胞のサイズであり、バックグラウンド照度均一化で使用されるものより小さい。ステップ４１２で、調査データ領域内の各点Ｐに対して、Ｐの近傍内でＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄとは「十分に異なる」値を有する点の個数を計算する。一実施形態では、Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄの値は２，０００に設定される。（当該点とＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄとの間の）どの程度の差が「十分に異なる」かの判断はしきい値数によって定義される。一実施形態では、しきい値数は、調査データの信号パターンを調べてバックグラウンド値と細胞（またはサンプル中の他の対象物体）の値との間の差を記録することによって決定される。他の検定法では、調査特徴物は、細胞である代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。他の実施形態では、しきい値数は、変動する条件に基づいてバックグラウンド雑音およびバックグラウンド値を決定する較正機構によって生成される。このような条件には、バイオディスクの反射率、バイオディスクドライブ内でのバイオディスクのアンバランス、バイオディスクのガタつき、振動または不安定性、電気的雑音、バイオディスクのメタライゼーション、関与するサンプルのタイプ（白血球かそれ以外か）、および較正調節による補償や補正を必要とするいかなる他の条件も含まれる。
【０１５０】
ステップ４１４で、「十分に異なる」点の個数について、当該個数が所定のフィルタリング基準より大きいかどうかをテストする。大きい場合、Ｐの値はステップ４１６の時のままとする。そうでない場合、ステップ４１８で、Ｐの値はＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ（または２，０００）に変更される。このステップの所望される効果は、雑音を除去して、細胞のみが調査データに残り、バックグラウンドが一様にＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに等しくなるようにすることである。図３８に、フィルタリングステップ後にソフトウェアによって表示される調査データ例を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞をマーキング、すなわち示している。なお、バックグラウンドが調査データ内の細胞と良好なコントラストを有することに留意されたい。図３９は、図３９の調査データの一部の拡大図を提供している。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞をマーキングし、またはそれに対応している。図３９の下側グラフ４２０によって示されているように、バックグラウンドがここでは水平線値を有し、細胞の領域がスパイク４２２によって明確に画定されている。向上したコントラストは、次のステップにおける細胞計数に役立つ。
【０１５１】
ステップ５ａ：不要コンポーネントの除去
図４０に、図２２のステップ２５４に関わるステップを詳細に示す。これは、細胞計数を妨害し得る空気泡、汚れ、およびクラックのような不要コンポーネントを除去するように設計された任意のステップである。ここで使用されるプロセスは、図２５に関連して説明したウィンドウを見つける際に使用されるプロセスに類似している。ステップ４２８（図４０）で、しきい値Ｔを選択する。一実施形態では、Ｔはバックグラウンド照度均一化のステップで求められるＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに設定される。次にステップ４３０で、２値化を実行する。ウィンドウを見つける際に使用される２値化ステップ（図２５のステップ３３４）と同様、ステップ４３０で、しきい値Ｔを超える値を有する点が黒と宣言される一方、残りは白と宣言される。これで調査データは白黒画像とみなすことができ、１ビットで表すことができる。ステップ４３２で、図２５のステップ３３６と同様にして、調査データに対して規格化を実行する。
【０１５２】
規格化を実行した後、結果として得られる調査データを、連結コンポーネントの抽出を行うステップ４３４に渡す。このステップで、調査データは、連結コンポーネントが画定されるように走査される。調査データ内の所与の黒点の対に対して、その対は、その２点の間を黒点の連鎖によって連結することができる場合に同一コンポーネントに属すると定義される。このステップの主な目的は、調査データを、白い空間で互いに分離された連結した黒コンポーネントの集まりに分解することである。ここで使用される連結コンポーネント抽出プロセスは、図２７で詳細に示したものと同一であってもよい。
【０１５３】
この除去プロセスにおける次のステップはステップ４３６であり、不整サイズのコンポーネントを除去することに関する。ユーザが選択したサイズしきい値をすべての連結コンポーネントに適用する。コンポーネントがサイズしきい値より小さいか、または大きい場合、そのコンポーネント全体が調査データから除去される。この手法が有効であるのは、不整コンポーネント（例えば泡、クラック）のサイズが通常、典型的な細胞サイズよりはるかに大きいからである。また、ユーザは、いかなるタイプの細胞が計数されるかに応じてしきい値を選択することができる。一実施形態では、除去は、コンポーネントのすべての点を一定値２，０００（バックグラウンド値）で置き換えることによって達成される。好ましくは、図４０の全ステップの完了時に、調査データは再処理のためにステップ２４８〜ステップ２５２（図２２）に戻されるべきである。
【０１５４】
図４１に、クラックの除去前の調査データの一例を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応している。図示のように、クラック５７４が領域全体にわたって分布している。図４２に、クラックの除去後の、図４１と同じ調査データを示す。画像化された調査データ５７２のうち、捕捉された細胞をマーキングしているもののみが残っている。
【０１５５】
ステップ６：輝中心による細胞計数
次に図４３を参照すると、図２２のステップ２５６に関わるステップが詳細に示されている。ステップ４４０（図４３）で、調査データに対して畳込みを実行する。畳込み中に、畳込み画像を表す補助配列が形成される。畳込み画像内の各点Ｐは、Ｐの円形近傍におけるフィルタリング後の調査データの積分の結果である。当業者には理解されるように、画像処理で使用される一般的な畳込み方法は２つの関数に関わる。２つの関数ｆ，ｇ：Ｒ２→Ｒの畳込みは次の関数である。
【０１５６】
【数１】
【０１５７】
より正確には、本発明の一実施形態では、積分される関数ｆは次の関数である。
ｆ（ｘ，ｙ）＝ｈ（ｘ，ｙ）−２，０００ ｈ（ｘ，ｙ）＞２，０００の場合、または
＝０ ｈ（ｘ，ｙ）≦２，０００の場合
ここで、ｈ（ｘ，ｙ）は前のステップでｘ，ｙにある点の値を記述する関数である。ｆ（ｘ，ｙ）が確定した後、円形近傍指標関数(indicator function)ｇとの畳込みを実行する。ここで：
ｇ（ｕ，ｖ）＝１ ｕ２＋ｖ２≦ｒ２の場合、または
＝０ その他の場合
であり、ｒは細胞の予想半径である。畳込み積分は次の通りである。
【０１５８】
【数２】
【０１５９】
積分は、次式で定義される円形近傍内にあるすべての格子点（ｕ，ｖ）におけるｆの値の和をとることで置き換えられる。
（ｕ−ｘ）２＋（ｖ−ｙ）２＜ｒ２
畳込み後、ステップ４４２（図４３）で、畳込み画像に対して局所最大値の探索を実行する。畳込みステップは、調査データ内の輝中心を局所最大値として目立たせ、より容易に認識されるようにする。整数値が使用されるので、丸めが冗長な局所最大値を生じることがある。これを補正するため、ステップ４４４で、同一閉近傍内にある冗長な局所最大値を除去する。次にステップ４４６で、残りのすべての局所最大値を細胞の中心と宣言する。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。局所最大値は、これらの検定法でターゲットとなるこれらの物体すなわち調査特徴物の中心を見つけるために使用される。本発明の他の実施形態では、計数方法は細胞凝集の効果を考慮する。互いに近い最大は自動的には無視されない。一実施形態では、付近にくぼみのある局所ピークが細胞の中心と宣言される。凝集した細胞が調査データに現れる場合に、冗長な局所最大値を定義する距離しきい値がより小さく調節されるように、パラメータを調節することができる。同様に、計数される細胞のタイプに応じて距離しきい値を調節することができる。例えば、赤血球はより一貫性のあるサイズを有するので、仮定される細胞サイズを距離しきい値とすることができる。
【０１６０】
別の実施形態では、細胞の分布に対して統計分析を実行することができる。この場合、視認性が低かったり細胞が凝集していたりして他の方法では計数できない領域で細胞数を推定するために、面積当たりの平均細胞数を使用することができる。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。別の実施形態では、ユーザがより高い解像度で調査データ領域を再サンプリングして、より完全で正確な計数を実行することができる。
【０１６１】
図４４に、輝中心法により計数された細胞で満たされている調査データ例を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞をマーキングしている。輝中心法で実行されるステップは、細胞がバックグラウンドの暗いコントラストに対して明るく見えるように細胞を強調するのに役立つ。ソフトウェアによって示されているように、細胞は個別にマーキングされ計数される。図４５は、図４４に示されている調査データの一部の拡大図および値トレースグラフを示している。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応している。
【０１６２】
ステップ７および８：暗縁による細胞マーキングおよび細胞の追加計数
ステップ７および８（図２２）は、細胞計数の精度を向上させるために実行可能な任意のステップである。図２２で、それらはステップ２５８および２６０として参照されている。これらの２つの任意ステップは、細胞に輝中心がないままとなり得るハードウェア構成の場合に細胞の過小計数を補正するために使用可能である。他の検定法では、本方法を細胞に適用する代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターに適用してもよい。別法として、これらの２つのステップは、輝中心を認識することによって細胞を計数する代わりに使用されてもよい。
【０１６３】
一部の細胞が輝中心を認識する方法によって計数されている場合、ステップ７を実行して、これらの計数された細胞をマーキングし、それらを調査データから除去する。次に、暗縁を有する細胞を認識することによる計数を行うことができる。図４６Ａに、図２２のステップ２６０（主要ステップ８）に関わるステップを詳細に示す。ステップ４５０で、調査データに対して反転を実行する。各点Ｐにおける値ｖを２，０００−ｖで置き換える。結果として得られる値が負の場合、それを０で置き換える。数式の形で反転を表すと、次のようになる。
ｈ（ｘ，ｙ）を前の調査データとすると、ｆ（ｘ，ｙ）を次のように作る。
ｆ（ｘ，ｙ）＝２，０００−ｈ（ｘ，ｙ） ｈ（ｘ，ｙ）＜２，０００の場合
＝０ その他の場合
これは、低いデータ値を有する暗縁が、畳込みを実行する時に高い値を有することを保証する。ステップ４５２で、シフトした円環との畳込みを実行する。当業者には理解されるように、画像処理で使用される一般的な畳込み方法は２つの関数に関わる。２つの関数ｆ，ｇ：Ｒ２→Ｒの畳込みは次の関数である。
【０１６４】
【数３】
【０１６５】
畳込みを数式の形で表すと、次のようになる。
【０１６６】
【数４】
【０１６７】
円形近傍指標関数ｇとの畳込みを実行する。ここで：
ｇ（ｕ，ｖ）＝１ ｕ２＋ｖ２≦ｒ２の場合、または
＝０ その他の場合
であり、ｒは細胞の予想半径である。この実施形態では、ｇは内側半径ｒ１および外側半径ｒ２を有する円環の指標関数であり、ｒ１およびｒ２はｒ、すなわち細胞の予想半径の限界である。これにより次式が得られる。
【０１６８】
【数５】
【０１６９】
積分は、円環内にあるすべての格子点（ｕ，ｖ）におけるｆの値の和をとることで置き換えられる。畳込みを４回実行するため、次の４つの関数をとる。
ｆ１（ｘ，ｙ）＝ｆ（ｘ＋ｈｘ，ｙ）
ｆ２（ｘ，ｙ）＝ｆ（ｘ−ｈｘ，ｙ）
ｆ３（ｘ，ｙ）＝ｆ（ｘ，ｙ＋ｈｙ）
ｆ４（ｘ，ｙ）＝ｆ（ｘ，ｙ−ｈｙ）
ここで、ｈｘおよびｈｙはｘおよびｙ方向の特定のシフトである。それらは細胞の推定サイズの半分に等しい。４つの関数は、内側半径ｒ１および外側半径ｒ２を有する円環の指標関数と畳込みを４回実行することを意味している。値ｒ１およびｒ２はそれぞれ、細胞の予想半径ｒの最小値および最大値の限界である。畳込みの４回のパスが、左、右、上、および下方向に距離ｒだけシフトした円環と実行される。図４６Ｂにこのような一例を示す。まず、細胞の暗縁の境界となる円環４５８を作成する。４個のシフトした畳込みが４個の円環を作り出す。ステップ４５４（図４６Ａ）で、４個のシフトの結果の和をとる。再び図４６Ｂに戻ると、和をとった円環が点４５７に局所最大値を作り出しているのが分かる。そこで、点４５７をこの細胞の局所最大値であると宣言し、計数する。なお、図４６Ｂは細胞に適用された一例であることに留意されたい。畳込み円環が細胞の暗縁の境界となっていない場所には、最大は存在しないであろう。このように、畳込みステップは、細胞の暗縁を強調することによって潜在的な細胞を見出す。ステップ４５６（図４６Ａ）で、計数ステップは畳込み後の調査データを調べ、局所最大値を計数する。
【０１７０】
図４７に、この方法により見つかった（計数された）細胞が十字印でマーキングされた調査データの画像を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応している。十字印５８０は計数された細胞をマーキングしている。
【０１７１】
別法として、畳込みステップは、次の形の式に従って実行することができる。
Ｆ（ｘ，ｙ）＝ｆ１（ｘ，ｙ）＋ｆ２（ｘ，ｙ）＋ｆ３（ｘ，ｙ）＋ｆ４（ｘ，ｙ） ｆ１、ｆ２、ｆ３、またはｆ４の少なくとも３個（または別法として、２個）が０より大きい場合、および
Ｆ（ｘ，ｙ）＝０ その他の場合
なお、この畳込みは、関数のうちの２個または３個が０より大きい場合に、円環をシフトせずに実行されることに留意されたい。畳込みステップに対する別の別法として、関数ｆとの畳込みをとるために、広く知られている平滑化関数を使用するものがある。この畳込みステップおよび輝中心を認識する際に使用されるものの両方に適用可能なさらにもう１つの別法では、異なる指標関数ｇが使用される。その特定の一実施形態では、ｇは、次の形のガウス関数：
【０１７２】
【数６】
【０１７３】
または、細胞の特徴を強調する目的で畳込みを実行するための他の好適な関数であり得る。
【０１７４】
ステップ９：データ出力
ステップ９で、適当なディスプレイ機構にデータを出力する。ソフトウェアの一実施形態は、評価矩形を境界とする調査データ領域に対する細胞計数の結果を表示するためのユーザインタフェースを有する。別の実施形態は、図４７に示されているように各細胞が十字印でマーキングされた調査データ領域の画像を表示する。
【０１７５】
Ｂ．赤血球の例
当業者には理解されるように、データ分析の種々のステップおよび方法を、種々のタイプの調査データを分析するために異なる形で組み合わせることができる。図４８は、調査データ内の赤血球を計数する一例を示すフローチャートを提供している。ステップ４６０で、しきい値を選択し、２値化を実行する。ここで、しきい値を超える値を有する点が黒と宣言される一方、残りは白と宣言される。この２値化のステップは、通常は細胞を表す高めの値の点と、通常はバックグラウンドまたはバックグラウンド雑音を表す低めの値の点とを分離する。
【０１７６】
図４９に、ステップ４６０が実行される前の調査データの画像表示を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応している。図５０に、２値化（ステップ４６０）の結果を示す。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングし、または示している。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は細胞を示している。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は細胞を表していないデータを示している。
【０１７７】
次にステップ４６２（図４８）で、規格化、侵食、および膨張を構成する２つの部分を実行して、細胞境界の欠損部分を塗りつぶす。ここでの目標は、個別の細胞を明確に区画する細胞境界を得ることである。図５１に、侵食および膨張（ステップ４６２）の結果を示す。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は細胞をマーキングしている。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は、細胞を表していないデータを示している。
【０１７８】
図４８のステップ４６４で、各細胞について１ピクセル幅細胞境界を抽出する。図５２に、１ピクセル幅境界を抽出（ステップ４６４、図４８）した結果を示す。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は、細胞をマーキングしている。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は細胞を表していないデータを示している。１ピクセル幅境界を抽出する際に、黒および白の両方の隣接点を有するすべての黒点はそれらの黒色を保持するように選択される。両方の色の隣接点を持たない黒点は白に変換される。これにより、数ピクセル幅の場所にある粗い境界ができる。次に、細線化プロセスを適用して、調査データ内の形状の輪郭に１ピクセルだけが残るまで境界の余分な点を除去する。細線化プロセスは、それぞれの黒領域の境界を区画するのが１ピクセル幅の線だけになるまで、境界から冗長な黒点を除去する。図５２に示すように、図５１には存在した、細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８が今度は存在しない。
【０１７９】
細線化プロセスは、まず粗い境界から出発する。粗い境界は、細胞の内側および外側の両方の隣接ピクセルを含むすべてのピクセルからなる。粗い境界の抽出後、データは次の３つのカテゴリからなる。
（１）細胞の内部のピクセル、
（２）細胞の境界を区画するピクセル、および
（３）細胞の外部にあるピクセル。
この３つは、次の３つの条件によって関連づけられている。
（Ａ）３つともすべて連結である、
（Ｂ）（１）は（２）によって（３）から切断されている、そして最後に、
（Ｃ）（２）の各点は（１）または（２）に隣接点を持つが、その両方には持たない。
次に、細線化プロセスは、（２）内のピクセルを１個ずつ調べる。（２）内のピクセルＰが（１）または（３）に隣接点を有する場合、Ｐの色を（例えば黒から白へ）付け替えて（２）から（１）または（３）に移しても条件（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）が保たれるかどうかのチェックを実行する。保たれる場合、色の付け替えを行う。この色の付け替えは、各細胞について１ピクセル幅の境界が得られるまで実行される。
【０１８０】
１ピクセル幅境界が抽出された後、１ピクセル幅境界によって画定される領域を黒点で塗りつぶす（ステップ４６６、図４８）。図５３に、ステップ４６６の結果を示す。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は細胞をマーキングしている。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は、例えば図５１に見られるように、細胞を表していないデータを示している。この白黒の点集合をマスクとして用いて、もとのデータ点を充填して黒点を置き換える。こうして、細胞領域が分離され、分析の準備が整うことになる。
【０１８１】
図５４に、もとのデータ点を充填した結果を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞をマーキングしている。この方法の利点は、細胞を精度良く抽出できることにある。この抽出により、ユーザは、細胞径を測定し、染色された細胞核の形態等の細胞内の他の特徴を調べることができる。このタイプの応用に関するさらなる詳細は、同一譲受人に譲渡された「Nuclear Morphology Based Identification and Quantification of White Blood Cell Types Using Optical Bio-Disc Systems」と題する２００２年９月６日出願の米国特許出願第１０／ｘｘｘ，ｘｘｘ号（これは参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０１８２】
画像化された細胞を調べることに加えて、ユーザは、本発明のユーザ機能を使用することにより細胞をマーキングし計数することができる。図５５は、図４９〜図５４の調査データのもとの画像表示の拡大図であり、赤血球が十字印でマーキングされ、それらが計数されたことを示している。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応している。十字印５８０は計数された細胞をマーキングしている。
【０１８３】
Ｃ．代替アルゴリズム
本発明は、細胞計数の作業中に生じ得る特殊な状況を扱うためのいくつかの代替アルゴリズムを含む。
【０１８４】
図５６Ａ〜図６４は、明瞭な輝中心または暗縁のない細胞を計数する場合を扱う本発明の一実施形態を示している。この方法は「絶対値計数」と呼ばれ、細胞に明瞭な輝中心または暗縁がないように見える場合を主として扱う。輝中心法は、調査データ内の高い値の領域（ブライトスポット）を分離して細胞を計数することに基づいている。暗縁法は、調査データ内の低い値の領域（ジムスポット）を分離して細胞を計数することに基づいている。これに対して、この絶対値計数法は、前の２つの方法のいずれかによって検出可能な明瞭に高いまたは低い値を有していないかもしれないが、それにも関わらずバックグラウンド雑音から識別可能な値パターンを含むような領域を分離する。
【０１８５】
図５６Ａは、絶対値計数法によって十字印でマーキングされる前のばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞を表している。図５６Ｂは、絶対値計数に関わるステップを示すフローチャートである。ステップ４８０で、調査データに対して規格化およびフィルタリングを実行する。図５７は、規格化およびフィルタリングのステップ（ステップ４８０、図５６Ｂ）の後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応している。規格化およびフィルタリングのプロセスは、本明細書において上記で説明したものと同じプロセスである。
【０１８６】
規格化およびフィルタリングの後、次のステップはバックグラウンド除去および２値化（ステップ４８２、図５６Ｂ）に関わる。図５８は、バックグラウンド除去および２値化のステップの後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は細胞を示している。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は、細胞を表していないデータを示している。バックグラウンドは除去され、細胞が位置する場所が分離されている。次に、調査データに対して２値化を実行し、調査データ内の白黒の点を生成する。２値化のプロセスは以下のように進行する。まず、各点の値を調べる。点の値とバックグラウンド値との差が所定しきい値数より大きい場合、その点を黒と宣言する。そうでない場合、その点を白と宣言する。一実施形態では、しきい値数は、バックグラウンド値とはほとんど異ならない点（バックグラウンドまたはバックグラウンド雑音）が白となり、バックグラウンド値とは大きく異なる点（細胞の暗または明領域）が黒となるように選択される。他の実施形態では、しきい値数は、変動する条件に基づいてバックグラウンド雑音およびバックグラウンド値を決定する較正機構によって生成される。このような条件には、バイオディスクの反射率、バイオディスクドライブ内でのバイオディスクのアンバランス、バイオディスクのガタつき、振動または不安定性、電気的雑音、バイオディスクのメタライゼーション、関与するサンプルのタイプ（白血球かそれ以外か）、および補償や補正を必要とするいかなる他のタイプの条件も含まれる。
【０１８７】
規格化（ステップ４８４、図５６Ｂ）がプロセスにおける次のステップである。図５９は、規格化のステップの後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は、細胞を表している。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は細胞を表していないデータを示している。規格化は、侵食および膨張からなる。侵食は以下のように実行される。画像Ｐに対して、対応する画像Ｐ’を構成する。Ｐ’内の点Ｘ’は、（１）Ｐ内の対応する点Ｘが白である場合、または（２）Ｘのいずれかの隣接点が白である場合、に白と宣言される。いずれの条件も満たされない場合、Ｘ’は黒と宣言される。Ｐ’は、侵食の結果得られる画像である。膨張は逆の形で作用する。画像Ｒに対して、対応する画像Ｒ’を構成する。Ｒ’内の点Ｙ’は、（１）Ｒ内の対応する点Ｙが黒である場合、または（２）Ｙのいずれかの隣接点が黒である場合、に黒と宣言される。いずれの条件も満たされない場合、Ｙ’は白と宣言される。Ｒ’は、膨張の結果得られる画像である。数回の侵食および膨張の合成によって、２値画像はより規則的になる（単一の黒点および単一の白点が消失する）。
【０１８８】
１ピクセル幅境界抽出が次のステップである。この抽出ステップは、図５６Ｂではステップ４８６として参照されている。図６０は、１ピクセル幅境界抽出のステップ４８６を適用した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の一部の画像スクリーンショットである。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は、細胞に対応している。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は細胞を表していないデータを示している。１ピクセル幅境界を抽出する際に、黒および白の両方の隣接点を有するすべての黒点はそれらの黒色を保持するように選択される。両方の色の隣接点を持たない黒点は白に変換される。これにより、数ピクセル幅の場所にある粗い境界ができる。次に、細線化プロセスを適用して、調査データ内の形状の輪郭に１ピクセルだけが残るまで境界の余分な点を除去する。細線化プロセスは、それぞれの黒領域の境界を区画するのが１ピクセル幅の線だけになるまで、境界から冗長な黒点を除去する。
【０１８９】
細線化プロセスは、まず粗い境界から出発する。粗い境界は、細胞の内側および外側の両方の隣接ピクセルを含むすべてのピクセルからなる。粗い境界の抽出後、データは次の３つのカテゴリからなる。
（１）細胞の内部のピクセル、
（２）細胞の境界を区画するピクセル、および
（３）細胞の外部にあるピクセル。
これらの３つのカテゴリは、次の３つの条件によって関連づけられている。
（Ａ）３つともすべて連結である、
（Ｂ）（１）は（２）によって（３）から切断されている、そして最後に、
（Ｃ）（２）の各点は（１）または（２）に隣接点を持つが、その両方には持たない。
次に、細線化プロセスは、（２）内のピクセルを１個ずつ調べる。（２）内のピクセルＰが（１）または（３）に隣接点を有する場合、Ｐの色を（例えば黒から白へ）付け替えて（２）から（１）または（３）に移しても条件（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）が保たれるかどうかのチェックを実行する。保たれる場合、色の付け替えを行う。この色の付け替えは、各細胞について１ピクセル幅の境界が得られるまで実行される。
【０１９０】
１ピクセル幅境界が抽出された後、１ピクセル幅境界によって画定される領域を黒点で塗りつぶす（ステップ４８８、図５６Ｂ）。図６１は、本方法によるコンポーネントを塗りつぶすステップ４８８を実行した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の一部の画像スクリーンショットである。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は細胞を示している。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は細胞を表していないデータを示している。この白黒の点集合をマスクとして用いて、もとのデータ点を充填して黒点を置き換える（ステップ４９０、図５６Ｂ）。こうして、細胞領域が分離され、計数が可能となる。一実施形態では、調査データ内の分離された領域に畳込みを適用して、局所最大値をマーキングし細胞を同定する。前に示した実施形態と同様、円形近傍との畳込みを適用することができる。畳込みで使用される円形近傍のサイズはおよそ細胞のサイズであるので、局所最大値は細胞の中心であると判断することができる。図６２は、調査データを塗りつぶすステップの後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞をマーキングしている。最後に、図６３に、図５６Ｂのステップ４９２によって計数され十字印でマーキングされた細胞を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応する。十字印５８０は計数された細胞をマーキングしている。図６３は凝集した細胞のみを示しているが、図６４は、単一細胞およびいくつかの凝集した細胞領域で疎に充填されたサンプルに、絶対値計数方法を適用したものを示している。これも同様に、画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応し、十字印５８０は計数された細胞をマーキングしている。
