JP2005296010A - ２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【課題】 ２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質を提供する。
【解決手段】 超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）種７（ＪＣＭ１０５４５）由来の２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有するタンパク質を該たんぱく質をコードすると推定される遺伝子をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより得た。
【選択図】 図１
【解決手段】 超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）種７（ＪＣＭ１０５４５）由来の２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有するタンパク質を該たんぱく質をコードすると推定される遺伝子をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより得た。
【選択図】 図１
Description
本発明は、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質に関する。なお、本出願は、国の委託の成果に係る出願である。
２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼは、Ｌ−ロイシンの生合成に関与している酵素であり、ロイシンを工業的に生産する場合にも重要になると考えられている。従来から知られている２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼとしては、例えば、アルカリゲネス・ユートロファス（Alcaligenes eutrophus）由来の酵素（例えば、非特許文献１および２参照）、酵母（yeast）由来の酵素（例えば、非特許文献３参照）などがある。また、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼを用いた、Ｌ−ロイシンの合成は、例えば、ホウレンソウ由来のクロロプラストについて研究されている（例えば、非特許文献４参照）。しかしながら、耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼは、いまだ知られていない。耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼは、工業的なロイシンの生産など、さまざま用途に使用できるものと期待されている。
他方、超好熱性古細菌（例えば、非特許文献５参照）についての研究があり、スルホロブス属細菌の１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）（例えば、非特許文献６参照）は、その遺伝子が既に解析されている（例えば、非特許文献７参照）。したがって、この超好熱古細菌が、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼを産生するとすれば、それは優れた耐熱性を有すると予想される。
Arch. Microbiol., 112(3), 247-255, 1977 Arch. Microbiol., 112(3), 239-246, 1977 Methods Enzymol., 166, 414-423, 1988 Biol. Chem. Hoppe Seyler.,374(12), 1105-1108, 1993 Advances in Protein Chemistry, Volume 48, Enzymes and Proteins from Hyperthermophilic Microorganisms (M.Adams ed.), Academic Press (1996) Suzuki, T. et al., Extremophiles, 2002 Feb;6(1):39-44 Kawarabayashi,Y. et al., "Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain7", DNA Res. 8 (4), 123-140 (2001)
Arch. Microbiol., 112(3), 247-255, 1977 Arch. Microbiol., 112(3), 239-246, 1977 Methods Enzymol., 166, 414-423, 1988 Biol. Chem. Hoppe Seyler.,374(12), 1105-1108, 1993 Advances in Protein Chemistry, Volume 48, Enzymes and Proteins from Hyperthermophilic Microorganisms (M.Adams ed.), Academic Press (1996) Suzuki, T. et al., Extremophiles, 2002 Feb;6(1):39-44 Kawarabayashi,Y. et al., "Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain7", DNA Res. 8 (4), 123-140 (2001)
本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質の提供を、その目的とする。
前記目的を達成するために、超好熱性古細菌であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）のゲノム情報について調べたところ、この細菌が、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼを産生する可能性があることを突き止めた。この知見に基づき、さらに研究を重ねたところ、この細菌の遺伝子から、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質を発現させることに成功し、本発明に到達した。
すなわち、本発明のタンパク質は、下記の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である。
（ａ） 配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ） 配列番号１のアミノ酸配列において、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
（ａ） 配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ） 配列番号１のアミノ酸配列において、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
なお、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）は、理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設に保存されており、第三者の要求により分譲可能である。
スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）の生育温度は８０℃であり、生育限界温度が８７℃であるから、本発明のタンパク質は、８０〜８７℃の高温であっても活性がある。