【０１９１】
本発明の別の実施形態は、細胞計数のために区画された評価矩形の画面表示を増強する。細胞計数の過程で、評価矩形の画像をユーザに対して表示するのが望ましいことがある。サンプルの可視表現を提供することに加えて、高品質画像が、細胞を計数し分析するためにどの方法を使用すべきかをユーザが決める際に役立ち得る。例えば、明確な画像が、輝中心のない多くの細胞が存在することをユーザに警告するかもしれない。そこで、ユーザは暗縁法でも細胞を計数することを選択することができる。本実施形態は、高速フーリエ変換により画像の品質を向上させる。本開示を考慮すれば当業者には理解されるように、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）はフーリエ変換（ＦＴ）の一変種である。フーリエ変換のいかなる変種もここで同様に適用可能である。フーリエ変換についてはバックグラウンド照度均一化に関連して前に説明した。図６５は、本発明のこの実施形態を説明するフローチャートを提供している。ステップ５２０で、調査データに対して高速フーリエ変換を実行する。調査データは周波数領域に変換される。次にステップ５２２で、周波数領域におけるスペクトルの一部を除去する。最後にステップ５２４で、逆変換を実行する。図６６に、高速フーリエ変換前の調査データ例を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞を表している。図６７に、高速フーリエ変換後の同じ調査データを示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞を示し、十字印５８０は計数された細胞をマーキングしている。こうして画面表示が増強される。
【０１９２】
本発明の別の実施形態は、ウィンドウ領域の画面表示を扱う。ウィンドウ付きディスク上の細胞計数の過程で、ウィンドウ領域をユーザに対して表示するのが望ましいことがある。時には、ウィンドウ領域の画像は図６８に示すように歪んでいる。ウィンドウ領域を正しく表示するためには、歪みを補正する必要がある。補正方法の第１ステップは歪みの方向を求める。この歪みを求めるステップは、ウィンドウが、それ以外の暗いバックグラウンド（ここでは便宜上、白で示す）内にある明るい領域であることを利用する。用語を明確にするため、ウィンドウとは、上下に半円が付いた矩形であり、この矩形の幅を以下ではウィンドウの幅と呼ぶ。歪みを求めるステップは以下のように進行する。まず、画像のラインごとにその上の点を数値微分する。これは、あらゆる点（ｘ，ｙ）に対して、（ｘ−ｄｘ，ｙ）から（ｘ，ｙ）までの区間内のすべての点の平均値を（ｘ，ｙ）から（ｘ＋ｄｘ，ｙ）までの区間内の平均値から減算することを意味する。ここでｄｘは、雑音を除去するように選択された特定の区間長である。
【０１９３】
ウィンドウと重なる画像のラインについて、この減算の結果は、ウィンドウの左の境界で極大値をとり、右の境界で極小値をとる。この理由は、明るいウィンドウ内の平均値は暗いバックグラウンド内の平均値よりはるかに高いからである。ウィンドウの外部にある画像のラインにおいては、これらの最大値および最小値はどこか他の任意の場所で起こり得る。というのは、平均値は暗いバックグラウンドから、おそらくは多少雑音を伴って得られるからである。この性質を利用して、次のステップでは、最大値と最小値の間の距離Ｄをラインごとに計算する。次に、プロセスは、標準ウィンドウ幅に近いＤの値を有するラインを選択する。その後、これらの選択されたラインにおける最大点をマーキングする。最後に、これらの最大点の全体に直線を当てはめる。この直線の方向が歪みの方向である。図６９に、求められた方向直線とともに結果を示す。最後に、この方向直線をガイドとして用い、すべての点をそれに従って移動して、歪みを補正する。画像は正しく配列され、図７０に示すようにユーザに対して表示される。
【０１９４】
本発明の一実施形態は、調査データから泡トラックを除去する方法に関わる。時には、空気泡がディスク上のチャネル内にトラップされることがある。空気泡は、サンプル中を通過し、それが捕捉ゾーンを通る間にその経路上の一部の細胞を除去する。この細胞の除去が不整な細胞分布を引き起こすかもしれない。報告される最終結果は１平方ミリメートル（ｍｍ２）の面積当たりの細胞数の形式であるので、このような不整細胞分布は補正しなければならない。補正は以下のように実行される。図７１Ａにプロセスのフローチャートを示す。ステップ５４０で、細胞計数を前述のように実行する。次にステップ５４２で、細胞の分布を分析する。ステップ５４４で、細胞の局所密度が小さすぎる領域を無視する。というのは、これらの領域内の細胞は泡によって拭い去られた可能性が高いからである。
【０１９５】
一実施形態では、計数される領域全体を、ボックスからなるグリッドに分割する。図７１Ｂにその一例を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞（円で表す）をマーキングしている。泡トラック５４８が、ボックス５５０、５５２、５５４、および５５６を境界とする領域を通り抜けている。トラック５４８より幅広い、もう１つの泡トラック５５８が、ボックス５６０、５６２、および５６４を境界とする領域を通り抜けている。これらのボックスを境界とする領域は無視される。このような領域を無視した後、図７１Ａのステップ５４６で、細胞数を再計算する。図７１Ｃおよび図７１Ｄに泡トラックの例を示す。図７１Ｃは、顕微鏡倍率５倍で見たサンプルを通る泡トラック（トラック５４８および５５８を含む）を示している。図７１Ｄは、もう１つの例を示しており、サンプルを通る泡トラック５４８が顕微鏡倍率４０倍で示されている。
【０１９６】
ＩＩＩ．白血球計数方法
図７２は、血液サンプル中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴリンパ球の絶対数およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋リンパ球数の比の迅速な決定のための一般的な均質固相細胞捕捉検定法が本発明の方法を利用してどのように実行され得るかの一例を提供している。バイオディスクに組み込まれた小さいフローチャネル内で行われる検査が、全血から単離された７〜１５μｌの単核細胞（ＭＮＣ）中の、捕捉ゾーン上の特異抗体によって捕捉されたＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２＋、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋、およびＣＤ４５＋細胞の数を決定する。検査は、ディスク上の局在位置での特異細胞捕捉の原理に基づいている。特定の血球表面抗原に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に基づく捕捉化学物質を局在させることにより、いくつかの特異細胞捕捉ゾーンをディスク上に作成する。２５〜１００μｌチャンバーをＭＮＣ血（１０，０００〜３０，０００細胞／μｌ）で満たした後、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１９、およびＣＤ４５抗原を発現している細胞をディスク内の捕捉ゾーンに捕捉する。捕捉ゾーン内には、画定した負および正の対照領域も組み込まれる。
【０１９７】
図７２のステップ１で、血液（４〜８ｍｌ）を、４または８ｍｌのBecton Dickinson CPT Vacutainer（商標）およびＥＤＴＡ、ＡＣＤ、またはヘパリン等の抗凝固剤中に直接採取する。本発明の別の実施形態の等価なステップでは、抗凝固剤中の血液３ｍｌをHistopaque 1077のような分離勾配１７６を含むチューブ１７２内に重層する。いずれの場合でも、血液サンプル１７４は採取から２時間以内に使用するのが好ましい。分離勾配１７６に血液サンプル１７４を重層したものを含むチューブ１７２を、水平ローターおよびスイングバケットを備えたバイオハザード遠心機で、１，５００〜１，８００ＲＣＦ（２，８００ｒｐｍ）で室温で２５分遠心する。遠心後、単核細胞（ＭＮＣ）分画１８０の上に血漿を約２ｍｍ残して血漿層１７８を除去する（ステップ２）。ＭＮＣ層１８０を採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。残っている血小板を除去するために、細胞を３００ＲＣＦ（１２００ｒｐｍ）で室温で１０分遠心してペレットにする。上澄みを除去してから、チューブを軽くたたいてＭＮＣペレット１８０をＰＢＳ中に再懸濁する。最終ペレット１８０を、バイオディスク１１０のフローチャネル１３０の高さに応じて、細胞数１０，０００〜３０，０００細胞／μｌに再懸濁する（ステップ３）。
【０１９８】
バイオディスク１１０のフローチャネル１３０を７μｌのＭＮＣ懸濁液で満たし、チャンバーの入口１２２および通気口１２４（図３および図５）を密封タブで密封する（ステップ４）。バイオディスク１１０を室温で１５分培養してから、光ドライブ１１２で７８０ｎｍレーザを用いて走査し、捕捉視野を画像化する（ステップ５）。透過バイオディスク１１０を使用する場合、光ドライブ１１２は、捕捉視野を画像化するための上部検出器１５８（図１０Ａ）を任意に含むことを理解されたい。好ましくは、以下の作業を自動的に実行するようにドライブに命令するためのソフトウェアがディスク上に符号化される：（ａ）１つまたは複数の段階で、ディスクを遠心して余分な結合していない細胞をスピン除去し、（ｂ）特異捕捉ウィンドウをディスプレイモニタ１１４上に画像化し、（ｃ）データを処理する。データ処理としては、各捕捉ゾーン内の特異的に捕捉された細胞を計数すること、およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋の比等の適宜プログラムされ得る所要の計数または比を導出することがあるが、これに限定されない。
【０１９９】
さらに図７２に示されているように、本発明は、光ディスクおよびディスクドライブを用いて表面抗原(cluster designation)計数を実行する方法に関する。本方法は、分離勾配を含む第１チューブに血液サンプルを提供するステップと、血液サンプルを各層に分離するのに十分な時間および速度で第１チューブを回転させるステップと、Ｔ細胞を含むＭＮＣ層を再懸濁してＭＮＣ懸濁液を形成するステップと、少なくとも１種の捕捉剤を含む少なくとも１つの捕捉ゾーンを含むディスク面上にＭＮＣ懸濁液のサンプルを用意するステップと、ディスクを光リーダに装填するステップと、ディスクを回転させるステップと、捕捉ゾーンに電磁放射の入射ビームを当てるステップと、捕捉ゾーンでディスクと相互作用した後に形成される電磁放射のビームを検出するステップと、検出されたビームを出力信号に変換するステップと、出力信号を分析して捕捉ゾーンに捕捉された細胞の数に関する情報を抽出するステップとを含む。この方法の一実施形態では、捕捉ゾーンに当てられ細胞と相互作用する光が反射されるように、光ディスクは反射層を備えて構成される。この方法の別の実施形態では、光ディスクは、捕捉ゾーンに当てられ細胞と相互作用する光が光ディスクを透過するように構成される。
【０２００】
分析／処理ステップ中に、ソフトウェアは各捕捉ゾーン画像を読み出し、細胞画像に遭遇するごとにそれをマーキングする。例えば、ソフトウェアは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の細胞数の推定後、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋の細胞数の比を計算し、全血１マイクロリットル当たりのＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ４５＋捕捉ゾーン内の細胞の絶対数とともにＣＤ４＋／ＣＤ８＋比を表示する。プロセス全体にかかる時間は、ディスクを光ドライブに挿入してから個数および比を得るまで約１２分である。
【０２０１】
一実施形態では、ディスクは、符号化情報層として３００ｎｍの金で被覆したフォワードウォブルセット(forward Wobble Set)ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０ ＣＤ−Ｒディスクである。反射ディスク上に、サイズ２×１ｍｍの長円形の観察ウィンドウを反射層から既知のリソグラフィ技法によりエッチングする。透過ディスクのいくつかの設計では、別個の観察ウィンドウはエッチングされず、ディスク全体が利用可能である。接着層は、Ｆｒａｙｌｏｃｋ接着剤ＤＢＬ ２０１ Ｒｅｖ Ｃ ３Ｍ９４６６１である。カバーは、直径０．０４０インチのサンプル入口４８個が半径２６ｍｍで等間隔に配置された透明ディスクである。データディスクは、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋計数ソフトウェアを用いて、４倍速、サンプルレート２．６７ＭＨｚでソフトウェアにより走査され読み出される。
【０２０２】
ＩＶ．結論
以上、実験室サンプル中の細胞を画像化し、当該画像を分析する方法および装置が、１つまたは複数の特定の実施形態とともに記載されている。本発明は、いくつかの好ましい実施形態を参照して詳細に説明されているが、本発明は記載通りの実施形態に限定されないことが理解されるべきである。むしろ、本発明を実施するための現在の最良の形態を記載している本開示を考慮すれば、当業者には、多くの変更および変形が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく自ずから明らかとなるであろう。したがって、本発明の範囲は、上記の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示される。請求項の均等の意味および範囲内に入るすべての変化、変更、および変形は、特許請求の範囲内にあるとみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】本発明によるバイオディスクシステムの画像表示である。
【図２】本発明とともに利用される反射バイオディスクの分解斜視図である。
【図３】図２に示したディスクの上面図である。
【図４】ディスクの相異なる層を切取断面で示した図２および図３のディスクの斜視図である。
【図５】本発明とともに使用される透過バイオディスクの分解斜視図である。
【図６】図５に示したディスクの上面図である。
【図７】図８に示すタイプの半反射層を含むディスクの相異なる層を切取断面で示した図５および図６の透過ディスクの斜視図である。
【図８】ディスクの半反射層の機能的態様を切取断面で示した図７のディスクを表す斜視図である。
【図９】金被膜の厚さと透過率の関係を示すグラフィカル表示である。
【図１０Ａ】本発明の一実施形態によるシステムの動作を示す斜視ブロック図表示である。
【図１０Ｂ】本発明の一実施形態による分割検出器および透過バイオディスクの断面を示す図である。
【図１１】形成されたフローチャネルを示す図２、図３および図４の反射光バイオディスクの半径に垂直にとった部分断面図である。
【図１２】形成されたフローチャネルおよび単一の上部検出器を示す図５、図６および図７の透過光バイオディスクの半径に垂直にとった部分断面図である。
【図１３】形成されたウォブル溝を示す図２、図３および図４の反射光バイオディスクの部分縦断面図である。
【図１４】形成されたウォブル溝および上部検出器を示す図５、図６および図７の透過光バイオディスクの部分縦断面図である。
【図１５】反射ディスクの全厚およびその初期屈折特性を示す図１１に類似の図である。
【図１６】透過ディスクの全厚およびその初期屈折特性を示す図１２に類似の図である。
【図１７】本発明の方法を用いたバイオディスクからのデータ収集のプロセスを示すフローチャートである。
【図１８】サンプリングされたアナログ信号から一次元配列として格納される対応するデジタル信号への変換の画像グラフィカル表示である。
【図１９】光バイオディスクのトラックを基準として配置されている捕捉白血球が入射ビームとの相互作用後に信号含有ビームを生じる様子を示す光ディスクの斜視図と、指示部分の拡大詳細図である。
【図２０】Ａは、本発明による光バイオディスクのトラックを基準として配置されている白血球のグラフィカル表示である。 Ｂは、本発明による図２０Ａの白血球から導出される一連のシグネチャトレースである。
【図２１Ａ】図２１ＡからＤを統合すると、図２０Ｂのシグネチャトレースから、一次元配列として格納されデータ入力用に２次元配列へと組み合わされるデジタル信号への変換の画像グラフィカル表示である。
【図２１Ｂ】図２１ＡからＤを統合すると、図２０Ｂのシグネチャトレースから、一次元配列として格納されデータ入力用に２次元配列へと組み合わされるデジタル信号への変換の画像グラフィカル表示である。
【図２１Ｃ】図２１ＡからＤを統合すると、図２０Ｂのシグネチャトレースから、一次元配列として格納されデータ入力用に２次元配列へと組み合わされるデジタル信号への変換の画像グラフィカル表示である。
【図２１Ｄ】図２１ＡからＤを統合すると、図２０Ｂのシグネチャトレースから、一次元配列として格納されデータ入力用に２次元配列へと組み合わされるデジタル信号への変換の画像グラフィカル表示である。
【図２１Ｅ】図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ、および図２５Ｄの間の関係を示すグラフィカル表示である。
【図２２】本発明の処理方法および計算アルゴリズムによるデータ評価のためのステップを示すフローチャートである。
【図２３】本発明の一実施形態による評価矩形を選択することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図２４】本発明の特定の一実施形態によるソフトウェアによって表示されるウィンドウ付きバイオディスクのグラフィカル表示である。
【図２５】本発明の一実施形態によるウィンドウ付きバイオディスクから収集された調査データに関してウィンドウを見つけることに関与するステップを示すフローチャートである。
【図２６】本発明の一態様によるしきい値を見つける目的で走査プロセスを受ける調査データ配列からの例示的行を示す図である。
【図２７】本発明のもう１つの態様による調査データから連結コンポーネントを抽出することに関与するサブステップを示すフローチャートである。
【図２８】本発明の一実施形態によるソフトウェアディスプレイ上でウィンドウを見つけた後、評価矩形をクロッピングした結果を示す図である。
【図２９】捕捉された細胞を有するウィンドウおよびターゲットゾーンのないディスク上のダークスポット例を示す図である。
【図３０】本発明の一実施形態による、細胞を見つけるためにウィンドウなしディスクでダークスポット例がどのように利用されるかを示す図２９に類似の図である。
【図３１】本発明のいくつかの態様による調査データに対してバックグラウンド照度均一化を実行することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図３２】本発明のソフトウェアによって表示されるバックグラウンド照度均一化前の調査データの一例を示す図である。
【図３３】本発明のソフトウェアによって表示されるバックグラウンド照度均一化後の調査データの一例を示す図である。
【図３４】本発明の一特定実施態様による調査データに対して規格化を実行することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図３５】規格化ステップ中にソフトウェアによって表示される調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図３６】本発明のソフトウェアによって表示される規格化後の調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図３７】本発明の好ましい一実施形態による調査データ例に対してフィルタリングを実行することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図３８】本発明のソフトウェアによって表示されるフィルタリングステップ後の調査データ例のグラフィカル表示である。
【図３９】図３８のグラフィカル表示の拡大図および付随する点の値グラフトレースである。
【図４０】本発明のいくつかの態様の特定の実施形態による調査データから不要コンポーネントを除去することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図４１】本発明のソフトウェアによって表示されるクラックの除去前の調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図４２】本発明のソフトウェアによって表示されるクラックの除去後の図４１の調査データ例のグラフィカル表示である。
【図４３】本発明の輝中心法による細胞をマーキングし計数することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図４４】輝中心法により計数された細胞で満たされた調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図４５】図４４のグラフィカル表示の一部の拡大図および値グラフトレースである。
【図４６Ａ】本発明の暗縁法による細胞をマーキングし計数することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図４６Ｂ】シフトした円環との畳込みのグラフィカル表示である。
【図４７】本発明のソフトウェアによって表示される、計数された細胞が十字印によってマーキングされている調査データ例のグラフィカル表示である。
【図４８】本発明のさまざまな方法で利用されるアルゴリズムを用いて赤血球を抽出することに関与するステップを示すフローチャート例である。
【図４９】図４８に略述したアルゴリズムが実行される前の赤血球を含む調査データのグラフィカル表示を示す図である。
【図５０】図４８に略述したアルゴリズムの第１ステップが実行された後の図４９の調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図５１】図４８に略述したアルゴリズムの第２ステップを適用した後の図４９の調査データ例のグラフィカル表示である。
【図５２】図４８に略述したアルゴリズムの第３ステップが実行された後の図４９の調査データ例を視覚的に示す図である。
【図５３】図４８に略述したアルゴリズムの第４ステップを実行した後の図４９の調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図５４】図４８に略述したアルゴリズムの第５ステップの適用が実行された後の図４９の調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図５５】図４８に略述したアルゴリズムによって計数された赤血球を示す拡大図である。
【図５６Ａ】本発明の絶対値計数方法によって計数される前のばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図５６Ｂ】本発明の絶対値計数方法の一実施形態によって細胞を計数することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図５７】本発明の絶対値計数方法のこの実施形態による規格化およびフィルタリングのステップを実行した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図５８】本発明の絶対値計数方法によるバックグラウンド除去および２値化のステップを適用した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図５９】本発明の絶対値計数方法により規格化のステップが実行された後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図６０】本発明の絶対値計数方法の例示的実施形態による１ピクセル幅境界抽出のステップを適用した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図６１】本発明の絶対値計数方法によるコンポーネントを塗りつぶすステップを実行した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図６２】本発明の絶対値計数方法のこの特定の実施形態による調査データを塗りつぶすステップを適用した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図６３】本発明の方法により計数され十字印によってマーキングされた後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図６４】凝集した、およびばらばらの赤血球を計数することに適用された絶対値計数方法の結果を示す図である。
【図６５】本発明の一代替実施形態による画像に対して高速フーリエ変換を実行することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図６６】本発明により高速フーリエ変換が実行される前の調査データ例のグラフィカル表示である。
【図６７】高速フーリエ変換が実行された後の図６６の調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図６８】再配列前の調査データの歪んだグラフィカル表示の一例を示す図である。
【図６９】図６８のグラフィカル表示の歪み方向を示す図である。
【図７０】再配列後の図６８のグラフィカル表示を示す図である。
【図７１Ａ】泡トラック状況に対して細胞計数を補正することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図７１Ｂ】本発明のもう１つの態様による泡トラック状況に対して細胞計数を補正する画像表示である。
【図７１Ｃ】顕微鏡倍率５倍で見られる捕捉された赤血球のターゲットゾーンを通る泡トラックの一例である。
【図７１Ｄ】顕微鏡倍率４０倍で見られる図７１Ｃの泡トラックの１つおよび周囲の捕捉された赤血球の拡大図である。
【図７２】本発明の方法を用いた血液サンプルの分析を示す画像フローチャートである。
【０００１】
［発明の背景］
１．発明の分野
本発明は、信号検出装置、データ処理方法、ならびに関連するコンピュータソフトウェアおよび検定法アルゴリズムに関する。特に、本発明は、細胞サンプル等の生物学的サンプルを画像化すること、および収集された画像を分析することに関する。より具体的には、以下で最良の実施の形態により記載される特定の実施形態には制限されないが、本発明は、白血球を含む分画細胞計数方法およびこのような細胞計数を実行するための光バイオディスク(optical bio-disc)の使用に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、以下の出願に基づく優先権の利益を主張する：２００１年９月１２日出願の米国仮特許出願第６０／３２２，８６３号；２００２年１月３１日出願の米国仮特許出願第６０／３５３，３００号；同じく２００２年１月３１日出願の米国仮特許出願第６０／３５３，９２１号；２００２年２月５日出願の米国仮特許出願第６０／３５５，６４４号；２００２年２月８日出願の米国仮特許出願第６０／３５５，３０４号；２００２年２月１９日出願の米国仮特許出願第６０／３５８，４７９号；２００２年３月１２日出願の米国仮特許出願第６０／３６３，９４９号；および２００２年８月２１日出願の米国仮特許出願第６０／４０４，９２１号。これらの出願およびそれらに提供されている開示は全体として参照により本明細書に援用される。
【０００３】
［著作権で保護された資料に関する陳述］
本特許文書の開示の一部は、著作権保護を受ける資料を含む。著作権者は、特許文書または特許開示の何人による複製に対しても、それが米国特許商標庁のファイルまたは記録にある通りである限り異議はないが、さもなければいかなるものであれすべての著作権を留保する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の説明
多くの研究および診断場面で、細胞の混合物から特定の細胞を単離し分析することが必要となる。このような混合物の出所としては、血液、髄液、骨髄、腫瘍ホモジェネート、リンパ系組織、およびその他の細胞物質を含むサンプルがあり得る。
【０００５】
全血球計数（ＣＢＣ）は、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球ヘモグロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均赤血球容積、血小板数、および白血球数を含む検査の全体である。最も一般的に用いられる臨床検査は、健康状態の評価ならびに臨床的な診断、治療、およびフォローアップのために日常的に使用される全ＣＢＣ計数である。
【０００６】
白血球（ＷＢＣ）は、感染と闘い異物を攻撃することによって体を保護する。分画白血球計数は、人の血液中の白血球数および各タイプの白血球の百分率を決定する。ＷＢＣすなわち白血球の数は、病気の存在についての手がかりを提供する。これらの検査は、一般の健康診断に含まれ、感染、アレルギー、および白血病等のさまざまな病気を調べるのに役立つ。追加の白血球が必要とされる時には、骨髄が産生を増大させる。
【０００７】
次の５つのタイプの白血球があり、それぞれ異なる機能を有する：好中球、リンパ球、単球、好酸球、および好塩基球。分画は、これらの細胞が通常の分布で存在するかどうか、またはある細胞タイプが増減しているかどうかを明らかにする。健常人では通常、ＷＢＣ数は１マイクロリットル（μｌ）当たり４，０００〜１０，８００個である。運動、ストレス、および疾病のような因子がこれらの値に影響を及ぼし得る。この情報は、特定のタイプの病気を診断するのに役立つ。ＷＢＣが高い場合、感染、白血病、または組織損傷の可能性がある。ＷＢＣが１マイクロリットル当たり１，０００個を下回る場合、感染のおそれが高い。ＡＩＤＳや化学療法のような免疫系を弱める条件や投薬が、白血球の減少を引き起こす。病気からの回復は、白血球数により監視することができる。数が異常レベルまで上昇または下降し続けることは、健康状態の悪化を示す。数が正常レベルに復帰することは増強を示す。
【０００８】
白血球分画検査は、白血球数自体から得られる以上の情報を集めるために不可欠である。白血球分画計数は、新たな感染や発熱の疑い（たとえＣＢＣが正常であっても）、異常に伴う障害の疑い、異常白血球数、白血病の疑い、その他、好酸球、単球、好塩基球等の異常を評価するために使用される。（例えば薬物療法に付随する）重篤な白血球減少がある場合には、白血球または白血球分画の検査が繰り返し実行されることもある。例えば化学療法や放射線療法の治療中には、治療が癌細胞以外に正常な血球を消耗させているかどうかを判定するために、血球数は非常に重要である。