本発明のタンパク質の酵素反応の温度条件は、好ましくは、５５〜８５℃の範囲であり、より好ましくは、６５〜８５℃の範囲である。
前記２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性は、水の存在下にアセチル補酵素Ａおよび３−メチル−２−オキソブタノエートに作用して、２−イソプロピルリンゴ酸および補酵素Ａを生成する機能である。
前述のように、本発明の新規耐熱性タンパク質は、超好熱性古細菌由来であり、具体的には、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii)（ＪＣＭ１０５４５）由来である。但し、本発明のタンパク質は、この菌が産生するものに限定されず、遺伝子工学的手法により、他の生物が産生するものであってもよい。
つぎに、本発明の発現ベクターは、前記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクターである。
つぎに、本発明の形質転換体は、前記本発明のベクターにより形質転換された形質転換体である。なお、宿主は特に制限されず、例えば、大腸菌等がある。
つぎに、本発明のタンパク質の製造方法は、前記本発明の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。
つぎに、本発明の製造方法は、酵素反応により、水の存在下に３−メチル−２−オキソブタノエートおよびアセチル補酵素Ａから２−イソプロピルリンゴ酸および補酵素Ａを製造する方法であって、前記酵素として前記本発明のタンパク質を用い、温度５５〜８５℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法である。なお、前記温度条件は、６５〜８５℃の範囲であることがより好ましい。このように、前記本発明のタンパク質を用いれば、温度５５〜８５℃の高温領域で酵素反応を実施でき、この結果、工業的な用途が広がる。なお、この製造方法において、前記酵素反応のｐＨは、ｐＨ６〜８の範囲が好ましい。
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
本発明者らは、海洋底から採取された超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）種７（ＪＣＭ１０５４５）の遺伝子配列から２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を示すと推定される遺伝子（配列番号２）をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより、本発明の新規耐熱性タンパク質を得るに至った。遺伝子のクローニング方法は、後記した実施例１に記載した通り実施した。クローニングされた遺伝子の塩基配列は配列番号２に示す通りとおりであり、また、その推定アミノ酸配列は配列番号１に示す通りである。なお、本発明の耐熱性タンパク質は、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有していれば、配列番号１のアミノ酸配列において、一つ以上若しくは数個のアミノ酸残基が、欠質、置換、付加若しくは挿入されていてもよい。このアミノ酸配列における「アミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入」は、当業者に公知の方法（例えば、突然変異誘発法）に従って実施することができる。
本発明のタンパク質は、前述の本発明のタンパク質の製造方法により製造可能であるが、これに限定されず、他の製造方法で製造されてもよい。例えば配列番号１に示すように、そのアミノ酸配列が決定されているタンパク質については、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、個々のアミノ酸を化学的に重合してタンパク質を合成する方法に従って調製することができる。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の一例としては、配列番号２に示す遺伝子がある。前記遺伝子は、例えば、後記する実施例２に示すように超好熱性古細菌スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii)（ＪＣＭ１０５４５）のゲノムから、例えば配列番号２で示される塩基配列の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ法あるいは該ＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により調製することができる。また、その塩基配列をもとに、当業者に公知である核酸化学合成法等に従って前記遺伝子を得ることもできるが、これらに限定されない。
本発明の発現ベクターは、前記遺伝子もしくは配列番号２のＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ＡｃＭＮＰＶなどのバキュロウイルスなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法またはその変法などにより調製することができる。また、市販プラスミドとして、例えばｐＥＴ-１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）あるいはバチルス属の宿主を用いた分泌型のプラスミドなどを用いてもよい。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが含まれていてもよい。
ベクターへの遺伝子等の挿入は、例えば、精製された遺伝子の塩基配列を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができるが、これらに限定されない。また、本発明の遺伝子の機能が発揮されるように、本発明の発現ベクターには本発明の遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合配列などを組み込んでいてもよい。さらに、本発明の遺伝子も他のタンパク質のコードする配列を融合したものを挿入してもよい。
前記発現ベクターで宿主生物を形質転換すれば、本発明の形質転換体が得られる。宿主生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、大腸菌などの原核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換法としては、既に公知である塩化カルシウム法などを使用することができるが、これらの方法に限定されない。
本発明のタンパク質の製造方法は、前記形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。前記培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の微生物を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行えるものであれば、天然培地、合成培地などのいずれを用いてもよい。本発明のタンパク質の回収は、特に制限されない。前記タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによって前記タンパク質を回収する。また、本発明の前記タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体または細胞を除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。なお、培養液をそのまま使用する場合、熱処理をすることにより、他のタンパク質が失活するので、実質上、本発明のタンパク質のみの酵素液として使用できる。
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されない。
染色体ＤＮＡの調製
スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii（ＪＣＭ１０５４５））をＬ培地中で３７℃にて一晩培養して集菌したものに、ＳＳＣ溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）１０ｍＬ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ニワトリ卵白リゾチーム０．１ｍＬおよび１０％非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ-５８を０．５ｍＬ加え、０℃で３０分間放置した後、プロテイナーゼＫ（Ｍｅｒｃｋ社製）５ｍｇを１０％ＳＤＳ０．２ｍＬに溶かした溶液を加え、３７℃で２、３日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、３７℃で１時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてＤＮＡを沈殿濃縮した。このＤＮＡの沈殿をＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））１０ｍＬに溶解し、リボヌクレアーゼ０．２５ｍＬ（最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ）を加えて、３７℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。次いで、ＤＮＡをＴＥ溶液５ｍＬに溶解した後、２６０ｎｍの吸光度より、ＤＮＡ濃度を決定した（Clarke,L. & Carbon,J. (1979) Methods Enzymol. 68,396-408）。
スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii（ＪＣＭ１０５４５））をＬ培地中で３７℃にて一晩培養して集菌したものに、ＳＳＣ溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）１０ｍＬ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ニワトリ卵白リゾチーム０．１ｍＬおよび１０％非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ-５８を０．５ｍＬ加え、０℃で３０分間放置した後、プロテイナーゼＫ（Ｍｅｒｃｋ社製）５ｍｇを１０％ＳＤＳ０．２ｍＬに溶かした溶液を加え、３７℃で２、３日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、３７℃で１時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてＤＮＡを沈殿濃縮した。このＤＮＡの沈殿をＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））１０ｍＬに溶解し、リボヌクレアーゼ０．２５ｍＬ（最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ）を加えて、３７℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。次いで、ＤＮＡをＴＥ溶液５ｍＬに溶解した後、２６０ｎｍの吸光度より、ＤＮＡ濃度を決定した（Clarke,L. & Carbon,J. (1979) Methods Enzymol. 68,396-408）。
発現プラスミドの構築と遺伝子発現
１．発現プラスミドの構築
耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の翻訳領域の後ろに制限酵素ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩサイトを含むＤＮＡを構築する目的で下記のＤＮＡプライマーを合成し、このプライマーを用いたＰＣＲで耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の翻訳領域の後ろに制限酵素サイトを導入した。用いたＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（東洋紡社製）であった。
Forward primer（配列番号３）：5'-TGGGGTGCCAATTTAGCGTTAATTCAAAAAAA-3'
Reverse primer（配列番号４）：5'-ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTATACTTTAATCTTTTTGCT-3'
１．発現プラスミドの構築
耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の翻訳領域の後ろに制限酵素ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩサイトを含むＤＮＡを構築する目的で下記のＤＮＡプライマーを合成し、このプライマーを用いたＰＣＲで耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の翻訳領域の後ろに制限酵素サイトを導入した。用いたＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（東洋紡社製）であった。
Forward primer（配列番号３）：5'-TGGGGTGCCAATTTAGCGTTAATTCAAAAAAA-3'
Reverse primer（配列番号４）：5'-ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTATACTTTAATCTTTTTGCT-3'
ＰＣＲ反応後、増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、その遺伝子断片を精製した。ｐＥＴ-１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｄｅＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔで末端を平滑化した後、制限酵素ＢａｍＨＩでさらに切断したものを精製し、上記の構造遺伝子とＴ４リガーゼで１５℃、３０分間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地（１８ｍＬ）で２４時間培養し、その培養液から発現プラスミドを改変アルカリＳＤＳ法で精製した。精製プラスミドのインサートの塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定し、インサートの塩基配列が耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子の正しい配列であることを確認した。
２．組換え遺伝子の発現