【０００９】
分画白血球数は、コンピュータ化された細胞計数機器によって決定される。機械は、５つの主要な白血球タイプの総数および百分率を決定する。正常人では、大部分が好中球（５０〜６０％）であり、リンパ球（２０〜４０％）、単球（２〜９％）がそれに続き、好酸球（１〜４％）および好塩基球（０．５〜２％）は少数である。
【００１０】
リンパ球のカテゴリ内には、さらに細胞のサブタイプがある。例えば、リンパ球はＴ細胞（胸腺由来リンパ球）とＢ細胞（嚢相当リンパ球）に大別され、これらはそれぞれ主として細胞性および体液性免疫を受け持つ。白血球のグループを分類するためには形態的特徴が使用されているが、リンパ球サブタイプの多くの機能的能力を区別するには形態だけでは不十分であることが分かっている。さまざまな機能を有するリンパ球を区別するには、ロゼット法、免疫蛍光顕微鏡法、酵素組織化学法、および最近では固有の細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体による分析等の技法が開発されている。
【００１１】
好中球は感染と闘うために重要である。好中球数が１マイクロリットル当たり１，０００個を下回っている時、その状態を好中球減少症という。リンパ腫治療が好中球減少症を引き起こすことがある。肥満および喫煙は好中球数を増加させる。リンパ球はＢ（骨髄成熟）およびＴ（胸腺成熟）リンパ球に分けられる。リンパ球数が、成人で１マイクロリットル当たり１，５００個、または子供で１マイクロリットル当たり３，０００個を下回っている時、その状態をリンパ球減少症という。リンパ腫がリンパ球減少症を引き起こすことがある。
【００１２】
血小板（栓球）は、出血が起きている部位に集まることによって出血を止める細胞様粒子である。その場合、血小板は活性化し、互いに凝集して、出血を止め、凝固を促進する。激しい運動中、患者に感染、炎症、悪性腫瘍等の骨髄増殖性障害がある場合や、脾臓が除去されている場合、血小板数は増大する。血小板数の過剰を血小板血症という。
【００１３】
血液の標準サンプル中の血小板数は通常、１マイクロリットル（μｌ）当たり１３３，０００〜３３３，０００個である。血小板数の過剰を血小板血症という。標準以上の血小板数は、反応性応答または骨髄機能不全に起因している可能性がある。反応性応答は通常、出血、感染、腫瘍形成、および骨髄増殖性障害によって引き起こされる。骨髄機能不全は通常、汎血球減少症と呼ばれる血球の損失を伴う。他方、血小板数の減少は、免疫血小板減少症に起因する。血小板減少症は、血小板数が３０，０００を下回る結果、異常出血を生じる場合に起こる。数が５，０００を下回ると、生命にかかわるとみなされる。
【００１４】
ＣＢＣは、ヘモグロビンレベル、ヘマトクリット、全白血球数、および赤血球数を測定する市販の手動または電子機器によってなされ得る。変形として、血小板数、白血球分画数、および細胞指数があり得る。血液学分析装置は完全自動化され、ＣＳＦ、胸膜液、腹水、心膜液、および胃吸引等の体液中の細胞数、細胞タイプについて結果は正確である。
【００１５】
従来の方法およびシステムと比較して、本発明者らは、細胞およびそのコンポーネントを画像化し分析するための簡単で、小型で、超高感度で、安価なシステムを開発した。このシステムは、光バイオディスク、関連する検出アセンブリ、ならびに情報および信号処理の方法およびソフトウェアを使用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
［発明の概要］
本発明は、実験室サンプル中の細胞物質の画像化および計数のための方法、装置およびソフトウェアを対象とする。本発明の実施形態は、サンプル中の細胞のデジタル画像を作成し、その画像に対してコンピュータ分析を実行する。本発明は、血液等の生体液に感染する寄生虫や病原体を含めて、細胞、特に血球を画像化する。他の検定法では、画像化は、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターに対して実行される。このシステムは、光バイオディスク、関連する検出アセンブリ、ならびに情報および信号処理の方法およびソフトウェアを使用する。
【００１７】
本発明は、バイオディスク、バイオドライブ、および関連方法も対象とする。本発明またはそのさまざまな態様は、以下の同一譲受人に譲渡された同時係属中の特許出願に開示されているディスク、検定法、およびシステムにおいて容易に実施され、それらに適応し、またはそれらとともに使用され得る：「Methods and Apparatus for Analyzing Operational and Non-operational Data Acquired from Optical Discs」と題する１９９９年８月２３日出願の米国特許出願第０９／３７８，８７８号；「Methods and Apparatus for Optical Disc Data Acquisition Using Physical Synchronization Markers」と題する１９９９年８月２３日出願の米国仮特許出願第６０／１５０，２８８号；「Trackable Optical Discs with Concurrently Readable Analyte Material」と題する１９９９年１０月２６日出願の米国特許出願第０９／４２１，８７０号；「Methods and Apparatus for Optical Disc Data Acquisition Using Physical Synchronization Markers」と題する２０００年８月２１日出願の米国特許出願第０９／６４３，１０６号；「Optical Biodiscs with Reflective Layers」と題する２００１年１１月１５日出願の米国特許出願第０９／９９９，２７４号；「Methods and Apparatus for Detecting and Quantifying Lymphocytes with Optical Biodiscs」と題する２００１年１１月２０日出願の米国特許出願第０９／９８８，７２８号；「Methods and Apparatus for Blood Typing with Optical Bio-discs」と題する２００１年１１月１９日出願の米国特許出願第０９／９８８，８５０号；「Apparatus and Methods for Separating Agglutinants and Disperse Particles」と題する２００１年１１月２０日出願の米国特許出願第０９／９８９，６８４号；「Dual Bead Assays Including Optical Biodiscs and Methods Relating Thereto」と題する２００１年１１月２７日出願の米国特許出願第０９／９９７，７４１号；「Apparatus and Methods for Separating Components of Particulate Suspension」と題する２００１年１１月３０日出願の米国特許出願第０９／９９７，８９５号；「Optical Discs for Measuring Analytes」と題する２００１年１２月７日出願の米国特許出願第１０／００５，３１３号；「Methods for Detecting Analytes Using Optical Discs and Optical Disc Readers」と題する２００１年１２月１０日出願の米国特許出願第１０／００６，３７１号；「Multiple Data Layer Optical Discs for Detecting Analytes」と題する２００１年１２月１０日出願の米国特許出願第１０／００６，６２０号；「Optical Disc Assemblies for Performing Assays」と題する２００１年１２月１０日出願の米国特許出願第１０／００６，６１９号；「Detection System For Disk-Based Laboratory and Improved Optical Bio-Disc Including Same」と題する２００１年１２月１４日出願の米国特許出願第１０／０２０，１４０号；「Surface Assembly for Immobilizing DNA Capture Probes and Bead-Based Assay Including Optical Bio-Discs and Methods Relating Thereto」と題する２００１年１２月２１日出願の米国特許出願第１０／０３５，８３６号；「Dual Bead Assays Including Covalent Linkages for Improved Specificity and Related Optical Analysis Discs」と題する２００２年１月４日出願の米国特許出願第１０／０３８，２９７号；「Optical Disc Analysis System Including Related Methods for Biological and Medical Imaging」と題する２００２年１月１０日出願の米国特許出願第１０／０４３，６８８号；「Optical Disc Analysis System Including Related Signal Processing Methods and Software」と題する２００２年１月１４日出願の米国仮出願第６０／３４８，７６７号；「Methods for DNA Conjugation Onto Solid Phase Including Related Optical Biodiscs and Disc Drive Systems」と題する２００２年２月２６日出願の米国特許出願第１０／０８６，９４１号；「Methods for Decreasing Non-Specific Binding of Beads in Dual Bead Assays Including Related Optical Biodiscs and Disc Drive Systems」と題する２００２年２月２８日出願の米国特許出願第１０／０８７，５４９号；「Dual Bead Assays Using Cleavable Spacers and/or Ligation to Improve Specificity and Sensitivity Including Related Methods and Apparatus」と題する２００２年３月１４日出願の米国特許出願第１０／０９９，２５６号；「Use of Restriction Enzymes and Other Chemical Methods to Decrease Non-Specific Binding in Dual Bead Assays and Related Bio-Discs, Methods, and System Apparatus for Detecting Medical Targets」と題する同じく２００２年３月１４日出願の米国特許出願第１０／０９９，２６６号；「Multi-Parameter Assays Including Analysis Discs and Methods Relating Thereto」と題する２００２年４月１１日出願の米国特許出願第１０／１２１，２８１号；「Variable Sampling Control for Rendering Pixelization of Analysis Results in a Bio-Disc Assembly and Apparatus Relating Thereto」と題する２００２年５月１６日出願の米国特許出願第１０／１５０，５７５号；「Surface Assembly For Immobilizing DNA Capture Probes in Genetic Assays Using Enzymatic Reactions to Generate Signals in Optical Bio-Discs and Methods Relating Thereto」と題する２００２年５月１７日出願の米国特許出願第１０／１５０，７０２号；「Optical Disc System and Related Detecting and Decoding Methods for Analysis of Microscopic Structures」と題する２００２年７月１２日出願の米国特許出願第１０／１９４，４１８号；「Multi-Purpose Optical Analysis Disc for Conducting Assays and Various Reporting Agents for Use Therewith」と題する同じく２００２年７月１２日出願の米国特許出願第１０／１９４，３９６号；「Transmissive Optical Disc Assemblies for Performing Physical Measurements and Methods Relating Thereto」と題する２００２年７月１９日出願の米国特許出願第１０／１９９，９７３号；「Optical Analysis Disc and Related Drive Assembly for Performing Interactive Centrifugation」と題する２００２年７月２２日出願の米国特許出願第１０／２０１，５９１号；「Method and Apparatus for Bonded Fluidic Circuit for Optical Bio-Disc」と題する２００２年７月２４日出願の米国特許出願第１０／２０５，０１１号；「Magnetic Assisted Detection of Magnetic Beads Using Optical Disc Drives」と題する同じく２００２年７月２４日出願の米国特許出願第１０／２０５，００５号。これらのすべての出願は全体として参照により本明細書に援用される。したがってそれらは、本明細書において完全に繰り返されているかのごとく、本明細書の裏づけとして背景および関連する開示を提供する。
【００１８】
検定法を実行する本発明の一方法は、光バイオディスク上に配置された特別のチャネル内の血球の光画像化を行うという原理に基づく。約７マイクロリットルの全血をディスク上の特別に設計されたチャネルに注入する。これらの種々の白血球サブタイプを同定し白血球分画数を生成する細胞認識ソフトウェアで画像を分析する。本方法は、特定の細胞に対する細胞特異抗体（specific antibody)を用いた特異的な細胞（specific cell）捕捉に基づく。この具体的な場合に、抗体はリンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、好酸球（ＣＤ１５）等に対するものである。これらの白血球サブタイプ特異抗体は、フローチャンバーを含むバイオディスク内の固体表面に集められるか、または被着される。
【００１９】
バイオディスクドライブアセンブリが、ディスクを回転させ、ディスク上に格納されている符号化情報の読み出しおよび処理を行い、バイオディスクのフローチャンバー内の細胞捕捉ゾーンを分析するために使用される。バイオディスクドライブは、バイオディスクを回転させるモーターと、ディスクの回転速度を制御するコントローラと、ディスクからの戻り信号を処理するプロセッサと、処理された信号を分析する分析器とを備える。回転速度は可変であり、速さ、方向、および回転時間のいずれに関しても綿密に制御され得る。バイオディスクは、フローチャンバーおよびターゲットゾーン内の検査物質がドライブの読み出しビームによって問合せされ、分析器によって分析される前、最中、または後のいずれにおいても、バイオディスクに情報を書き込むために利用されてもよい。バイオディスクは、ディスクの回転を制御し、行われる免疫型判定検定法のタイプに固有の処理情報を提供し、およびバイオドライブに関連するモニタ上に所望の結果を表示するための、符号化された情報を含んでもよい。
【００２０】
包括的に分画細胞計数プロトコールが、そして特に分画白血球計数プロトコールが、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ、またはＤＶＤフォーマット、これらのフォーマットの修正バージョン、およびそれらの代替フォーマット用に開発される。ドライブの読み出しすなわち問合せビームは、分析サンプル中の種々の細胞を検出し、分画細胞計数ソフトウェアで分析可能な画像を生成する。
【００２１】
これらの面倒な細胞計数検定法を実行するためには、顕微鏡的方法または高性能の細胞計数器が不可欠である。本発明により行われる他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。
【００２２】
本方法は、光バイオディスクおよび関連するディスクアセンブリを使用する。分析チャンバー中で遊離している、または特異抗体法により捕捉された種々の白血球サブタイプの光画像が、血液等の体液中の種々の細胞要素をそれらの光散乱特性により同定する細胞認識ソフトウェアプログラムによって生成され分析される。本方法は、細胞染色、ＲＢＣ除去等の面倒なプロトコールのような、分析前のサンプルの処理を必要としない。これらの方法は、上部検出器、下部検出器、イベント計数器、または細胞計数器を用いたＣＤ型リーダ、ＤＶＤ型リーダ等の光ディスクリーダにおける顕微鏡分析または細胞検出を含む。
【００２３】
ＣＤ４／ＣＤ８比を求める等の表面抗原分析に関連する以下の概要は、本方法、装置、システム、およびディスクアセンブリの応用に適した関連検定法の一特定グループを表す。
【００２４】
ディスク準備：エアガンを用いて金製の反射ディスクまたは透過ディスクからちり粒子を除去して清浄にする。スピンコーターを用いてディスクをイソプロパノールで２回すすぐ。２％ポリスチレンをディスク上にスピンコートし、全面にわたり比較的厚いコーティングを形成する。
【００２５】
化学物質の被着：一実施形態は、以下のものを培養する３ステップ被着プロトコールを含む：ストレプトアビジン（３０分培養）；ビオチン化された第１の抗体（６０分培養）；および第２の捕捉抗体（３０分培養）。すべてのステップは、好ましくは、被着と被着の間に厳しい洗浄および乾燥ステップを用いて、湿潤チャンバー（humidity chamber）内で室温で実行する。
【００２６】
簡単に述べると、１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンを含むリン酸緩衝生理食塩水を１μｌずつ各ウィンドウ上に積層し、３０分培養する。蒸留水を用いて余分なストレプトアビジンをすすぎ落とし、ディスクを乾燥する。等量のビオチン化ＩｇＧ（ＰＢＳ中１２５μｇ／ｍｌ）とアルデヒド活性化デキストラン（２００μｇ／ｍｌ）を混合することによりビオチン化ＩｇＧデキストラン複合体を調製する。デキストラン−アルデヒド・ビオチン化ＩｇＧ複合体を各捕捉ウィンドウ内のストレプトアビジン上に積層し、６０分または一晩冷蔵庫で培養する。余分な試薬をすすぎ落とし、ディスクをスピン乾燥する。バイオディスクスロット上の指定スポットに捕捉抗体を積層することによって、特定のバーコード捕捉パターンを作成する。分画計数のため、抗好中球（ＣＤ１２８等）、抗リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ５６等）、抗好酸球（ＣＤ１５）、抗単球（ＣＤ１４）、抗好塩基球（ＣＤ６３）および抗血小板（ＣＤ３２およびＣＤ１５１）を各スロットの指定スポットに積層する。下記の表１に、捕捉層アセンブリのさまざまな捕捉パターンの例を掲げる。冷蔵庫で３０分または一晩培養する。２５μｍ、５０μｍまたは１００μｍ（５０μｍチャネルに必要なサンプル容積は２５μｍチャンバーに必要なサンプル容積の２倍である）の、直線形、Ｕ字形、または他のチャネルフォーマットを用いたディスクと、透明な（上部検出器用）または反射性のカバーディスク（下部検出器用）を組み立てる。
【００２７】
【表１】
ディスクの漏れチェック：通常、バイオハザード物質である血液が分析されるので、これらのディスクは、ｉｎ ｓｉｔｕサンプルを有するディスクのスピン中にどのチャンバーも漏れないことを確かめる漏れチェックがなされる。それぞれのチャネルに、ブロッキング剤であるＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄを満たし、１時間ブロッキングする。ディスクを５，０００ｒｐｍで５分回転させ、漏れおよびディスク安定性を検査する。漏れをチェックした後、ディスクを真空チャンバーに２４時間入れる。真空処理後、チャンバーを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液で満たし、または別法として空のまま放置してから、真空パウチに入れ、使用時まで冷蔵保存する。
【００２９】
全血からのバフィーコート層の単離：静脈血をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やクエン酸デキストラン（ＡＣＤ）のような抗凝固剤とともに遠心チューブに入れ、１，５００×ｇで１５分遠心することにより、バフィーコートを調製する。血漿と赤血球の界面に白血球がバフィーコート層と呼ばれる層を形成する。血漿を細いピペットで慎重に取り除いてから、バフィーコート層を採取する。遠心なしで血液からバフィーコートを得る別法として、血液をフィブリノーゲン、デキストラン、アラビアゴム、フィコールまたはメチルセルロースのような沈降促進剤で沈降させる方法がある。Ｂｏｙｕｍ試薬（メチルセルロースとメトリゾ酸ナトリウム）が、赤血球汚染のない白血球調製品を得るのに特に好適である。
【００３０】
ディスク上の検定法基礎技術の説明：分画白血球計数ディスク検査の好ましい一実施形態は、３つの個別のコンポーネント、すなわち（１）化学物質を含むベースディスク、（２）チャネル層、および（３）カバーディスクを含む。
【００３１】
バフィーコートまたは全血（７マイクロリットルのＰＢＳ溶液）をディスクチャンバーに注入し、チャンバーの入口および出口を密閉タブで密封し、ディスクを室温で１５分培養する。第１の方法では、上部または下部検出器を有する光ドライブの標準７８０ｎｍレーザを用いてディスク上の所与の領域（例えば面積１平方ミリメートル）を走査する。本発明による細胞認識ソフトウェアは、１平方ミリメートルに等しい捕捉画像から分画数を出力するように自動化されており、得られた値を補外して全血の１立方ミリメートル当たりの計数を決定する。また第２のバーコード法では、標準７８０ｎｍレーザを用いてディスクを走査して捕捉ゾーン（リンパ球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、および血小板）を画像化する。本発明の細胞認識ソフトウェアは、とりわけ、以下のルーチンを実行する：（ａ）ディスクを遠心して余分な結合していない細胞をスピン除去し、（ｂ）それぞれの特異的な細胞捕捉ゾーン内の画定領域を画像化し、（ｃ）各捕捉ゾーン内の特定して捕捉された細胞を計数する等のデータ処理を行い、（ｄ）異なる白血球のサブセットについて全血の１立方ミリメートル当たりの白血球数を導出する。
【００３２】
本発明の一態様によれば、処理ステップ中に、認識ソフトウェアは各捕捉ゾーンを読み出し、遭遇した細胞をマーキングする。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。各捕捉ゾーンからのデータを処理した後、ソフトウェアは、容積１マイクロリットルすなわち１立方ミリメートルの血液当たりのリンパ球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、および血小板ゾーンの数を表示する。プロセス全体にかかる時間は、ディスクを光ドライブに挿入してから所望の計数または比を求めて表示するまで約１０〜１５分である。本発明のこの態様の別の実施形態では、捕捉ゾーンから電気的応答を読み出し、ディスクまたはメモリに格納してデータファイルを得る。これは、以下でさらに詳細に説明するように、認識目的で後処理してもよい。
【００３３】
ディスクの仕様：以下のサブセクションは、本発明とともに有利に使用可能ないくつかの光バイオディスクの特定の実施形態について概説することを目的とする。
【００３４】
（Ａ）トラッキング設計：本発明の好ましい一実施形態では、ディスクは、３００ｎｍの金で被覆したフォワードウォブルセット(forward Wobble Set)ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０である。この反射ディスク上に、サイズ２×１ｍｍの長円形データウィンドウをリソグラフィによりエッチングする。Ｕ字形チャネルを用いて、高さ２５〜１００マイクロメートルのチャンバーを作成する。入口および出口を含むチャンバー全体を満たすには約７μｌのサンプルを要する。４ウィンドウ／４チャネルのフォーマットを用いるのが好ましいであろう。しかし、透過ディスク上にはデータウィンドウはエッチングされず、ディスク全体が利用可能である。
【００３５】
（Ｂ）接着剤および接合：FraylockのＵ字形接着剤DBL 201 Rev C 3M94661または直線状チャネルを用いてチャンバーを作成する。
【００３６】
（Ｃ）カバーディスク：直径０．０４０インチのサンプルインレット４８個が半径２６ｍｍで等間隔に配置された完全反射性の透明ディスクを用いる。
【００３７】
データの捕捉および処理：データディスクは、本発明のソフトウェアにより、特定の細胞認識方法を用いて、４倍速、サンプルレート２．６７ＭＨｚで走査され読み出される。
【００３８】
ソフトウェア：本発明は、さらに、処理方法ならびに関連する細胞認識および画像化ソフトウェアを含む。このソフトウェアは、細胞計数および分画細胞計数を実行し表示することを対象とする。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。本ソフトウェアは、光バイオディスク上や光ディスクドライブリーダデバイス内に格納されてもよく、別法として安全なサーバから光リーダによってのみアクセス可能であってもよい。このサーバは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）のようなコンピューティングネットワークで実施されてもよく、または規定された条項のもとでインターネットを通じて利用可能とされてもよい。このような配布方法は、同一譲受人に譲渡された「Interactive Method and System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Medical Information Using Specially Prepared Bio-Optical Disc, Optical Disc Drive, and Internet Connections」と題する２０００年１１月８日出願の米国仮出願第６０／２４６，８２４号および対応する米国特許出願第０９／９８６，０７８号に開示されている。
【００３９】
本明細書に開示されるさまざまな好ましい実施形態を実施するために使用される資材には、フォワードウォブル金メタライズドフォトレジストディスク、透過性金メタライズドディスク、ピペットおよびチップ、スピンコーター、遠心機、スイングローター、クエン酸ナトリウムやエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような抗凝固剤を添加したＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）ＣＰＴチューブ、恒湿チャンバー、絞り機、接着剤、カバーディスク、透明カバーディスク、テープまたは同等品、真空装置、イエローチップ、および真空チャンバーがある。
【００４０】
本発明の一実施形態では、血球を含む実験室サンプルをバイオディスク上に、またはディスクアセンブリに形成された流体チャネル内に被着する。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。バイオディスクは、血球の成分を適所に結合させるための特異抗原を含む流体チャネルおよび／または混合チャンバーを有する特製のＣＤサイズのディスクである。バイオディスクは、慎重に積層した金属および基板からなるため、被着された検査サンプルと電磁ビームが相互作用することを可能にする特定の光学的性質を有する。バイオディスクを光ドライブに挿入すると、ドライブはディスクを回転させ、いくつかの実施形態では、他の必要な溶液とサンプルを混合してもよい。ドライブ内のバイオディスクに電磁ビームが当てられる。反射ディスクと称する一実施形態では、ビームはバイオディスクの反射面で反射し、光ドライブ内の検出器が反射ビームを収集する。透過ディスクと称する別の実施形態では、ビームの一部がバイオディスクを通過し、光ドライブ内のもう１つのタイプの検出器へと透過する。いずれの場合でも、検出器によって収集されるビームは、バイオディスク上の実験室サンプルに関する情報を含む。次にその情報はアナログ−デジタルプロセッサに送られ、そこで検出器からの電気信号を表すデジタルデータが生成される。このデジタルデータは、リアルタイムで処理され、メモリまたはディスクに格納されてから、全部または一部が生データとして処理されてもよく、または画像フォーマットを含む種々のフォーマットへとエクスポートされてもよい。これらのフォーマットのいずれも、意図する結果を生成するために他のアプリケーションまたは手段によってさらに処理されてよい。このデジタルデータは、自動式、電気式、コンピュータ制御式、および／または機械式の計数および分析に有用である。デジタルデータは、専門家による手計数、認識等の手作業の分析に好適な可視画像を生成するためにも使用可能である。本発明の別の実施形態では、画像を含み得る生データ、デジタルデータ、エクスポートされたデータがアーカイブに格納される。このように、本発明の方法は一般に「調査データ」に適用可能である。「調査データ」としては、本明細書で使用される場合、生の検出器出力データ、生の信号データ、デジタルデータ、エクスポートされたデータ、または画像もしくは画像データを含むエクスポートされたデータがあるが、これらには限定されない。アーカイブは、調査データが登録され、所望であれば、例えば人口統計的、地理的、医学的、歴史的、または個人的データのような他の識別情報と関連づけられ得る場所を提供する。その後、例えばさまざまな母集団グループの健康動向研究を行うために、調査データのグループを分析することができる。
【００４１】