大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに０．１ｍＬ移した。その中に上記１．の精製発現プラスミドの溶液０．００２ｍＬを加え氷中に２０分間放置した後、４２℃でヒートショックを９０秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地（５ｍＬ）で１８時間培養し、耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子を発現した。培養後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）で集菌した。集菌した菌体に、破砕液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５）を０．２ｍＬ加え、超音波発生器で細胞を破砕し、その懸濁液を０．１ｍＬずつ２本のサンプルチューブに分けた。一方のサンプルチューブは遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。もう一方のサンプルチューブは、熱処理（７０℃、１０分）を施した後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。これらの試料の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析し、発現を確認できた。この結果を図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真に示す。
耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現が見られた試料についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写し、染色によって可視化された目的組換えタンパク質である耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼのバンドを切り出し、プロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ４９２Ｐｒｏｃｉｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、アミノ末端配列を解析した結果、配列番号５に示すように７残基のアミノ末端配列が決定できた。この配列により、発現タンパク質が耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼであることを確認できた。この発現タンパク質は、３８６アミノ酸残基より構成されており、その推定分子量は４２.４ｋＤａであり、図１の結果とほぼ一致した。
大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに０．１ｍＬ移した。その中に上記１．の精製発現プラスミドの溶液０．００２ｍＬを加え氷中に２０分間放置した後、４２℃でヒートショックを９０秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地（５ｍＬ）で１８時間培養し、耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ遺伝子を発現した。培養後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）で集菌した。集菌した菌体に、破砕液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５）を０．２ｍＬ加え、超音波発生器で細胞を破砕し、その懸濁液を０．１ｍＬずつ２本のサンプルチューブに分けた。一方のサンプルチューブは遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。もう一方のサンプルチューブは、熱処理（７０℃、１０分）を施した後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け、沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。これらの試料の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析し、発現を確認できた。この結果を図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真に示す。
耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼの発現が見られた試料についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写し、染色によって可視化された目的組換えタンパク質である耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼのバンドを切り出し、プロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ４９２Ｐｒｏｃｉｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、アミノ末端配列を解析した結果、配列番号５に示すように７残基のアミノ末端配列が決定できた。この配列により、発現タンパク質が耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼであることを確認できた。この発現タンパク質は、３８６アミノ酸残基より構成されており、その推定分子量は４２.４ｋＤａであり、図１の結果とほぼ一致した。
組換え大腸菌の大量培養
実施例２と同様にして調製したプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ−１１ａベクター）を用いて、大腸菌ＤＨ５α株を常法に従い形質転換した。形質転換された大腸菌ＤＨ５αからアルカリＳＤＳ法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを用いて、大腸菌ロゼッタ・ガミ（Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ）（ＤＥ３）株を形質転換した。プレート上に生えてきたコロニーを３白金耳量とり、５ｍＬのＬＢＬ培地（１％ペプトン、０．５％酵母抽出液、０．５％ＮａＣｌ、０．１％ラクトース、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、４０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）に植菌して、培養開始直前まで約６時間、３７℃で前培養した。この前培養液を全量、３Ｌの４×ＬＢＬ培地（４％ペプトン、２％酵母抽出液、２％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）に加え、高密度培養槽（ＡＢＬＥ社製）にて３７℃、ｐＨ７．２、圧力０．０２Ｐａでコンピュータプログラム制御し、培養した。ｐＨは、オートクレーブ済みの２Ｍ ＨＣｌ（和光純薬社製）および２Ｍ ＮａＯＨ（和光純薬社製）で調整した。集菌約２４時間前にオートクレーブ済みの３００ｍＬ発現誘導液（１０％ラクトース、２０％グリセロール）を加えた。集菌約１７時間前に培養温度を２８℃とし、以降は２８℃とした。