本発明の一実施形態は、血球を計数するという要求に対処する。本発明は、処理方法ならびに関連する細胞認識および画像化ソフトウェアを含む。このソフトウェアは、細胞計数を実行し、対応する結果を表示することを対象とする。本発明の一実施形態では、２値化、バックグラウンド均一化、規格化およびフィルタリング等の種々の画像処理方法を実行して、調査データ内の細胞の外観を増強（enhance）し、細胞計数のプロセスを支援する。調査データ内の閉じ込められた泡、クラック、およびぼやけた細胞のような不整部分について細胞計数を補正するために、他の技法が実行される。
【００４２】
本発明の実施形態は、光バイオディスク上や光ディスクドライブリーダデバイス内にソフトウェアを格納し、または別法としてソフトウェアは安全なサーバから光リーダによってのみアクセス可能である。このサーバは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）のようなコンピュータネットワークで実施されてもよく、または規定された条項のもとでインターネットを通じて利用可能とされてもよい。このような配布方法は、同一譲受人に譲渡された「Interactive System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Information and the Use Thereof」と題する２００１年１１月７日出願の米国特許出願第０９／９８６，０７８号に開示されており、これは参照により本明細書に援用される。
【００４３】
より具体的には、本発明は、細胞等の調査特徴物を計数する方法に関する。この方法は、細胞のサンプルの調査データを取得するステップと、調査データ内で評価矩形を選択するステップと、評価矩形内で調査データを増強するステップと、評価矩形に示される細胞を計数するステップとを含む。この方法の特定の一実施形態では、細胞計数は、輝中心（bright center）、または別法として暗縁（dark rim）を認識することによって実行される。
【００４４】
本発明の別の態様は、評価矩形のカスタムサイズを選択する方法に関する。
【００４５】
さらに本発明の別の態様は、複数の評価矩形を選択する方法に関する。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、調査データに対してバックグラウンド照度均一化を実行するステップと、調査データに対して規格化を実行するステップと、調査データをフィルタリングするステップを通じて評価矩形内の調査データを増強することに関する。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、調査データに対して近傍矩形のサイズを選択するステップと、調査データ内の点を選ぶステップと、水平走査を実行するステップであって、それによって、点を中心とする近傍矩形内に配置されたすべての隣接点に対する第１スライド平均を計算するステップと、垂直走査を実行するステップであって、それによって、点を中心とする近傍矩形内に配置されたすべての隣接点に対する第２スライド平均を計算する、垂直走査を実行するステップと、第１スライド平均および第２スライド平均を組み合わせるステップであって、それによって、全平均を生成するステップと、全平均と点のもとの値の差を求めて該差をバックグラウンド値に加算することにより計算される結果値に、点のもとの値を再割当てするステップと、調査データ内のすべての点について、水平走査を実行するステップ、垂直走査を実行するステップ、２つの平均を組み合わせるステップおよびもとの値を再割当てするステップを繰り返すステップを通してバックグラウンド照度均一化を実施することに関する。
【００４８】
本発明の別の態様において、調査データに規格化を実行するステップは、調査データ内のすべての点の値の平均および標準偏差を計算するステップと、平均および標準偏差を用いて調査データ内のすべての点の値を規格化するステップと、必要であればいくつかの点の値を切り詰めるステップとをさらに含む。
【００４９】
本発明のさらなる別の態様において、調査データをフィルタリングする方法がさらに提供され、該方法は、近傍矩形のサイズを選択するステップと、調査データ内の点を選ぶステップと、点を中心とする近傍矩形内に配置されたすべての十分に異なる点を見つけるステップと、十分に異なる点の数が所定のフィルタリング基準より大きい場合に点の値を再割当てするステップと、調査データ内のすべての点について、すべての十分に異なる点を見つけるステップおよび値を再割当てするステップを繰り返すステップとをさらに含む。
【００５０】
本発明のさらに別の態様において、処理方法が提供され、該方法は、調査データから不要なコンポーネントを除去するステップを含み、不要なコンポーネントを除去するステップは、しきい値を選択するステップと、しきい値を用いて調査データに対して２値化を実行するステップと、調査データに対して規格化を実行するステップと、連結コンポーネントを抽出するステップと、サイズしきい値を選択するステップと、サイズしきい値を満たさないコンポーネントを除去するステップとをさらに含む。
【００５１】
本発明のもう１つの追加的態様は、輝中心によって調査データ内の細胞を計数する方法に関する。この方法は、調査データに対して畳込みを実行するステップと、複数の局所最大値を探索するステップと、複数の局所最大値から冗長な局所最大値を除去するステップと、残りの最大を細胞の中心であると宣言するステップと、細胞の中心を計数するステップとを含む。
【００５２】
本発明の別の態様によれば、輝中心によって調査データ内の細胞を計数する方法が提供される。この代替的な方法は、上記調査データに対して反転を実行するステップと、シフトした円環との複数の畳込みを実行するステップと、複数の畳込みからの結果の和をとるステップと、局所最大値を見つけるステップと、最大を細胞の中心であると宣言するステップと、細胞の中心を計数するステップとをさらに含む。
【００５３】
さらに、本発明のもう１つの態様は、輝中心により計数された細胞を調査データから除去するステップと、細胞をそれらの暗縁により計数するステップと、輝中心を認識することにより細胞を計数するステップからの合計を暗縁を認識することにより計数するステップからの合計に加算するステップとを含む方法に関する。
【００５４】
本発明のさらに別の態様は、調査データ内の暗縁により細胞を計数する方法を含む。本方法は、調査データに対して反転を実行するステップと、シフトした円環との複数の畳込みを実行するステップと、複数の畳込みからの結果の和をとるステップと、最大を細胞の中心であると宣言するステップと、細胞の中心を計数するステップとを含む。
【００５５】
本発明の別の態様において、細胞を計数増強する方法は、調査データに対して規格化を実行するステップと、調査データをフィルタリングするステップと、しきい値数を選択するステップと、調査データが上記しきい値数だけ所定バックグラウンド値と異なっているかどうかを判断することにより調査データに対して２値化を実行するステップと、調査データに対して規格化を実行するステップと、調査データ内の１ピクセル幅境界を抽出するステップと、１ピクセル幅境界により画定される領域を塗りつぶすステップと塗りつぶされた領域に畳込みを適用するステップとをさらに含む。
【００５６】
本発明のもう１つの態様は、細胞のサンプルのデジタルデータを取得する方法に関する。この方法は、（１）光ディスク表面上に血液サンプルを用意するステップと、（２）光ディスクを光リーダに装填するステップと、（３）光ディスクを回転させるステップと、（４）光ディスク上の捕捉ゾーンの１つに電磁放射の入射ビームを当てるステップとを含む。表面は、１種または数種の捕捉剤を有する１つまたは複数の捕捉ゾーンを備える。この方法は、続いて、（５）捕捉ゾーンでディスクと相互作用した後に形成される電磁放射のビームを検出器で検出するステップと、（６）検出されたビームをアナログ出力信号に変換するステップと、（７）アナログ出力信号を、捕捉ゾーンに捕捉された細胞を含むデジタルデータに変換するステップとを含む。
【００５７】
本発明の別の態様によれば、アナログ出力をデジタルデータに変換する方法が提供される。この変換方法は、一定間隔でアナログ信号の振幅をサンプリングするステップと、サンプリング振幅を一次元配列に記録するステップと、サンプリングするステップおよび記録するステップを用いて複数の一次元配列を作成するステップと、複数の一次元配列を組み合わせるステップであって、それによって、サンプルのデジタルデータを含む２次元配列を作成するステップとを含む。
【００５８】
本発明のさらにもう１つの態様は、細胞のサンプルのデジタルデータを取得する方法に関する。この方法は、光ディスク表面（この表面は１種または数種の捕捉剤を有する１つまたは複数の捕捉ゾーンを含む）上に血液サンプルを用意するステップと、光ディスクを光リーダに装填するステップと、光ディスクを回転させるステップと、光ディスク上の捕捉ゾーンの１つに電磁放射の入射ビームを当てるステップと、捕捉ゾーンでディスクと相互作用した後に形成される電磁放射のビームを検出器で検出するステップと、検出されたビームをアナログ出力信号に変換するステップとを含む。本方法のこの特定の実施形態は、アナログ出力信号を、捕捉ゾーンに捕捉された細胞を含むデジタルデータに変換するステップで終わる。捕捉ゾーンに当てられる光が検出器へ反射されるように、光ディスクは反射層を備えて構成され、検出器は下部検出器である。本発明のもう１つの態様では、上部検出器または分割検出器が使用される。
【００５９】
本発明のもう１つの態様は、評価矩形を選択する方法に関する。この方法は、（１）調査データ内で複数のウィンドウの１つを見つけるステップと、（２）ウィンドウ内で標準サイズの評価矩形をクロッピングするステップとを含む。この方法の特定の一実施形態では、複数のウィンドウの１つを見つけるステップは、（ａ）調査データに対して圧縮を実行するステップと、（ｂ）画像に対してしきい値評価を実行するステップと、（ｃ）調査データに対して２値化を実行するステップと、（ｄ）調査データに対して規格化を実行するステップと、（ｅ）調査データから連結コンポーネントを抽出するステップと、（ｆ）連結コンポーネントからウィンドウに対応するコンポーネントを見つけるステップとを含む。
【００６０】
本発明のさらにもう１つの態様は、調査データから連結コンポーネントを抽出する方法に関する。この方法は、調査データのすべての黒点のコンポーネントに初期コンポーネント番号を割り当てるステップと、初期走査方向を設定するステップと、調査データを走査して連結黒点のコンポーネント番号が同一になるようにコンポーネント番号を再割当てするステップとを含む。
【００６１】
本発明のさらに追加的な態様は、ダークスポットを有する光ディスク実施形態からの調査データ内で評価矩形を選択する方法に関する。この方法は、調査データ内で少なくとも１つのダークスポットを見つけるステップと、ダークスポットから所定距離シフトすることによって求められる点を中心とする標準サイズの評価矩形を作成するステップとを含む。
【００６２】
本発明の表示態様によれば、調査データの画像の表示を増強する方法が提供される。この方法は、調査データに対して高速フーリエ変換を実行するステップと、周波数領域でデータのスペクトルの一部を除去するステップと、逆変換を実行して調査データの修正バージョンを回復するステップとを含む。
【００６３】
本発明の表示態様によれば、調査データの画像の表示を増強する別の方法が提供される。本方法は、画像が歪んでいるかどうかを判断するステップと、歪みの方向を求めるステップと、画像の歪みを補正するステップとを含む。
【００６４】
本発明のもう１つの態様は、以前に格納された調査データをアーカイブから取り出し、調査データに対して分析を実行する方法に関する。このようなアーカイブは、検査サンプルを提供した患者の特徴に従って、格納される調査データを登録することができる。本発明の一態様では、患者の特徴から選択された複数の基準に適合するサンプルが、母集団健康動向研究を行うために選択される。
【００６５】
本発明のもう１つの態様は、白血球計数においてさまざまなコンポーネントを計数し、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の計数、ならびにＣＤ４細胞数のＣＤ８細胞数に対する比を表示することに関する。
【００６６】
本発明のさらなる目的、態様、および方法は、それらに寄与する追加的特徴およびそれらから生じる利点とともに、添付図面に示される本発明の好ましい実施形態の以下の説明から明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００６７】
［発明の詳細な説明］
本発明は、実験室サンプル中の細胞物質の画像化および計数のための方法および装置を対象とする。これらの方法および方法は、光ディスクの上または内部にある、対象とするいかなるタイプの調査特徴物を画像化し計数することに適用されてもよい。本発明の実施形態は、サンプル中の調査特徴物すなわち細胞の調査データを作成し、その調査データに対してコンピュータ分析を実行する。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。
【００６８】
以下の説明では、本発明の実施形態をさらに詳細に説明するために、数多くの具体的な詳細が記載される。しかし、当業者には明らかなはずであるが、本発明はこれらの具体的な詳細なしに実施され得る。他の場合には、本発明を不明瞭にしないために、既知の特徴については詳述しない。
【００６９】
本明細書では、光ディスクデータを用いた白血球計数のためのいくつかの実施形態がさらに詳細に説明される。これらの実施形態は、白血球のみを画像化し計数することに限定されず、いかなるタイプの細胞物質の計数を行うことにも容易に適用され得る。これには、以下のものには限定されないが、赤血球、白血球、ビーズ、および光リーダによって検出可能な類似の光シグネチャ(signature)を生成する、生物学的か非生物学的かを問わずいかなる他の物体も含まれ得る。他の検定法では、対象となる調査特徴物は、細胞である代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。白血球以外の物質に対して本発明を使用するのに必要ないくつかの変更については、以下で細胞計数の議論においてさらに詳細に説明する。
【００７０】
以下の議論では、本発明のデータ収集およびデータ分析の態様を説明するために、２つの主要なセクションが提示される。第１セクションは、実験室サンプルから調査データを収集し、当該調査データを配列型のストレージに変換するために用いられる装置、方法、およびアルゴリズムの詳細な説明を提示する。第２セクションは、調査データの分析に関する方法およびアルゴリズムの詳細な説明を提示する。その２つのセクションに続いて、白血球計数検定法を実行する方法に関するセクションが与えられる。
【００７１】
Ｉ．データ収集
本発明の実施形態は、実験室サンプル中の細胞物質からの調査データの取得を含む。図１は本発明による光バイオディスク１１０の斜視図である。この光バイオディスク１１０は、光ディスクドライブ１１２およびディスプレイモニタ１１４とともに示されている。検査サンプルがバイオディスク１１０上の指定領域に被着される。バイオディスクが光ディスクドライブ１１２に挿入されると、ディスクドライブは、検査サンプルとの相互作用により修正または変調された電磁放射ビームを用いることによりサンプルから情報を収集することを受け持つ。情報が分析され処理された後、コンピュータモニタ１１４がその結果を表示する。
【００７２】
本発明で使用可能な光バイオディスク１１０の２つの主要な実施形態がある。図２、図３および図４は光バイオディスク１１０の反射実施形態を示す一方、図５、図６および図７は光バイオディスク１１０の透過実施形態を示している。
【００７３】
Ａ．反射実施形態
図２は、光バイオディスク１１０の一実施形態の構造要素の分解斜視図である。図２は、本発明において使用可能な反射ゾーン光バイオディスク１１０（以下「反射ディスク」）の一例である。構造要素は、キャップ部分１１６、接着すなわちチャネル部材１１８、および基板１２０を含む。キャップ部分１１６は、１つまたは複数の入口１２２および１つまたは複数の通気口１２４を含む。キャップ部分１１６は、ポリカーボネートから形成されてもよく、好ましくは、図２の斜視図で見た場合の下部が反射面１４６（図４にさらに分かりやすく示されている）で被覆される。好ましい実施形態では、トリガマーキング１２６が反射層１４２（図４）の表面上に含まれる。トリガマーキング１２６は、情報が符号化された、バイオディスクの３層すべてで透明なウィンドウ、不透明領域、または反射もしくは半反射領域を含んでもよい。符号化情報は、データをプロセッサ１６６（図１０Ａに示す）に送るために使用され、プロセッサ１６６は図８および図１０Ａに示す問合せすなわち入射ビーム１５２の作用機能と相互作用する。図２に示す第２の要素は、流体回路１２８すなわちＵ字形チャネルが形成された接着すなわちチャネル部材１１８である。流体回路１２８は、好ましくは、メンブレンを打ち抜きまたは切削してプラスチックフィルムを除去し、図示のような形状を形成することによって形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フローチャネル１３０および戻りチャネル１３２を含む。図２に示す流体回路１２８のいくつかは、混合チャンバー１３４を含む。２つの異なるタイプの混合チャンバー１３４が例示されている。第１のものは、対称混合チャンバー１３６であり、フローチャネル１３０に関して対称的に形成される。第２のものはオフセット混合チャンバー１３８である。オフセット混合チャンバー１３８は、図示のようにフローチャネル１３０の片側に形成される。図２に示す第３の要素は、ターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０を含む基板１２０である。基板１２０は、好ましくはポリカーボネートからなり、その上部に反射層１４２が被着される（図４）。ターゲットゾーン１４０は、反射層１４２を図示の形状に、または別法として、除去することによって所望の形状に形成される。別法として、ターゲットゾーン１４０は、反射層１４２を付ける前にターゲットゾーン１４０領域をマスキングすることを含むマスキング技法によって形成されてもよい。反射層１４２は、アルミニウムまたは金のような金属から形成されてもよい。
【００７４】
図３は、図２に示す光バイオディスク１１０の上面図である。ディスク内に位置する流体回路１２８、ターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０およびトリガマーキング１２６が見えるように、キャップ部分１１６の上の反射層１４２が透明に示されている。各捕捉ゾーンは、サンプル中の異なるコンポーネント（または異なる細胞）を結合するための１種または数種の特異抗原を有するので、検定法処理後、チャンバー内の各捕捉ゾーンはあるタイプの細胞または細胞コンポーネントを含む。結合すなわち捕捉は、血球の特定コンポーネントに「結合」(lock)することによりその特異的な細胞を捕捉する化学構造を有する１種または数種の抗原を有することによって達成される。細胞コンポーネントの分離は、血球、例えば白血球の分画計数を実行するために極めて重要である。他の検定法では、調査特徴物は、細胞である代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。ターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０は、電磁問合せビームが検査サンプルと相互作用する場所を画定する。
【００７５】
図４は、本発明の一実施形態による反射ゾーン型光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。この図は、それぞれの層、基板、コーティング、またはメンブレンの部分断面図を示すように切り取られた、その種々の層の一部を含む。図４は、反射層１４２で被覆された基板１２０を示している。活性層１４４が反射層１４２を覆う。好ましい実施形態では、活性層１４４はポリスチレンから形成されてもよい。別法として、ポリカーボネート、金、活性ガラス、改質ガラス、または改質ポリスチレン、例えばポリスチレン−無水マレイン酸共重合体を使用してもよい。さらに、ヒドロゲルを使用可能である。この特定の実施形態に示されているように、プラスチック接着部材１１８が活性層１４４を覆う。プラスチック接着部材１１８の露出部分は、流体回路１２８を作り出す切削または打ち抜きされたＵ字形状を示している。本バイオディスクのこの反射ゾーン実施形態における最後の構造層はキャップ部分１１６である。キャップ部分１１６は、その下部に反射面１４６を含む。反射面１４６は、アルミニウムまたは金のような金属からなってもよい。
【００７６】
Ｂ．透過実施形態
図５は、本発明による透過型の光バイオディスク１１０の構造要素の分解斜視図である。透過型の光バイオディスク１１０の構造要素は、同様に、キャップ部分１１６、接着すなわちチャネル部材１１８、および基板１２０層を含む。キャップ部分１１６は、１つまたは複数の入口１２２および１つまたは複数の通気口１２４を含む。キャップ部分１１６は、ポリカーボネート層から形成されてもよい。図７および図８に最も分かりやすく示されているように、任意のトリガマーキング１２６が、薄い半反射層１４３の表面に含まれてもよい。トリガマーキング１２６は、情報が符号化された、バイオディスクの３層すべてで透明なウィンドウ、不透明領域、または反射もしくは半反射領域を含んでもよい。符号化情報は、データをプロセッサ１６６（図１０Ａに示す）に送るために使用され、プロセッサ１６６は図８および図１０Ａに示す問合せすなわち入射ビーム１５２の作用機能と相互作用する。
【００７７】
図５に示す第２の要素は、流体回路１２８すなわちＵ字形チャネルが形成された接着すなわちチャネル部材１１８である。流体回路１２８は、メンブレンを打ち抜きまたは切削してプラスチックフィルムを除去し、図示のような形状を形成することによって形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フローチャネル１３０および戻りチャネル１３２を含む。図５に示す流体回路１２８のいくつかは、混合チャンバー１３４を含む。２つの異なるタイプの混合チャンバー１３４が例示されている。第１のものは、対称混合チャンバー１３６であり、フローチャネル１３０に関して対称的に形成される。第２のものはオフセット混合チャンバー１３８である。オフセット混合チャンバー１３８は、図示のようにフローチャネル１３０の片側に形成される。
【００７８】
図５に示す第３の要素は基板１２０であり、これはターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０を含んでもよい。基板１２０は、好ましくはポリカーボネートからなり、その上部に薄い半反射層１４３が被着される（図８）。図５および図８に示すディスク１１０の基板１２０に関連する半反射層１４３は、図２、図３および図４に示す反射ディスク１１０の基板１２０上の反射層１４２よりも大幅に薄い。半反射層１４３がより薄いため、図１１に示すように、問合せビーム１５２の一部が透過ディスクの構造層を透過することができる。薄い半反射層１４３は、アルミニウムまたは金のような金属から形成されてもよい。
【００７９】
図６は、図４の透過型光バイオディスク１１０の上面図である。キャップ部分１１６が透明なので、ディスク内に位置する流体回路、トリガマーキング１２６およびターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０が見えている。ターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０は、電磁ビームが検査サンプルと相互作用する場所である。ディスクの回転後、サンプル中の細胞の特定コンポーネントが、チャンバー内にあらかじめ装填された種々の捕捉剤または抗原によって、異なる捕捉ゾーンに捕捉される。
【００８０】
図７は、本発明の透過ディスク実施形態による光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。ディスク１１０は、その種々の層の一部が、それぞれの層、基板、コーティング、またはメンブレンの部分断面図を示すように切り取られて示されている。図７は、透明なキャップ部分１１６、基板１２０上の薄い半反射層１４３、およびトリガマーキング１２６を有する透過ディスクフォーマットを示している。トリガマーキング１２６は、キャップの上部に配置される不透明材料を含む。別法として、トリガマーキング１２６は、ディスクの薄い反射層１４３上にエッチングされた透明な非反射性ウィンドウによって、またはトリガ検出器１６０（図１０Ａ）から来る信号を吸収し、もしくは反射しないいかなるマークによって形成されてもよい。また、図７は、図示の形状、または別法として所望の形状の指定領域をマーキングすることによって形成されるターゲットゾーン１４０も示している。ターゲットゾーン１４０を指示するためのマーキングは、基板１２０上の薄い半反射層１４３上に、または基板１２０の下部（ディスクの下）に形成されてもよい。別法として、ターゲットゾーン１４０は、ターゲットゾーン１４０を除く薄い半反射層１４３全体をマスキングすることを含むマスキング技法によって形成されてもよい。この実施形態では、ターゲットゾーン１４０は、薄い半反射層１４３上にインクをシルクスクリーン加工することによって作成してもよい。活性層１４４が薄い半反射層１４３を覆う。好ましい実施形態では、活性層１４４は厚さ４０〜２００μｍの２％ポリスチレン層である。別法として、ポリカーボネート、金、活性ガラス、改質ガラス、または改質ポリスチレン、例えばポリスチレン−無水マレイン酸共重合体を使用してもよい。さらに、ヒドロゲルを使用可能である。この実施形態に示されているように、プラスチック接着部材１１８が活性層１４４を覆う。プラスチック接着部材１１８の露出部分は、流体回路１２８を作り出す切削または打ち抜きされたＵ字形状を示している。本バイオディスク１１０のこの透過実施形態における最後の構造層は、入口１２２および通気口１２４を含む透明な非反射性のキャップ部分１１６である。
【００８１】
Ｃ．ディスク実施形態の光学的性質
２つのディスク実施形態の主な相違点の１つは、光ディスクの上部層のコーティングの厚さである。透過ディスクの場合、薄い半反射層１４３が基板層１２０の上に被着される。反射ディスクの場合、実質的により厚い反射層が基板層１２０の上に被着される。図８に示す好ましい実施形態では、透過ディスクの薄い半反射層１４３は厚さ約１００〜３００Åであり、４００Åを超えない。この理由は、金被膜層は８００Å以上の厚さでは完全反射性であり、光はおよそ４００Å以下の厚さの金被膜を透過することができるからである。下記の表２に、被膜の厚さに関して、金被膜の反射および透過特性を示す。
【００８２】
【表２】
金被膜の光の透過に対するしきい値密度は約４００Åである。表２に加えて、図９は、金の厚さに基づく薄い半反射層１４３の反射性と透過性の逆比例関係のグラフィカル表示を提供している。図９のグラフで用いられている反射性および透過性の値は絶対値である。図８に示すように、より薄い半反射層１４３のために、入射すなわち問合せビーム１５２の一部が侵入し通り抜けることができる。こうして、入射すなわち問合せビーム１５２は、図１０Ａに示すような上部検出器１５８によって検出され得る。同時に、光の一部は入射路に沿って反射すなわち逆戻りする。
【００８４】
反射光バイオディスクの場合、戻りビーム１５４が、生物学的サンプルに関する情報を伝達する。上記のように、生物学的サンプルに関するこのような情報は、入射ビームがフローチャネル１３０またはターゲット（すなわち捕捉）ゾーン１４０内にあるためにサンプルと接触する時に実質的に限って、戻りビームに含まれる。戻りビーム１５４は、反射層１４２の中または上に符号化された、さもなければ図１３および図１４に示すウォブル溝１７０に符号化された情報を伝達してもよい。当業者には明らかなように、対応する入射ビームが反射層１４２と接触する時にのみ、あらかじめ記録された情報が、ターゲットすなわち捕捉ゾーンを有する反射ディスクの戻りビーム１５４に含まれる。情報を含む反射層１４２が除去されたか、さもなければ存在しない領域に入射ビーム１５２がある時には、このような情報は戻りビーム１５４に含まれない。
【００８５】
本発明の方法は、同一の譲受人に譲渡された「Optical Discs Including Equi-Radial and/or Spiral Analysis Zones and Related Disc Drive Systems and Methods」と題する２００２年１月２９日出願の米国仮出願第６０／３５３，０１４号（これは参照により本明細書に援用される）に開示されているような等半径(equi-radial)チャネルを含むバイオディスクにも容易に適用され得る。
【００８６】
Ｄ．システム装置
図１０Ａは、斜視ブロック図によりシステム装置の動作を説明する表示である。これは、光アセンブリ１４８、入射すなわち問合せビーム１５２を生成する光源１５０、戻りビーム１５４、および透過ビーム１５６を含む。反射バイオディスク実施形態の場合、戻りビーム１５４は、光バイオディスク１１０のキャップ部分１１６の反射面１４６で反射される。本光バイオディスク１１０のこの反射実施形態では、戻りビーム１５４が下部検出器１５７によって検出され、信号作用物質が存在するかどうかが分析される。透過バイオディスク実施形態では、透過ビーム１５６が上部検出器１５８によって検出され、同じく信号作用物質が存在するかどうかが分析される。透過実施形態では、上部検出器１５８として光検出器を用いてもよい。
【００８７】
図１０Ａは、ディスク上のトリガマーキング１２６およびトリガ検出器１６０を含むハードウェアトリガ機構も示している。ハードウェアトリガ機構は、反射バイオディスクおよび透過バイオディスクの両方で使用される。トリガ機構により、プロセッサ１６６は、問合せビーム１５２がそれぞれのターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０上にある時にのみデータを収集することができる。さらに、透過バイオディスクシステムでは、ソフトウェアトリガを使用してもよい。ソフトウェアトリガは、下部検出器を用いて、問合せビーム１５２がそれぞれのターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０の端に当たったらすぐにデータを収集するようにプロセッサ１６６に通知する。図１０Ａは、光バイオディスク１１０の回転を制御するドライブモーター１６２およびコントローラ１６４も示している。図１０Ａはさらに、透過光バイオディスクに関連する戻りビーム１５４および透過ビーム１５６を処理するために別法として実施されるプロセッサ１６６および分析器１６８も示している。透過光バイオディスクの場合、透過ビーム１５６が生物学的サンプルに関する情報を伝達する。この実施形態では、あらかじめ記録された情報がディスク上にある。検出器１５８がビームを収集する。