大腸菌の生育度が定常期に入ったところ（培養開始４３時間後）で大型遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製、商品名ＡｖａｎｔｉＨＰ−３０Ｉ）を用い集菌した。回収した菌体は、−３０℃で保存した。この時、菌体を少量、別に取り、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ β−メルカプトエタノール（和光純薬社製）に溶解・懸濁し、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製、商品名ＵＤ−２０１）で破砕した。この溶液を２等分し、一方を９１００Ｇ、４℃で１０分間、遠心分離し、上清と沈殿に分け、他方を７５℃に設定した恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＤｒｙＴｈｅｒｍｏＵｎｉｔ ＤＴＵ−１Ｃ）で１０分間、加熱した後、９１００Ｇ、４℃で１０分間、遠心分離し、上清と沈殿に分けた。これら４種の上清および沈殿（沈殿は、菌体破砕液にて再懸濁）に変性剤（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、２．４％β−メルカプトエタノール、０．００５％ブロムフェノールブルー（和光純薬社製））を加え、９５℃で５分間加熱し、変性させた。これらの変性させたタンパク質溶液を１２．５％または１５％（発現させるタンパク質の分子量により異なる）ポリアクリルアミドゲルに加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行った。染色液（和光純薬社製、商品名Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ）を用い、電気泳動後のゲルを染色・脱色し、目的タンパク質の発現を確認した。
実施例２と同様にして調製したプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ−１１ａベクター）を用いて、大腸菌ＤＨ５α株を常法に従い形質転換した。形質転換された大腸菌ＤＨ５αからアルカリＳＤＳ法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを用いて、大腸菌ロゼッタ・ガミ（Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ）（ＤＥ３）株を形質転換した。プレート上に生えてきたコロニーを３白金耳量とり、５ｍＬのＬＢＬ培地（１％ペプトン、０．５％酵母抽出液、０．５％ＮａＣｌ、０．１％ラクトース、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、４０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）に植菌して、培養開始直前まで約６時間、３７℃で前培養した。この前培養液を全量、３Ｌの４×ＬＢＬ培地（４％ペプトン、２％酵母抽出液、２％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）に加え、高密度培養槽（ＡＢＬＥ社製）にて３７℃、ｐＨ７．２、圧力０．０２Ｐａでコンピュータプログラム制御し、培養した。ｐＨは、オートクレーブ済みの２Ｍ ＨＣｌ（和光純薬社製）および２Ｍ ＮａＯＨ（和光純薬社製）で調整した。集菌約２４時間前にオートクレーブ済みの３００ｍＬ発現誘導液（１０％ラクトース、２０％グリセロール）を加えた。集菌約１７時間前に培養温度を２８℃とし、以降は２８℃とした。大腸菌の生育度が定常期に入ったところ（培養開始４３時間後）で大型遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製、商品名ＡｖａｎｔｉＨＰ−３０Ｉ）を用い集菌した。回収した菌体は、−３０℃で保存した。この時、菌体を少量、別に取り、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ β−メルカプトエタノール（和光純薬社製）に溶解・懸濁し、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製、商品名ＵＤ−２０１）で破砕した。この溶液を２等分し、一方を９１００Ｇ、４℃で１０分間、遠心分離し、上清と沈殿に分け、他方を７５℃に設定した恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＤｒｙＴｈｅｒｍｏＵｎｉｔ ＤＴＵ−１Ｃ）で１０分間、加熱した後、９１００Ｇ、４℃で１０分間、遠心分離し、上清と沈殿に分けた。これら４種の上清および沈殿（沈殿は、菌体破砕液にて再懸濁）に変性剤（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、２．４％β−メルカプトエタノール、０．００５％ブロムフェノールブルー（和光純薬社製））を加え、９５℃で５分間加熱し、変性させた。これらの変性させたタンパク質溶液を１２．５％または１５％（発現させるタンパク質の分子量により異なる）ポリアクリルアミドゲルに加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行った。染色液（和光純薬社製、商品名Ｑｕｉｃｋ−ＣＢＢ）を用い、電気泳動後のゲルを染色・脱色し、目的タンパク質の発現を確認した。
組換えタンパク質の精製
実施例３において、−３０℃で保存してあった菌体を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールに溶解・懸濁し、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製、商品名ＵＤ−２０１）で破砕し、７５℃に設定した恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＤｒｙＴｈｅｒｍｏＵｎｉｔ ＤＴＵ−１Ｃ）で、１０分間、加熱した後、すばやく冷却した。次に、この破砕菌体液を大型遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製、商品名Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−３０Ｉ）を用いて、１００，０００Ｇで１時間、遠心分離し、上清を回収した。
つぎに、この上清をタンパク質精製装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＡＫＴＡTM ｅｘｐｌｏｒｅｒ）を用いて、１．３５Ｍ 硫安、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールの緩衝溶液に置換した後、疎水交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＲＥＳＯＵＲＣＥTMＰｈｅ ６ｍＬ）に通した。１．３５Ｍ→０の硫安濃度勾配で溶出させ、各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
つぎに、回収した画分を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールの緩衝溶液に置換した後、陰イオン交換カラム（東ソー社製、ＴＳＫ−ＧＥＬ ＢｉｏＡｓｓｉｓｔTM Ｑ ６ｍＬ）に通した。塩化ナトリウムで溶出を行い、溶出してきた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