【００８８】
本発明の別の実施形態では、分割上部検出器を用いて透過ビーム１５６を収集する。図１０Ｂに、本発明の一実施形態による分割検出器を示す。検出器１７０は、２個の検出器コンポーネント１７２および１７４を有する。２個の検出器コンポーネントは、物体１８６（例えば細胞）で屈折した透過ビーム１５６を集め、２つの信号ＡおよびＢを生成する。物体１８６は、例えば赤血球や白血球等の生物細胞のような調査特徴物であり得る。一方の信号を他方から減算する（すなわちＡ−ＢまたはＢ−Ａ）ことによって差分信号を得ることができる。検出器コンポーネントが、入射ビーム１５２を散乱する物体を有する領域の上方にある時、それらは信号の変化を検出する。各検出器には、他方の検出器とは逆の変化が見える。すなわち、光が一方の検出器のほうへ曲がると、その検出器には信号が増大して見える一方、他方の検出器には信号が減少して見える。この性質のため、２つの検出器のそれぞれによって生成される信号の差である信号を生成することによって、信号対雑音比を大幅に増大させることができる。この差信号は２つの利点を有する。第１に、両方の検出器に等しく生じるシステム内の雑音（光学的または電気的）が、差信号では消去される。第２に、光を単に吸収するのではなく屈折するディスク上の対象物体により、差信号において大きく、容易に検出される変化が生じる。これは、対象物体によって生成された信号をバックグラウンド雑音から分離しなければならない分析作業の助けとなる。
【００８９】
分割検出器についてのさらに詳細な議論は、同一出願人の「Segmented Area Detector for BioDrive and Methods Relating Thereto」と題する２００２年２月１４日出願の米国仮特許出願第６０／３５５，０９０号、ならびに同一名称のそれぞれ２００１年１０月１０日、２００２年１月２８日、２００２年１月３０日、および２００２年２月７日出願の関連する仮出願第６０／３３５，１２３号、第６０／３５２，６４９号、第６０／３５３，７３９号、および第６０／３５５，０９０号に提示されており、これらはすべて参照により本明細書に援用される。本発明とともに使用可能な異なるタイプの検出器についてのさらに詳細な議論は、同一出願人の「Optical Disc Analysis System Including Related Methods for Biological and Medical Imaging」と題する２００２年１月１０日出願の米国特許出願第１０／０４３，６８８号に提示されており、これも参照により本明細書に援用される。
【００９０】
図１１〜図１６は、ディスクの光学的性質および検出器がディスクからの情報伝達ビームを収集するためにどのようにして使用されるかを説明するための、反射および透過の両方の実施形態の断面図を示している。
【００９１】
ここで特に図１１を参照すると、本発明による光バイオディスク１１０の反射ディスク実施形態の部分断面図が示されている。図１１は、基板１２０および反射層１４２を示している。上記のように、反射層１４２は、アルミニウム、金または他の好適な反射材料のような材料から形成することができる。この実施形態では、基板１２０の上面は滑らかである。図１１は、反射層１４２を覆う活性層１４４も示している。図１１に示されているように、ターゲットゾーン１４０が、所望の位置で反射層１４２の一領域すなわち一部を除去することによって、または別法として、反射層１４２を施す前に所望の領域をマスキングすることによって、形成される。さらに図１１に示すように、プラスチックチャネル部材１１８が活性層１４４を覆う。図１１は、キャップ部分１１６およびそれに関連する反射面１４６も示している。このように、キャップ部分１１６が、所望の切り抜き形状を含むプラスチックチャネル部材１１８に施されると、それによってフローチャネル１３０が形成される。図１１に示す矢印によって指示されているように、入射ビーム１５２の経路は最初はディスク１１０の下から基板１２０へ向かっている。次いで入射ビームは反射層１４２に近い点に集束する。この集束は、ターゲットゾーン１４０における反射層１４２の一部が存在しない場所で起こるので、入射は活性層１４４を通りフローチャネル１３０に入る経路に沿って続く。続いて入射ビーム１５２はフローチャネルを通って上方へ進み、最終的に反射面１４６に入射する。この点で、入射ビーム１５２は、入射経路に沿って逆戻りすなわち反射することにより、戻りビーム１５４を形成する。
【００９２】
図１２は、本発明によるバイオディスク１１０の透過実施形態の部分断面図である。図１２は、基板１２０上に透明なキャップ部分１１６および薄い半反射層１４３のある透過ディスクフォーマットを示している。図１２は、薄い半反射層１４３を覆う活性層１４４も示している。好ましい実施形態では、透過ディスクは、厚さ約１００〜３００オングストロームのアルミニウムまたは金のような金属からなる薄い半反射層１４３を有し、好ましくは４００オングストロームを超えない。この薄い半反射層１４３により、光源１５０（図１０Ａ）からの入射すなわち問合せビーム１５２の一部がディスクに侵入しそれを上方へ通り抜けて上部検出器１５８により検出されることができる一方、光の一部は入射ビームと同じであるが逆方向の経路に沿って反射される。この配置では、戻りすなわち反射ビーム１５４は半反射層１４３で反射される。このように、戻りビーム１５４はフローチャネル１３０に入らない。反射光すなわち戻りビーム１５４は、図１３および図１４に関連してさらに詳細に説明するように、半反射層１４３の中または上に形成されたあらかじめ記録された情報トラック上で入射ビーム１５２をトラッキングするために使用可能である。図１２に示すディスク実施形態では、画定したターゲットゾーン１４０があってもなくてもよい。ターゲットゾーン１４０が、基板１２０上の薄い半反射層１４３上に形成された直接マーキングにより作成されてもよい。これらのマーキングは、シルクスクリーン加工またはいかなる同等の方法を用いてなされてもよい。ターゲットゾーンを画定するためにいかなる物理的印も使用しない代替実施形態では、フローチャネル１３０は事実上、調査特徴物の検査が行われる限定されたターゲット領域として利用される。
【００９３】
図１３は、本発明によるバイオディスク１１０の反射ディスク実施形態のトラックを横切る断面図である。この図は、ディスクの半径およびフローチャネルに沿って縦断した図である。図１３は、基板１２０および反射層１４２を含む。この実施形態では、基板１２０は一連の溝１７０を含む。溝１７０は、ディスクの中心付近から外縁に向かって延びるらせんの形態である。溝１７０は、問合せビーム１５２がディスク上でらせん溝１７０に沿ってトラッキングすることができるように実施される。このタイプの溝１７０は「ウォブル溝」として知られている。波状すなわち波形の側壁を有する下部が溝１７０を形成する一方、隆起したすなわち高い部分が、らせんの隣接する溝１７０を分離する。この実施形態で溝１７０を覆う反射層１４２は、図示のように、本質的にコンフォーマルである。図１３は、反射層１４２を覆う活性層１４４も示している。図１３に示されているように、ターゲットゾーン１４０が、所望の位置で反射層１４２の一領域すなわち一部を除去することによって、または別法として、反射層１４２を施す前に所望の領域をマスキングすることによって、形成される。さらに図１３に示すように、プラスチック接着すなわちチャネル部材１１８が活性層１４４を覆う。図１３は、キャップ部分１１６およびそれに関連する反射面１４６も示している。このように、キャップ部分１１６が、所望の切り抜き形状を含むプラスチック接着部材１１８に施されると、それによってフローチャネル１３０が形成される。
【００９４】
図１４は、図１２に記載した本発明によるバイオディスク１１０の透過ディスク実施形態のトラックを横切る断面図である。この図は、ディスクの半径およびフローチャネルに沿って縦断した図である。図１４は、基板１２０および薄い半反射層１４３を示している。この薄い半反射層１４３により、光源１５０からの入射すなわち問合せビーム１５２がディスクに侵入しそれを通り抜けて上部検出器１５８により検出されることができる一方、光の一部は戻りビーム１５４の形式で反射される。薄い半反射層１４３の厚さは、ディスクリーダがそのトラッキング能力を維持するのに必要な反射光の最小量によって決定される。この実施形態における基板１２０は、図１３で説明したものと同様に、一連の溝１７０を含む。この実施形態における溝１７０もまた、好ましくは、ディスクの中心付近から外縁に向かって延びるらせんの形態である。溝１７０は、問合せビーム１５２がらせんに沿ってトラッキングすることができるように実施される。図１４は、薄い半反射層１４３を覆う活性層１４４も示している。さらに図１４に示すように、プラスチック接着すなわちチャネル部材１１８が活性層１４４を覆う。図１４は、反射面１４６なしのキャップ部分１１６も示している。このように、キャップが、所望の切り抜き形状を含むプラスチックチャネル部材１１８に施されると、それによってフローチャネル１３０が形成され、入射ビーム１５２の一部が実質的に反射されずにそれを通ることができる。
【００９５】
図１５は、反射ディスクの全厚およびその初期屈折特性を示す、図１１に類似の図である。図１６は、透過ディスクの全厚およびその初期屈折特性を示す、図１２に類似の図である。図１５および図１６では、断面が溝１７０に沿って切ってあるため、溝１７０は見えない。図１５および図１６は、これらの実施形態で溝１７０に垂直に位置する狭いフローチャネル１３０の存在を示している。図１３、図１４、図１５、および図１６は、それぞれの反射および透過ディスクの全厚を示している。これらの図で、入射ビーム１５２は最初に基板１２０と相互作用するように示されている。基板１２０は、図示のように入射ビームの経路を変える屈折特性を有し、反射層１４２または薄い半反射層１４３上でビーム１５２を集束させる。
【００９６】
Ｅ．アナログ−デジタル変換処理
反射ディスクの戻りビーム１５４または透過ディスクの透過ビーム１５６のいずれから得られるかを問わず、生体検査サンプルに関する情報は信号処理のためにプロセッサ１６６（図１０Ａ参照）に送られる。この処理は、下部検出器１５７（反射ディスク）または上部検出器１５８（透過ディスク）によって検出されたアナログ信号から離散デジタル形式への変換を含む。
【００９７】
図１７は、図１０Ｂに示した装置に関連する情報取り出しプロセスの概要フローチャートである。ステップ２７０で、実施形態が透過バイオディスクである場合、生物学的サンプルに関する情報を伝達する透過ビームが検出器１５８によって検出される。ステップ２７２で、実施形態が反射バイオディスクである場合、反射ビーム１５４が検出器１５７によって検出される。いずれの場合でも、ステップ２７４で、情報はアナログ−デジタル変換に送られる。ステップ２７６で、結果として得られるデジタルデータは配列である。
【００９８】
図１８に、プロセッサ１６６によって実行されるアナログ−デジタル変換を示す。変換は、一定時間間隔２１２でアナログ信号２１０をサンプリングすること、および、信号の対応する瞬間アナログ振幅２１４を離散２進整数２１６として符号化することを含む。サンプリングはある開始時刻２１８に開始され、ある終了時刻２２０に終了する。いかなるアナログ−デジタル変換プロセスにも関連する２つの一般的な値は、サンプリング周波数およびビット深度である。サンプリング周波数は、サンプリングレートとも呼ばれるが、単位時間当たりに取られるサンプルの数である。サンプリング周波数が高いほど、連続するサンプル間の時間間隔２１２は短くなり、その結果、もとのアナログ信号２１０と比べてデジタル信号２２２の忠実度が高くなる。ビット深度は、アナログ信号２１０のサンプリングされた振幅２１４を符号化するために各サンプル点で使用されるビット数である。ビット深度が大きいほど、２進整数２１６によるもとのアナログ振幅２１４の近似が良くなる。本発明の一実施形態では、サンプリングレートは８ＭＨｚ、ビット深度はサンプル当たり１２ビットであり、０〜４，０９５（０〜２ｎ−１、ここでｎはビット深度）の整数サンプル範囲が可能となる。
【００９９】
ビット深度およびサンプリング周波数の組合せは、他の実施形態では必要な特定の精度に対応するようにカスタマイズすることができる。例として、限定ではないが、一般に細胞より小さいビーズを計数する方法に関わる実施形態では、サンプリング周波数を高くするのが望ましいかもしれない。アナログ−デジタル変換中に、レーザー経路に沿ったそれぞれの連続するサンプル点２２４が連続的にディスク上に、またはメモリ内に一次元配列２２６として格納される。それぞれの連続するトラックが、独立の一次元配列を与える。すべての一次元配列が組み合わされて、一般的な画像表現に類似する２次元配列２２８（図２１Ｂに示す）を形成する。
【０１００】
ここで、バイオディスクからのデータ収集に関与する詳細をさらに説明するために、データ収集例を提供する。図１９は、本発明の光バイオディスク１１０の斜視図を示している。図１９は、光バイオディスクのトラック２３２を基準として配置されている捕捉された白血球２３０を示すために、指示部分の拡大詳細斜視図を含む。図示のように、入射ビーム１５２と白血球２３０との相互作用により、反射ディスクの戻りビーム１５４または透過ディスクの透過ビーム１５６のいずれかの形式で信号含有ビームが得られ、これが下部検出器１５７または上部検出器１５８のいずれかによって検出される。
【０１０１】
図２０Ａ、図２０Ｂおよび図２１Ａ〜図２１Ｄは、細胞がどのようにしてデジタルデータへと捕捉されるかを示している。他の検定法では、対象となる調査特徴物は、細胞の代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。図２０Ａは、光バイオディスク１１０のトラック２３２を基準として位置決めされている白血球２３０のグラフィカル表示である。細胞２３０は、図１９に示したディスクに類似のディスク上に配置される。図２０Ｂは、本発明による図２０Ａの白血球２３０から導出される一連のシグネチャトレースである。図２０Ｂは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤとラベル付けされた対応するトレースを示している。次に、アナログシグネチャトレース（信号）２１０は、対応するデジタル信号２２２に変換（図２１Ａ〜図２１Ｄに示す）するためにプロセッサ１６６に送られる。図２０Ｂはさらに、白血球２３０全体の走査が、検出され処理されることが可能な入射ビームの摂動２３１を生じることも明らかにしている。
【０１０２】
図２１は、図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ、および図２１Ｄの間の配置関係を示すグラフィカル表示であり、これらの図が全体として、図２０Ｂの４個のトレースＡ、Ｂ、ＣおよびＤがどのようにして単一の２次元デジタルデータ配列２２８に変換されるかを示している。
【０１０３】
ここで具体的に図２１Ａを参照すると、図２０Ａに示した光バイオディスクのトラックＡおよびＢからサンプリングされたアナログ信号２１０が示されている。プロセッサ１６６は、アナログ信号２１０の対応する瞬間アナログ振幅２１４を離散２進整数２１６（図１２）として符号化する。結果として得られる一連のデータ点は、サンプリングされたアナログ信号２１０に類似するデジタル信号２２２である。
【０１０４】
次に図２１Ｂに進むと、トラックＡおよびＢからのデジタル信号２２２（図２１Ａ）が、独立の一次元メモリ配列２２６として格納される。それぞれの連続するトラックが対応する一次元配列を与え、前の一次元配列と組み合わされると、デジタルデータの２次元配列２２８を生じる。次にデジタルデータは、サンプル領域内の特定の点における戻りビーム１５４または透過ビーム１５６（図１９）の相対強度を表すサンプル点２２４（図１８）の２次元配列２２８として、メモリ内またはディスク上に格納される。そして２次元配列は、生ファイル、データファイル、または画像ファイル２４０の形式でメモリ内またはディスク上に格納される。その後、ファイル２４０に格納されたデータは、メモリ２４２から取り出され、分析器１６８（図１０Ａ）へのデータ入力２４４として使用される。
【０１０５】
図２１Ｃは、図２０Ａに示した光バイオディスクのトラックＣおよびＤからサンプリングされたアナログ信号２１０を示している。プロセッサ１６６は、アナログ信号２１０の対応する瞬間アナログ振幅２１４を離散２進整数２１６（図１８）として符号化する。結果として得られる一連のデータ点は、サンプリングされたアナログ信号２１０に類似するデジタル信号２２２である。
【０１０６】
次に図２１Ｄを参照すると、トラックＣおよびＤからのデジタル信号２２２（図２１Ｃ）が、独立の一次元メモリ配列２２６として格納される。それぞれの連続するトラックが対応する一次元配列を与え、前の一次元配列と組み合わされると、画像に類似する２次元配列２２８（図２１Ｂ）を生じる。次に、上記と同様、デジタルデータは、サンプル領域内の特定の点における戻りビーム１５４または透過ビーム１５６（図１９）の相対強度を表すサンプル点２２４（図１８）の２次元配列２２８として、メモリ内またはディスク上に格納される。そして２次元配列は、生ファイル、データファイル、または画像ファイル２４０の形式でメモリ内またはディスク上に格納される。その後、ファイル２４０に格納されたデータは、メモリ２４２から取り出され、分析器１６８（図１０Ａ）へのデータ入力２４４として使用される。
【０１０７】
光バイオディスクからデータを捕捉し、このデータを整数の２次元配列に変換するさらなる方法およびアルゴリズムは、一般的適用可能性を有し、同一譲受人に譲渡された「Variable Sampling Control for Rendering Pixelation of Analysis Results in Optical Bio-Disc Assembly and Apparatus Relating Thereto」と題する２００１年５月１６日出願の米国仮出願第６０／２９１，２３３号（これは参照により本明細書に援用される）に開示されている。
【０１０８】
本発明の別の実施形態は、調査データをアーカイブに格納する。アーカイブは、調査データを登録することができる場所を提供する。その後、さまざまな母集団グループの健康動向研究を行うために、データのグループを分析することができる。例えば、調査データと患者情報との相関をとり、患者の属性によって分類され得る調査データのカタログを作成することができる。例えば年齢、性別、人種、および血液型のような情報を用いて調査データを分類することができる。アーカイブは、検索可能な関係データベースの機能を利用することができる。このようなアーカイブが構築された後、あるカテゴリの調査データについて分析を行うことができる。例えば、ある都市の患者から提供されたサンプルから抽出された調査データを検索し、これらの調査データを分析することによって、母集団健康動向研究を行うことができる。利益として、母集団の人々自身の参加がなくても研究を実行することができる。長期にわたり歴史的アーカイブを構築することが可能であり、長期間にわたり特定の母集団について研究を行い、長期動向を分析することができる。
【０１０９】
ＩＩ．データ分析
以下のセクションは、本発明のデータ分析態様に関する。これらは、具体的には図２２〜図７１Ｄに関連して議論され、一般的には前の図１〜図２１を参照する。
【０１１０】
Ａ．データの収集および処理
一実施形態では、デジタルデータの配列の形式で格納されているバイオディスクからの調査データが、細胞計数のために分析される。別の実施形態では、他の形式の調査データが分析のために使用される。他の検定法では、調査データは、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターを計数するための情報を含んでもよい。本発明の一実施形態は、調査データをリアルタイムでデータ分析器へ送る。別の実施形態では、調査データは格納され、後で分析のために取り出される。両方の実施形態で、本発明の計算および処理アルゴリズムは分析器１６８（図１０Ａ）に格納され、入力調査データ２４４に適用されて、ディスプレイモニタ１１４（図１０Ａ）に表示され得る有益な出力結果２６２（図２２）を生成する。例として、限定ではないが、以下では、デジタルデータ配列の形式の調査データに対する分析方法を説明する。本開示を考慮して、当業者は、本発明の方法がデジタルデータ配列のフォーマット以外のさまざまな形式の調査データに適用可能であることを認識するであろう。
【０１１１】
ここで図２２に進むと、本発明の処理方法および計算アルゴリズムによるデータ分析のステップの全般的概観を提示するフローチャートが示されている。本処理方法の第１ステップは、入力調査データ２４４を受け取ることに関わる。上記のように、データ分析は、０〜４，０９５の範囲内の整数の２次元配列から開始される。次のステップ２４６は、計数のためにディスクの評価矩形を選択することである。この矩形が画定された後、目的は、矩形内部に含まれる全白血球の実際の計数を行うことが目的となる。この領域を「調査データ領域」という。ステップ２４６の実施態様は、ディスクの構成に左右される。２つの可能なディスク構成として、ウィンドウ付きディスクおよびウィンドウなしディスクがある。
【０１１２】
例として、限定ではないが、図２および図４に示したターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０のようなウィンドウ付きのディスクを用いた本発明の実施形態では、ソフトウェアがウィンドウを認識し、分析および計数のためにその一部をクロッピングする。図２に示したような好ましい一実施形態では、各ウィンドウ（すなわち捕捉ゾーン）は１×２ｍｍの矩形の形状であり、その両端に半円形部分を有する。この実施形態では、ソフトウェアは、それぞれのウィンドウ内の１×２ｍｍ領域の標準サイズの評価矩形をクロッピングする。この実施形態の一態様では、リーダが、数個の異なるウィンドウ内の細胞数を比較するために数個の連続するサンプル値を取ってもよい。
【０１１３】
図４に示したようなウィンドウなし透過ディスクを用いる本発明の実施形態では、ステップ２４６は、２つの異なる方法のうちの１つで実行される。標準矩形の位置が、固定座標を有する点を基準としてその中心を位置決めすること、または較正ドット（これは好ましくは、固有の特徴を有する濃い色素のスポットである）を見つけることのいずれかによって選択される。較正ドットを使用する場合、所望のコントラストを有する色素を、細胞の２つのクラスタに関してディスク上の特異的な位置に沈着させる。そして、光ディスクリーダが、一方の細胞クラスタの中心へスキップするように指示されてから、標準サイズ（１×２ｍｍ）の評価矩形が、選択されたクラスタを中心として位置決めされる。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。
【０１１４】
両方のタイプのディスクに対応する以外に、ステップ２４６は、ユーザの選択の余地も見込んでいる。ユーザは、細胞計数のために、マウス選択等による直接対話によって、矩形領域のような所望のサンプル領域形状を指定してもよい。ソフトウェアの本実施形態では、これは、マウスを用いて、モニタ１１４（図１）に表示されている調査データのグラフィカル表示の所望の部分の上をクリック・アンド・ドラッグすることを含む。評価領域選択方法の如何に関わらず、それぞれの矩形領域が次のステップ２４８で計数のために評価される。
【０１１５】
図２２における第３ステップはステップ２４８であり、これはバックグラウンド照度均一化に関する。このプロセスは、いくつかのハードウェア構成によって引き起こされる可能性のあるバックグラウンド一様性変動を補正する。バックグラウンド照度均一化は、バックグラウンド全体、または調査データのうち細胞でない部分が、任意のバックグラウンド値Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを有する平面に近づくように、各サンプル点の強度レベルをずらす。Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは、標準矩形サンプル領域にわたる平均値をとる等の多くの方法で決定することができるが、本実施形態ではＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは２，０００に設定される。選択された矩形サンプル領域の各点Ｐにおける値Ｖは、数（Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ＋（Ｖ−Ｐの近傍にわたる平均値））で置き換えられる。必要であれば、結果として得られるＶを、実際の可能な値の範囲（これは本発明の好ましい一実施形態では０〜４，０９５である）に合うように切り詰めてもよい。近傍矩形の寸法は、細胞のサイズより十分に大きく、標準矩形のサイズより十分小さくなるように選択される。他の検定法では、近傍矩形は、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターに合わせて選択される。
【０１１６】
図２２のフローチャートにおける次のステップは規格化ステップ２５０である。規格化ステップ２５０を実行する際に、標準矩形サンプル領域内のデータについて、平均が２，０００、標準偏差が６００となるように線形変換が実行される。必要であれば、値は、範囲０〜４，０９５に合うように切り詰められる。このステップ２５０は、バックグラウンド照度均一化ステップ２４８とともに、ソフトウェアがハードウェアの変更および調整から影響を受けにくいようにする。例として、限定ではないが、上部検出器１５８（図１３）のような検出回路における信号利得は、結果として得られる細胞計数に大幅に影響を及ぼさずに変更可能である。
【０１１７】
図２２に示すように、フィルタリングステップ２５２が次に実行される。標準矩形内の各点Ｐについて、Ｐの近傍（その寸法はステップ２４８で指示されるものより小さい）内の点で、その値がＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄとは十分に異なるものの個数を計算する。計算された点の個数は、調査データ内の細胞のサイズを近似するはずである。他の検定法では、計算される点の個数は、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーター等の対象物体を近似するはずである。求められた異なる点の個数が十分に大きい場合、Ｐにおける値はそのままにされるが、そうでない場合、その値にはＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄが割り当てられる。このフィルタリング操作は、雑音を除去するために実行され、最適な場合には、細胞のみが調査データにとどまる一方、バックグラウンドは一様にＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに等しくなる。
【０１１８】
図２２に示すように、不良なコンポーネントを除去するための任意のステップ２５４を実行してもよい。きず、泡、汚れ、およびその他の同様の不整部分のような欠陥がフィルタリングステップ２５２を通過するかもしれない。これらの欠陥は、直接的に、または調査データのヒストグラムにおける全体の分布に影響を及ぼすことによって間接的に、細胞計数エラーを引き起こし得る。このステップは、これらの欠陥が細胞に比べてサイズが十分に大きいという事実を利用して、適当なアルゴリズムを用いてそれらを除去する。他の検定法では、これは、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターのような他の調査特徴物に容易に適用され得る。それらのサイズは、欠陥を除去するにはどうするのが最善かを判断する際に考慮される。任意ステップ２５４の後、好ましくは、ステップ２４８、２５０、および２５２が繰り返される。
【０１１９】
図２２に示す次の処理ステップはステップ２５６であり、輝中心によって細胞を計数することに関する。計数ステップ２５６はいくつかのサブステップからなる。それらは（１）畳込みを用いることであって細胞の中心をより良く見えるようにする、畳み込みを用いること、（２）これらの中心をマーキングすること、および（３）細胞の実際の計数を実行すること、に関する。ハードウェア構成によっては、一部の細胞は輝中心がないように見えるかもしれない。このような場合、暗縁のみが見えるので、以下の２つの任意ステップ２５８および２６０が有益である。
【０１２０】
ステップ２５８は、見つかった細胞を画像から除去することに関する。ステップ２５８で、見つかった各細胞の中心の周りの円形領域を値２，０００（バックグラウンドデフォルト）で満たし、輝中心および暗縁の両方を有する細胞が２度見つからないようにする。ステップ２６０は、暗縁を認識することによりさらなる細胞を計数することに関する。ステップ２５８の後、調査データに対して２つの変換が実行される。その目標は、暗縁をよりはっきりさせ、ステップ２５６で輝中心法によって計数されなかった細胞を計数できるようにすることである。別の実施形態では、輝中心によって細胞を計数する方法の代わりに、暗縁によって細胞を計数する方法を使用することができる。
【０１２１】
計数ステップ２５６の後、または計数ステップ２６０が任意に使用された場合にはその後、図２２に示す最終ステップは、結果出力ステップ２６２である。標準矩形内に見つかった細胞の数が図１に示したモニタ１１４に表示される。同定された各細胞は、表示されている光バイオディスクから導出された調査データ上で十字印を用いてマーキングされる。
【０１２２】
図２２に示した各ステップのさらに詳細な説明は、サブステップを詳細に記載した対応するブロック図とともに、以下で与えられる。
【０１２３】
ステップ１：データ入力
ステップ２４４は、０から４，０９５までの範囲の２次元配列に格納されているデータを取り出す。黒セグメントは定数値０で埋められる一方、光が検出された領域は１から４，０９５までの範囲にある。結果のデータ評価において、０は無視される。
【０１２４】
ステップ２ａ：ウィンドウ付きディスクにおける評価矩形の選択
図２３に、評価矩形を選択するプロセス（図２２のステップ２４６）の詳細を示す。ステップ３００で、選択のタイプを判断する。第１の選択肢３０２は、図２および図４に示したターゲットすなわち捕捉ゾーン１４０のような物理的に埋め込まれたウィンドウを有するバイオディスクから評価矩形を選択することを含む。図２４に、本発明の一実施形態によるソフトウェアによって表示された、ウィンドウ３２６および３２８を有するディスクの調査データ例のグラフィカル表示を示す。
【０１２５】
一実施形態によるステップ３０４の詳細なプロセスを図２５に示す。ステップ３３０（図２５）で、調査データ配列を、ｎ行につき１行およびｎ列につき１列が考慮されるように圧縮する。次にステップ３３２で、圧縮された調査データを１行ずつ走査して、２値化ステップで使用されることになるしきい値を決定する。図２６は、説明のための一例を提供している。例示的行３４２で、各セルは調査データ上の点を表し、各セル内の値はその点で検出された光強度を表す。走査は、調査データ配列の各行について長さＬのすべての可能なセグメントを選択することによって開始される。そこで図２６は、調査データ配列からのこの例示的行についての長さＬのすべての可能なセグメントを示している。実際の配列は多くのこのような例示的行を有するであろう。Ｌは、ディスク上のウィンドウの幅よりわずかに小さく選択される。次に、各セグメントについて、当該セグメント内のすべての整数値を用いて平均値を計算する。セグメントは行に沿って「スライド」されるので、このプロセスは「スライド平均」を求めると呼ばれる。すべての行の長さＬの全セグメントについて平均を求めた後、平均の最小および最大を求める。しきい値Ｔを、（ｍｉｎ（平均）＋ｍａｘ（平均））／２として計算する。このプロセスは、検索ウィンドウを、ウィンドウ領域を覆うセグメントに狭める。ウィンドウ領域は非ウィンドウ領域より明るいので、これらのセグメントの平均はしきい値Ｔより高くなり、後のステップで、より容易に同定することができる。
【０１２６】
一実施形態は、以下のようにして、セグメントＬの平均値の計算を加速する。セグメントｎ内のＫ＋１からＫ＋Ｌまでのすべての値の和ａ（ｎ）を計算する場合（Ｋ＋１はセグメントの開始点である）、ａ（Ｋ＋Ｌ）を和ａ（ｎ）に加算し、ａ（Ｋ）を和ａ（ｎ）から減算する。これをＫのすべての値について繰り返す。これにより、アルゴリズムは、セグメントが行を１ユニット移動するたびにセグメントのすべての値の和を初めから足し上げずに済む。しきい値を求めるこのプロセス全体を、すべての行がこのように走査されるまで各行について繰り返す。
【０１２７】
図２５に戻って、ステップ３３４で２値化を実行する。このステップで、しきい値Ｔを超える値を有する点が黒と宣言される一方、残りは白と宣言される。これで、調査データは、白黒画像であるかのように扱うことができる。２値化の後、ステップ３３６で、調査データに対して規格化を実行する。規格化は、侵食および膨張という２つのステップからなる。侵食は以下のように実行される。画像Ｐに対して、対応する画像Ｐ’を構成する。Ｐ’内の点Ｘ’は、（１）Ｐ内の対応する点Ｘが白である場合、または（２）Ｘのいずれかの隣接点が白である場合、に白と宣言される。いずれの条件も満たされない場合、Ｘ’は黒と宣言される。Ｐ’は、侵食の結果得られる画像である。膨張は逆の形で作用する。画像Ｒに対して、対応する画像Ｒ’を構成する。Ｒ’内の点Ｙ’は、（１）Ｒ内の対応する点Ｙが黒である場合、または（２）Ｙのいずれかの隣接点が黒である場合、に黒と宣言される。いずれの条件も満たされない場合、Ｙ’は白と宣言される。Ｒ’は、膨張の結果得られる画像である。数回の侵食および膨張の合成によって、２値画像はより規則的になる（単一の黒点および単一の白点が消失する）。
【０１２８】
規格化を実行した後、結果として得られる調査データを、連結コンポーネントの抽出を行うステップ３３８に渡す。このステップで、調査データは、連結コンポーネントが画定されるように走査される。調査データ内の所与の黒点の対に対して、その対は、その２点の間を黒点の連鎖によって連結することができる場合に同一コンポーネントに属すると定義される。このステップの主な目的は、調査データを、白い空間で互いに分離された連結した黒コンポーネントの集まりに分解することである。
【０１２９】
図２７に、連結コンポーネントの抽出におけるサブステップを示す。第１ステップ３５０は、初期コンポーネント番号を割り当てることを含む。調査データは、走査中に遭遇した最初の黒点に「０」を割り当て、次に「１」を割り当て、というように走査される。白点にはすべて「−１」を割り当てる。ステップ３５２で、初期走査方向が設定される。次の４つの方向がある：
（１）「＋＋」は、上から下、左から右を表す。
（２）「＋−」は、上から下、右から左を表す。
（３）「−＋」は、下から上、左から右を表す。
（４）「−−」は、下から上、右から左を表す。
最初に、走査方向は「＋＋」に設定される。これは、上から下、左から右を意味する。ステップ３５４で、調査データを以下のように走査する。黒点Ｐについて、その隣接黒点Ｐ’の（ステップ３５０で割り当てられた）割当て番号がＰの割当て番号より小さいようなあらゆる黒点Ｐが、Ｐ’の割当て番号をとる。例えば、Ｐの番号が７であり、その隣接点Ｐ’に番号６を有するものがある場合、Ｐの新たな番号は６である。
【０１３０】
次に、変更判断ステップ３５６に進む。アルゴリズムは、ステップ３５４で調査データ内のいずれかの黒点に新しい番号が割り当てられたかどうかをチェックする。その通りである場合、ステップ３５８で、走査方向が変更される。方向の変更は以下のルールに従う：
（１）現在の方向が「＋＋」である場合、新しい方向は「＋−」である。
（２）現在の方向が「＋−」である場合、新しい方向は「−＋」である。
（３）現在の方向が「−＋」である場合、新しい方向は「−−」である。
（４）現在の方向が「−−」である場合、新しい方向は「＋＋」である。
ステップ３５４で、新しい方向を用いて走査が再び開始される。このサイクルは、コンポーネント番号の変化を検出せずに走査を完了することができるまで継続する。コンポーネント番号変化時に走査方向を変えることにより、プロセスに必要な走査パス数が少なくなる。
【０１３１】
ステップ３５６の後、連結コンポーネント内のすべての点は同じ番号を有するはずである。ステップ３６０で、コンポーネント内の点の番号を再割当てする。このステップが必要であるのは、いくつかの番号が消失しているかもしれないからである。例えば、初期調査データ中に２０個の黒点があった場合、各点は０から１９までの番号を取っていたであろう。走査後に５個のコンポーネントがあることが分かった場合、２０個の初期番号のうちの５個は消失しているであろう。これにより、例えば番号１、４、９、１６、および１８を有する５個のコンポーネント内の黒点が残る。再付番(re-enumeration)ステップは、これらの５個のコンポーネント内の点に０から４までの番号を再割当てする。一般に、調査データ内にＮ個のコンポーネントがある場合、０からＮ−１までの付番が行われる。これにより、連結コンポーネント抽出のプロセスが完了する。
【０１３２】
図２５に戻って、連結コンポーネントの抽出（ステップ３３８）の後、ウィンドウ内に入るコンポーネントを見つけるステップ（ステップ３４０）に進む。ある一定の論理的制限を満たす最大の黒コンポーネントが選択される。論理的制限としては、ディスク上に存在し得るウィンドウ数およびウィンドウ間の近似的距離がある。これにより、ウィンドウを見つけるプロセスが完了し、（図２３における）矩形選択の全プロセスは、次のステップであるウィンドウ内で標準矩形をクロッピングするステップ（ステップ３０６）に移る。
【０１３３】
（１）最大合計照度を有し、（２）ウィンドウに対応するコンポーネントの点の１つを中心とする、標準矩形を見つけるために、このコンポーネントを含む領域を以下のように走査する。まず、アルゴリズムは水平方向に走査を行い、図２６に示したようなスライド平均を計算する。次にアルゴリズムは垂直方向に走査を行いスライド平均を計算する。これは、調査データ配列内のいくつかの行にわたり垂直に連なるセグメントを作成することを含む。セグメントは、ウィンドウの高さにほぼ等しい長さを有するであろう。水平スライド平均および垂直スライド平均のうちの最大平均の交点を、評価矩形の中心と宣言する。この点は、ウィンドウ内の最も明るいスポットであるので、最大値を有する。その点が評価矩形の中心として選択される。中心を画定した後、ステップ３１２で、中心点から測ることによって、１×２ｍｍ（標準サイズ）の評価矩形を作成する。図２８に、本発明の一実施形態によるソフトウェアディスプレイ上で、ウィンドウを見つけた後の評価矩形のクロッピングの結果を示す。
【０１３４】
中心点を見つける他の技法としては、エッジ追跡を用いてウィンドウを見つける技法、ウィンドウの（点の値を用いた）重心を見つける技法、および調査データを表す画像を調べることによって手動で点を選択する技法がある。
【０１３５】
ステップ２ｂ：ウィンドウなしディスクにおける評価矩形の選択
評価矩形を選択する際の第２の選択肢は、図２３のウィンドウなしバイオディスクのステップ３０８の場合である。一実施形態は、評価矩形のための所望の位置を見つけるために、ディスク上のダークスポットを使用する。アルゴリズムはステップ３１０（図２３）から開始され、ディスク上のサンプルのさまざまな領域をインデックス付けするためのインデックスマーカーとして働くダークスポットを見つける。ダークスポットは、図２６に関連して説明したウィンドウを見つける際に使用されるスライド平均を用いたプロセスと同様に見つけることができる。今度はターゲットが（ウィンドウではなく）はるかに小さいダークスポットであるので、ダークスポットを見つける際に使用されるセグメントははるかに短い。それらの長さはダークスポットのサイズにほぼ等しい。しかし、スライド平均を求める動作原理は同じままである。最小のスライド平均を有するセグメントがダークスポットとして同定される。
【０１３６】
図２９に、ダークスポット３６６の一例を示す。ステップ３１２（図２３）で、ダークスポットが見つかった後、アルゴリズムは、ダークスポットからシフトして評価矩形を作成する。標準サイズの評価矩形をクロッピングする。ここで矩形の中心は、見つかったダークスポットから所定距離シフトすることによって見出される点に位置する。図３０に、見つかったダークスポット３６６から所定距離シフトした後にクロッピングされた評価矩形３６８の一例を示す。破線の楕円３６８、３７０、および３７２は、他の細胞領域を同定している。本発明の好ましい一実施形態では、評価矩形の位置情報をディスクに埋め込むことができる。ダークスポットを見つける代わりに、システムはディスクから位置情報を読み出し、評価矩形を配置するための領域を見つけることができる。
【０１３７】
ステップ２ｃ：ユーザ選択オプションを含む評価矩形の選択
最後に、評価矩形の選択における第３の選択肢は、図２３のステップ３１６に示すように、ソフトウェアユーザインタフェースを通じてのユーザからの入力を含む。画面上に、調査データに基づいて作成されたバイオディスクの画像がユーザに対して示され、ユーザは画像上で矩形を画定することによって評価矩形を選択する。ステップ３１６で、ユーザが選択した矩形が標準サイズより大きいかどうかを判断する。大きくない場合、ユーザの矩形が標準サイズより小さいことを意味する（ステップ３１８、図２３）。この場合、ユーザが選択した矩形をステップ３２２での計数のために使用する。ユーザの矩形が標準サイズより大きい場合（ステップ３２０、図２３）、ステップ３２４で、ユーザが選択した矩形から標準サイズ評価矩形をクロッピングする。
【０１３８】
ステップ３：バックグラウンド照度均一化
図３１は、図２２のステップ２４８のさらに詳細な説明を与えている。評価矩形が選択された後、評価矩形を境界とする領域（「調査データ領域」という）でバックグラウンド照度均一化を実行する。このステップの主な目的は、バックグラウンド雑音を除去することにより、バックグラウンドをより一様にすることである。これを達成するため、バックグラウンド照度均一化は、ソフトウェアアルゴリズムを用いて、電気的実施態様における利得制御の効果をシミュレートする。
【０１３９】
図３１のステップ３８０で、（評価矩形内の）近傍矩形の標準サイズを選択する。なお、近傍矩形を評価矩形と混同しないように注意されたい。近傍矩形は、単一の評価点の周りにあるように形成される。そのサイズは、細胞よりは十分に大きいが、バックグラウンド照度の非一様性によって影響を受ける程度には小さいように選択される。他の検定法では、調査特徴物は、細胞である代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。したがって、近傍矩形のサイズは、行われる検定法のタイプに基づいて選択される。近傍矩形のサイズは、所与の点Ｐに対して、Ｐの近くのいくつの点がバックグラウンド照度均一化のプロセスのために評価されるかを決定する。
【０１４０】
ステップ３８２および３８４でそれぞれ垂直走査および水平走査を実行して、調査領域内の各点に対する平均Ｋを計算する。
【０１４１】
Ｋは以下のように導出される。まず、垂直走査を実行する。一実施形態では、調査データ領域内のすべての点に対する垂直平均をまず計算する。点（ｘ，ｙ）に対する垂直平均Ｋｖｅｒｔは、（ｘ，ｙ−ｄｙ）から（ｘ，ｙ＋ｄｙ）までの範囲内のすべての点の平均値である。結局、すべての列が垂直方向に走査される。項ｄｙは、ステップ３８０で決定したサイズを有する近傍矩形の高さの半分である。図２６で説明したスライド平均計算技法をここで適用する。ただし、今の場合以外、プロセスは垂直方向に進む。
【０１４２】
すべての点に対してＫｖｅｒｔが求められた後、水平走査を以下のように実行する。点（ｘ，ｙ）に対して、その点に対する最終平均Ｋは、（ｘ−ｄｘ，ｙ）から（ｘ＋ｄｘ，ｙ）までの範囲内の点に対するすべてのＫｖｅｒｔの平均を取ることによって与えられる。結局、行が水平方向に走査される。項ｄｘは、ステップ３８０で決定したサイズを有する近傍矩形の幅の半分である。全体の効果は、特定の点Ｐに対して、Ｐと同じ行にありＰの近傍矩形内にあるすべての事前に計算されたＫｖｅｒｔの値を平均してＰに対する最終平均を得ることである。Ｋｖｅｒｔの値の事前計算は計算時間を短縮する。計算時間は、調査データ領域内のサイズに近傍矩形のサイズを乗じたものに比例するのではなく、調査データ領域にのみ比例する。
【０１４３】
引き続き図３１を参照すると、ステップ３８６で、各点Ｐの値ＶをＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ＋（Ｖ−Ｋｎｅｉｇｈｂｏｒ）に再割当てすることによって均一化を実行する。ここでＫｎｅｉｇｈｂｏｒは、Ｐの近傍矩形の境界内のすべての点にわたる平均値である。一実施形態では、バックグラウンド値Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは、調査データ領域全体にわたる平均値であるように設定される。別の実施形態では、Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは２，０００に設定される。Ｐの新しい値が４，０００より大きい場合、４，０００が使用される。Ｐの新しい値が１より小さい場合、１が使用される。前に０であったＰの値は２，０００で置き換えられる。このステップの後、調査データのいかなる大きい領域内の平均値も約２，０００となる。すなわち、バックグラウンド全体が任意のバックグラウンド値Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを有する平面に近づく。図３２はバックグラウンド照度均一化前にソフトウェアによって表示された調査データを示し、図３３はバックグラウンド照度均一化後にソフトウェアによって表示される調査データを示している。画像化された調査データ５７２は、ある画像フォーマットでレンダリングされた調査データであるが、調査対象のデータを示している。図３２および図３３の両方において、画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞をマーキングし、またはそれに対応している。スライド平均を使用する代わりに、別の実施形態は、バックグラウンド照度均一化のステップでフーリエ変換（ＦＴ）を使用する。フーリエ変換を実行する際には、まず調査データを周波数領域に変換する。次に、周波数領域におけるスペクトルの一部を除去する。これは、バイオディスクおよび回路における電気的雑音およびその他の不整動作によって発生するバックグラウンド雑音の一部を除去する。一実施形態では、非常に短い、または非常に長い波長のスペクトルを除去する（周波数は波長分の１である）。これらの除去される波長のしきい値は実験的に決定される。最後に、逆変換を実行してデータを空間領域に戻す。
【０１４４】
ステップ４：規格化
図３４に、図２２のステップ２５０に関わるステップを詳細に示す。本明細書において上記の概要で述べたように、標準偏差の値を約６００に等しくし、調査データの平均の値を約２，０００に等しくするために、規格化が必要である。規格化はまた、ソフトウェアがハードウェアの変更および調整から影響を受けにくいようにする。例えば、図１０Ａの上部検出器１５８のような検出回路における信号利得は、結果として得られる細胞計数に実質的に影響を及ぼさずに変更可能である。
【０１４５】
これを達成するため、一実施形態では、ステップ３９０でプロセスが開始され、前のステップ（バックグラウンド照度均一化）の結果として得られた調査データに対する平均Ａおよび標準偏差Ｓの計算を行う。値が０の点は無視される。ステップ３９２（図３４）で、調査データ内の各点に対して規格化を以下のように実行する。一実施形態では、あらゆる点Ｐに対して、Ｐの値ｖを２，０００＋（ｖ−Ａ）×６００／（Ｓ）で置き換える。（ｖ−Ａ）のコンポーネントは各点を中心に移す一方、コンポーネント（６００／Ｓ）は振幅を調節する。その結果をバックグラウンド値２，０００に加算する。６００という値は、所望の振幅範囲を得るように調節することができる。図３６の値グラフ４００に、規格化後のグラフの一例を示す。なお、値グラフは２，０００前後を推移し、変動の振幅は６００付近にとどまっていることに留意されたい。
【０１４６】
Ｐの値が規格化された後、以下のように切り詰め（ステップ３９４）を実行する。１）Ｐの新しい値が４，０００を超える場合、値を４，０００に切り詰める。２）Ｐの新しい値が１を下回る場合、値を１に切り詰める。
【０１４７】
一実施形態では、ソフトウェアのグラフィカルユーザインタフェースが、調査データ内のすべての点のヒストグラムを表示して、ユーザに規格化のプロセスを見せる。図３５に、規格化ステップ中にソフトウェアによって表示される調査データ例の一部を示す。画像化された調査データ５７２は調査対象のデータを示している。図３５で、画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞を表し、またはそれに対応している。入力ボックスは、規格化の範囲を尋ねている。表示されているように、１〜４，０００の値が使用されている。所望に応じていかなる値範囲も使用可能であることは理解されよう。
【０１４８】
図３６に、規格化ステップ後のソフトウェアディスプレイを示す。上側ウィンドウ３９６は調査データ例の一部の拡大図を示している。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞を表している。下側グラフ４００は、ウィンドウ３９６内の水平点線３９８によってたどられる点の対応する値を示している。下側グラフ４００は、調査データのバックグラウンド領域が規格化されている（すなわち、小さい雑音を伴う定常値）一方、細胞の領域はグラフ内で顕著な「スパイク」を有することを示している。例えば、下側グラフ４００において、スパイク信号４０２はその特定位置における特異的な細胞例４０４に対応する。スパイク信号４０２は、バックグラウンド雑音４０６とは明瞭に異なる。これが細胞認識のプロセスを容易にする。
【０１４９】
ステップ５：フィルタリング
図３７に、図２２のステップ２５２に関わるステップを詳細に示す。図３７のステップ４１０で、近傍矩形のサイズを選択する。これらの近傍矩形は、概念的には、バックグラウンド照度均一化のステップ（図２２のステップ２４８）で使用されるものと類似している。しかし、このステップで使用される近傍矩形はおよそ細胞のサイズであり、バックグラウンド照度均一化で使用されるものより小さい。ステップ４１２で、調査データ領域内の各点Ｐに対して、Ｐの近傍内でＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄとは「十分に異なる」値を有する点の個数を計算する。一実施形態では、Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄの値は２，０００に設定される。（当該点とＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄとの間の）どの程度の差が「十分に異なる」かの判断はしきい値数によって定義される。一実施形態では、しきい値数は、調査データの信号パターンを調べてバックグラウンド値と細胞（またはサンプル中の他の対象物体）の値との間の差を記録することによって決定される。他の検定法では、調査特徴物は、細胞である代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。他の実施形態では、しきい値数は、変動する条件に基づいてバックグラウンド雑音およびバックグラウンド値を決定する較正機構によって生成される。このような条件には、バイオディスクの反射率、バイオディスクドライブ内でのバイオディスクのアンバランス、バイオディスクのガタつき、振動または不安定性、電気的雑音、バイオディスクのメタライゼーション、関与するサンプルのタイプ（白血球かそれ以外か）、および較正調節による補償や補正を必要とするいかなる他の条件も含まれる。
【０１５０】
ステップ４１４で、「十分に異なる」点の個数について、当該個数が所定のフィルタリング基準より大きいかどうかをテストする。大きい場合、Ｐの値はステップ４１６の時のままとする。そうでない場合、ステップ４１８で、Ｐの値はＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ（または２，０００）に変更される。このステップの所望される効果は、雑音を除去して、細胞のみが調査データに残り、バックグラウンドが一様にＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに等しくなるようにすることである。図３８に、フィルタリングステップ後にソフトウェアによって表示される調査データ例を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞をマーキング、すなわち示している。なお、バックグラウンドが調査データ内の細胞と良好なコントラストを有することに留意されたい。図３９は、図３９の調査データの一部の拡大図を提供している。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞をマーキングし、またはそれに対応している。図３９の下側グラフ４２０によって示されているように、バックグラウンドがここでは水平線値を有し、細胞の領域がスパイク４２２によって明確に画定されている。向上したコントラストは、次のステップにおける細胞計数に役立つ。
【０１５１】
ステップ５ａ：不要コンポーネントの除去
図４０に、図２２のステップ２５４に関わるステップを詳細に示す。これは、細胞計数を妨害し得る空気泡、汚れ、およびクラックのような不要コンポーネントを除去するように設計された任意のステップである。ここで使用されるプロセスは、図２５に関連して説明したウィンドウを見つける際に使用されるプロセスに類似している。ステップ４２８（図４０）で、しきい値Ｔを選択する。一実施形態では、Ｔはバックグラウンド照度均一化のステップで求められるＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに設定される。次にステップ４３０で、２値化を実行する。ウィンドウを見つける際に使用される２値化ステップ（図２５のステップ３３４）と同様、ステップ４３０で、しきい値Ｔを超える値を有する点が黒と宣言される一方、残りは白と宣言される。これで調査データは白黒画像とみなすことができ、１ビットで表すことができる。ステップ４３２で、図２５のステップ３３６と同様にして、調査データに対して規格化を実行する。
【０１５２】
規格化を実行した後、結果として得られる調査データを、連結コンポーネントの抽出を行うステップ４３４に渡す。このステップで、調査データは、連結コンポーネントが画定されるように走査される。調査データ内の所与の黒点の対に対して、その対は、その２点の間を黒点の連鎖によって連結することができる場合に同一コンポーネントに属すると定義される。このステップの主な目的は、調査データを、白い空間で互いに分離された連結した黒コンポーネントの集まりに分解することである。ここで使用される連結コンポーネント抽出プロセスは、図２７で詳細に示したものと同一であってもよい。
【０１５３】
この除去プロセスにおける次のステップはステップ４３６であり、不整サイズのコンポーネントを除去することに関する。ユーザが選択したサイズしきい値をすべての連結コンポーネントに適用する。コンポーネントがサイズしきい値より小さいか、または大きい場合、そのコンポーネント全体が調査データから除去される。この手法が有効であるのは、不整コンポーネント（例えば泡、クラック）のサイズが通常、典型的な細胞サイズよりはるかに大きいからである。また、ユーザは、いかなるタイプの細胞が計数されるかに応じてしきい値を選択することができる。一実施形態では、除去は、コンポーネントのすべての点を一定値２，０００（バックグラウンド値）で置き換えることによって達成される。好ましくは、図４０の全ステップの完了時に、調査データは再処理のためにステップ２４８〜ステップ２５２（図２２）に戻されるべきである。
【０１５４】
図４１に、クラックの除去前の調査データの一例を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応している。図示のように、クラック５７４が領域全体にわたって分布している。図４２に、クラックの除去後の、図４１と同じ調査データを示す。画像化された調査データ５７２のうち、捕捉された細胞をマーキングしているもののみが残っている。
【０１５５】
ステップ６：輝中心による細胞計数
次に図４３を参照すると、図２２のステップ２５６に関わるステップが詳細に示されている。ステップ４４０（図４３）で、調査データに対して畳込みを実行する。畳込み中に、畳込み画像を表す補助配列が形成される。畳込み画像内の各点Ｐは、Ｐの円形近傍におけるフィルタリング後の調査データの積分の結果である。当業者には理解されるように、画像処理で使用される一般的な畳込み方法は２つの関数に関わる。２つの関数ｆ，ｇ：Ｒ２→Ｒの畳込みは次の関数である。
【０１５６】
【数１】
より正確には、本発明の一実施形態では、積分される関数ｆは次の関数である。
ｆ（ｘ，ｙ）＝ｈ（ｘ，ｙ）−２，０００ ｈ（ｘ，ｙ）＞２，０００の場合、または
＝０ ｈ（ｘ，ｙ）≦２，０００の場合
ここで、ｈ（ｘ，ｙ）は前のステップでｘ，ｙにある点の値を記述する関数である。ｆ（ｘ，ｙ）が確定した後、円形近傍指標関数(indicator function)ｇとの畳込みを実行する。ここで：
ｇ（ｕ，ｖ）＝１ ｕ２＋ｖ２≦ｒ２の場合、または
＝０ その他の場合
であり、ｒは細胞の予想半径である。畳込み積分は次の通りである。
【０１５８】
【数２】
積分は、次式で定義される円形近傍内にあるすべての格子点（ｕ，ｖ）におけるｆの値の和をとることで置き換えられる。
（ｕ−ｘ）２＋（ｖ−ｙ）２＜ｒ２
畳込み後、ステップ４４２（図４３）で、畳込み画像に対して局所最大値の探索を実行する。畳込みステップは、調査データ内の輝中心を局所最大値として目立たせ、より容易に認識されるようにする。整数値が使用されるので、丸めが冗長な局所最大値を生じることがある。これを補正するため、ステップ４４４で、同一閉近傍内にある冗長な局所最大値を除去する。次にステップ４４６で、残りのすべての局所最大値を細胞の中心と宣言する。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。局所最大値は、これらの検定法でターゲットとなるこれらの物体すなわち調査特徴物の中心を見つけるために使用される。本発明の他の実施形態では、計数方法は細胞凝集の効果を考慮する。互いに近い最大は自動的には無視されない。一実施形態では、付近にくぼみのある局所ピークが細胞の中心と宣言される。凝集した細胞が調査データに現れる場合に、冗長な局所最大値を定義する距離しきい値がより小さく調節されるように、パラメータを調節することができる。同様に、計数される細胞のタイプに応じて距離しきい値を調節することができる。例えば、赤血球はより一貫性のあるサイズを有するので、仮定される細胞サイズを距離しきい値とすることができる。
【０１６０】
別の実施形態では、細胞の分布に対して統計分析を実行することができる。この場合、視認性が低かったり細胞が凝集していたりして他の方法では計数できない領域で細胞数を推定するために、面積当たりの平均細胞数を使用することができる。他の検定法では、細胞は代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターであってもよい。別の実施形態では、ユーザがより高い解像度で調査データ領域を再サンプリングして、より完全で正確な計数を実行することができる。
【０１６１】
図４４に、輝中心法により計数された細胞で満たされている調査データ例を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞をマーキングしている。輝中心法で実行されるステップは、細胞がバックグラウンドの暗いコントラストに対して明るく見えるように細胞を強調するのに役立つ。ソフトウェアによって示されているように、細胞は個別にマーキングされ計数される。図４５は、図４４に示されている調査データの一部の拡大図および値トレースグラフを示している。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応している。
【０１６２】
ステップ７および８：暗縁による細胞マーキングおよび細胞の追加計数
ステップ７および８（図２２）は、細胞計数の精度を向上させるために実行可能な任意のステップである。図２２で、それらはステップ２５８および２６０として参照されている。これらの２つの任意ステップは、細胞に輝中心がないままとなり得るハードウェア構成の場合に細胞の過小計数を補正するために使用可能である。他の検定法では、本方法を細胞に適用する代わりに、本発明の光学系の入射ビームにより検出可能なサイズのビーズ（ビーズ検定法）、凝集物質、沈殿（酵素反応）、または他の生物学的レポーターに適用してもよい。別法として、これらの２つのステップは、輝中心を認識することによって細胞を計数する代わりに使用されてもよい。