次に、回収した画分を１０ｍＭのリン酸緩衝溶液に置換した後、ヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏｓｃａｌｅ社製 Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ， Ｔｙｐｅ Ｉ Ｃｏｌｕｍｎ， ＣＨＴ-１０１）に通した。高濃度リン酸緩衝溶液で溶出を行い、溶出してきた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて確認し、目的タンパクの画分を回収した。
つぎに、回収した画分を、遠心濃縮チューブ（ミリポア社製、ＶＩＶＡＳＰＩＮTM １００００）を用いて遠心分離して濃縮し、タンパク質精製装置（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールで平衡化したゲルろ過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＨｉＬｏａｄTM １６／６０、ＳｕｐｅｒｄｅｘTM ２００）に通した。溶出してきた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
つぎに、回収した画分を遠心濃縮チューブ（ミリポア社製、ＶＩＶＡＳＰＩＮTM １００００）を用いて遠心分離して濃縮し、活性測定に供した。
実施例３において、−３０℃で保存してあった菌体を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールに溶解・懸濁し、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ社製、商品名ＵＤ−２０１）で破砕し、７５℃に設定した恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製、商品名ＤｒｙＴｈｅｒｍｏＵｎｉｔ ＤＴＵ−１Ｃ）で、１０分間、加熱した後、すばやく冷却した。次に、この破砕菌体液を大型遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製、商品名Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−３０Ｉ）を用いて、１００，０００Ｇで１時間、遠心分離し、上清を回収した。
つぎに、この上清をタンパク質精製装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＡＫＴＡTM ｅｘｐｌｏｒｅｒ）を用いて、１．３５Ｍ 硫安、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールの緩衝溶液に置換した後、疎水交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＲＥＳＯＵＲＣＥTMＰｈｅ ６ｍＬ）に通した。１．３５Ｍ→０の硫安濃度勾配で溶出させ、各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
つぎに、回収した画分を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールの緩衝溶液に置換した後、陰イオン交換カラム（東ソー社製、ＴＳＫ−ＧＥＬ ＢｉｏＡｓｓｉｓｔTM Ｑ ６ｍＬ）に通した。塩化ナトリウムで溶出を行い、溶出してきた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
次に、回収した画分を１０ｍＭのリン酸緩衝溶液に置換した後、ヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏｓｃａｌｅ社製 Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ， Ｔｙｐｅ Ｉ Ｃｏｌｕｍｎ， ＣＨＴ-１０１）に通した。高濃度リン酸緩衝溶液で溶出を行い、溶出してきた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて確認し、目的タンパクの画分を回収した。
つぎに、回収した画分を、遠心濃縮チューブ（ミリポア社製、ＶＩＶＡＳＰＩＮTM １００００）を用いて遠心分離して濃縮し、タンパク質精製装置（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ β−メルカプトエタノールで平衡化したゲルろ過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＨｉＬｏａｄTM １６／６０、ＳｕｐｅｒｄｅｘTM ２００）に通した。溶出してきた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
つぎに、回収した画分を遠心濃縮チューブ（ミリポア社製、ＶＩＶＡＳＰＩＮTM １００００）を用いて遠心分離して濃縮し、活性測定に供した。
活性測定
１．測定方法
実施例４において精製したタンパク質は、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼであり、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼは、生体内で、３−メチル−２−オキソブタノエート＋アセチル補酵素Ａ＋Ｈ2Ｏ→２−イソプロピルリンゴ酸＋補酵素Ａ＋Ｈ+の反応を触媒する酵素である。前記実施例４において精製したタンパク質について、下記の種々条件下で、その活性を測定した。この活性測定は、つぎの通りである。すなわち、まず、２００μＭの３−メチルー２−オキソブタン酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ社製）と、２００μＭのアセチル補酵素Ａ（Ｓｉｇｍａ社製）とを含む１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を５分間、後述の各反応温度で保温した。ついで、１μＭの前記実施例４において精製したタンパク質を加えて反応を開始した。４１２ｎｍの吸収の変化を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ社製、商品名Ｕ−３３００）で追跡することで、反応の進行度（前記実施例４において精製したタンパク質の活性に対応する）を観測した。進行度の指標として見かけの速度定数ｋappを用いた。各測定値は、前記実施例４において精製したタンパク質の代わりに水を加えて前記測定を行ったコントロール実験結果を除いた値である。また、前記反応系に２００μＭのＤＴＮＢ（５，５'−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（和光純薬社製））を共存させておき、これと反応生成物である補酵素Ａとが反応してできる化合物の吸光度（モル吸光係数１３，６００Ｍ-1ｃｍ-1）を定量することにより、生成物の量を計算した。
１．測定方法
実施例４において精製したタンパク質は、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼであり、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼは、生体内で、３−メチル−２−オキソブタノエート＋アセチル補酵素Ａ＋Ｈ2Ｏ→２−イソプロピルリンゴ酸＋補酵素Ａ＋Ｈ+の反応を触媒する酵素である。前記実施例４において精製したタンパク質について、下記の種々条件下で、その活性を測定した。この活性測定は、つぎの通りである。すなわち、まず、２００μＭの３−メチルー２−オキソブタン酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ社製）と、２００μＭのアセチル補酵素Ａ（Ｓｉｇｍａ社製）とを含む１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を５分間、後述の各反応温度で保温した。ついで、１μＭの前記実施例４において精製したタンパク質を加えて反応を開始した。４１２ｎｍの吸収の変化を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ社製、商品名Ｕ−３３００）で追跡することで、反応の進行度（前記実施例４において精製したタンパク質の活性に対応する）を観測した。進行度の指標として見かけの速度定数ｋappを用いた。各測定値は、前記実施例４において精製したタンパク質の代わりに水を加えて前記測定を行ったコントロール実験結果を除いた値である。また、前記反応系に２００μＭのＤＴＮＢ（５，５'−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（和光純薬社製））を共存させておき、これと反応生成物である補酵素Ａとが反応してできる化合物の吸光度（モル吸光係数１３，６００Ｍ-1ｃｍ-1）を定量することにより、生成物の量を計算した。
２．至適温度
２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５℃の各温度において、前記測定を行い、ｋappを求めた。なお、この測定においては、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを前記各温度でｐＨ７．５になるように調製した。測定結果を、下記表１および図２のグラフに示す。図示のとおり、６５〜８５℃において特に高い活性を示した。
２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５℃の各温度において、前記測定を行い、ｋappを求めた。なお、この測定においては、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを前記各温度でｐＨ７．５になるように調製した。測定結果を、下記表１および図２のグラフに示す。図示のとおり、６５〜８５℃において特に高い活性を示した。
（表１）
温度（℃） ｋ app （ｓ -1 ）
２５ ０．００２８
３５ ０．００５１
４５ ０．００８８
５５ ０．０１４
６５ ０．０２１
７５ ０．０２１
８５ ０．０２０
９５ ０．００３７
温度（℃） ｋ app （ｓ -1 ）
２５ ０．００２８
３５ ０．００５１
４５ ０．００８８
５５ ０．０１４
６５ ０．０２１
７５ ０．０２１
８５ ０．０２０
９５ ０．００３７
３．至適ｐＨ
ｐＨ４．７、６．７、７．５、８．６の各条件で、前記測定を行い、ｋappを求めた。緩衝溶液には、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用い、反応温度は、５５℃とした。測定結果を、下記表２および図３のグラフに示す。図示のとおり、ｐＨ６．７で最も高い活性が認められ、至適ｐＨが７程度であることが分かった。
ｐＨ４．７、６．７、７．５、８．６の各条件で、前記測定を行い、ｋappを求めた。緩衝溶液には、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用い、反応温度は、５５℃とした。測定結果を、下記表２および図３のグラフに示す。図示のとおり、ｐＨ６．７で最も高い活性が認められ、至適ｐＨが７程度であることが分かった。
（表２）
ｐＨ ｋ app （ｓ -1 ）
４．７ ０．００７６
６．７ ０．０１９
７．５ ０．０１４
８．６ ０．００９８
ｐＨ ｋ app （ｓ -1 ）
４．７ ０．００７６
６．７ ０．０１９
７．５ ０．０１４
８．６ ０．００９８
４．３−メチル−２−オキソブタン酸ナトリウムに対するＫ M 、ｋ cat 、ｋ cat ／Ｋ M の算出
前記測定において、アセチル補酵素Ａの濃度は、２００μＭのまま固定して、３−メチル−２−オキソブタン酸ナトリウムの濃度を変えることで、３−メチル−２−オキソブタン酸ナトリウムの濃度と反応速度ｖとの関係を求めた。反応温度は、７５℃とした。測定結果を、下記表３および図４のグラフに示す。
前記測定において、アセチル補酵素Ａの濃度は、２００μＭのまま固定して、３−メチル−２−オキソブタン酸ナトリウムの濃度を変えることで、３−メチル−２−オキソブタン酸ナトリウムの濃度と反応速度ｖとの関係を求めた。反応温度は、７５℃とした。測定結果を、下記表３および図４のグラフに示す。
（表３）
３−メチル−２−オキソブタン酸ナトリウムの濃度（μＭ） ｖ（μＭ／ｓ）
０ ０
０．１ ０．００１２２５
１ ０．００１９６１
５ ０．００７３５３
１０ ０．００９８０４
２５ ０．０１５９３１
５０ ０．０２４５１
１００ ０．０２６９３１
１０００ ０．０２５７３５
３−メチル−２−オキソブタン酸ナトリウムの濃度（μＭ） ｖ（μＭ／ｓ）
０ ０
０．１ ０．００１２２５
１ ０．００１９６１
５ ０．００７３５３
１０ ０．００９８０４
２５ ０．０１５９３１
５０ ０．０２４５１
１００ ０．０２６９３１
１０００ ０．０２５７３５
上記測定結果より、ＩＧＯＲ Ｐｒｏ（ヒューリンクス社製）を用いて、３−メチル−２−オキソブチル酸ナトリウムに対するＫM、ｋcat、ｋcat／ＫMを算出した。算出結果を、下記表４に示す。
（表４）
Ｋ M （μＭ） ｋ cat （ｓ -1 ） ｋ cat ／Ｋ M （ｓ -1 ／Ｍ）
１５ ０．０２９ １．９×１０3
Ｋ M （μＭ） ｋ cat （ｓ -1 ） ｋ cat ／Ｋ M （ｓ -1 ／Ｍ）
１５ ０．０２９ １．９×１０3
５．アセチル補酵素Ａの濃度と反応速度ｖとの関係
前記測定において、３−メチル−２−オキソブタン酸ナトリウムの濃度は、２００μＭのまま固定して、アセチル補酵素Ａの濃度を変えることで、アセチル補酵素Ａの濃度と反応速度ｖとの関係を求めた。反応温度は、７５℃とした。測定結果を、下記表５および図５のグラフに示す。なお、アセチル補酵素Ａと前記実施例４において精製したタンパク質との親和性が低く、アセチル補酵素Ａに対するＫMは、値が大きすぎて、ＫM、ｋcatは、算出できなかった。
前記測定において、３−メチル−２−オキソブタン酸ナトリウムの濃度は、２００μＭのまま固定して、アセチル補酵素Ａの濃度を変えることで、アセチル補酵素Ａの濃度と反応速度ｖとの関係を求めた。反応温度は、７５℃とした。測定結果を、下記表５および図５のグラフに示す。なお、アセチル補酵素Ａと前記実施例４において精製したタンパク質との親和性が低く、アセチル補酵素Ａに対するＫMは、値が大きすぎて、ＫM、ｋcatは、算出できなかった。
（表５）
アセチル補酵素Ａの濃度（μＭ） ｖ（μＭ／ｓ）
０ ０
１ ０．００１２２５
２ ０．００１２２５
２０ ０．００３６７６
５０ ０．００７３５３
１００ ０．０１２２５５
２００ ０．０１５９３１
６５０ ０．０３４３１４
１３００ ０．０７５９８
アセチル補酵素Ａの濃度（μＭ） ｖ（μＭ／ｓ）
０ ０
１ ０．００１２２５
２ ０．００１２２５
２０ ０．００３６７６
５０ ０．００７３５３
１００ ０．０１２２５５
２００ ０．０１５９３１
６５０ ０．０３４３１４
１３００ ０．０７５９８
６．熱安定性