【０１６３】
一部の細胞が輝中心を認識する方法によって計数されている場合、ステップ７を実行して、これらの計数された細胞をマーキングし、それらを調査データから除去する。次に、暗縁を有する細胞を認識することによる計数を行うことができる。図４６Ａに、図２２のステップ２６０（主要ステップ８）に関わるステップを詳細に示す。ステップ４５０で、調査データに対して反転を実行する。各点Ｐにおける値ｖを２，０００−ｖで置き換える。結果として得られる値が負の場合、それを０で置き換える。数式の形で反転を表すと、次のようになる。
ｈ（ｘ，ｙ）を前の調査データとすると、ｆ（ｘ，ｙ）を次のように作る。
ｆ（ｘ，ｙ）＝２，０００−ｈ（ｘ，ｙ） ｈ（ｘ，ｙ）＜２，０００の場合
＝０ その他の場合
これは、低いデータ値を有する暗縁が、畳込みを実行する時に高い値を有することを保証する。ステップ４５２で、シフトした円環との畳込みを実行する。当業者には理解されるように、画像処理で使用される一般的な畳込み方法は２つの関数に関わる。２つの関数ｆ，ｇ：Ｒ２→Ｒの畳込みは次の関数である。
【０１６４】
【数３】
畳込みを数式の形で表すと、次のようになる。
【０１６６】
【数４】
円形近傍指標関数ｇとの畳込みを実行する。ここで：
ｇ（ｕ，ｖ）＝１ ｕ２＋ｖ２≦ｒ２の場合、または
＝０ その他の場合
であり、ｒは細胞の予想半径である。この実施形態では、ｇは内側半径ｒ１および外側半径ｒ２を有する円環の指標関数であり、ｒ１およびｒ２はｒ、すなわち細胞の予想半径の限界である。これにより次式が得られる。
【０１６８】
【数５】
積分は、円環内にあるすべての格子点（ｕ，ｖ）におけるｆの値の和をとることで置き換えられる。畳込みを４回実行するため、次の４つの関数をとる。
ｆ１（ｘ，ｙ）＝ｆ（ｘ＋ｈｘ，ｙ）
ｆ２（ｘ，ｙ）＝ｆ（ｘ−ｈｘ，ｙ）
ｆ３（ｘ，ｙ）＝ｆ（ｘ，ｙ＋ｈｙ）
ｆ４（ｘ，ｙ）＝ｆ（ｘ，ｙ−ｈｙ）
ここで、ｈｘおよびｈｙはｘおよびｙ方向の特定のシフトである。それらは細胞の推定サイズの半分に等しい。４つの関数は、内側半径ｒ１および外側半径ｒ２を有する円環の指標関数と畳込みを４回実行することを意味している。値ｒ１およびｒ２はそれぞれ、細胞の予想半径ｒの最小値および最大値の限界である。畳込みの４回のパスが、左、右、上、および下方向に距離ｒだけシフトした円環と実行される。図４６Ｂにこのような一例を示す。まず、細胞の暗縁の境界となる円環４５８を作成する。４個のシフトした畳込みが４個の円環を作り出す。ステップ４５４（図４６Ａ）で、４個のシフトの結果の和をとる。再び図４６Ｂに戻ると、和をとった円環が点４５７に局所最大値を作り出しているのが分かる。そこで、点４５７をこの細胞の局所最大値であると宣言し、計数する。なお、図４６Ｂは細胞に適用された一例であることに留意されたい。畳込み円環が細胞の暗縁の境界となっていない場所には、最大は存在しないであろう。このように、畳込みステップは、細胞の暗縁を強調することによって潜在的な細胞を見出す。ステップ４５６（図４６Ａ）で、計数ステップは畳込み後の調査データを調べ、局所最大値を計数する。
【０１７０】
図４７に、この方法により見つかった（計数された）細胞が十字印でマーキングされた調査データの画像を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応している。十字印５８０は計数された細胞をマーキングしている。
【０１７１】
別法として、畳込みステップは、次の形の式に従って実行することができる。
Ｆ（ｘ，ｙ）＝ｆ１（ｘ，ｙ）＋ｆ２（ｘ，ｙ）＋ｆ３（ｘ，ｙ）＋ｆ４（ｘ，ｙ） ｆ１、ｆ２、ｆ３、またはｆ４の少なくとも３個（または別法として、２個）が０より大きい場合、および
Ｆ（ｘ，ｙ）＝０ その他の場合
なお、この畳込みは、関数のうちの２個または３個が０より大きい場合に、円環をシフトせずに実行されることに留意されたい。畳込みステップに対する別の別法として、関数ｆとの畳込みをとるために、広く知られている平滑化関数を使用するものがある。この畳込みステップおよび輝中心を認識する際に使用されるものの両方に適用可能なさらにもう１つの別法では、異なる指標関数ｇが使用される。その特定の一実施形態では、ｇは、次の形のガウス関数：
【０１７２】
【数６】
または、細胞の特徴を強調する目的で畳込みを実行するための他の好適な関数であり得る。
【０１７４】
ステップ９：データ出力
ステップ９で、適当なディスプレイ機構にデータを出力する。ソフトウェアの一実施形態は、評価矩形を境界とする調査データ領域に対する細胞計数の結果を表示するためのユーザインタフェースを有する。別の実施形態は、図４７に示されているように各細胞が十字印でマーキングされた調査データ領域の画像を表示する。
【０１７５】
Ｂ．赤血球の例
当業者には理解されるように、データ分析の種々のステップおよび方法を、種々のタイプの調査データを分析するために異なる形で組み合わせることができる。図４８は、調査データ内の赤血球を計数する一例を示すフローチャートを提供している。ステップ４６０で、しきい値を選択し、２値化を実行する。ここで、しきい値を超える値を有する点が黒と宣言される一方、残りは白と宣言される。この２値化のステップは、通常は細胞を表す高めの値の点と、通常はバックグラウンドまたはバックグラウンド雑音を表す低めの値の点とを分離する。
【０１７６】
図４９に、ステップ４６０が実行される前の調査データの画像表示を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応している。図５０に、２値化（ステップ４６０）の結果を示す。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングし、または示している。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は細胞を示している。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は細胞を表していないデータを示している。
【０１７７】
次にステップ４６２（図４８）で、規格化、侵食、および膨張を構成する２つの部分を実行して、細胞境界の欠損部分を塗りつぶす。ここでの目標は、個別の細胞を明確に区画する細胞境界を得ることである。図５１に、侵食および膨張（ステップ４６２）の結果を示す。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は細胞をマーキングしている。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は、細胞を表していないデータを示している。
【０１７８】
図４８のステップ４６４で、各細胞について１ピクセル幅細胞境界を抽出する。図５２に、１ピクセル幅境界を抽出（ステップ４６４、図４８）した結果を示す。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は、細胞をマーキングしている。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は細胞を表していないデータを示している。１ピクセル幅境界を抽出する際に、黒および白の両方の隣接点を有するすべての黒点はそれらの黒色を保持するように選択される。両方の色の隣接点を持たない黒点は白に変換される。これにより、数ピクセル幅の場所にある粗い境界ができる。次に、細線化プロセスを適用して、調査データ内の形状の輪郭に１ピクセルだけが残るまで境界の余分な点を除去する。細線化プロセスは、それぞれの黒領域の境界を区画するのが１ピクセル幅の線だけになるまで、境界から冗長な黒点を除去する。図５２に示すように、図５１には存在した、細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８が今度は存在しない。
【０１７９】
細線化プロセスは、まず粗い境界から出発する。粗い境界は、細胞の内側および外側の両方の隣接ピクセルを含むすべてのピクセルからなる。粗い境界の抽出後、データは次の３つのカテゴリからなる。
（１）細胞の内部のピクセル、
（２）細胞の境界を区画するピクセル、および
（３）細胞の外部にあるピクセル。
この３つは、次の３つの条件によって関連づけられている。
（Ａ）３つともすべて連結である、
（Ｂ）（１）は（２）によって（３）から切断されている、そして最後に、
（Ｃ）（２）の各点は（１）または（２）に隣接点を持つが、その両方には持たない。
次に、細線化プロセスは、（２）内のピクセルを１個ずつ調べる。（２）内のピクセルＰが（１）または（３）に隣接点を有する場合、Ｐの色を（例えば黒から白へ）付け替えて（２）から（１）または（３）に移しても条件（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）が保たれるかどうかのチェックを実行する。保たれる場合、色の付け替えを行う。この色の付け替えは、各細胞について１ピクセル幅の境界が得られるまで実行される。
【０１８０】
１ピクセル幅境界が抽出された後、１ピクセル幅境界によって画定される領域を黒点で塗りつぶす（ステップ４６６、図４８）。図５３に、ステップ４６６の結果を示す。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は細胞をマーキングしている。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は、例えば図５１に見られるように、細胞を表していないデータを示している。この白黒の点集合をマスクとして用いて、もとのデータ点を充填して黒点を置き換える。こうして、細胞領域が分離され、分析の準備が整うことになる。
【０１８１】
図５４に、もとのデータ点を充填した結果を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞をマーキングしている。この方法の利点は、細胞を精度良く抽出できることにある。この抽出により、ユーザは、細胞径を測定し、染色された細胞核の形態等の細胞内の他の特徴を調べることができる。このタイプの応用に関するさらなる詳細は、同一譲受人に譲渡された「Nuclear Morphology Based Identification and Quantification of White Blood Cell Types Using Optical Bio-Disc Systems」と題する２００２年９月６日出願の米国特許出願第１０／ｘｘｘ，ｘｘｘ号（これは参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０１８２】
画像化された細胞を調べることに加えて、ユーザは、本発明のユーザ機能を使用することにより細胞をマーキングし計数することができる。図５５は、図４９〜図５４の調査データのもとの画像表示の拡大図であり、赤血球が十字印でマーキングされ、それらが計数されたことを示している。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応している。十字印５８０は計数された細胞をマーキングしている。
【０１８３】
Ｃ．代替アルゴリズム
本発明は、細胞計数の作業中に生じ得る特殊な状況を扱うためのいくつかの代替アルゴリズムを含む。
【０１８４】
図５６Ａ〜図６４は、明瞭な輝中心または暗縁のない細胞を計数する場合を扱う本発明の一実施形態を示している。この方法は「絶対値計数」と呼ばれ、細胞に明瞭な輝中心または暗縁がないように見える場合を主として扱う。輝中心法は、調査データ内の高い値の領域（ブライトスポット）を分離して細胞を計数することに基づいている。暗縁法は、調査データ内の低い値の領域（ジムスポット）を分離して細胞を計数することに基づいている。これに対して、この絶対値計数法は、前の２つの方法のいずれかによって検出可能な明瞭に高いまたは低い値を有していないかもしれないが、それにも関わらずバックグラウンド雑音から識別可能な値パターンを含むような領域を分離する。
【０１８５】
図５６Ａは、絶対値計数法によって十字印でマーキングされる前のばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞を表している。図５６Ｂは、絶対値計数に関わるステップを示すフローチャートである。ステップ４８０で、調査データに対して規格化およびフィルタリングを実行する。図５７は、規格化およびフィルタリングのステップ（ステップ４８０、図５６Ｂ）の後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応している。規格化およびフィルタリングのプロセスは、本明細書において上記で説明したものと同じプロセスである。
【０１８６】
規格化およびフィルタリングの後、次のステップはバックグラウンド除去および２値化（ステップ４８２、図５６Ｂ）に関わる。図５８は、バックグラウンド除去および２値化のステップの後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は細胞を示している。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は、細胞を表していないデータを示している。バックグラウンドは除去され、細胞が位置する場所が分離されている。次に、調査データに対して２値化を実行し、調査データ内の白黒の点を生成する。２値化のプロセスは以下のように進行する。まず、各点の値を調べる。点の値とバックグラウンド値との差が所定しきい値数より大きい場合、その点を黒と宣言する。そうでない場合、その点を白と宣言する。一実施形態では、しきい値数は、バックグラウンド値とはほとんど異ならない点（バックグラウンドまたはバックグラウンド雑音）が白となり、バックグラウンド値とは大きく異なる点（細胞の暗または明領域）が黒となるように選択される。他の実施形態では、しきい値数は、変動する条件に基づいてバックグラウンド雑音およびバックグラウンド値を決定する較正機構によって生成される。このような条件には、バイオディスクの反射率、バイオディスクドライブ内でのバイオディスクのアンバランス、バイオディスクのガタつき、振動または不安定性、電気的雑音、バイオディスクのメタライゼーション、関与するサンプルのタイプ（白血球かそれ以外か）、および補償や補正を必要とするいかなる他のタイプの条件も含まれる。
【０１８７】
規格化（ステップ４８４、図５６Ｂ）がプロセスにおける次のステップである。図５９は、規格化のステップの後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は、細胞を表している。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は細胞を表していないデータを示している。規格化は、侵食および膨張からなる。侵食は以下のように実行される。画像Ｐに対して、対応する画像Ｐ’を構成する。Ｐ’内の点Ｘ’は、（１）Ｐ内の対応する点Ｘが白である場合、または（２）Ｘのいずれかの隣接点が白である場合、に白と宣言される。いずれの条件も満たされない場合、Ｘ’は黒と宣言される。Ｐ’は、侵食の結果得られる画像である。膨張は逆の形で作用する。画像Ｒに対して、対応する画像Ｒ’を構成する。Ｒ’内の点Ｙ’は、（１）Ｒ内の対応する点Ｙが黒である場合、または（２）Ｙのいずれかの隣接点が黒である場合、に黒と宣言される。いずれの条件も満たされない場合、Ｙ’は白と宣言される。Ｒ’は、膨張の結果得られる画像である。数回の侵食および膨張の合成によって、２値画像はより規則的になる（単一の黒点および単一の白点が消失する）。
【０１８８】
１ピクセル幅境界抽出が次のステップである。この抽出ステップは、図５６Ｂではステップ４８６として参照されている。図６０は、１ピクセル幅境界抽出のステップ４８６を適用した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の一部の画像スクリーンショットである。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は、細胞に対応している。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は細胞を表していないデータを示している。１ピクセル幅境界を抽出する際に、黒および白の両方の隣接点を有するすべての黒点はそれらの黒色を保持するように選択される。両方の色の隣接点を持たない黒点は白に変換される。これにより、数ピクセル幅の場所にある粗い境界ができる。次に、細線化プロセスを適用して、調査データ内の形状の輪郭に１ピクセルだけが残るまで境界の余分な点を除去する。細線化プロセスは、それぞれの黒領域の境界を区画するのが１ピクセル幅の線だけになるまで、境界から冗長な黒点を除去する。
【０１８９】
細線化プロセスは、まず粗い境界から出発する。粗い境界は、細胞の内側および外側の両方の隣接ピクセルを含むすべてのピクセルからなる。粗い境界の抽出後、データは次の３つのカテゴリからなる。
（１）細胞の内部のピクセル、
（２）細胞の境界を区画するピクセル、および
（３）細胞の外部にあるピクセル。
これらの３つのカテゴリは、次の３つの条件によって関連づけられている。
（Ａ）３つともすべて連結である、
（Ｂ）（１）は（２）によって（３）から切断されている、そして最後に、
（Ｃ）（２）の各点は（１）または（２）に隣接点を持つが、その両方には持たない。
次に、細線化プロセスは、（２）内のピクセルを１個ずつ調べる。（２）内のピクセルＰが（１）または（３）に隣接点を有する場合、Ｐの色を（例えば黒から白へ）付け替えて（２）から（１）または（３）に移しても条件（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）が保たれるかどうかのチェックを実行する。保たれる場合、色の付け替えを行う。この色の付け替えは、各細胞について１ピクセル幅の境界が得られるまで実行される。
【０１９０】
１ピクセル幅境界が抽出された後、１ピクセル幅境界によって画定される領域を黒点で塗りつぶす（ステップ４８８、図５６Ｂ）。図６１は、本方法によるコンポーネントを塗りつぶすステップ４８８を実行した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の一部の画像スクリーンショットである。２値の画像化されたデータ５７６は調査対象のデータをマーキングしている。この場合、２値の画像化されたデータ５７６は細胞を示している。細胞をマーキングしていない２値の画像化されたデータ５７８は細胞を表していないデータを示している。この白黒の点集合をマスクとして用いて、もとのデータ点を充填して黒点を置き換える（ステップ４９０、図５６Ｂ）。こうして、細胞領域が分離され、計数が可能となる。一実施形態では、調査データ内の分離された領域に畳込みを適用して、局所最大値をマーキングし細胞を同定する。前に示した実施形態と同様、円形近傍との畳込みを適用することができる。畳込みで使用される円形近傍のサイズはおよそ細胞のサイズであるので、局所最大値は細胞の中心であると判断することができる。図６２は、調査データを塗りつぶすステップの後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞をマーキングしている。最後に、図６３に、図５６Ｂのステップ４９２によって計数され十字印でマーキングされた細胞を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応する。十字印５８０は計数された細胞をマーキングしている。図６３は凝集した細胞のみを示しているが、図６４は、単一細胞およびいくつかの凝集した細胞領域で疎に充填されたサンプルに、絶対値計数方法を適用したものを示している。これも同様に、画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞に対応し、十字印５８０は計数された細胞をマーキングしている。
【０１９１】
本発明の別の実施形態は、細胞計数のために区画された評価矩形の画面表示を増強する。細胞計数の過程で、評価矩形の画像をユーザに対して表示するのが望ましいことがある。サンプルの可視表現を提供することに加えて、高品質画像が、細胞を計数し分析するためにどの方法を使用すべきかをユーザが決める際に役立ち得る。例えば、明確な画像が、輝中心のない多くの細胞が存在することをユーザに警告するかもしれない。そこで、ユーザは暗縁法でも細胞を計数することを選択することができる。本実施形態は、高速フーリエ変換により画像の品質を向上させる。本開示を考慮すれば当業者には理解されるように、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）はフーリエ変換（ＦＴ）の一変種である。フーリエ変換のいかなる変種もここで同様に適用可能である。フーリエ変換についてはバックグラウンド照度均一化に関連して前に説明した。図６５は、本発明のこの実施形態を説明するフローチャートを提供している。ステップ５２０で、調査データに対して高速フーリエ変換を実行する。調査データは周波数領域に変換される。次にステップ５２２で、周波数領域におけるスペクトルの一部を除去する。最後にステップ５２４で、逆変換を実行する。図６６に、高速フーリエ変換前の調査データ例を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞を表している。図６７に、高速フーリエ変換後の同じ調査データを示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞を示し、十字印５８０は計数された細胞をマーキングしている。こうして画面表示が増強される。
【０１９２】
本発明の別の実施形態は、ウィンドウ領域の画面表示を扱う。ウィンドウ付きディスク上の細胞計数の過程で、ウィンドウ領域をユーザに対して表示するのが望ましいことがある。時には、ウィンドウ領域の画像は図６８に示すように歪んでいる。ウィンドウ領域を正しく表示するためには、歪みを補正する必要がある。補正方法の第１ステップは歪みの方向を求める。この歪みを求めるステップは、ウィンドウが、それ以外の暗いバックグラウンド（ここでは便宜上、白で示す）内にある明るい領域であることを利用する。用語を明確にするため、ウィンドウとは、上下に半円が付いた矩形であり、この矩形の幅を以下ではウィンドウの幅と呼ぶ。歪みを求めるステップは以下のように進行する。まず、画像のラインごとにその上の点を数値微分する。これは、あらゆる点（ｘ，ｙ）に対して、（ｘ−ｄｘ，ｙ）から（ｘ，ｙ）までの区間内のすべての点の平均値を（ｘ，ｙ）から（ｘ＋ｄｘ，ｙ）までの区間内の平均値から減算することを意味する。ここでｄｘは、雑音を除去するように選択された特定の区間長である。
【０１９３】
ウィンドウと重なる画像のラインについて、この減算の結果は、ウィンドウの左の境界で極大値をとり、右の境界で極小値をとる。この理由は、明るいウィンドウ内の平均値は暗いバックグラウンド内の平均値よりはるかに高いからである。ウィンドウの外部にある画像のラインにおいては、これらの最大値および最小値はどこか他の任意の場所で起こり得る。というのは、平均値は暗いバックグラウンドから、おそらくは多少雑音を伴って得られるからである。この性質を利用して、次のステップでは、最大値と最小値の間の距離Ｄをラインごとに計算する。次に、プロセスは、標準ウィンドウ幅に近いＤの値を有するラインを選択する。その後、これらの選択されたラインにおける最大点をマーキングする。最後に、これらの最大点の全体に直線を当てはめる。この直線の方向が歪みの方向である。図６９に、求められた方向直線とともに結果を示す。最後に、この方向直線をガイドとして用い、すべての点をそれに従って移動して、歪みを補正する。画像は正しく配列され、図７０に示すようにユーザに対して表示される。
【０１９４】
本発明の一実施形態は、調査データから泡トラックを除去する方法に関わる。時には、空気泡がディスク上のチャネル内にトラップされることがある。空気泡は、サンプル中を通過し、それが捕捉ゾーンを通る間にその経路上の一部の細胞を除去する。この細胞の除去が不整な細胞分布を引き起こすかもしれない。報告される最終結果は１平方ミリメートル（ｍｍ２）の面積当たりの細胞数の形式であるので、このような不整細胞分布は補正しなければならない。補正は以下のように実行される。図７１Ａにプロセスのフローチャートを示す。ステップ５４０で、細胞計数を前述のように実行する。次にステップ５４２で、細胞の分布を分析する。ステップ５４４で、細胞の局所密度が小さすぎる領域を無視する。というのは、これらの領域内の細胞は泡によって拭い去られた可能性が高いからである。
【０１９５】
一実施形態では、計数される領域全体を、ボックスからなるグリッドに分割する。図７１Ｂにその一例を示す。画像化された調査データ５７２は捕捉された細胞（円で表す）をマーキングしている。泡トラック５４８が、ボックス５５０、５５２、５５４、および５５６を境界とする領域を通り抜けている。トラック５４８より幅広い、もう１つの泡トラック５５８が、ボックス５６０、５６２、および５６４を境界とする領域を通り抜けている。これらのボックスを境界とする領域は無視される。このような領域を無視した後、図７１Ａのステップ５４６で、細胞数を再計算する。図７１Ｃおよび図７１Ｄに泡トラックの例を示す。図７１Ｃは、顕微鏡倍率５倍で見たサンプルを通る泡トラック（トラック５４８および５５８を含む）を示している。図７１Ｄは、もう１つの例を示しており、サンプルを通る泡トラック５４８が顕微鏡倍率４０倍で示されている。
【０１９６】
ＩＩＩ．白血球計数方法
図７２は、血液サンプル中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴリンパ球の絶対数およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋リンパ球数の比の迅速な決定のための一般的な均質固相細胞捕捉検定法が本発明の方法を利用してどのように実行され得るかの一例を提供している。バイオディスクに組み込まれた小さいフローチャネル内で行われる検査が、全血から単離された７〜１５μｌの単核細胞（ＭＮＣ）中の、捕捉ゾーン上の特異抗体によって捕捉されたＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２＋、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋、およびＣＤ４５＋細胞の数を決定する。検査は、ディスク上の局在位置での特異細胞捕捉の原理に基づいている。特定の血球表面抗原に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に基づく捕捉化学物質を局在させることにより、いくつかの特異細胞捕捉ゾーンをディスク上に作成する。２５〜１００μｌチャンバーをＭＮＣ血（１０，０００〜３０，０００細胞／μｌ）で満たした後、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１９、およびＣＤ４５抗原を発現している細胞をディスク内の捕捉ゾーンに捕捉する。捕捉ゾーン内には、画定した負および正の対照領域も組み込まれる。
【０１９７】
図７２のステップ１で、血液（４〜８ｍｌ）を、４または８ｍｌのBecton Dickinson CPT Vacutainer（商標）およびＥＤＴＡ、ＡＣＤ、またはヘパリン等の抗凝固剤中に直接採取する。本発明の別の実施形態の等価なステップでは、抗凝固剤中の血液３ｍｌをHistopaque 1077のような分離勾配１７６を含むチューブ１７２内に重層する。いずれの場合でも、血液サンプル１７４は採取から２時間以内に使用するのが好ましい。分離勾配１７６に血液サンプル１７４を重層したものを含むチューブ１７２を、水平ローターおよびスイングバケットを備えたバイオハザード遠心機で、１，５００〜１，８００ＲＣＦ（２，８００ｒｐｍ）で室温で２５分遠心する。遠心後、単核細胞（ＭＮＣ）分画１８０の上に血漿を約２ｍｍ残して血漿層１７８を除去する（ステップ２）。ＭＮＣ層１８０を採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。残っている血小板を除去するために、細胞を３００ＲＣＦ（１２００ｒｐｍ）で室温で１０分遠心してペレットにする。上澄みを除去してから、チューブを軽くたたいてＭＮＣペレット１８０をＰＢＳ中に再懸濁する。最終ペレット１８０を、バイオディスク１１０のフローチャネル１３０の高さに応じて、細胞数１０，０００〜３０，０００細胞／μｌに再懸濁する（ステップ３）。
【０１９８】
バイオディスク１１０のフローチャネル１３０を７μｌのＭＮＣ懸濁液で満たし、チャンバーの入口１２２および通気口１２４（図３および図５）を密封タブで密封する（ステップ４）。バイオディスク１１０を室温で１５分培養してから、光ドライブ１１２で７８０ｎｍレーザを用いて走査し、捕捉視野を画像化する（ステップ５）。透過バイオディスク１１０を使用する場合、光ドライブ１１２は、捕捉視野を画像化するための上部検出器１５８（図１０Ａ）を任意に含むことを理解されたい。好ましくは、以下の作業を自動的に実行するようにドライブに命令するためのソフトウェアがディスク上に符号化される：（ａ）１つまたは複数の段階で、ディスクを遠心して余分な結合していない細胞をスピン除去し、（ｂ）特異捕捉ウィンドウをディスプレイモニタ１１４上に画像化し、（ｃ）データを処理する。データ処理としては、各捕捉ゾーン内の特異的に捕捉された細胞を計数すること、およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋の比等の適宜プログラムされ得る所要の計数または比を導出することがあるが、これに限定されない。
【０１９９】
さらに図７２に示されているように、本発明は、光ディスクおよびディスクドライブを用いて表面抗原(cluster designation)計数を実行する方法に関する。本方法は、分離勾配を含む第１チューブに血液サンプルを提供するステップと、血液サンプルを各層に分離するのに十分な時間および速度で第１チューブを回転させるステップと、Ｔ細胞を含むＭＮＣ層を再懸濁してＭＮＣ懸濁液を形成するステップと、少なくとも１種の捕捉剤を含む少なくとも１つの捕捉ゾーンを含むディスク面上にＭＮＣ懸濁液のサンプルを用意するステップと、ディスクを光リーダに装填するステップと、ディスクを回転させるステップと、捕捉ゾーンに電磁放射の入射ビームを当てるステップと、捕捉ゾーンでディスクと相互作用した後に形成される電磁放射のビームを検出するステップと、検出されたビームを出力信号に変換するステップと、出力信号を分析して捕捉ゾーンに捕捉された細胞の数に関する情報を抽出するステップとを含む。この方法の一実施形態では、捕捉ゾーンに当てられ細胞と相互作用する光が反射されるように、光ディスクは反射層を備えて構成される。この方法の別の実施形態では、光ディスクは、捕捉ゾーンに当てられ細胞と相互作用する光が光ディスクを透過するように構成される。
【０２００】
分析／処理ステップ中に、ソフトウェアは各捕捉ゾーン画像を読み出し、細胞画像に遭遇するごとにそれをマーキングする。例えば、ソフトウェアは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の細胞数の推定後、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋の細胞数の比を計算し、全血１マイクロリットル当たりのＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ４５＋捕捉ゾーン内の細胞の絶対数とともにＣＤ４＋／ＣＤ８＋比を表示する。プロセス全体にかかる時間は、ディスクを光ドライブに挿入してから個数および比を得るまで約１２分である。
【０２０１】
一実施形態では、ディスクは、符号化情報層として３００ｎｍの金で被覆したフォワードウォブルセット(forward Wobble Set)ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０ ＣＤ−Ｒディスクである。反射ディスク上に、サイズ２×１ｍｍの長円形の観察ウィンドウを反射層から既知のリソグラフィ技法によりエッチングする。透過ディスクのいくつかの設計では、別個の観察ウィンドウはエッチングされず、ディスク全体が利用可能である。接着層は、Ｆｒａｙｌｏｃｋ接着剤ＤＢＬ ２０１ Ｒｅｖ Ｃ ３Ｍ９４６６１である。カバーは、直径０．０４０インチのサンプル入口４８個が半径２６ｍｍで等間隔に配置された透明ディスクである。データディスクは、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋計数ソフトウェアを用いて、４倍速、サンプルレート２．６７ＭＨｚでソフトウェアにより走査され読み出される。
【０２０２】
ＩＶ．結論
以上、実験室サンプル中の細胞を画像化し、当該画像を分析する方法および装置が、１つまたは複数の特定の実施形態とともに記載されている。本発明は、いくつかの好ましい実施形態を参照して詳細に説明されているが、本発明は記載通りの実施形態に限定されないことが理解されるべきである。むしろ、本発明を実施するための現在の最良の形態を記載している本開示を考慮すれば、当業者には、多くの変更および変形が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく自ずから明らかとなるであろう。したがって、本発明の範囲は、上記の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示される。請求項の均等の意味および範囲内に入るすべての変化、変更、および変形は、特許請求の範囲内にあるとみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】本発明によるバイオディスクシステムの画像表示である。
【図２】本発明とともに利用される反射バイオディスクの分解斜視図である。
【図３】図２に示したディスクの上面図である。
【図４】ディスクの相異なる層を切取断面で示した図２および図３のディスクの斜視図である。
【図５】本発明とともに使用される透過バイオディスクの分解斜視図である。
【図６】図５に示したディスクの上面図である。
【図７】図８に示すタイプの半反射層を含むディスクの相異なる層を切取断面で示した図５および図６の透過ディスクの斜視図である。
【図８】ディスクの半反射層の機能的態様を切取断面で示した図７のディスクを表す斜視図である。
【図９】金被膜の厚さと透過率の関係を示すグラフィカル表示である。
【図１０Ａ】本発明の一実施形態によるシステムの動作を示す斜視ブロック図表示である。
【図１０Ｂ】本発明の一実施形態による分割検出器および透過バイオディスクの断面を示す図である。
【図１１】形成されたフローチャネルを示す図２、図３および図４の反射光バイオディスクの半径に垂直にとった部分断面図である。
【図１２】形成されたフローチャネルおよび単一の上部検出器を示す図５、図６および図７の透過光バイオディスクの半径に垂直にとった部分断面図である。
【図１３】形成されたウォブル溝を示す図２、図３および図４の反射光バイオディスクの部分縦断面図である。
【図１４】形成されたウォブル溝および上部検出器を示す図５、図６および図７の透過光バイオディスクの部分縦断面図である。
【図１５】反射ディスクの全厚およびその初期屈折特性を示す図１１に類似の図である。
【図１６】透過ディスクの全厚およびその初期屈折特性を示す図１２に類似の図である。
【図１７】本発明の方法を用いたバイオディスクからのデータ収集のプロセスを示すフローチャートである。
【図１８】サンプリングされたアナログ信号から一次元配列として格納される対応するデジタル信号への変換の画像グラフィカル表示である。
【図１９】光バイオディスクのトラックを基準として配置されている捕捉白血球が入射ビームとの相互作用後に信号含有ビームを生じる様子を示す光ディスクの斜視図と、指示部分の拡大詳細図である。
【図２０】Ａは、本発明による光バイオディスクのトラックを基準として配置されている白血球のグラフィカル表示である。 Ｂは、本発明による図２０Ａの白血球から導出される一連のシグネチャトレースである。
【図２１Ａ】図２１ＡからＤを統合すると、図２０Ｂのシグネチャトレースから、一次元配列として格納されデータ入力用に２次元配列へと組み合わされるデジタル信号への変換の画像グラフィカル表示である。
【図２１Ｂ】図２１ＡからＤを統合すると、図２０Ｂのシグネチャトレースから、一次元配列として格納されデータ入力用に２次元配列へと組み合わされるデジタル信号への変換の画像グラフィカル表示である。
【図２１Ｃ】図２１ＡからＤを統合すると、図２０Ｂのシグネチャトレースから、一次元配列として格納されデータ入力用に２次元配列へと組み合わされるデジタル信号への変換の画像グラフィカル表示である。
【図２１Ｄ】図２１ＡからＤを統合すると、図２０Ｂのシグネチャトレースから、一次元配列として格納されデータ入力用に２次元配列へと組み合わされるデジタル信号への変換の画像グラフィカル表示である。
【図２１Ｅ】図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ、および図２５Ｄの間の関係を示すグラフィカル表示である。
【図２２】本発明の処理方法および計算アルゴリズムによるデータ評価のためのステップを示すフローチャートである。
【図２３】本発明の一実施形態による評価矩形を選択することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図２４】本発明の特定の一実施形態によるソフトウェアによって表示されるウィンドウ付きバイオディスクのグラフィカル表示である。
【図２５】本発明の一実施形態によるウィンドウ付きバイオディスクから収集された調査データに関してウィンドウを見つけることに関与するステップを示すフローチャートである。
【図２６】本発明の一態様によるしきい値を見つける目的で走査プロセスを受ける調査データ配列からの例示的行を示す図である。
【図２７】本発明のもう１つの態様による調査データから連結コンポーネントを抽出することに関与するサブステップを示すフローチャートである。
【図２８】本発明の一実施形態によるソフトウェアディスプレイ上でウィンドウを見つけた後、評価矩形をクロッピングした結果を示す図である。
【図２９】捕捉された細胞を有するウィンドウおよびターゲットゾーンのないディスク上のダークスポット例を示す図である。
【図３０】本発明の一実施形態による、細胞を見つけるためにウィンドウなしディスクでダークスポット例がどのように利用されるかを示す図２９に類似の図である。
【図３１】本発明のいくつかの態様による調査データに対してバックグラウンド照度均一化を実行することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図３２】本発明のソフトウェアによって表示されるバックグラウンド照度均一化前の調査データの一例を示す図である。
【図３３】本発明のソフトウェアによって表示されるバックグラウンド照度均一化後の調査データの一例を示す図である。
【図３４】本発明の一特定実施態様による調査データに対して規格化を実行することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図３５】規格化ステップ中にソフトウェアによって表示される調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図３６】本発明のソフトウェアによって表示される規格化後の調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図３７】本発明の好ましい一実施形態による調査データ例に対してフィルタリングを実行することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図３８】本発明のソフトウェアによって表示されるフィルタリングステップ後の調査データ例のグラフィカル表示である。
【図３９】図３８のグラフィカル表示の拡大図および付随する点の値グラフトレースである。
【図４０】本発明のいくつかの態様の特定の実施形態による調査データから不要コンポーネントを除去することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図４１】本発明のソフトウェアによって表示されるクラックの除去前の調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図４２】本発明のソフトウェアによって表示されるクラックの除去後の図４１の調査データ例のグラフィカル表示である。
【図４３】本発明の輝中心法による細胞をマーキングし計数することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図４４】輝中心法により計数された細胞で満たされた調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図４５】図４４のグラフィカル表示の一部の拡大図および値グラフトレースである。
【図４６Ａ】本発明の暗縁法による細胞をマーキングし計数することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図４６Ｂ】シフトした円環との畳込みのグラフィカル表示である。
【図４７】本発明のソフトウェアによって表示される、計数された細胞が十字印によってマーキングされている調査データ例のグラフィカル表示である。
【図４８】本発明のさまざまな方法で利用されるアルゴリズムを用いて赤血球を抽出することに関与するステップを示すフローチャート例である。
【図４９】図４８に略述したアルゴリズムが実行される前の赤血球を含む調査データのグラフィカル表示を示す図である。
【図５０】図４８に略述したアルゴリズムの第１ステップが実行された後の図４９の調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図５１】図４８に略述したアルゴリズムの第２ステップを適用した後の図４９の調査データ例のグラフィカル表示である。
【図５２】図４８に略述したアルゴリズムの第３ステップが実行された後の図４９の調査データ例を視覚的に示す図である。
【図５３】図４８に略述したアルゴリズムの第４ステップを実行した後の図４９の調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図５４】図４８に略述したアルゴリズムの第５ステップの適用が実行された後の図４９の調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図５５】図４８に略述したアルゴリズムによって計数された赤血球を示す拡大図である。
【図５６Ａ】本発明の絶対値計数方法によって計数される前のばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図５６Ｂ】本発明の絶対値計数方法の一実施形態によって細胞を計数することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図５７】本発明の絶対値計数方法のこの実施形態による規格化およびフィルタリングのステップを実行した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図５８】本発明の絶対値計数方法によるバックグラウンド除去および２値化のステップを適用した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図５９】本発明の絶対値計数方法により規格化のステップが実行された後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図６０】本発明の絶対値計数方法の例示的実施形態による１ピクセル幅境界抽出のステップを適用した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図６１】本発明の絶対値計数方法によるコンポーネントを塗りつぶすステップを実行した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図６２】本発明の絶対値計数方法のこの特定の実施形態による調査データを塗りつぶすステップを適用した後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図６３】本発明の方法により計数され十字印によってマーキングされた後の、当初は図５６Ａに示されている通りであったばらばらの細胞の画像スクリーンショットである。
【図６４】凝集した、およびばらばらの赤血球を計数することに適用された絶対値計数方法の結果を示す図である。
【図６５】本発明の一代替実施形態による画像に対して高速フーリエ変換を実行することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図６６】本発明により高速フーリエ変換が実行される前の調査データ例のグラフィカル表示である。
【図６７】高速フーリエ変換が実行された後の図６６の調査データ例のグラフィカル表示を示す図である。
【図６８】再配列前の調査データの歪んだグラフィカル表示の一例を示す図である。
【図６９】図６８のグラフィカル表示の歪み方向を示す図である。
【図７０】再配列後の図６８のグラフィカル表示を示す図である。
【図７１Ａ】泡トラック状況に対して細胞計数を補正することに関与するステップを示すフローチャートである。
【図７１Ｂ】本発明のもう１つの態様による泡トラック状況に対して細胞計数を補正する画像表示である。
【図７１Ｃ】顕微鏡倍率５倍で見られる捕捉された赤血球のターゲットゾーンを通る泡トラックの一例である。
【図７１Ｄ】顕微鏡倍率４０倍で見られる図７１Ｃの泡トラックの１つおよび周囲の捕捉された赤血球の拡大図である。
【図７２】本発明の方法を用いた血液サンプルの分析を示す画像フローチャートである。
Claims (56)
- 細胞を計数する方法であって、
細胞のサンプルの調査データを取得し、
前記調査データ内で評価矩形を選択し、
前記評価矩形内の前記調査データを増強し、そして
前記評価矩形内の細胞を計数するステップ、
を含む方法。 - 前記選択するステップは、前記評価矩形のカスタムサイズを選択するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
- 前記選択するステップは複数の評価矩形を選択する請求項１に記載の方法。
- 前記調査データ領域を増強する前記ステップが、
前記調査データに対してバックグラウンド照度均一化を実行し、
前記調査データに対して規格化を実行し、そして
前記調査データをフィルタリングするステップ、
をさらに含む請求項１に記載の方法。 - 前記バックグラウンド照度均一化を実行するステップが、
近傍矩形のサイズを選択し、
前記調査データ内の点を選び、
水平走査を実行し、それによって、前記点を中心とする前記近傍矩形内に配置されたすべての隣接点に対する第１スライド平均を計算し、
垂直走査を実行し、それによって、前記点を中心とする前記近傍矩形内に配置されたすべての隣接点に対する第２スライド平均を計算し、
前記第１スライド平均および第２スライド平均を組み合わせ、それによって、全平均を生成し、
前記全平均と前記点のもとの値との差を求めて該差をバックグラウンド値に加算することにより計算される結果値に、前記点のもとの値を再割当て、そして
前記調査データ内のすべての点について、前記水平走査を実行するステップ、前記垂直走査を実行するステップ、２つの前記平均を組み合わせるステップおよび前記もとの値を再割当てするステップを繰り返すステップ、
をさらに含む請求項４に記載の方法。 - 前記バックグラウンド照度均一化を実行するステップは、
前記調査データに対してフーリエ変換を実行し、それによって、周波数領域関数を生成し、
前記周波数領域関数から低波長関数を除去し、
前記周波数領域関数から長波長関数を除去し、そして
前記周波数領域関数に対して逆変換を実行するステップであって、それによって、前記調査データの修正バージョンを求める、逆変換を実行するステップ、
をさらに含む請求項４に記載の方法。 - 前記規格化を実行するステップは、
前記調査データ内のすべての点の値の平均および標準偏差を計算し、
前記平均および前記標準偏差を用いて前記調査データ内のすべての点の前記値を規格化し、そして
必要であればいくつかの点の前記値を切り捨てるステップ、
をさらに含む請求項４に記載の方法。 - 前記フィルタリングするステップは、
近傍矩形のサイズを選択し、
前記調査データ内の点を選び、
前記点を中心とする前記近傍矩形内に配置されたすべての十分に異なる点を見つけ、
前記十分に異なる点の数が所定のフィルタリング基準より大きい場合に前記点の値を再割当て、そして
前記調査データ内のすべての点について、前記すべての十分に異なる点を見つけるステップおよび前記値を再割当てするステップを繰り返すステップ、
をさらに含む請求項４に記載の方法。 - 前記フィルタリングステップの後に前記調査データから不要なコンポーネントを除去し、そして
前記バックグラウンド照明を実行するステップ、前記規格化を実行するステップおよび前記フィルタリングするステップを繰り返すステップ、
をさらに含む請求項４に記載の方法。 - 前記不要なコンポーネントを除去するステップは、
しきい値を選択し、
前記しきい値を用いて前記調査データに対して２値化を実行し、
前記調査データに対して規格化を実行し、
連結コンポーネントを抽出し、
サイズしきい値を選択し、そして
前記サイズしきい値を満たさないコンポーネントを除去するステップ、
をさらに含む請求項９に記載の方法。 - 前記規格化を実行するステップは、複数の侵食および膨張を実行するステップをさらに含む請求項１０に記載の方法。
- 前記連結コンポーネントを抽出するステップは、
前記調査データのすべての黒点に初期コンポーネント番号を割り当て、
開始点を選び、
走査方向を設定し、
前記調査データのすべての点を走査し、それによって、隣接する黒点のコンポーネント番号に一致するように前記黒点のそれぞれのコンポーネント番号を再割当てし、
所定ルールのセットに従って前記走査方向を変更し、そして
連結黒点の前記コンポーネント番号が同一になるように前記走査するステップおよび前記変更するステップを繰り返すステップ、
をさらに含む請求項１０に記載の方法。 - 前記評価矩形内の細胞を計数する前記ステップは、
前記調査データに対して畳込みを実行し、
前記調査データの複数の局所最大値を探索し、
前記複数の局所最大値から冗長な局所最大値を除去し、
残りの最大を細胞の輝中心であると宣言し、そして
前記細胞の輝中心を認識することにより細胞を計数するステップ、
をさらに含む請求項１に記載の方法。 - 前記畳込みを実行するステップは円形近傍を定義する指標関数を使用し、該円形近傍は
細胞の予想サイズの限界を定める請求項１３に記載の細胞を計数する方法。 - 前記畳込みを実行するステップはガウス指標関数を使用する請求項１３に記載の方法。
- 前記冗長な局所最大値を除去するステップは、
距離しきい値を選択し、そして
前記距離しきい値を使用するステップであって、それによって、局所最大値が冗長であるかどうかを判断するステップ、
をさらに含む請求項１３に記載の方法。 - 統計分析を実行するステップをさらに含み、該ステップは、
計数された細胞に基づいて細胞の分布を取得し、そして
細胞が凝集しているか、または視認性が低い領域内の細胞数を推定するステップ、
を含む請求項１３に記載の方法。 - 高分解能で前記調査データを再サンプリングし、そして
前記畳込みを実行し、前記複数の局所最大値を探索し、前記冗長な局所最大値を除去し、前記残りの最大を細胞の輝中心であると宣言し、そして前記細胞の輝中心を認識することにより細胞を計数するステップを繰り返すステップ、
をさらに含む請求項１３に記載の方法。 - 輝中心により計数された前記細胞を前記調査データから除去し、
暗縁を認識することにより細胞を計数し、
前記輝中心を認識することにより細胞を計数するステップからの合計を、前記暗縁を認識することにより計数するステップからの合計に加算するステップ、
をさらに含む請求項１３に記載の方法。 - 前記暗縁を認識することにより細胞を計数するステップは、
前記調査データに対して反転を実行し、
シフトした円環との複数の畳込みを実行し、
前記複数の畳込みからの結果の和をとり、
局所最大値を見つけ、
最大を細胞の中心であると宣言し、そして
前記細胞の中心を計数するステップ、
をさらに含む請求項１９に記載の方法。 - 前記複数の畳込みを実行するステップはシフトした円環なしで畳込みを実行する請求項２０に記載の方法。
- 前記畳込みを実行するステップはガウス指標関数を使用する請求項２０に記載の方法。
- 前記畳込みを実行するステップは平滑化関数を使用する請求項２０に記載の方法。
- 前記評価矩形において示される細胞を計数するステップは、
前記調査データに対して反転を実行し、
シフトした円環との複数の畳込みを実行し、
前記複数の畳込みからの結果の和をとり、
局所最大値を見つけ、
最大を細胞の中心であると宣言し、そして
前記細胞の中心を計数するステップ、
をさらに含む請求項１に記載の方法。 - 前記複数の畳込みを実行するステップはシフトした円環なしで畳込みを実行する請求項２４に記載の方法。
- 前記増強するステップは、
前記調査データに対して規格化を実行し、
前記調査データに対してフィルタリングを実行し、
しきい値数を選択し、
前記調査データが前記しきい値数より大きい値だけ所定バックグラウンド値と異なっているかどうかを判断することにより前記調査データに対して２値化を実行し、
前記調査データに対して規格化を実行し、そして
前記調査データ内の１ピクセル幅境界を抽出し、
前記１ピクセル幅境界により画定される領域を調査データで塗りつぶし、
前記塗りつぶされた領域に畳込みを適用するステップ、
をさらに含む請求項１に記載の方法。 - 前記調査データの画像表現をコンピュータモニタに表示するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
- 前記表示するステップは、
前記調査データに対して高速フーリエ変換を実行し、それによって、周波数領域内の調査データを生成し、
前記周波数領域内のスペクトルの一部を除去し、そして
前記周波数領域内の前記調査データに対して逆変換を実行するステップであって、それによって、表示のために前記調査データを増強するステップ、
をさらに含む請求項２７に記載の方法。 - 前記細胞のサンプルの調査データを取得するステップは、
１種または数種の捕捉剤を有する１つまたは複数の捕捉ゾーンを含む光ディスク表面上に血液サンプルを用意し、
前記光ディスクを光リーダに装填し、
前記光ディスクを回転させ、
電磁放射の入射ビームを前記捕捉ゾーンの１つに光源から当て、
前記入射ビームが前記捕捉ゾーンで前記ディスクと相互作用した後に形成される電磁放射の結果ビームを検出器で検出し、
検出されたビームをアナログ出力信号に変換し、そして
前記アナログ出力信号を、前記捕捉ゾーンに捕捉された細胞を含むデジタルデータに変換するステップ、
を含む請求項１に記載の方法。 - 前記アナログ出力を前記デジタルデータに変換する前記ステップは、
一定間隔で前記アナログ信号の振幅をサンプリングし、
前記サンプリング振幅を一次元配列に記録し、
前記サンプリングするステップおよび前記記録するステップを用いて複数の一次元配列を作成し、そして
前記複数の一次元配列を組み合わせるステップであって、それによって、前記サンプルのデジタルデータを含む２次元配列を作成するステップ、
をさらに含む請求項２９に記載の方法。 - 前記光ディスクは、前記捕捉に当てられる光が前記検出器へ反射されるように反射層を備えて構成される請求項２９に記載の方法。
- 前記検出器は下部検出器である請求項３１に記載の方法。
- 前記光ディスクは、前記捕捉ゾーンに当てられる光が前記光ディスクを透過するように構成され、前記ディスクは前記光源と前記検出器の間にある請求項２９に記載の方法。
- 前記検出器は上部検出器である請求項３３に記載の方法。
- 前記検出器は分割検出器である請求項３３に記載の方法。
- 前記１つまたは複数の捕捉ゾーンは、前記光ディスク内の１つまたは複数のチャンバー内に配置される請求項２９に記載の方法。
- 前記光ディスクは、前記捕捉ゾーンに対応する複数のウィンドウを備える請求項２９に記載の方法。
- 前記評価矩形を選択するステップは、
前記調査データ内で前記複数のウィンドウの１つを見つけ、そして
前記ウィンドウ内で標準サイズの評価矩形をクロッピングするステップ、
をさらに含む請求項３７に記載の方法。 - 前記複数のウィンドウの１つを見つける前記ステップは、
前記調査データに対して圧縮を実行し、
前記調査データに対してしきい値評価を実行し、
前記調査データに対して２値化を実行し、
前記調査データに対して規格化を実行し、
前記調査データから連結コンポーネントを抽出し、そして
前記連結コンポーネントからウィンドウに対応するコンポーネントを見つけるステップ、
をさらに含む請求項３７に記載の方法。 - 前記連結コンポーネントを抽出するステップは、
前記調査データのすべての黒点に初期コンポーネント番号を割り当て、
開始点を選び、
走査方向を設定し、
前記調査データのすべての点を走査し、それによって、隣接する黒点のコンポーネント番号に一致するように前記黒点のそれぞれのコンポーネント番号を再割当てし、
所定ルールのセットに従って前記走査方向を変更し、そして
連結黒点の前記コンポーネント番号が同一になるように前記走査するステップおよび前記変更するステップを繰り返すステップ、
をさらに含む請求項３９に記載の方法。 - 前記光ディスクの表面は前記捕捉ゾーンの位置をマーキングするダークスポットを含む請求項２９に記載の方法。
- 前記評価矩形を選択するステップは、
前記調査データ内で前記ダークスポットの１つを見つけ、そして
前記ダークスポットから所定距離シフトすることにより求められる点を中心とする標準サイズの評価矩形を作成するステップ、
をさらに含む請求項４１に記載の方法。 - 前記ダークスポットの１つを見つける前記ステップは、
前記調査データに対して圧縮を実行し、
前記調査データに対してしきい値評価を実行し、
前記調査データに対して２値化を実行し、
前記調査データに対して規格化を実行し、
前記調査データから連結コンポーネントを抽出し、そして
前記連結コンポーネントからダークスポットに対応するコンポーネントを見つけるステップ、
をさらに含む請求項４２に記載の方法。 - 前記連結コンポーネントを抽出するステップは、
前記調査データのすべての黒点に初期コンポーネント番号を割り当て、
開始点を選び、
走査方向を設定し、
前記調査データのすべての点を走査し、それによって、隣接する黒点のコンポーネント番号に一致するように前記黒点のそれぞれのコンポーネント番号を再割当てし、
所定ルールのセットに従って前記走査方向を変更し、そして
連結黒点の前記コンポーネント番号が同一になるように前記走査するステップおよび前記変更するステップを繰り返すステップ、
をさらに含む請求項４３に記載の方法。 - 前記ダークスポットの１つを見つける前記ステップは、位置情報を読み出すステップをさらに含む請求項４２に記載の方法。
- 前記光ディスクは、前記捕捉ゾーンを位置特定するためのコンピュータ可読位置情報を含む請求項２９に記載の方法。
- コンピュータモニタ上に前記ウィンドウの画像を表示するステップをさらに含む請求項３７に記載の方法。
- 前記ウィンドウの前記画像を表示する前記ステップは、
前記画像が歪んでいるかどうかを判断し、
歪みの方向を求め、そして
前記画像の歪みを補正するステップ、
をさらに含む請求項４７に記載の方法。 - 細胞の前記サンプルの調査データを取得する前記ステップは、アーカイブからサンプルの事前に格納されている調査データを取り出すことを含む請求項１に記載の方法。
- 前記アーカイブは、患者の特徴に従って前記格納されている調査データを登録する請求項４９に記載の方法。
- 前記サンプルの事前に格納されている調査データを取り出すステップは、患者の前記特徴から選択される複数の基準に適合するサンプルを選択するステップをさらに含み、それによって、母集団健康動向研究が行われる請求項５０に記載の細胞を計数する方法。
- 前記細胞を計数するステップからの結果を出力するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
- 前記細胞は白血球である請求項５２に記載の方法。
- 前記結果はＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の計数、ならびにＣＤ４＋細胞数のＣＤ８＋細胞数に対する比を含む請求項５３に記載の方法。
- 前記結果は、ＣＤ３＋細胞およびＣＤ４５＋細胞の計数をさらに含む請求項５４に記載の方法。
- 前記細胞を計数するステップは、
泡トラックについて細胞の分布を分析し、
小さすぎる局所細胞密度を有する領域を無視し、そして
細胞数を再計算するステップ、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
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