前記測定に先立ち、前記実施例４において精製したタンパク質を、８０℃で、１、２、６時間前処理した。前記前処理物を用いて、前記測定を行った。反応温度は、７５℃とした。この測定には、１μＭの前記実施例４において精製したタンパク質に代えて、１００μＭの前記実施例４において精製したタンパク質を用いた。なお、前処理時間０時間は、前処理を行っていないものである。前処理時間０時間の活性を基準（１００％）として各前処理時間での残存活性を求めた。測定結果を、下記表６および図６のグラフに示す。図示のとおり、前処理を行うことで、活性の低下は見られるものの、活性は残存していることが分かった。
前記測定に先立ち、前記実施例４において精製したタンパク質を、８０℃で、１、２、６時間前処理した。前記前処理物を用いて、前記測定を行った。反応温度は、７５℃とした。この測定には、１μＭの前記実施例４において精製したタンパク質に代えて、１００μＭの前記実施例４において精製したタンパク質を用いた。なお、前処理時間０時間は、前処理を行っていないものである。前処理時間０時間の活性を基準（１００％）として各前処理時間での残存活性を求めた。測定結果を、下記表６および図６のグラフに示す。図示のとおり、前処理を行うことで、活性の低下は見られるものの、活性は残存していることが分かった。
（表６）
前処理時間（時間） 残存活性（％）
０ １００
１ ２３．４
２ １６．３
６ ０．５４３
前処理時間（時間） 残存活性（％）
０ １００
１ ２３．４
２ １６．３
６ ０．５４３
７．二次構造の熱安定性
この測定では、前記測定方法に代えて、１０μＭの前記実施例４において精製したタンパク質、１００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウムからなる反応溶液を、ｐＨ７．０の条件で、２５℃から１℃／ｍｉｎの速度で温度を上昇させたときの２２２ｎｍのＣＤ（円偏光二色性）スペクトルの変化を測定した。測定には、円偏光二色性分散計（日本分光社製、商品名Ｊ−７２０Ｗ）を用いた。なお、ここで用いた２２２ｎｍは、α−へリックス由来の吸収波長である。測定結果を、図７のグラフに示す。図示のとおり、２５℃から８５℃までの連続温度変化を見ても、前記実施例４において精製したタンパク質の二次構造が保持されていることが分かった。
この測定では、前記測定方法に代えて、１０μＭの前記実施例４において精製したタンパク質、１００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウムからなる反応溶液を、ｐＨ７．０の条件で、２５℃から１℃／ｍｉｎの速度で温度を上昇させたときの２２２ｎｍのＣＤ（円偏光二色性）スペクトルの変化を測定した。測定には、円偏光二色性分散計（日本分光社製、商品名Ｊ−７２０Ｗ）を用いた。なお、ここで用いた２２２ｎｍは、α−へリックス由来の吸収波長である。測定結果を、図７のグラフに示す。図示のとおり、２５℃から８５℃までの連続温度変化を見ても、前記実施例４において精製したタンパク質の二次構造が保持されていることが分かった。
本発明により、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質が提供できる。本発明のタンパク質は、高温下で使用することが可能であり、工業的用途が広がると共に、基質濃度の増加、反応効率の向上、混入微生物の除去、保存期間および耐用期間の延長などの多くの利点がもたらされる。
配列番号１：耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号２：耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号３：耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための順方向プライマー
配列番号４：耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための逆方向プライマー
配列番号５：Ｎ末端アミノ酸配列
配列番号２：耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号３：耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための順方向プライマー
配列番号４：耐熱性２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための逆方向プライマー
配列番号５：Ｎ末端アミノ酸配列
Claims (9)
- 下記の（ａ）または（ｂ）の耐熱性タンパク質
（ａ） 配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ） 配列番号１のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。 - 前記２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性が、水の存在下にアセチル補酵素Ａおよび３−メチル−２−オキソブタノエートに作用して、２−イソプロピルリンゴ酸および補酵素Ａを生成する機能である請求項１記載のタンパク質。
- 超好熱性古細菌由来である請求項１または２記載のタンパク質。
- 超好熱性古細菌が、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）である請求項３記載のタンパク質。
- 請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクター。
- 請求項５記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
- 請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、請求項６記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法。
- 酵素反応により、水の存在下に３−メチル−２−オキソブタノエートおよびアセチル補酵素Ａから２−イソプロピルリンゴ酸および補酵素Ａを製造する方法であって、前記酵素として請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質を用い、温度５５〜８５℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法。
- 前記酵素反応のｐＨが、ｐＨ６〜８の範囲である請求項８記載の製造方法。
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| JP2005080334A JP2005296010A (ja) | 2004-03-19 | 2005-03-18 | ２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010045629A3 (en) * | 2008-10-18 | 2010-08-19 | The Regents Of The University Of California | Production of c5-c8 alcohols using evolved enzymes and metabolically engineered microorganisms |
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-
2005
- 2005-03-18 JP JP2005080334A patent/JP2005296010A/ja not_active Withdrawn
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